KR100930279B1

KR100930279B1 - 인산칼슘 극초박막 및 그의 제조법

Info

Publication number: KR100930279B1
Application number: KR1020070060645A
Authority: KR
Inventors: 김현만
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2009-12-09
Also published as: US8597718B2; WO2008156332A1; KR20080111993A; US20100183858A1

Abstract

본 발명은 고체기재 표면에 형성시킨 인산칼슘 결정으로 구성된 두께 200 nm 이하의 극초박막 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 인산칼슘 극초박막은 고체기재 표면에 구현된 요철을 우수하게 보전한 상태에서 고체기재 표면을 인산칼슘 결정으로 코팅할 수 있는 효과가 있다. 이 방법은 저온에서 인산칼슘 이온용액을 사용하여 인산칼슘 극초박막을 형성시키는데, 인산칼슘 이온용액을 (1)고체기재 표면에 비정질 인산칼슘 과립을 형성하는 단계, (2)비정질 인산칼슘 과립 주위로 인산칼슘 표면결정의 모체를 형성시키는 단계, (3)비정질 인산칼슘 과립을 용해시켜 제거하는 단계, (4)인산칼슘 표면결정의 모체를 결정으로 변환 및 증식시키는 단계로 각각 구분하여 적용하므로서 인산칼슘 결정의 증식 및 성숙을 제한하여 두께 200 nm 이하의 인산칼슘 결정 극초박막을 제조할 수 있다.

인산칼슘, 극초박막, 비정질 인산칼슘과립, 표면결정의 모체, 결정형성

Description

인산칼슘 극초박막 및 그의 제조법 {CALCIUM PHOSPHATE ULTRATHIN FILMS AND ITS PREPARATION}

도 1은 본 발명의 실시예에 의해 극초박막을 티타늄 고체기재 표면에 형성시킨 것을 주사전자현미경(x 5,000)으로 관찰한 사진으로 인산칼슘으로 표면이 코팅되어있지만 티타늄 표면에 구현된 요철 거칠기가 우수하게 보전되어있다.

도 2는 본 발명의 실험예에 의해 티타늄 고체기재 표면에 인산칼슘 결정 극초박막을 형성한 후의 표면 거칠기(가: Ra = 2.222 μm)와 결정박막 형성전의 거칠기(나: Ra = 2.794 μm)를 공초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 비교한 결과이다. 거칠기 감소가 크지않음을 보여준다.

도 3은 본 발명의 비교예에 의해 기존방법으로 티타늄 고체기재 표면에 형성된 인산칼슘 결정 박막 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진으로서, 본 발명의 실시예에 의해 티타늄 고체기재 표면에 형성된 도 1의 인산칼슘 결정 극초박막과 표면을 비교할 때 티타늄 표면의 거칠기가 상당히 상쇄된 것을 알 수 있다.

도 4는 본 발명의 실시예에 의해 극초박막을 폴리스티렌 고체기재 표면에 형성시킨 것을 파절하여 극초박막의 측면을 주사전자현미경(x 5,000)으로 관찰한 사진이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 의해 극초박막을 formvar 필름 고체기재 표면에 형성시킨 것을 투과전자현미경(x 50,000)으로 관찰한 사진이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 의해 폴리스티렌 표면에 형성된 인산칼슘 극초박막 표면에 세포가 안정하게 부착되어있는 것을 광학현미경(x200)으로 관찰한 사진이다.

본 발명은 인산칼슘 결정 극초박막 제조법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고체기재 표면을 인산칼슘 박막으로 코팅하면서도 고체기재 표면의 요철 거칠기 상태를 우수하게 보전할 수 있는 두께 200 nm 이하의 인산칼슘 결정 극초박막 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인산칼슘 결정(calcium phosphate crystal)은 사람 등 척추동물의 골격을 유지하는 뼈나 치아등에 존재하는 물질로서[H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 1995, 10., 1589-1601; 미국특허 제5,565,502호; 및 미국특허 제5,691,397호], 생체 적합성(biocompatibility)이 있어서 뼈 대체 물질로 안전하게 사용될 수 있는 생체재료로 알려져 왔다. 또한 인산칼슘은 유무기 이온 및 분자에 대한 흡착도가 높아 중금속의 흡착제거와 탈취 및 바이러스와 같은 미생물 흡착제거 등의 특성을 가지고 있다 (M. Peld et al. Environ. Sci. Technol. 2004, 38, 5626-5631; Q. Y. Ma et al. Environ. Sci. Technol. 1993, 27, 1803-1810; H. Tanaka et al. Arch. Oral Biol. 1996, 41, 505-508; S. Tsuru et al. Biomed. Mater. Eng. 1991,1, 143-147). 인산칼슘 제재로는 막대기형, 가시형, 플래트(flake)형, 과립형, 박막형 등 다양한 형태로서 생체재료, 중금속제거, 탈취제 등의 다방면에서 유용하게 활용되고 있다.

인산칼슘 박막은 고체기재 표면에 코팅할 수 있는데, 고체기재에 박막으로 코팅하는 것은 고체기재 자체에서 얻을 수 있는 고체기재의 기계적 성질에는 변화를 초래하지 않고 인산칼슘의 유용한 생물학적 물리화학적 반응성을 얻을 목적으로 표면에 코팅하는 것이다. 이렇게 함으로써 금속이나 폴리머의 다양한 형태와 물리적 특성과 인산칼슘의 높은 반응성 특성을 융합하는 고성능 소재를 개발할 수 있다.

