KR20000020125A - 고농도 칼슘포스페이트 과포화 용액의 제조 및이를 이용한 칼슘포스페이트 결정 박막 형성 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수용액 내에서 칼슘포스페이트 결정의 침전 반응을 억제시키므로써 높은 농도의 칼슘포스페이트의 과포화 용액을 제조하고 이를 이용하여 칼슘포스페이트 결정 박막을 전하를 갖는 고형기질 표면에 형성하는 방법이 제공된다.

Description

고농도 칼슘포스페이트 과포화 용액의 제조 및 이를 이용한 칼슘포스페이트 결정 박막 형성 방법

본 발명은 수용액 내에서 칼슘포스페이트 침전물이 형성되는 것을 억제시키므로써 자유 이온 상태를 높은 농도로 유지한 과포화 이온 용액을 제조하고 이를 이용하여 전하를 갖는 고형체 표면에 칼슘포스페이트 결정 박막을 형성하는 방법에 관한 것이다.

칼슘포스페이트 결정은 생체 적합성이 있는 것으로 알려져 있는데, 그 중에 인회석 결정은 생체 석회화 조직에 존재하는 유일한 것으로서(H.-M. Kim et al., J. Bone-Miner. Res. 10., 1589-1601 (1995); US Pat. No. 5,565,502호(발명의 명칭Isolation of the Calcium-Phosphate Crystals of Bone으로 1996년 10월 15일 Melvin J. Glimcher 등에게 허여됨); 및 US Pat. No. 5,691,397호(발명의 명칭Isolation of the Calcium-Phosphate Crystals of Bone으로 1997년 11월 25일 Melvin J. Climcher 등에게 허여됨), 뼈 대체 물질로서 사용되거나 혹은 금속 등으로 만들어진 생체 재료의 표면에 인회석 막을 형성시켜 조직과 접촉하게 하여 조직의 적합성을 높이는데 널리 사용되어 왔다(R. G. T. Geesink, Clin. Orthop. Relat. Res. 261, 39-58 (1990), M. G. Dunn and S. H. Maxian, J. Long Term Effect. Med. Implants, 1, 193-203 (1991)).

지금까지 칼슘포스페이트 결정을 이용하여 조직 적합성을 높이기 위하여 타이타늄 등과 같은 기질 표면에 칼슘포스페이트 결정 특히 인회석을 도포하고자 많은 방법이 개발되었다. 가장 널리 쓰이는 방법은 플라즈마 도포법(plasma coating)인데, 이 방법에 의해서 형성되는 인회석 결정은 고온에서 생성되어 성장하기 때문에 결정도가 매우 높고 크기가 커서 생체 반응성이 매우 낮은 수산화 인회석을 형성하고, 또한 부산물로서 다른 종류의 칼슘포스페이트나 칼슘옥사이드 같은 물질도 생성하는 것으로 알려져 있다(H.-G. Pfaff et al., Properties of HA-Coatings in 'Bioceramics', vol. 6., eds.. P. Ducheyne and D. Christiansen, pp. 419-424, Butterworth-Heinemann Ltd. (1993)). 그리고 아직까지 이와 같은 부산물이 생체 적합성에 어떠한 부정적인 영향을 미칠 것인지 확실히 규명되어 있지 않다. 이에 뼈 인회석 결정과 같이, 결정도가 낮아서 생체 반응성이 높고 크기가 작아서 반응 표면적이 넓은, 인회석 결정막을 기질 표면에 형성시키는 방법의 개발이 요구되어 왔다.

이러한 문제점을 극복하기 위해서 칼슘 및 포스페이트 이온 용액을 사용하여 저온에서 결정을 기질 표면에 직접 부착시킬 수 있는 방법이 개발되었는데, 현재까지 개발된 방법은 과포화 용액에서 저절로 일어나는 침전 현상 때문에 고농도로 이온을 유지시킬 수 없어서 이온 용액의 농도적 [Ca²⁺]x[HPO₄ ^2-]을 6 mM²정도 이상으로 유지시키기 어려웠다(H. B. Wen et al., J. Biomed. Mater. Res. 41, 227-236 (1998)). 그러나, 이러한 낮은 과포화 이온 농도에서 기질 표면에 결정을 부착시켜 성장시키는 것은 온도 및 표면 조건에 제약이 있을 수 밖에 없었다. 즉 온도를 37℃ 정도로 유지시켜야 하고, 표면의 이온 조건에 따라서 길게는 한달 이상의 기간이 걸렸다. 따라서 형성되는 결정의 성질을 조절하는데 중요한 역할을 하는 온도를 조절할 필요가 있거나, 온도에 민감한 생체 활성 물질 등을 결정에 함께 부착시키는 등 더 낮은 온도 조건을 요구하는 경우에는 이 방법을 사용할 수 없었다.

