JP2002514894A - 酵素のスクリーニング方法および酵素キット - Google Patents

酵素のスクリーニング方法および酵素キット

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Abstract

(57)【要約】 複数の酵素が異なる物理的および／または化学的特徴によってそれぞれ特徴づけられ、そして共通の特徴によって分類されている、組換え酵素ライブラリーおよびキット。これらの特徴は、種々の微生物から作製されたＤＮＡライブラリーによって発現された組換え酵素のスクリーニングによって決定される。少なくとも１つの微生物のＤＮＡからランダムに作製された発現クローンのライブラリーをスクリーニングすることにより、所望の活性を有するタンパク質を発現する組換えライブラリーのクローンを同定する方法もまた開示され、ここで該スクリーニングは該クローンの発現産物を用いて実施され、それによって所望の活性を有するタンパク質を発現するクローンが同定される。また、（ｉ）少なくとも１つの非培養微生物に由来するＤＮＡ集団からＤＮＡを回収し；そして（ii）回収したＤＮＡを用いて宿主を形質転換し、特定のタンパク質活性についてスクリーニングされるクローンライブラリーを作製することによって調製されたクローンライブラリーにおいて特定のタンパク質活性についてスクリーニングすることによる、非培養微生物由来のＤＮＡを有するクローンを特定のタンパク質活性についてスクリーニングする方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素のスクリーニング方法および酵素キット 本発明は、微生物由来のＤＮＡを含むクローンライブラリーを調製およびスク リーニングする分野、ならびにタンパク質（例えば酵素）ライブラリーおよびそ れから作製されるキットに関する。より具体的には、本発明は微生物から得られ るＤＮＡより作製される組換え酵素発現ライブラリー、組換え酵素ライブラリー およびそれから調製されるキットに関する。 産業界は多様な工業的応用のための新しい酵素の必要を認識してきた。その結 果、種々の微生物がスクリーニングされ、所望の酵素活性を有するかどうかが確 かめられた。もしそのような微生物が所望の酵素活性を有する場合は、その微生 物から酵素が回収された。 天然に存在する微生物の集合体は、しばしば驚くほどの生理学的および代謝的 多様性を包含する。実際、世界の生物の１％未満しか今日までに培養されていな いと推定される。微生物を富化し純粋培養物の形で単離することの困難性ゆえに 、かくもはるかな多様性の大きな部分は認識されていないことが示唆されている 。したがって、これらのサンプルから有益な酵素を同定または単離することは困 難または不可能であった。このような期限は、未だに培養されていない微生物の 生理学的および代謝的可能性（すなわち興味のある活性）を特徴付ける別なアプ ローチの必要性を示唆する。そのような活性は、今日まで、混合された集合体の 核酸からクローン的に回収し、ＰＣＲで増幅したｒＲＮＡ遺伝子断片の分析によ ってのみ特徴付けられてきた。 本発明の一側面によれば、さらなる研究のためにキット中にパッケージングす るため等の、さらなる使用のための酵素を得るための新規なアプローチが提供さ れる。本発明によれば、微生物より組換え酵素が作製され、種々の酵素の特性に より分類される。このように、酵素はパッケージされた酵素のスクリーニングキ ットとして提供されうる。このキット中の酵素は、選択された酵素の特性を有す るようにグループ化されている。 より具体的には、本発明のこの側面によれば、組換え酵素を発現することがで きる多数のクローンからなる組換え発現ライブラリーが提供される。この発現ラ イブラリーは、微生物からＤＮＡを回収し、そのＤＮＡを適切な発現ベクター中 にクローニングし、次にこのベクターを用いて組換えタンパク質発現用の適切な 宿主をトランスフェクションまた形質転換することによって作製される。 したがって、例えば培養可能または不可能な微生物からゲノムＤＮＡを回収し 、これを用いてその後の酵素活性測定のための適切な組換え発現ライブラリーを 作製することができる。 本発明の一側面によれば、ライブラリーを調製する生物を酵素活性に関してプ レスクリーニングすることなしに、上記のような組換え発現ライブラリーを作製 することができる。 微生物から単離したＤＮＡから多数の組換え発現クローンを調製した後、特定 の酵素の特性を有するポリペプチドを産生する組換えクローンを同定し分類する ため、上記クローンによって発現されたポリペプチドを酵素活性および特定の酵 素の特性についてスクリーニングする。 一側面において、本発明は下記の工程を含んでなる、非培養微生物由来のＤＮ Ａを有するクローンを特定のタンパク質（例えば酵素）活性についてスクリーニ ングする方法を提供する。すなわち： （ｉ）少なくとも１つの非培養微生物に由来するＤＮＡ集団からＤＮＡを回収し ；そして （ii）該回収したＤＮＡを用いて宿主を形質転換し、特定のタンパク質（例えば 酵素）活性についてスクリーニングされるクローンライブラリーを作製する、 ことによって調製されたクローンライブラリーにおいて特定のタンパク質（例え ば酵素）活性についてスクリーニングすることを含む方法である。 上記ライブラリーは微生物を培養することなく回収したＤＮＡから作製され、 特に、上記ＤＮＡは培養されていない、または培養することのできない微生物を 含む環境サンプルから回収される。 この側面の好ましい実施態様においては、ＤＮＡはベクター、特にライゲート されたＤＮＡに由来する検出可能な酵素活性の産生を制御および調節することの できる発現調節配列をさらに含むベクターにライゲートされる。 大腸菌のｆ因子（または稔性因子）は、接合中にそれ自身の高頻度な移行、お よび細菌染色体自体のより頻度の低い移行をもたらすプラスミドである。混合微 生物サンプル由来の大型のＤＮＡ断片を獲得し、安定に増殖させるためには、特 に好ましい実施態様はｆ因子複製起点を含むクローニングベクターを用いて、高 い忠実度で複製され得るゲノムライブラリーを作製することである。混合非培養 環境サンプル由来のＤＮＡと統合された時、このベクターは大きいゲノム断片を 安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形で獲得することが可能になる。 別の好ましい実施態様においては、非培養ＤＮＡ集団から得た二本鎖ＤＮＡを 以下のように選択する： 二本鎖ゲノムＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換し； 変換された一本鎖ＤＮＡから、ハイブリダイゼーション等によってプローブＤ ＮＡ配列に特異的に結合する一本鎖ＤＮＡを回収し；そして 回収された一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する。 上記ブローブは、固相に直接または間接的に結合していてもよく、それによっ てこのプローブにハイブリダイズまたは特異的に結合しない一本鎖ＤＮＡと分離 する。 上記プロセスは、該ハイブリダイズまたは結合した一本鎖ＤＮＡを回収後、該 プローブから一本鎖ＤＮＡを遊離させ、そして遊離させた一本鎖ＤＮＡを二本鎖 ＤＮＡに変換する前に増幅することを含むことも可能である。 本発明はまた、下記の工程を含んでなる、非培養微生物由来のＤＮＡを有する クローンを特定のタンパク質（例えば酵素）活性についてスクリーニングする方 法をも提供する。すなわち、（ｉ）少なくとも１つの非培養微生物に由来するＤ ＮＡ集団からＤＮＡを回収し；そして（ii）該回収したＤＮＡを用いて宿主を形 質転換し、特定のタンパク質（例えば酵素）活性についてのスクリーニングを有 するクローンライブラリーを作製する、ことによって調製されたクローンライブ ラリーにおいて特定の遺伝子クラスタータンパク質産物活性についてスクリーニ ングすることを含む方法である。上記ライブラリーは、遺伝子クラスターＤＮＡ から作製される。このＤＮＡは、微生物を培養することなく回収され、特に、該 ＤＮＡ遺伝子クラスターが培養されていない、または培養することができない環 境サンプルから回収される。 または、非培養ＤＮＡ集団から得た二本鎖遺伝子クラスターＤＮＡは、二本鎖 ゲノム遺伝子クラスターＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変換し；変換された一本鎖遺伝 子クラスターポリシストロンＤＮＡから、ハイブリダイゼーション等によって特 異的にポリヌクレオチドプローブ配列に結合する一本鎖ＤＮＡを回収し；そして 回収した一本鎖遺伝子クラスターＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換することによって 選択される。 本発明のこれらのおよび他の側面は具体的な好ましい実施態様にそくして説明 される。それらの側面は本明細書の記述より当業者には明らかであろう。 図面の簡単な説明 図１は、実施例３に記述するように、混合ピコプランクトン(picoplankton)サ ンプルから環境ライブラリーを構築するのに用いられた手順の概略を示す。 図２は、実施例４に記述するように本発明に使用することができる、１酵素の 化学的特徴の種々の階層の一態様を図式的に示す。 図３は、実施例４に記述するように本発明に使用することができる、１酵素の 化学的特徴の種々の階層の別な態様を模式的に示す。 図４は、実施例４に記述するように本発明に使用することができる、１酵素の 化学的特徴の種々の階層のさらなる態様を模式的に示す。 図５は、実施例４に記述するように本発明に使用することができる、１酵素の 化学的特徴の種々の階層のさらに別な態様を模式的に示す。 図６は、実施例５に記述する実験において酵素ESL-001-01によってもたらされ た至適ｐＨの結果である。 図７は、実施例５に記述する実験において酵素ESL-001-01によってもたらされ た至適温度の結果である。 図８は、実施例５に記述する実験において酵素ESL-001-01によってもたらされ た有機溶媒耐性の結果である。好ましい実施態様の詳細な説明 本発明の好ましい側面によれば、組換え酵素は物理的および化学的特徴の両方 によって特徴づけられる。そして好ましくは、そのような化学的特徴は、ある化 学的特徴を共通に有する組換え酵素が別の化学的特徴によって分類され、この特 徴はより選択的であってもなくてもよく、または特異的な化学的特徴であっても よい、というように以下により詳細に記述するように階層型に分類される。 上に記述したように、組換え酵素は好ましくは物理的特徴によっても分類され る。そして、化学的特徴によって分類された１以上の階層の酵素を物理的特徴に よって分類することもでき、あるいはその逆の分類も可能である。 本明細書に使用する組換え酵素の「化学的特徴」という用語は、該酵素が作用 する基質または化学的官能性(functionality)、および／または該酵素によって 達成される触媒反応を意味する；例えば、触媒反応は加水分解（ヒドロラーセ） であってもよく、化学的官能性は酵素が作用する結合の種類（エステラーゼはエ ステル結合を開裂する）または酵素が作用する特定の種類の構造（グリコシド結 合に作用するグリコシダーゼ）であってもよい。したがって、例えばグリコシド 結合に作用する組換え酵素は、例えば階層１：ヒドロラーゼ；階層２：アセター ル結合；階層３：グリコシダーゼという階層型システム(tiered system)によっ て、化学的に分類することができる。 