JP2002519051A - ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質 - Google Patents

ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、脂肪酸アシルおよびジアシルグリセロール基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）タンパク質を提供する。1つの態様においては、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGATタンパク質が単離されており、これらはSDS-PAGEによる測定で約36〜37kDaの分子量を有する。本発明はまた、新規DAGATポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、および組換え技術を用いるそのようなポリペプチドの製造方法を提供する。さらに、植物におけるトリアシルグリセロールレベルを変化させるための及びDAGATの活性または発現の変化に関連した疾患を治療するための、そのような配列の使用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、酵素、そのような酵素の精製および入手方法、それに関連したアミ
ノ酸および核酸配列、ならびに遺伝子工学の用途におけるそのような組成物の使
用方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） トリアシルグリセロール（TAG）は、細胞にとって最も重要なエネルギー貯蔵
体であると考えられている。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは
、TAGの構造を調節しTAGの合成を導くと考えられる酵素である。DAGATにより触
媒される反応は、グリセロ糖脂質の生合成における決定的な分岐点で生じる。そ
のような分岐点における酵素は代謝調節部位の主要な候補とみなされている。ジ
アシルグリセロール、TAGおよび膜脂質の合成に共通したいくつかの酵素が存在
するが、DAGAT反応は油合成に特異的である。
【０００３】 植物においては、TAGは、種子発芽中に利用されるエネルギー貯蔵形態として
種子により用いられる植物油の主要成分である。高等植物は、共通の代謝経路に
より油を合成するらしい。脂肪酸は、一括して脂肪酸合成酵素（FAS）として公
知の酵素に触媒される一連の反応を介してアセチル-CoAから色素体内で産生され
る。色素体内で産生された脂肪酸は、細胞のサイトゾル画分に輸出され、補酵素
Aに対してエステル化される。これらのアシルCoAは、小胞体（ER）内でのグリセ
ロ脂質合成の基質である。グリセロ脂質合成自体は、まずホスファチジン酸（PA
）およびジアシルグリセロール（DAG）に導く一連の反応である。これらの代謝
中間体はいずれも、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルエタノ
ールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（PC）などの膜リン脂質に導かれるか
、または中性トリアシルグリセロール（TAG）の形成に導かれうる。
【０００４】 ジアシルグリセロール（DAG）は、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェ
ラーゼ（G3PAT）およびリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT
）により逐次的に触媒されてPAを与える2工程、およびそれに続く、ホスファチ
ジン酸ホスファターゼ（PAP）により触媒されてDAGを与える追加的な加水分解工
程で、グリセロール-3-リン酸および脂肪酸アシル-CoAから合成される。ほとん
どの細胞において、DAGは膜リン脂質を産生するのに用いられ、第1工程は、CTP
ホスホコリンシチジルトランスフェラーゼにより触媒されるPCの合成である。貯
蔵油を産生する細胞において、DAGは、ジアシルグリセロールアシルトランスフ
ェラーゼ（DAGAT）により触媒される反応において第3の脂肪酸でアシル化される
。総合すると、これらの反応は、ケネディー経路と一般に称されるものの一部を
構成する。
【０００５】 TAGの構造は、脂肪酸の位置特異性に関しては、脂肪酸アシルCoAおよびグリセ
ロールバックボーン基質に対する3つの各アシルトランスフェラーゼの特異性に
より定められる。したがって、例えば、多数の温帯種の種子に由来するアシルト
ランスフェラーゼは、sn-1またはsn-3位には飽和または不飽和脂肪酸を許容する
が、sn-2には不飽和脂肪酸しか許容しない傾向がある。sn-2における不飽和脂肪
酸に対する絶対的特異性はLPAAT酵素の基質優先性により定められる。ココアな
どのいくつかの種においては、sn-1位が飽和脂肪酸にエステル化される場合には
sn-3位が飽和脂肪酸でアシル化される見掛け上の優先性が存在する点で、この傾
向が更に保有されていることが、TAG組成から示唆される。例えば、SUS形態（S=
飽和脂肪酸およびU=不飽和脂肪酸）の構造化（structured）TAGの割合は、sn-2
位を不飽和脂肪酸に固定した場合の全脂肪酸組成に基づくランダムな分布から予
想される割合より高い。このことはまた、DAGATが、TAGの合成の制御とまではい
かなくともTAGの構造の調節において重要な役割を果たしていることを示唆して
いる。
【０００６】 油が産生されるよう脂肪酸がグリセロールバックボーン中に取込まれる際に表
現型に影響を及ぼしうる核酸配列を得ることは、種々の障害にさらされる。その
ような障害には、関心のある代謝因子の同定、有用な速度論的パラメーターを有
するタンパク質源の選択および特徴づけ、アミノ酸配列決定を可能にするレベル
までの関心のあるタンパク質の精製、所望のDNA配列を回収するためのプローブ
として使用しうる核酸配列を得るためのアミノ酸配列データの利用、および構築
物の調製、形質転換および得られた植物の分析が含まれるが、これらに限定され
るものではない。
【０００７】 したがって、酵素標的の同定、および油の構造および量を修飾しうるそのよう
な酵素標的の核酸配列の有用な組織源の同定が必要とされている。理想的には、
酵素標的は、単独で又は他の核酸配列（これは、油産生の増加／減少、TAGの構
造、脂肪酸プール中の不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率、および／または
該脂肪酸プールの修飾から生じた他の新規油組成物に関連したものである）と組
合せて、1以上の用途に適用可能なものとなろう。
【０００８】 例えば、いくつかの場合には、種子荒粉に対する油の比率がより高い油料種子
を得るのが、より低いコストで所望の油を得るために有用であろう。これは、高
価な油製品に典型的なことであろう。あるいは、そのような油料種子は、より優
れた動物用飼料となるかもしれない。いくつかの場合には、種子荒粉に対する油
の比率がより低い油料種子を得るのが、カロリー含量を低下させるために有用で
あろう。他の用途においては、心臓血管の健康上の理由から、不飽和脂肪酸の比
率がより高い食用植物油が望ましい。あるいは、ヤシ、ココナッツ、ココアなど
の高不飽和熱帯油の温帯産代替物も、種々の産業的および食用用途において有用
であろう。
【０００９】 哺乳動物においては、DAGATは、細胞ジアシルグリセロールの代謝において重
要な役割を果たし、腸脂肪吸収、リポタンパク質集合、脂肪組織形成および乳汁
分泌を含むトリアシルグリセロール代謝に関わる過程において重要である。その
ため、DAGATタンパク質の及びポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の同定
および単離が望まれている。
【００１０】 DAGATを単離するためのいくつかの推定的方法が公開されている。Polokoffお
よびBell (1980) は、ラット肝臓ミクロソームからのDAGATの部分精製および可
溶化を報告している。この調製物は、活性をもたらす特異的タンパク質因子を同
定するのに十分なほどには純粋でなかった。KwanyuenおよびWilson (1986, 1990
) は、ダイズ子葉からの該酵素の精製および特徴づけを報告している。しかしな
がら、その分子量（1843kDa）は、この調製物が十分には可溶化されず、それに
含まれるDAGATタンパク質が多数のタンパク質の大きな凝集体の一部であったこ
とを示唆している。Littleら (1993) は、菜種の小胞子由来の胚からのDAGATの
可溶化を報告しているが、KwanyuenおよびWilsonの場合と同様、活性関連物質の
分子量が大きすぎるため、完全な可溶化が生じたとは考えにくい。Anderssonら
(1994) は、ラット肝臓からのDAGATの可溶化および415倍の精製（イムノアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用するもの）を報告している。しかしながら、
彼らが使用した抗体がDAGATエピトープを認識するという証拠も、彼らが精製し
たタンパク質が本当にDAGATだという証拠も存在しない。実際のところ、Kwanyue
nおよびWilsonの場合と同様、彼らの調製物におけるDAGAT活性は、凝集した膜タ
ンパク質に典型的な分子量を示した。最後に、Kamisakaら (1993, 1994, 1996,
1997) は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella rammaniana）からのDA
GATの可溶化およびそれに続く、均質になるまでの精製を報告している。彼らは
、この真菌種から可溶化されたDAGATがSDS-PAGEで53kDaの見掛け分子量を有する
と示唆している。しかしながら、後記実施例4に示すとおり、Kamisakaらのプロ
トコールを用いて得られた画分は、DAGAT活性と相関する十分な量の53kDaポリペ
プチドを与えなかった。
【００１１】 （発明の概要） 本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）、特に
、DAGATポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明のポリペプチド
およびポリヌクレオチドは、植物、ヒトを含む哺乳類、線虫および真菌に由来す
るものを含む。
【００１２】 もう1つの態様において、本発明は、SDS-PAGE分析で約36kDaおよび37kDaの分
子量、特に36kDaおよび36.5kDaの分子量を有するDAGATタンパク質を提供する。
本発明の好ましいDAGATタンパク質はモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierel
la ramanniana）から入手可能である。
【００１３】 もう1つの態様において、本発明は、DAGATタンパク質に由来するオリゴヌクレ
オチド、および部分的または完全なDAGATコード配列を含むオリゴヌクレオチド
に関する。
【００１４】 DAGATの転写または転写・翻訳（発現）に使用しうる組換えDNA構築物を提供す
ることも、本発明の1つの態様である。特に、植物および哺乳類宿主細胞内で転
写または転写・翻訳されうる構築物を提供する。特に、好ましい構築物は、植物
細胞内で転写または転写・翻訳されうる構築物である。
【００１５】 本発明のもう1つの態様において、宿主細胞またはその子孫細胞内でのDAGATの
製造方法を提供する。特に、宿主細胞を、DAGATの転写または転写・翻訳に使用
しうるDNA構築物で形質転換またはトランスフェクトする。DAGATを含有する組換
え細胞も本発明の一部である。
【００１６】 もう1つの態様において、本発明は、油以外の構成成分に対する油の比率を修
飾するための、およびトリグリセリド分子の組成および／または構造（特に、油
料種子作物の種子油におけるもの）を修飾するための、ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチド配列の使用方法に関する。そのような修飾されたトリグリセリドを
有する植物細胞も本発明に含まれる。
【００１７】 植物DAGATタンパク質の発現により得られた修飾植物、種子および油も、本発
明の一部とみなされる。
【００１８】 もう1つの態様において、本発明は、哺乳動物におけるそのようなポリペプチ
ドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。そのような方法は、DAGAT活性
に関連した疾患細胞、例えば、変化したジアシルグリセロール濃度またはプロテ
インキナーゼC活性に関連した疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬
化症など（これらに限定されるものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス
（adipocytosis）；白血病および皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常
な脂質代謝に関連した疾患；異常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関
連した疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない]を治療または改善
することを含む。また、DAGAT活性のレベルを変化させるための方法を提供する
。
【００１９】 本発明のもう1つの態様においては、DAGATのアゴニストおよびアンタゴニスト
／インヒビターを同定するための方法、ならびにそのようなアゴニストまたはア
ンタゴニストで、DAGAT活性に関連した状態を治療し又はDAGAT活性のレベルを変
化させるための方法を提供する。
【００２０】 DAGAT活性のレベルの変化を検出するための及びDAGAT活性に関連した状態を診
断するための診断アッセイを提供することも、本発明の1つの態様である。
【００２１】 （図面の簡単な説明） 図1は、イエロー（Yellow）86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマン
ニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示
す。 図2Aは、ヘパリンセファロース（Heparin Sepharose）CL6Bのカラム上のイエ
ロー86-アガロースカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella r
amanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図2Bは、ヘパリンセ
ファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは
銀染色により検出されている。 図3Aは、75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロー
スカラム上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロース（Heparin
Sepharose）CL6Bのカラムの第2活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナ
（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図3
Bは、イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク
質のバンドは銀染色により検出されている。 図4は、イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ（Mo
rtierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。 図5Aは、ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガ
ロースカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）
DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図5Bは、ヒドロキシアパタイト
カラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検
出されている。 図6は、DAGAT精製プロトコールによるカラム画分におけるモルティエレラ・ラ
マンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性の分析の結果を示す。図6Aは
、タンデム（縦列）イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィーの結果を示す。図6Bは、該タンデムクロマトグラフィーからのピーク画
分のSDS-PAGE分析の結果を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出されて
いる。 図7Aおよび7Bは、イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィーにより精製した脂肪体画分の高塩および低塩調製物のSDS-PAGE分析を示
す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。 図8Aは、イエロー86-アガロースおよびヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）
上でのクロマトグラフィー後のヘパリンカラムからのモルティエレラ・ラマンニ
アナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す
。図8Bは、ヘパリンカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバン
ドは銀染色により検出されている。 図9は、イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ（Mo
rtierella ramanniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。 図10Aは、ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガ
ロースカラムからプールしたモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella rama
nniana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図10Bは、ヒドロキシア
パタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染色
により検出されている。 図11Aは、ヘパリンセファロースCL6Bのカラム上のヒドロキシアパタイトカラ
ムからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT活性
のクロマトグラフィーの結果を示す。図11Bは、ヘパリンセファロースCL6Bカラ
ムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシーブルー染
色により検出されている。 図12Aは、75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロ
ースカラム上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロースCL6Bカラ
ムの第1活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanni
ana）DAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。図12Bは、イエロー86-アガ
ロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドはクーマシ
ーブルー染色により検出されている。 図13は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）において
同定した2つのDAGATタンパク質のタンパク質アライメントを示す。36kDa候補体
については完全長タンパク質配列が示されており、36.5kDaタンパク質について
は部分配列が示されている。 図14は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）において
同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFAST
BACベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜上のDAGAT活性データを示す。
【００２２】 図15は、酵母およびシー・エレガンス（C. elegans）由来のDAGATホモログのD
NA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細
胞から単離した膜上のDAGAT活性データを示す； 図16は、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）において
同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列を含有するpFASTBACベクターまたは空pFAST
BACベクターに感染した昆虫細胞内の相対トリアシルグリセロール含量を示す。
【００２３】 （発明の詳細な記載） 本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（本明細書におい
てはDAGATと称される）、特に、単離されたDAGATタンパク質、および該DAGATタ
ンパク質をコードする核酸配列に関する。本発明のジアシルグリセロールアシル
トランスフェラーゼは、酵素反応条件下で1,2-ジアシルグリセロールおよび脂肪
酸アシル基質からトリアシルグリセロール産生を触媒する能力を示す、細胞源か
ら入手可能な任意の核酸配列コード化アミノ酸（例えば、タンパク質、ポリペプ
チドまたはペプチド）を含む。「酵素反応条件」は、該酵素が機能するのを可能
にする環境（すなわち、温度、pH、阻害物質の欠如などの要因）において、任意
の必要な条件が利用可能であることを意味する。
【００２４】 単離されたタンパク質、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド 本発明の第1の態様は、単離されたDAGATタンパク質に関する。本発明で用いる
「単離（された）」なる語は、「人間の手により」その天然状態から改変されて
いることを意味する。例えば、それが天然に存在する場合には、それは、その元
の環境から変化している若しくは取り出されている又はその両者に付されている
。例えば、生きた生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は「単離」されていないが、その天然状態の物質から分離された同じポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドは「単離」されている。特に、SDS-PAGE分析で約36kD
a〜約37kDaの分子量を有するDAGATタンパク質を同定した。特に、約36kDaおよび
36.5kDaの分子量を有しモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramannian
a）から入手可能なDAGATタンパク質を提供する。さらに、該DAGATタンパク質は
可溶化されている。「可溶化」は、膜に結合していない酵素に典型的な様態で挙
動するようDAGAT酵素を膜から抽出することを意味する。
【００２５】 本発明のDAGATタンパク質は、宿主細胞内の種々のアシル基質（脂肪酸アシル-
CoAおよび脂肪酸アシル-ACP分子を含む）を利用しうる。また、DAGATは、ある種
の分子に対して優先的な活性を示しうるが、DAGATが作用するアシル基質は種々
の炭素鎖長および飽和度を有しうる。
【００２６】 本発明のもう1つの態様はDAGATポリペプチドに関する。そのようなポリペプチ
ドは、配列表に記載の単離されたポリペプチドならびにそれらのポリペプチドお
よび断片、特に、DAGAT活性を示すポリペプチド、また、配列表に記載の配列の
群から選ばれるポリペプチド配列に対して少なくとも50％、60％または70％の同
一性、好ましくは少なくとも80％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同
一性、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有するポリペプチドを含み、そ
のようなポリペプチドの一部（該ポリペプチドの一部は、好ましくは少なくとも
30アミノ酸を含み、より好ましくは、少なくとも50アミノ酸を含む）も含む。
【００２７】 「同一性」は、当技術分野でよく知られているとおり、配列の比較により決定
