KR100944942B1

KR100944942B1 - 고체기재 표면에 구현한 저용해성 비정질인산칼슘 및 그의제조법

Info

Publication number: KR100944942B1
Application number: KR1020070068890A
Authority: KR
Inventors: 김현만
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-07-09
Filing date: 2007-07-09
Publication date: 2010-03-03
Also published as: KR20090005683A

Abstract

본 발명은 고체기재 표면에 형성시킨 저용해성 비정질인산칼슘(amorphous calcium phosphate) 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 용해도가 낮은 비정질인산칼슘은 고용해성 비정질인산칼슘을 모체로 얻을 수 있다. 고용해성 비정질인산칼슘은 인산칼슘 과포화 이온용액으로 저온에서 처리하면 저용해성 비정질인산칼슘으로 물리적 성질이 바뀐다. 용해도가 낮은 비정질인산칼슘은 생체재료로서 유용하게 사용할 수 있다. 소수성 표면에 코팅하여 세포에 친수성 표면을 제공하거나, 서서히 용해하여 칼슘, 인산, 혹은 비정질인산칼슘내에 미리 함유시킨 내용물을 유리하여 세포활성을 조절할 수 있는 효과가 있다.

비정질인산칼슘, 용해도, 생체재료

Description

고체기재 표면에 구현한 저용해성 비정질인산칼슘 및 그의 제조법 {LOW SOLUBLE AMORPHOUS CALCIUM PHOSPHATE PREPARED ON THE SOLID SURFACE AND ITS PREPARATION}

도 1은 본 발명의 실시예에 의해 인산이온과 칼슘이온의 농도가 각각 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5 mM 인 인산칼슘 이온용액을 각각 2회(2 step), 3회(3 step), 4회( step)까지 반복처리하여 폴리스티렌 표면에 형성시킨 비정질과립을 주사전자현미경(x 10,000)으로 관찰한 사진이다. 이온용액의 농도가 낮을수록 밀도가 높은 반면에 과립의 크기는 작아진다.

도 2는 본 발명의 실험예에 의해 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM인 이온용액으로 폴리스티렌 표면을 4번 처리하여 제조한 저용해성 비정질인산칼슘 과립을 뼈모세포배양조건에서 3(3h), 6(6h), 9(9h), 12(12H), 24(24h), 48(48h)시간까지 처리한 후 주사전자현미경을 사용하여 과립의 용해도를 관찰한 사진이다. 비정질 과립 은 세포배양조건에서 서서히 용해되는 것을 보여준다.

도 3은 본 발명의 실험예에 의해 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM인 인산칼슘 이온용액으로 폴리스티렌 표면을 1회 처리하여 인산칼슘 결정박막을 형성시키면서 측정한 이온 용액의 pH 강하 및 승온 과정을 보여주는 그래프이다. 반응초기에서는 완만하게 pH강하가 일어나지만, 중기에서는 급격한 pH강하가 초래되고, 말기에서 pH강하가 다시 완만해진다.

도 4는 본 발명의 실험예에 의해 폴리스티렌 표면에 형성된 인산칼슘 극초박막 표면에 세포가 안정하게 부착되어있는 것을 광학현미경(x200)으로 관찰한 사진이다. 제조된 비정질인산칼슘은 이온용액의 처리회수가 많을수록 세포를 안정하게 잘 부착시킴을 보여준다. ACP1은 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM인 이온용액을 2회 처리한 비정질 인산칼슘과립 표면이고, ACP2는 이온용액을 4회 처리한 비정질 인산칼슘과립 표면이다. HB는 비정질 인산칼슘을 형성시키지 않은 표면이다.

도 5는 본 발명의 실험예에 의해 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM인 이온용액으로 폴리스티렌 표면을 4번 처리하여 제조한 저용해성 비정질인산칼슘 과립위에서 1, 2일간 배양한 뼈모세포의 세포사멸정도를 보여주는 그래프이다. 그래프는 세포의 세포사멸정도가 소수성 표면(HB)보다 저용해성 비정질인산칼슘 표면(ACP)에서 2일 배양시에 낮음을 보여준다.

본 발명은 고체표면에 부착된 저용해성 비정질인산칼슘(amorphous calcium phosphate) 및 그 제조법에 관한 것이다.

