JP2002511415A - ヘッジホッグシグナリング経路の阻害剤としてのステロイドアルカロイド誘導体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヘッジホッグ蛋白質またはヘッジホッグシグナル変換経路の異常活性によって生産されたパラクリンおよび／またはオートクラインシグナルを阻害する利用可能なアッセイおよび試薬を利用し、例えば、これはステロイドアルカロイドまたは他の小分子の使用を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） パターン形成は、それによって胚細胞が分化した組織の秩序立った空間的配置
を形成する活性である。高等生物の物理的複雑性は、細胞固有の系列および細胞
外因性シグナリングの内部役割を介して胚発生の間に生起する。誘導的相互作用
は、身体プランの最も初期の確立からの脊椎動物発生における胚パターンニング
に、器官系のパターンニングに、組織分化の間の発散細胞タイプの発生に必須で
ある（Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｅ．（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０８
：３６５−３８９；Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１
８５−１９９；Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：２
５７−２７０）。発生細胞相互作用の効果は変化する。典型的には、応答細胞は
、応答細胞の未誘導および誘導状態双方とは異なる細胞を誘導することによって
細胞分化の１つの経路からもう１つの経路に転換する（誘導）。時々、細胞はそ
の隣接細胞がそれ自体のように分化するように誘導する（ホメオジェネティック
誘導）；他の場合において、細胞はその隣接細胞をそれ自体のように分化するの
を阻害する。初期発生における細胞相互作用は順次のものであり得、従って、２
つの細胞タイプの間の初期誘導は、多様性の進行的増幅に至る。さらに、誘導的
相互作用は胚においてのみならず、成体細胞においても起こり、形態形成パター
ンを確立し維持し、ならびに分化を誘導するように作用することができる（Ｊ．
Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ （１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１８５−１９９）。

【０００２】 シグナリング分子のヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）ファミリーのメンバー
は、非脊椎動物および脊椎動物発生の間に多くの重要な短いおよび長い範囲パタ
ーンニングプロセスを媒介する。ハエにおいては、単一ヘッジホッグ遺伝子はセ
グメントおよびイメージのディスクパターンニングを調節する。対照的に、脊椎
動物においては、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーは左−右対象性、ＣＮＳにおけ
る極性、体節および四肢、器官形成、軟骨形成および精子形成の制御に関与して
いる。

【０００３】 最初のヘッジホッグ遺伝子は果実ハエであるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａ
ｎｏｇａｓｔｅｒにおける遺伝子スクリーニングによって同定された（Ｎｕｓｓ
ｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ， Ｃ．およびＷｉｅｓｃｈａｕｓ，Ｅ．（１９８０
） Ｎａｔｕｒｅ ２８７，７９５−８０１）。このスクリーニングは、胚およ
び幼虫発生に影響する多数の突然変異を同定した。１９９２年および１９９３年
において、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ヘッジホッグ（ｈｈ）遺伝子の分子性質が報
告され（Ｃ．Ｆ．，Ｌｅｅら（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１，３３−５０）、そ
れ以来、いくつかのヘッジホッグ相同体が種々の脊椎動物種から単離された。１
つのヘッジホッグ遺伝子がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび他の非脊椎動物で見いだ
され、複数のヘッジホッグ遺伝子が脊椎動物に存在する。

【０００４】 種々のヘッジホッグ蛋白質はシグナルペプチド、高度に保存されたＮ−末端領
域、およびより発散したＣ−末端ドメインよりなる。分泌経路におけるシグナル
配列切断（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：３３−５０；Ｔａ
ｂａｔａ，Ｔ．ら（１９９２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２６３５−２６４５；Ｃ
ｈａｎｇ，Ｄ．Ｅ．ら（１９９４） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：３３３
９−３３５３）に加えて、ヘッジホッグ前駆体蛋白質は、Ｃ−末端蛋白質におけ
る保存された配列に依存する内部自己蛋白質分解切断を受ける（Ｌｅｅら（１９
９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１５２８−１５３７；Ｐｏｒｔｅｒら（１９
９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６３−３６６）。この自己切断は１９ｋＤの
Ｎ−末端ペプチドおよび２６−２８ｋＤのＣ−末端ペプチドに導く（Ｌｅｅら（
１９９２）、前掲：Ｔａｂａｔａら（１９９２）前掲；Ｃｈａｎｇら（１９９４
）前掲；Ｌｅｅら（１９９４）、前掲；Ｂｕｍｃｒｏｔ，Ｄ．Ａ．ら（１９９５
） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２２９４−２３０３；Ｐｏｒｔｅｒ
ら（１９９５）前掲；Ｅｋｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．ら（１９９５） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏ
ｌ．５：９４４−９５５；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ら（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ １２１：２３４９−２３６０）。Ｎ−末端ペプチドは、それが合成された
細胞の表面に密接に会合しており、他方、Ｃ−末端ペプチドはイン・ビトロおよ
びイン・ビボ双方において自由に拡散できる（Ｐｏｒｔｅｒら（１９９５） Ｎ
ａｔｕｒｅ ３７４：３６３；Ｌｅｅら（１９９４）前掲；Ｂｕｍｃｒｏｔら（
１９９５）前掲；Ｍａｒｔ’，Ｅ．ら（１９９５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１２１：２５３７−２５４７；Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．ら（１９９５） Ｃｅｌｌ
８１：４４５−４５５）。興味深いことには、Ｎ−末端ペプチドの細胞表面保
持は、イン・ビトロで（Ｐｏｒｔｅｒら（１９９５）前掲）およびイン・ビボで
（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ら（１９９６） Ｃｅｌｌ ８６，２１−３４）拡散
可能である内部切断の正常位置で正確に終止するＲＮＡによってコードされたＨ
Ｈの切形形態として、自己切断に依存する。生化学研究は、ＨＨ前駆体蛋白質の
自己蛋白質分解切断が、求核置換で引き続いて切断される内部チオエステル中間
体を介して進行することが示されている。求核はＮ−ペブチドのＣ−末端の末端
に共有結合する小さい求核分子であり（Ｐｏｒｔｅｒら（１９９６）前掲）、そ
れを細胞表面に連結するであろう。生物学的重要性は深遠である。連結の結果と
して、ヘッジホッグ生産細胞の表面に、高い局所濃度のＮ−末端ヘッジホッグペ
プチドが生成する。ショウジョウバエおよび脊椎動物において短いおよび長い範
囲のヘッジホッグシグナリング活性に必要かつ十分であるのがこのＮ−末端ペプ
チドである（Ｐｏｒｔｅｒら（１９９５）前掲；Ｅｋｋｅｒら（１９９５）前掲
；Ｌａｉら（１９９５）前掲；Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．ら（１９９５）Ｃｅｌｌ
８１：４４５−４５５；Ｐｏｒｔｅｒら（１９９６）前掲；Ｆｉｅｔｚ，Ｍ．Ｊ
．ら（１９９５） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ５：６４３−６５１；Ｆａｎ，Ｃ．
−Ｍ．ら（１９９５） Ｃｅｌｌ ８１：４５７−４６５；Ｍａｒｔ’，Ｅ．ら
（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３２２−３２５；Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔ
ｉｎｅｚら（１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ ５：７９１−７９５；Ｅｋｋ
ｅｒ，Ｓ．Ｃ．ら（１９９５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２３３７−
２３４７；Ｆｏｒｂｅｓ，Ａ．Ｊ．ら（１９９６） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１２２：１１２５−１１３５）。

【０００５】 ＨＨはショウジョウバエ発生の間に種々の部位における短いおよび長い範囲の
パターンニングプロセスに関係付けられてきた。初期胚におけるセグメント極性
の確立において、それは直接的に媒介されるように見える短い範囲の効果を有し
、他方、イメージディスクのパターンニングにおいては、それは二次シグナルの
誘導を介して長い範囲の効果を誘導する。

【０００６】 脊椎動物においては、いくつかのヘッジホッグ遺伝子が過去数年間でクローン
化されている。隣接組織をパターン化するシグナルの源である異なる組織中心で
それが発現されるごとく、これらの遺伝子のうち、Ｓｈｈは実験の注意のほとん
どを受容した。最近の証拠は、Ｓｈｈがその相互作用に関与することを示す。

【０００７】 Ｓｈｈの発現は、推定中胚葉、マウス（Ｃｈａｎｇら（１９９４）前掲；Ｅｃ
ｈｅｌａｒｄ，Ｙ．ら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：１４１７−１４３０）、
ラット（Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．ら（１９９４） Ｃｅｌｌ ７６：７６１−７７
５）およびニワトリ（Ｒｉｄｄｌｅ，Ｒ．Ｄ．ら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７５
：１４０１−１４１６）、およびゼブラフィッシュにおける保護物（Ｅｋｋｅｒ
ら（１９９５）前掲；Ｋｒａｕｓｓ，Ｓ．ら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：１
４３１−１４４４）における節での原腸形成の開始後まもなく開始する。ニワト
リ胚において、節でのＳｈｈ発現パターンは左右不対称を生じ、これは心臓の左
右位置の原因であるようである（Ｌｅｖｉｎ，Ｍ．ら（１９９５） Ｃｅｌｌ
８２：８０３−８１４）。

