CN108339152A - 一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架及其制备方法 - Google Patents

一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种具有抑菌‑促成骨双功能的多孔微球细胞支架及其制备方法涉及生物材料领域。针对现有促进骨生成材料功能性普遍较为单一，具有抑菌和促成骨双功能的骨组织工程支架非常有限，不利于有感染危险骨缺损再生修复的现状，本发明的目的是为骨缺损再生修复提供一种具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球细胞支架。该微球由生物可降解脂肪族聚酯‑聚乙二醇两亲性嵌段共聚物多孔微球及其表面依次负载的聚多巴胺、银纳米粒子和羟基磷灰石构成，其表面有利于细胞的粘附和增殖，其负载的银纳米粒子提供抑菌活性，其负载的羟基磷灰石提供成骨活性，是一种可注射的骨缺损再生修复材料。

Description

一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物材料领域，涉及一种骨再生修复材料及其制备方法，特别涉及一种具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球细胞支架及其制备方法。
背景技术
近年来，由肿瘤切除、创伤、感染以及先天畸形导致的骨缺损日益增多，每年成千上万的发病率急需先进的生物医用材料来满足相关治疗需求。相对于骨移植治疗的种种不足，骨组织工程提供了一种非常有前景的修复策略。然而，骨缺损再生修复在局部存在发生感染的潜在危险，或者对已经有感染存在骨缺损(如一些口腔环境下的骨缺损)的再生修复，这些都可能给临床治疗带来严峻的挑战。骨组织工程的要素之一是支架材料，为细胞粘附、增殖和分化提供适宜的微环境。目前，研究促进骨生成材料的报道很多，关于局部控制释放抗生素药物的报道也不少，但是具有抑菌和促成骨双功能的骨组织工程支架非常有限。
生物可降解微球多用于药物控释体系，但粒径范围、表面性质合适的生物可降解微球，也可以作为一类细胞培养的微载体。得益于脂肪族聚酯的生物可降解性和生物相容性，得益于微球的可注射性，负载细胞的聚酯微球可以采用微创手术直接注射到骨缺损部位进行诱导再生修复。为了获得满意的骨缺损再生修复效果，聚酯微球作为骨组织工程细胞支架必须能够提供细胞粘附和增殖的表面，能够为细胞成骨分化提供促成骨生物活性成分，能够具有一定抑菌能力，预防或对抗缺损部位可能发生或存在的感染。但截至目前，尚未见有此类多功能微球细胞支架及其制备方法的报导。
生物可降解聚酯微球一般采用乳液法制备，生物活性成分如生长因子骨形态发生蛋白，可以通过内水相引入到微球中。虽然这样制备得到的微球也表现出良好的促成骨活性，但生长因子在包埋过程中的失活往往是不可避免的，生物利用度较低。考虑到天然骨中存在的大量羟基磷灰石成分，采用生物矿化在聚酯微球上沉积羟基磷灰石被认为是更简单有效的途径。而抗菌功能微球的制备，通常有两种途径：一是将抗菌类药物如万古霉素包埋到微球中，通过缓释获得抑菌能力；二是将抗菌成分如抗菌多肽和纳米银负载到微球表面获得抑菌能力。
因此，如何通过微球制备方法的改进，获得一种细胞亲和性好、同时具有抑菌和促成骨分化功能的多孔微球，对于发展可注射细胞支架用于促进骨再生修复，尤其是促进有感染危险的骨缺损再生修复，具有显著的意义。
发明内容
针对现有促进骨生成材料功能性普遍较为单一，具有抑菌和促成骨双功能的骨组织工程支架非常有限，不利于有感染危险骨缺损再生修复的现状，本发明的目的是为骨缺损再生修复提供一种具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球细胞支架。这种双功能的多孔微球细胞支架是采用脂肪族聚酯-聚乙二醇两亲性嵌段共聚物，通过水包油包水(W1/O/W2)双乳液-溶剂挥发技术制备得到多孔微球后，再在其表面依次负载具有抑菌功能的银纳米粒子和具有促成骨活性的羟基磷灰石。这种新型的多孔微球细胞支架具有可调控的生物可降解速度、抑菌能力，具有优异的促细胞粘附、增殖和成骨分化特性，作为细胞载体，可与其表面粘附生长的细胞一起注射到体内骨缺损部位，随着骨组织再生，微球支架逐渐降解被机体吸收让位于新生组织。该多孔微球细胞支架由其抑菌能力带来的潜在细胞毒性问题，可由银纳米粒子负载量的合理控制来避免。本发明同时提供一种具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球细胞支架的制备方法。