される2以上のポリペプチド配列または2以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
ある。また、当技術分野においては、「同一性」は、一連のそのような配列間の
マッチにより決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連
性の度合を意味する。「同一性」は、Computational Molecular Biology, Lesk,
A.M.編, Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informa
tics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993;
Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.およびGriffin,
H.G.編, Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular
Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Prime
r, Gribskov, M.およびDevereux, J.編, Stockton Press, New York (1991);な
らびにCarillo, H.およびLipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1988)に
記載の方法を含む（これらに限定されるものではない）公知方法により容易に計
算することができる。同一性の決定方法は、試験する配列間で最大のマッチを与
えるように設計する。さらに、同一性の決定方法は、公的に利用可能なプログラ
ムにおいてプログラミングされている。2つの配列間の同一性の決定に使用しう
るコンピュータープログラムには、GCG（Devereux, Jら, Nucleic Acids Resear
ch 12(1):387 (1984); 5つのBLASTプログラム1式 [そのうちの3つはヌクレオチ
ド配列の照会用に設計されたものであり（BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX）、2つ
はタンパク質配列の照会用に設計されたものである（BLASTPおよびTBLASTN）]（
Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birrenら, Genome Anal
ysis, 1:543-559 (1997)）が含まれるが、これらに限定されるものではない。BL
AST Xプログラムは、NCBIおよび他の入手元から公的に入手可能である（BLAST M
anual, Altschul, Sら, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, Sら, J
. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)）。よく知られたSmith Watermanアルゴリズ
ムも同一性の決定に使用することができる。
【００２８】 ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターは、典型的には、以下のものを
含む： アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89
:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62 ギャップペナルティー：12 ギャップ長ペナルティー：4。
【００２９】 これらのパラメーターで使用しうるプログラムは、Genetics Computer Group,
Madison Wisconsinからの「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である
。末端（end）ギャップに関するペナルティーを伴わない前記パラメーターは、
ペプチドの比較のためのデフォールト・パラメーターである。
【００３０】 ポリヌクレオチド配列の比較のためのパラメーターは以下のものを含む： アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝+10；ミスマッチ＝0 ギャップペナルティー：50 ギャップ長ペナルティー：3。
【００３１】 これらのパラメーターで使用しうるプログラムは、Genetics Computer Group,
Madison Wisconsinからの「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である
。前記パラメーターは、核酸の比較のためのデフォールト・パラメーターである
。
【００３２】 本発明はまた、式： X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y （式中、アミノ末端のXは水素、カルボキシル末端のYは水素または金属、R1およ
びR3は任意のアミノ酸残基、nは1〜1000の整数、およびR2は本発明のアミノ酸配
列、特に、配列表に記載の群、好ましくは配列番号38および45から選ばれるアミ
ノ酸配列である）のポリペプチドを含む。該式中、R2は、そのアミノ末端残基が
左側でR1に結合しそのカルボキシ末端残基が右側でR3に結合するように配向して
いる。いずれかのR基（この場合、Rは1より大きい）で示されるアミノ酸残基の
いずれの伸長も、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってもよく、好ましく
はヘテロポリマーである。
【００３３】 本発明のポリペプチドは、配列番号37、44および46〜72に含まれる配列の群か
ら選ばれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプ
チドを含む。
【００３４】 本発明のポリペプチドはDAGAT活性を有することが示されている。DAGATは、細
胞グリセロ脂質の代謝に関与し、特に、1,2-ジアシルグリセロールと脂肪酸アシ
ル-CoAとからのトリアシルグリセロールの形成を触媒するため、本発明のポリペ
プチドには関心が持たれる。DAGATは、トリアシルグリセロールの生合成経路に
特有の唯一の酵素である（Coleman RA, (1992) Methods. Enzymol. 209:98-104
）。
【００３５】 本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質であってもよく、あるいは融合タン
パク質の一部であってもよい。
【００３６】 該ポリペプチドの断片および変異体も本発明の一部とみなされる。断片は、前
記ポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなくその一部と完全に同じアミノ酸配
列を有する変異体ポリペプチドである。該断片は「独立（free-standing）」し
ていてもよく、あるいはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい（この
場合、該断片はその一部または一領域を形成し、最も好ましくは単一の連続領域
としてそれを形成する）。好ましい断片は、本発明のポリペプチドの活性を媒介
する断片（同様の活性もしくは改善された活性を有するもの又は減少した活性を
有するものを含む）である生物学的に活性な断片である。また、動物、特にヒト
において抗原性または免疫原性である断片も含まれる。
【００３７】 また、該ポリペプチドの変異体は、同類アミノ酸置換、同様の特性を有する別
の残基による残基の置換により配列表に記載の配列とは異なっているポリペプチ
ドを含む。一般に、そのような置換は、Ala、Val、LeuおよびIle間；SerおよびT
hr間；AspおよびGlu間；AsnおよびGln間；LysおよびArg間；またはPheおよびTyr
間のものである。5〜10；1〜5；1〜3または1個のアミノ酸が任意の組合せで置換
され欠失しており又は付加されている変異体が、特に好ましい。
【００３８】 本発明のポリペプチドの断片である変異体は、対応する完全長ポリペプチドを
ペプチド合成により製造するために使用することができる。したがって、これら
の変異体は、本発明の完全長ポリペプチドの製造用中間体として使用することが
できる。
【００３９】 本発明のもう1つの態様は、単離されたDAGATポリヌクレオチドに関する。本発
明のポリヌクレオチド配列は、配列表に記載の配列の群から選ばれる推定アミノ
酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド
、およびそのような配列およびそれらの変異体と密接に関連した他のポリヌクレ
オチド配列を含む。
【００４０】 本発明は、配列表に記載の各コード配列と全長にわたり同一であるポリヌクレ
オチド配列を提供する。本発明はまた、成熟ポリペプチドまたはその断片のコー
ド配列、および他のコード配列（例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ-、プ
ロ-またはプレプロ-タンパク質配列をコードする配列など）と共にリーディング
フレームをなす成熟ポリペプチドまたはその断片のコード配列を提供する。また
、該ポリヌクレオチドは、例えば、非コード5'および3'配列、例えば転写される
非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、mRNAを安定化する配列、イン
トロン、ポリアデニル化シグナル、および追加的なアミノ酸をコードする追加的
なコード配列を含む（これらに限定されるものではない）非コード配列を含みう
る。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するためのマーカー配列が含まれう
る。また、本発明のポリヌクレオチドは、構造遺伝子と、遺伝子発現を制御する
天然に結合している配列とを含むポリヌクレオチドを含む。
【００４１】 本発明はまた、式： X-(R1)n-(R2)-(R3)n-Y （式中、5'末端のXは水素、3'末端のYは水素または金属、R1およびR3は任意の核
酸残基、nは1〜3000、好ましくは1〜1000の整数、およびR2は本発明の核酸配列
、特に、配列表に記載の群、好ましくは配列番号37、44および46〜72から選ばれ
る核酸配列である）のポリヌクレオチドを含む。該式中、R2は、その5'末端残基
が左側でR1に結合しその3’末端残基が右側でR3に結合するように配向している
。いずれかのR基（この場合、Rは1より大きい）で示される核酸残基のいずれの
伸長も、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであってもよく、好ましくはヘテロ
ポリマーである。
【００４２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドの変異体をコードする本明細書に記載の
ポリヌクレオチドの変異体に関する。本発明のポリヌクレオチドの断片である変
異体を、本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に使用することができる。好ま
しい実施形態は、本発明のポリペプチド配列の5〜10、1〜5、1〜3、2、1または0
個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換され付加され又は欠失しているポリペプ
チド変異体をコードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの特性または活性を改変しないサイレントな置換、付加および欠失が
特に好ましい。
【００４３】 本発明の更に好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドに対して全長にわたり少なくとも50％、60％または70％同一であるポ
リヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドである。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長に
わたり少なくとも80％同一である領域を含むポリヌクレオチド、およびそれに相
補的なポリヌクレオチドが、より好ましい。この点に関しては、全長にわたり少
なくとも90％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも95％同一
であるものが格別に好ましい。さらに、少なくとも97％の同一性を有するものが
非常に好ましく、少なくとも98％および99％の同一性を有するものが更に好まし
く、少なくとも99％の同一性を有するものがより一層好ましい。
【００４４】 好ましい実施形態は、配列表に記載のポリヌクレオチドにコードされる成熟ポ
リペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドである。
【００４５】 本発明は更に、前記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特
に、本発明は、ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチドにハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。本発明で用いる「ストリンジェントな条件
」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」なる語は、配列間
に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合にハイブ
リダイゼーションが一般に生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件の一例として、50％ホルムアミド、5x SSC（150mM NaCl、15
mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハルト液
、10％硫酸デキストランおよび20マイクログラム/ミリリットルの変性剪断サケ
精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩のインキュベーション、およびそれに続く約6
5℃、0.1x SSC中でのハイブリダイゼーション支持体の洗浄が挙げられる。他の
ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrookら, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, cold Spring Harbor, NY (1989)
, 特に第11章に例示されている。
【００４６】 本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、配列表に
記載のポリヌクレオチド配列に関して、該ポリヌクレオチド配列またはその断片
の配列を有するプローブで、完全な遺伝子を含有する適当なライブラリーをスク
リーニングし、該ポリヌクレオチド配列を単離することにより入手可能なポリヌ
クレオチド配列より実質的になるポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリ
ヌクレオチドを得るのに有用な断片には、例えば、本明細書に記載のプローブお
よびプライマーが含まれる。
【００４７】 例えば、本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書中に説明すると
おり、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする完全長cDNAまた
はゲノムクローンを単離するための又は配列表に記載のポリヌクレオチドに対し
て高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAまたはゲノムクローンを単離するた
めのRNA、cDNAまたはゲノムDNA用のハイブリダイゼーションプローブとして使用
することができる。そのようなプローブは、一般には、少なくとも15塩基を含む
であろう。好ましくは、そのようなプローブは、少なくとも30塩基を有し、少な
くとも50塩基を有しうる。特に好ましいプローブは、30塩基〜50塩基を有するで
あろう。
【００４８】 配列表に記載のポリヌクレオチド配列を含む又はそれに含まれる各遺伝子のコ
ード領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために配列表に記載のDNA
配列を使用してスクリーニングすることにより単離することができる。ついで、
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドを
使用してcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニングして、該
プローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する。例えば、DA
GATペプチド配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを調製する。DAGAT遺伝子の
部分DNA配列を得るためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術におけるプライマー
として、該オリゴヌクレオチドを使用する。ついで、そのようにして得られた部
分配列をプローブとして使用して、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierell
a ramanniana）組織から調製した遺伝子ライブラリーからDAGATクローンを得る
。あるいは、低い縮重のオリゴヌクレオチドが特定のDAGATペプチドから調製さ
れうる場合には、DAGAT遺伝子配列に関して遺伝子ライブラリーをスクリーニン
グするために、そのようなプローブを直接使用することができる。特に、ファー
ジベクターにおけるcDNAライブラリーのスクリーニングは、バックグラウンドハ
イブリダイゼーションのレベルがより低いため、そのような方法において有用で
ある。
【００４９】 典型的には、核酸プローブを使用して入手可能なDAGAT配列は、プローブとし
て使用するコード配列と標的DAGAT配列との間で60〜70％の配列同一性を示すで
あろう。しかしながら、僅か50〜60％の配列同一性しか有さない非常に長い配列
も得られうる。該核酸プローブは、該核酸配列の非常に長い断片、またはより短
いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。より長い核酸断片を（約100bp
以上）プローブとして使用する場合には、プローブとして使用する配列からの20
〜50％の偏差（すなわち、50〜80％の配列相同性）を有する標的サンプル由来の
配列を得るために、より低いストリンジェンシーでスクリーニングすることがで
きる。オリゴヌクレオチドプローブは、DAGAT酵素をコードする全核酸配列より
かなり短くてもよいが、少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、より好ま
しくは少なくとも約20ヌクレオチドであるべきである。より長い領域に対して、
より短い領域を使用する場合には、より高い配列同一性が望ましい。したがって
、他の関連DAGAT遺伝子を検出し回収するためのオリゴヌクレオチドプローブを
設計するためには、高度に保存されたアミノ酸配列の領域を同定することが望ま
しいかもしれない。より短いプローブは、しばしば、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）に特に有用である（特に、高度に保存された配列が同定されうる場合）（Gou
ldら, PNAS USA (1989) 86:1934-1938を参照されたい）。
【００５０】 本明細書中に更に詳しく説明するとおり、本発明のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドは、例えば、植物などの宿主細胞の形質転換において、研究用試薬と
して、および疾患の治療および診断の開発に使用することができる。
【００５１】 本発明はまた、成熟タンパク質＋追加的アミノもしくはカルボキシル末端アミ
ノ酸または該成熟ポリペプチド内のアミノ酸（例えば、該タンパク質の成熟形態
が2以上のポリペプチド鎖を有する場合）であるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供する。そのような配列は、例えば、前駆体から成熟形態への
タンパク質のプロセシングにおいて何らかの役割を果たし、タンパク質の輸送を
可能にし、タンパク質の半減期を短縮または延長し、またはアッセイもしくは製
造における該タンパク質の取扱いを容易にしうる。いずれかの追加的アミノ酸を
成熟タンパク質から除去するために細胞酵素を使用することができると考えられ
る。
【００５２】 1以上のプロ配列と融合した該ポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タンパ
ク質は該ポリペプチドの不活性形態でありうる。該不活性前駆体は、一般には、
該プロ配列が除去されると活性化される。該プロ配列の一部または全部が、活性
化前に除去されうる。そのような前駆体タンパク質は、一般には、プロタンパク
質と称される。
【００５３】 植物構築物および使用方法 特に関心が持たれるのは、宿主植物細胞内での本発明のアシルトランスフェラ
ーゼ配列の転写または転写・翻訳（発現）を指令するための組換えDNA構築物に
おける該ヌクレオチド配列の使用である。該発現構築物は、一般には、本発明の
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列に作動的
に結合した宿主植物細胞内で機能的なプロモーターと宿主植物細胞内で機能的な
転写終結領域とを含む。
【００５４】 当業者は、植物細胞内で機能的な文献記載の多数のプロモーターが存在すると
認識するであろう。葉緑体および色素体に特異的なプロモーター、葉緑体または
色素体において機能的なプロモーター、および葉緑体または色素体において作動
的なプロモーターも予想される。
【００５５】 1組のプロモーターとして、ほとんどの植物器官内で高レベルの発現をもたら
すCaMV35SまたはFMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターが挙げられる。C
aMV35SまたはFMV35Sプロモーターの増強または重複形態は、本発明の実施に有用
である（Odellら (1985) Nature 313:810-812; Rogers, 米国特許第5,378,619号
）。また、植物の特定の組織（例えば、葉、幹、根、塊茎、種子、果実など）内
でアシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を引き起こさせることも好ましいかも
しれない。選択するプロモーターは、所望の組織・発生特異性を有すべきである
。
【００５６】 特に関心が持たれるのは、植物種子組織内で優先的に発現される転写開始領域
からの本発明の核酸配列の発現である。そのような種子に優先的な転写開始配列
の具体例には、植物貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列に由来する又は油料
種子内の脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来する配列が含まれる。そのような
プロモーターの具体例には、ナピン（napin）（Kridlら, Seed Sci Res 1:209-2
19 (1991)）、ファセオリン、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター、ACP、ス
テアロイル-ACPデサチュラーゼ、β-コングリシニンのダイズα'サブユニット遺
伝子（soy 7s, (Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci, 83:8560-8564 (1986))）およ
びオレオシン（oleosin）などの遺伝子に由来する5'調節領域が含まれる。
【００５７】 特定の細胞下画分、例えばミトコンドリア、小胞体、液胞、葉緑体または他の
色素体画分にDAGATを付与するタンパク質の局在化を指令することが好都合かも
しれない。例えば、本発明の関心のある遺伝子を色素体（例えば、葉緑体）に標
的化して発現させる場合には、該構築物において、該遺伝子を該色素体に導く配
列を使用することになろう。そのような配列は、本発明では葉緑体輸送ペプチド
（CTP）または色素体輸送ペプチド（PTP）と称される。このように、関心のある
遺伝子が色素体内に直接的に導入されない場合には、該発現構築物は更に、関心
のある遺伝子を色素体に導く輸送ペプチドをコードする遺伝子を含有するであろ
う。葉緑体輸送ペプチドは、関心のある遺伝子に由来するものであってもよく、
あるいはCTPを有する異種配列に由来するものであってもよい。そのような輸送
ペプチドは当技術分野で公知である。例えば、Von Heijneら (1991) Plant Mol.