【０００８】 ＣＮＳにおいて、脊索およびフロールプレートからのＳｈｈは腹側細胞の運命
を誘導するようである。 異所的に発現されると、Ｓｈｈはマウス（Ｅｃｈｅｌ
ａｒｄら（１９９３） 前掲；Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｌ．Ｖ．ら（１９９６）Ｇｅ
ｎｅｓ Ｄｅｖ．１０：３０１−３１２），ツメガエル（Ｒｏｅｌｉｎｋ，Ｈ．
ら（１９９４） 前掲；Ｒｕｉｚｉ Ａｌｔａｂａ，Ａ．ら（１９９５） Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１０６−１２１）、ゼブラフィッシュ（
Ｅｋｋｅｒら（１９９５）前掲；Ｋｒａｕｓら（１９９３）前掲；Ｈａｍｍｅｒ
ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １９：６４７−６
５８）において中央および裏側脳の大きな領域の腹形成に導く。脊髄レベルにお
いて中間神経外胚葉の外植体において、Ｓｈｈ蛋白質は、区別される濃度閾値を
持つフロールプレートおよび運動ニューロン発生、低濃度の高い運動ニューロン
におけるフロールプレートを誘導する（Ｒｏｅｌｉｎｋら（１９９５）前掲；Ｍ
ａｒｔ’ら（１９９５）前掲；Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．ら（１９９５） Ｃｕｒｒ．
Ｂｉｏｌ． ５：６５１−６５８）。さらに、抗体ブロッキングは、脊索によっ
て生産されたＳｈｈが運動ニューロン運命の脊索媒介誘導で必要である（Ｍａｒ
ｔ’ら（１９９５）前掲）。かくして、Ｓｈｈ−生産中線細胞の表面上のＳｈｈ
の高濃度はイン・ビトロで観察されたフロールプレートの接触−媒介誘導を説明
するようであり（Ｐｌａｃｚｅｋ，Ｍ．ら（１９９３） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ １１７：２０５−２１８）、該中線はイン・ビボで脊索の直ぐに上方のフロ
ールプレートに位置する。脊索およびフロールプレートから放出されたより低濃
度のＳｈｈは、恐らくは、イン・ビトロで接触−独立性であることが示されてい
るプロセスにおいて、より遠位腹側外側領域で運動ニューロンを誘導する（Ｙａ
ｍａｄａ，Ｔ．ら（１９９３） Ｃｅｌｌ ７３：６７３−６８６）。中脳およ
び前脳レベルで採取した外植体において、Ｓｈｈは、各々、ドーパミン作動性（
Ｈｅｙｎｅｓ，Ｍ．ら（１９９５） Ｎｅｕｒｏｎ １５：３５−４４；Ｗａｎ
ｇ，Ｍ．Ｚ．ら（１９９５） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １：１１８４−１１８
８）およびコリン作動性（Ｅｒｉｃｓｏｎ，Ｊ．ら（１９９５） Ｃｅｌｌ ８
１：７４７−７５６）前駆体の、適当な腹側外側ニューロン細胞タイプを誘導し
、これは、ＳｈｈがＣＮＳの全長さを超える腹側明細の共通のインデューサーで
あることを示す。これらの観察は、Ｓｈｈに対する異なる応答が特定の前後位置
でいかにして調製されるかに関して疑問を生じる。

【０００９】 中線からのＳｈｈは、脊椎動物胚、体幹における体節（Ｆａｎら（１９９５）
前掲）および体節の頭部間葉吻側（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら（１９９６）
前掲）の軸傍領域をパターン化する。ニワトリおよびマウス軸傍中胚葉外植体に
おいて、Ｓｈｈは、皮膚筋板マーカーＰａｘ３を犠牲にして、Ｐａｘ１およびＴ
ｗｉｓｔ様硬節特異的マーカーの発現を促進する。さらに、フィルターバリアー
実験は、Ｓｈｈが二次シグナリングメカニズムの活性化によるよりもむしろ直接
的に硬節の誘導を媒介することを示唆する（Ｆａｎ，Ｃ．−Ｍ．およびＴｅｓｓ
ｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｍ．（１９９４） Ｃｅｌｌ ７９，１１７５−１１
８６）。

【００１０】 また、Ｓｈｈは筋板遺伝子発現を誘導するが（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら
（１９９６）前掲；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９４） Ｃｅｌｌ ７９
：１１６５−１１７３；Ｍｕｎｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．ら（１９９５） Ｇ
ｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９：２９１１−２９２２；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｓ．ら
（１９９６） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２７１−２８０）、最近の実
験は、ＷＮＴファミリーのメンバー、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｎｇｌｅｓｓ
の脊椎動物ホモログが協働的に必要であることを示唆する（Ｍｕｎｓｔｅｒｂｅ
ｒｇら（１９９５）前掲）。当惑することには、ニワトリにおける筋板誘導は硬
節マーカーの誘導より高いＳｈｈ濃度を要する（Ｍｕｎｓｔｅｒｂｅｒｇら（１
９９５）前掲）が、筋板は脊索よりもかなり近く位置した体節細胞に由来する。
同様の結果がゼブラフィッシュで得られており、ここに、高濃度のヘッジホッグ
が筋板を誘導し、硬節マーカー遺伝子発現を抑制する（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉ
ｄｔら（１９９６）前掲）。しかしながら、有羊膜類とは対称的に、これらの観
察は魚類胚の構築と合致し、ここでは、筋板は体節の支配的かつより軸方向の構
成要素である。かくして、Ｓｈｈシグナリングの変調および新しいシグナリング
因子の獲得は、脊椎動物進化の間の体節構造を修飾してきた。

【００１１】 脊椎動物四肢芽において、後間葉細胞のサブセット、「極性活性のゾーン」（
ＺＰＡ）は前後指同一性を調節する（Ｈｏｎｉｇ，Ｌ．Ｓ．（１９８１）Ｎａｔ
ｕｒｅ２９１：７２−７３にレビューされている）。Ｓｈｈの異所性発現または
Ｓｈｈペプチドに浸漬したビーズの適用は前方ＺＰＡグラフトの影響を模倣し、
指の鏡像複製を生成する（Ｃｈａｎｇら（１９９４）前掲；Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒ
ｔｉｎｅｚら（１９９５）前掲；Ｒｉｄｄｌｅら（１９９３）前掲）（図２）。
かくして、指の同一性は、主としてＳｈｈ濃度に依存するように見えるが、他の
シグナルがこの情報をＡＰパターンニングに要するようである実質的距離にわた
って中継し得るのは可能である（１００−１５０μｍ）。ショウジョウバエイメ
ージディスクにおけるＨＨおよびＤＰＰの相互作用と同様に、脊椎動物四肢芽に
おけるＳｈｈはＢａｍｐ２（Ｆａｎｃｉｓ，Ｐ．Ｈ．ら（１９９４） Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ １２０：２０９−２１８）、ｄｐｐホモログの発現を活性化す
る。しかしながら、ショウジョウバエとは異なり、ＢＭＰ２はニワトリ四肢芽に
おける異所性適用に際してＳｈｈの極性効果を模倣しない（Ｆｒａｎｃｉｓら（
１９９４）前掲）。前後パターンニングに加えて、Ｓｈｈは、後方先端外胚葉隆
起における繊維芽細胞成長因子ＦＧＦ４の合成を誘導することによって、四肢の
近位遠位派生物の調節に関与するようである（Ｌａｕｆｅｒ，Ｅ．ら（１９９４
） Ｃｅｌｌ ７９：９９３−１００３；Ｎｉｓｗａｎｄｅｒ，Ｌ．ら（１９９
４） Ｎａｔｕｒｅ ３７１：６０９−６１２）。

【００１２】 ヘッジホッグ蛋白質およびＢＭＰの間の密接な関係は脊椎動物ヘッジホッグ発
現の多くの、しかし恐らくは全てではない部位で保存されているようである。例
えば、ニワトリ後腸において、ＳｈｈはＢｍｐ４、もう１つの脊椎動物ｄｐｐホ
モログを誘導することが示されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９５
） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：３１６３−３１７４）。さらに、Ｓｈｈ
およびＢｍｐ２、４または６は胃の上皮および間葉細胞、尿生殖系、肺、歯芽お
よび毛嚢でのそれらの発現において驚くべき関係を示す（Ｂｉｔｇｏｏｄ，Ｍ．
Ｊ．およびＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．（１９９５） Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７２
：１２６−１３８）。さらに、Ｉｈｈ、２つの他のマウスヘッジホッグ遺伝子の
うちの１つは、腸および発生する軟骨におけるＢｍｐ発現細胞に隣接して発現さ
れる（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ（１９９５）前掲）。

【００１３】 最近の証拠は、Ｉｈｈが軟膏形成発生の調節で非常に重要な役割を演じるモデ
ルを示唆する（Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９５）前掲）。軟骨形成の間に、軟骨細
胞は中間のプレ肥大性状態を介して増殖状態から分化した肥大性軟骨細胞まで進
行する。Ｉｈｈはプレ肥大性軟骨細胞で発現され、軟骨細胞分化のブロックに至
るシグナリングカスケードを開始する。その直接的標的はＩｈｈ発現ドメインの
回りの軟骨膜であり、これは、ＧｌｉおよびＰａｔｃｈｅｄ （Ｐｔｃ）、ヘッ
ジホッグシグナルの保存された転写標識（後記参照）の発現によって応答する。
最もありそうには、これは関節周囲軟骨膜における上皮小体ホルモン−関連蛋白
質（ＰＴＨｒＰ）の合成の結果となる二次シグナリングに至る。ＰＴＨｒＰ自体
はプレ肥大性軟骨細胞に信号を戻し、そのさらなる分化をブロックする。同時に
、ＰＴＨｒＰはＩｈｈの発現を抑制し、それにより、軟骨細胞の分化の速度を変
調する陰性フィードバックを形成する。

【００１４】 （発明の概要） 本発明は、ヘッジホッグシグナル変換経路を阻害する方法および試薬に関する
。例えば、本発明は、ヘッジホッグ蛋白質に感受性の細胞を、ヘッジホッグ蛋白
質に対する該細胞の感受性を減少させるのに十分な量のステロイドアルカロイド
、または他の小分子に接触させることを含むヘッジホッグ蛋白質によって生産さ
れたパラクリンおよび／またはオートクリンシグナルを阻害する方法および試薬
を利用する。他の態様において、本発明は、細胞を、成長状態を調節する、例え
ば、正常ｐｔｃ経路に作動するまたは平滑化活性に拮抗するのに十分な量の、ス
テロイドアルカロイドまたは他の小分子のごときｐｔｃアゴニストと接触させる
ことを含む、ｐｔｃ機能喪失または平滑化機能獲得から得られた異常成長状態を
阻害する方法および試薬を利用する。

【００１５】 （図面の簡単な説明） 図１． 植物ステロイドアルカロイドジェルビン、シクロパミンおよびトマチ
ジンの、およびコレステロールの合成化合物ＡＹ９９４４およびトリパラノール
の構造。

【００１６】 図２． ジェルビン（４）に暴露されたニワトリ胚で誘導された全前脳。（Ａ
）未処理胚の外部面特徴ののＳＥＭ。（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）中線組織の可変喪
失を持つ１０μＭジェルビンに暴露された胚および対となって、側方嗅覚突起（
ｏｌｆ）、光学小胞（Ｏｐｔ）および上顎（Ｍｘ）および下顎（Ｍｎ）突起の得
られた融合。光学小胞（Ｅ）の完全な融合は真の単眼症に至った。