이에 본 발명자들은 더 낮은 온도에서 빠른 속도로, 그리고 열악한 기질 표면의 이온 조건에서도 칼슘포스페이트 결정을 기질 표면에 형성할 수 있기 위해서 필요한 조건인, 높은 농도로 과포화 이온 용액을 유지할 수 있는 방법을 개발하므로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고농도 칼슘포스페이트의 과포화 용액의 침전 현상을 억제시키므로써 칼슘, 포스페이트 이온의 농도를 고농도로 유지시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 얻어진 칼슘 및 포스페이트 이온의 농도가 고농도로 유지되는 용액을 사용하여 고형 기질 표면 위의 이온성 표면에 칼슘포스페이트 결정을 보다 빠르고 우수한 품질로 부착형성시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 고농도 과포화 이온 용액을 얻기 위해 침전물 형성 억제재를 사용하여 과포화 용액에서의 침전 현상을 지연시키므로써 장시간 동안 이온이 고농도로 존재할 수 있도록 하여 본 발명을 완성하였다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 칼슘포스페이트 인회석 결정 박막의 일만배 확대시킨 주사전자현미경 사진.

도 2는 본 발명에 따라 봉합사 표면에 생성된 인회석 결정 박막 위에 배양된 세포를 보여주는 일만배 확대시킨 주사전자현미경 사진.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따르면,

(가) 칼슘포스페이트 결정이나, 칼슘과 포스페이트 염을 산용액에 녹여 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 용액을 얻는 단계;

(나) 0 내지 37℃에서 (가)의 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 산용액에 알칼리 용액을 혼합하는 단계; 및

(다) (나)의 단계에서 얻은 용액으로부터 침전 반응의 핵으로 작용할 수 있는 무형 칼슘포스페이트 과립이나 결정을 제거하므로써 더 이상의 침전 반응이 일어나지 않게하는 단계를 포함하는 칼슘 및 포스페이트 이온이 고농도로 보존된 칼슘포스페이트의 과포화 용액을 얻는 방법에 제공된다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 칼슘포스페이트 결정은 당업계에 공지된 인공 합성 방법에 의해 얻어지는 것일 수 있다. 예를 들면, C. Rey 등의 문헌 [Calcif. Tissue Int. 45, 157-164 (1989) 및 Calcif. Tissue Int. 46, 157-164 (1990)]에 공지된 바와 같이 Ca(NO₃)₂·4H₂O을 증류수에 녹인 용액과 (NH₄)₂·HPO₄과 암모니아수를 증류수에 녹인 용액을 급속히 혼합하여 여과하고 냉동 건조시켜 인회석을 얻을 수 있다. 또한 본 발명에 사용될 수 있는 인회석 결정은 뼈조직에서 분리할 수도 있다(H.-M. Kim 등, J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995)). 인공 합성된 칼슘포스페이트 결정을 이용하는 경우는, 이온 용액 내에 포함될 이온의 종류를 칼슘, 포스페이트, 탄산 이온 등의 결정을 구성하는 이온 만으로 제한시킬 수 있는 이점이 있다. 그밖에, 석회화 조직을 산용액으로 탈회하여 얻은 용액을 사용하여 바로 (나) 단계를 실시할 수도 있다.

상기 칼슘포스페이트 결정을 용해시키는데 사용되는 산용액은 어떤 종류의 산을 사용하여도 무방하다. 예를 들면, 통상적인 유기산 또는 무기산 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있으며, 완충효과가 큰 HCl이 가장 적합하다. 칼슘포스페이트 결정은 이후 알칼리 용액과 혼합된 용액 상태에서 결정 침전물의 형성이 가능한 농도 이상으로 용해시킨다.