체내에 존재하는 칼슘과 인산으로 구성된 인산칼슘은 생체안전성이 높아 생체재료로서 널리 쓰이고 있다. 인산칼슘은 인산칼슘결정과 비결정상인 비정질인산칼슘으로 구별된다. 인산칼슘결정은 체내조건에서 안정한 반면, 비정질인산칼슘은 체내조건에서 빠른 속도로 용해되어 제거된다. 따라서 생체재료로서 널리 사용되고있는 것은 체내에서 안정한 인산칼슘결정으로서 주로 석회화조직에 매식체로서 사용된다. 인산칼슘결정은 이상석회화 등을 유발할 수 있기 때문에 연조직에서는 사용할 수 없었다. 이에 비석회화 조직인 연조직 등에서 사용할 수 있도록 매식 후 기능을 완료한 후에는 제거될 수 있는 인산칼슘 소재의 개발이 요구되어왔다. 수 시간 혹은 수 일간 체내에 잔존할 수 있고, 기능을 수행한 후에는 제거될 수 있는 인산칼슘 소재는 연조직에서 생체안전성이 우수한 세포전달소재 혹은 약물전달소재로 널리 활용될 수 있다.

비정질인산칼슘은 칼슘이온과 인산이온의 비결정고형체으로서, 결정체가 아니기 때문에 용해도가 매우 높다. 통상적인 방법으로 제조한 비정질인산칼슘은 체액조건에서 수분 내에서 용해된다. 따라서 이와 같은 고용해성 비정질인산칼슘은 생체재료로 사용할 수 없었다. 세포부착전달체나 약물전달체로서 사용되기 위해서는 최소한 수 시간 내지 수 일간 조직내에 잔존할 수 있어야한다.

상기와 같이 종래의 비정질인산칼슘이 우수한 생체안전성이 있음에도 불구하고 생체재료로서 사용할 수 없는 이유는 높은 용해도가 문제인 점에 착안하여 본 발명자는 용해도를 감소시켜 서서히 용해될 수 있는 비정질인산칼슘을 제조할 수 있는 방법을 모색하였다. 그 결과 비정질인산칼슘을 과포화 이온용액으로 저온에서 반복 처리하면 비정질인산칼슘은 결정으로 변환하는 대신 용해도가 낮아짐을 알게되었다. 이에 본 발명의 목적은 저용해성 비정질인산칼슘 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서 제조한 용해도를 낮춘 비정질인산칼슘은 소수성 조직공학용 스캐폴드나 생체재료 표면에 대한 코팅재료로서 활용할 수 있다. 특히 세포는 소수성표면에서 세포증식률이 낮고 세포사멸률이 높기 때문에 조직공학용 스캐폴드 표면에 인산칼슘의 친수성을 부여하는 것은 조직공학용 스캐폴드 표면의 세포안정성을 높여 체 내로의 세포전달률을 획기적으로 증진시킬 수 있는 방법이 된다. 또한 비정질인산칼슘은 체내에서 결국 용해되어 제거되므로 석회화조직 뿐 만아니라 연조직에 세포를 전달할 수 있는 안전한 조직공학적 방법으로 활용될 수 있다. 또한 서서히 녹는 비정질인산칼슘은 칼슘 및 인산 이온과 제조시 함유시킬 수 있는 세포활성물질을 부변 세포에 서서히 제공할 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 비정질인산칼슘의 용해도를 낮출 수 있는 조건의 인산칼슘 이온용액을 제공하고, 이를 사용하여 고체기재표면을 저용해성 비정질인산칼슘으로 코팅하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 저용해성 비정질인산칼슘 코팅 방법에 대해 상세하게 설명한다.

1) 인산칼슘 이온용액의 제조

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인산칼슘 결정박막과정의 각 단계를 조절하기위해 다음과 같이 이미 알려진 기존 방법 (김현만, 고재승, 대한민국 특허 제 0511338 호)을 이용하여 인산칼슘 이온용액을 제조하여 사용한다. 그러나 본 발명이 기존의 방법과 다른 점은 인산칼슘 결정박막을 제조하는 기존방법과는 달리 비정질상태에서 인산칼슘 이온용액을 여러 차례 사용하여 비정질인산칼슘의 용해도 를 낮추는 점이다.