【００１７】 図３． 合成および植物由来テトラジェンは外植ニワトリ組織における外因性
Ｓｈｈシグナリングをブロックする（４１）。中線組織をＨｅｎｓｅｎ節に対し
て丁度吻のレベルの段階９−１０ラワトリ胚から摘出し（白色ダッシュ線）、さ
らに切開して（黒色ダッシュ線）して、Ｓｈｈシグナルの外因性源（脊索）およ
び応答性組織（神経板外胚葉）を含有する外植体を得た。コラーゲンゲルマトリ
ックスにおける培養の２日後、神経外胚葉は、未処理対照外植体（Ｂ）および非
奇形発生アルカロイドトマチジン（５０μＭ、Ｃ）で培養した外植体においてロ
ールプレート細胞（ＨＮＦ３β、ローダミン）および運動ニューロン（Ｉｓｌ−
１、ＦＩＴＣ）のマーカーを発現する。奇形発生化合物ＡＹ９９４４（０．５μ
Ｍ、Ｄ）、トリパラノール（０．２５μＭ、Ｅ）、ジェルビン（０．５μＭ、Ｆ
）およびシクロパミン（０．２５μＭ、Ｇ）の媒介物用量は、低レベルのＳｈｈ
経路活性化（１．０μＭ、Ｉ）を要するＩｓｌ−Ｉの誘導を可能としつつ、高レ
ベルのＳｈｈ経路活性化を要するＨＮＦ３βの誘導をブロックする（テキスト参
照）。高用量の奇形発生化合物ＡＹ９９４４（４．０μＭ、Ｈ）、トリパラノー
ル（１．０μＭ、Ｉ）、ジェルビン（４．０μＭ、Ｊ）およびシクロパミン（１
．０μＭ、Ｋ）はＨＮＦ３βおよびＩｓｌ−Ｉ誘導を十分に阻害する。

【００１８】 図４． 奇形発生化合物はイン・ビボでＳｈｈ自己プロセッシングを阻害しな
い（４７）。エクジソン−誘導性対照（レーン１、２、３）下でＳｈｈ蛋白質を
発現する安定にトランスフェクトされたＨＫ２９３細胞をジェルビン（レーン４
、５）、シクロパミン（レーン６，７）、トマチジン（レーン１０、１）、ＡＹ
９９４４（レーン１２、１３）で処理し、細胞溶解物免疫ブロットして自己プ
ロセッシングの有効性を評価した。未処理対照で見られるように（レーン３）、
処理細胞におけるＳｈｈは効果的にプロセッシングされ、前駆体の検出可能蓄積
はほとんどまたは全くなかった（Ｍ、４５ｋＤ）。プロセッシングされたアミノ
−末端生成物（Ｓｈｈ−Ｎ_ｐ）は細胞会合し、Ｇｌｙ_１９８後に切形したオープ
ンリーディングフレームを担う構築体でトランスフェクトされた培養細胞の培地
からＳｈｈ−Ｎ蛋白質よりも早く移動する（レーン８；共にレーン９および１７
に負荷されたＳｈｈ−Ｎ_ｐおよびＳｈｈ−Ｎ）。より速い移動および培養培地に
おける検出可能な蛋白質の欠如（示さず）は、処理された細胞からのＳｈｈ−Ｎ _ｐ がステロールアダクトを担うようであることを示す。トマチジン処理から得ら
れたより遅く移動する種は〜１．９ｋＤ大きく、シグナル配列切断の従たる阻害
を示唆する（星印；レーン１０、１１参照）。各レーンの免疫ブロットしたアク
チンは負荷対照として示される。

【００１９】 図５． 植物ステロイドアルカロイドはイン・ビトロにおいてＨｈ自己プロセ
ッシングを阻害またはそれに参画しない（５）。（Ａ）〜２５ｋＤ Ｈｈ−Ｃ産
物（レーン２−２７）および〜５ｋＤ ＮＨ_２−末端産物（このゲルでは解像さ
れず）を生じさせるためにステロールを添加せず（レーン１）または１２μＭコ
レステロールを添加して３０℃で３時間インキュベートしたバテリカリに発現さ
れたＨｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ蛋白質（〜２９ｋＤ）のイン・ビトロ自己プロセッシング
反応を示すクーマシーブル−染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。ジェルビン
（レーン３−６）、シクロパミン（レーン８−１１）およびトマチジン（レーン
１３−１６）は、２７倍過剰にコレステロールに添加した場合でさえ（レーン６
、１１および１６）、自己プロセッシングに干渉しない。（Ｂ）ステロールの不
存在下で行う場合（レーン１）、またはこれらのステロイドアルカロイドの３２
４μＭ濃度においてさえ（レーン５、９および１３）、ジェルビン（レーン２−
５）、シクロパミン（レーン６−９）およびトマチジン（レーン１０−１３）の
存在下で、Ｈｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ自己切断反応が進行しないことを示すクーマシーブ
ルー−染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。（Ｃ）５０ｍＭジチオスレイ
トール（レーン２）、１２μＭコレステロール（レーン３）、１２μＭ ７デヒ
ドロコレステロール（レーン４）、１２μＭデスモステロール（レーン５）、１
２μＭムリステロン（レーン９、１０）にて、ステロールの不存在下で（レーン
１）行ったＨｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ自己切断反応のクーマシーブルー−染色ＳＤＳ０ポ
リアクリルアミドゲル。２７−炭素コレステロール前駆体（レーン４−６）は、
５０ｍＭジチオスレイトール（レーン２）、１２μＭコレステロール（レーン３
）、１２μＭ ７デヒドロコレステロール（レーン４）、１２μＭラソステロー
ル（レーン６）、１２および３５０μＭラノステロール（７、８）および１２お
よび３５０μＭムリステロン（レーン９、１０）にて、ステロールの不存在下で
（レーン１）で行ったＨｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ自己切断反応を刺激する。２７−炭素コ
レステロール前駆体（レーン４−６）はコレステロール（レーン３）と同程度効
果的にＨｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ自己プロセッシングを刺激する。アミノ−末端産物は５
０ｍＭジチオスレイトールの存在下で生じた場合〜７ｋＤ種（レーン２）として
移動し、ステロールアダクトと共に〜５ｋＤ種として移動する（レーン３−６）
。ラノステロール（レーン７および８）およびムリステロン（レーン９および１
０）はバックグラウンドを超えて自己プロセッシングを刺激しない（レーン１）
。

【００２０】 図６． 奇形形成化合物は外因性Ｓｈｈ−Ｎ蛋白質に対する神経外胚葉応答を
阻害する（４１）。（Ａ）脊索および他の組織のない中間神経板外胚葉を、Ｈｅ
ｎｓｅｎ節に対して丁度吻側のレベルの段階９−１０ニワトリ胚からの示された
ごとく（ダッシュ線）切開した（図３Ａ参照）。（Ｂ）コラーゲンゲルマトリッ
クス中で２０時間培養した外植された中間神経板組織は背面マーカーＰａｘ７（
ＦＩＴＣ）を発現し、フロールプレートマーカーＨＮＦ３βを発現しない（ロー
ダミン）。（Ｃ）組換え精製Ｓｈｈ−Ｎの２ｎＭでの添加はＰａｘ７発現を抑制
する。運動ニューロン（Ｉｓｌ−１、ＦＩＴＣ）および底板細胞（ＨＮＦ３β、
ローダミン）運命は６．２５ｎＭ Ｓｈｈ−Ｎの存在下で４０時間の外植体培養
に際して誘導された。（Ｅ）２５ｎＭ Ｓｈｈ−Ｎにおいて、ＨＮＦ３β発現は
、失われるＩｓｌ−１発現を犠牲にして拡大される。２ｎＭ Ｓｈｈ−Ｎによる
Ｐａｘ７発現の抑制は（Ｆ）０．５μＭ ＡＹ ９９４４、（Ｇ）０．２５μＭ
トリパラノール、（Ｈ）０．１２５μＭジェルビンおよび（Ｉ）０．０６２５μ
Ｍシクロパミンによって阻害されるが、（Ｊ）５０μＭトマチジンによっては阻
害されない。ＨＮＦ３βの誘導はブロックされ、他方、２５ｎＭ Ｓｈｈ−Ｎに
おけるＩｓｌ−１の誘導は中間レベルのＡＹ ９９４９（１．０μＭ、Ｋ）、ト
リパラノール（０．２５μＭ、Ｌ）、ジェルビン（０．２５μＭ、Ｍ）およびシ
クロパミン（０．１２５μＭ、Ｎ）で維持されまたは拡大される。２５ｎＭのト
マチジンはＨＮＦ３β発現の減少および番号Ｉｓｌ−１発現細胞の増加でもって
わずかな阻害効果を呈する。ＨＮＦ３βおよびＩｓｌ−１誘導は、阻害剤ＡＹ９
９４４（２．０μＭ、Ｐ）、トリパラノール（０．５μＭ、Ｑ）、ジェルビン（
０．５μＭ、Ｒ）およびシクロパミン（０．２５μＭ、Ｓ）の２倍高い用量で完
全にブロックされる。５０μＭ（Ｔ）のトマチジンはＨＮＦ３β誘導を顕著に減
少させ、Ｉｓｌ−１誘導を増強する。各奇形形成化合物については、２ｎＭ Ｓ
ｈｈ−Ｎ（Ｆ−Ｉ）に対する完全な応答をブロックするのに要する濃度は２５ｎ
Ｍ Ｓｈｈ−Ｎ（Ｐ−Ｓ）に対する応答を完全にブロックするのに必要なものよ
りも低いことに注意されたし。また、２５ｎＭ Ｓｈｈ−Ｎに対する応答は、こ
の応答を完全にブロックするのに必要なものよりも２倍低いテラトゲンの濃度で
部分的にのみ阻害した（Ｋ−Ｎ）ことに注意されたし。さらなるコメントについ
てはテスキト参照。