本发明的一种具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，具体通过以下步骤实现：
(1)将脂肪族聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物溶于二氯甲烷，得到浓度为10-100mg/ml的溶液A。
(2)向步骤(1)配置的溶液A中加入0.05-0.10g司班80和1-5ml去离子水，200-400W超声处理3-10分钟，得到油包水(W1/O)乳液B。
(3)将0.05-0.10g表面活性剂吐温60，1-5g稳定剂和300ml去离子水混合配置得到溶液C，于100-500rpm搅拌下，向此溶液C中滴加步骤(2)制备得到的乳液B，滴加完毕后，在室温下继续搅拌4-8h至二氯甲烷完全挥发后，停止搅拌，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集硬化成型的微球，去离子水洗涤3-5次后，得到生物可降解多孔微球I。
(4)配置0.5-2mg/ml的多巴胺水溶液，调控pH范围为7.2-8.5，将步骤(3)得到的多孔微球I悬浮于其中，室温反应12-48h后，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集微球，去离子水洗涤3-5次后，得到聚多巴胺包覆改性的生物可降解多孔微球II。
(5)避光配置1-5mg/ml的硝酸银水溶液，将步骤(4)得到的多孔微球II悬浮于其中，室温反应2-6h后，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集微球，去离子水洗涤3-5次后，得到负载银纳米粒子的生物可降解多孔微球III。
(6)配置一定浓度的模拟体液，将步骤(5)得到的多孔微球III悬浮于其中，根据模拟体液的浓度，体系在37℃反应3h-7天后，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集微球，去离子水洗涤3-5次后，得到具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球。
制备步骤(1)中所述的脂肪族聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物，可以是聚酯-聚乙二醇两嵌段共聚物和聚酯-聚乙二醇-聚酯三嵌段共聚物中的一种，脂肪族聚酯可以是聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯及它们的共聚物中的任一种。
制备步骤(1)中所述的脂肪族聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物，选取的聚合物分子量范围为5-15万，聚合物溶液浓度为50mg–200mg/ml，其中，聚乙二醇嵌段的分子量范围为2000-6000，脂肪族聚酯嵌段的分子量范围为20000-50000。
制备步骤(2)中所述表面活性剂司班80，其添加量为0.05-0.10g
制备步骤(2)中所制备的油包水(W1/O)乳液B，水相与油相体积比为1:10，选取的的超声处理功率为200-400W，超声时间为3-10分钟。
制备步骤(3)中所述表面活性剂吐温60，其添加量为0.05-0.10g。
制备步骤(3)中所述稳定剂，为明胶、聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮中的一种，其浓度范围为10mg-100mg/ml。
制备步骤(4)中所述多巴胺水溶液，多巴胺浓度为0.5-2mg/ml，溶液pH值为8.5，反应时间为24h。
制备步骤(5)中所述硝酸银水溶液，硝酸银浓度为1-5mg/mL，反应时间为4h。
制备步骤(6)中所述模拟体液，其浓度可以是标准模拟体液(ISO 23317-2007)的1-10倍，优化的生物矿化条件为5倍浓度的标准模拟体液，矿化时间为24h。
由上述方法制备的生物可降解微球，其粒径控制在50-500um，具有规则的球形，表面微孔的孔径范围为1-30um，微球表面同时负载有具有抑菌能力的银纳米粒子和具有促成骨能力的羟基磷灰石，具有良好的可注射性，可作为微球细胞支架应用。
发明效果
本发明所制备的具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球，是一种有机-无机复合微球，能提供利于细胞粘附和增殖的表面。一般而言，采用水包油包水双乳液法制备的疏水性脂肪族聚酯微球，其表面是光滑的，而在本发明中，采用脂肪族聚酯-聚乙二醇两亲性嵌段共聚物，所制备的微球具有微孔表面。这是由于聚乙二醇链段具有的水亲和能力，使微球在溶剂挥发过程中呈溶胀状态，冷冻干燥后冰晶的致孔作用使得微球表面呈现多孔形态结构，利于营养物质和细胞代谢产物的交换，利于细胞粘附和增殖。