인산칼슘 이온용액은 Ca²⁺ 이온 및 PO₄ ³ ^-이온을 포함하는 모든 화합물 중에서 선택하여 제조할 수 있다. Ca²⁺ 이온을 포함하는 화합물의 일례로는 Ca(NO₃)₂ㅇ4H₂O, CaCl₂ 등에서 선택될 수 있으며, PO₄ ^3-이온을 포함하는 화합물의 일례로는 Na₂HPO₄ㅇ2H₂O, NaH₂PO₄ㅇH₂O, K₂HPO₄ㅇ3H₂O, 또는 KH₂PO₄ 등에서 선택되어 사용될 수 있다.

고체기재 표면에 비정질인산칼슘 과립을 형성하기위해 기존 방법(김현만, 고재승, 대한민국 특허 제 0511338 호)으로 인산칼슘 이온농도의 농도적이 1 ∼ 25 mM²인 인산칼슘 이온용액을 제조한다. 인산이온을 포함하는 이온용액과 칼슘이온을 포함하는 이온용액을 혼합하여 인산칼슘 이온용액을 제조한다. 이온용액을 혼합할 때, 온도는 0 ∼ 20^oC에서 수행하는데 더욱 바람직하게는 0 ∼ 10^oC에서 유지하는 것이고, 가장 바람직하게는 상기 온도 범위에서 가능한 한 낮은 온도에서 수행하여 인산칼슘 침전물의 형성을 지연시키는 것이다. 또한, 혼합시 국소적 농도증가가 증가하여 인산칼슘 침전물이 형성되지 않도록 하기 위하여, 용액의 교반방법 또는 기계적인 방법을 이용하여 혼합용액을 소량으로 분배하여 저속으로 첨가하는 방법을 사용할 수 있다. 이때, 혼합용액의 저속 첨가 및 용액의 교반은 첨가되는 이온의 확산을 촉진하여, 인산칼슘 용액의 고농도에 기인한 국소적으로 자발적인 인산칼슘 화합물 생성을 억제 또는 지연한다.

본 발명의 인산칼슘 이온용액의 제조방법 과정에서 완충용액을 사용하는 것이 균질한 인산칼슘 용액을 얻는데 바람직하며, 완충용액은 유기이온 또는 무기이온의 완충용액 모두를 사용할 수 있다. 가장 단순한 조성으로는 인산완충용액을 사용하는 것이다. 특히 생체재료와 같이 생체적합성을 고려해야하는 경우는 성분이 단순하고 생체에서 발견되는 이온으로만 제조되는 인산완충용액이 가장 바람직하다.

본 발명의 인산칼슘 이온용액의 pH는 6.8 - 8.0사이의 용액을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 pH 7.0 - 7.6 사이가 적당하며, 가장 바람직한 pH 범위는 7.2 - 7.5이다.

2) 고용해성 비정질인산칼슘 과립코팅 형성

상기 제조된 인산칼슘 이온 용액을 사용하여 비정질인산칼슘과립을 고체 기재 표면에 생성시킨다. 기재표면에 비정질인산칼슘 과립을 생성시키기 위해서는 이온용액을 승온 처리한다. 승온시작의 온도범위는 0 ^oC 이상부터 30 ^oC 이하인데, 가장 바람직한 승온시작의 온도범위는 0 ^oC ∼ 10 ^oC 의 조건이다. 승온마침의 온도범위는 8 ^oC ∼ 50 ^oC 이되, 최소한의 승온 온도는 5 ^oC 이상이다. 과립이 생성된 후 이온 용액을 제거하고 증류수로 2 - 3초간 수세하여 반응을 중단시킨다. 이 반응으로 제조한 비정질인산칼슘과립은 용해도가 매우 높다.

다음, 상기 제조된 인산칼슘 이온 용액을 다시 사용하여 표면에 기 제조된 고용해성 비정질인산칼슘과립을 처리한다. 역시 이온용액을 승온 처리한다. 승온시작의 온도범위는 0 ^oC 이상부터 30 ^oC 이하인데, 가장 바람직한 승온시작의 온도범위는 0 ^oC ∼ 10 ^oC 의 조건이다. 승온마침의 온도범위는 8 ^oC ∼ 50 ^oC 이되, 최소한의 승온 온도는 5 ^oC 이상이다. 과립이 생성된 후 이온용액을 제거하고 증류수로 2 - 3초간 수세하여 반응을 중단시킨다. 이 반응으로 처리한 비정질인산칼슘과립은 용해도가 감소한다. 필요에 따라 상기와 동일한 방법으로 인산칼슘과립을 반복처리하여 비정질인산칼슘의 용해도를 감소시킨다.