本明細書に使用する組換え酵素に関する「物理的特徴」という用語は、ｐＨ、 温度安定性、触媒反応の至適温度、有機溶媒耐性、金属イオン選択性、界面活性 剤感受性、等の特性（化学反応以外のもの）を意味する。 組換え酵素を化学的および／または物理的特徴により分類するために階層型シ ステムによるアプローチを用いた本明細書の実施態様においては、１以上の化学 的特徴の階層にある酵素を１以上の物理的特徴によっても分類することが可能で あり、またその逆も可能である。好ましい実施態様においては、酵素は物理的お よび化学的特徴の両方（例えば、酵素が作用する個々の基質および物理的特徴） によって分類される。 したがって、例えば、組換え酵素が本発明にしたがって分類される方法の代表 的な例としての、組換え酵素はプロテアーゼである（この例では、階層１はヒド ロラーゼ；階層２はアミド（ペプチド結合）で、これは階層３で開裂がおこるア ミノ酸配列中の最終的な部位に関してさらに分類される：例えば、アニオン、カ チオン、大きい疎水基、小さい疎水基。階層３において側鎖によって分類された 各組換え酵素を、上に記述した種類の物理的特徴によってさらに分類することも 可能である。 このようにして、特定の化学的特徴を共通に有する酵素、例えばあらゆるエン ドペプチダーゼ（内部のペプチド結合に作用する）、および特定の物理的特徴を 共通に有する酵素、例えば特定の範囲内のｐＨにおいて最適に作用するあらゆる 酵素を組換えライブラリーから選択することが可能である。 上に記述したように、微生物から調製した組換え酵素ライブラリーは、好まし くは階層型システムによるアプローチにおいて化学的特徴によって分類される。 これは、該ライブラリーによって作製された組換えポリペプチドを選択性の低い スクリーニング（例えば、酵素によって達成される触媒反応）で最初に試験する ことによって達成される。これは、６個のＩＵＢクラス、すなわちオキシドレダ クターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよび リガーゼのうち１以上についてスクリーニングすることにより好都合に達成され る。 次に、１以上のＩＵＢクラスについて陽性であると決定された組換え酵素をよ り特異的な酵素活性について再スクリーニングする。 したがって、例えばヒドロラーゼ活性について組換えライブラリーをスクリー ニングした場合、ヒドロラーゼ活性が陽性である組換えクローンをより特異的な ヒドロラーゼ活性、すなわちヒドロラーゼが作用する結合の種類について再スク リーニングすることができる。したがって、例えばヒドロラーゼである組換え酵 素を再スクリーニングして、１以上の特定の化学的官能性、例えば(a)アミド（ ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；(b)エステル結合、すなわちエステラ ーゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、すなわちグリコシダーゼ、等に作用する ヒドロラーゼを突き止めることが可能である。 組換え酵素をそれらが作用する化学結合によって分類し、次に再スクリーニン グしてより詳細な活性、例えばそれらが作用する基質の種類、等を決定すること ができる。 したがって、例えばエステル結合に作用すると分類された組換え酵素（リパー ゼおよびエステエラーゼ）を再スクリーニングして、光学的に活性な化合物を生 成するそれらの能力、すなわちメソアルコール、メソ二酸、キラルアルコール、 キラル酸、等の特定の基質に作用する能力を決定することができる。 例えば、アセタールに作用すると分類された組換え酵素を再スクリーニングし て、このような組換え酵素をそれらが作用する特定の種類の基質、例えば(a)グ ルコース、ガラクトース、等のＰ１糖、(b)グルコースポリマー（エキソ-、エン ド-または両方）、等によって分類することができる。 酵素の階層 したがって、代表的ではあるが限定的ではない例として、以下のものを酵素の 代表的な階層として挙げることができる： 階層１：分類は酵素によって達成される触媒反応、例えば、加水分解、還元、酸 化、等に基づいている。６個のＩＵＢクラス、すなわちオキシドレダクターゼ、 トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼが 使用される。 階層２：分類は反応を受ける化学的官能性、例えば、エステル、アミド、リン酸 ジエステル、硫酸モノエステル、アルデヒド、ケトン、アルコール、アセタール 、ケタール、アルカン、オレフィン、芳香環、ヘテロ芳香環、分子酸素、エノー ル、等に基づいている。 リパーゼおよびエステラーゼは両方ともエステル結合を開裂する。区別は、天 然の基質が膜に凝集するか（リパーゼ）、または溶液中に分散するか（エステラ ーゼ）によってなされる。 階層３：分類およびサブ分類は、階層２に規定される反応を受ける官能性に共有 結合される個々の基質構造の相違に基づいている。例えば、アセタール加水分解 がグルコースまたはガラクトースのアセタール部分であるか；またはアセタール がαまたはβアノマーであるか？階層３で行なわれる区別には複数の種類がある 。基質特異性に基づく分類は、それぞれの特定の酵素反応に独特である。そこに は、酵素が例えばプロテアーゼか、またはホスファターゼかということによる異 なる 基質区別が存在する。 階層４：分類は、酵素が２つの可能性のある鏡像異性体生成物のうちどちらをも たらすかに基づいている。これは、酵素が２つの鏡像異性体のうち一方と選択的 に反応する能力（動力学的分割）、または酵素がメソ二官能化合物と反応して２ つの鏡像異性体反応生成物のうち１つを選択的に生成する能力の測定である。 階層５／直交する(orthogonal)階層／物理的特徴の階層 第５の階層は他の階層と直交する。この階層は化学反応自体というよりはむしろ 、酵素の物理的特性に基づいている。第５階層は、それによって酵素を分類する 第２の大きさ(dimension)を形成する。第５階層は他のどの階層にも適用できる が、第３階層に最も頻繁に適用される。 したがって、本発明の一態様によれば、微生物のＤＮＡ、特に微生物のゲノム ＤＮＡまたはｃＤＮＡから発現ライブラリーがランダムに作製される。そしてそ のような発現ライブラリーによって作製された組換えタンパク質またはポリペプ チドは、組換え酵素を異なる酵素特性によって分類するためスクリーニングされ る。好ましい実施態様においては、組換えタンパク質を１以上の特定の化学的特 徴についてスクリーニングし、その特徴を有すると同定された酵素を次により特 異的な化学的特徴について再スクリーニングし、そしてこの再スクリーニングは １回以上繰り返してもよい。さらに、好ましい実施態様においては、組換え酵素 はそれらの酵素を分類するために１以上の物理的特徴によってもスクリーニング される。このように、微生物のＤＮＡから作製された組換え酵素は化学的および 物理的特徴の両方によって分類され、そしてそれゆえ１または２以上の異なる生 物から１以上の共通の化学的特徴および／または１以上の共通の物理的特徴を有 する組換え酵素を選択することが可能である。さらに、このような酵素は組換え 酵素なので、それらの酵素を所望の量だけ所望の純度で生産することができる。 本発明の階層アプローチは、例えば階層がより制限的な階層アプローチに限定 されない。たとえば、この階層アプローチは第１階層が「木分解」酵素である階 層アプローチの使用にも適用できる。次に、第２の化学的特徴の階層は、「木分 解」酵素である酵素の種類でありうる。 同様に、第１階層または他の任意の階層は物理的特徴であり得る。そして、次 の階層は特異的な化学的特徴であり得る。 したがって本発明は、種々の酵素が異なる化学的および／または物理的特徴に よって分類されている組換え酵素および組換え酵素ライブラリーの提供に一般的 に適用可能である。 調製される組換えライブラリーが由来する微生物は、真正細菌および古細菌等 の原核微生物、ならびに菌類、ある種の藻類および原生動物等の下等真核微生物 を含む。これらの微生物は培養された微生物であっても、または環境サンプルか ら得た非培養の微生物であってもよい。そして、そのような微生物は好熱菌、超 好熱菌、好冷菌、低温菌、等の好極限性細菌(extremophile)であってよい。 好ましくは、前記ライブラリーは生物を培養することなく回収したＤＮＡから 作製される。特に、上記ＤＮＡが培養されていない、または培養することができ ない微生物を含む環境サンプルから回収される場合はそうである。得られるＤＮ Ａが由来する出発物質ライブラリーとしての微生物ＤＮＡの起源は、環境サンプ ルを含むことが特に考慮されている。環境サンプルとしては、例えば北極および 南極の氷、水または永久凍結帯等の起源、火山を起源とする物質、熱帯地方の土 壌または植物を起源とする物質、等から得た微生物サンプルが挙げられる。した がって、例えばゲノムＤＮＡを培養されていない、または培養不可能な生物から 回収し、そして後に酵素活性の測定を行なうために適切なクローンライブラリー を作製するのに使用することができる。 細菌および多くの真核生物は、その産物が関連するプロセスに関与する複数の 遺伝子を調節するための整合された(coordinated)作用機構を有する。これらの 遺伝子は１本の染色体上に「遺伝子クラスター」と呼ばれる形で群をなしており 、１つの調節配列（全クラスターの転写を開始させる１個のプロモーターを含む ）の制御下で一緒に転写される。遺伝子クラスター、プロモーター、および調節 に機能する付加的配列は全体として「オペロン」と呼ばれ、通常は２〜６個、最 大で20個以上の遺伝子を含むことができる。したがって、遺伝子クラスターとは 、通常は機能に関して、同一または関連している隣接する遺伝子のｌ群である。 幾つかの遺伝子ファミリーは同一のメンバーからなっている。クラスターをな す遺伝子は必ずしも同一ではないが、クラスターを形成することは遺伝子間の同 一性を維持するための必要条件である。遺伝子クラスターは、隣接する関連遺伝 子に対して複製が生成される極端な場合から、数百の同一の遺伝子がタンデムな 列をなして存在する場合まで様々である。時々、特定の遺伝子の反復に何ら重要 性が認められない場合がある。この主な例は、他の哺乳動物種においては１個の インスリン遺伝子で十分であるのに、幾つかの種においては発現される重複イン スリン遺伝子である。 遺伝子クラスター、およびそれによってもたらされるタンパク質を発現するた めに該クラスターの全長はどの程度まで必要か、をさらに研究することは重要で ある。さらに、遺伝子クラスターは継続的再編成を受ける。したがって、例えば 細菌または他の原核生物から遺伝子クラスターの異種ライブラリーを作製する能 力は、新規なタンパク質、特に、例えば多数の有用な活性を有するポリケチドの 合成に関与するポリケチドシンターゼ等の酵素を含めて、タンパク質の供給源を 決定するうえで価値がある。遺伝子クラスターの産物であるタンパク質の他の種 類もまた、例えば抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、インスリン等の調節タン パク質を含めて考慮されている。 ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリスロマイシン）、抗癌 剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（FK506およびラパマイシン）、および動物 薬(veterinary products)（モネンシン）を含む生物活性の極めて豊かな供給源 である分子である。