본 발명에 따르면, 무형 칼슘포스페이트 과립의 석출을 위한 알칼리 용액으로서 유기성 완충제를 증류수에 녹인 용액을 사용하여 칼슘포스페이트를 용해시킨 산용액에 첨가한다. 이 때, 두 용액의 온도는 0 내지 37℃를 유지한다. 알칼리 용액을 제조하기 위해서는 비스[2-히드록시에틸]이미노트리[히드로메틸]메탄, 1,3-비스[트리스(히드록시메틸)메틸아미노]프로판, (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설포닉산]), 트리스[히드록실메틸]아미노메탄 등의 유기성 완충제를 사용한다. 이 때 유기성 완충제는 원하는 pH 범위에 따라, 각 완충제의 완충 허용범위를 고려하여 선택한다. 이 알칼리 용액은 전체 혼합 용액의 pH가 6.0 내지 8.0이 되도록 첨가한다. 칼슘포스페이트 결정은 알칼리 용액의 첨가에 의해 결정되는 pH에 따라서 형성되는 결정의 종류가 달라진다. 따라서, pH를 조절하여 원하는 결정을 얻을 수 있다. 디칼슘 포스페이트 이수화물 결정을 위한 이온의 과포화 용액은 pH를 6.0 내지 6.5 로 조절하고, 옥타칼슘 포스페이트 결정을 위한 이온의 과포화 용액은 pH를 6.5 내지 6.8로 조절하고, 생체재료로서 널리 쓰이는 인회석 결정막을 얻기위한 이온의 과포화 용액은 pH를 6.8 내지 8.0으로 조절한다. 그러나 표면 상태가 고른 인회석 표면을 얻기 위해서는 완충제 및 칼슘포스페이트 과립 침전물 형성 억제재로서 트리스[히드록실메틸]아미노메탄을 사용하여 pH를 7.4 내지 7.6으로 유지하는 것이 좋다.

이어서, 알칼리 용액으로 중화시킨 용액으로부터 형성된 무형 칼슘포스페이트 과립을 제거한다. 침전물의 제거 방법으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 여과법이나 원심 분리법이 포함된다. 필터를 사용하는 여과법을 실행하면, 용액 중의 세균을 동시에 제거할 수 있기 때문에 후에 이온 용액을 별도로 멸균하지 않아도 되는 잇점이 있다.

이렇게 생성된 칼슘포스페이트의 과포화 이온 용액의 농도는 반응조건에 따라 이온적이 6.0 내지 30.0 mM²[Ca²⁺]x[HPO₄ ^2-]이다. 이 용액의 특징은 용액 내에 침전 억제재가 함유되어 있어서, 이온의 농도가 동종 핵형성(homogenous nucleation)에 의헌 침전물이 형성될 수 있는 고농도임에도 불구하고 침전물의 형성이 억제된 상태로 유지될 수 있다는 것이다. 그러나, 이 용액을 이온전하를 갖고있는 고형체 표면과 접촉시키면, 침전 억제재의 영향을 받지않는 이형 핵 형성(heterogenous nucelation)에 의해 고형체 표면 상에서 결정이 형성되어 부착되고 성장할 수 있다. 더구나, 이 용액내의 자유이온 농도가 매우 높기 때문에 낮은 온도에서 또는 풍부하지 못한 이온 전하를 갖는 표면상태에서와 같이 높은 에너지가 필요한 조건 하에서도 이형 핵 형성에 의해, 결정이 쉽게 형성될 수 있다. 그결과, 지금까지 개발된 방법으로는 불가능했던 조건에서도 여러 가지 재료표면에 빠르게 칼슘포스페이트 결정막을 형성시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양면은

(가) 칼슘포스페이트 결정이나, 칼슘과 포스페이트 염을 산용액에 녹여 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 용액을 얻는 단계;

(나) 0 내지 37℃에서 (가)의 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 산용액에 알칼리 용액을 혼합하는 단계;

(다) (나)의 단계에서 얻은 용액으로부터 침전 반응의 핵으로 작용할 수 있는 무형 칼슘포스페이트 과립이나 결정을 제거하므로써 더 이상의 침전 반응이 일어나지 않게하는 단계; 및

(라) (다)의 단계에서 얻은 용액을 표면 전하를 갖는 고형체 기질 표면에 적용하여 칼슘포스페이트 결정 박막을 형성시키는 방법에 관한 것이다.