그러나 인산칼슘 박막의 두께는 인산칼슘 박막의 성능에 큰 영향을 주는 요인이다. 인산칼슘 박막은 두터울수록 외부의 기계적 충격에 파절되기 쉽고 코팅된 하부 고체기재 표면에 부여된 요철효과를 상쇄시키게 된다. 고체 표면의 요철은 흡착효율에 영향을 미치는 표면적의 크기에 직접 관련될 뿐만 아니라 생체재료의 경우 세포 및 조직반응에 큰 영향을 미치는 요소이다 (S. A. Hacking et al. Clin. Orthop. Relat. Res. 2002, 405, 24-38; D. Perrin et al. Clin. Oral. Implants. Res. 2002, 13, 465-469). 따라서 인산칼슘 박막은 하부 고체기재 표면에 구현된 미세한 요철을 상쇄시키지 않고 박막에 가해지는 응력에 견딜수 있도록 가능한 한 얇은 두께를 갖는 것이 바람직하다.

그러나 종래 개발된 인산칼슘 박막의 두께는 마이크로미터 단위 이상으로 두터워 요철효과를 상쇄할 뿐 만 아니라 기계적 충격에 파절되기 쉬웠다. 이에 가능한 한 얇은 나노단위 두께로 인산칼슘 극초박막을 제작하여 물리화학적 특성 및 생물학적 반응성에서 진보된 인산칼슘박막 개발의 필요성이 요구된다.

인산칼슘의 제조는 인산칼슘 이온용액으로부터 개시된다. 인산칼슘 이온용액은 Ca²⁺ 이온 및 PO₄ ^3-이온을 포함하는 모든 화합물 중에서 선택하여 인산칼슘 이온용액으로 제조하는 것이다. 이때, Ca²⁺ 이온을 포함하는 화합물의 일례로는 Ca(NO₃)₂·4H₂O, CaCl₂ 등에서 선택될 수 있으며, PO₄ ^3-이온을 포함하는 화합물의 일례로는 Na₂HPO₄·2H₂O, NaH₂PO₄·H₂O, K₂HPO₄·3H₂O, 또는 KH₂PO₄ 등에서 선택되어 사용될 수 있다. 통상적인 인산칼슘 박막은 고농도 인산칼슘 과포화 용액을 이용하여 제작할 수 있다 (김현만, 고재승, 김윤지, 박수진, 대한민국 특허 제 0353141 호, 김현만, 고재승, 대한민국 특허 제 0511338 호). 그러나 종래 방법에서는 두께를 조절하는 방법이 제공되지 않아 기 방법에 의해 제조된 박막의 두께는 500 nm 이상의 수 micrometer 두께로 박막이 제조되었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 표면에서 일어나는 인산칼슘 표면결정 형성과정에 대한 새로운 인식에 근거한다. 즉 인산칼슘 박막은 1) 고체기재 표면에 비정질 인산칼슘 과립이 형성되고, 2) 비정질 인산칼슘 과립에서 고체기재 표면으로 표면결정의 모체로서 수지상 비정질 돌기가 자라나오고, 3) 수지상 비정질 돌기 및 비정질 과립이 결정으로 변환하여 고체기재 표면에 인산칼슘 결정이 생성되고, 4) 이어서 결정이 증식하여 표면을 코팅하므로써 형성된다. 이때 표면에 부착한 표면결정 모체인 비정질돌기는 결정에 비해서는 용해도가 높지 만, 비정질 과립에 비해서는 용해도가 낮다. 또한 비정질 인산칼슘 과립의 결정변환은 비정질인 표면결정 모체가 표면에 뻗어나온 후에 일어나는 것이 특징이다.

이에 본 발명은 표면결정 모체인 비정질돌기가 비정질 인산칼슘 과립에 비해 용해도가 낮으며, 비정질 인산칼슘 과립의 결정변환이 표면결정 모체가 형성된 후에 일어나는 성질을 이용하여 표면결정형성을 조절하므로서 인산칼슘 극초박막을 제조한다. 즉 비정질 수지상돌기가 표면에 생성된 후 비정질 과립이 결정으로 변환하기 전에 과립을 용해하여 제거하므로서 과립이 표면결정층 형성에 기여하지 못하도록 하고 바닥에 얇게 부착된 비정질 결정의 모체에서만 결정이 형성되도록하여 두께가 극히 얇은 결정층을 제조할 수 있다.

요약하면 인산칼슘 결정 극초박막 형성과정을 1) 고체기재 표면에 비정질 인산칼슘 과립의 형성단계, 2) 비정질 인산칼슘 과립 주위로 표면결정의 모체를 형성하는 단계, 3)비정질과립이 결정으로 변환하기 전에 비정질 과립을 용해시켜 제거하는 단계, 4) 표면결정 모체의 결정변환 및 증식 단계로 구별하고, 각 단계를 인위적으로 조절하여 인산칼슘 결정 극초박막을 제조하는 발명의 목적을 완성할 수 있다. 종래에는 인산칼슘 결정박막을 형성하는데 있어서 이와 같은 단계를 구별하지 않고 연속적인 일련 과정으로 인산칼슘 결정박막을 제조하였기 때문에 두터운 인산칼슘 결정박막을 제조할 수 있었을 뿐 극초박막을 제조할 수는 없었다. 이에 본 발명은 인산칼슘 이온용액에 의해 인산칼슘 결정박막이 제조되는 과정을 단계별로 구분하고 형성반응을 몇 단계로 나누어 새로운 조건의 이온용액에서 박막형성과정이 진행되도록 하므로서 본 발명의 목적을 달성한다.