【００２１】 図７． ジェルビンはＢＭＰ７に対する神経外胚葉を阻害しない（４１）。（
Ａ）腹側神経板外胚葉をＨｅｎｓｅｎ節に対して丁度吻側のレベルの段階９−１
０ニワトリ胚から示されたごとく（ダッシュ線）切開した（図３Ａ参照）。（Ｂ
）コラーゲンゲルマトリックス中で２４時間培養した腹側神経板外植体は、ＨＮ
Ｋ−１抗原につき免疫染色することによって可視化することができるいずれかの
移動性細胞を生起しない。（Ｃ）１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７の添加は、外植体
から移動する多数のＨＮＫ−１陽性細胞の形成を誘導する（白色ダッシュ線によ
って描かれた境界）。（Ｄ）１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７による移動性ＨＮＫ−
１陽性細胞の誘導は、１０μＭジェルビンの存在によって阻害されず、他の植物
−由来化合物の添加によって阻害されない（１０μＭシクロパミン、５０μＭト
マチジン、データは示さず）。

【００２２】 図８． 対照およびＳｈｈ−／−初代毛髪胚芽の形態学および遺伝子発現パタ
ーン。（Ａ、Ｂ）上皮プラコードおよび隣接間葉濃縮物（矢印）よりなる正常出
現毛髪膝は対照（Ａ）およびＳｈｈ−／−（Ｂ）摂取の１５．５日における胚双
方の皮膚で検出された（Ｈ＆Ｅ染色）。（Ｃ−Ｈ）Ｓｈｈ−／−マウス皮膚にお
ける毛髪膝中でのＳｈｈ標的遺伝子の変化した豊富さ。Ｇｌｉｌ（Ｃ、Ｄ）、Ｐ
ｔｃｌ（Ｅ、Ｆ）、およびＢＭＰ−４（Ｇ、Ｈ）転写体を、ジゴキシゲニン−標
識ｃＲＮＡプローブを用いてＥ １５．５マウス皮膚で調べた。突然変異体毛髪
胚芽の上皮および間葉成分双方におけるＧｌｉｌの実質的不存在は、Ｓｈｈ−／
−皮膚における間葉Ｐｔｃ１発現を減少させたことに注意されたい。

【００２３】 図９． Ｓｈｈ−／−マウス皮膚における、毛包形態発生の阻害、しかし生化
学的分化ではない。（Ａ、Ｂ）摂取の１７．５日における対照からの（Ａ）（し
かしＳｈｈ−／−（Ｂ）胚ではない）皮膚における進行した毛包（Ｈ＆Ｅ染色）
。最大毛包の上皮球によって囲まれた皮膚乳頭（矢印）、およびより未成熟の嵌
入先端に隣接する組織化間葉凝集体（矢印頭部）（Ａ）。顕著に対照的に、皮膚
乳頭はＳｈｈ突然変異体皮膚では検出されない（Ｂ）。（Ｃ−Ｆ）対照およびＳ
ｈｈ−欠陥嚢におけるケラチン発現の同様のパターンを明らかとする免疫組織化
学。対照（Ｃ）およびＳｈｈ−／−（Ｄ）毛包（矢印）双方におけるケラチノサ
イトの亜群におけるケラチンＫ１４免疫染色の不存在。対照（Ｅ）およびＳｈｈ
突然変異体（Ｆ）皮膚における毛包ケラチノサイトでの非表皮ケラチンＫ１７の
誘導。

【００２４】 図１０． ヌードマウスに移植したＳｈｈ突然変異体皮膚における損傷した毛
包発育。（Ａ）移植後６週間のヌードマウス移植部位の大きな出現。無毛である
が着色したＳｈｈ−／−皮膚グラフトと比較した対照グラフトにおけるかなりの
毛髪成長に注意されたし。（Ｂ、Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色。対照グラフトにおける組織学
的に正常に出現する皮膚（Ｂ）は、関連する皮脂線および皮下脂肪組織と共に成
熟した毛包を含有する。表皮の基底におけるケラチノサイト凝集体（矢印）を含
有する厚化表皮によって特徴付けられるＳｈｈ−／−グラフトにおける異常皮膚
発育（Ｃ）。（Ｄ−Ｆ）免疫組織化学。隣接する表皮細胞とは異なり、Ｓｈｈ−
／−ケラチノサイト凝集体はＫ５（Ｄ、矢印）を発現しないが、核に局所化され
たＬｅｆ−１につき陽性である（Ｅ）。また、右側のケラチノサイト凝集体と会
合したＬｅｆ−１陽性間葉細胞の小クラスターの存在に注意されたし（Ｅ）。Ｓ
ｈｈ突然変異体皮膚における嚢分化の進行した段階を明らかとする、毛髪−特異
的ケラチン抗体ＡＥ１３（Ｆ）での流産毛髪シャフトの免疫染色。

【００２５】 図１１． シクロパミンは外植体において鼻毛嚢形態発生を損なう。（Ａ）培
養中の第１日および第８日における核孔膜で成長する鼻毛パッド外植体（暗視野
）。（Ｂ）毛髪−特異的マーカーＭＨＫＡIおよびＨａｃ−１をコードする転写
体の発現、および表皮分化マーカーフィラッゲンを調べるＦＣ−ＰＣＲ分析（ｐ
ｒｏｆｉｏ. 最初に単離された（０日）およびＩ〜Ｍシクロパミンの存在下ま
たは不存在下で外植体として成長させた後（７日）、胚鼻毛パッドからＲＮＡを
単離した。各レーンは個々の鼻毛パッドから単離したＲＮＡについての反応生成
物を含有する。Ｃ）鼻毛嚢の形態発生はシクロパミン、Ｓｈｈシグナリングの阻
害剤によってブロックされる。シクロパミンは実験の持続のために培地中に存在
させた。

【００２６】 図１２． ＳｈｈＮｐと共に５日間インキュベートしたＰｔｃ＋／−ＭＥＦ。

【００２７】 図１３． シクロパミンで３日間培養したＰｔｃ−／−ＭＥＦ_ｓ２３−１。

【００２８】 図１４． シクロパミンで１６時間培養したＰｔｃ−／−ＭＥＦ_ｓ２３−４。

【００２９】 図１５． トマチジンで１６時間培養したＰｔｃ−／−ＭＥＦ_ｓ２１−４。

【００３０】 （発明の詳細な説明） ヘッジホッグ蛋白質は、動物胚形成において種々の構造のパターニングに必須
の分泌されたシグナリング分子のファミリーよりなり、細胞増殖を調節し、成体
における発散系における細胞同一性を特定するにおいて役割を演じる。

【００３１】 生合成の間に、ヘッジホッグは、全ての公知のヘッジホッグシグナリング活性
を担う脂質−修飾アミノ末端断片を生産するそのカルボキシル−末端ドメインに
よって媒介される、自己切断反応を受ける。ペプチド結合切断に加えて、ヘッジ
ホッグ自己プロセッシングはＮ−末端ヘッジホッグ断片のＣＯＯＨ−末端への脂
溶性アダクトの共有結合を引き起こす。この修飾はヘッジホッグシグナルの空間
的に制限された組織位置で非常に重要である；その不存在において、シグナリン
グドメインは発現のその部位を超えて不適当な影響を発揮する。最近、コレステ
ロールが自己プロセッシングの間にアミノ−末端シグナリングドメインに共有結
合した脂溶性部位であり、カルボキシル−末端ドメインは分子内コレステロール
トランスフェラーゼとして作用することが報告されている（Ｐｏｒｔｅｒら（１
９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：２５５）。ヘッジホッグシグナリング蛋白
質を修飾するためのコレステロールのこの使用は、乱れたコレステロール生合成
は動物発育を有し得るという何らかの効果と一致する。また、Ｖｏｌｈａｒｄら
（１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ２８７ ７９５；Ｍｏｈｌｅｒｅｔら（１９８８
） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０：１０６１；Ｌｅｅら（１９９２） Ｃｅｌｌ
７１：３３；Ｔａｂａｔａら（１９９２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ６：２６３５
；Ｔａｓｈｉｒｏら（１９９３） Ｇｅｎｅｌ ２４：１８３；Ｐ．Ｗ．Ｉｎｇ
ｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ ３６６：５６０（１９９３）；Ｍｏｈｌｅｒら Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ １１５：９５７（１９９２）；Ｍａら Ｃｅｌｌ ７５：９
２７（１９９３）；Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎら， 前掲，９１３頁；Ｅｃｈｅｌａｒ
ｄら， 前掲，１４１７頁；Ｒｉｄｄｌｅら，前掲，１４０１頁；Ｋｒａｕｓｓ
ら，前掲，１４３１頁；Ｒｏｅｌｉｎｋら，前掲７６，７６１（１９９４）；Ｃ
ｈａｎｇら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：３３３９（１９９４）；Ｂａｓ
ｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３６８：２０８（１９９４）；Ｔａｂａｔａら Ｃ
ｅｌｌ ７６：８９（１９９４）；Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋら，前掲，４４９頁；Ｆ
ａｎら， 前掲 ７９：１１７５（１９９４）；Ｊｏｈｎｓｏｎら，前掲，１１
６５頁；Ｈｙｎｅｓら， Ｎｅｕｒｏｎ １５：３５（１９９５）；Ｅｋｋｅｒ
ら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：２３３７（１９９５）；Ｍａｃｄｏｎａ
ｌｄら，前掲，３２６７頁；Ｅｋｋｅｒら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ ５：９４４（
１９９５）；Ｌａｉら， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１，２３４９（１９９
５）；Ｅｒｉｃｓｏｎら， Ｃｅｌｌ ８１：７４７（１９９５）， Ｃｈｉａ
ｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ ８３：４０７（１９９６）；Ｂｉｔｇｏｏｄら， Ｃｕ
ｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：２９８（１９９６）；Ｖｏｒｔｋａｍｐら， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２７３：６１３（１９９６）；Ｌｅｅら， 前掲 ２６６：１５２８
（１９９４）；Ｐｏｒｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６３（１９９５）
；Ｐｏｒｔｅｒら Ｃｅｌｌ ８６：２１（１９９６）参照。

【００３２】 Ｉ．総括 本発明は、ヘッジホッグ蛋白質によって誘導されたシグナル変換経路が、少な
くとも部分的には、ヘッジホッグ蛋白質のコレステロール修飾を破壊するおよび
／またはヘッジホッグ蛋白質の生物活性を阻害する化合物によって阻害すること
ができるという発見に関する。特に、出願人は、例えば、２５００ａｍｕ未満の
分子量を有する小分子が、ヘッジホッグシグナル変換経路によって誘導された生
物学的活性の少なくともいくらかを阻害できることを証明した最初のものである
と信じる。例えば、主題の阻害剤を用いて、ヘッジホッグ−依存性シグナル変換
、ならびにｐｔｃ^ｌｏｆ−およびｓｍｏ^ｇｏｆ−媒介シグナリングを阻害するこ
とができる。