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼによって生成され る）は、治療剤として有益である。ポリケチドシンターゼとは、長さ並びに官能 性および環化のパターンが異なる極めて多様な炭素鎖の生合成を触媒する多機能 酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は遺伝子クラスターに該当し、少なく とも１種類（Ｉ型と称する）のポリケチドシンターゼは大きいサイズの遺伝子お よび酵素を有し、それらは遺伝子操作およびこれら遺伝子／タンパク質のin vit ro研究を複雑にしている。 研究のための新規なポリケチドの作製のために、ポリケチドおよびポストポリ ケチド生合成遺伝子のライブラリーから所望の成分を選択して組み合わせる能力 は興味深い。本発明の方法を用いることは、特に遺伝子クラスターのクローン化 を容易にするｆ因子に基づくベクターを用いる場合には、新規なポリケチドシン ターゼのクローン化を容易にする。 好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡをベクターにライゲートする。特に、検 出可能なタンパク質の産生、またはライゲートした遺伝子クラスター由来のタン パク質に関連するアレイ活性を制御および調節することのできる発現調節配列を さらに含むベクターにライゲートすることが好ましい。外因性ＤＮＡ導入のため の極端に大きい容量を有するベクターの使用は、そのような遺伝子クラスターと 共に使用するのに特に適切であり、例として大腸菌のｆ因子（または稔性因子） を含めて本明細書に記述する。この大腸菌のｆ因子は、接合中にそれ自身の高頻 度転移をもたらすプラスミドであって、大きいＤＮＡ断片（混合微生物サンプル 由来の遺伝子クラスター等）を獲得し、それを安定に増殖させるのに理想的であ る。 「由来の(derived)」または「単離された」という用語は、物質がその元の環 境（例えば、それが天然に存在するものであれば、天然の環境）から移されたこ とを意味する。例えば、生きている動物中に存在する天然のポリヌクレオチドま たはポリペプチドは単離されていない。しかし、天然の系において共存する物質 の一部または全部から分離された同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは 単離されている。 上に記述したように、環境サンプルから発現ライブラリーを作製することがで きる。この場合、生物を培養することなくＤＮＡを回収することができるし、ま たは、培養した生物からＤＮＡを回収することもできる。 発現ライブラリーを調製するにあたっては、ゲノムＤＮＡを培養された生物ま たは環境サンプル（例えば土壌）から種々の方法により回収することができる。 次に、回収または単離されたＤＮＡを、発現ライブラリーを作製し、所望の遺伝 子が発現されて過剰な数のクローンをスクリーニングする必要なしにスクリーニ ングされる妥当な確率を提供するのに適した大きさに断片化する。したがって、 例えば剪断によって作製された平均的ゲノム断片が4.5kbpであるならば、約90% の確率で特定の遺伝子を獲得するためには、1.8Mbpのゲノムに対して約2000個の クローンをスクリーニングしなければならない。ある場合には、特に培養しない でＤＮＡを回収した場合には、該ＤＮＡを剪断後に増幅する（例えばＰＣＲに よって）。 適切な大きさにしたＤＮＡを適切な発現ベクター中にクローン化し、適切な宿 主、好ましくは細菌宿主で特に大腸菌、に導入して形質転換する。大腸菌が好ま しいが、広範な他の宿主もまた発現ライブラリーの作製に使用できる。 使用する発現ベクターは、好ましくは、天然のゲノムプロモーターが選択され た宿主中で機能しない場合に該宿主中で機能することが知られているプロモータ ーを含むベクターである。 発現ライブラリーを調製するために使用できる発現ベクターの代表的例として は、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌性人工 染色体、Ｐ１に基づく人工染色体、酵母人工染色体、および興味のある特定の宿 主（桿菌、アスペルギルス、酵母、等）に特異的な他の任意のベクターを挙げる ことができる。ベクターは精製を容易にするため、当分野で公知の種類の標識も 含むことができる。 以下は、培養可能な生物および培養不可能な生物の両方から発現ライブラリー を作製するための一般的手順の概略を示す。培養可能な生物 バイオマスを得る。 ＤＮＡを単離する（ＣＴＡＢ）。 ＤＮＡを剪断する（25ゲージの針）。 ＤＮＡを平滑末端とする（マングビーンヌクレアーゼ）。 メチル化する（Eco RIメチラーゼ）。 Eco RIリンカーにライゲートする（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）。 リンカーを切り戻す（Eco RI制限エンドヌクレアーゼ）。 大きさにより分画する（ショ糖勾配）。 λベクターにライゲートする(λ ZAP IIおよびgtl1)。 パッケージする（in vitro λパッケージング抽出物）。 大腸菌宿主上に播き、増幅させる。培養不可能な微生物 細胞を得る。 ＤＮＡを単離する（種々の方法）。 ＤＮＡを平滑末端とする（マングビーンヌクレアーゼ）。 Not Ｉ部位を含むアダプターにライゲートし、磁気ビーズに結合させる。 未結合アダプターをＤＮＡの他の端にライゲートする。 高い忠実性を可能とし、かつアダプター配列をプライマーとして用いる反応でＤ ＮＡを増幅する。 NotＩを用いてＤＮＡを切断する。 大きさにより分画する（ショ糖勾配またはSephacrylカラム） λベクターにライゲートする（λ ZA PIIおよびgtl1)。 パッケージする（in vitro λパッケージング抽出物）。 大腸菌宿主上に播き、増幅させる。 少なくとも１つの非培養微生物由来のＤＮＡから興味のあるＤＮＡを選択的に 回収するために用いるプローブＤＮＡは、公知の活性を有する酵素、系統発生マ ーカー、または他の同定されたＤＮＡ配列のＤＮＡの全長コード領域配列または 部分コード領域配列であり得る。元のＤＮＡライブラリーを、好ましくは、特定 の活性をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む混合プローブを用いて釣 り上げることができる。これらのプローブまたはプローブライブラリーは好まし くは一本鎖であり、釣り上げられる微生物ＤＮＡは好ましくは一本鎖に変換され ている。特に適切なプローブは、スクリーニングされるべき特定の酵素活性に類 似または同一の活性を有する酵素をコードするＤＮＡに由来するものである。 プローブＤＮＡは少なくとも10塩基であり、好ましくは少なくとも15塩基であ る。１つの実施態様においては、プローブとして全コード領域を用いることがで きる。少なくとの１つのＤＮＡプローブの使用によりＤＮＡが選択的に単離され るハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約50%の配列同一性をもたらす ハイブリダイゼーションストリンジェンシー、より好ましくは少なくとも約70% の配列同一性をもたらすストリンジェンシーを提供するように設計される。 微生物ＤＮＡライブラリーを釣り上げて潜在的に興味のあるＤＮＡを単離する ハイブリダイゼーション技法は当分野で周知であり、そして、文献に記載されて いる任意のことがら、特に該微生物由来の残りのＤＮＡから容易に分離するため に固相に直接または間接的に結合したプローブＤＮＡを用いるものは、本発明に 使用するのに適する。 好ましくは、プローブＤＮＡは特異的結合ペアの一方のパートナー（例えばリ ガンド）を用いて「標識」され、ペアの他方のパートナーは固相マトリックスに 結合されて、標的をその起源から分離するのを容易にする。リガンドおよび特異 的結合パートナーは以下のものから、どちらの方向においてでも、選択すること ができる：(1)抗原またはハプテンおよび抗体またはその特異的結合断片;(2)ビ オチンまたはイミノビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン;(3)糖お よびそれに特異的なレクチン;(4)酵素およびそのインヒビター:(5)アポ酵素およ び補因子;(6)相補的ホモポリマー性オリゴヌクレオチド;および(7)ホルモンおよ びその受容体。固相は好ましくは(1)ガラスまたはポリマー表面;(2)ポリマービ ーズを充填したカラム;および(3)磁性または常磁性粒子から選択される。 上記のように調製されたクローンライブラリーは、培養物の拡大、増幅、また は他の補助的手順を必要とせずに、所望の（例えば酵素）活性について直接スク リーニングすることが可能である。しかし、１つの好ましい実施態様においては 、各クローンから回収されたＤＮＡをＰＣＲ等によって増幅するとが望ましいと 考えられる。 さらに、単離された標的ＤＮＡの増幅を実施することは任意であるが、望まし い。この実施態様においては、選択的に単離されたＤＮＡは単離後プローブＤＮ Ａから分離される。次に、該単離されたＤＮＡを宿主の形質転換に用いる前に増 幅する。あらかじめ定められたＤＮＡ配列を少なくともその一部として含むよう に選択された二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変換し、増幅にかけ、再度アニーリングし て増幅された数の選択された二本鎖ＤＮＡをもたらすことができる。当分野では 現在おびだだしい増幅方法論が周知である。 次に、適切な生物を形質転換することによってスクリーニングするために、選 択されたＤＮＡをライブラリーの調製に用いることができる。宿主、特に本明細 書中で好ましいと特に同定された宿主は、そのような形質転換を促進する条件下 での接種による標的ＤＮＡを含むベクターの人工的導入によって形質転換される 。 使用できる発現ベクターの代表的なものとして、ウイルス粒子、バキュロウイ ルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌性人 工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フ ァウルポックスウイルス(foul pox virus)、仮性狂犬病ウイルスおよびＳＶ４０ 誘導体）、Ｐ１に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および 興味のある特定の宿主（桿菌、アスペルギルス、酵母、等）に特異的な他の任意 のベクターを挙げることができる。したがって、例えば、ＤＮＡはポリペプチド を発現するための種々の発現ベクターのうちの任意の１つに含まれていればよい 。そのようなベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列を含む。多数の 適切なベクターが当業者には公知であり、市販されている。以下のベクターは例 として挙げるものである：細菌性：pQE70，pQE60，pQE-9(Quiagen);psiX174，pB luescript SK，pBluescript KS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene); pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia);真核細胞性:pWLNEO ，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene);pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmaci a)。