本发明所制备的具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球，其抑菌效果是由在多孔微球表面负载一定量的银纳米粒子来实现的，而银纳米粒子的负载是通过微球表面聚多巴胺包覆层的邻苯二酚还原硝酸银来实现的，无需引入额外的还原试剂。天然粘附分子多巴胺在室温、pH 8.5的水溶液中非常容易自聚合，通过其粘附特性很容易在微球表面形成包覆，制备方法简单有效。该聚多巴胺表面层，不仅提供了还原硝酸银的官能团，同时其自身也能促进细胞的粘附和增殖。本发明微球的抑菌能力，可由引入银纳米粒子的量来调控，在合适的负载量下，既能获得显著的抑菌活性，其能杀死90％以上的细菌；又不会引起明显的细胞毒性，细胞存活率在95％以上。
本发明所制备的具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球，其促成骨活性主要得益于微球表面生物矿化沉积的羟基磷灰石。利用聚多巴胺包覆层提供的官能团，诱导模拟体液中钙离子和磷酸根离子在微球表面成核，模拟生物矿化过程得到的羟基磷灰石，具有与天然骨矿相似的化学组成和结晶结构，表现出优异的促BMSCs粘附、增殖和促成骨分化的活性。其中，成骨相关的碱性磷酸酶蛋白表达高达15ug/mg protein，I型胶原蛋白表达高达9ug/mg protein。
本发明所制备的具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球，具有多重可设计性，不仅可提供利于细胞粘附和增殖的表面，赋予抑菌和促成骨双功能，其降解速率还由所选用脂肪族聚酯的化学组成和分子量决定，其微球表面孔隙率和孔径由嵌段共聚物中脂肪族聚酯和聚乙二醇的比例调控。同时，这种多孔微球作为细胞支架，可单独注射使用，也可在体外与成骨相关类细胞共培养得到微球/细胞复合物直接注射到骨缺损部位。根据骨缺损所在部位或形状对微球或微球/细胞复合物局部填充的需求，用于注射的液体载体可以考虑是平衡盐溶液、细胞培养基，或者是可注射水凝胶材料，不仅避免开放性手术，还能更好地满足缺损部位对修复材料的要求。
以下结合具体实施方式对本发明的内容进行详细说明，但本发明并不限于以下这些实例，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
附图说明：
图1水包油包水(W1/O/W2)双乳液法制备的聚左旋丙交酯-聚乙二醇-聚左旋丙交酯三嵌段共聚物多孔微球。
图2同时负载银纳米粒子和羟基磷灰石的具有抑菌和促成骨分化双功能多孔微球。
实施例1
(1)将聚乙二醇嵌段分子量为2000和聚左旋丙交酯嵌段分子量20000的聚左旋丙交酯-聚乙二醇-聚左旋丙交酯三嵌段共聚物2g，溶于20ml二氯甲烷，加入0.05g司班80，然后加入2ml去离子水，于200W下超声3分钟得到油包水(W1/O)乳液A；
(2)配置浓度为10mg/ml的聚乙烯醇水溶液300ml，加入0.1g的吐温60，然后在500rpm搅拌速度下，将乳液A加入到加了0.1g吐温60的聚乙烯醇水溶液中，得到水包油包水(W1/O/W2)双乳液，持续搅拌时间4h，待二氯甲烷挥发完全后进行离心分离，得到的微球经去离子水洗涤后，冷冻干燥得到生物可降解多孔微球I(附图1)；
(3)配置浓度为2mg/ml的多巴胺水溶液，并调节溶液pH值为8.5，然后将步骤(2)制备的多孔微球I悬浮于其中，于室温反应24h后，在4000rpm下离心10分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，得到聚多巴胺包覆改性的生物可降解多孔微球II；
(4)避光配置1mg/ml的硝酸银水溶液，将步骤(3)制备的多孔微球II悬浮于其中，室温反应6h后，在4000rpm下离心10分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，得到负载银纳米粒子的生物可降解多孔微球III；