위에서 설명한 인산칼슘 박막형성의 세 단계 중에서 인산칼슘 박막의 두께에 영향을 미치는 요소 중 중요한 요소는 단계 1) 에서 형성되는 비정질 인산칼슘 과립의 결정변환이다. 과립이 결정으로 변환하여 이온용액을 사용하여 제거할 수 없게되면 과립 및 주위로 인산칼슘 결정이 두텁게 증식하여 박막의 두께가 두터위진다. 따라서 인산칼슘 결정박막의 두께를 줄이기 위해서는 인산칼슘 비정질과립이 결정으로 변환하기 전에 비정질 과립을 제거하는 것이다. 한편 비정질 과립을 제거하지 않고 극초박막을 제조할 수도 있다. 결정의 크기와 유사한 정도로 극히 작은 비정질 과립을 제조하는 경우는 비정질과립의 결정변환이 결정과립 형태 대신 바닥에 부착한 편평한 결정으로 변환하므로 비정질 과립의 존재에도 불구하고 박막의 두께를 얇게 유지할수 있다. 그러나 비정질 과립이 극히 작지않은 경우를 제외하고는 과립이 공모양결정으로 변환하는 경우 결정과립 주변으로 결정이 두텁게 성장할 수 있기 때문에 비정질과립이 극히 작은 경우가 아니면 가능한 한 비정질 과립을 제거하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인산칼슘 결정박막 형성의 각 단계를 조절할 수 있는 조건을 갖춘 인산칼슘 이온용액을 제조하고, 이를 사용하여 고체기재에 형성된 비정질 인산칼슘 과립을 일시적으로 이용하여 인산칼슘 결정 극초박막을 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 인산칼슘 결정 극초박막의 제조방법에 대해 상세하게 설명한다.

1) 인산칼슘 이온용액의 제조

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인산칼슘 결정박막과정의 각 단계를 조절하기위해 다음과 같이 이미 알려진 기존 방법 (김현만, 고재승, 대한민국 특허 제 0511338 호)을 이용하여 인산칼슘 이온용액을 제조하여 사용한다. 그러나 본 발명이 기존의 방법과 다른 점은 사용 목적에 맞게 농도를 조절한 인산칼슘 이온용액을 여러 차례 사용하는 점이다. 각 인산칼슘 이온용액은 다음과 같은 4가지 목적으로 사용된다.

인산칼슘 이온용액 1: 금속, 유리, 세라믹, 친수성 폴리머, 그리고 친수성 동물과 식물의 조직과 같이 표면에너지가 높은 고체기재의 표면에 직경이 20 nm 이하인 비정질 인산칼슘과립과 결정모체의 형성, 혹은 소수성 폴리머와 같이 표면에너지가 낮은 고체기재 표면에 직경이 400 nm 이하인 비정질 인산칼슘 과립을 형성하는 인산칼슘 이온용액. 인산칼슘 이온농도의 농도적이 1 ∼ 25 mM²인 인산칼슘 이온용액이다.

인산칼슘 이온용액 2: 비정질 인산칼슘 과립주위에 비정질 표면결정의 모체를 형성 시키는 인산칼슘 이온용액. 인산칼슘 이온농도의 농도적이 1∼ 25 mM²인 인산칼슘 이온용액이다.

인산칼슘 이온용액 3: 비정질 인산칼슘 과립은 용해시키고 비정질인 표면결정의 모체는 용해시키지않는 인산칼슘 이온용액. 인산칼슘 이온농도의 농도적이 0.16 ∼ 1 mM²인 인산칼슘 이온용액이다.

인산칼슘 이온용액 4: 비정질인 표면결정의 모체를 결정으로 변환시키고 결정을 증식시키는 인산칼슘 이온용액. 인산칼슘 이온농도의 농도적이 1 ∼ 64 mM²인 인산칼슘 이온용액이다.

각 목적을 위해 사용하는 이온용액을 제조하는 방법은 보다 구체적으로는,

(1) 인산이온을 포함하는 이온용액을 제조하는 단계;

(2) 칼슘이온을 포함하는 이온용액을 제조하는 단계; 및

(3) 상기 이온용액을 혼합하여 각 농도범위의 인산칼슘 이온용액을 제조하는 단계로 구성된다.

단계 (3)에서 이온용액을 혼합할 때, 온도는 0 ∼ 20^oC에서 수행하는데 더욱 바람직하게는 0 ∼ 10^oC에서 유지하는 것이고, 가장 바람직하게는 상기 온도 범위에서 가 능한 한 낮은 온도에서 수행하여 인산칼슘 침전물의 형성을 지연시키는 것이다. 또한, 혼합시 국소적 농도증가가 증가하여 인산칼슘 침전물이 형성되지 않도록 하기 위하여, 용액의 교반방법 또는 기계적인 방법을 이용하여 혼합용액을 소량으로 분배하여 저속으로 첨가하는 방법을 사용할 수 있다. 이때, 혼합용액의 저속 첨가 및 용액의 교반은 첨가되는 이온의 확산을 촉진하여, 인산칼슘 용액의 고농도에 기인한 국소적으로 자발적인 인산칼슘 화합물 생성을 억제 또는 지연한다.