Biol. Rep. 9:104-126; Clarkら (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; de
lla-Cioppaら (1987) Plant Physiol 84:965-968; Romerら (1993) Biochem. Bi
ophys. Res Commun. 196:1414-1421; およびShahら (1986) Science 233:478-48
1を参照されたい。
【００５８】 意図する用途に応じて、該構築物は、全DAGATタンパク質またはその一部をコ
ードする核酸配列を含有していてもよい。例えば、与えられたDAGATタンパク質
のアンチセンス阻害が望ましい場合には、全DAGAT配列は必ずしも必要でない。
さらに、構築物中で使用するDAGAT配列をプローブとして使用することを意図す
る場合には、DAGATコード配列の特定の部分（例えば、高度に保存されたDAGAT領
域をコードすることが判明している配列）だけを含有する構築物を調製すること
が好都合かもしれない。
【００５９】 当業者は、宿主細胞における内因性配列の発現の抑制のための種々の方法があ
ることを認識するであろう。そのような方法には、アンチセンス抑制（Smithら
(1988) Nature 334:724-726）、共発現（Napoliら (1989) Plant Cell 2:279-28
9）、リボザイム（PCT公開WO 97/10328）、センスおよびアンチセンスの組合せ
（Waterhouseら (1998) Proc. Natl. Acad. USA 95:13959-13964）が含まれるが
、これらに限定されるものではない。宿主細胞における内因性配列の抑制のため
の方法は、典型的には、抑制しようとする配列の少なくとも一部の転写または転
写・翻訳を用いる。そのような配列は、該内因性配列のコードおよび非コード領
域と相同であってもよい。
【００６０】 また、本発明の植物発現構築物中に調節性転写終結領域を設けることができる
。転写終結領域は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードす
るDNA配列、または異なる遺伝子由来の簡便な転写終結領域、例えば、転写開始
領域に天然で付随する転写終結領域により与えられうる。当業者は、植物細胞に
おいて転写を終結しうる任意の簡便な転写終結領域を本発明の構築物中で使用す
ることが可能であると認識するであろう。
【００６１】 あるいは、宿主植物細胞色素体から直接的にDAGAT配列の発現を指令する構築
物を調製することができる。そのような構築物および方法は当技術分野で公知で
あり、例えば、Svabら (1990) Proc. Natl. Acad. USA 87:8526-8530ならびにSv
abおよびMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917ならびに米国
特許第5,693,507号に全般的に記載されている。
【００６２】 該発現構築物を含有する組換えDNA構築物が導入された植物細胞、組織、器官
または植物は、形質転換もしくはトランスフェクトされている又はトランスジェ
ニックであるとみなされる。また、トランスジェニックまたは形質転換細胞また
は植物は、該細胞または植物の後代、および交雑における親としてそのようなト
ランスジェニック植物を用いる育種計画から生産され、DAGAT核酸配列の存在か
ら生じる改変した表現型を示す後代を含む。
【００６３】 関心のあるDNA配列として植物DAGATを有する、発現の増加または減少のための
植物の発現または転写構築物は、多種多様な植物、例えば、食用または産業用の
植物油の生産に関与する植物で用いることができる。最も好ましいのは、温帯油
料種子作物である。関心のある植物には、ナタネ（カノラおよび高エルカ酸（Hi
gh Erucic Acid）品種）、ヒマワリ、サフラワー、綿、ダイズ、ラッカセイ、コ
コナッツおよびギネアアブラヤシ、およびトウモロコシが含まれるが、これらに
限定されるものではない。該組換え構築物を宿主細胞内に導入する方法によって
は、他のDNA配列が必要かもしれない。重要なことは、本発明が双子葉植物種に
も単子葉植物種にも等しく適用可能であり、新規のおよび／または改良された形
質転換および調節技術に容易に適用可能なことである。
【００６４】 特に関心が持たれるのは、植物種子油中に特定の脂肪酸を生産するように遺伝
的に操作された植物（その操作された種の未操作植物の種子中のTAGはその特定
の脂肪酸を天然では含有しない）における植物DAGAT構築物の使用である。した
がって、植物における新規DAGATの発現は、sn-3位への特有の脂肪酸アシル基の
取込みに望ましいかもしれない。
【００６５】 本発明のDAGATタンパク質に関する更なる植物遺伝子操作用途には、TAG分子上
の特定の位置に取込まれた所望の脂肪酸アシル基を有するTAG分子を含有する構
造化植物脂質の製造におけるそれらの使用が含まれる。
【００６６】 植物にとって好ましい配列を付与するのが望ましい場合には特に、完全に又は
部分的に遺伝子配列を合成しうることが意図される。したがって、所望の構造遺
伝子（DAGATタンパク質をコードする遺伝子部分）の全部または一部を、選択し
た宿主にとって好ましいコドンを使用して合成することができる。宿主にとって
好ましいコドンは、例えば、所望の宿主種内で発現されるタンパク質において最
も頻繁に使用されるコドンから決定することができる。
【００６７】 当業者は、抗体調製物、核酸プローブ（DNAおよびRNA）などを調製し使用して
種々の植物から「相同」または「関連」DAGATをスクリーニングし回収しうるこ
とを容易に認識するであろう。核酸もしくはアミノ酸の配列情報の比較の際に又
は公知DAGATと候補源とのハイブリダイゼーション反応により決定されうる配列
同一性が存在する場合に、相同配列が見出される。配列相同性の決定の際には、
同類変化（例えば、Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/LysおよびGln/Asn）も考
慮することができる。2つの完全な成熟タンパク質間の僅か25％の配列同一性に
より、アミノ酸配列は相同とみなされる（全般的には、Doolittle, R.F., OF UR
FS and ORFS (University Science Books, CA, 1986)を参照されたい）。
【００６８】 このように、例示されている特定のモルティエレラ（Mortierella）タンパク
質調製物および本発明で提供する配列から、他のDAGATを得ることができる。さ
らに、例示されているDAGATから、およびそのような例示されている配列の使用
により得られるDAGATから、合成タンパク質のモデル化のための出発物質、なら
びに天然および合成DAGAT（修飾アミノ酸配列を含む）を得ることができること
が明らかであろう。修飾アミノ酸配列は、そのような配列が部分的または全体的
に合成されたものであるか否かに無関係に、突然変異、トランケート化、増強な
どを受けた配列を含む。植物調製物から実際に精製された配列、それと同一の配
列、またはそれと同一のタンパク質をコードする配列は、該タンパク質または配
列を得るために用いた方法に無関係に、等しく天然に由来するとみなされる。
【００６９】 免疫学的スクリーニングのために、精製されたタンパク質またはその一部をウ
サギまたはマウスに注射することによりDAGATタンパク質に対する抗体を製造す
ることが可能であり、そのような抗体製造方法は当業者によく知られている。典
型的には、ポリクローナル抗体が、遺伝子の単離には、より有用であるが、モノ
クローナルまたはポリクローナル抗体のいずれもが製造可能である。モルティエ
レラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGATに対する抗体との交差反
応による測定により所望の植物種の粗抽出物中に関連タンパク質が存在すること
を確認するために、ウエスタン分析を行うことができる。交差反応が認めらる場
合には、該関連タンパク質をコードする遺伝子を、所望の植物種を表す発現ライ
ブラリーをスクリーニングすることにより単離する。発現ライブラリーは、Samb
rookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）に記載のとおりラムダgt
11などの商業的に入手可能な種々のベクター中で構築することができる。
【００７０】 多くの植物は、種子中の貯蔵TAGの産生においてDAGATタンパク質を利用する。
したがって、そのような任意の植物種は追加的なDAGATタンパク質源とみなされ
うる。sn-1およびsn-3位にパルミチン酸またはステアリン酸アシル基を、sn-2位
にオレイン酸またはリノレン酸を有する大量のTAGを有する植物は、S-U-S形態（
式中、Sは飽和脂肪酸を表し、Uは不飽和脂肪酸を表す）の構造化TAGの合成に対
して特別の選択性を示しTAGのsn-3位に飽和脂肪酸を取込みうる植物DAGATを得る
ための好ましい候補である。例えば、ココア、イリッペ（illipe）、サラノキ、
シアバターノキ、およびコクム（kokum）などのガルシニア（Garcinia）を含む
いくつかの熱帯植物に由来する油はこの形態の大量のTAGを蓄積することが示さ
れている。
【００７１】 種子油中に有意な中鎖脂肪酸を有する植物は、TAGのsn-3位に中鎖脂肪酸を取
込みうる植物DAGATを得るための好ましい候補である。クフェア属（Cuphea）の
いくつかの種、例えば、プロキュンベンス（procumbens）、ルテア（lutea）、
フーケリアナ（hookeriana）、ヒッソピフォリア（hyssopifolia）、リヒティ（
wrightii）およびインフラタ（inflata）は、中鎖脂肪酸を含有するトリグリセ
リドをそれらの種子中に蓄積する。中鎖脂肪酸のもう1つの天然植物源は、クス
ノキ（Lauraceae）科の種子である。例示されているものに加えて、カリフォル
ニア・ベイ（California Bay）（Umbellularia californica）、ピサ（Pisa）（
Actinodophne hookeri）、ゲッケイジュ（Laurus nobilis）およびシンナモムム
・カムフォラ（Cinnamomum camphora）（ショウノウ）も中鎖脂肪酸を蓄積する
。他の起源植物には、ニレ科（Ulmaceae）（ニレ）、ヤシ科（Palmae）、ニクズ
ク科（Myristicaceae）、ニガキ科（Simarubaceae）、ボキシア科（Vochysiacea
e）およびサルバドラ（Salvadoraceae）が含まれる。
【００７２】 また、貯蔵TAG中に異常な長鎖脂肪酸を取込む植物種に由来するDAGATには特に
関心が持たれる。例えば、キンレンカおよびメドウフォーム（meadowfoam）は種
子中に22:1アシル基を含有する。
【００７３】 また、多種多様なインビボ用途における植物脂質生合成のTAG生合成事象を研
究するために、種々の起源に由来する植物DAGATを使用しうることに注目すべき
である。すべての植物は共通の代謝経路を介して脂質を合成するらしいため、異
種植物宿主に対する1つの植物DAGATの適用および／または研究は種々の種におい
て容易に達成されうる。他の用途においては、産生を増強し及び／又はインビト
ロで産生もしくは合成されるTAGの組成を修飾するために、天然のDAGAT起源植物
以外に由来する植物DAGATを使用することができる。
【００７４】 他のDAGATの単離に加えて、他の関連アシルトランスフェラーゼタンパク質の
遺伝子も、DAGATおよび関連核酸配列からの配列情報を用いて得られうると考え
られる。例えば、色素体DAGAT、ミトコンドリアDAGAT、リゾホスホスファチジル
コリンアシルトランスフェラーゼ（LPCAT）、リゾホスホスファチジルセリンア
シルトランスフェラーゼ（LPSAT）、リゾホスホスファチジルエタノールアミン
アシルトランスフェラーゼ（LPEAT）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロ
ールアシルトランスフェラーゼ（PDAT）およびリゾホスホスファチジルイノシト
ールアシルトランスフェラーゼ（LPIAT）を含む他のアシルトランスフェラーゼ
酵素が、植物脂質生合成に関与している。これらの酵素の多くは、リゾホスホ脂
質のsn-2位が関与するアシルトランスフェラーゼ反応を触媒するが、これらの配
列をコードする遺伝子は本発明の植物アシル-CoA DAGAT配列に関連づけることが
可能であり、それより入手可能である。
【００７５】 ある関連遺伝子が、与えられた配列に対するハイブリダイゼーションにより単
離されうるか否かを判定するために、該配列を標識して（典型的には、放射能を
用いるが、他の方法も利用可能である）検出が可能となるようにする。該標識プ
ローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、ノーザンまたはサザンブロットな
どの所望の核酸を含有するフィルターまたはスクリーニングするcDNAまたはゲノ
ムクローンを含有するフィルターと共にインキュベートする。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄条件は、関心のある配列に対する該プローブのハイブリダイゼ
ーションを最適化するために様々に変化させることができる。より低い温度およ
びより高い塩濃度は、より遠縁の配列のハイブリダイゼーションを可能にする（
低いストリンジェンシー）。バックグラウンドハイブリダイゼーションが、低い
ストリンジェンシー条件下で問題となる場合には、ハイブリダイゼーションまた
は洗浄工程において温度を上昇させ、および／または塩含量を低下させて、ハイ
ブリダイズする特異的配列の検出を向上させることができる。Beltzら（Methods
in Enzymology (1983) 100:266-285）に記載されているとおり、ハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄温度は、該プローブの推定融解温度に基づいて調節するこ
とができる。有用なプローブならびに適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄
条件を、前記のとおり同定したら、該標識配列および最適化条件を用いてcDNAま
たはゲノムライブラリーをスクリーニングする。
【００７６】 植物DAGATタンパク質に関連する核酸配列は、多数の用途において有用であろ
う。例えば、プローブとして使用しうる組換え構築物を調製することができる。
あるいは、直ぐに利用できるDAGAT酵素源を得るために、および／または、宿主
細胞内で見出されるトリグリセリドの組成を修飾するために、宿主細胞内でDAGA
Tタンパク質の発現をもたらす組換え構築物を調製することができる。宿主細胞
が植物宿主細胞である場合、インビトロまたはインビボにおける他の有用な用途
が見出されうる。例えば、植物TAG生合成経路に利用されうるそれぞれの中鎖を
優先するDAGATを増加させることにより、TAG中の中鎖脂肪酸の比率の増加がもた
らされうる。同様にして、いくつかの用途には、アンチセンス技術により、植物
細胞内で内因的に発現されるDAGATの量を減少させるのが望ましいかもしれない
。例えば、挿入された外来性DAGATが飽和アシル基または中鎖もしくは異常な長
鎖脂肪酸アシル基をsn-3位に転移させる機会を増加させるために、天然アブラナ
（Brassica）長鎖優先性DAGATの発現を減少させることが望ましいかもしれない
。
【００７７】 前記のとおり、本発明の植物DAGATをコードする核酸配列は、ゲノム、cDNAま
たはmRNA配列を含みうる。「コード（する）」は、該配列がセンスまたはアンチ
センス配向で特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。「染色体外」は、
該配列が、それが天然で付随する植物ゲノムの外部に存在することを意味する。
「組換え」は、該配列が、突然変異誘発、制限酵素などによる操作により遺伝的
に操作された修飾を含有することを意味する。
【００７８】 所望の植物DAGATの核酸配列が得られたら、それを種々の方法で操作すること
ができる。該配列が非コードフランキング領域を含む場合、該フランキング領域
を制限酵素処理、突然変異誘発などに付すことができる。したがって、天然に存
在する配列上でトランジション、トランスバージョン、欠失および挿入を施すこ
とができる。また、該配列の全部または一部を合成することができる。構造遺伝
子においては、修飾されたアミノ酸配列を得るために1以上のコドンを修飾した
り、あるいは簡便な制限部位を得るために又は構築もしくは発現に関連した他の
目的のために1以上のコドンの突然変異を導入することができる。1以上の簡便な
制限部位を導入するための合成アダプター、リンカーなどを使用することにより
、構造遺伝子を更に修飾することができる。
【００７９】 本発明の植物DAGATをコードする核酸またはアミノ酸配列は、様々な方法で他
の非天然または「異種」配列と組合せることができる。「異種」配列は、植物DA
GATと一緒になっていることが天然では見出されない任意の配列（例えば、一緒
になっていることが天然では見出されない同一植物由来の核酸配列の組合せを含
む）を意味する。
【００８０】 本発明の植物DAGATをコードするDNA配列は、DAGATに通常関連している遺伝子
配列の全部または一部と共に使用することができる。その成分部分においては、
宿主細胞内での転写および翻訳を促進しうる転写開始制御領域、植物DAGATをコ
ードするDNA配列ならびに転写および翻訳終結領域を5'から3'への転写方向に有
するDNA構築物中、DAGATをコードするDNA配列を合体させる。
【００８１】 潜在的宿主細胞には原核性および真核性細胞が含まれる。宿主細胞は、意図さ
れる用途に応じて、単細胞であってもよく、あるいは多細胞性の分化または未分
化生物中に見出されうる。本発明の細胞は、野生型細胞にとって外来性である植
物DAGATを有することにより、例えば、植物DAGATをコードする組換え核酸構築物
DAGATを有することにより識別されうる。
【００８２】 宿主に応じて、調節領域は様々なもの、例えばウイルス、プラスミドまたは染
色体遺伝子などに由来する領域を含むものとなろう。原核性または真核性微生物
、特に単細胞宿主内での発現には、多種多様な構成的または調節可能プロモータ
ーを使用することができる。微生物における発現は、すぐに利用できる植物酵素
源を与えうる。既に記載されている転写開始領域としては、大腸菌（E. coli）
、枯草菌（B. subtilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerev
isiae）などの細菌および酵母宿主由来の領域（βガラクトシダーゼ、T7ポリメ
ラーゼ、トリプトファンEなどの遺伝子を含む）が挙げられる。
【００８３】 宿主植物細胞の形質転換に用いる方法は、本発明にとって決定的なものではな
い。該植物の形質転換は、好ましくは恒久的なもの（すなわち、導入された構築
物が連続的な植物世代に伝達されるよう、導入された発現構築物が宿主植物細胞
のゲノム内に組込まれることによるもの）である。当業者は、当技術分野におい
ては多種多様な形質転換技術が存在し、新規技術が絶えず利用可能になりつつあ
ると認識するであろう。標的宿主植物に適した任意の技術を、本発明の範囲内で
利用することができる。例えば、該構築物は、プラスミド中の又は人工染色体中
のDNA鎖を含む（これらに限定されるものではない）種々の形態に導入すること
ができる。標的植物細胞内への該構築物の導入は、リン酸カルシウムDNA共沈法
、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム（
Agrobacterium）感染、リポソームまたは微粒子形質転換を含む（これらに限定
されるものではない）種々の技術により達成されうる。当業者は、詳細について
は文献を参照し、本発明の方法に用いるのに適した技術を選択することができる
。
【００８４】 通常、該DNA構築物と共に、宿主内での発現に必要な調節領域を有し形質転換
細胞の選択をもたらす構造遺伝子が含まれるであろう。該遺伝子は、細胞傷害性
因子、例えば、抗生物質、重金属、毒素などに対する抵抗性、栄養要求宿主に原
栄養性を付与する相補性、ウイルス免疫などをもたらしうる。宿主によって異な
る選択条件を用いる場合には、該発現構築物またはその成分が導入される異なる
宿主種の数に応じて1以上のマーカーを使用することができる。
【００８５】 植物細胞の形質転換にアグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用する場合
には、T-DNAまたはTi-もしくはRi-プラスミド（該アグロバクテリウム宿主内に
存在するもの）との相同組換えのためにアグロバクテリウム（Agrobacterium）
宿主内に導入されうるベクターを使用することができる。組換え用のT-DNAを含
有するTi-またはRi-プラスミドは武装（armed）（ゴール形成を引き起こす能力
を有する）していても、武装解除（disarmed）（ゴール形成を引き起こす能力を
有さない）されていてもよく、形質転換アグロバクテリウム（Agrobacterium）
宿主内にvir遺伝子が存在する場合に限り後者が許容される。該武装プラスミド
は、正常な植物細胞とゴールとの混合物を与えうる。
【００８６】 宿主植物細胞を形質転換するための運び屋としてアグロバクテリウム（Agroba
cterium）を使用するいくつかの場合には、T-DNA境界領域に隣接する発現または
転写構築物を、大腸菌（E. coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）
内で複製されうる広い宿主域のベクター内に挿入する。広い宿主域のベクターは
文献に記載されている。pRK2またはその誘導体が一般に使用される。参照により
本明細書に組み入れるDittaら（Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. (1980) 77:734
7-7351）およびEPA 0 120 515を参照されたい。あるいは、植物細胞内で発現さ
せる配列を、別々の複製配列（そのうちの一方は大腸菌内で、もう一方はアグロ
バクテリウム内で該ベクターを安定化する）を含有するベクター内に挿入するこ
とができる。例えば、pRiHRI（Jouaninら, Mol. Gen. Genet. (1985) 201:370-3
74）複製起点を使用して宿主アグロバクテリウム細胞内での該植物発現ベクター
の付加的安定性を得ているMcBrideおよびSummerfelt（Plant Mol. Biol. (1990)
14:269-276）を参照されたい。
【００８７】 形質転換されたアグロバクテリウムおよび形質転換された植物細胞の選択を可
能にする1以上のマーカーが、該発現構築物および該T-DNAと共に含まれるであろ
う。植物細胞に使用するための多数のマーカー（例えば、クロラムフェニコール
、カナマイシン、アミノグリコシドG418、ハイグロマイシンなどに対する耐性）
が開発されている。使用する個々のマーカーは本発明に本質的なものではなく、
個々の宿主および構築の様態に応じて、好ましいマーカーは様々となる。
【００８８】 アグロバクテリウム（Agrobacterium）を使用する植物細胞の形質転換のため
には、外植片を組合せて、形質転換に十分な時間、該形質転換アグロバクテリウ
ムと共にインキュベートし、該細菌を殺し、該植物細胞を適当な選択培地内で培
養することができる。カルスが形成したら、公知方法に従い適当な植物ホルモン
を使用することによりシュート形成を促し、該シュートを発根培地に移して植物
を再生させることができる。ついで該植物を種子にまで成長させ、該種子を使用
して、反復発生を確立し、植物油を単離することができる。
【００８９】 複数の発現構築物を含有する本発明の植物細胞を得るためのいくつかの可能な
方法がある。本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコード
するDNA配列を有する構築物を含む植物を生産するための任意の手段、および酵
素をコードするもう1つのDNA配列を有する少なくとも1つの他の構築物が本発明
に含まれる。例えば、単一の形質転換ベクター中に両発現構築物を含有させるこ
とにより又はそれぞれが所望の遺伝子を発現する別々のベクターを使用すること
により第2構築物と同時に植物を形質転換するために、該発現構築物を使用する
ことができる。DAGAT発現構築物で既に形質転換された植物内に該第2構築物を導
入することが可能であり、あるいは、DAGAT構築物を発現する植物と第2構築物を
発現する植物とからなる形質転換植物を交雑させて、それらの構築物を同一植物
内で一緒にすることができる。
【００９０】 他の構築物および使用方法 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター
で遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチド
の製造に関する。本発明のDNA構築物由来のRNAを使用してそのようなタンパク質
を製造するために、無細胞翻訳系を用いることができる。
【００９１】 組換え産生のためには、発現系もしくはその一部または本発明のポリヌクレオ
チドを組込むために、宿主細胞を遺伝的に操作することができる。宿主細胞内へ
のポリヌクレオチドの導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology,
(1986)およびSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)などの
多数の標準的な実験マニュアルに記載の方法により行うことができる。そのよう
な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介ト
ランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェ
クション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
形質導入、スクレープ（scrape）ローディング衝撃導入および感染が含まれるが
、これらに限定されるものではない。
【００９２】 適当な宿主の代表例には、細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、
大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセスおよびバシラス・サチリス（Bacillus
subtilis）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス細胞；昆虫細
胞、例えばドロゾフィラ（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf
9細胞；動物細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293およびBowes黒
色腫細胞；および前記の植物細胞が含まれる。
【００９３】 本発明のポリペプチドを製造するためには、種々の発現系を使用することがで
きる。そのようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルスに由来する
ベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母
エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、
パポーバウイルス、例えばSB40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウ
イルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクター、および
そのようなウイルスの組合せに由来するベクター、例えばプラスミドおよびバク
テリオファージ遺伝要素、例えばコスミドおよびファジミドに由来するベクター