【００３３】 本発明の１つの態様は、ヘッジホッグ蛋白質、特に該蛋白質のコレステロール
−修飾（ＣＭ）形態によって生じたパラクリンおよび／またはオートクラインシ
グナル、ならびにｐｔｃの機能喪失突然変異またはｓｍｏの機能獲得突然変異に
よって引き起こされた構成的シグナリングと干渉するためのステロイドアルカロ
イド、およびそのアナログの使用に関する。後記にて記載されるごとく、我々は
、Ｖｅｒａｔｒｕｍ−由来化合物ジェルビンのごときステロイドアルカロイドク
ラスの化合物のメンバーがかかるシグナルおよび細胞の同時生物学的応答を破壊
することを観察した。

【００３４】 いずれかの特定の理論に拘束させるつもりはないが、ヘッジホッグシグナリン
グを阻害するジェルビンおよび他のステロイドアルカロイドの能力は、パッチ化
または平滑化−媒介シグナル変換経路と相互作用する、あるいはｐｔｃおよび／
または平滑化−媒介シグナル変換経路を活性化する蛋白質の能力に干渉するかか
る分子の能力によるものであり得る。例えば、主題の阻害剤は、パッチ化された
ヘッジホッグ受容体のステロール感知ドメインと相互作用でき、あるいはヘッジ
ホッグ蛋白質、例えば、コレステロール−修飾蛋白質の能力に少なくとも干渉で
き、その受容体、または受容体に会合した他の分子、またはヘッジホッグ−媒介
シグナル変換に関与する蛋白質と相互作用することができる。

【００３５】 別法として、あるいはかかる作用メカニズムに加えて、ヘッジホッグシグナリ
ングに対するジェルビンの効果は、ヘッジホッグ蛋白質のコレステロール−媒介
自己プロセッシングおよび／または蛋白質の活性または安定性に影響するコレス
テロールホメオスタシスの乱れの結果であり得る。特に、添付の実施例に記載さ
れたごとく、ジェルビンおよび他のステロイドアルカロイドはコレステロール生
合成のいわゆる「クラス２」阻害剤である、すなわち、それらはステロールの内
向きフラックスを阻害する。ＬａｎｇｅおよびＳｔｅｃｋ（１９９４）Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２９３７１−４によって記載されているごとく
、これらの阻害剤は原形質膜コレステロールのエステル化を直ちに阻害し、３−
ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素リダクターゼ活性およびステロール生
合成を暫時に誘導する。相対的コレステロールレベルの変化は、例えば、ｐｔｃ
の活性および／または安定性に影響し得る。本発明によると、主題の方法は、ジ
ェルビンと同様にして、コレステロールホメオスタシスを乱す他の剤を利用して
行うことができる。

【００３６】 従って、ｐｔｃ活性のコレステロール依存性態様に同様に干渉する、構造にお
いて他の小分子、ステロイドおよび非ステロイドが同様にヘッジホッグ−媒介シ
グナルを破壊することができると特に考えられる。好ましい具体例において、主
題の阻害剤は、２５００ａｍｕ未満、より好ましくは１５００ａｍｕ未満、なお
さらに好ましくは７５０ａｍｕ未満の分子量を有する有機分子であり、ヘッジホ
ッグ蛋白質の生物学的活性の少なくともいくつかを阻害することができる。

【００３７】 かくして、本発明の方法は、例えば、広い範囲の細胞、組織および器官の修復
および／または機能的効率の調節において、シグナル経路の平滑化または下流成
分の活性化を阻害することによるごとくして、ヘッジホッグシグナル経路に拮抗
するステロイドアルカロイド、および他の小分子の使用を含み、神経組織の調節
、骨および軟骨形成および修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、原始腸に由来
する肺、肝臓および他の器官の調節、ホメオスタシス機能の調節、皮膚および毛
髪成長の調節の範囲の治療および化粧適用を有する。従って、本発明の方法およ
び組成物は、主題の阻害剤の使用を含み、全てのかかる使用につき、ヘッジホッ
グ蛋白質のアンタゴニストを含むことができる。さらに、主題の方法は、培養で
供される細胞（イン・ビトロ）、または全動物における細胞（イン・ビボ）で行
うことができる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ ９５／１８８５６およびＷＯ ９６
／１７９２４（その明細書を出典明示して本明細書の一部とみなす）に対して行
うことができる。

【００３８】 好ましい具体例において、主題の方法は、ヘッジホッグの機能獲得、ｐｔｃ機
能喪失または平滑化機能獲得の表現型を有する上皮細胞を治療するためのもので
あり得る。例えば、主題の方法は基底細胞癌または他の増殖性障害を治療または
予防するのに使用することができる。

【００３９】 １つの態様において、本発明は、本明細書に記載されるごとく、有効成分とし
て、ヘッジホッグシグナル経路の阻害剤を含む医薬製剤を提供する。

【００４０】 本発明の阻害剤を用いる主題の治療はヒトおよび動物対象双方に対して有効で
あり得る。本発明が適用できる動物対象はペットまたは商業目的で生育された、
家畜動物または愛玩動物双方に拡大される。その例はイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、
ヒツジ、ブタおよびヤギである。

【００４１】 II．定義 便宜のために、明細書、実施例および添付の請求の範囲で使用されるある用語
をここに集める。

【００４２】 用語「ヘッジホッグポリペプチド」は、ヘッジホッグ蛋白質およびそのペプチ
ジル断片の調製物を含み、特別の意味としてアゴニストおよびアンタゴニスト双
方は明瞭となる。

【００４３】 用語「ヘッジホッグ機能獲得」とは、野生型蛋白質よりも、ｐｔｃ−依存性活
性に関して、より活性である蛋白質の形態を生起するヘッジホッグコーディング
配列の突然変異をいう。ヘッジホッグ機能喪失は野生型蛋白質の異常発現を含み
、例えば、ここに該蛋白質は異常に高いレベルで発現され、あるいは増大した寿
命を有し、あるいは（翻訳後プロセスによって）正しくなく修飾され、あるいは
誤った時点で発現される（異所性発現）。

【００４４】 用語「ｐｔｃ機能喪失」とは、ｐｔｃ遺伝子の異常修飾または突然変異、また
は該遺伝子の発現のレベルの減少（または喪失）をいい、その結果、細胞とヘッ
ジホッグ蛋白質との接触、例えば、ヘッジホッグ経路の異常活性化に似た表現型
となる。機能喪失はＣｉ遺伝子、例えば、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２およびＧｌｉ３の
発現のレベルを調節するｐｔｃ遺伝子の能力の喪失を誘導し得る。

【００４５】 用語「平滑化機能獲得」とは、ｐｔｃ遺伝子の異常修飾または突然変異、また
は遺伝子の増大したレベルをいい、その結果、細胞とヘッジホッグ蛋白質との接
触、例えば、ヘッジホッグ経路の異常活性化に似た表現型となる。いずれかの特
定の理論に拘束されるつもりはないが、ｐｔｃは細胞に直接的にシグナル付与で
きず、むしろヘッジホッグシグナリングにおいてｐｔｃの下流に位置した平滑化
されたもう１つの膜結合蛋白質と相互作用する（Ｍａｒｉｇｏら（１９９６）
Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１７７−１７９）。遺伝子ｓｍｏはショウジョウバエに
おける各セグメントの正しいパターンニングに必要なセグメント−極性遺伝子で
ある（Ａｌｃｅｄｏら， （１９９６） Ｃｅｌｌ ８６：２２１−２３２）。
ｓｍｏのヒトホモログが同定されている。例えば、Ｓｔｏｎｅら（１９９６）
Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１２９−１３４およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８４４
０１参照。平滑化遺伝子はヘテロトリマーＧ蛋白質がカップリングされた受容体
；すなわち、７−膜貫通領域の特徴を持つ一体化膜蛋白質をコードする。この蛋
白質はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ （Ｆｚ）蛋白質、無翼経路の
メンバーに対する相同性を示す。ｓｍｏはＨｈシグナルの受容体をコードすると
元来考えられている。しかしながら、この示唆は、ｐｔｃにつきＨｈ受容体が得
られた証拠として引き続いて否認された。かくして、Ｓｍｏを発現する細胞はＨ
ｈに結合せず、ＳｍｏはＨｈと直接相互作用しないことを示す（Ｎｕｓｓｅ（１
９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１１９−１２０）。むしろ、その受容体ＰＴ
ＣＨに対するＳｏｎｉｃ ヘッジホッグ（ＳＨＨ）の結合は、平滑化された（Ｓ
ＭＯ）７−スパン膜貫通蛋白質のＰＴＣＨによって正常阻害を妨げると考えられ
る。

【００４６】 最近、平滑化突然変異の活性化が散在性基底細胞癌（Ｘｉｅら（１９９８）
Ｎａｔｕｒｅ ３９１：９０−２）および中枢神経系の原始神経外胚葉（Ｒｅｉ
ｆｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８：１７９８−
８０３）で起こることが報告されている。

【００４７】 フレーズ遺伝子の「異常修飾または突然変異」とは、例えば、遺伝子に対する
ヌクレオチドの欠失、置換または付加、ならびに遺伝子の大きな染色体再配置お
よび／または遺伝子の異常メチル化のごとき遺伝子病巣をいう。同様に、遺伝子
の誤発現とは、同様の条件下での正常細胞におけるレベルに対する遺伝子の転写
の異常レベル、ならびに遺伝子から転写されたｍＲＮＡの非野生型スプライシン
グをいう。

【００４８】 用語「ヘッジホッグアンタゴニスト」とは、ヘッジホッグシグナリング経路に
拮抗する化合物をいう。かくして、該用語はヘッジホッグ−媒介シグナル変換、
ならびにｐｔｃ^ｌｏｆまたはｓｍｏ^ｇｏｆ突然変異に由来するもののごときヘッ
ジホッグ−独立性シグナルの阻害剤を含む。本発明の意味において、かかるアン
タゴニストは、ステロール輸送の阻害を介するごときコレステロールホメオスタ
シスを破壊する能力（例えば、クラス２阻害剤）、ヘッジホッグ受容体部位に結
合し、ヘッジホッグの受容体への同時結合を阻害する、あるいは非競合的および
／またはアロステリック効果によって、結合するヘッジホッグに対する細胞の応
答を阻害する、あるいはｐｔｃ^ｌｏｆまたはｓｍｏ^ｇｏｆの効果を阻害する、例
えば、野生型表現型に似た表現型に逆行する能力のような特徴を有するジェルビ
ンの能力を模倣する化合物を含むことができる。かくして、該用語はｐｔｃアゴ
ニストおよび平滑化アンタゴニストを含む。