본 발명의 인산칼슘 이온용액의 제조방법 과정에서 완충용액을 사용하는 것이 균질한 인산칼슘 용액을 얻는데 바람직하며, 완충용액은 유기이온 또는 무기이온의 완충용액 모두를 사용할 수 있다. 가장 단순한 조성으로는 인산완충용액을 사용하는 것이다. 특히 생체재료와 같이 생체적합성을 고려해야하는 경우는 성분이 단순하고 생체에서 발견되는 이온으로만 제조되는 인산완충용액이 가장 바람직하다.

본 발명의 인산칼슘 이온용액의 pH는 6.8 - 8.0사이의 용액을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 pH 7.0 - 7.6 사이가 적당하며, 가장 바람직한 pH 범위는 7.2 - 7.5이다.

2) 인산칼슘 극초박막의 제조

상기 제조된 인산칼슘 이온 용액을 사용하여 200 nm 이하 두께의 인산칼슘 결정 박막을 제조한다.

제 1 실시형태는 인산칼슘 이온용액 1을 사용하여 직경이 400 nm 이하 크기의 비정질 인산칼슘 과립을 고형기재위에 형성시킨 후 인산칼슘 이온용액 2를 사용하여 비정질 인산칼슘 과립 주위로 비정질 표면결정의 모체를 형성시키고 인산칼슘 이온용액 3를 사용하여 비정질 인산칼슘 표면결정의 모체는 잔존시키고 비정질 인산칼슘 과립을 제거한 다음 인산칼슘 이온용액 4를 사용하여 표면에 생성된 인산칼슘 표면결정의 모체를 결정으로 변환 증식시켜 200 nm 이하 두께로 인산칼슘 결정 박막을 제조할 수 있다. 비정질 과립의 크기는 400 nm이하로 제조하여 인산칼슘 극초박막을 제조할 수 있는데, 표면에너지가 낮아 비정질 결정모체의 형성이 느리기 때문에 비정질과립의 직경을 100 - 400 nm로 제조하여 사용하는 것이 바람직하다. 제 1 실시 형태는 친수성 및 소수성의 모든 표면에 적용이 가능하다. 그러나 물 접촉각도가 60도 이상인 소수성 폴리머 및 소수성인 동물 및 식물 조직과 같이 표면에너지가 낮은 경우는 비정질 인산칼슘 과립은 크기가 커지고 밀도가 낮게 형성되며 비정질 결정모체의 형성도 늦기 때문에 제 1 실시 형태를 적용하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로는, 1차 반응으로서 고체기재 표면을 인산칼슘 이온용액 1을 사용하여 400 nm 이하 크기의 비정질 인산칼슘과립을 제조한다. 기재표면에 비정질 인산칼슘 과립을 생성시키기 위해서는 이온용액을 승온 처리한다. 승온시작의 온도범위는 0 ^oC 이상부터 30 ^oC 이하인데, 가장 바람직한 승온시작의 온도범위는 0 ^oC ∼ 10 ^oC 의 조건이다. 승온마침의 온도범위는 8 ^oC ∼ 50 ^oC 이되, 최소한의 승온 온 도는 5 ^oC 이상이다. 과립이 생성된 후 이온용액을 제거하고 증류수로 2 - 3초간 수세하여 반응을 중단시킨다.

다음, 2차 반응으로 인산칼슘 이온용액 2를 사용하여 비정질 인산칼슘 과립에서부터 바닥에 부착하여 표면결정의 모체로서 수지상 비정질 돌기를 뻗어나오게 한다. 표면결정의 모체가 조절할 수 없도록 급격히 만들어지고 이어서 표면결정 모체의 결정의 변환 및 증식이 급속히 일어나지 않도록 하기위해서는 가능한 한 저온에서 처리하여 결정모체의 형성 속도를 늦추는 것이 바람직하다. 그러나 반응온도가 너무 낮으면 반응속도가 너무 느려진다. 반응온도는 빙점이상부터 50 ^oC 이하의 조건에서 사용할 수 있으나, 바람직하게는 5 ^oC 이상부터 35 ^oC 이하이고, 적절한 반응속도를 얻을 수 있는 반응 온도는 10 - 25 ^oC 가 가장 바람직하다. 표면결정 모체가 형성된 후 이온용액을 제거하고 증류수로 2 - 3초간 수세하여 반응을 중단시킨다.

이후, 인산칼슘 이온용액 3을 사용하여 표면결정의 모체만을 남기고 아직 비정질상태인 인산칼슘 과립을 용해시켜 결정으로 변환 시에 박막의 두께를 두텁게 만들 수 있는 비정질 인산칼슘 과립을 제거한다. 반응온도는 빙점이상부터 50 ^oC 이하의 조건에서 사용할 수 있으나, 바람직하게는 5 ^oC 이상부터 35 ^oC 이하이고, 적절한 반응속도를 얻을 수 있는 반응 온도는 10 - 25 ^oC 가 가장 바람직하다.

다음, 인산칼슘 이온용액 4를 사용하여 결정형성의 모체를 결정으로 변환 증식시켜 200 nm 두께 이하의 극초박막을 고체기재 표면에 제조한다. 이때 결정이 조절할 수 없도록 급격하게 두껍게 증식하지 못하도록 제한하기위해서는 가능한 한 저온에서 처리하여 결정의 증식 속도를 늦추어 서서히 증식하도록 하므로서 두께 200 nm 이하의 인산칼슘 결정 극초박막을 제조한다. 그러나 반응온도가 너무 낮으면 반응속도가 너무 느려진다. 반응온도는 5 ^oC 이상부터 50 ^oC 이하의 조건에서 사용할 수 있으나, 바람직하게는 5 ^oC 이상부터 35 ^oC 이하이고, 적절한 반응속도를 얻을 수 있는 반응 온도는 10 - 25 ^oC 가 가장 바람직하다.