が含まれるが、これらに限定されるものではない。該発現系構築物は、発現を調
節し発現を引き起こす制御領域を含有していてもよい。一般に、ポリヌクレオチ
ドの維持、増殖または発現および／または宿主内でのポリペプチドの発現に適し
た任意の系またはベクターを発現に使用することができる。よく知られた常套的
な種々の技術のいずれかにより、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A L
aboratory Manual, (前掲)に記載の技術により、選択した発現系内に適当なDNA
配列を挿入することができる。
【００９４】 小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境中への該タンパク質の分泌が可能と
なるよう、同種または異種の適当な分泌シグナルを該発現ポリペプチド内に組込
むことができる。
【００９５】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを含む（これらに限定されるものではない）よく知られた多数の方法のいず
れかにより、組換え細胞培養から回収し精製することができる。高速液体クロマ
トグラフィー（HPLC）を精製に使用するのが最も好ましい。単離および／または
精製中に該ポリペプチドが変性している場合には、活性なコンホメーションを再
生させるために、タンパク質のリフォールディングのためのよく知られた公知技
術のいずれかを用いることができる。
【００９６】 本発明はまた、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。
遺伝子の突然変異形態の検出は、該遺伝子の過少発現、過剰発現または改変され
た発現から生じる疾患に対する感受性の又はそのような疾患の診断を助けるため
の診断手段として用いることができる。該遺伝子内に突然変異を有する個体のDN
Aレベルでの検出のためには、よく知られた種々の技術を用いることができる。
【００９７】 診断用の核酸は、感染個体の細胞および組織、例えば骨、血液、筋肉、軟骨お
よび皮膚から得ることができる。ゲノムDNAを、検出のために直接使用したり、
あるいはPCRまたは他の増幅技術を用いて分析前に増幅することができる。RNAま
たはcDNAも同様にして使用することができる。欠失および挿入は、参照配列の遺
伝子型と比較した場合の増幅産物のサイズの変化により検出することができる。
点突然変異は、増幅されたDNAを本発明の標識ポリヌクレオチド配列にハイブリ
ダイズさせることにより同定することができる。完全にマッチする配列は、RNア
ーゼ消化により又は融解温度の相違により、ミスマッチ二本鎖から識別すること
ができる。配列の相違は、変性剤の存在下または不存在下のゲル内のDNA断片の
電気泳動移動度を比較することにより、あるいは直接的なDNA配列決定により、D
NAレベルで検出することができる（例えば、Myersら, Science 230:1242 (1985)
を参照されたい）。また、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、例えばRNアー
ゼおよびS1プロテクションまたは化学的切断法（例えば、Cottonら, Proc. Natl
. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)を参照されたい）を用いて、特定の位
置での配列の変化を検出することができる。DAGATヌクレオチド配列またはその
断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、特に遺伝子突然変異のスク
リーニングに使用することができると予想される。アレイ技術の方法はよく知ら
れており、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝的変異性分析に有用である（例え
ば、M. Cheeら, Science, 274:610-613 (1996)を参照されたい）。
【００９８】 本発明は更に、異常に変化したポリペプチドまたはmRNAのレベルをサンプルか
ら決定することにより、DAGAT活性に関連した疾患、特に、変化した細胞ジアシ
ルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性に関連した疾患 [癌；糖尿
病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに限定されるものではない）
の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；白血病および皮膚癌；線維
芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連した疾患；異常な脂肪吸収、
リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれるが、これらに限定される
ものではない]に対する感受性を診断または判定するための方法を提供する。ポ
リヌクレオチドの定量のための当技術分野でよく知られた技術（増幅、PCR、RT-
PCR、RNアーゼプロテクション、ノーザンブロット法および他のハイブリダイゼ
ーション法が含まれるが、これらに限定されるものではない）のいずれかにより
、発現の変化をRNAレベルで測定することができる。タンパク質発現レベルを検
出する診断アッセイ（ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブ
ロット分析およびELISAアッセイが含まれるが、これらに限定されるものではな
い）も意図される。
【００９９】 本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも使用することができる。
【０１００】 本発明のポリペプチドもしくはその変異体またはそれらを発現する細胞は、本
発明のポリペプチドに対して免疫特異的である抗体を産生させるための免疫原と
して使用することができる。「免疫特異的」は、該抗体が、他の関連ポリペプチ
ドに対する該抗体のアフィニティーより実質的に大きな、本発明のポリペプチド
に対するアフィニティーを有することを意味する。「抗体」は、モノクローナル
およびポリクローナル抗体 [キメラ、一本鎖、シミアン化、ヒト化、再表面化（
resurfaced）および他のタイプの相補性決定領域（CDR）置換抗体およびFabフラ
グメント、例えばFab免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む]を含む。
【０１０１】 該ポリペプチドまたはエピトープを保持する断片、類似体または細胞を、通常
のプロトコールを用いて動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより、抗
体を得ることができる。ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler, G.およびMilste
in, C., Nature 256:495-497 (1975)を参照されたい）；トリオーマ技術；ヒトB
細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら, Immunology Today 4:72 (1983)）；および
EBV-ハイブリドーマ技術（Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy
, Alan R. Liss, 77-96, (1985)）を含むよく知られた技術（連続的細胞培養技
術）のいずれかを用いて、モノクローナル抗体を製造することができる。
【０１０２】 一本鎖、ヒト化、再表面化、シミアン化および他のタイプのCDR置換抗体は、
当技術分野でよく知られた技術に従い製造することができる。
【０１０３】 該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために又はアフィニ
ティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために、記載されてい
る抗体を使用することができる。また、該抗体は、DAGAT活性に関連した疾患、
特に、変化した細胞ジアシルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性
に関連した疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに
限定されるものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；
白血病および皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連し
た疾患；異常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれ
るが、これらに限定されるものではない]の治療に使用することができる。
【０１０４】 本発明はまた、種々のサブクラス（IgG、IgM、IgAおよびIgE）の免疫グロブリ
ンの重鎖または軽鎖の定常領域の部分に融合した本発明のポリペプチドまたはそ
の断片を含む遺伝的に操作された可溶性融合タンパク質に関する。好ましくは、
ヒトIgG（特にIgG1）の重鎖の定常部分をヒンジ領域における融合で使用する。
特に好ましいのはFc部分の使用である（例えば、WO 94/29458およびWO 94/22914
を参照されたい）。
【０１０５】 本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドに結合する（特に、結合により該ポ
リペプチドの活性を阻害または刺激する）化合物の同定に使用することができる
。小分子の基質およびリガンドの結合を、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ラ
イブラリーおよび天然物混合物中で評価することができる。該アゴニストまたは
アンタゴニスト／インヒビターは、天然の基質またはリガンドであってもよく、
あるいはそれらの構造的または機能的模擬体であってもよい。例えば、Coligan
ら, Curr Prot in Immuno, 1(2):第5章 (1991)を参照されたい。
【０１０６】 本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する化合
物、特に、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増強（アゴニ
スト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物を同定するための、化合物のス
クリーニング方法を提供する。ハイスループットのスクリーニング技術を用いる
ことができる。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストに関するスクリーニン
グには、合成反応混合物、細胞画分、例えば膜、細胞エンベロープまたは細胞壁
、またはこれらのいずれかの調製物（本発明のポリペプチドとそのようなポリペ
プチドの標識基質またはリガンドとを含むもの）を、スクリーニングされている
候補化合物の存在下または不存在下でインキュベートする。該候補化合物が本発
明のポリペプチドを作動させる又は拮抗する能力は、該標識リガンドの結合の減
少または該基質からの産物の産生の減少により検出される。本発明のポリペプチ
ドの作用を誘導することなく無償で結合する候補化合物が良好なアンタゴニスト
である可能性が高い。一方、十分に結合し基質からの産物の産生速度を増加させ
る化合物はアゴニストとみなされる。基質からの産物の産生の速度またはレベル
の検出は、比色標識など（これに限定されるものではない）のレポーター系、ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するレポーター遺伝子の組
込み、および当技術分野で公知の結合アッセイを用いることにより増強されうる
。
【０１０７】 本発明のポリペプチドおよび潜在的アンタゴニストを、該ポリペプチド、天然
基質もしくはリガンドまたは基質もしくはリガンド模擬体に結合する化合物と組
合せる競合アッセイも、アンタゴニスト化合物に関するスクリーニングに用いる
ことができる。該潜在的アンタゴニストの有効性の評価のために、該結合分子に
結合し産物に変換された該ポリペプチド分子の数が測定されうるよう、本発明の
ポリペプチドを例えば放射能または比色性化合物により標識することができる。
【０１０８】 潜在的アンタゴニストには、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに
結合してその活性を阻害し又は部分的もしくは完全に遮断する小有機分子、ペプ
チド、ポリペプチドおよび抗体が含まれうるが、これらに限定されるものではな
い。また、アンタゴニストには、本発明のポリペプチドにより誘導される活性を
誘導することなく結合分子上の同一部位に結合して該ポリペプチドの作用をその
結合の阻止により妨げる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含ま
れうる。また、潜在的アンタゴニストには、該ポリペプチドの結合部位に結合し
それを占拠して細胞結合分子に対する該ポリペプチドの結合を妨げて該ポリペプ
チドの正常な生物学的活性を妨げ又は減少させる小分子が含まれる。そのような
小分子の具体例には、小有機分子、ペプチドおよびペプチド様分子が含まれるが
、これらに限定されるものではない。他の潜在的アンタゴニストには、アンチセ
ンス分子（例えば、Okano, J. Neurochem, 56:560 (1991); Oligodeoxynucleoti
des as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, F
L (1988)を参照されたい）が含まれる。
【０１０９】 DAGATは小腸内のキロミクロン、肝臓内のVLDLの形成および脂肪組織内のトリ
アシルグリセロールとしてのエネルギーの貯蔵に重要であるため、DAGAT活性の
アンタゴニストおよびアゴニストは特に有用である。したがって、小腸、肝臓お
よび脂肪組織内のDAGAT活性の阻害は脂質吸収および血漿トリグリセリドレベル
を減少させ、脂肪生成を減少させるであろう。さらに、高トリグリセリド血症は
アテローム性動脈硬化症の独立したリスクファクターであることが示されており
（Kugiyama, K.ら, (1998) Circulation 97:2519-2526）、冠状動脈疾患のリス
クの増大に関するマーカーであり、いくつかのじゅく腫形成因子に関するマーカ
ーとして働きうる（Grundy, S.M., (1998) Am. J. Cardiol, 81:18B-25B）。ま
た、DAGAT活性を阻害する化合物は、腸脂肪吸収の制御、TAGに富むリポ蛋白分泌
の改変、血清TAGの制御および脂肪生成の減少において有用である（Owen MRら (
1997) Biochem J 323:17-21, Jamdar SCおよびCao WF (1995) Biochem Biophys
Acta 1255:237-243）。さらに、DAGATのジアシルグリセロール基質は細胞内のシ
グナル伝達分子であり、プロテインキナーゼC活性の公知モジュレーターである
。変化した細胞ジアシルグリセロール濃度およびプロテインキナーゼC活性は癌
（da Costaら (1993) J. Biol. Chem. 268:2100-2105）、糖尿病（Koya Dおよび
King GL (1998) Diabetes 47:859-866）、心不全（Okumuraら, (1991) J. Mol.
Cell. Cardiol. 23:409-416）、脂肪細胞（Baldoら, (1995) J. Lipid Res., 36
:1415-1426）、白血病および皮膚癌細胞（Goldkorn T.およびDing, T. (1997) A
dv. Exp. Med. Biol., 400A:461-472）およびラット繊維芽細胞（Paiら, (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci., 88:598-602）に関連している。本発明のアゴニスト
およびアンタゴニストはそれ自体が、DAGAT活性に関連した疾患、例えば、変化
した細胞ジアシルグリセロール濃度またはプロテインキナーゼC活性に関連した
疾患 [癌；糖尿病；心不全、アテローム性動脈硬化症など（これらに限定される
ものではない）の心肺疾患；アジポサイトーシス（adipocytosis）；白血病およ
び皮膚癌；線維芽細胞腫；代謝障害；肥満；異常な脂質代謝に関連した疾患；異
常な脂肪吸収、リポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患が含まれるが、これ
らに限定されるものではない]の治療または改善に特に有用である。
【０１１０】 本発明はまた、該ポリヌクレオチドもしくは該ポリペプチドまたはそれらの変
異体、アゴニストもしくはアンタゴニストを含む組成物に関する。本発明のポリ
ペプチドは、細胞、組織または生物での使用のための無菌または非無菌担体（例
えば、対象に対する投与に適した医薬担体）と組合せて使用することができる。
そのような組成物は、例えば、治療的に有効な量の本発明のポリペプチドまたは
他の化合物と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む。そのような担体には
、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよび
それらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。該製剤は投与
様式に適合したものであるべきである。本発明は更に、本発明の前記組成物の1
以上の成分で満たされた1以上の容器を含む診断および医薬パックまたはキット
に関する。
【０１１１】 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で又は他の化合物と組合せて
投与することができる。
【０１１２】 該医薬組成物は、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻
腔内または皮内経路を含む（これらに限定されるものではない）有効で簡便な任
意の方法で投与することができる。
【０１１３】 必要な投与量の範囲は、使用する本発明のペプチドまたは他の化合物、投与経
路、該製剤の性質、対象の状態の性質および診療医の判断に左右されるであろう
。適当な投与量は、一般には、約0.1〜100μg/kgの範囲となるであろう。化合物
の多様性および投与の有効性の相違による大きなばらつきが予想される。例えば
、経口投与は静脈内投与より大きな投与量を要すると予想される。熟練した診療
医は、標準的な経験的方法を用いて適当な投与量を決定することができる。
【０１１４】 また、ポリペプチドを対象において内因的に生成させることが可能であり、こ
れは一般には「遺伝子治療」と称される。例えば、ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）で、およびレトロウイルスプラスミド
ベクターの使用により、対象からの細胞をex vivoで操作することができる。つ
いで該細胞を該対象に導入する。
【０１１５】 また、本発明の配列と相同な追加的な配列を同定するために、該ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチド配列を使用することができる。最も好ましく簡便な方法
は、コンピューターにより読取り可能な媒体（例えば、フロッピーディスク、CD
ROM、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブおよびDVD）中に配列を
記憶させ、ついでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段で配列
データベースを検索することである。公的なデータベースの具体例には、DNA Da
tabase of Japan（DDBJ）(http://www.ddbj.nig.ac.jp/); Genebank (http://ww
w.ncbi.nlm. nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); およびthe European Molecul
ar Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL)（http://www.
ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html）が含まれる。多数の種々の検索アルゴリズ
ムが当業者に利用可能であり、その一例として、BLASTプログラムと称されるプ
ログラム1式が挙げられる。5つのBLAST手段があり、そのうちの3つはヌクレオチ
ド配列の照会用に設計されたものであり（BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX）、2つ
はタンパク質配列の照会用に設計されたものである（BLASTPおよびTBLASTN）（C
oulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birrenら, Genome Analy
sis, 1:543-559 (1997)）。追加的なプログラム、例えば、配列アライメントプ
ログラム、より遠縁の配列の同定のためのプログラムなどが、同定された配列の
分析のために当技術分野において利用可能であり、当業者によく知られている。
【０１１６】 以上、本発明を全般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照するこ
とにより、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単なる例示目的
として記載されており、本発明を限定するものではない。
【０１１７】 （実施例） 実施例1：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT）アッセイ 未可溶化または可溶化タンパク質調製物におけるDAGAT活性に関するアッセイ
方法を、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）に関して説
明する。
【０１１８】 A．未可溶化サンプル Kamisakaら (1993) 前掲およびKamisakaら (1994) 前掲に記載されているのと
同様にして、10mMリン酸カリウム（pH7.0）、100〜150mM KClおよび0.1％ TX-10
0(w/v)を全容積100μl中に含有するバッファー中の3.67μM 1-14C-18:1-補酵素A
（53.5〜54.5 Ci/モル, New England Nuclear, Boston, MA）および1.5mM 1,2-1
8:1ジアシルグリセロール（DAG）（Sigma D-013、2-メトキシエタノール中の150
mMストックとして調製）で、DAGAT活性をアッセイする。アッセイを30℃で5分間
行い、1.5mlのヘプタン:イソプロパノール: 0.5M H2SO4（10:40:1, v/v/v）の添
加により終了させる。必要に応じて、該アッセイ中の産物生成の直線的な速度を
維持するためにアッセイの前にサンプルをバッファーで希釈することができる。
【０１１９】 B．可溶化サンプル 以下の変更以外は未可溶化サンプルに関する記載のとおりに該アッセイを行う
：1,2-18:1 DAGの量を0.5mMに減少させ、Triton X-100の量を0.2％に増加させ、
KCl濃度を100〜125mMに維持する。また、プロトコールの以下の変更以外はKamis
akaら (1996および1997) 前掲に記載のとおりに界面活性剤での可溶化後に活性
を回復させるためにL-α-ホスファチジン酸（Sigma P-9511、1％ Triton X-100
(w/v)中の50mMストックとして調製）を加える必要がある。500μMの代わりに300
μMのホスファチジン酸を使用することにより、Triton X-100による処理後に、D
AGAT活性の、より高い刺激を得る。また、該DAGAT活性は、該アッセイに導入さ
れるKClの量に感受性であり、最適レベルは100〜125mMである。アッセイを30℃
で5〜30分間行い、未可溶化サンプルに関して記載したとおりに終了させる。
【０１２０】 C．サンプルアッセイの加工 アッセイを終了した後、該サンプルを、後日行う加工のために4℃で保存する
か、または0.1mlの1M NaHCO3およびそれに続く、抽出用担体として15nmol/mlト
リオレインを含有する1mlの1Mヘプタンの添加により、直ちに加工することがで
きる。該サンプルをボルテックスし、水相と有機相とを分離した後、上側の有機
相を取り出して新たなガラスバイアル内に入れ、1mlの1M NaClで洗浄する。該最
終有機相の40％を液体シンチレーション計数のために取り出し、残りの有機相を
清潔なバイアルに移し、窒素ガス下で蒸発乾固させる。該残渣を45μlのヘキサ
ンに再懸濁させ、前吸着（pre-adsorbent）ローディングゾーンを有するシリカ
ゲル-Gガラス薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（Analtech #31011, Newa
rk, Delaware）上にスポットする。該TLCプレートをヘキサン:ジエチルエーテル
:酢酸（50:50:1, v/v/v）中で最上部まで展開し、ついで乾燥させ、ラジオイメ
ージアナライザー（AMBIS 3000, San Diego, CA）によりスキャンしてトリアシ
ルグリセロール中に取込まれた放射能部分を測定する。活性をpmol/分の単位で
表す。
【０１２１】 実施例2：モルティエレラ・ラマンニアナ培養条件 1リットルの規定グルコース培地（Defined Glucose Media） [逆浸透により精
製した1Lの水（pH5.7）中の30gのグルコース、1.5gの(NH4)2SO4、3gのK2HPO4、0
.3gのMgSO4・7H2O、0.1gのNaCl、5gのCH3COONa・3H2O、10mgのFeSO4・7H2O、1.2mg
のCaCl2・2H2O、0.2mgのCuSO4・5H2O、1.0mgのZnSO4・7H2O、1.0mgのMnCl2・4H2O、2
mgのチアミン-HClおよび0.02mgのビオチン]に1.5〜3 x 106個の胞子を接種し、2
00rpmで振とうしながら30℃で9〜11日間インキュベートすることにより、モルテ
ィエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）を培養する。1層のMiraclo
th（Calbiochem, La Jolla, CA）に通す濾過により、培養を収穫する。過剰の液
体を、手で搾ることにより除去する。収穫された1リットル当たりの充填細胞の
平均収量は22.5gである。
【０１２２】 実施例3：SDS-PAGE分析 カラム画分からのサンプルをSDS-PAGEサンプルバッファー（1xバッファー=2％
SDS w/v、250mM β-メルカプトエタノール、0.0025％ブロモフェノールブルー
）中で希釈し、電気泳動により分析する。ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動
（10〜13％）を、Delepelaire (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:111-115
の改変の一部を伴うLaemmli（(1970) Nature 227:680-685）の方法に従い行う。
ドデシル硫酸ナトリウムは、0.1％で上部貯蔵バッファー中には使用するが、下
部貯蔵バッファー、濃縮用ゲルおよび分離用ゲルには使用しない。該濃縮用ゲル
は30％アクリルアミドストック（アクリルアミド:N,N'-メチレンアクリルアミド
、37.5:1、Bio-Rad、Hercules, CA）の5％、0.06％過硫酸アンモニウムおよび0.