【００４９】 用語「ｐｔｃアゴニスト」とは、標的遺伝子の抑制転写に対するごときｐｔｃ
の生物活性を増強しまたは再降伏する剤をいう。好ましいｐｔｃアゴニストを用
いて、ｐｔｃ機能喪失および／または平滑化機能獲得を克服することができ、後
者は平滑化アンタゴニストという。

【００５０】 用語「競合的アンタゴニスト」とは、受容体部位に結合する化合物をいい；そ
の効果はアゴニストの増大した濃度によって克服することができるる 主題の治療方法に関する、例えば、ヘッジホッグアンタゴニストの「有効量」
とは、所望の投与法の一部として適用された場合に、例えば、細胞増殖の速度の
変化および／または細胞の分化の状態および／または治療されるべき障害につい
ての臨床的に許容される標準に従うまたは化粧目的の細胞の生存の率の変化を引
き起こす調製物におけるアンタゴニストの量をいう。

【００５１】 主題の方法によって治療されるべき「患者」または「対象」は、ヒトまたは非
ヒト動物を意味することができる。

【００５２】 細胞の「成長状態」とは、細胞の増殖速度および／または細胞の分化の状態を
いう。

【００５３】 用語「ステロイド」および「ステロイド−様」とはここでは相互交換的に使用
され、シクロペンタノフェナントレンの骨格または１以上の結合分裂または環拡
大または収縮によってそれから由来する骨格を保有する多環化合物の一般的クラ
スをいう。該環は１以上の位置で置換することができて、メチルまたは他の低級
アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシル基等によるごとき、原子価および安
定性の規則に従う誘導体を創製することができる。

【００５４】 用語「上皮」、「上皮の」および「上皮細胞」とは、腺およびそれから誘導さ
れる他の構造、例えば、角膜、食道、表皮、および毛嚢上皮細胞を含めた、内部
および外部身体表面（皮膚、粘膜および漿液）の細胞被覆をいう。他の例示的上
皮組織は、鼻孔の嗅覚領域をライニングする偽層化上皮細胞であり、臭いの感覚
のための受容体を含有する嗅覚上皮細胞；分泌細胞よりなる上皮細胞；平滑化板
−様細胞よりなる上皮細胞をいう偏平上皮細胞を含む。また、用語上皮細胞は、
収縮および膨張による大きな機械的変化に付される特徴的に見いだされるライニ
ング中空器官のような転移上皮細胞、例えば、層化偏平および柱状上皮細胞の間
の転移を表す組織をいう。

【００５５】 用語「上皮化」とは、剥がれた表面の上皮細胞の増殖による治癒をいう。

【００５６】 用語「皮膚」とは、真皮および表皮よりなる、体の外側保護被覆をいい、汗腺
および皮脂腺、ならびに毛嚢構造を含むと理解される。本出願を通じて、形容詞
「皮膚」を用いることができ、それが使用される意味で適した、皮膚の属性を一
般的にいうと理解される。

【００５７】 用語「表皮細胞」とは、胚性外胚葉に由来する皮膚の最も外側の非血管層をい
い、厚みは０．０７−１．４ｍｍで変化する。平面および平面表面において、そ
れは、外側内から、５つの層：垂直に配置された柱状細胞よりなる基底層；短い
突起またはとげ状突起を持つ平坦化された多角形よりなるとげ細胞またはとげ状
層；平坦化細胞よりなる顆粒層；核が区別されずまたは存在しない透明な薄い細
胞のいくつかの層よりなる透明層；および平坦化され角化された非有核細胞より
なるつの状層よりなる。一般的身体表面の表皮細胞において、透明な層は通常は
存在しない。

【００５８】 「真皮」とは、血管結合組織の密なベッドよりなり、神経および感覚の末端器
官を含有する表皮細胞までの深い皮膚の層をいう。毛髪根および皮脂線および汗
腺は真皮に深く包埋された表皮細胞の構造である。

【００５９】 用語「爪」とは、指または足の指の末端の背面表面のつの状皮膚板をいう。

【００６０】 用語「表皮腺」とは、表皮細胞に関連し、その通常の代謝必要性に関連しない
物質を分泌しまたは排出するように特殊化された細胞の集合をいう。例えば、「
皮脂線」は、油状物質および皮脂を分泌する真皮中の全分泌腺である。用語「汗
腺」とは、汗を分泌し、真皮または皮下組織に位置し、体表面の管によって開口
される腺をいう。

【００６１】 用語「毛髪」とは、糸状構造、特にケラチンよりなり、真皮中の乳頭から発生
し、哺乳動物によってのみ生産され、動物のその群に特徴的な特殊化された上皮
構造をいう。また、かかる毛髪の集合体。「毛嚢」とは、毛髪を包み、それから
毛髪が成長する上皮の管状−陥入の１つをいい；「毛嚢上皮細胞」とは、毛嚢中
の皮膚乳頭を囲む上皮細胞、例えば、幹細胞、外側根保護細胞、マトリックス細
胞、および内方根保護細胞をいう。かかる細胞は正常非悪性細胞、または形質転
換／不滅化細胞であり得る。

【００６２】 用語「鼻上皮組織」とは鼻および嗅覚上皮細胞をいう。

【００６３】 「切除創傷」とは、皮膚の上皮細胞における裂け、擦過傷、切り傷、刺し傷ま
たは破傷を含み、皮膚層まで拡大することができ、皮下脂肪およびそれを超えて
拡大することができる。切除創傷は外科的手法または皮膚の事故による貫通から
起こり得る。

【００６４】 「火傷創傷」とは、皮膚の大きな表面積が加熱および／または化学剤により個
体から除去されまたは喪失された場合をいう。

【００６５】 「皮膚潰瘍」とは、通常は炎症を伴う組織の表層の喪失によって生じる皮膚上
の病巣をいう。本発明の方法によって治療することができる皮膚潰瘍は、臥位潰
瘍、糖尿病潰瘍、毒液静止潰瘍および動脈潰瘍を含む。臥位潰瘍とは、長時間皮
膚の領域に適用された圧力に由来する慢性潰瘍をいう。この種類の潰瘍はしばし
ばとこずれといわれる。毒液静止潰瘍は欠陥静脈からの血液または他の流体の滞
留に由来する。動脈潰瘍とは、貧弱な血流を有する動脈の回りの領域における壊
死皮膚をいう。

【００６６】 「歯科組織」とは、上皮組織と同様の口中の組織、例えば、歯肉組織をいう。
本発明の方法は歯周疾患を治療するのに有用である。

【００６７】 「内部上皮組織」とは、皮膚における上皮層と同様の特徴を有する身体の内部
の組織をいう。その例は腸のライニングを含む。本発明の方法は、ある種の内部
創傷、例えば、外科手術に由来する創傷の治癒を促進するのに有用である。

【００６８】 「目の組織に対する創傷」とは、ひどい乾燥目症候群、角膜潰瘍および擦過お
よび目の外科的創傷をいう。

【００６９】 本出願を通じて、用語「増殖皮膚障害」とは、皮膚組織の望まないまたは異常
な増殖によって特徴付けられる皮膚のいずれの病気／障害もいう。これらの疾患
は、典型的には、上皮細胞増殖または不完全な細胞分化によって特徴付けられ、
例えば、Ｘ−結合魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、
表皮剥離過剰ケラトーシス、および脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮形成異常
は表皮の誤った発生の形態である。もう１つの例は「表皮剥離」であり、これは
自然発生のまたは外傷の部位におけるブレブおよび水泡の形成を伴う表皮の緩ん
だ状態をいう。

【００７０】 用語「癌」とは、周囲組織に侵潤し、転移を生起する傾向にある上皮細胞より
なる悪性の新しい増殖をいう。例示的癌は稀に転移しつつ、局所侵害および破壊
についての可能性を有する皮膚の上皮腫瘍である「基底細胞癌」；偏平上皮細胞
から生起し、立方体様細胞を有する癌をいう「偏平細胞癌」；癌性および肉腫性
組織よりなる悪性腫瘍を含む「癌性肉腫」；「腺癌」、小上皮細胞の巣または索
によって分離されたまたは囲まれた硝子質またはムチン質の円筒またはバンドに
よって特徴付けられ、乳腺および唾液腺、および呼吸器管の粘膜腺で起こる癌；
表皮細胞のものと同様に分化する傾向にある癌性細胞をいう「表皮性癌」；すな
わち、それらは、とげ細胞を形成し、角化を受ける傾向にある；鼻の後の空間の
上皮ライニングに生起する悪性腫瘍をいう「鼻咽頭癌」；および変化する配置の
管状細胞よりなる腎臓実質の癌に関する「腎臓細胞癌」を含む。もう１つの癌性
上皮細胞増殖は、上皮細胞に由来し、原因剤としてパピローマウイルスを有する
良性腫瘍をいう「乳頭腫」；および神経溝の閉鎖の時点に外胚葉要素を含めるこ
とによって形成された大脳または髄膜腫瘍をいう「類表皮腫」である。

【００７１】 「基底細胞癌」は、小節−潰瘍性、表層性、着色性、限局性強皮症様の、線維
上皮腫および母斑様症候群のごとき種々の臨床的および組織学的形態で存在する
。基底細胞癌はヒトで見いだされる最も普通の皮膚新形成である。非メラノーマ
皮膚癌の５００，０００の新しい場合の大部分。

【００７２】 本明細書で用いられる用語「乾癬」とは、皮膚の調節メカニズムを改変する過
剰増殖皮膚障害をいう。特に、表皮増殖、皮膚の炎症性応答、およびリンホカイ
ンおよび炎症性因子のごとき調節分子発現における一次および二次改変を含む病
巣が形成される。乾癬皮膚は、表皮細胞の増大した代謝回転、厚化表皮、異常ケ
ラチン化、皮膚層への炎症細胞の侵潤および基底細胞周期の増加をもたらす表皮
層への多形核白血球侵潤によって形態学的に特徴付けられる。加えて、過剰角化
性およびパラ角化性細胞が存在する。