しかし、宿主中で複製可能かつ生存可能であるかぎり、他の任意のプラスミ ドまたはベクターを用いることができる。 本発明に用いるのに特に好ましい種類のベクターは、ｆ因子複製起点を含む。 大腸菌のｆ因子（または稔性因子）は、接合中にそれ自身の高頻度転移、および 細菌染色体自体のより頻度の低い転移をもたらすプラスミドである。特に好まし い実施態様は、「フォスミド(fosmid)」または細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ベク ターと呼ばれるクローニングベクターを用いることである。これらは大腸菌ｆ因 子に由来するもので、ゲノムＤＮＡの大きいセグメントを安定に組み込むことが できる。混合非培養環境サンプル由来のＤＮＡと統合された時、このベクターは 大きいゲノム断片を安定した「環境ＤＮＡライブラリー」の形で獲得することを 可能とする。 微生物由来のＤＮＡを種々の手順によってベクター中に挿入することができる 。一般に、該ＤＮＡ配列は当分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレ アーゼ部位に挿入される。このような手順およびその他は当業者の技術の範囲内 であると見なされる。 発現ベクター中の該ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を引き出すため、適切な発 現制御配列（プロモーター）に機能しうる形でライゲートされている。特に命名 された細菌性プロモーターは、lac1，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PLおよびtrpを 含む。真核細胞プロモーターは、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および 後記SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン-Iを含む 。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分当業者の技術レベルの範囲 内にある。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写タ ーミネーターをも含む。ベクターは発現を増幅させるための適切な配列を含むこ ともできる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラ ーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて任意の所望の 遺伝子から選択することができる。 さらに、好ましくは、発現ベクターは形質転換宿主細胞の選択のために表現型 的特徴を提供する１以上の選択マーカー遺伝子（例えば、真核細胞培養物のため にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌において はテトラサイクリンあるいはアンピシリン耐性、等）を含む。 一般に、組換え発現ベクターは複製起点、宿主細胞の形質転換を可能とする選 択マーカー（例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシエ(S.c erevisiae)のTRPI遺伝子）、および下流構造配列の転写を引き出すための、高発 現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、3-ホスホグリ セリン酸キナーゼ(PGK)等の解糖酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱 ショックタンパク質をコードするオペロンから引き出すことができる。異種構造 配列は、適切な段階で、翻訳開始および終結配列、および好ましくは翻訳された タンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を引き出すことのできるリー ダー配列と共に組み立てられる。 上記のように選択し、単離したＤＮＡを適切な宿主に導入し、所望の酵素活性 にっいてスクリーニングされるライブラリーを調製する。好ましくは、選択され たＤＮＡは適切な制御配列を含むベクター中にすでに挿入されていて、それによ って酵素をコードする選択されたＤＮＡは所望の活性の検出のために発現される 。宿主細胞は、哺乳動物細胞等の高等真核細胞、または酵母等の下等真核細胞で あ りうる。または、宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞でありうる。宿主細胞への構 築物の導入は、形質転換、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキ ストラン媒介トランスフェクション、DMSOまたはエレクトロポレーションによっ て達成することができる(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。 適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、桿菌(Bacillus)、ストレプトミセ ス(Streptomyces)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)等 の細菌細胞；酵母等の真核細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)S2およびスポド プテラ(Spodoptera)Sf9等の昆虫細胞；CHO、COSまたはBowes黒色腫等の哺乳動物 細胞；アデノウイルス；植物細胞、等が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、 本明細書の教示より当業者の技術的範囲内にあると見なされる。 宿主細胞は一般にベクターを用いて遺伝子工学的に作製される（遺伝子導入ま たは形質転換またはトランスフェクションされる）。遺伝子操作された宿主細胞 は、プロモーターを活性化させ、形質転換体を選択し、または遺伝子を増幅する のに適切なように改変された常用の栄養培地中で培養することができる。培養条 件（温度、ｐＨ、等）は発現のために選択された宿主細胞に対して以前に用いら れたものであり、当業者には明らかであろう。 本明細書に記述するように分類されたライブラリー中の組換え酵素は、配列決 定をしても、しなくてもよい。また、精製された形であっても、そうでなくても よい。したがって本発明によれば、１以上の組換え酵素を、その配列を得る前ま たは後で、またはその酵素を本質的に均質になるまで精製する前または後で、分 類することが可能である。 化学的特徴についてのスクリーニングは、個々の発現クローンを用いて実施し てもよいし、または最初に発現クローン混合物を用いて実施して該混合物が１以 上の特定の酵素活性を有するかどうかを突き止めてもよい。もし該混合物が特定 の酵素活性を有するならば、そのような酵素活性について、あるいはもっと特異 的な活性について個々のクローンを再スクリーニングすることができる。したが って、例えば、もしクローン混合物がヒドロラーゼ活性を有するならば、個々の クローンを回収し、スクリーニングしてどのクローンがヒドロラーゼ活性を有す るのかを決定することができる。 本発明はまた、さらなるスクリーニングおよび／または研究に用いるための酵 素キットを調製し提供することに関する。したがって、本発明の１つの態様によ れば、キットまたはパッケージ（例えば、適切な容器）中に少なくとも３つの異 なる組換え酵素を入れることにより、試薬パッケージまたはキットが調製される 。ここで該少なくとも３つの異なる組換え酵素の各々は、少なくとも２つの共通 した酵素特徴を有する。好ましい実施態様においては、共通の特徴の一方は化学 的特徴または特性であり、他方は物理的特徴または特性である。しかし、２つ以 上の共通した化学的特徴または特性を有し、共通した物理的特徴または特性が全 くないキット、またはその逆を作製することも可能である。 本発明によれば、１以上の微生物由来の、複数の化学的および／または物理的 特性によって分類される組換え酵素ライブラリーを提供することが可能なので、 種々の選択された化学的および／または物理的特性を有する種々の酵素キットま たはパッケージが調製できる。これらのキットまたはパッケージは、少なくとも ３つ、好ましくは全ての組換え酵素が共通して少なくとも１つの化学的特徴を有 し、そして共通して少なくとも１つの物理的特徴を有する、３つ以上の組換え酵 素を含むように作製することができる。このキットは、そのような共通の特徴を 特定する適切なラベルを含まなくてはならない。 １つの実施態様においては、キット中の少なくとも３つの組換え酵素は、ラベ ルに特定されている最も特異的な化学的特徴を共通に有する。「ラベル」という 用語はその最も広い意味で使用されており、パッケージの差し込み印刷物、また はキットあるいはパッケージに付随する、またはそれと同時に配付されるパンフ レットを含む。したがって、例えば、もしキットが特異的基質（上記の階層３の 例の１つ）についてラベルを付されているならば、例えばキット中の少なくとも ３つの酵素はその基質に作用するであろう。 キットは好ましくは３以上の、例えば５、６またはそれ以上の酵素を含む。好 ましい実施態様においては、上に記述したように、キット中の少なくとの３つの 、好ましくは大半の、そしてある場合には全ての組換え酵素が少なくとも２つの 酵素特性または特徴を共通に持つ。 キット中の組換え酵素は、１個の容器内に２つ以上の酵素を、または各容器に 各酵素を、またはそれらの種々の組合せを有してよい。 当分野で公知の手順により、ライブラリーを特定の酵素活性についてスクリー ニングすることができる。例えば、６つのＩＵＢクラス、すなわちオキシドレダ クターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼおよび リガーゼの１以上について酵素活性をスクリーニングすることができる。次に、 １以上のＩＵＢクラスについて陽性であると確認された組換え酵素を、より特異 的な酵素活性について再スクリーニングすることができる。 または、より特殊化した酵素活性についてライブラリーをスクリーニングする ことができる。例えば、ヒドロラーゼ活性について包括的にスクリーニングする 代わりに、より特殊化した活性、すなわちヒドロラーゼが作用する結合の種類に ついてライブラリーをスクリーニングすることができる。したがって、例えばラ イブラリーをスクリーニングして、１以上の特定の化学的官能性、例えば(a)ア ミド（ペプチド結合）、すなわちプロテアーゼ；(b)エステル結合、すなわちエ ステラーゼおよびリパーゼ；(c)アセタール、すなわちグリコシダーゼ、等に作 用するヒドロラーゼを突き止めることができる。 次に、特定の酵素活性を有すると同定されたクローンを配列決定して、該特定 の活性を有する酵素のＤＮＡ配列を同定することができる。したがって、本発明 によれば、(i)特定の酵素活性を有する酵素をコードするＤＮＡおよび(ii)その ような活性を有する酵素（そのアミノ酸配列を含む）を単離し同定して、そして (iii)そのような活性を有する組換え酵素を作製することができる。 