1％ TEMED（v/v）を含有する。該分離用ゲルは、0〜10％ショ糖直線勾配により
安定化された10〜13％直線勾配のアクリルアミドストックを含有する。電気泳動
を室温、150Vの定電圧で7〜9時間行う。タンパク質を、Blumら (1987) Electrop
horesis 8:93-99に従う銀染色またはクーマシーブルー（0.1％ クーマシーブル
ーR-250、50％メタノール(v/v)、10％酢酸(v/v)）染色により可視化する。
【０１２３】 実施例4：DAGATの精製においてKamisakaら (1997)らが用いたクロマトグラフ
ィーの評価 A．脂肪体画分の調製 以下の工程を4℃で行う。
【０１２４】 典型的には、70〜75gの湿潤充填（wet packed）モルティエレラ・ラマンニア
ナ（Mortierella ramanniana）細胞（-70℃で保存）を各脂肪体調製に使用する
。使用直前に、細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーA（10mMリン酸カリウム
(pH7.0)、0.15M KCl、0.5Mショ糖および1mM EDTA）に再懸濁させる。タンパク
質分解を減少させるために、以下のプロテアーゼ阻害剤を加える：0.1μMアプロ
チニン、1μMロイペプチンおよび100μMペファブロック（Pefabloc）（すべてBo
ehringer Mannheim, Germanyから入手）。細胞を5本の管内に分割し、直径1cmの
プローブによる設定#7のポリトロン組織ホモジナイザー（Polytron Tissue Homo
genizer）（Kinematic GmbH, Brinkman Instruments, Switzerland）で7 x 1分
間溶解する。得られたスラリーを遠心管（29 x 104mm）に移し、固体残渣を1500
x g、4℃で10分間の遠心分離（Beckman Instruments, J2-21、JA-20ローター、
3500rpm）によりペレット化する。該上清を除去し、該ペレットを更に5mlのバッ
ファーAで洗浄する。遠心分離後、それらの上清容積を合わせる。この画分を「S
1」と称することにする。S1を6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments
, Fullerton, CA）内に分割し、それぞれに5mlのバッファーB（10mMリン酸カリ
ウム、pH7.0、0.15M KCl、0.3Mショ糖および1mM EDTA）で重層する。サンプルを
100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ロータ
ー, 21000rpm）する。該重層上に浮遊する脂肪体画分（LBF）をスパーテルで回
収し、ガラスホモジナイザー（Potter-Elvehjem）に移す。該遠心管内に残って
いる少量のLBFをピペットで、4mlのバッファーB重層物を取り出しそれを該ホモ
ジナイザー内のLBFと一緒にすることにより回収する。最終的なLBFを40mlのバッ
ファーB中でホモジナイズする。残りの画分を以下のとおりに集める：界面画分
（0.3Mショ糖バッファーと0.5Mショ糖バッファーとの間の界面）、可溶性画分（
該界面下の液体容積）および膜画分（各管の底の褐色／茶色のペレット）。可溶
化および更なる精製のために、すべてを-70℃で凍結保存する。
【０１２５】 B．DAGAT活性の可溶化 LBFを氷上で融解し、Triton X-100（Boehringer Mannheim, Mannheim, German
y）を10％（w/v）ストックから1.3％（w/v）の最終濃度になるまで加えることに
より可溶化を行う。固体ショ糖（Mallinckrodt, Paris, Kentucky）を加えて0.5
Mの最終濃度にする。界面活性剤で処理したサンプルを4℃で1時間振とうし、つ
いで6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments）内に分割する。各管に5
mlのバッファーBを重層する。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Be
ckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。細い管を該重層物
を経由して各遠心管の底から1cm以内にまで挿入し、穏やかな吸引により下側の0
.5Mショ糖層を取り出し、一方、上側の0.3Mショ糖重層（浮遊脂肪層を含む）お
よび該ペレットを後に残すことにより、「Triton X-100抽出物」と称される可溶
化物質を回収する。
【０１２６】 Kamisakaら (1997) 前掲に記載されているプロトコールにおいては、脂肪体画
分が0.1％ (w/v) Triton X-100で可溶化され、さらに100,000 x gで遠心分離ま
たは0.2μmフィルターで濾過されている。Kamisakaら (1997) 前掲に記載されて
いるとおり、DAGAT活性が第1カラムに結合するためには、Triton X-100濃度を1.
5％にまで増加させる必要があった。
【０１２７】 C．DAGATの精製に用いたクロマトグラフィー クロマトグラフィーに使用するバッファーCは、10mMリン酸カリウム(pH7.0)、
0.1％ Triton X-100（w/v）（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）、10
％グリセロール（w/v）、0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチン、100μMペフ
ァブロック（すべてBoehringer Mannheim, Mannheim, Germanyから入手）および
種々の量の塩化カリウム（75〜500mM）を含有する。このバッファーは、エチレ
ングリコールの代わりにグリセロールが使用され、EDTA、DTTおよびPMSFを使用
せずにアプロチニン、ロイペプチンおよびペファブロックが加えられている点で
、Kamisakaら (1997) 前掲で使用された対応カラムバッファーとは異なる。Kami
sakaら (1997) 前掲によるプロトコールに従い、イエロー86-アガロース（Sigma
R-8504, St. Louis, MO）カラム（1.5cm x 5.8cm）を調製し、バッファーC中の
150mM KClで平衡化する。Triton X-100抽出物中に存在するDAGAT活性の大部分は
該イエロー86-アガロースカラムに結合しなかった。しかしながら、アプライし
たサンプルのKCl濃度を等容積のバッファーC（KClを含まない）で75mMまで希釈
することにより、該DAGATの有意な部分がカラムに結合した。それに応じて、該
イエロー86-アガロースカラムをバッファーC中の75mM KCl中で平衡化する。該サ
ンプルを0.56ml/分でアプライした後、該カラムを4カラム体積の平衡バッファー
で洗浄する。該カラムに結合したDAGAT活性およびタンパク質をバッファーC中の
500mM KClで溶出する（図1）。
【０１２８】 イエロー86-アガロースカラム（画分17〜20）から溶出したDAGAT活性をバッフ
ァーCで1:3.33に希釈してKCl濃度を150mMまで減少させる。該希釈化プール（103
ml）を、0.2ml/分でバッファーC中で150mM KClで平衡化したヘパリン-セファロ
ースCL-6Bカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden, 0.5cm x 4.8cm）にアプライす
る。該カラムを5容積の平衡バッファーで洗浄し、DAGAT活性およびタンパク質を
バッファーC中の150〜500mM KClの直線勾配（15ml）中で溶出する。DAGAT活性は
、2つの重複したピークとして溶出する。第1ピークは、Kamisakaら (1997) 前掲
により見出されているとおり該勾配中に溶出する。第2ピークは、それよりはる
かに少量のタンパク質と共に該勾配の終了時に溶出し（図2A）、このことはKami
sakaらにより見出されていない。
【０１２９】 ヘパリンカラムからのそれらの2つのピーク画分の一部（250μl）を、バッフ
ァーC中の150mM KClで平衡化されたSuperdex-200カラム（1 x 30cm, Bio-Rad, H
ercules, CA）上のサイズ排除クロマトグラフィー（0.2ml/分）により更に精製
する。専ら校正のために、該カラムを、Triton X-100がTriton X-100 R（Calbio
chem, La Jolla, CA）で置換された修飾バッファーC中の150mM KClで平衡化する
。該カラムを、Bio-Rad Gel Filtration Standardsを使用して校正する。ヘパリ
ン-セファロースCL-6Bからのそれらの2つのピークのそれぞれからのDAGAT活性は
99kDaの推定分子量で溶出する。
【０１３０】 より後にヘパリンカラムから溶出するピークについて、追加的なクロマトグラ
フィーを行う。それは、より高い特異的活性にてDAGATを含有していた。この場
合、ヘパリンカラムからの第2ピーク（画分36〜41）をバッファーCで1:6.6に希
釈して46.7mlとする。該サンプルを、0.5ml/分でバッファーC中の75mM KClで平
衡化されたイエロー86アガロースカラム（1.0cm x 64cm）にアプライする。5カ
ラム容積の平衡バッファーで洗浄した後、結合タンパク質およびすべてのDAGAT
活性はバッファーC中の75〜500mM KCl直線勾配（40ml）中で溶出する。DAGAT活
性は単一のピークとして溶出する（図3A）。
【０１３１】 ヘパリンおよび第2イエロー86カラムからのDAGAT活性を含有する画分のタンパ
ク質組成を、実施例3のプロトコールに従い勾配SDS-PAGEにより分析する。タン
パク質のバンドを銀染色により検出する。これらのカラムから溶出するバンドの
パターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する。DAGAT活
性の存在と相関する多数のタンパク質候補が存在する。この精製プロトコールは
、DAGAT活性に関連した特定のタンパク質候補を同定するには不十分である（図2
B、3B）。
【０１３２】 実施例5：DAGATタンパク質候補の同定のための新規精製プロトコール A．脂肪体画分の調製 以下の工程は4℃で行う。
【０１３３】 典型的には、70〜75gの湿潤充填（wet packed）モルティエレラ・ラマンニア
ナ（Mortierella ramanniana）細胞（-70℃で保存）を各脂肪体調製に使用する
。使用直前に、細胞を氷上で融解し、150mlのバッファーA（10mMリン酸カリウム
(pH7.0)、0.15M KCl、0.5Mショ糖および1mM EDTA）に再懸濁させる。タンパク
質分解を減少させるために、以下のプロテアーゼ阻害剤を加える：0.1μMアプロ
チニン、1μMロイペプチンおよび100μMペファブロック（Pefabloc）（すべてBo
ehringer Mannheim, Germanyから入手）。サンプルを、0.5mmガラスビーズを使
用する細胞破壊機（Bead-Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK）で溶
解する。該サンプルチャンバを180mlのガラスビーズで満たす。湿潤充填細胞を
氷上で融解し、150mlのバッファーAに再懸濁させる。該細胞スラリーを該ガラス
ビーズ上に注ぐ。一般には、適切に機能するよう該チャンバを満たすためには、
さらに40〜50mlのバッファーAが必要である。この容積を用いて、その元の容器
からの細胞スラリーの残りをリンスし、それを該サンプルの残りと一緒にする。
細胞を、該サンプルの粘度に応じて45〜90秒間粉砕する（「ホモジナイズ」設定
）。ガラスビーズを含有する細胞スラリーを何本かの管（29 x 104mm）内に分割
し、500 x g、4℃で遠心分離（Beckman Instruments, GP遠心機、GH3.7 Horizon
talローター、1500rpm）する。該上清を除去し、該ペレットを更に5mlのバッフ
ァーAで洗浄する。遠心分離後、それらの上清容積を合わせる。この画分を「S1
」と称することにする。S1を6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments
）内に分割し、それぞれに5mlの修飾バッファーB（10mMリン酸カリウム、pH7.0
、0.15M KClおよび0.3Mショ糖）で重層する。EDTAは、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィーを妨げるため、バッファーBからEDTAを除く（実施例4を参照さ
れたい）。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments
, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。該重層上に浮遊する脂肪体画分（LBF
）をスパーテルで回収し、ガラスホモジナイザーに移す。該遠心管内に残ってい
る少量のLBFをピペットで、4mlのバッファーB重層物を取り出しそれを該ホモジ
ナイザー内のLBFと一緒にすることにより回収する。最終的なLBFを40mlのバッフ
ァーB中でホモジナイズする。残りの画分を以下のとおりに集める：界面画分（0
.3Mショ糖バッファーと0.5Mショ糖バッファーとの間の界面）、可溶性画分（該
界面下の液体容積）および膜画分（各管の底の褐色／茶色のペレット）。可溶化
および更なる精製のために、すべてを-70℃で凍結保存する。
【０１３４】 B．脂肪体画分からのDAGAT活性の可溶化 可溶化の前に、ウシ血清アルブミンを標準物として使用するBradford（Bio-Ra
d Reagent, Hercules, CA）の方法により脂肪体画分のアリコートでタンパク質
の測定を行う。LBFを氷上で融解し、タンパク質1mg/mlの濃度になるまで希釈し
、界面活性剤:タンパク質の比が15:1（w/w、1.3％ Triton X-100と等価）になる
までTriton X-100で処理する。固体ショ糖（Mallinckrodt, Paris, Kentucky）
を加えて0.5Mの最終濃度にする。界面活性剤で処理したサンプルを4℃で1時間振
とうし、ついで6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments）内に分割す
る。各管に5mlの修飾バッファーBを重層する。サンプルを100,000 x g、4℃で3
時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M, SW-28ローター, 21000rpm）する。
細い管を該重層物を経由して各遠心管の底から1cm以内にまで挿入し、穏やかな
吸引により下側の0.5Mショ糖層を取り出し、一方、上側の0.3Mショ糖重層（浮遊
脂肪層を含む）および該ペレットを後に残すことにより、「Triton X-100抽出物
」と称される可溶化物質を回収する。
【０１３５】 C．DAGATカラムクロマトグラフィー 該タンパク質を更に精製するために、イエロー86-アガロースおよびそれに続
くヒドロキシアパタイトによりクロマトグラフィーの精製方法を用いる。該方法
を2通りに行う。プロトコールAでは、活性を第1カラムに結合させ、溶出後、画
分を活性に関してアッセイする。ついで該活性画分をプールし、第2カラムにア
プライする（連続的実施（sequential run）とも称される）。プロトコールBで
は、活性を第1カラムに結合させ、ついで第2カラム上に直接的に溶出および流出
させ、それらの間にプールしたりアッセイしたりしない（タンデム実施とも称さ
れる）。
【０１３６】 プロトコールAにおいては、Triton X-100抽出物を、2ml/分でバッファーC（実
施例4．C）中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（2.5cm x 6
.4cm）にアプライする。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで洗浄し、つ
いでバッファーC中の500mM KClで0.5ml/分で溶出する（図4）。溶出した活性の9
3％を含有する最も活性な2つの画分（64および65）をプールし、5ml/分でバッフ
ァーC中の500mM KClで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Gel HT, Bi
o-Rad, 1cm x 25.5cm）上にローディングする。DAGAT活性体はカラムを通って流
れるが、該タンパク質の大部分は該カラムに結合する。該カラムを3容積の平衡
バッファーで洗浄する。結合タンパク質をバッファーC中の100mMリン酸二カリウ
ムおよび500mM KClで0.5ml/分で溶出する（図5A）。DAGAT活性ピークを含有する
画分の一部を、実施例9に記載のとおりに勾配ゲルSDS-PAGE上で泳動させる。該
タンパク質を銀染色し、該バンドのパターンを画分ごとに該活性プロフィールと
比較する（図5B）。いくつかのDAGATタンパク質候補が活性と相関する。特に、4
3kD、36.5kD、33kDa、29kD、28kDおよび27kDにほぼ対応する位置に移動するバン
ドに注意すべきである。活性と相関する53kDの領域内の候補タンパク質は存在し
ないらしい。
【０１３７】 プロトコールBにおいては、Triton X-100抽出物を、1ml/分でバッファーC中の
75mM KClで平衡化しイエロー86-アガロースカラム（1.5cm x 5.8cm）にアプライ
する。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで洗浄する。ついで、イエロー8
6-アガロースカラムからの出口を、バッファーC中の500mM KClで平衡化したヒド
ロキシアパタイトカラム（1.0cm x 26.2cm, Bio-Gel HT, Bio-Rad, Hercules, C
A）の入口に接続する。イエロー86カラムに結合したDAGAT活性を、500mM KClを
含有する110mlのバッファーCで溶出し、0.2ml/分でヒドロキシアパタイトカラム
に直接通す。最後に、該ヒドロキシアパタイトカラムを該イエロー86-アガロー
スカラムから取り外し、該ヒドロキシアパタイトカラムに結合したタンパク質を
バッファーC中の100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで溶出する。DAGAT活性
は、500mM KClを含有するバッファーCでの110mlの洗浄中に集めたヒドロキシア
パタイトカラムからの画分内に見出される。
【０１３８】 Triton X-100抽出物中のタンパク質の大部分はイエロー86-アガロースカラム
に結合しない。それを廃棄する。DAGATを含む小さなタンパク質サブセットはイ
エロー86-アガロースカラムに結合し、それを、バッファーC中の500mM KClで溶
出する。この溶出物を該ヒドロキシアパタイトカラムにアプライした場合、DAGA
T活性は流出し、一方、残留タンパク質のほとんどは該カラムに結合し、分離さ
れる（図6A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を勾配ゲルSDS-PAGE上で
泳動させ、銀染色する。これらのカラムから溶出するバンドのパターンを画分ご
とに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する。染色されたタンパク質バ
ンドを調べてみると、約33kDaにおけるタンパク質がDAGAT活性と最も良く相関す
ることが示される（図6B）。
【０１３９】 図5Bに示される36.5kDa候補体および図6Bに示される33kDa候補体からのタンパ
ク質配列は実施例8および9に記載のとおりに得、該ペプチドを使用して該データ
ベースを検索する。36.5kDa候補体から得たペプチドはグリセルアルデヒド-3-リ
ン酸（GAP）デヒドロゲナーゼとマッチした。該33kDa候補体からのペプチドに対
する最良のマッチ体はRNAヘリカーゼである。
【０１４０】 実施例6：DAGATを同定するための修飾プロトコール A．脂肪体画分の調製 以下の工程は4℃で行う。
【０１４１】 典型的には、70〜75gの湿潤モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ram
anniana）充填細胞（-70℃で保存）を各脂肪体調製に使用する。使用直前に、細
胞を氷上で融解し、150mlのバッファーA（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、1M KCl
、0.5Mショ糖、1mM EDTA）に再懸濁させる。可溶性タンパク質の非特異的結合を
減少させるために、KCl濃度を0.15Mから1Mに増加させる。タンパク質分解を減少
させるために、以下のプロテアーゼ阻害剤を加える：0.1μMアプロチニン、1μM
ロイペプチンおよび100μMペファブロック（Pefabloc）（すべてBoehringer Man
nheim, Germanyから入手）。サンプルを、0.5mmガラスビーズを使用する細胞破
壊機（Bead-Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK）で溶解する。該サ
ンプルチャンバを180mlのガラスビーズで満たす。湿潤充填細胞を氷上で融解し
、150mlのバッファーAに再懸濁させる。該細胞スラリーを該ガラスビーズ上に注
ぐ。一般には、適切に機能するよう該チャンバを満たすためには、さらに40〜50
mlのバッファーAが必要である。この容積を用いて、その元の容器からの細胞ス
ラリーの残りをリンスし、それを該サンプルの残りと一緒にする。溶解中に該サ
ンプルを冷却温度に維持するために、該チャンバを氷で包囲する。細胞を15秒間
粉砕し（「ホモジナイズ」設定）、ついで1分間冷却し、この操作を2回繰返す。
ガラスビーズを含有する細胞スラリーを何本かの管（29 x 104mm）内に分割し、
1500 x g、4℃で10分間遠心分離（Beckman Instruments, GP遠心機、GH3.7 Hori
zontalローター、2460rpm）する。該上清を除去し、該ペレットを更に5mlのバッ
ファーAで洗浄する。遠心分離後、それらの上清容積を合わせる。この画分を「S
1」と称することにする。S1を6本の超遠心管（25 x 89mm, Beckman Instruments
）内に分割し、それぞれに5mlの修飾バッファーB（10mMリン酸カリウム、pH7.0
、1M KClおよび0.3Mショ糖）で重層する。EDTAはヒドロキシアパタイトクロマト
グラフィーを妨げるため、バッファーBからEDTAを除く（実施例4を参照されたい
）。サンプルを100,000 x g、4℃で3時間遠心分離（Beckman Instruments, L8-M
, SW-28ローター, 21000rpm）する。該重層上に浮遊する脂肪体画分（LBF）をス
パーテルで回収し、可溶化のためにガラスホモジナイザーに移す。残りの画分を
以下のとおりに集める：可溶性画分（該脂肪体画分の下の液体容積）、および膜
画分（各管の底の褐色／茶色のペレット）を各管からプールし、アッセイのため
に取っておく。膜画分を3.8〜4mlの修飾バッファーA（KCl濃度は75mM KClにまで
減少している）に再懸濁させる。
【０１４２】 B．脂肪体画分からのDAGAT活性の可溶化 同じ日に、最終的なLBFを50mlの可溶化バッファー（10mMリン酸カリウム （pH
7.0）、75mM KCl、0.5Mショ糖、1.5％ Triton X-100）中でホモジナイズし、該
ホモジネートを90,000 xg、で1.8時間遠心分離（SW-28、27k rpm）する。遠心分
離後、浮遊している脂質層を捨て、可溶化層（Triton X-100抽出物）をプールし