【００７３】 用語「ケラトーシス」とは、表皮細胞のつの状層の過形成によって特徴付けら
れる増殖性皮膚障害をいう。例示的角化性障害は毛包性角化症、掌蹠角皮症、咽
頭角化症、毛髪角化症、および光線性角化症を含む。

【００７４】 本明細書で用いる「増殖性」および「増殖」とは有糸分裂を受ける細胞をいう
。

【００７５】 本明細書で用いる「形質転換細胞」とは、非拘束増殖の状態に自然発生的に変
換された細胞をいい、すなわち、それらは培養中の無限数の分裂を通じて増殖す
る能力を獲得している。形質転換細胞は、増殖制御のその喪失に関して、新形成
、形成外科および／または過形成のごとき項目によって特徴付けることができる
。

【００７６】 本明細書で用いる「不滅化細胞」とは、該細胞が培養中の無限数の分裂を通じ
て増殖する能力を有するように、化学的および／または組換え手段を介して改変
された細胞をいう。

【００７７】 用語「プロドラッグ」とは、生理学的条件下で、本発明の治療的に活性な剤に
変換される化合物を含むことを意図する。プロドラッグを作成するための通常の
方法は、生理学的条件下で加水分解されて所望のものを生じる部位を選択するこ
とである。他の具体例において、プロドラッグは宿主動物の酵素活性によって変
換される。

【００７８】 本明細書で用いる用語「ヘテロ原子」とは炭素または水素以外のいずれかの元
素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子はホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄お
よびセレンである。

【００７９】 ここに、「脂肪族基」とは、直鎖、分岐鎖、または環状脂肪族炭化水素基をい
い、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基のごとき飽和および不飽和脂
肪族基を含む。

【００８０】 用語「アルキル」とは、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル
（非環）基、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル
基を含めた飽和脂肪族基の基をいう。好ましい具体例において、直鎖または分岐
鎖アルキルはその骨格に３０以下の炭素原子（例えば、直鎖ではＣ１−Ｃ３０、
分岐鎖ではＣ３−Ｃ３０）、より好ましくは２０以下を有する。同様に、好まし
いシクロアルキルはその構造に３−１０個の炭素原子、より好ましくは環構造中
に５、６または７個の炭素を有する。

【００８１】 さらに、明細書、実施例および請求の範囲を通じて使用される用語「アルキル
」（または「低級アルキル」）は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」
を共に含める意図であり、その後者は炭化水素骨格の１以上の炭素上に水素を置
き換える置換基を有するアルキル部位をいう。かかる置換基は、例えば、ハロゲ
ン、ヒドロキシル、（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、または
アシルのごとき）カルボニル、（チオエステル、チオアセテート、またはチオホ
ルメートのごとき）チオカルボニル、アルコキシ、ホスホリル、ホスホネート、
ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド
、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイ
ル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロサイクル、アラルキル、または芳香族
もしくはヘテロ芳香族部位を含むことができる。炭化水素鎖上で置換された基は
それ自体置換され得ることは当業者によって理解されるべきである。例えば、置
換アルキルの置換基はアミノ、アジド、イミノ、アミド、（ホスホネートおよび
ホスフィネートを含めた）ホスホリル、（スルフェート、スルホンアミド、スル
ファモイルおよびスルホネートを含めた）スルホニル、シリル基、ならびにエー
テル、アルキルチオ、（ケトン、アルデヒド、カルボキシレートおよびエステル
を含めた）カルボニル、−ＣＦ３−、−ＣＮ等の置換または非置換形態を含むこ
とができる。例示的置換アルキルは後記する。シクロアルキルは、さらに、アル
キル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル−
置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮ等で置換することができる。

【００８２】 本明細書で使用される用語「アラルキル」とは、アリール基で置換されたアル
キル基（例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基）をいう。

【００８３】 用語「アルケニル」および「アルキニル」とは、前記アルキルに対して長さお
よび可能な置換が類似した不飽和脂肪族基をいうが、それは、各々、少なくとも
１つの二重結合または三重結合を含有する。

【００８４】 炭素の数を特定しない限り、本明細書で使用する「低級アルキル」とは前記し
たが、その骨格構造中に１ないし１０個の、より好ましくは１ないし６個の炭素
原子を有するアルキル基を意味する。同様に、「低級アルケニル」および「低級
アルキニル」は同様の鎖長さを有する。出願を通じ、好ましいアルキル基は低級
アルキルである。好ましい具体例において、ここにアルキルとして指名した置換
基は低級アルキルである。

【００８５】 本明細書で用いる用語「アリール」は、０ないし４個のヘテロ原子、例えば、
ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チア
ゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピ
リミジン等を含むことができる５−、６−および７−員の単一環芳香族を含む。
環構造中にヘテロ原子を有するアリール基は「アリール複素環」または「ヘテロ
芳香族」をいうことができる。芳香族環は前記したごとき置換基、例えば、ハロ
ゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキ
ル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、
アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、
エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、
エステル、複素環、芳香族またはヘテロ芳香族部位、−ＣＦ３、−ＣＮ等で１以
上の環位置で置換することができる。また、用語「アリール」は、２以上の炭素
が２つの隣接する環に共通し（該環は「縮合環」である）、ここに、環の少なく
とも１つが芳香族であり、例えば、他の環状環がシクロアルキル、シクロアルケ
ニル、シクロアルキニル、アリールおよび／または複素環であり得る、２以上の
環状環を有する多環系を含む。

【００８６】 略語Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ、Ｍｓは、各々、メチル、エチル、
フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ナノフルオロブタンスルホニル、ｐ
−トルエンスルホニルおよびメタンスルホニルを表す。当業者の有機化学によっ
て利用された略語のより包括的リストは、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉ
ｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの各巻の最初の論点に出現し、このリストは典型的には
Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｓｔ ｏｆ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓと題された表
に提示される。該リストに含まれた略語、および当業者の有機化学によって利用
される全ての略語は引用して一体化させる。

【００８７】 用語「複素環」または「複素環基」とは、その環構造が１ないし４個のヘテロ
原子を含む３−ないし１０−員の環構造、より好ましくは３−ないし７−員の環
をいう。複素環はまた多環でありうる。複素環基は、例えば、チオフェン、チア
ントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノ
キサチイン、ピロール、インダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキ
サゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソ
インドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、
キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン
、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピ
リミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルザリン、フェノトリアジン
、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキサラン、チオラン、オキサゾー
ル、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンおよびピロ
リジノンのごときラクタム、スルタン等を含む。複素環は前記したごとき置換基
、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロ
アルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、
ホスホラン、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、
アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香族も
しくはヘテロ芳香族部位、−ＣＦ３、−ＣＮ等で１以上の位置で置換することが
できる。

【００８８】 用語「多環」または「多環基」とは、２以上の炭素は２つの隣接する環に共通
の、例えば、該環は「縮合した環」である２以上の環（例えば、シクロアルキル
、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／または複素環）をい
う。非隣接原子を通じて接合した環は「架橋」環という。多環の環の各々は前記
したごとき置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、ア
ルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、
イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、
シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル
、複素環、芳香族もしくはヘテロ芳香族部位、−ＣＦ３、−ＣＮ等のごとき置換
基で置換することができる。

【００８９】 本明細書で用いる用語「炭素環」とは、環の各原子が炭素である芳香族または
非芳香族環をいう。

【００９０】 本明細書で用いる用語「ニトロ」とは、−ＮＯ２を意味し、用語「ハロゲン」
とは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉをいい；用語「スルフヒドリル」は−ＳＨ
を意味する；用語「ヒドロキシル」は−ＯＨを意味する；および用語「スルホニ
ル」は−ＳＯ２−を意味する。

【００９１】 用語「アミン」および「アミノ」とは当該分野で認められており、非置換およ
び置換アミン、例えば、一般式：

【化９】 ［式中、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ’１０は、独立して、水素、アルキル、アルケニ
ル、−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８、あるいはＲ９およびＲ１０はそれらが結合している
Ｎ原子と一緒になって環構造中に４ないし８個の原子を有する複素環を完成し；
Ｒ８はシクロアルキル、シクロアルケニル、複素環または多環を表し；ｍは０ま
たは１ないし８の整数である］ によって表すことができる部位を共にいう。好ましい具体例において、Ｒ９およ
びＲ１０の１つはカルボニルであり、例えば、Ｒ９、Ｒ１０および窒素は一緒に
なってイミドを形成しない。より好ましい具体例において、Ｒ９およびＲ１０（
および所望によりＲ’１０）は、各々、独立して、水素、アルキル、アルケニル
、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表す。かくして、本明細書で用いる用語「アル
キルアミン」とは、それに結合した置換または非置換アルキルを有する前記定義
のアミン基を意味し、すなわち、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも１つはアルキル
基である。

【００９２】 用語「アシルアミノ」とは当該分野で認識されており、一般式：

【化１０】 ［式中、Ｒ９は前記定義に同じであり、Ｒ’１１は水素、アルキル、アルケニル
または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し、ここに、Ｒ８は前記定義に同じである］ によって表すことができる部位をいう。

【００９３】 用語「アミド」とはアミノ−置換カルボニルとして認識されており、一般式：

【化１１】 ［式中、Ｒ９、Ｒ１０は前記定義に同じである］ によって表すことができる部位を含む。

【００９４】 アミドの好ましい具体例は不安定であり得るイミドは含まない。

【００９５】 用語「アルキルチオ」とは、それに結合した硫黄基を有する前記定義のアルキ
ル基をいう。好ましい具体例において、「アルキルチオ」部位は−Ｓ−アルキル
、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、および−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８のう
ちの１つによって表され、ｍおよびＲ８は前記定義に同じである。代表的なアル
キルチオ基はメチルチオ、エチルチオ等を含む。