제 2 실시 형태는 1차 반응으로서 인산칼슘 이온용액 1을 사용하여 20 nm 이하 크기의 비정질 인산칼슘 과립 및 결정형성의 모체를 고형기재위에 형성시킨 다음 2차 반응으로서 비정질 인산칼슘 과립을 인산칼슘 이온용액 4로 처리하여 200 nm 이하 두께의 인산칼슘 결정 박막을 제조할 수 있다. 표면에너지가 높은 고형기재표면에는 표면에너지가 낮은 표면에 비해 직경은 작지만 더 많은 비정질 인산칼슘 과립이 더 빠른 속도로 흡착된다. 또한 비정질 과립에서 더 빠른 속도로 표면결정의 모체가 자라나온다. 따라서 표면에너지가 높은 고형기재 표면에서는 이온용액 2 및 3의 적용을 생략하고 이온용액 4를 적용하는 두 단계 방법으로 극초박막을 제조할 수 있다. 즉 고형기재 표면에 인산칼슘 이온용액 1을 사용하여 20 nm 이하 크기의 비정질 과립을 생성시키고 이어서 이온용액 4의 적용하에서 표면결정의 모체형성 및 결정변환, 비정질 인산칼슘 과립의 용해 혹은 결정변환, 그리고 결정의 증식을 일 으켜 두께 200nm 이하의 극초박막을 제조할 수 있다. 비정질과립은 과립의 결정변환 전에 제거되거나, 결정으로 변환되어 박막에 편입된다. 비정질 과립은 과립의 크기가 작기 때문에 결정과립의 형태대신 표면에 부착하는 형태의 결정으로 변환되기 때문에 박막의 두께를 두텁게 만드는데 기여하지 않는다. 크기가 작은 비정질 과립은 칼슘포스페이트 결정형성 반응에 의해 산성화되는 이온용액에 의해 조기에 용해제거될 수도 있다. 제 2 실시 형태는 친수성 및 소수성의 모든 표면에 적용이 가능하다. 그러나 금속, 유리, 세라믹, 물접촉각도가 60도 이하인 친수성 폴리머 및 친수성인 동물 및 식물조직과 같이 표면에너지가 높아 작은 크기의 비정질 인산칼슘 과립이 높은 밀도로 형성되는 고체기재에 적용하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로는, 1차 반응으로서 고형기재 표면을 인산칼슘 이온용액 1을 사용하여 20 nm 이하 크기의 비정질 인산칼슘과립 및 결정형성의 모체를 제조한 다음 인산칼슘 이온용액 1을 제거하고 증류수로 2 - 3초간 수세하여 반응을 중단시킨다. 기질표면에 비정질 인산칼슘 과립을 형성시키기 위해서는 이온용액을 승온 처리한다. 승온시작의 온도범위는 0 ^oC 이상부터 30 ^oC 이하인데, 가장 바람직한 승온시작의 온도범위는 0 ^oC ∼ 10 ^oC 의 조건이다. 승온마침의 온도범위는 8 ^oC ∼ 50 ^oC 이되, 최소한의 승온 온도는 5 ^oC 이상이다.

다음, 2차 반응으로 인산칼슘 이온용액 4를 사용하여 표면결정의 모체를 생성시켜 결정으로 변환시키고, 비정질 과립을 제거하거나 혹은 결정으로 변환시킨 뒤 표면 에 부착한 결정을 증식시켜 극초박막을 제조한다. 극초박막을 제조하는 반응은 반응의 속도를 조절하기 위해서 가능한 한 저온에서 처리하여 반응 속도를 늦추는 것이 바람직하다. 그러나 반응온도가 너무 낮으면 반응속도가 너무 느려진다. 반응온도는 빙점이상부터 50 ^oC 이하의 조건에서 사용할 수 있으나, 바람직하게는 5 ^oC 이상부터 35 ^oC 이하이고, 적절한 반응속도를 얻을 수 있는 반응 온도는 10 - 25 ^oC 가 가장 바람직하다.

본 발명의 모든 실시 형태에서 제조한 극초박막은 두께가 200 nm이하로서 극히 얇기 때문에 고체 기재 표면의 미세한 표면구조를 우수하게 보전한 상태에서 인산칼슘 박막을 표면에 코팅할 수 있다.

본 발명의 모든 실시 형태에서 사용되는 고체기재는 인산칼슘 극초박막을 제조할 수 있도록 제공되는 표면이며, 친수성 및 소수성의 모든 표면이 가능하다. 바람직하게는 유기 폴리머, 금속, 세라믹, 유리, 동물 및 식물의 생체 조직이 있다. 유기 폴리머는 천연 또는 인공적으로 합성된 모든 폴리머가 사용 가능하며, 그 예로서 폴리스타일렌(polystyrene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락트산(polylactic acid) 및 폴리(락틴-글리콜산)(poly lactic glycolytic acid) 등이 있다. 또한 금속은 고체금속이면 모두 사용할 수 있으며, 생체재료인 경우 가장 바람직하게는 티타늄을 사용한다. 이때, 고 체기재로 사용되는 물질의 기하학적 모양에도 제한이 없다. 따라서, 평판형, 원통형, 입방체, 원뿔, 각주 또는 이들의 복합 형상 등 다양한 구조가 가능하며 상기 고체 표면은 전하를 띨 수도 있고 또는 띠지 않을 수도 있다.