、さらなる精製のために-70℃で保存する。該Triton X-100抽出物は、さらに希
釈することなくそのまま第1カラムにローディングできる。
【０１４３】 C．イエロー86-アガロースおよびHAをタンデム方式（プロトコールB）で使用
するDAGATカラムクロマトグラフィー 実施例5に記載のプロトコールと比較するために、1つの脂肪体画分を実施例5B
に記載のとおりに調製し（低塩）、もう1つの脂肪体画分を実施例6Bに記載のと
おりに調製する（高塩）。各調製物をTriton X-100で可溶化する。該Triton X-1
00抽出物を、実施例5C、プロトコールBに記載のイエロー86-アガロースおよびヒ
ドロキシアパタイトによるクロマトグラフィーに付す。図7A（高塩）および7B（
低塩）に示すとおり、該高塩調製物において回収されたタンパク質の量は、低塩
調製物において回収された量より多い。後続のすべての調製は、実施例6A/Bに記
載の高塩プロトコールを用いて行う。
【０１４４】 また、これらの2つの比較用調製物は、SDS-PAGE分析後、特に高塩プロトコー
ルを用いた場合に、これまでに認められていない追加的なDAGATタンパク質候補
を示している。それらの2つの精製物から活性画分を、HA実施例8Bに記載のとお
りにカラムからの画分を沈殿させることによりゲル内消化用に調製し、実施例8C
に記載のとおりに勾配ゲルSDS-PAGEにより分離する。約55、50、39、36.5、36、
33、32.5、32、29および27kDaのサイズのクーマシー染色タンパク質を、該高塩
調製物から作製したゲルから切り出す（図7A）。約39、36.5、36、35、32、31、
29および27kDaのサイズのクーマシー染色タンパク質を、低塩調製物から作製し
たゲルから切り出す（図7B）。これらの候補を、後にタンパク質配列決定に使用
するために-70℃で保存する。該高塩調製物からの36kDaのバンドをMr18と命名し
た。該低塩調製物からの36kDaのバンドをMr19と命名した。
【０１４５】 D．イエロー86-アガロース、ヒドロキシアパタイトおよびヘパリンを使用する
DAGATカラムクロマトグラフィー 実施例6Bに記載のTriton X-100を融解し、2ml/分でバッファーC（10mMリン酸
カリウム (pH7.0)、0.1％ (w/v) Tx-100、10％ (w/v)グリセロール）中の75mM K
Clで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（2.5cm x 64cm）にアプライする
。該タンパク質のほとんどは該カラムに結合しないが、該タンパク質およびDAGA
T活性の一部は該カラムに結合する。該カラムを5カラム容積の平衡バッファーで
洗浄し、ついで結合タンパク質およびDAGAT活性をバッファーC中の75〜500mM KC
lの直線勾配120mlで2ml/分で溶出する。画分を直ちにアッセイし、活性画分をプ
ールし、YM-30膜を備えた加圧攪拌セル（Amicon）を使用する限外濾過により8倍
濃縮する。該濃縮物を、0.5ml/分でバッファーC中の500mM KClで平衡化したヒド
ロキシアパタイトカラム（約1.0cm x 26cm、Bio-Gel HT、Bio-Rad、Hercules、C
A）上にローディングし、該カラムを40mlの平衡バッファーで洗浄する。DAGAT活
性は該流動液および洗液中に見出されるため、結合タンパク質はこの実験では溶
出しない。活性画分をプールし、1:3.3に希釈して、KCl濃度を500から150mMに減
少させる。該希釈サンプルを、0.5ml/分でバッファーC中の150mM KClで平衡化し
たヘパリンカラム（0.55 x 4.7cm）にアプライする。該カラムを5容積の平衡バ
ッファーで洗浄し、結合タンパク質をバッファーC中の150〜500mM KClの直線勾
配10ml中で0.25ml/分で溶出する。該勾配の後、該カラムをバッファーC中の15容
積の500mM KClで0.25ml/分で洗浄する。DAGAT活性は2つのピークとして溶出し、
そのうちの1つは該勾配中に、1つは該勾配後の500mM KCl洗浄中に溶出する。該
カラムプロフィールにわたる画分（DAGAT活性を含有する画分を含む）を、実施
例8と同様の沈殿により濃縮する。該沈殿サンプルを勾配ゲルSDS-PAGEにより分
離し、該ゲルを銀染色する（実施例3に記載のとおり）。該カラムから溶出する
バンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する
（実施例8A）。該染色タンパク質バンドの検査は、約36kDa〜約37kDaのサイズ範
囲のタンパク質が、500mM KClでの洗浄中に溶出するピーク中に見出されるDAGAT
活性と最も良く相関することを示している（図8B）。この情報に基づき、実施例
6Cに記載の2つのゲルから切り出した36〜約37kDaのタンパク質のバンドをゲル内
消化およびタンパク質配列決定に送る。
【０１４６】 実施例7：モルティエレラ・ラマンニアナからのDAGATタンパク質候補を同定す
るための精製プロトコールの大規模化 実施例6Dに記載の精製プロトコールは、2つの可能なDAGAT形態がこの調製物中
に存在しうることを示しているが、精製の最終工程においては、タンパク質の配
列決定に進めるには不十分なタンパク質しか存在していない。したがって、該プ
ロトコールの大規模化を行った。
【０１４７】 A．イエロー86-アガロースによる大規模化 実施例6Aおよび6Bに記載のTriton X-100抽出物を融解し、2ml/分でバッファー
C（10mMリン酸カリウム (pH7.0)、0.1％ (w/v) Tx-100、10％ (w/v)グリセロー
ル）中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（25cm x 6.4cm）
にアプライする。該タンパク質のほとんどは該カラムに結合しないが、該タンパ
ク質およびDAGAT活性の一部は該カラムに結合する。該カラムを5カラム容積の平
衡バッファーで洗浄し、ついで結合タンパク質およびDAGAT活性をバッファーC中
の500mM KClで2ml/分で溶出する（図9）。該DAGAT活性は精製のこの段階の凍結
／融解に安定であるため、この段階では溶出画分を典型的には-70℃で保存する
。また、実施例1Bに従い、溶出画分をDAGAT活性に関してアッセイする。
【０１４８】 B．ヒドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィー 4つの調製物をイエロー86-アガロースで精製した後、最も活性な画分をプール
し、限外濾過（Amicon攪拌セル、YM-30膜）により12〜14倍濃縮し、バッファーC
中の500ml KClで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Gel HT、Bio-Rad
、1cm x 25.5cm）にアプライ（0.5ml/分）する。サンプルのローディングに要す
る時間を短縮するために、HAクロマトグラフィーの前に該サンプルの濃縮を行う
。DAGAT活性は該カラム内を流れるが、残りのタンパク質の大部分は該カラムに
結合し分離される。該カラムを3容積の平衡バッファーで洗浄する。結合タンパ
ク質をバッファーC中の100mMリン酸二カリウムおよび500mM KClで0.5ml/分で溶
出する（図10A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を、実施例3に記載の
とおりに勾配ゲルSDS-PAGE上で泳動させる。該タンパク質を銀染色し、該バンド
のパターンを画分ごとに、該活性プロフィールと比較する（図10B）。いくつか
のDAGATタンパク質候補は活性と相関する。特に、約36.5kD、36kD、35kDa、34kD
、33kD、33kDおよび31kDに対応する位置に泳動するバンドに注目すべきである。
この場合もまた、活性と相関する既に記載されている53kDの領域内には候補タン
パク質は存在しないらしい。
【０１４９】 C．ヘパリン上でのクロマトグラフィー ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後は、DAGAT活性は凍結／融解に適
さないため、画分を直ちにアッセイし、活性画分を更なるクロマトグラフィーの
ためにプールする。該プールをバッファーCで希釈して、KCl濃度を500mMから150
mM KClに減少させる。該希釈化プールを、バッファーC中の150mM KClで平衡化し
たヘパリンカラム（0.55 x 4.7cm）にローディングする。タンパク質およびDAGA
T活性は、バッファーC中の150〜500mM KClの勾配（10ml）およびそれに続くバッ
ファーC中の500mM KClでの10mlの洗浄中に溶出する。DAGAT活性は2つのピーク中
に溶出する。鋭いピークは該KCl勾配中に、よりブロードなもう1つのピークは該
洗浄中に見出される（図11A）。DAGAT活性ピークを含有する画分の一部を勾配ゲ
ルSDS-PAGE上で移動させ、銀染色する。該カラムから溶出するバンドのパターン
を画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィールと比較する。それらの染色タ
ンパク質バンドを検討することにより、36kDaにおけるタンパク質が、該ブロー
ドピークにおいて見出されるDAGAT活性と最も良く相関することが示される（図1
1B）。いくつかのタンパク質（約36.5kDa、35kDa、34kDaのタンパク質）は、そ
の鋭いピークにおいて見出される活性に関連している。約33kDaおよび約31kDaに
おける候補体はDAGAT活性と相関していないらしい。表1は、ヘパリンによる該15
00 x g画分からの精製倍率を示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】 同定した4つの候補（約36.5kDa、36kDa、35kDaおよび34kDaにおけるもの）を
、実施例8Bに記載のヘパリンカラムからの画分の沈殿によりゲル内消化のために
準備し、実施例8Cに記載のとおり勾配ゲルSDS-PAGEにより分離する。このように
して、DAGAT候補のそれぞれからペプチドマップを得、個々のペプチドをタンパ
ク質配列決定用に選択する。
【０１５２】 D．勾配溶出によるイエロー86-アガロース上でのクロマトグラフィー もう1つの精製プロトコールを検討するために、DAGATを実施例6Aに記載のとお
りにヒドロキシアパタイトにより精製し、75mM KClにまで希釈し、ついで、バッ
ファーC中の75mM KClで平衡化したイエロー86-アガロースカラム（1.3cm x 6.3c
m）にアプライする。該カラムを25mlの平衡バッファーで洗浄し、結合タンパク
質をバッファーC中の75〜500ml KClの40mlの勾配にわたり溶出する。実施例1Bに
記載のとおり、画分をDAGAT活性に関してアッセイする。DAGAT活性は該勾配の中
央部分に単一のピークとして出現する。DAGAT活性を含有する画分を、実施例8B
と同様の沈殿により濃縮し、実施例8Cと同様のSDS-PAGEにより分離する。該カラ
ムから溶出するバンドのパターンを画分ごとに、それぞれのDAGAT活性プロフィ
ールと比較する（図12A）。該34kDa候補体は該勾配の初期に溶出し、DAGAT活性
とは相関しないらしい（図12B）。それぞれMr21、Mr22、Mr23と称される残りの3
つのタンパク質候補体（約36.5kDa、36kDaおよび35kDa）はDAGAT活性と相関する
。
【０１５３】 実施例8：ゲル内消化のためのタンパク質の調製 タンパク質候補を同定した後、配列決定に十分な量を調製する必要がある。タ
ンパク質配列決定は、当技術分野で公知の多種多様な方法により行うことができ
る。1つの技術は、SDS-ポリアクリルアミドゲル中でもなお、トリプシンなどの
酵素を使用する該タンパク質の消化を行うことを含む。いくつかの商業的企業が
、このようにしてペプチドを得るためのプロトコールを確立している。ペプチド
の生成後、標準的な技術を用いてそれらを分離し配列決定する。
【０１５４】 タンパク質候補をゲル精製するためには、液体サンプルが該ゲル上にローディ
ングされうるよう該液体サンプルをまず濃縮することが必要となることが多い。
大量の界面活性剤を含有するサンプルは特別な問題を引き起こしうる。該界面活
性剤のミセルサイズに応じて、それは限外濾過中に濃縮され、電気泳動中に問題
を引き起こしうる。したがって、タンパク質サンプルを濃縮する別の方法を用い
る必要がある。
【０１５５】 A．濃縮によるSDS-PAGE用サンプルの調製 画分を、適当な分子量保持限界の膜を備えた加圧セル内で濃縮することができ
る。あるいは、個々のユニット [例えばCentricon-30（Amicon, Inc., Beverly,
MA）などの製品] 内での遠心分離による濾過により該サンプルを約50μlの容積
にまで濃縮することができる。濃縮後、サンプルをローディングバッファー（例
えば、Laemmli）で処理することができる。
【０１５６】 B．沈殿によるSDS-PAGE用サンプルの調製 サンプルを沈殿により濃縮することが望ましいこともある。これは、酸および
／またはアセトンを使用して達成されうる。典型的なプロトコールは、トリクロ
ロ酢酸（TCA）を濃縮ストック（40％〜50％ (w/v)）から7〜10％ (w/v)の最終濃
度になるまで加えることであろう。氷上で約10分後、該サンプルを遠心分離（12
,000 x g、4℃で15分間）して、沈殿したタンパク質をペレット化させる。該上
清を除去し、沈殿した界面活性剤を除去するために、該ペレットを氷冷アセトン
で洗浄し、再遠心分離する。沈殿物をサンプルローディングバッファー（すなわ
ち、実施例3と同様のLaemmliまたはSDS-PAGEサンプルバッファー）と共に再懸濁
させる。実施例3に記載のとおり実験室内で成型したゲルまたは業者により調製
されたゲルを使用してSDS-PAGEを行うことができる。
【０１５７】 C．SDS-PAGE ゲルをローディングする前のサンプルの加熱は行っても行わなくてもよい。い
くつかの膜タンパク質は加熱の際に凝集する傾向があることが認められている。
この場合、サンプルを、一般には、室温で15分間放置した後のゲルにアプライす
る。アクリルアミドゲルは商業的に購入するか、あるいは実験室内で調製するこ
とができる。10〜13％ (w/v)アクリルアミドゲルを調製するための1つのプロト
コールは実施例3に記載されている。電気泳動後、該ゲルを50％ (v/v)メタノー
ル、10％ (v/v)酢酸中の0.1％ (w/v)クーマシーブルーで染色し、ついで脱染す
ることができる。脱染は、Gel-Clear（Novex, San Diego, Ca）などの市販品を
使用して、あるいは50％ (v/v)メタノール、10％ (v/v)酢酸中で行うことができ
る。ついでタンパク質候補を該ゲルから切り出し、さらに脱染を行って又は行う
ことなくゲル内消化に送ることができる。
【０１５８】 実施例9：アミノ酸配列の決定 タンパク質の配列決定をサービスとして提供する商業的施設が設立されている
。利用可能な技術のなかでは、トリプシンなどのエンドペプチダーゼを使用する
ゲル内消化によるペプチドの生成およびそれに続くHPLC精製が最も有用であるこ
とが判明している。PVDF上でのN末端配列決定、およびそれより低度ではあるがP
VDFタンパク質の限定臭化シアン処理によるペプチドの生成も、成功につながる
ことが判明している。ゲル内消化のための方法は、定量およびアミノ酸組成に関
するゲル切片の一部（10〜15％）のアミノ酸分析、タンパク質分解酵素（トリプ
シンまたはリシルエンドペプチダーゼ）の1つによるタンパク質の消化、および
逆相HPLCによる該産物の分画を含みうる。タンパク質配列決定の前に該ペプチド
の存在、量および質量を測定するために、吸光ピークをHPLCの実施から選択し、
レーザー脱離質量分析法に付すことができる。マイクロシークエンシング（micr
osequencing）には最長のペプチドを選択する。特に、DAGAT候補をゲル精製し、
ゲル内消化およびマイクロシークエンシングのためにArgo Bioanalytica（商業
的サービス）に送る。
【０１５９】 実施例10：トリプシンにより生成したペプチドのアミノ酸配列 実施例9に記載のとおりのトリプシン消化により約36kDaのタンパク質から生成
したペプチド（MR1とも称される）（実施例6Cおよび6Dを参照されたい）のアミ
ノ酸配列は、以下のとおりである（配列の番号の最初の2つの数字は、実施例6C
および7Cに記載のMrバンドを示す）。
【０１６０】
【表２】
【０１６１】 実施例9に記載のとおりにトリプシン消化により約36.5kDaのタンパク質から生
成したペプチド（MR2とも称される）（実施例7Bを参照されたい）のアミノ酸配
列は、以下のとおりである。
【０１６２】
【表３】
【０１６３】 該アミノ酸配列は、1文字のコードを用いて表されている。小文字で表された
アミノ酸は、より低い信頼度で同定された残基を表す。該35kDa候補体（実施例7
CにおけるMr23）のペプチドマップは、該36.5候補体（実施例7CにおけるMr21）
のペプチドマップに実質的に類似している。
【０１６４】 前記ペプチドのアミノ酸配列を公的および私的データベース中の公知タンパク
質配列と比較する。DAGATペプチドと、既知機能の酵素をコードするいずれの配
列（例えば、SDS-PAGEにおいて約36kDaに泳動するグリセルアルデヒド3-リン酸
（GAP）デヒドロゲナーゼのいずれの部分）との間にも、有意な相同性は見出さ
れない。
【０１６５】 実施例11：モルティエレラ・ラマンニアナDAGAT核酸配列の同定 一般に、mRNAから逆転写された一本鎖DNA鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）プライマーとして使用するために、DAGATペプチドをコードする配列に対応
するセンス配向の配列を含有するオリゴヌクレオチドを調製する。該コードDNA
鎖の増幅の「リバース」反応のために、DAGATペプチドをコードする配列に相補
的な配列を含有するオリゴヌクレオチドを設計することができる。
【０１６６】 あるいは、PCR用のDNA鋳型の調製に使用するプライマーの一部と同一となるよ
う、オリゴヌクレオチドを設計することができる。このオリゴヌクレオチドは「
フォワード」または「リバース」プライマー（前記のとおり）として使用するこ
とができる。
【０１６７】 DAGATペプチド配列が、多数の異なるコドンにコードされうるアミノ酸を含有
する場合には、フォワードまたはリバースプライマーは「縮重」オリゴヌクレオ
チド（すなわち、ある特定のペプチド領域に関する可能なコード配列の全部また
は一部の混合物を含有するもの）であってもよい。そのような混合物中に存在す
る異なるオリゴヌクレオチドの数を減少させるために、PCRプライマー用の合成
オリゴヌクレオチドを調製する際には最小数の可能なコード配列を有するペプチ
ド領域を選択することが好ましい。
【０１６８】 A．DAGAT MR1の同定 モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1の核酸
配列を同定するために、ペプチド18-151を使用して縮重プライマー5'-CACTGCAGA
CRAAYTCNARYTCYTTNAC-3'（配列番号25）を設計し、ペプチド18-208を使用してプ
ライマー5'-CCAAGCTTGGNGTNTTYAAYTAYGAYTTYG-3'（配列番号26）および5'-CACTG
CAGCRAARTCRTARTTRAANACNCC-3'（配列番号27）を設計し、ペプチド18-164を使用
してプライマー5'-CACTGCAGCYTGNACNGCNGCRTGCATRTA-3'（配列番号28）を設計し
、ペプチド18-219-1を使用してプライマー5'-CCAAGCTTATHGCNGTNCARACNGGNGC-3'
（配列番号29）を設計し、ペプチド19-181を使用してプライマー5'-CCAAGCTTAAR
CAYCCNATHTAYACNAT-3'（配列番号30）および5'-CACTGCAGACDATNGTRTADATNGGRTG-
3'（配列番号31）を設計し、ペプチド19-169を使用してプライマー5'-CCAAGCTTG
CNYTNGGNTTYACNATGCC-3'（配列番号32）、5'-CCAAGCTTTTYACNATGCCNYTNTTYCA-3'
（配列番号33）および5'-CACTGCAGAARTGRAANARNGGCATNGT-3'（配列番号34）を設
計する。
【０１６９】 PCRにより得たDNA断片を、実施例10のペプチド中に見出されるアミノ酸配列を
コードする核酸配列に関して分析する。モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortie
rella ramanniana）DAGAT MR1タンパク質に対応する全コード領域を得るために
、MR1配列を含有する部分cDNAクローンの5'および3'末端を増幅するよう合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを設計する。プライマーをモルティエレラ・ラマン
ニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1配列に従い設計し、それをRACE（R
apid Amplification of cDNA Ends）反応（Frohmanら (1988) Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85:8998-9002）において使用する。cDNAクローンからのフランキン
グ配列の増幅を、Marathon cDNA Amplificationキット（Clontech, CA）を使用
して行う。例えば、3'RACEプライマー RACE5'-GGTTTGCTCCCCCATCGCCATCCTATC-3'
（配列番号35）および5'RACEプライマー5'-GATAGGATGGCGATGGGGGAGCAAACC-3'（
配列番号36）でPCR反応を行うことができる。このようにして、1065ヌクレオチ
ドの完全なMR1コード配列を決定する（配列番号37）。MR1 DAGATの推定タンパク
質配列も決定する（配列番号38）。核酸配列に関して分析し原核性および真核性
の両方の種々の宿主内でのDAGATの発現に使用しうるDAGAT核酸配列を得る。
【０１７０】 製造業者のプロトコール（Clonetech）に従い作製したモルティエレラ・ラマ
ンニアナ（Mortierella ramanniana）Marathon cDNAライブラリーからのオープ
ンリーディングフレーム（ORF）をPCR増幅するために、プライマー5-AATTCGCGGC
CGCATGGCCAGCAAGGATCAACATTTACAGC-3'（配列番号39）および5'-TGCTGCAGCTATTCG
ACGAATTCTAGTTCTTTTACCCGATCC-3'（配列番号40）を使用する。これらのプライマ
ーは、該ORFの5'および3'末端にそれぞれNotIおよびPstI制限部位を導入する。
該PCR産物を、製造業者のプロトコール（Invitrogen）に従いプラスミドpCR2.1
内にクローニングして、プラスミドpCGN8707を得る。PCR増幅により誤りが導入
されていないことを確認するために、二本鎖cDNA配列を得る。バキュロウイルス
発現系を使用して昆虫細胞内でエム・ラマンニアナ（M. ramanniana）DAGAT MR1
タンパク質を発現させるために、pCGN8707のNotI-PstI断片を、NotI-PstIで消化
されたプラスミドpFASTBAC1（Gibco）内にクローニングし、得られたプラスミド
pCGN8708を大腸菌（E. coli）DH10BAC（Gibco）内に形質転換する。バクミド（b
acmid）DNAを使用して昆虫細胞をトランスフェクトする。植物内でモルティエレ
ラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR1配列を発現させるため