(5)配置标准模拟体液的5倍浓度模拟体液，(以下实施例的表述类似)具体操作为向恒温37℃的1000ml去离子水中，加入NaCl 39.98g，NaHCO3 1.764g，KCl 1.118g，K2HPO4·3H2O 1.141g，MgCl2·6H2O 1.5225g，Na2SO4 0.355g和Tris 10g，用1mol/L盐酸调节溶液pH至6.0后加入CaCl2 1.1375g，然后将步骤(4)制备的多孔微球III悬浮于其中，体系在37℃反应12h后，在4000rpm下离心10分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，冷冻干燥得到具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球(附图2)。
实施例2：
(1)将聚乙二醇嵌段分子量为6000和聚左旋丙交酯嵌段分子量50000的聚左旋丙交酯-聚乙二醇-聚左旋丙交酯三嵌段共聚物2g，溶于20ml二氯甲烷，加入0.10g司班80，然后加入2ml去离子水，于200W下超声3分钟得到油包水(W1/O)乳液B；
(2)配置浓度为30mg/ml的明胶水溶液300ml，加入0.05g的吐温60水溶液，然后在500rpm搅拌速度下，将乳液B加入混合了0.05g吐温60的明胶水溶液中，得到水包油包水(W1/O/W2)双乳液，持续搅拌时间6h，待二氯甲烷挥发完全后进行离心分离，得到的微球经去离子水洗涤后，冷冻干燥得到生物可降解多孔微球IV；
(3)配置浓度为2mg/ml的多巴胺水溶液，并调节溶液pH值为8.5，然后将步骤(2)制备的多孔微球IV悬浮于其中，于室温反应24h后，在4000rpm下离心10分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，得到聚多巴胺包覆改性的生物可降解多孔微球V；
(4)避光配置3mg/ml的硝酸银水溶液，将步骤(3)制备的多孔微球V悬浮于其中，室温反应6h后，在4000rpm下离心10分钟收集微球，去离子水洗涤5次后，得到负载银纳米粒子的生物可降解多孔微球VI；
(5)配置5倍模拟体液，具体操作为向恒温37℃的1000ml去离子水中，加入NaCl39.98g，NaHCO3 1.764g，KCl 1.118g，K2HPO4·3H2O 1.141g，MgCl2·6H2O 1.5225g，Na2SO4 0.355g和Tris 10g，用1mol/L盐酸调节溶液pH至6.0后加入CaCl2 1.1375g，然后将步骤(4)制备的多孔微球VI悬浮于其中，体系在37℃反应12h后，在4000rpm下离心20分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，冷冻干燥得到具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球。
实施例3：
(1)将聚乙二醇嵌段分子量为4000和聚己内酯嵌段分子量30000的聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯三嵌段共聚物1g，溶于20ml二氯甲烷，加入0.10g司班80，然后加入2ml去离子水，于200W下超声5分钟得到油包水(W1/O)乳液C；
(2)配置浓度为100mg/ml的聚乙烯醇水溶液200ml，加入0.10g的吐温60，然后在300rpm搅拌速度下，将乳液A加入到加了0.10g吐温60的聚乙烯醇水溶液中，得到水包油包水(W1/O/W2)双乳液，持续搅拌时间4h，待二氯甲烷挥发完全后进行离心分离，得到的微球经去离子水洗涤后，冷冻干燥得到生物可降解多孔微球VII；
(3)配置浓度为1mg/ml的多巴胺水溶液，并调节溶液pH值为8.5，然后将步骤(2)制备的多孔微球VII悬浮于其中，于室温反应24h后，在4000rpm下离心15分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，得到聚多巴胺包覆改性的生物可降解多孔微球VIII；
(4)避光配置1mg/ml的硝酸银水溶液，将步骤(3)制备的多孔微球VIII悬浮于其中，室温反应6h后，在4000rpm下离心15分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，得到负载银纳米粒子的生物可降解多孔微球IX；
(5)配置1.5倍模拟体液，具体操作为向恒温37℃的1000ml去离子水中，加入NaCl11.994g，NaHCO3 0.525g，KCl 0.336g，K2HPO4·3H2O 0.342g，MgCl2·6H2O 0.458g，Na2SO40.107g和Tris 9.086g，用1mol/L盐酸调节溶液pH至6.5后加入CaCl2 0.417g，最后再用少量Tris将溶液pH调至7.0，将步骤(4)制备的多孔微球IX悬浮于其中，然后将体系在37℃反应72h后，在4000rpm下离心10分钟收集微球，去离子水洗涤3次后，冷冻干燥得到具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球。