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예와 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 인산칼슘 이온 용액 제조

<실시예 1> 폴리스티렌 표면 및 티타늄 표면에 적용하는 인산칼슘 이온용액 1의 제조

표면에너지가 높은 티타늄 표면에 직경이 20 nm 이하인 비정질 인산칼슘 과립을 만들거나 표면에너지가 낮은 폴리스티렌 표면에 직경이 400 nm 이하인 비정질 인산칼슘 과립을 형성하는데 사용한 인산칼슘 이온용액은 다음과 같이 제조하였다. pH 7.4, 인산농도가 2.5 mM인 인산완충용액을 제조하였고, 빠른 속도로 교반하면서 상기 인산완충용액 20 ㎖에 칼슘이온의 최종농도가 2.5 mM 농도가 되도록 250 mM CaNO₃수용액 200 ㎕을 1.0 ℃에서 분당 200 ㎕ 속도로 첨가하였다. 상기 제조된 인 산칼슘이온 용액은 사용하기 전까지 1 ℃에서 보관하였다.

<실시예 2> formvar막에 적용하는 인산칼슘 이온용액 1의 제조

표면에너지가 낮은 formvar막 표면에 직경이 400 nm 이하인 비정질 인산칼슘 과립을 형성하는데 사용한 인산칼슘 이온용액은 다음과 같이 제조하였다. pH 7.4, 인산농도가 2.8 mM인 인산완충용액을 제조하였고, 빠른 속도로 교반하면서 상기 인산완충용액 20 ㎖에 칼슘이온의 최종농도가 2.8 mM 농도가 되도록 280 mM CaNO₃수용액 200 ㎕을 1.0 ℃에서 분당 200 ㎕ 속도로 첨가하였다. 상기 제조된 인산칼슘이온 용액은 사용하기 전까지 1 ℃에서 보관하였다.

<실시예 3> 인산칼슘 이온용액 2의 제조

표면에너지가 낮은 폴리스티렌 및 formvar막 표면에 부착한 비정질 인산칼슘 과립주위로 결정형성의 모체를 형성하기 위한 인산칼슘 이온용액은 다음과 같이 제조하였다. pH 7.4이고 인산농도가 3 mM인 인산완충용액을 제조하였고, 빠른 속도로 교반하면서 상기 인산완충용액 20 ㎖에 칼슘이온의 최종농도가 3 mM 농도가 되도록 300 mM CaNO₃수용액 200 ㎕을 1.0 ℃에서 분당 200 ㎕ 속도로 첨가하였다. 상기 제조된 인산칼슘이온 용액은 사용하기 전까지 1 ℃에서 보관하였다.

<실시예 4> 인산칼슘 이온용액 3의 제조

표면에너지가 낮은 폴리스티렌 및 formvar막 표면에 부착한 비정질 인산칼슘 과립은 용해시키고 결정형성의 모체는 용해시키지않는 인산칼슘 이온용액은 다음과 같이 제조하였다. pH 7.4, 인산농도가 0.8 mM인 인산완충용액을 제조하였고, 빠른 속도로 교반하면서 상기 인산완충용액 20 ㎖에 칼슘이온의 최종농도가 0.8 mM 농도가 되도록 80 mM CaNO₃수용액 200 ㎕을 1.0 ℃에서 분당 200 ㎕ 속도로 첨가하였다. 상기 제조된 인산칼슘이온 용액은 사용하기 전까지 1 ℃에서 보관하였다.

<실시예 5> 인산칼슘 이온용액 4의 제조

결정형성의 모체를 결정으로 변환 및 증식시키는 인산칼슘 이온용액 및 표면에너지가 높은 표면에 형성된 작은 크기의 비정질 과립을 처리하기위한 이온용액은 다음과 같이 제조하였다. pH 7.4, 인산농도가 2.5 mM인 인산완충용액을 제조하였고, 빠른 속도로 교반하면서 상기 인산완충용액 20 ㎖에 칼슘이온의 최종농도가 2.5 mM 농도가 되도록 250 mM CaNO₃수용액 200 ㎕을 1.0 ℃에서 분당 200 ㎕ 속도로 첨가하였다. 상기 제조된 인산칼슘이온 용액은 사용하기 전까지 1 ℃에서 보관하였다.

2. 인산칼슘 극초박막의 제조

<실시예 6> 티타늄 표면상에 인산칼슘 결정 극초박막의 제조

직경 35 mm 소수성 폴리 스티렌 접시에 직경 25mm의 티타늄 디스크를 넣고 -20 ℃ 에서 15분간 방치하여 온도를 낮추었다. 이후 실시예 1에서 제조한 1 ℃의 2.5 mM, pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 티타늄 디스크가 들어있는 폴리 스티렌 접시에 5 ml을 붓고 42 ℃ 배양기에서 40분간 방치하여 승온시켜 티타늄 디스크 표면에 작은 비정질 인산칼슘 과립을 형성시켰다. 이후 실시예 5의 방법으로 인산과 칼슘 농도가 각각 2.5 mM이고 pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 제조하여 이 용액을 비정질 인산칼슘과립이 표면에 형성된 티타늄 디스크가 들어있는 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 18 ℃ 배양기에서 50분간 유지시켜 표면결정의 모체형성, 결정변화 및 증식을 일으켜 두께 200 nm 이하 두께의 인산칼슘 결정 극초박막을 티타늄디스크 표면에 형성하였다. 도 1은 형성된 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.