に、pCGN8708のNotI-Pst1断片を、NotI-PstIで消化されたバイナリーベクターpC
GN8622内にクローニングして、ナピン（napin）プロモーターの制御下のプラス
ミドpCGN8709を得る。プラスミドpCGN8709をアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）EHA105内に導入する。
【０１７１】 B．DAGAT MR-2の同定 モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT MR2の核酸
配列を同定するために、ペプチド21-221を使用して縮重プライマー5'-GGCACNGCD
ATNGGYTTNCCNAC-3'（配列番号41）を設計し、ペプチド21-218を使用してプライ
マー5'-CCNGCRTTRTARTTRAADATNCC-3'（配列番号42）を設計する。これらを、製
造業者の説明書に従いMarathon cDNA増幅キット（Clontech）で構築したcDNAラ
イブラリーを使用するRACE（Rapid Amplification of DNA Ends）反応（Frohman
ら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002）におけるアンチセンス
プライマーとしてネスティドPCRにおいて使用する。
【０１７２】 製造業者の説明書に従いMarathon cDNA Amplificationキット（Clontech）で
構築したcDNAライブラリーを使用して、モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortie
rella ramanniana）DAGAT MR2タンパク質に対応する5'領域のRACE増幅をプライ
マー5'-TGCCTAGTGACATCATGAAATCTCG-3'（配列番号43）で行う。このようにして
、ヌクレオチドの部分コード配列が決定される（配列番号44）。MR2タンパク質
の部分アミノ酸配列も推定される（配列番号45）。
【０１７３】 当業者は、さらなるRACE反応が、原核性および真核性の両方の種々の宿主内で
のDAGATの発現に使用されうる完全な核酸配列のクローニングにつながると認識
するであろう。
【０１７４】 C．MR1およびMR2配列の比較 モルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DAGAT配列MR1（配
列番号38）およびMR2（配列番号45）（図13）のタンパク質配列間のタンパク質
配列アライメントの分析は、それらが55％の類似性を有することを示している。
【０１７５】 実施例12：DAGAT関連配列の同定 植物DAGATは当技術分野で知られていないため、モルティエレラ・ラマンニア
ナ（Mortierella ramanniana）DAGAT核酸およびタンパク質配列を使用して公的
および私的ESTデータベースならびに公的ゲノムデータベースを検索して、他のD
AGAT様配列を同定する。
【０１７６】 トウモロコシ私的データベースにおいてtblastnにより3つのEST配列を同定す
ることができる。それは、GCG集合プログラムを使用して2つのコンティグに集合
する（配列番号46〜47）。西洋アブラナ（Brassica napus）（配列番号48）およ
びダイズ私的データベース（配列番号49）のそれぞれにおいて、1つのESTを同定
することができる。2つのEST配列をシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）私
的データベース（配列番号50〜51）、および1つの私的ゲノム配列（配列番号52
）において同定することができる。
【０１７７】 MR1タンパク質配列を使用して私的マウスおよびヒトデータベースを検索する
。この検索の結果は、GCG集合プログラムを使用して5個のコンティグ（配列番号
53〜57）に集合するヒト由来の約45個のEST配列、およびGCG集合プログラムを使
用して3個のコンティグ（配列番号58〜60）に集合するマウス由来の12個のEST配
列を同定した。私的アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）
（配列番号61および62）、アスペルギルス・オラセウス（Aspergillus oraceus
）（配列番号63）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（配列番号64
）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）（配列番号65）、モ
ルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）（配列番号66）およびシゾキト
リウム・アグレガツム（Schizochytrium aggregatum）（配列番号67）は追加的
なEST配列を与える。
【０１７８】 これらのEST配列と共に、シー・エレガンス（C. elegans）のゲノムおよびア
ミノ酸配列データベース由来の公的推定タンパク質のデータベース検索は、類似
した4個の配列W01A11.2（配列番号68）、K07B1.4（配列番号69）、F59A1.10（配
列番号70）およびタンパク質配列y53G8B_93.B（配列番号71）を与える。公的エ
ス・セレビシエ（S. cerevisae）推定タンパク質データベースの同様の検索は、
1つの配列YOR245c（配列番号72）を与える。
【０１７９】 これらの2つの生物から全RNAを集め、Marathon cDNAライブラリーキット（Clo
ntech）を使用して第1鎖cDNAライブラリーを作製した。プライマー5'-GCGCGGCCG
CCTGCAGTCACTGGAAGATGAG-3'（配列番号73）および5'-GCGCGGCCGCATGAGACTCCGGCT
GAGCTCG-3'（配列番号74）を使用して、シー・エレガンス（C. elegans）cDNAラ
イブラリーからW01A11.2を増幅する。プライマー5'-GAGCGGCCGCATGCCACATCTACTA
GGAGTTGA-3'（配列番号75）および5'-CGGCGGCCGCCTGCAGTTAATTGATAACAAGTTGT-3'
（配列番号76）を使用して、シー・エレガンス（C. elegans）cDNAライブラリー
からCEK07B1.4 2をPCR増幅する。5'-GCGCGGCCGCATGCTAAACTACCAAATTCACA-3'（配
列番号77）および5'-TGGCGGCCGCCTGCAGTCACTGAAAAACGAGCC-3'（配列番号78）を
使用して、シー・エレガンス（C. elegans）cDNAライブラリーからCEF59A1.10 2
をPCR増幅する。5'-CAGCGGCCGCATGTCAGGAACATTC-3'（配列番号79）および5'-CAC
TGCAGTTACCCAACTATCTTCAA-3'（配列番号80）を使用して、エス・セレビシエ（S.
cerevisae）cDNAライブラリーからYOR245CをPCR増幅する。該PCR産物を製造業
者のプロトコール（Invitrogen）に従いpCR2.1 TOPO内にクローニングし、これ
らの配列を確認した。
【０１８０】 実施例13：配列の比較 いくつかの異なる起源からのDAGAT様配列の間の配列アライメントを比較して
、これらの配列間の類似性を同定する。
【０１８１】 DNASTARにおけるClustal Algorithmを用いて、より長い配列をアラインさせる
。MR1配列との比較により、以下の類似性の値（％）が得られる。
【０１８２】
【表４】
【０１８３】 MR1の塩基355〜796に対応する保存領域を含有するタンパク質配列をアライン
させ、この領域までトランケート化し、以下の類似性（％）を得る。
【０１８４】
【表５】
【０１８５】 実施例14：発現構築物 A．バキュロウイルス発現構築物 培養昆虫細胞内でモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）
DAGATタンパク質の発現を指令する構築物を調製する。pCGN8707のNotI-PstI断片
を、NotI-PstIで消化されたプラスミドpFASTBAC1（Gibco）内にクローニングし
、得られたプラスミドpCGN8708を大腸菌（E. coli）DH10BAC（Gibco）内に形質
転換する。バクミド（bacmid）DNAを使用して昆虫細胞をトランスフェクトする
。
【０１８６】 B．植物発現構築物の調製 植物細胞内でのDAGAT配列の発現をもたらす構築物を以下のとおりに調製する
ことができる。
【０１８７】 pCGN3223由来のナピン（napin）カセットを含有するプラスミド（全体を参照
により本明細書に組み入れる米国特許第5,639,790号に記載されている）を修飾
して、それが、複数の制限部位を含有する大きなDNA断片のクローニングに、よ
り有用となるようにし、かつ、植物バイナリー形質転換ベクター内への複数のナ
ピン融合遺伝子のクローニングが可能となるようにした。配列5'-CGCGATTTAAATG
GCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAAT-3'（配列番号81）の自己アニー
リング化オリゴヌクレオチドを含むアダプターを、制限エンドヌクレアーゼBssH
IIでの消化後にクローニングベクターpBC SK+（Stratagene）内に連結して、ベ
クターpCGN7765を構築する。プラスミドpCGN3223およびpCGN7765をNotIで消化し
、互いに連結する。得られたベクターpCGN7770は、pCGN3223由来のナピン種子特
異的発現カセットと共にpCGN7765バックボーンを含有する。
【０１８８】 オリゴヌクレオチド5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3'（配列番号82）
および5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3'（配列番号83）を、SalI/XhoI
で消化されたpCGN7770内に連結することにより、プラスミドpCGN8618を構築する
。ナピンプロモーター、ポリリンカーおよびナピン3'領域を含有する断片をAsp7
18Iでの消化によりpCGN8618から切り出す。該断片を、クレノウ断片で5'突出部
分を埋めることにより平滑末端化し、ついで、Asp718IおよびHindIIIで消化され
5'突出部分がクレノウ断片で埋められて平滑末端化されたpCGN5139内に連結する
。該ナピンプロモーターがpCGN5139の平滑末端化Asp718I部位に最も近く該ナピ
ン3'が該平滑末端化HindIII部位に最も近くなるように配向しているインサート
を含有するプラスミドを配列分析に付して、インサートの配向およびクローニン
グ結合部の完全性の両方を確認する。得られたプラスミドをpCGN8622と命名する
。
【０１８９】 全DAGATコード領域を含有するpCGN8708のNot1/Pst1断片を、Not1/Pst1で消化
されたpCGN8622内に連結して、該ナピンプロモーターの調節下にセンス配列の転
写のために配置されたモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana
）DAGATコード配列を有する発現構築物pCGN8709を得る。
【０１９０】 また、MR1核酸配列を、植物に好ましいコドン使用頻度に関して再合成し（配
列番号84）、宿主植物細胞内への形質転換用の発現構築物の作製に使用する。
【０１９１】 バイナリーベクター構築物を、Holstersら（Mol. Gen. Genet. (1978) 163:18
1-187）の方法によりEHA105株（Hoodら, Transgenic Research (1993) 2:208-21
8）などのアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞内に形質転換し、それを、
後記のとおりの植物形質転換方法において使用する。
【０１９２】 実施例15：昆虫細胞培養内でのDAGATの発現 推定DAGATをコードする完全長36kDaモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortiere
lla ramanniana）cDNAを培養昆虫細胞内で発現させるために、バキュロウイルス
発現系を使用する。
【０１９３】 組換えウイルスの収穫をトランスフェクションの5日後に行った以外は製造業
者の指示書に従いBAC-to-BACバキュロウイルス発現系（Baculovirus Expression
System）（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）を使用して、バキュロウイルス発現
構築物pCGN8708（実施例14Aを参照されたい）を形質転換し発現させる。アッセ
イで用いるSf9細胞の感染に使用するウイルスストックを作製するために、該ト
ランスフェクション混合物からの上清を使用する。
【０１９４】 A．昆虫細胞培養膜におけるDAGAT酵素活性のアッセイ 該形質転換昆虫細胞を、本明細書に記載の方法を用いてDAGATまたは他のアシ
ルトランスフェラーゼ活性に関してアッセイすることができる。昆虫細胞を遠心
分離し、得られたペレット化細胞を直ちに使用するか、あるいは後の分析のため
に-70℃で保存することができる。細胞を培地I（100mMトリシン/NaOH、pH7.8、1
0％ (w/v)グリセロール、280mM NaCl）に0.1μMアプロチニン、1μMロイペプチ
ンおよび100μMペファブロック（すべてBoehringer Mannheim, Germany）と共に
再懸濁させ、超音波処理（2 x 10秒）により溶解する。細胞壁および他の残渣を
遠心分離（14,000 x g、10分間、4℃）によりペレット化する。該上清を新たな
バイアルに移し、膜を遠心分離（100,000 x g、Ti 70.1ローター、46,000rpm、4
℃で1時間）によりペレット化する。全膜を培地Iに再懸濁させる。DAGAT活性を
、30mMトリシン/NaOH（pH7.8）、56mM NaCl、10mM MgCl2、0.2mM 1,2-ジオレイ
ン（2-メトキシエタノール中）、25mM 1-14C-パルミトイル-CoA（17,600dpm/nmo
l）および0.2〜30mgの膜タンパク質を含有する0.1mlの反応混合物中でアッセイ
する。その5分間の反応を、イソプロパノール:ヘプタン:0.5M硫酸（80:20:2, v/
v/v）の1.5ml溶液の添加により終結させる。該反応混合物を4℃で保存するか、
実施例1Cに記載のとおりに直ちに加工することができる。
【０１９５】 36kDaのモルティエレラ（Mortierella）候補は、昆虫細胞内で発現された場合
、空ベクターに感染した昆虫細胞から単離した対照膜より94倍大きなDAGAT活性
を示す（図14）。DAGAT活性アッセイの結果は、このモルティエレラ・ラマンニ
アナ（Mortierella ramanniana）DNA配列が、DAGAT活性を有するタンパク質をコ
ードすることを示している。
【０１９６】 同様に、酵母（SCYOR245c）およびシー・エレガンス（C. elegans）（CEK07B1
.4、CEF59A1.10およびCEWOLA11.2）から同定したDAGATのホモログもpFASTBAC1（
Gibco）ベクター内にクローニングして、それぞれバキュロウイルス発現構築物p
CGN8821、pCGN8822、pCGN8823およびpCGN8824を作製した。DAGAT酵素活性アッセ
イの結果は、昆虫細胞内で発現させた場合、対照ベクターに対してDAGAT酵素活
性の有意な増加を示している（図15）。例えば、酵母ホモログ配列の発現用のベ
クターに感染した昆虫細胞から単離した膜は、空ベクターに感染した昆虫細胞か
ら単離した対照膜と比較してDAGAT酵素活性における95倍の増加を示す（図15）
。さらに、シー・エレガンス（C. elegans）ホモログ配列の発現用のベクター（
pCGN8823）に感染した昆虫細胞から単離した膜は、DAGAT酵素活性における約15
倍の増加を示す（図15）。このように、本発明の配列を使用して、追加的なDAGA
Tコード配列を容易に同定することが可能となった。
【０１９７】 B．昆虫細胞培養内でのトリアシルグリセロール産生 該形質転換昆虫細胞を、本明細書に記載の方法によりトリアシルグリセロール
、ホスホチジルコリンまたは他の脂質クラスに関してアッセイすることができる
。昆虫細胞培養懸濁液を、吸光度600nmで0.3〜0.6の標準光学濃度になるまで培
地で希釈する。培地内の4.5mlの培養懸濁液のサンプルを200μlの氷酢酸、12.5
μgのc17:0 TAGおよび25μgのc15:0 PCよりなる内部標準、および10mlのクロロ
ホルム:メタノール（1:1、v/v）に加える。ボルテックスした後、遠心分離（約5
00 x g、5分間）により相を分離する。下側の有機相（OP1）は取っておく。上側
の水相を200μlの氷酢酸、10mlのクロロホルム:メタノール（1:1、v/v）および4
.5mlの水の混合物の下側有機相で再抽出する。該サンプルを再びボルテックスし
、遠心分離して相を分離する。下側の有機相（OP2）は取っておく。OP1を0.45μ
mフィルターで濾過し、該フィルターをOP2でリンスする。該濾液を合わせ、窒素
ガス下で最終容積0.4mlまで濃縮する。該最終容積の25％を、無機結合剤（Allte
ch Associates, Inc., Newark, Delaware）を含む硬層シリカゲルGHL TLCプレー
ト上にスポットする。該TLCプレートを、抗酸化剤として20mg/100mlの没食子酸
プロピルを含有するヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸（80:20:2, v/v/v）中で30
分間展開させる。該プレートを乾燥した後、それに80％アセトン中の0.001％プ
リムリンを噴霧し、脂質バンドをUV光下で同定する。TAGおよびリン脂質バンド
をTLCプレートからガラスバイアル内に剥ぎ取る。該サンプルを、メタノール中
のH2SO4の2ml中、90℃で2時間メタノール分解する。サンプルを冷却した後、2ml
の0.9％NaClおよび0.50mlのヘキサンを加える。該サンプルをボルテックスし、
遠心分離して相を分離した後、当技術分野でよく知られた方法を用いるガスクロ
マトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル（FAME）の分析のために上部へキサ
ン層を取っておく。
【０１９８】 該36kDaモルティエレラ（Mortierella）候補は、昆虫細胞内で発現させた場合
、空ベクターに感染した昆虫細胞の対照培養と比較してトリアシルグリセロール
含量における3.15倍の増加を示す（図16）。比較のために、該アッセイを細胞リ
ン脂質含量に関して正規化した。トリアシルグリセロール分析の結果は、このモ
ルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）DNA配列が、トリアシ
ルグリセロール産生をもたらすタンパク質をコードすることを示している。
【０１９９】 実施例16：植物の形質転換 表現型の変化を引き起こす配列の転写または転写・翻訳を達成するために対象
DNA配列を植物宿主のゲノム内に挿入するための種々の方法が開発されている。
【０２００】 Radkeら（Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (19
92) 11:499-505）に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換
により、トランスジェニックアブラナ（Brassica）植物を得る。トランスジェニ
ックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物は、Valverkensら（Proc. Na
tl. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540）またはBentら（(1994) Science 265:185
6-1860）またはBechtoldら（(1993), C.R.Acad. Sci. Life Sciences 316:1194-
1199）に記載のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換により得る
ことができる。関連技術を用いて、他の植物種を同様に形質転換することができ
る。
【０２０１】 別法として、核形質転換植物を得るために、例えばKleinら（Bio/Technology
10:286-291）に記載の微粒子射撃法を用いることもできる。
【０２０２】 実施例1および7に記載のDAGATアッセイ方法を用いて、形質転換植物からの種
子または他の植物物質をDAGAT活性に関して分析することができる。
【０２０３】 前記の結果は、脂肪酸アシルおよびジアシルグリセロール基質からのトリアシ
ルグリセロールの形成において活性な部分精製されたDAGATタンパク質が入手可
能であることを示している。DAGATタンパク質の入手方法およびそのアミノ酸配
列を提供する。また、本発明で提供するPCRおよびライブラリースクリーニング
方法を用いて、該アミノ酸配列からDAGAT核酸配列も得ることができる。そのよ
うな核酸配列を操作して、該配列の転写および／または宿主細胞内でのDAGATタ
ンパク質の発現をもたらすことができ、それらのタンパク質は種々の用途に使用
することができる。そのような用途には、宿主細胞内のトリアシルグリセロール
のレベルおよび組成の修飾が含まれる。
【０２０４】 各個の刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み入れられると具体的
かつ個別的に記載されているのと同程度に、本明細書中に引用したすべての刊行
物および特許出願を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０２０５】 前記の発明は、理解を明瞭にする目的で例示および具体例として相当詳しく説
明されているが、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または
範囲から逸脱することなくそれに或る種の変更および修飾を施しうることが当業
者に明らかであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 イエロー（Yellow）86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナD
AGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２Ａ】 ヘパリンセファロースCL6Bのカラム上のイエロー86-アガロースカラムからの
モルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す
【図２Ｂ】 ヘパリンセファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク
質のバンドは銀染色により検出されている。
【図３Ａ】 75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロースカラム
上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロースCL6Bのカラムの第2
活性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィ
ーの結果を示す。
【図３Ｂ】 イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質
のバンドは銀染色により検出されている。