본 발명에서 저용해성 인산칼슘 코팅을 제조하기위해서는 과립주위로 자라나올 수 있는 표면결정의 모체형성과 과립자체의 결정변환을 방지하여 결정변환이 일어나지 않도록 해야한다. 결정변환이 일어나지 않도록 하는 방법은 상기 이온용액을 짧은 시간동안 저온에서 승온하여 처리하는 것이다. 처리시간은 이온용액의 pH에 의해 모니터링할 수 있다. 인산칼슘 이온의 고형질 형성반응은 pH의 저하를 가져온다. 본 발명에서 이온용액을 연속해서 승온하면 초기 반응으로는 완만하게 pH강하를 초래하고, 중기반응으로는 급격한 pH강하를 가져오고, 말기반응으로서 pH강하가 다시 완만해진다. 인산칼슘 이온용액에 의해 결정상이 생성하지 않도록하기 위해서는 매번 이온용액으로 처리할 때 마다 반응 중기의 급격한 pH 강하 이전에 반응을 중단하는 것이다. 반응을 중단시키는 pH는 높을 수록 결정변환을 억제한다. 반응을 중단하는 바람직한 pH는 7.0 이상이다.

이온용액의 반복처리에 의해 비정질인산칼슘과립은 직경이 증가한다. 과립의 밀도가 높게 형성된 경우는 이온용액의 반복처리에 의해 직경이 증가하는 인접한 과립의 융합에 의해 저용해성 비정질 박막을 제조할 수 있다. 또한 이온용액의 반복처리에 의해 비정질인산칼슘 과립에서 표면으로 비정질 꼬리가 자라나올 수 있다. 꼬리도 역시 이온용액의 반복처리에 의해 비정질상태로 용해도가 낮아진다.

본 발명의 모든 실시 형태에서 사용되는 고체기재는 비정질인산칼슘과립을 제조할 수 있도록 제공되는 표면이며, 친수성 및 소수성의 모든 표면이 가능하다. 바람직하게는 유기 폴리머, 금속, 세라믹, 유리, 동물 및 식물의 생체 조직이 있다. 유기 폴리머는 천연 또는 인공적으로 합성된 모든 폴리머가 사용 가능하며, 그 예로서 폴리스타일렌(polystyrene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락트산(polylactic acid) 및 폴리(락틴-글리콜산)(poly lactic glycolytic acid) 등이 있다. 또한 금속은 고체금속이면 모두 사용할 수 있다. 이때, 고체기재로 사용되는 물질의 기하학적 모양에도 제한이 없다. 따라서, 평판형, 원통형, 입방체, 원뿔, 각주 또는 이들의 복합 형상 등 다양한 구 조가 가능하며 상기 고체 표면은 전하를 띨 수도 있고 또는 띠지 않을 수도 있다.

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예와 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 인산칼슘 이온 용액의 제조

<실시예 1> 인산칼슘 이온용액의 제조

pH 7.4, 인산농도가 2.5 mM인 인산완충용액을 제조하였고, 빠른 속도로 교반하면서 상기 인산완충용액 20 ㎖에 칼슘이온의 최종농도가 2.5 mM 농도가 되도록 250 mM CaNO₃수용액 200 ㎕을 1.0 ℃에서 분당 200 ㎕ 속도로 첨가하였다. 상기 제조된 인산칼슘이온 용액은 사용하기 전까지 1 ℃에서 보관하였다.