<실험예 1> 티타늄 표면상에 형성된 인산칼슘 결정 극초박막의 표면 거칠기 측정

공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 티타늄 표면과 실시예 6에서 티타늄 표면에 제조한 인산칼슘 결정 극초박막의 표면거칠기를 비교하였다. 도 2는 거칠기를 측정한 결과이다. 가는 인산칼슘 결정 극초박막 형성이후 이며, 나는 박막형성 전 표면을 측정한 것이다. 박막 형성 전 거칠기가 Ra = 2.794 μm인데 반해서 극초박막 형성 후에는 Ra = 2.222 μm로서 본 발명의 방법이 표면 거칠기 값에 큰 감소를 가져오지 않음을 알 수 있다. 도 2는 티타늄 고체기재 표면에 인산칼슘 결정 극초박막을 형성한 후(가: Ra = 2.222 μm)의 표면 거칠기를 결정박막 형성전(나: Ra = 2.794 μm)의 거칠기와 공초점 주사 레이저 현미경을 사용하여 비교한 결과이다.

<비교예 1> 티타늄 표면상에 형성된 인산칼슘 결정 극초박막과 박막의 비교

인산칼슘 결정 극초박막은 실시예 6의 방법으로 제조하였다. 반면에 통상적인 인산칼슘 결정 박막은 직경 35 mm 소수성 폴리 스티렌 접시에 직경 25mm의 티타늄 디스크를 넣고 -20 ℃에서 15분간 방치하여 온도를 낮추었다. 이후 실시예 1에서 제조한 1 ℃의 2.5 mM, pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 티타늄 디스크가 들어있는 폴리 스티렌 접시에 5 ml을 붓고 42 ℃ 배양기에서 70분간 방치하여 승온시켜 티타늄 디스크 표면에 인산칼슘 결정 박막을 형성하였다. 도 2는 형성된 인산칼슘 결정박막 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다. 티타늄 기재상의 미세한 표면 거칠기가 인산칼슘 결정 박막에 의해 상쇄 됨을 알 수 있다.

<실시예 7> 폴리스티렌 표면상에 인산칼슘 결정 극초박막의 제조

직경 35 mm 폴리 스티렌 접시를 -20 ℃에서 15분간 방치하여 온도를 낮추었다. 이후 실시예 1에서 제조한 1 ℃의 2.5 mM, pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 42 ℃ 배양기에서 40분간 방치하여 승온시켜 크기가 150 - 300 nm인 비정질 인산칼슘 과립을 형성시켰다. 그리고 실시예 3의 방법으로 인산과 칼슘 농도가 각각 3.0 mM이고 pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 제조하였다. 이 용액을 비정질 인산칼슘과립이 표면에 형성된 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 18 ℃ 배양기에서 2 시간동안 유지시켜 바닥표면에 용해도가 낮은 비정질 인산칼슘으로 구성된 결정형성의 모체를 형성하였다. 그리고 실시예 4의 방법으로 인산과 칼슘 농도 가 각각 0.8 mM이고 pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 제조하여 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 18 ℃ 배양기에서 30분 동안 유지시켜 용해도가 높은 비결정 과립은 제거하고 용해도가 낮은 비정질 인산칼슘으로 구성된 결정형성의 모체만을 표면에 남겼다. 이후 실시예 5의 방법으로 제조된 인산과 칼슘 농도가 각각 2.5 mM이고 pH 7.4인 인산칼슘 이온용액 5 ml으로 18 ℃ 배양기에서 50분 동안 표면을 한번 더 처리하여 두께 200 nm 이하 두께의 인산칼슘 결정 극초박막을 폴리 스티렌 접시 표면에 형성하였다. 도 4는 형성된 표면의 측면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.

<실시예 8> formvar막 표면상에 인산칼슘 결정 극초박막의 제조

직경 35 mm 폴리스티렌 접시를 -20 ℃에서 15분간 방치하여 온도를 낮추었다. 이후 실시예 2에서 제조한 1 ℃의 2.8 mM, pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 formvar막이 입혀진 투과전자현미경 관찰용 grid를 용액위에 뛰운 후 37 ℃ 배양기에서 29분간 방치하여 승온시켜 formvar막 표면에 150 - 200 nm 크기의 비정질 인산칼슘 과립을 형성시켰다. 그리고 실시예 3의 방법으로 pH 7.4 조건에서 인산과 칼슘 농도가 각각 3.0 mM인 인산칼슘 이온용액을 제조하여 폴리 스티렌 접시에 붓고 수면에 비정질 인산칼슘 과립이 표면에 생성된 formvar가 입혀진 grid를 뛰워 15 ℃에서 2시간동안 반응시켜 formvar 표면의 비정질 인산칼슘과립 주위에 결정형성의 모체가 생성되도록 하였다. 이후 실시예 4의 방법으로 제조 한 pH 7.4 조건에서 인산과 칼슘 농도가 각각 0.8 mM인 인산칼슘 이온용액으로 15 ℃에서 formvar 박막표면을 30분동안 반응시켜 비정질 과립은 제거하고 용해도가 낮은 결정형성의 모체를 남겼다. 그리고 실시예 5의 방법으로 제조한 pH 7.4 조건에서 인산과 칼슘 농도가 각각 2.5 mM인 인산칼슘 이온용액으로 15 ℃에서 12 시간동안 formvar막 표면을 반응시켜 결정형성의 모체를 결정으로 변환 및 증식시켰다. 도 5는 형성된 200 nm 이하의 두께로 나노결정이 증식한 것을 투과전자현미경으로 관찰한 사진이다. 이와 같이 전체를 덮고 있지 않는 극초박막은 생체재료에 적용시에 세포 및 조직이 하부의 고체기재와 인산칼슘 결정의 극초박막과 동시에 반응할 수있는 이점을 준다.