상기 (라) 단계의 박막 형성시 온도는 0 내지 60 ℃ 이며, 균질한 결정막을 얻기 위해서는 0 내지 37℃가 적당하다.

결정막을 형성시킬 수 있는 표면은 전하를 가진 표면(charged suface)을 제공할 수 있는 재료로서, 예를 들면, 금속, 세라믹, 유기 폴리머, 유리, 동물 및 식물 생체 조직 표면 등의 표면이 포함된다. 또한, 그의 기하학적 모양에도 구애되지 않는다. 따라서, 예를 들면, 평판형, 원통형, 입방체, 원뿔, 각주 또는 이들의 복합 형상 등이 가능하다.

하기 실시예를 사용하여 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이다. 이는 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

Ca(NO₃)₂·4H₂O 17.7 ㎎을 증류수 250 ㎖에 녹인 용액과 (NH₄)₂·HPO₄40 ㎎과 암모니아수 1 ㎖를 증류수 500 ㎖에 녹인 용액을 급속히 혼합하여 여과하고 냉동 건조시켜 합성한 합성 인회석 결정 400 ㎎을 0.2 M HCl 40 ㎖에 용해시켜 칼슘 포스페이트 이온을 함유한 산성 이온 용액(acidic ion solution)을 만든다. 산용액을 0.2 M HCl로 다시 희석하여 15% 용액이 되도록 한 후 이 용액을 0.2 M 트리스[히드록시메틸]아미노메탄과 혼합하고 교반하여 pH 7.2의 트리스/HCl 완충 용액을 만든다. 이때 모든 용액의 온도는 4℃ 를 유지한다. 이 시점에서 무형 칼슘포스페이트가 급속하게 형성되지만 서서히 결정 석출의 양이 감소되고 평형을 이루게된다. 4℃에서 10 분간 방치한 후 0.2 ㎛ 여과 크기 필터를 사용하여 이때까지 형성된 무형 칼슘포스페이트를 제거하고 중화 이온 용액(neutralized ionic buffer solution)을 얻는다.

생성된 용액의 이온 농도를 원자 흡광 스펙트럼법이나 비색검출법 측정하면 이온의 농도적이 15 내지 20 mM²[Ca²⁺]x[HPO₄ ^2-]로서 과포화 고농도가 된다.

이렇게 얻어진 과포화 이온 용액은 사용전 까지 4℃에서 보관한다.

실시예 2

CaCl₂·H₂O 93㎎과 KH₂PO₄52㎎을 바로 0.2 M HCl 75ml에 녹이는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건에서 실시하여 칼슘포스페이트 인회석 박막을 형성 시킨다.

생성된 용액의 이온 농도를 원자 흡광 스펙트럼법이나 비색검출법 측정하면 이온의 농도적이 15 내지 20 mM²[Ca²⁺]x[HPO₄ ^2-]로서 과포화 고농도가 된다.

이렇게 얻어진 과포화 이온 용액은 사용전 까지 4℃에서 보관한다.

실시예 3

실시예 1 또는 2의 방법에 따라 제조된 과포화 이온 용액을 전하를 갖는 표면을 갖는 세포배양용 배양접시에 부은 후 8℃로 유지되는 항온조에 7일간 보존한다. 이 후 20℃ 까지 온도를 올려 이 온도에서 24시간 보존한다. 얻어진 칼슘포스페이트 인회석 결정으로 구성된 박막을 주사전자현미경하에서 관찰한다. 일만 배로 확대한 사진을 도 1에 제시하였다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 방법에 따라 제조된 인회석 결정막은 고른 결정 크기를 가지며 안정된 구조로 제조되었다.