酵素活性についてのスクリーニングは、個々の発現クローンを用いて実施して もよいし、または最初に発現クローン混合物を用いて実施して該混合物が１以上 の特定の酵素活性を有するかどうかを突き止めてもよい。もし該混合物が特定の 酵素活性を有するならば、次にそのような酵素活性またはより特異的な活性につ いて個々のクローンを再スクリーニングすることができる。したがって、例えば 、もしクローン混合物がヒドロラーゼ活性を有するならば、個々のクローンを回 収し、スクリーニングしてどのクローンがヒドロラーゼ活性を有するのかを決定 することができる。 発現ライブラリーを１以上の選択された化学的特徴についてスクリーニングす ることができる。選択される代表的な化学的特徴を以下に記述するが、そのよう な特徴は本発明を制限するものではない。さらに、発現ライブラリーを特徴のい くつか、または全部についてスクリーニングすることができる。したがって、本 明細書に特定する化学的特徴の幾つかは、ライブラリーの全てにおいて、または 幾つかのライブラリーにおいてのみ確認することができる。または、それらはど のライブラリーにおいても確認することができない。 組換え酵素は物理的特性によっても試験し、分類することができる。例えば、 組換え酵素は下記のような物理的特性によって分類することができる：最適ｐＨ ＜３ ３−６ ６−９ ９−12 ＞12最適温度 >90℃ 75-90℃ 60-75℃ 45-60℃ 30-45℃ 15-30℃ 0-15℃温度安定性 以下の温度における半減期: 90℃ 75℃ 60℃ 45℃有機溶媒耐性 水混和性 （DMF） 90% 75% 45% 30% 水非混和性 ヘキサン トルエン金属イオン選択性 EDTA‐10mM Ca+2‐１mM Mg+2‐100μM Mn+2‐10μM Co+3‐10μM界面活性剤感受性 中性（トリトン） アニオン性（デオキシコレート） カチオン性（CHAPS） 本発明のライブラリーおよびキットの組換え酵素は、種々の目的に使用するこ とができる。そして本発明は、複数の異なる酵素活性によって分類された複数の の組換え酵素を提供することによって、種々の用途のための酵素の迅速なスクリ ーニングを可能とする。したがって、例えば、本発明は特定の条件下で特定の結 合または特定の基質に作用することができ、それによって種々の用途のための酵 素のスクリーニングを可能とする、複数の酵素を含む酵素キットの組み立てを可 能とする。そのような用途の代表的例として、以下のものを挙げることができる ： １．リパーセ／エステラーゼ ａ．エステル（脂質）／チオエステルのエナンチオ選択性加水分解 １）ラセミ混合物の分割 ２）メソジエステル由来の光学活性な酸またはアルコールの合成 ｂ．選択的合成 １）炭水化物エステルの位置特異的加水分解 ２）環状第二級アルコールの選択的加水分解 ｃ．光学活性なエステル、ラクトン、酸、アルコールの合成 １）活性化／非活性化エステルのエステル交換反応 ２）インターエステリフィケーション ３）ヒドロキシエステル由来の光学活性ラクトン ４）無水物の位置およびエナンチオ選択的開環 ｄ．界面活性剤 ｅ．脂肪／油変換 ｆ．チーズの熟成 ２．プロテアーゼ ａ．エステル／アミド合成 ｂ．ペプチド合成 ｃ．アミノ酸エステルのラセミ混合物の分割 ｄ．非天然アミノ酸の合成 ｅ．界面活性剤／タンパク質加水分解 ３．グリコシダーゼ／グリコシルトランスフェラーゼ ａ．糖／ポリマー合成 ｂ．単糖、二糖およびオリゴ糖を形成するためのグリコシド結合の開裂 ｃ．複合オリゴ糖の合成 ｄ．UDP-ガラクトシルトランスフェラーゼを用いたグリコシド合成 ｅ．二糖、フッ化グリコシル、アリールガラクトシドのグリコシル転移 ｆ．オリゴ糖合成におけるグリコシル転移 ｇ．β−グルコシルスルホキシドのジアステレオ選択性開裂 ｈ．非対称グリコシル化 ｉ．食品加工 ｊ．紙加工 ４．ホスファターゼ／キナーゼ ａ．リン酸エステルの合成／加水分解 １）位置−エナンチオ選択性リン酸化 ２）リン酸エステルの導入 ３）リン脂質前駆体の合成 ４）制御されたポリヌクレオチド合成 ｂ．生物学的分子の活性化 ｃ．保護基なしの選択的リン酸結合形成 ５．モノ／ジオキシゲナーゼ ａ．活性化されていない有機基質の直接的オキシファンクショナリゼーション （oxyfunctionalization） ｂ．アルカン、芳香族化合物、ステロイドのヒドロキシル化 ｃ．アルケンのエポキシ化 ｄ．エナンチオ選択性スルホ酸化 ｅ．位置および立体選択性バイヤー−ビリガー(Bayer-Villiger)酸化 ６．ハロペルオキシダーゼ ａ．ハロゲン化物イオンの求核部位への酸化的付加 ｂ．次亜ハロゲンのオレフィン結合への添加 ｃ．シクロプロパンの環開裂 ｄ．オルトまたはパラ誘導体に変換された活性化芳香族基質 ｅ．２−ハロ−誘導体に変換された1.3ジケトン ｆ．硫黄および窒素含有基質のヘテロ原子酸化 ｇ．酢酸エノール、アルキン、および活性化芳香族環の酸化 ７．リグニンペルオキシダーゼ／ジアリールプロパンペルオキシダーゼ ａ．Ｃ−Ｃ結合の酸化的開裂 ｂ．ベンジルアルコールのアルデヒドへの酸化 ｃ．ベンジル炭素のヒドロキシル化 ｄ．フェノール二量体化 ｅ．ジオールを形成するための二重結合のヒドロキシル化 ｆ．リグニンアルデヒドの開裂 ８．エポキシドヒドロラーゼ ａ．鏡像異性体的に純粋な生物活性化合物の合成 ｂ．エポキシドの位置およびエナンチオ選択性加水分解 ｃ．エポキシドを形成するためのモノオキシゲナーゼによる芳香族およびオレ フィンのエポキシ化 ｄ．ラセミエポキシドの分割 ｅ．ステロイドエポキシドの加水分解 ９．ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼ ａ．脂肪族ニトリルのカルボキシアミドへの加水分解 ｂ．芳香族、複素環式、不飽和脂肪族ニトリルの対応する酸への加水分解 ｃ．アクリロニトリルの加水分解 ｄ．芳香族およびカルボキシアミド、カルボン酸の生産 （ニコチンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド） ｅ．アクリルジニトリルの位置選択性加水分解 ｆ．αヒドロキシニトリル由来のαアミノ酸 10．トランスアミナーゼ ａ．オキソ酸へのアミノ基の転移 11．アミダーゼ／アシラーゼ ａ．アミド、アミジン、および他のＣ−Ｎ結合の加水分解 ｂ．非天然アミノ酸の分割および合成 本発明を以下の実施例を参照しながらさらに詳細に説明する。しかし、本発明 の範囲はそれによって限定されるものではない。特に指示しないかぎり、全ての 「部」は「重量部」である。実施例１ 発現ライブラリーの作製 以下、本発明の段階的なアプローチによるスクリーニングのための発現ライブ ラリーの代表的な調製方法を説明する。 １gのテルモコッカス（Thermococcus）GU5L5細胞ペレットを溶菌し、ＤＮＡを 文献公知の方法（Current Protocols in Molecular Biology,2.4.1,1987）によ り単離した。その単離されたＤＮＡの約100μgをTE緩衝液に再懸濁し、剪断され た断片が0.5〜10.0Kb（平均3.0Kb）の範囲のサイズとなるまで、25ゲージの二重 ハブ化（double-hubbed）針に勢いよく通す。そのＤＮＡの末端をヤエナリ（Mun g Bean）ヌクレアーゼ（300単位、37℃、15分）で「ポリッシュ(polish)」また は平滑化し、標的ＤＮＡ中のEcoRI制限部位をEcoRIメチラーゼ（200単位、37℃ 、１時間）で保護する。平滑／保護化ＤＮＡへのEcoRIリンカー［GGAATTCC］の 連結を、１pmolの標的ＤＮＡ末端に対して10pmolのリンカー末端を用いて行なっ た。該リンカーを、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ（200単位、37℃、1.5時間） で切断し、該ＤＮＡをショ糖勾配によりサイズ分画した(Maniatis,T.,Fritsch,E .F.およびSambrook,J.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Press,New York ，1982)。調製された標的ＤＮＡをLambda 物を用いてパッケージングし、XLI-Blue MRF'大腸菌（E.coli）株上で製造業 から切り出し、HayおよびShortの方法により(HayおよびShort,J.Strategies,5:1 6,1992)、大腸菌（E.coli）DH10BF'kan.中で増殖させた。得られたコロニーを無 菌爪楊枝で拾い、11個の96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１つず つ接種するのに使用した(全部で1056クローン)。それらのウェルは、100μg/mL アンピシリン、80μg/mLメチシリンおよび10％v/vグリセロールを含む250μＬの LB培地（LB Amp/Meth，グリセロール）を含有していた。細胞を、振とうせずに3 7℃で一晩増殖させた。これにより、「起源ライブラリー」が得られた。したが って、起源ライブラリーの各ウェルは、大腸菌（E.coli）細胞のストック培養を 含有しており、そのそれぞれは、ユニークＤＮＡ挿入断片を 有するpBluescriptファージミドを含有していた。 実施例２ 哺乳動物ＤＮＡライブラリーの調製 以下に、潜水調査中にSanta Catalina Basinの深さ1240メートルで見つけられ たクジラの骨の外部表面サンプルからの遺伝子ライブラリーの作製に用いた方法 の概要を説明する。 ＤＮＡの単離 製造業者の指示に従うIsoQuick法。 ＤＮＡの剪断 １．25G二重ハブ針および１ccシリンジにより約500回、ＤＮＡを激しく押引す る。 ２．該ＤＮＡの大半が所望のサイズの範囲内（約３〜６kb）であることを確認 するために、0.8％アガロースゲル上で少量（0.5μg）を調べる。 ＤＮＡの平滑化 １．以下のものを加える： H2O 最終容量が405μlになるまで 45μl 10×ヤエナリ緩衝液 2.0μl ヤエナリヌクレアーゼ(150u/μl)。 ２．37℃で15分間インキュベートする。 ３．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。 ４．クロロホルムで１回抽出する。 ５．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させる。 ６．氷上に10分間放置する。 ７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。 ８．70％エタノール１mlで洗浄する。 ９．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心し、乾燥する。 ＤＮＡのメチル化 １．ＤＮＡを26μl TEに穏やかに再懸濁する。 ２．以下のものを加える： 4.0μl 10×EcoRIメチラーゼ緩衝液 0.5μl SAM（32mM） 5.0μl EcoRIメチラーゼ(40u/μl)。 ３．37℃で１時間インキュベートする。 平滑末端の保証 １．該メチル化反応へ以下のものを加える： 5.0μl 100mM MgCl2 8.0μl dNTP混合物（dGTP、dATP、dTTP、dCTPのそれぞれの2.5mM ） 4.0μl クレノウ（５u/μl） ２．12℃で30分間インキュベートする。 ３．450μl １×STEを加える。 ４．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。 ５．クロロホルムで１回抽出する。 ６．