3. 인산칼슘 극초박막의 세포부착 반응

<실험예 2> 인산칼슘 극초박막의 세포부착 실험

실시예 6에서 제조한 인산칼슘 극초박막의 생체적합성을 조사하기 위하여 세포부착 실험을 하였다.

실시예 7에서 제조한 인산칼슘 극초박막이 형성된 세포배양용 배양접시에 골모세포주(MC3T3-E1 osteoblast, ATCC)를 넣고 CO₂ 항온조 내에 방치하여 95% 공기와 5%의 이산화탄소를 공급하여 37℃에서 배양하였다. 1 일 후, 상기 배양접시의 표면을 위상차현미경으로 (× 200)으로 관찰하였다.

도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 7에서 제조된 인산칼슘 극초박막 상에 세포가 안정하게 잘 부착되어있다, 따라서, 본 발명의 인산칼슘으로 구성된 극초박막의 생체적합성을 확인하였으며, 생체재료로 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 인산칼슘 결정 극초박막은 두께가 200 nm 이하로서 간단히 제조할 수 있는 인산칼슘 이온용액을 이용하여 제조할 수 있고, 두께가 얇은 인산칼슘 극초박막은 피코팅 재료 표면에 구현된 표면구조를 상쇄시키지않고 표면을 인산칼슘 박막으로 코팅할 수 있는 효과가 있다.

따라서, 이러한 인산칼슘 결정 극초박막은 다양한 고체기재 표면에 코팅하여 생체재료, 중금속의 흡착제거, 그리고 탈취 및 바이러스와 같은 미생물의 흡착제거 등의 여러 용도로 이용될 수 있는 효과가 있다.

Claims

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(1) 이온농도적이 1 내지 25mM²인 인산칼슘 이온용액을 승온 처리함으로써 고체기재 표면에 비정질 인산칼슘 과립을 형성시키는 단계, 및 (2) (1)에서 제조한 비정질 인산칼슘 과립을, 이온농도적이 1 내지 25mM²인 새로운 인산칼슘 이온용액과 반응시켜, 비정질 인산칼슘 과립 표면으로부터 수지상 비정질 돌기를 형성시키는 단계를 포함하는, 인산칼슘 과립 표면의 수지상(dendrite) 비정질 돌기의 제조 방법.
제13항에 있어서, (1) 단계에서 승온 시작의 온도 범위는 0℃ 내지 30℃이고, 승온 마침의 온도 범위는 8℃ 내지 50℃이되, 최소 승온 온도가 5℃이상이고, (2) 단계에서 반응 온도는 0℃ 내지 50℃임을 특징으로 하는 제조 방법.
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수지상 비정질 돌기를 인산칼슘 결정 극초박막 제조에 있어 중간 물질로 사용함을 특징으로 하는, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체 기재의 제조 방법.
제16항에 있어서, 수지상 비정질 돌기는 비정질 인산칼슘 과립의 표면에서부터 생성된 것으로, 수지상 비정질 돌기는 표면결정의 모체로서 남겨두고, 수지상 비정질 돌기와 함께 생성된 비정질 인산칼슘 과립은 용해시켜 제거하는 단계를 포함하는, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체 기재의 제조 방법.
제17항에 있어서, 당해 비정질 인산칼슘 과립의 제거 단계가, 수지상 비정질 돌기와 함께 생성된 비정질 인산칼슘 과립을 이온농도적이 0.16 내지 1mM²인 새로운 인산칼슘 이온용액과 0℃ 내지 50℃에서 반응시킴을 포함하는, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체 기재의 제조 방법.
제17항에 있어서, 수지상 비정질 돌기를 이온농도적이 1 내지 64mM²인 새로운 인산칼슘 이온용액과 5℃ 내지 50℃에서 반응시켜 결정으로 변환시키고 증식시킴을 포함하는, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체 기재의 제조 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체 기재가 소수성 폴리머, 소수성 동물 조직 또는 소수성 식물 조직인 제조 방법.
(1) 이온농도적이 1 내지 25mM²인 인산칼슘 이온용액을 승온 처리함으로써 고체기재 표면에 비정질 인산칼슘 과립 및 수지상 비정질 돌기를 형성시키는 단계, 및 (2) (1)에서 제조한 비정질 인산칼슘 과립 및 수지상 비정질 돌기를, 이온농도적이 1 내지 64mM²인 새로운 인산칼슘 이온용액과 반응시키는 단계를 포함하는, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체기재의 제조 방법.
제21항에 있어서, (1) 단계에서 승온 시작의 온도 범위는 0 내지 30℃이고, 승온 마침의 온도 범위는 8 내지 50℃이되, 최소 승온 온도가 5℃ 이상이고, (2) 단계의 반응 온도가 5 내지 50℃임을 특징으로 하는, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체기재의 제조 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 고체 기재가 금속, 유리 또는 세라믹이거나, 친수성 폴리머, 친수성 동물 조직 또는 친수성 식물 조직인 제조 방법.
제16항 내지 제19항, 제21항 또는 제22항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 두께 20nm 미만인 인산칼슘 결정 극초박막을 포함하는 고체 기재.