실시예 4

세포배양용 접시 대신 외과용 봉합사 표면을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2의 방법에 따라 칼슘포스페이트 인회석 박막을 형성시켰다. 그리고나서, 상기 얻어진 인회석 박막이 형성된 봉합사를 섬유모세포 배양액 내에 넣고 항온조 내에 방치하여 배양하였다. 3 일 후 상기 봉합사를 주사전자현미경하에서 1,300배의 배율로 관찰하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 세포가 칼슘포스페이트 인회석 박막 위에 고르고 안정하게 부착하여 증식하였다. 이로써, 본 발명에 의해 형성된 칼슘포스페이트 인회석 박막이 생체 적합성이 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 고농도 과포화 칼슘 및 포스페이트 이온 용액은 칼슘포스페이트의 산성 용액과 알칼리 용액을 반응시켜 칼슘포스페이트를 침전시킬 때 알칼리 용액으로서 유기성 완충제를 사용하므로써 과포화 이온 상태를 얻을 수 있었다.

특히, 종래의 방법 보다 이 발명에 의한 방법은 칼슘포스페이트 과포화 용액의 이온 농도가 월등히 높기 때문에 이 용액을 이용하여 금속, 세라믹, 유기 폴리머, 유리, 동물 및 식물 생체 조직 표면 등과 같은 이온 표면을 가진 임의의 표면에 칼슘포스페이트 결정 박막을 빠르게 형성시킬 수 있었다. 또한, 이 용액은 4 내지 8℃의 낮은 온도에서도 이온 표면에 결정 박막을 형성시킬 수 있을 뿐만 아니라 이 용액에 의해 형성된 칼슘포스페이트 박막은 섬유모세포 등 여러 가지 세포를 부착시켜 증식시킬 수 있는 생체 적합성을 보여 생체에 적용할 수 있는 가능성을 보였다.

지금까지 본 발명을 상기 특정 실시예에 의해 상세히 설명하였지만, 본 발명의 진의 또는 범위에서 벗어나지 않고 본 발명에 대한 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당 기술 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.

Claims (9)

1. (가) 칼슘포스페이트 결정이나, 칼슘과 포스페이트 염을 산용액에 녹여 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 용액을 얻는 단계;

   (나) 0 내지 37℃에서 (가)의 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 산용액에 알칼리 용액을 혼합하는 단계; 및

   (다) (나)의 단계에서 얻은 용액으로부터 침전 반응의 핵으로 작용할 수 있는 무형 칼슘포스페이트 과립이나 결정을 제거하므로써 더 이상의 침전 반응이 일어나지 않게하는 단계를 포함하는 칼슘 및 포스페이트 이온이 고농도로 보존된 칼슘포스페이트의 과포화 용액을 얻는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, (나) 단계에서 상기 산용액과 알칼리 용액의 온도 및 반응온도를 0 내지 37℃에 유지하고 수행하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, (나) 단계에서 상기 알칼리 제재로서 유기성 완충제를 사용하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, (나) 단계에서 알칼리 용액을 첨가하여 용액의 pH를 6.0 내지 8.0이 되게 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, (다) 단계에서 무형 칼슘포스페이트 과립이나 결정을 제거하기 위해 여과 공극을 갖는 필터를 사용하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, (다) 단계에서 무형 칼슘포스페이트 과립이나 결정을 제거하기 위해 원심분리법을 사용하는 방법.
7. (가) 칼슘포스페이트 결정이나, 칼슘과 포스페이트 염을 산용액에 녹여 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 용액을 얻는 단계;

   (나) 0 내지 37℃에서 (가)의 고농도의 칼슘 및 포스페이트 이온 산용액에 알칼리 용액을 혼합하는 단계;

   (다) (나)의 단계에서 얻은 용액으로부터 침전 반응의 핵으로 작용할 수 있는 무형 칼슘포스페이트 과립이나 결정을 제거하므로써 더 이상의 침전 반응이 일어나지 않게하는 단계; 및

   (라) (다)의 단계에서 얻은 용액을 전하를 갖는 고형체 기질 표면에 적용하여 칼슘포스페이트 결정 박막을 형성시키는 방법
8. 제 7 항에 있어서, (라) 단계에서 공정 온도를 0 내지 60℃ 로 하는 방법.
9. 제 7 항에 따른 방법에 의해 얻어지는 칼슘포스페이트 결정막.