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させ、氷上に10分間放置する。 ７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。 ８．70％エタノール１mlで洗浄する。 ９．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。 リンカーの連結 １．ＤＮＡをトリス−EDTA（TE）７μlに穏やかに再懸濁する。 ２．以下のものを加える： 14μl リン酸化EcoRIリンカー（200ng/μl） 3.0μl 10×連結緩衝液 3.0μl 10mM rATP 3.0μl T4 ＤＮＡリガーゼ(４Wu/μl)。 ３．４℃で一晩インキュベートする。 EcoRI切断 １．連結反応を68℃で10分間加熱して失活させる。 ２．以下のものを加える： 237.9μl H2O 30μl 10×EcoRI緩衝液 2.1μl EcoRI制限酵素(100u/μl)。 ３．37℃で1.5時間インキュベートする。 ４．0.5M EDTA 1.5μlを加える。 ５．氷上に放置する。 ショ糖勾配（2.2ml）サイズ分画 １．サンプルを65℃に10分間加熱する。 ２．ショ糖勾配2.2ml上に穏やかにローディングする。 ３．小さな超遠心機中、45K、20℃で４時間遠心する(中断なし)。 ４．勾配管の底に20G針で穴をあけ、その針にショ糖を流すことにより、画分 を集める。Falcon2059管内に最初の20滴を集め、ついで10個の１滴画分(１〜10 と標識)を集める。各滴は、約60μlの容量である。 ５．各画分５μlを0.8％アガロースゲル上で移動させて、そのサイズを確認す る。 ６．画分１〜４（−10−1.5kb）をプールし、別の管内に画分５〜７（約５−0 .5kb）をプールする。 ７．氷冷エタノール１mlを加えて沈殿させ、氷上に10分間放置する。 ８．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。 ９．70％エタノール１mlで洗浄する。 10．ミクロフュージ中、高速で10分間速心し、乾燥する。 11．それぞれをTE緩衝液10μlに再懸濁する。 ラムダアームに対する試験的な連結 １．およその濃度を得るためにプレートアッセイを行なう。臭化エチジウムを 含有するアガロース上に、標準物（既知濃度のＤＮＡサンプル）と共にサンプル 0.5μlをスポットする。紫外線中で観察し、標準物と比較して濃度を推定する。 画分１〜４＝＞1.0μg/μl。画分５〜７＝500ng/μl ２．以下の連結反応（５μl反応）を調製し、４℃で一晩インキュベートする 。 試験パッケージおよびプレート １．製造業者のプロトコールに従い、連結反応物をパッケージングする。パッ ケージング抽出物当たり2.5μlをパッケージングする(１連結当たり２抽出物)。 ２．SM緩衝液500μlでパッケージング反応を停止し、同じ連結に由来するパッ ケージングをプールする。 ３．それぞれの1.0μlを適当な宿主上で力価測定する（OD600＝1.0）[ZAPでは XLI-Blue MRF、gtl1ではY1088]。 200μlの宿主（mM MgSO4中）をFalcon2059管へ加える。 パッケージングされたファージ１μlを接種する。 37℃で15分間インキュベートする。 約３mlの48℃の重層寒天を加える。 ［150μlのIPTG（0.5M）および300μlのX-GAL（350mg/ml）を含有する50m lのストック］ 100mmプレート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。 ４．効率の結果 gtl1：1.7×104個の組換え体（95％バックグラウンド） ZAP II：4.2×104個の組換え体（66％バックグラウンド） ショ糖勾配および有機抽出によりＤＮＡサンプル中の混入物は除去されたかも しれないが、該混合物が酵素反応を阻害したのかもしれない。ＤＮＡサンプルは 責重であったため、クローニングのために末端を「固定」することを試みた。 ＤＮＡの再平滑化 １．ラムダアームに連結しなかった残りのすべてのＤＮＡ（画分ｌ〜７）をプ ールし、最終容量が12μlになるまでH2Oを加える。ついで以下のものを加える： 143μl H2O 20μl 10×緩衝液２(StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから ） 23μl 平滑化用dNTP（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから ） 2.0μl Pfu（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから） ２．72℃で30分間インキュベートする。 ３．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。 ４．クロロホルムで１回抽出する。 ５．３ＭNaOAc 20μＬおよび氷冷エタノール400μlを加えて沈殿させる。 ６．−20℃で一晩放置する。 ７．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。 ８．１mlの70％エタノールで洗浄する。 ９．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心し、乾燥する。 （ＤＮＡは処理の第１ラウンドで既にメチル化されているため、それをメチル化 してはならない） アダプター連結 １．ＤＮＡを８μlのEcoRIアダプター(StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kit から)に穏やかに再懸濁する。 ２．以下のものを加える： 1.0μl 10×連結緩衝液 1.0μl 10mM rATP 1.0μl T4 ＤＮＡリガーゼ（４Wu/μl） ３．４℃で２日間インキュベートする。 （今回はアダプターを使用しているため、切断はしない。その代わりに、リン酸 化が必要である） アダプターのリン酸化 １．連結反応を70℃で30分間加熱して失活させる。 以下のものを加える： 1.0μl 10×連結緩衝液 2.0μl 10mM rATP 6.0μl H2O 1.0μl PNK（StratageneのｃＤＮＡ Synthesis Kitから） ３．37℃で30分間インキュベートする。 ４．31μlのH2Oおよび５μlの10×STEを加える。 ５．SephacrylS-500スピンカラム上でサイズ分画する(プール画分１〜３)。 ６．フェノール／クロロホルムで１回抽出する。 ７．クロロホルムで１回抽出する。 ８．氷冷エタノールを加えて沈殿させる。 ９．氷上で10分間放置する。 10．ミクロフュージ中、高速で30分間遠心する。 11．１mlの70％エタノールで洗浄する。 12．ミクロフュージ中、高速で10分間遠心し、乾燥する。 13．10.5μlのTE緩衝液に再懸濁する。 プレートアッセイを行なってはならない。その代わりに、2.5μlのＤＮＡを使用 し水を使用しないこと以外は前記のとおり、アームに直接連結する。 前記のとおりのパッケージングおよび滴定 効率の結果： gtl1：2.5×106個の組換え体（2.5％バックグラウンド） ZAP II：9.6×105個の組換え体（0％バックグラウンド） ライブラリーの増幅（各ライブラリーからの5.0×105個の組換え体） １．3.0mlの宿主細胞（OD660＝1.0）を２本の円錐管へ加える。 ２．円錐管１本当たり2.5×105pfuを接種する。 ３．37℃で20分間インキュベートする。 ４．最終容量が45mlになるまで、各管へ重層寒天を加える。 ５．該管を５個の150mmプレートの全体にプレーティングする。 ６．プラークのサイズがピンの頭くらいに小さくなくまで、37℃で６〜８時間 インキュベートする。 ７．８〜10mlのSM緩衝液で重層し、４℃で一晩放置する(可能ならば、穏やか に振とうしながら)。 ファージの収穫 １．各プレートから50ml円錐管中へSM緩衝液を注ぎ出すことによりファージ懸 濁液を回収する。 ２．３mlのクロロホルムを加え、激しく振とうし、室温で15分間インキュベー トする。 ３．２Krpmで10分間遠心して、細胞デブリを除く。 ４．上清を無菌フラスコ中へ注ぎ、500μlのクロロホルムを加える。 ５．４℃で保存する。 増幅ライブラリーの力価測定 １．連続希釈を作製する。 10-5＝１mlのSM緩衝液中の１μlの増幅ファージ 10-6＝１mlのSM緩衝液中の１μlの10-3希釈 ２．200μlの宿主（10mM MgSO4中）を２本の管へ加える。 ３．一方に10μlの10-6希釈物（10-5）を接種する。 ４．もう一方に１μlの10-6希釈物（10-6）を接種する。 ５．37℃で15分間インキュベートする。 ６．約３ml、48℃の重層寒天を加える。 ［150μlのIPTG（0.5M）および375μlのX-GAL（350mg/ml）を含有する50ml のストック］ ７．100mmプレート上でプレーティングし、37℃で一晩インキュベートする。 ８．結果： gtl1： 1.7×1011/ml ZAP II： 2.0×1010/ml ZAP IIライブラリーを切除して、pBluescriptライブラリーを作製する。 実施例３ 未培養の原核ＤＮＡライブラリーの調製 図１は、混合ピコプランクトンサンプルから環境ライブラリーを構築するのに 用いる方法の概観を示す。その目的は、ピコプランクトンゲノムＤＮＡを表す安 定で大きな挿入ＤＮＡライブラリーを構築することであった。 細胞の収集およびＤＮＡの調製 濃縮されたピコプランクトン細胞を含有するアガロースプラグを、オレゴン州 ニューポートからハワイ州ホノルルまでの海洋巡航で集めたサンプルから調製し た。海水（30リットル）をNiskinボトル内に集め、10μｍのNitexに通してスク リーニングし、分子量30,000のカットオフボリスルホンフィルターに通す中空糸 濾過（Amicon DC10）により濃縮する。濃縮された細菌プランクトン細胞を0.22 μｍ、47mm Duraporeフィルター上で集め、１mlの２×STE緩衝液（１Ｍ NaCl、0 .1M EDTA、10mMトリス(pH8.0)）に再懸濁し、最終密度を約１×1010細胞/mlとす る。細胞懸濁液を、40℃まで冷却した１容量の１％溶融Seaplaque LMPアガロー ス（FMC）と混合し、ついで直ちに１mlシリンジ中に取る。シリンジをパラフィ ルムで密封し、氷上で10分間放置する。細胞含有アガロースプラグを10mlの溶解 緩衝液（10mMトリス(pH8.0)、50mM NaCLl、0.1M EDTA、１％Sarkosyl、0.2％デ オキシコール酸ナトリウム、１mg/mlリゾチーム）中に押出し、37℃で１時間イ ンキュベートする。ついでアガロースプラグを40misのESP緩衝液(１％Sarkosyl 、１mg/mlプロテイナーゼ−Ｋ(0.5M EDTA中))に移し、55℃で16時間インキュベ ートする。溶液をデカントし、新鮮なESP緩衝液で置換し、55℃でさらに１時間 インキュベートする。ついでアガロースプラグを50mM EDTA中に入れ、海洋巡航 の間、４℃の船のデッキにて保存する。 オレゴン海岸沖合いで集めたサンプルから調製したアガロースプラグ（72μl ）の１個の切片を、２mlのミクロ遠心管中、１mlの緩衝液Ａ（100mM NaCl、10mM ビストリスプロパン−HCl、100μg/mlアセチル化BSA：pH7.0、25℃）に対して４ ℃で一晩透析する。