2. 저용해도 비정질인산칼슘의 제조

<실시예 2> 저용해성 비정질인산칼슘 과립의 제조

직경 35 mm 소수성 폴리 스티렌 접시를 -20 ℃에서 15분간 방치하여 온도를 낮추었다. 이후 실시예 1에서 제조한 칼슘과 인산이 각각 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5 mM이고 pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 1 ℃에서 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 37 ℃ 배양기에서 40분간 방치하여 승온시켜 폴리스티렌 표면에 고용해성 비정질인산칼슘 과립을 형성시켰다. 이후 이온용액을 제거한 후 증류수로 표면을 2 - 3초간 짧게 수세하였다. 그리고 후속 반응으로서 1차 반응에서 고용해성 비정질인산칼슘 과립이 형성된 표면을 가지고 있는 접시에 1차 반응과 동일한 농도조건으로 제조한 이온용액을 동일한 방법으로 3회까지 반복 처리하여 저용해성 비정질인산칼슘 과립으로 코팅된 표면을 얻었다. 도 1은 칼슘과 인산이온의 농도가 각각 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5 mM인 인산칼슘이온용액을 4차례 까지 전 처리와 동일한 농도로 2 (2 step), 3 (3 step), 4 (4 step) 차례까지 반복해서 처리한 이후 비정질 과립이 형성된 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다. 이온용액의 농도가 높을수록 과립의 크기가 커지거나 꼬리가 형성되며, 과립의 밀도가 낮아짐을 보여준다.

<실험예 1> 생체조건과 유사한 세포배양 조건에서 저용해성 비정질인산칼슘의 용해정도 측정

실시예 2에서 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM의 조건으로 4번 처리하여 제조한 저용해성 비정질인산칼슘 과립위에 뼈모세포를 부착시키고 세포배양 용액내에서 CO₂ 항온조 내에 방치하여 95% 공기와 5%의 이산화탄소를 공급하여 37℃에서 각각 3, 6, 9, 24, 48시간동안 배양하였다. 이후 저용해성 비정질인산칼슘과립의 용해정도를 관찰하였다. 과립은 24시간까지 용해되지 않음을 알 수 있었으며 48시간에도 일부가 녹았지만 남아있는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 실시예 2의 조건의 이온용액을 폴리스티렌 표면에 1차례만 처리하여 형성시킨 고용해도 인산칼슘 과립은 세포배양 용액내에서 2 시간 이내에 용해되었다. 도 2는 주사전자현미경을 사용하여 세포배양조건에서 저용해성 비정질인산칼슘과립의 용해정도를 각 시간에 따라 관찰한 사진이다.

<실험예 2> 저용해성 비정질인산칼슘 결정박막의 제조시 이온용액 pH 변화 측정

직경 35 mm 소수성 폴리 스티렌 접시를 -20 ℃에서 15분간 방치하여 온도를 낮추었다. 이후 실시예 1에서 제조한 1 ℃의 2.0 mM, pH 7.4인 인산칼슘 이온용액을 폴리스티렌 접시에 5 ml을 붓고 37 ℃ 배양기에서 방치하여 승온시켜 폴리스티렌 표면에 인산칼슘 결정박막을 형성시켰다. 반응과정의 pH와 온도변화를 pH미터를 사용하여 측정하였다. 도 3은 이온용액의 반응시 보이는 이온용액의 pH 변화이다. 초기 반응으로는 완만하게 pH강하를 초래하고, 중기반응으로는 급격한 pH강하를 가져오고, 말기반응으로서 pH강하가 다시 완만해진다.

3. 저용해성 비정질인산칼슘에 대한 세포반응

<실험예 3> 저용해성 비정질인산칼슘의 세포부착 실험

실시예 2에서 제조한 저용해성 비정질인산칼슘의 생체적합성을 조사하기 위하여 세포부착 실험을 하였다.

실시예 2에서 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM의 조건으로 2번(ACP1) 및 4번(ACP2)처리하여 제조한 저용해성 비정질인산칼슘과립이 형성된 소수성 배양접시에 골모세포주(MC3T3-E1 osteoblast, ATCC)를 넣고 CO₂ 항온조 내에 방치하여 95% 공기와 5%의 이산화탄소를 공급하여 37℃에서 배양하였다. 1 일 후, 상기 배양접시의 표면을 위상차현미경으로 (ㅧ 200)으로 관찰하였다.

도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 소수성 표면(HB)은 세포의 부착이 불량하지만, 상기 실시예 2에서 제조된 비정질인산칼슘은 이온용액의 처리회수가 많을수록 세포를 안정하게 잘 부착시켰다, 따라서, 본 발명의 인산칼슘으로 구성된 저용해성 비정질 과립의 생체적합성을 확인하였으며, 저용해성 비정질 과립은 생체재료로 사용될 수 있다.