【図４】 図4は、イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナ）DA
GAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図５Ａ】 ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガロースカ
ラムからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結
果を示す。
【図５Ｂ】 ヒドロキシアパタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質の
バンドは銀染色により検出されている。
【図６Ａ】 DAGAT精製プロトコールによるカラム画分におけるモルティエレラ・ラマンニア
ナDAGAT活性の分析の結果を示し、タンデム（縦列）イエロー86-アガロース／ヒ
ドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す。
【図６Ｂ】 DAGAT精製プロトコールによるカラム画分におけるモルティエレラ・ラマンニ
アナDAGAT活性の分析の結果を示し、該タンデムクロマトグラフィーからのピー
ク画分のSDS-PAGE分析の結果を示す。タンパク質のバンドは銀染色により検出さ
れている。
【図７Ａ】 イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精
製した脂肪体画分の高塩および低塩調製物のSDS-PAGE分析を示す。
【図７Ｂ】 イエロー86-アガロース／ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精
製した脂肪体画分の高塩および低塩調製物のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質の
バンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
【図８Ａ】 イエロー86-アガロースおよびヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）上でのク
ロマトグラフィー後のヘパリンカラムからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGA
T活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図８Ｂ】 ヘパリンカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質のバンドは銀染
色により検出されている。
【図９】 イエロー86-アガロースカラム上のモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性の
クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１０Ａ】 ヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HT）のカラム上のイエロー86-アガロースカ
ラムからプールしたモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフ
ィーの結果を示す。
【図１０Ｂ】 ヒドロキシアパタイトカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質の
バンドは銀染色により検出されている。
【図１１Ａ】 ヘパリンセファロースCL6Bのカラム上のヒドロキシアパタイトカラムからのモ
ルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図１１Ｂ】 ヘパリンセファロースCL6Bカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク
質のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
【図１２Ａ】 75〜150mM KClの勾配中でタンパク質を溶出するイエロー86-アガロースカラム
上でのクロマトグラフィーに付されたヘパリンセファロースCL6Bカラムの第1活
性ピークからのモルティエレラ・ラマンニアナDAGAT活性のクロマトグラフィー
の結果を示す。
【図１２Ｂ】 イエロー86-アガロースカラムからの画分のSDS-PAGE分析を示す。タンパク質
のバンドはクーマシーブルー染色により検出されている。
【図１３】 モルティエレラ・ラマンニアナにおいて同定した2つのDAGATタンパク質のタン
パク質アライメントを示す。36kDa候補体については完全長タンパク質配列が示
されており、36.5kDaタンパク質については部分配列が示されている。
【図１４】 モルティエレラ・ラマンニアナにおいて同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列
を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞から
単離した膜上のDAGAT活性データを示す。
【図１５】 酵母およびシー・エレガンス由来のDAGATホモログのDNA配列を含有するpFASTB
ACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞から単離した膜上のDA
GAT活性データを示す。
【図１６】 モルティエレラ・ラマンニアナにおいて同定した36kDaのDAGAT配列のDNA配列
を含有するpFASTBACベクターまたは空pFASTBACベクターに感染した昆虫細胞内の
相対トリアシルグリセロール含量を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/00 9/00 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 9/10 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:66 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:66 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1:865） 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＢＲ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＭＸ，ＵＳ (72)発明者 トンプソン，グレゴリー・エイ アメリカ合衆国、ワシントン・99403、ク ラークストン、ハイウエイ・12・16397

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリア
    シルグリセロールの形成において活性な酵素をコードする単離されたDNA配列。
  2. 【請求項２】 該核酸配列がジアシルグリセロールアシルトランスフェラー
    ゼをコードする、請求項1に記載の単離されたDNA配列。
  3. 【請求項３】 該核酸配列が真核細胞源から単離されたものである、請求項
    1に記載の単離されたDNA配列。
  4. 【請求項４】 該真核細胞源が、哺乳類、線虫、真菌および植物細胞よりな
    る群から選ばれる、請求項3に記載の単離されたDNA配列。
  5. 【請求項５】 該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク
    質がモルティエレラ・ラマンニアナ（Mortierella ramanniana）由来である、請
    求項4に記載のDNAコード配列。
  6. 【請求項６】 該細胞源が、ダイズ、西洋アブラナ（Brassica napus）、シ
    ロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、トウモロコシ、ヒト、マウス、モルテ
    ィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、アスペルギルス・フミガーツス（
    Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・オラセウス（Aspergillus oraceus
    ）、フザリウム・グラミネアラム（Fuserium graminearum）、シジチトリウム・
    アグレガツム（Schzichytrium aggregatum）、セノラブディティス・エレガンス
    （Caenorhabditis elegans）およびサッカロミセス・セレビシエ（Sacchromyces
    cervaisae）よりなる群から選ばれる、請求項4に記載のDNAコード配列。
  7. 【請求項７】 該酵素が構造化トリアシルグリセロールの合成に選択的であ
    る、請求項4に記載のDNAコード配列。
  8. 【請求項８】 該構造化トリアシルグリセロールが式：S-U-S（式中、Sは飽
    和脂肪酸を表し、Uは不飽和脂肪酸を表す）の構造を有する、請求項7に記載のDN
    Aコード配列。
  9. 【請求項９】 該ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク
    質が、配列番号46〜72よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む配列にコ
    ードされる、請求項4に記載のDNAコード配列。
  10. 【請求項１０】 配列番号38のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペ
    プチド。
  11. 【請求項１１】 配列番号45のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペ
    プチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号37に記載のヌクレオチド配列にコードされる単離
    されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 配列番号44に記載のヌクレオチド配列にコードされる単離
    されたポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 配列番号84に記載のヌクレオチド配列にコードされる単離
    されたポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 a）配列番号38のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 b）配列番号37を含む単離されたポリヌクレオチド、 c）配列番号37の全長にわたり配列番号37のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 d）配列番号37の全長にわたり配列番号37のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 e）配列番号37の全長にわたり配列番号37のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 f）配列番号37の全長にわたり配列番号37のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 g）ストリンジェントな条件下、配列番号37またはその断片にハイブリダイズ
    する単離されたポリヌクレオチド、および h）（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）または（g）のポリヌクレオチ
    ド配列に相補的な単離されたポリヌクレオチドよりなる群から選ばれる単離され
    たポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 a）配列番号84を含む単離されたポリヌクレオチド、 b）配列番号84の全長にわたり配列番号84のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 c）配列番号84の全長にわたり配列番号84のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 d）配列番号84の全長にわたり配列番号84のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 e）配列番号84の全長にわたり配列番号84のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 f）ストリンジェントな条件下、配列番号84またはその断片にハイブリダイズ
    する単離されたポリヌクレオチド、および g）（a）、（b）、（c）、（d）、（e）または（f）のポリヌクレオチド配列
    に相補的な単離されたポリヌクレオチドよりなる群から選ばれる単離されたポリ
    ヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 a）配列番号45のポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列を含む単離されたポリヌクレオチド、 b）配列番号44を含む単離されたポリヌクレオチド、 c）配列番号44の全長にわたり配列番号44のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも70％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 d）配列番号44の全長にわたり配列番号44のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 e）配列番号44の全長にわたり配列番号44のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 f）配列番号44の全長にわたり配列番号44のヌクレオチド配列に対して少なく
    とも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド
    、 g）ストリンジェントな条件下、配列番号44またはその断片にハイブリダイズ
    する単離されたポリヌクレオチド、および h）（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）または（g）のポリヌクレオチ
    ド配列に相補的な単離されたポリヌクレオチドよりなる群から選ばれる単離され
    たポリヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 配列番号46〜67よりなる群から選ばれる単離されたポリヌ
    クレオチド。
  19. 【請求項１９】 ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリ
    アシルグリセロールの形成において活性であり、モルティエレラ（Mortierella
    ）に固有の他のタンパク質から単離されているモルティエレラ（Mortierella）
    アシルトランスフェラーゼタンパク質。
  20. 【請求項２０】 天然細胞の膜および他のタンパク質から実質的に精製され
    ており、ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリグリセリドの
    産生を触媒する能力を有し、SDS-PAGE上で約36kDの見掛け分子量を有するアシル
    トランスフェラーゼタンパク質。
  21. 【請求項２１】 天然細胞の膜および他のタンパク質から実質的に精製され
    ており、ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリグリセリドの
    産生を触媒する能力を有し、SDS-PAGE上で約36.5kDの見掛け分子量を有するアシ
    ルトランスフェラーゼタンパク質。
  22. 【請求項２２】 転写開始領域と、 ジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル基質からのトリアシルグリセロール
    の形成において活性な酵素をコードするポリヌクレオチド配列とを、5'から3'へ
    の転写方向の作動的結合成分として含んでなる核酸構築物。
  23. 【請求項２３】 該酵素がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
    である、請求項22に記載の核酸構築物。
  24. 【請求項２４】 請求項22に記載のDNA構築物を含んでなる宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 該宿主細胞が、細菌、昆虫、真菌、哺乳類および植物より
    なる群から選ばれる、請求項24に記載の宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 請求項25に記載の細胞を含んでなる植物。
  27. 【請求項２７】 適当な培養条件下で宿主細胞がアシルトランスフェラーゼ
    タンパク質を産生するよう、転写開始領域とジアシルグリセロールおよび脂肪酸
    アシル基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な酵素をコードす
    るポリヌクレオチド配列とを含む核酸構築物で細胞を形質転換またはトランスフ
    ェクトすることを含んでなる、組換え宿主細胞の製造方法。
  28. 【請求項２８】 該宿主細胞が植物細胞である、請求項27に記載の製造方法
    。
  29. 【請求項２９】 適当な培養条件下で宿主細胞がアシルトランスフェラーゼ
    タンパク質を産生するよう、転写開始領域と請求項12に記載のポリヌクレオチド
    および請求項13に記載のポリヌクレオチドよりなる群から選ばれるポリヌクレオ
    チド配列とを含む核酸構築物で細胞を形質転換またはトランスフェクトすること
    を含んでなる、組換え宿主細胞の製造方法。
  30. 【請求項３０】 該ポリヌクレオチド配列が配列番号37に記載のヌクレオチ
    ド配列を含む、請求項29に記載の製造方法。
  31. 【請求項３１】 該宿主細胞が植物細胞である、請求項29に記載の製造方法
    。
  32. 【請求項３２】 転写開始領域とジアシルグリセロールおよび脂肪酸アシル
    基質からのトリアシルグリセロールの形成において活性な酵素またはその断片も
    しくは変異体をコードするポリヌクレオチド配列とを含む核酸構築物で植物細胞
    を形質転換することを含んでなる、植物細胞におけるトリアシルグリセロール組
    成の修飾方法。
  33. 【請求項３３】 該ポリヌクレオチド配列がアンチセンス配向である、請求
    項32に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 該ポリヌクレオチド配列がセンス配向である、請求項32に
    記載の方法。
  35. 【請求項３５】 内因性ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタ
    ンパク質の活性が抑制される、請求項32に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 内因性ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタ
    ンパク質の活性が増強される、請求項32に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 適当な培養条件下で植物細胞がアシルトランスフェラーゼ
    タンパク質を産生するよう、転写開始領域と請求項12に記載のポリヌクレオチド
    および請求項13に記載のポリヌクレオチドよりなる群から選ばれるポリヌクレオ
    チド配列とを含む核酸構築物で植物細胞を形質転換することを含んでなる、植物
    細胞における脂質組成の修飾方法。
  38. 【請求項３８】 該ポリヌクレオチド配列がアンチセンス配向であり、それ
    により、該配列から転写されたmRNAが、該内因性遺伝子から転写された対応mRNA
    に相補的であり、該植物細胞における該ジアシルグリセロールアシルトランスフ
    ェラーゼタンパク質の活性が抑制される、請求項37に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 該ポリヌクレオチド配列がセンス配向である、請求項37に
    記載の方法。
  40. 【請求項４０】 請求項10に記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体
    。
  41. 【請求項４１】 請求項11に記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体
    。
  42. 【請求項４２】 ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT
    ）活性の変化に関連した疾患または状態の治療または改善方法であって、それを
    要する対象にDAGAT活性のアンタゴニストの治療的に有効な量を投与する工程を
    含んでなる方法。
  43. 【請求項４３】 ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（DAGAT
    ）活性の変化に関連した疾患または状態の治療または改善方法であって、それを
    要する対象にDAGAT活性のアゴニストの治療的に有効な量を投与する工程を含ん
    でなる方法。
  44. 【請求項４４】 患者におけるDAGATの発現または活性に関連した疾患また
    は該疾患に対する感受性の診断方法であって、該患者のゲノム中のDAGATをコー
    ドするヌクレオチド配列中の突然変異の存在または不存在を判定する工程を含ん
    でなる方法。
  45. 【請求項４５】 患者におけるDAGATの発現または活性に関連した疾患また
    は該疾患に対する感受性の診断方法であって、該患者から得たサンプル中のDAGA
    Tまたはその指標の存在または量を検出する工程を含んでなる方法。
  46. 【請求項４６】 配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよ
    び配列番号45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドよりなる群から選ばれる
    ポリペプチドを含む組成物を候補化合物と接触させ、 該ポリペプチドと該候補化合物との相互作用を検出することを含んでなる、DA
    GATの発現または活性を刺激または抑制する化合物の同定方法。
  47. 【請求項４７】 配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよ
    び配列番号45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドよりなる群から選ばれる
    ポリペプチドのアゴニスト。
  48. 【請求項４８】 配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよ
    び配列番号45に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドよりなる群から選ばれる
    ポリペプチドのアンタゴニスト。
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