溶液を、10mM MgCl2および１mM DTTを含有する250μlの新鮮 な緩衝液Ａで置換し、揺れ動くプラットホーム上、室温で１時間インキュベート する。ついで溶液を、４ＵのSau3A1（NEB）を含有する250μlの同じ緩衝液に変 え、水浴中で37℃に平衡化し、ついで揺れ動くプラットホーム上、37℃のインキ ュベーター中で45分間インキュベートする。プラグを 1.5mlミクロ遠心管へ移し、68℃で30分間インキュベートして、タンパク質（例 えば酵素）を失活させ、アガロースを溶融する。アガロースの消化およびＤＮＡ の脱リン酸化を、それぞれ、GelaseおよびHK−ホスファターゼ（Epicentre）を 製造業者の推奨に従い使用して行なう。穏やかにフェノール／クロロホルムで抽 出することによりタンパク質を除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ペレット 化し、ついで70％エタノールで洗浄する。pFOS1ベクターに連結するために、こ の部分消化されたＤＮＡを2.5ng/μlの濃度になるまで滅菌水に再懸濁する。 アガロースプラグのいくつかから得たPCR増幅の結果（データは示していない ）は、有意量の古細菌（archaeal）ＤＮＡの存在を示した。１つのサンプルから 抽出しオレゴン海岸沖合いの深さ200mで集めたｒＲＮＡを用いる定量的ハイブリ ダイゼーション実験は、この集合体内の浮遊古細菌が、全プランクトン生物量の 約4.7％を含むことを示した(このサンプルは、DeLongら，南極海洋のピコプラン クトン中の古細菌の高い存在量(high abundance of Archaea in Antarctic mari ne picoplankton)，Nature，371:695-698，1994の表１中の「PACl」−200mに対 応する)。アガロースプラグライゼート上で行なった古細菌偏向性（archaeal-bi ased）ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅の結果から、このサンプル中に比較的多量の古細菌 ＤＮＡの存在が確認された。このピコプランクトンサンプルから調製したアガロ ースプラグを、後続のフオスミドライブラリーの調製のために選択した。この部 位からのそれぞれ１mlのアガロースプラグは、7.5×105個の細胞を含有していた 。したがって、約5.4×105個の細胞が、部分消化ＤＮＡの調製で用いた72μlの 切片中に存在していた。 ベクターアームは、文献記載(Kimら，Ｆ因子に基づくベクター中のカスミドサ イズのヒトＤＮＡ挿入断片の安定な増殖(Stable propagation of casmid sized human DNA inserts in an F factor based vector)，Nucl.Acids Res.,20:10832 -10835，1992)のとおりpFOS1から調製した。簡単に言えば、プラスミドをAstII で完全に消化し、HKホスファターゼで脱リン酸化し、ついでBamHIで消化して、 ２つのアーム(それらはそれぞれ、35〜45kbpの連結ＤＮＡのクローニングおよび パッケージングのための適切な配向でcos部位を含有していた)を得た。部分消化 されたピコプランクトンＤＮＡを、ベクターおよび挿入断片（それぞれ 25ng）および１ＵのT4 ＤＮＡリガーゼ（Boehringer-Mannheim）を含有する15μ l連結反応中、PFOS1アームに一晩連結した。４μlのこの反応液中の連結ＤＮＡ を、Gigapack XLパッケージング系（Stratagene）を用いてin vitroパッケージ ングし、フォスミド粒子を大腸菌（E.coli）DH10B株（BRL）中にトランスフェク ションし、細胞をLBcm15プレート上に広げる。得られたフォスミドクローンを、 ７％グリセロールで補足されたLBcm15を含有する96ウェルマイクロタイター皿内 に拾い入れる。ピコプランクトンＤＮＡ挿入断片の約40kbをそれぞれが含有する 組換えフォスミドは、クローン化ＤＮＡの約1.4×108塩基対を含有する3.552個 のフォスミドクローンのライブラリーを与えた。調べたクローンはすべて、38〜 42kbpの挿入断片を含有していた。このライブラリーは、後の分析のために、−8 0℃で凍結保存した。 実施例４ 酵素活性アッセイ 以下は、実施例２に従い調製した発現ライブラリーのスクリーニング方法の代 表的な実施例である。以降においては、化学的特性の段階（Tier）は以下のとお りである。 段階１：加水分解酵素 段階２：アミド、エステルおよびアセタール 段階３：分類および亜分類は、反応を行なっている段階２の官能性に共有結合し た個々の基質間の相違および基質の特異性に基づく。 段階４：その酵素が基質から与えるその２つの可能なエナンチオマー生成物。 以下の実施例は、特に前記の段階に向けられているが、種々の化学的特性を試 験するための一般的な方法は、一般には、本実施例に特に言及されている以外の 基質にも適用可能である。段階１−加水分解酵素；段階２−アミドに関するスクリーニング 起源ライブラリーの11個のプレートを使用して、各ウェル内に200μＬのLB Am p/Meth.グリセロールを含有する単一のプレート(「凝縮プレート(Condensed Plat e)」)に複数接種する。この工程は、１％漂白水、イソプロパノール、各接種の間 に風乾滅菌サイクルを含むBeckman Biomekの高密度複製手段（High Density Replicating Tool(HDRT)）を用いて行なった。したがって凝縮プレート の各ウェルは、11個の起源ライブラリープレートのそれぞれからの11個の異なる pBluescriptクローンを含有していた。凝縮プレートを37℃で２時間増殖させ、 ついで、各ウェル内に250μＬのLB Amp/Meth.グリセロールを含有する２個の白 色の96ウェルDynatechマイクロタイター娘プレートに接種するのに使用した。も との凝縮プレートを37℃で18時間インキュベートし、ついで−80℃で保存する。 その２つの凝縮娘プレートも、37℃で18時間インキュベートする。ついで凝縮娘 プレートを70℃で45分間加熱して細胞を殺し、宿主大腸菌（E.coli）酵素を失活 させる。DMSO中５mg/mLのモルホウレア フェニルアラニル−７−アミノ−４−ト リフルオロメチルクマリン（MuPheAFC、「基質」）のストック溶液を、洗浄剤であ るドデシルマルトシドの0.6mg/mLを含有する50mM（pH7.5）ヘペス緩衝液で600μ Ｍになるまで希釈した。 600μＭ MuPheAFC溶液の50μＬを、Biomekを用いて単一の100μＬ混合サイク ルで白色の凝縮プレートの各ウェルへ加えて、基質の最終濃度を100μＭ以下と した。基質の添加直後に(t＝０)、プレート読み取り蛍光光度計上で蛍光値を記 録した(励起＝400nm、発光＝505nm)。プレートを70℃で100分間インキュベート し、ついでさらに15分間、外界温度にまで冷却した。蛍光値を再び記録した(t＝ 100)。t＝100での値からt＝０での値を引き算して、活性クローンが存在するか 否かを判定した。 これらのデータは、ウェルG8中の11個のクローンのうちの１個が基質を加水分 解していることを示した。活性を保持する個々のクローンを確認するために、そ の11個の起源ライブラリーを解凍し、個々のクローンを用いて、LB Amp/Meth.グ リセロールを含有する新たなプレートに１つずつ接種した。前記のとおり、細 胞を増殖させるために該プレートを37℃でインキュベートし、宿主酵素を失活さ せるために70℃で加熱し、600μＭ MuPheAFCの50μＬを、Biomekを用いて加えた 。さらに他の３つの基質を試験した。メチル ウンベリフェロンヘプタノエート 、CBZ−アルギニンローダミン誘導体およびフルオレセイン結合カゼイン(カゼイ ン１mol当たリフルオレセイン3.2mol以下)。 ウンベリフェロンおよびローダミンを、50μＬヘペス緩衝液中の600μＭスト ック溶液として加えた。フルオレセイン結合カゼインも、20および200mg/mLのス トック濃度にて50μＬで加えた。基質を加えた後、t＝０の蛍光値を記録し、プ レートを70℃でインキュベートし、t＝100分の値を前記のとおり記録した。 これらのデータば、活性クローンがプレート２中に存在することを示した。ま た、アルギニンローダミン誘導体は、この活性により代謝回転したが、リパーゼ の基質であるメチル ウンベリフェロンヘプタノエートおよびタンパク質である フルオレセイン結合カゼインは基質として機能しなかった。 前記のデータに基づけば、段階１の分類は「加水分解酵素」であり、段階２の 分類はアミド結合である。段階２−エステル分類の場合の交差反応性はなかった 。 図２に示すとおり、段階１で加水分解酵素として、そして段階２でアミドとし て特徴づけられているライブラリーからの組換えクローンを、ついで、段階３で 種々の特異性に関して試験してもよい。図２では、段階３の種々のクラスの後に 、段階３のそのような特異性の同定に用いる表１の基質を同定する括弧内の記号 が続いている。 図３および４に示すとおり、段階１で加水分解酵素として、そして段階２でエ ステルとして特徴づけられているライブラリーからの組換えクローンを、ついで 、段階３で種々の特異性に関して試験してもよい。図３および４では、段階３の 種々のクラスの後に、段階３のそのような特異性の同定に用いる表２および２の 基質を同定する括弧内の記号が続く。図３および４では、R2はエステルのアルコ ール部分を表し、R1はエステルの酸部分を表す。 図５に示すとおり、段階１で加水分解酵素として、そして段階２でアセタール として特徴づけられているライブラリーからの組換えクローンを、ついで、段階 ３で種々の特異性に関して試験してもよい。図５では、段階３の種々のクラスの 後に、段階３のそのような特異性の同定に用いる表４の基質を同定する括弧内の 記号が続いている。 酵素は、該酵素により産生された生成物のキラリティーに関して、段階４で分 類してもよい。例えば、キラルなアミノエステルは、少なくとも以下の基質を用 いて決定してもよい。 代謝回転される各基質に関して、エナンチオ選択性の値（Ｅ）は以下の式から 求める： [式中、eepは加水分解生成物のエナンチオマー過剰率（ee）であり、ｃは反応の 変換率(％)である]。WongおよびWhitesides,Enzymes in Synthetic Organic Che mistry,1994,Elsevier,Tarrytown,NY,p.9-12を参照されたし。 エナンチオマー過剰率は、キラル高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または キラルキャピラリー電気泳動（CE）のいずれかにより決定する。アッセイは、以 下のとおり行なう。200μＬの適当な緩衝液、ついで50μＬの部分精製または完 全精製された酵素溶液を、96ウェルの白色のマイクロタイタープレートの各ウェ ルに加え、50μＬの基質を加え、基質の50％が消費されるか反応が停止するかの いずれかが最初に生じるまで、蛍光の増加を時間に対してモニターする。 同定されたエステラーゼの１つについて、以下のとおり、エナンチオ選択性を 求めた。α−メチルベンジルアセテートを形成（エステル交換反応）または分解 （加水分解）する反応の場合、eec(未反応基質のエナンチオマー過剰率(ee))、e ep（加水分解生成物のee）およびｃ（反応の変換率(％)）を求めることにより、 酵素のエナンチオ選択性を得た。エナンチオマー過剰率は、キラル高速ガスクロ マトグラフィー（GC）により求めた。