<실험예 4> 저용해성 비정질인산칼슘의 세포사멸(apoptosis) 억제효과 실험

실시예 2에서 제조한 저용해성 비정질인산칼슘의 생체적합성을 조사하기 위하여 세 포사멸(apoptosis) 실험을 하였다.

실시예 2에서 칼슘과 인산의 농도가 각각 2.0 mM의 조건으로 4번처리하여 제조한 저용해성 비정질인산칼슘과립이 형성된 소수성 배양접시에 골모세포주(MC3T3-E1 osteoblast, ATCC)를 넣고 CO₂ 항온조 내에 방치하여 95% 공기와 5%의 이산화탄소를 공급하여 37℃에서 배양하였다. 1, 2 일 후 세포사멸정도를 측정하였다.

도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 제조된 저용해성 비정질인산칼슘 상에서 세포는 소수성 표면에 비해 세포사멸정도가 낮아짐을 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 인산칼슘으로 구성된 저용해성 비정질인산칼슘 과립의 생체적합성을 확인하였으며, 생체재료로 사용될 수 있다.

본 발명에 의하면 인산칼슘 이온용액을 이용하여 간단히 제조할 수 있는 저용해성 비정질인산칼슘 과립은 기존의 고용해성 비정질인산칼슘보다 긴 시간동안 생체조건에서 서서히 용해되기 때문에 세포부착이 잘 일어나지 않는 표면에 코팅하여 세포부착을 도모할 수 있어서 세포의 사멸을 억제하는 등 고체기재 표면에서 세포활성을 유지하는 효과가 매우 크다. 특히 조직공학용 스캐폴드로 사용하는 재질은 대부분 소수성이기 때문에 세포부착력이 낮은데, 이와같은 소수성 표면에 친수성인 비정질인산칼슘을 도포하므로서 세포부착을 증진시킬 수 있다. 또한 서서히 녹는 비정질인산칼슘은 세포활성에 필요한 칼슘, 인산 이온을 서서히 방출하며, 비정질인산칼슘 내에 세포활성물질을 함유시켜 제조하면 용해시에 세포활성물질을 서서히 제공할 수 있는 효과가 있다.

Claims

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(1) 이온농도적이 2.25 내지 25 mM²이며 pH가 6.8 내지 8.0 인 인산칼슘 이온용액을 승온처리하므로써 고체기재 표면에 단층으로 생성시킨 비정질인산칼슘 과립을 생성시키는 단계, 및 (2) (1)에서 제조한 비정질 인산칼슘 과립을 이온농도적이 2.25 내지 25 mM²이며 pH가 6.8 내지 8.0 인 새로운 인산칼슘 이온용액과 반복적으로 반응시켜, 용해도가 낮아진 비정질 인산칼슘 과립을 생성시키는 단계를 포함하는, 저용해성 비정질인산칼슘 과립의 제조방법.
제7항에 있어서, (1) 단계에서 승온 시작의 온도 범위는 0℃ 내지 30℃이고, 승온 마침의 온도 범위는 8℃ 내지 50℃이되, 승온 온도가 5℃ 내지 50℃이하이고, (2) 단계에서 승온 시작의 온도 범위는 0℃ 내지 25℃이고, 승온 마침의 온도 범위는 8℃ 내지 45℃이되, 최소 승온 온도가 5℃ 내지 45℃이하 임을 특징으로 하는 제조 방법.
제7항에 있어서, (2) 단계에서 비정질 인산칼슘 과립의 용해도를 낮추기 위해 새로운 인산칼슘 이온용액을 반복적으로 사용하는 회수는 1회 이상 3회 이하임을 특징으로 하는 제조 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 고체기재 표면에 생성된 단층의 비정질 인산칼슘 과립.
제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 단층의 저용해성 비정질 인산칼슘 과립은 세포배양용액에서 12시간 이내에 소실되지 않는 저용해성 비정질 인산칼슘 과립.
제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체 기재가 폴리머인 제조 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 단층의 저용해성 비정질 인산칼슘 과립을 포함하는 폴리머 고체 기재.
제13항의 단층의 저용해성 비정질 인산칼슘 과립을 포함하는 폴리머 고체 기재는, 세포의 부착을 증진시키고 세포사멸을 저하시키는 단층의 저용해성 비정질 인산칼슘 과립을 포함하는 폴리머 고체 기재.