Claims (7)

1.一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架，其特征在于：该微球由生物可降解脂肪族聚酯-聚乙二醇两亲性嵌段共聚物多孔微球及其表面依次负载的聚多巴胺、银纳米粒子和羟基磷灰石构成，其表面有利于细胞的粘附和增殖，其负载的银纳米粒子提供抑菌活性，其负载的羟基磷灰石提供成骨活性，是一种可注射的骨缺损再生修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，其特征是采用水包油包水双乳液方法结合表面改性技术，通过以下步骤完成：
(1)将脂肪族聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物0.5g溶于5-50ml二氯甲烷中，得到溶液A；
(2)向步骤(1)配置的溶液A中加入0.05-0.10g的表面活性剂司班80和1-5ml去离子水，200-400W超声处理3-10分钟，得到油包水乳液B；
(3)将0.05-0.10g吐温60，1-5g的稳定剂和300ml去离子水混合配置得到溶液C，于100-500rpm搅拌下，向此溶液C中滴加步骤(2)制备得到的乳液B，滴加完毕后，在室温下继续搅拌4-8h至二氯甲烷完全挥发后，停止搅拌，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集硬化成型的微球，去离子水洗涤3-5次后，得到生物可降解多孔微球I；
(4)配置0.5-2mg/ml的多巴胺水溶液，调控pH范围为7.2-8.5，将步骤(3)得到的多孔微球I悬浮于其中，室温反应12-48h后，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集微球，去离子水洗涤3-5次后，得到聚多巴胺包覆改性的生物可降解多孔微球II；
(5)避光配置1-5mg/ml的硝酸银水溶液，将步骤(4)得到的多孔微球II悬浮于其中，室温反应2-6h后，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集微球，去离子水洗涤3-5次后，得到负载银纳米粒子的生物可降解多孔微球III；
(6)配置模拟体液，其浓度是标准模拟体液的1-10倍；将步骤(5)得到的多孔微球III悬浮于其中，根据模拟体液的浓度，体系在37℃反应3h-7天后，在3000-4000rpm下离心10-20分钟收集微球，去离子水洗涤3-5次后，得到具有抑菌和促成骨分化双功能的多孔微球。
3.根据权利要求2所述的一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，其特征是步骤(1)中的脂肪族聚酯-聚乙二醇嵌段共聚物，是聚酯-聚乙二醇两嵌段共聚物和聚酯-聚乙二醇-聚酯三嵌段共聚物中的一种，脂肪族聚酯是聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯及它们的共聚物中的任一种，嵌段共聚物分子量范围为5-15万，其中，聚乙二醇嵌段分子量范围为2000-6000，脂肪族聚酯嵌段分子量范围为20000-50000，共聚物溶液浓度为10-100mg/ml。
4.根据权利要求2所述的一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，其特征是步骤(3)中的稳定剂为明胶、聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮中的一种，其浓度范围为10-100mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，其特征是步骤(4)中的多巴胺水溶液，选取的多巴胺浓度为0.5-2mg/ml，溶液pH值为8.5，反应时间为24h。
6.根据权利要求2所述的一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，其特征是步骤(5)中的硝酸银水溶液，选取的硝酸银浓度为1-5mg/mL，反应时间为4h。
7.根据权利要求2所述的一种具有抑菌-促成骨双功能的多孔微球细胞支架的制备方法，其特征是步骤(6)中的模拟体液，其浓度是标准模拟体液的5倍浓度。
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