クロマトグラフィー条件は、以下のとおり であった。 サンプル調製：サンプルを0.2μｍ、13mm径のPTFEフィルターで濾過した。 カラム：Supelco β−DEX 120、0.25mm内径、30m、0.25μｍ df。 乾燥：90℃で１分間、ついで５℃/分にて90℃〜150℃。 キャリヤーガス：ヘリウム、１mL/分で２分間、ついで１mL/分〜３mL/分(0.2m L/分にて)。 検出器：FID、300℃。 注入：１μＬ(反応溶媒中、１mLの基質)、スプリット(１：75)、200℃。 「有機溶媒耐性」、「水不溶性溶媒」に記載されている方法に従い、エステル 交換反応を行なった。以下を参照されたし。 酵素ESL-001-01によるエステル交換は、以下の結果を与えた。溶媒 ％ees ％eep ％c ｎ−ヘプタン 10.9 44.3 19.8 トルエン 3.2 100 3.1 加水分解反応は、以下のとおり行なった。10％水性DMSO（v/v）中のα−メチ ルベンジルアセテートの10mM溶液の50μＬを、100mM（pH6.9）リン酸緩 衝液の200μＬに加えた。この溶液に、250μＬの酵素ESL-001-01（100mM（pH6.9 ）リン酸緩衝液中、２mg/mL）を加え、反応を70℃で15分間加熱した。この反応 を、以下の方法に従い後処理した。250μＬの加水分解反応混合物を取り出し、 １mLエッペンドルフ管に加える。250μＬの酢酸エチルを加え、30秒間、激しく 振とうする。15分間、相を分離させる。最上部の有機相の200μＬをピペットで 取り、0.2μｍ、４mm径のPTFEフィルターで濾過する。前記のとおり、キラルGC により分析する。 酵素ESL-001-01による加水分解は、以下の結果を与えた。 ％ees ％eep ％c 100 0.7 99.3 実施例５ 組換えクローンの物理学的特性に関する試験 本実施例では、ライブラリーの組換えクローンの、ある物理学的特性に関して 試験する方法を説明する。 最適ｐＨ 200μＬの４−メチル−ウンベリフェリル−2,2−ジメチル−４−ペンテノエー トを、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、カラム１からカラ ム12へ連続希釈した。８つの異なるｐＨにおける反応速度を単一のプレート上で 試験するために、50μＬの適当な５×ｐＨ緩衝液をプレートの各列に加えた。20 μＬの酵素ESL-001-01（１mg/mLストック溶液の１：3000希釈）を、各ウェルに 加えて、反応を開始させた。70℃、370nmでの吸光度の増加をモニターして、反 応速度を求め、速度対基質濃度を、ミカエリスーメンテン式にあてはめて、各ｐ ＨにおけるＶMAXを求めた。 酵素ESL-001-01は、図６に示す結果を与えた。 最適温度 １mLの恒温キュベットヘ、930μＬの50mM（pH7.5）ヘペス緩衝液を加えた。温 度を平衡化した後、50μＬの酵素ESL-001-01(ヘペス緩衝液中の１mg/mLストック 溶液の１：8000希釈)、および30mg/mLドデシルマルトシドを含有する20μＬの５ mM ４−メチル−ウンベリフェリル−ヘプタノエートを加えた。 370nmでの吸光度の増加率を、10、20、30、40、50、60、70、80および90℃で測 定した。 酵素ESL-001-01は、図７に示す結果を与えた。 温度安定性 酵素ESL-001-01（ヘペス緩衝液中の１mg/mLストック溶液の１：4000希釈）の サンプル１mLを、70、80および90℃でインキュベートした。選択された時点で、 25μＬのアリコートを取り出し、200μＬの100μＭ ４−メチルウンベリフェリ ルパルミテートおよび0.6mg/mLのドデシルマルトシドを含む96ウェルマイクロタ イタープレート中で、前記のとおリアッセイした。このデータを用いて、酵素の 失活の半減期を求めた。 酵素ESL-001-01は、以下の結果を与えた。 温度 半減期 90 23分 80 32分 70 110時間 有機溶媒耐性 水溶性溶媒（ジメチルスルホキシド(DMSO)およびテトラヒドロフラン(THF)） 有機溶媒中の１mM ４−メチル−ウンベリフェリル−ブチレート30μＬを、96 ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えた。緩衝液と有機溶媒との混合 物の240μＬ(以下の表を参照されたし)、ついで30μＬの酵素ESL-001-01（50mM( pH6.9)MOPS緩衝液中の１mg/mLストック溶液の１：50,000希釈）をプレートのウ ェルに加え、70℃でインキュベートした。蛍光（EX＝360nm、EM＝440nm）の増加 を、時間に対してモニターして、相対活性を求めた。 有機溶媒(μＬ) 緩衝液(μＬ) 最終的な有機溶媒(％) 240 0 90 195 45 75 150 90 60 120 120 50 90 150 40 60 180 30 30 210 20 0 240 10 酵素ESL-001-01 O1は、図８に示す結果を与えた。 水不溶性溶媒（ｎ−ヘプタン、トルエン） １mLの溶媒を、１mgの凍結乾燥された酵素ESL-001-01および攪拌棒を含有する バイアルヘ加えた。10μＬの100mM １−フェネチルアルコールおよび10μＬの10 0mM酢酸ビニルをバイアルに加え、ヒートブロック中70℃で24時間、バイアルを 攪拌した。サンプルを0.2μｍ、４mm径のPTFEフィルターで濾過し、キラルGCに より前記のとおり分析した。データに関しては、前記の節を参照されたし。 比活性 比活性は、pH6.9のMOPS緩衝液中90℃で100μＭ ４−メチルウンベリフェリル ヘプタノエートを用いて測定した。酵素ESL-001-01について得た比活性は、1662 μmol/分・mgであった。 実施例６ 組換えクローンの基質特異性に関する試験 本実施例では、ライブラリーの組換えクローンの基質特異性に関して試験する 方法を説明する。 基質のフィンガープリント 以下の各基質の50mM(pH6.9)MOPS緩衝液中に１mg/mLのドデシルマルトシドを含 有する1.25ミリモルの溶液を調製した： ４−メチルウンベリフェリルアセテート（Ａ） ４−メチルウンベリフェリルプロパノエート（Ｂ） ４−メチルウンベリフェリルブチレート（Ｃ） ４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート（Ｄ） ４−メチルウンベリフェリルα−メチルブチレート（Ｅ） ４−メチルウンベリフェリルβ−メチルクロトネート（Ｆ） ４−メチルウンベリフェリル2,2−ジメチル−４−ペンテノエート（Ｇ） ４−メチルウンベリフェリルアジピン酸モノエステル（Ｈ） ４−メチルウンベリフェリル1,4−シクロヘキサンジカルボキシレート（Ｉ） ４−メチルウンベリフェリルベンゾエート（Ｍ） ４−メチルウンベリフェリルｐ−トリメチルアンモニウムシアナメート（Ｎ） ４−メチルウンベリフェリル４−グアニジノベンゾエート（Ｏ） ４−メチルウンベリフェリルα−メチルフェニルアセテート（Ｐ） ４−メチルウンベリフェリルα−メトキシフェニルアセテート（Ｑ） ４−メチルウンベリフェリルパルミテート（Ｓ） ４−メチルウンベリフェリルステアレート（Ｔ） ４−メチルウンベリフェリルオレエート（Ｕ） ４−メチルウンベリフェリルエライデート（Ｗ)。 前記の各溶液200μＬ、ついで50μＬの酵素ESL-001-01（MOPS緩衝液中の１mg/ mLストック溶液の１：2,000希釈）を96ウェルマイクロタイタープレートのウェ ルに加え、70℃で20分間インキュベートした。蛍光（EX＝360nm、EM＝440nm）を 測定し、非酵素的加水分解による蛍光を差し引いた。表５は、前記の各基質の相 対蛍光を示す。 前記の教示を考慮して、本発明の多数の修飾および変形が可能である。したが って、本発明は、請求の範囲の範囲内であれば、特に記載されていないものであ っても実施することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／６５７，４０９ (32)優先日 平成８年６月３日(1996．6．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＩＬ，Ｊ Ｐ，ＵＳ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．パッケージを含んでなる酵素キットであって、該パッケージは少なくとも３ つの異なる組換え酵素を含み、該少なくとも３つの異なる組換え酵素はそれぞ れ少なくとも２つの酵素の特徴を共通に有し、該少なくとも２つの共通な酵素 の特徴の一方は化学的特徴であり、そして該少なくとも２つの共通な酵素特徴 の他方は物理的特徴である、該酵素キット。 ２．以下の工程を含んでなる、組換え酵素ライブラリーの作製方法： それぞれが微生物に由来するポリヌクレオチドを含む複数の発現クローンに よって産生された組換えタンパク質をスクリーニングし、該スクリーニングは 組換え酵素を産生するクローンを決定するためおよび該組換え酵素について複 数の異なる酵素の特徴を決定するために実施され；そして 該組換え酵素を該酵素の特徴によって分類する。 ３．該スクリーニングが該組換え酵素を化学的特徴についてスクリーニングし、 そして該化学的特徴を有する組換え酵素を第２の化学的特徴について再スクリ ーニングすることを含む、請求項２に記載の方法。 ４．酵素スクリーニングキットの作製方法であって、パッケージ中に少なくとも ３つの異なる選択された酵素を入れることを含んでなり、該酵素は異なる酵素 特徴を有する複数の異なる酵素を有する組換え酵素ライブラリーから選択され 、該ライブラリーの該酵素は該酵素の特徴によって分類されており、前記少な くとも３つの異なる選択された酵素のそれぞれは少なくとも２つの共通な酵素 特徴を有する、該方法。 ５．以下の工程を含んでなる、所望の活性を有するタンパク質を発現する組換え ライブラリーのクローンを同定する方法： 少なくとも１つの微生物のＤＮＡからランダムに作製された発現クローンの ライブラリーを液相中でスクリーニングし、該スクリーニングは該クローンの 発現産物を用いて実施され、それによって所望の活性を有するタンパク質を発 現するクローンを同定する。 ６．それから該発現クローンのライブラリーを作製したＤＮＡが遺伝子クラスタ ーＤＮＡである、請求項５に記載の方法。 ７．該タンパク質が酵素である、請求項５に記載の方法。 ８．以下の工程を含んでなる、非培養微生物由来のＤＮＡを有するクローンを特 定のタンパク質活性についてスクリーニングする方法： （ｉ）少なくとも１つの非培養微生物に由来するＤＮＡ集団からＤＮＡを回収 し；そして （ii）回収したＤＮＡを用いて宿主を形質転換し、特定のタンパク質活性につ いてスクリーニングされるクローンライブラリーを作製する、 ことによって調製されたクローンライブラリーにおいて特定のタンパク質活性 についてスクリーニングする。 ９．回収したＤＮＡを増幅する、請求項８に記載の方法。 10．回収したＤＮＡをベクターにライゲートする、請求項８に記載の方法。 11．回収したＤＮＡをライゲートするベクターが、該回収したＤＮＡからの検出 可能な酵素活性の産生を調節することができる少なくとも１つのＤＮＡ配列を含 む、請求項10に記載の方法。 12．回収したＤＮＡをライゲートしたベクターが宿主を形質転換するのに用いら れる、請求項８に記載の方法。 13．該タンパク質が酵素である、請求項８に記載の方法。
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