【００９６】 用語「カルボニル」とは当該分野で認められており、一般式：

【化１２】 ［式中、Ｘは結合であるか、あるいは酸素または硫黄を表し、Ｒ１１は水素、ア
ルキル、アルケニル、−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８またはその医薬上許容される塩を表
し、Ｒ’１１は水素、アルキル、アルケニルまたは−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し
、ここに、ｍおよびＲ８は前記定義に同じである］ によって表すことができる部位を含む。Ｘが酸素であって、Ｒ１１またはＲ’１
１が水素ではない場合、該式は「エステル」を表す。Ｘが酸素であって、Ｒ１１
が前記定義に同じである場合、該部位はここではカルボキシル基として表され、
特にＲ１１が水素である場合、該式は「カルボン酸」を表す。Ｘが酸素であって
Ｒ’１１が水素である場合、該式は「ホルマート」を表す。一般に、前記式の酸
素原子が硫黄によって置き換えられる場合、該式は「チオールカルボニル」基を
表す。Ｘが硫黄であって、Ｒ１１またはＲ’１１が水素でない場合、該式は「チ
オエステル」を表す。Ｘが硫黄であってＲ１１が水素である場合、該式は「チオ
カルボン酸」を表す。Ｘが硫黄であってＲ１１’が水素である場合、該式は「チ
オホルメート」を表す。他方、Ｘが結合であってＲ１１が水素ではない場合、前
記式は「ケトン」基を表す。Ｘが結合であって、Ｒ１１が水素である場合、前記
式は「アルデヒド」基を表す。

【００９７】 本明細書で用いる用語「アルコキシル」または「アルコキシ」とは、それに結
合した酸素基を有する、前記定義の、アルキル基をいう。代表的なアルコキシル
基はメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等を含む。「エ
ーテル」は酸素によって共有結合した２つの炭化水素である。従って、そのアル
キルをエーテルとするアルキルの置換基は、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル
、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８のうちの１つによって表すこと
ができ、ｍおよびＲ８は前記記載の通りである。

【００９８】 用語「スルホネート」は当該分野で認められており、一般式：

【化１３】 ［式中、Ｒ４１は電子対、水素、アルキル、シクロアルキル、またはアリールで
ある］ によって表すことができる部位を含む。

【００９９】 用語トリフリル、トシル、メシル、およびノナフリルは当該分野で認められて
おり、各々、トリフルオロメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、メタン
スルホニル、およびノナフルオロブタンスルホニル基をいう。用語トリフレート
、トシレート、メシレートおよびノナフレートは当該分野で認められており、各
々、トリフルオロメタンスルホネートエステル、ｐ−トルエンスルホネートエス
テル、メタンスルホネートエステル、およびノナフルオロブタンスルホネートエ
ステル官能基および該基を含有する分子をいう。

【０１００】 用語「スルフェート」は当該分野で認められており、一般式：

【化１４】 ［式中、Ｒ４１は前記定義に同じである］ によって表すことができる部位を含む。

【０１０１】 用語「スルホンアミド」は当該分野で認められており、一般式：

【化１５】 ［式中、Ｒ９およびＲ’１１は前記定義に同じである］ によって表すことができる部位を含む。

【０１０２】 用語「スルファモイル」は当該分野で認められており、一般式：

【化１６】 ［式中、Ｒ９およびＲ１０は前記定義に同じである］ によって表すことができる部位を含む。

【０１０３】 本明細書で用いる用語「スルホキシド」または「スルフィニル」は当該分野で
認められており、一般式：

【化１７】 ［式中、Ｒ４４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、
複素環、アラルキル、またはアリールよりなる群から選択される］ によって表すことができる部位を含む。

【０１０４】 「ホスホリル」は、一般式：

【化１８】 ［式中、Ｑ１はＳまたはＯを表し、Ｒ４６は水素、低級アルキルまたはアリール
を表す］ によって表すことができる。例えば、アルキルを置換するのに使用する場合、ホ
スホリルアルキルのホスホリル基は一般式：

【化１９】 ［式中、Ｑ１はＳまたはＯを表し、各Ｒ４６は、独立して、水素、低級アルキル
またはアリールを表し、Ｑ２はＯ、ＳまたはＮを表す。Ｑ１がＳである場合、ホ
スホリル基は「ホスホロチオエート」である］によって表すことができる。

【０１０５】 「ホスホルアミダイト」は一般式：

【化２０】 ［式中、Ｒ９およびＲ１０は前記定義に同じであり、Ｑ２はＯ、ＳまたはＮを表
す］ によって表すことができる。

【０１０６】 「ホスホルアミダイト」は一般式：

【化２１】 ［式中、Ｒ９およびＲ１０は前記定義に同じであり、Ｑ２はＯ、ＳまたはＮを表
し、Ｒ４８は低級アルキルまたはアリールを表し、Ｑ２はＯ、ＳまたはＮを表す
］ によって表すことができる。

【０１０７】 「セレノアルキル」とはそれに結合した置換されたセレノ基を有するアルキル
基をいう。アルキル上で置換することができる例示的「セレノエーテル」は、−
Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル、および−Ｓｅ−（
ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８のうちの１つから選択され、ｍおよびＲ８は前記定義に同じで
ある。

【０１０８】 類似の置換をアルケニルおよびアルキニル基になして、例えば、アミノアルケ
ニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケ
ニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル−置換
アルケニルまたはアルキニルを生じさせることができる。

【０１０９】 本明細書で用いるごとく、各表現、例えば、アルキル、ｍ、ｎ等の定義は、そ
れがいずれかの構造において一回を超えて起こる場合、同一構造の他の箇所にお
けるその定義とは独立することを意図する。

【０１１０】 本発明のある種の化合物は特定の幾何学的または立体異性体形態で存在するこ
とができる。本発明で、本発明の範囲内に入るシス−およびトランス−異性体、
Ｒ−およびＳ−エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−
異性体、そのラセミ混合物、およびその他の混合物を含めた全てのかかる化合物
が考えられる。さらなる不斉炭素原子がアルキル基のごとき置換基に存在するこ
とができる。全てのかかる異性体、ならびにその混合物は、本発明に含まれるこ
とを意図する。

【０１１１】 もし、例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望ならば、それは
、不斉合成によって、あるいはキラル補助体での誘導によって調製することがで
き、ここに、得られたジアステレオマー混合物は分離され、補助基を切断して純
粋な所望のエナンチオマーを供することができる。別法として、分子がアミノの
ごとき塩基性官能基、またはカルボキシルのごとき酸性官能基を含有する場合、
ジアステレオマー塩は適当な光学活性酸もしくは塩基とで形成され、続いて、当
該分野でよく知られた分別結晶化またはクロマトグラフィー手段、および純粋な
エナンチオマーの引き続いての回収によってかく形成されたジアステレオマーを
分解する。

【０１１２】 前記した化合物の考えられる同等物は、それに対応し、その同一一般的特性（
例えば、ヘッジホッグシグナリングを阻害する能力）を有する化合物を含み、こ
こに、置換基の１以上の単純な変形がなされ、これは、化合物の効率に悪影響し
ない。一般に、本発明の化合物は、容易に入手できる出発物質、試薬および通常
の合成手法を用い、例えば、後記するごとき一般的反応スキームで説明されてい
る方法によって、あるいはその修飾法によって調製することができる。これらの
反応において、自体公知であるが、ここに言及しない変異体を利用することも可
能である。

【０１１３】 「置換」または「で置換された」は、かかる置換が置換された原子の許容され
る原子価に従っていること、および置換の結果、例えば、転位、環化、脱離等の
ごとき変換を同時に受けない安定な化合物がもたらされる黙示的但し書きを含む
。

【０１１４】 本明細書で用いるごとく、用語「置換された」とは、有機化合物の全ての許容
される置換基を含むことが考えられる。広い態様において、許容される置換基は
有機化合物の非環状および環状の、分岐状および非分岐状の、炭素環および複素
環、芳香族および非芳香族置換基を含む。例示的置換基は、例えば、前記されて
いるものを含む。許容される置換基は適当な有機化合物につき１以上であり、同
一または異なり得る。本発明の目的では、窒素のごときヘテロ原子は、ヘテロ原
子の原子価を満足するここに記載された有機化合物の水素置換基および／または
いずれかの許容される置換基を有し得る。本発明は、有機化合物の許容される置
換基によっていずれかの様式で限定されることを意図しない。

【０１１５】 本発明の目的では、化学元素は元素の周期律表、ＣＡＳバージョン、Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ６７版，
１９８６−８７、内表紙と同一である。また、本発明の目的では、用語「炭化水
素」とは、少なくとも１つの水素および１つの炭素原子を有する全ての許容され
る化合物を含むと考えられる。広い態様において、許容される炭化水素は、置換
されたまたは非置換であり得る非環状および環状の、分岐状および非分岐状の、
炭素環および複素環の、芳香族および非芳香族化合物を含む。

【０１１６】 本明細書で用いるフレーズ「保護基」は、望まない化学的変換からの潜在的反
応性官能基を保護する一時的置換基を意味する。かかる保護基の例は、各々、カ
ルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、およびアルテヒドおよびケ
トンのアセタールおよびケタールを含む。保護基化学の分野はレビューされてい
る（Ｇｒｅｅｎｅ， Ｔ．Ｗ； Ｗｕｔｓ， Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉ
ｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｉｓ， 第２版；Ｗ
ｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。

【０１１７】 当業者の有機化学によって利用された略語の多くのリストはＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの各巻の最初の論点に出現し；この
リストはＳｔａｎｄａｒｄ Ｌｉｓｔ ｏｆ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓと題
された表に典型的には提示されている。該リストに含まれた略語、および当業者
の有機化学によって利用される全ての略語はここに引用して一体化させる。

【０１１８】 用語「ＥＤ５０」とは、その最大応答または効果の５０％を生じる薬物の用量
を意味する。あるいは、テスト主題または調製物の５０％において予備決定され
た応答を生じる用量。

【０１１９】 用語「ＬＤ５０」はテスト主題の５０％で致死的である薬物の用量を意味する
。

【０１２０】 用語「治療指標」とは、ＬＤ５０／ＥＤ５０として定義される薬物の治療指標
をいう。

【０１２１】 本明細書で用いるごとく、「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー」
とは、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、プロゲステロン、エステロ
ゲン、エステロゲン−関連の、ビタミンＤ３、チロイド、ｖ−ｅｒｂ−Ａ、レチ
ノイン酸およびＥ７５（ショウジョウバエ）受容体よりなる関連受容体のクラス
をいう。本明細書で用いるごとく、「ステロイドホルモン受容体」とは、ステロ
イドホルモン受容体スーパーファミリー内のメンバーをいう。高等生物において
、核ホルモン受容体スーパーファミリーは、その各々がステロイド、チロイドホ
ルモン（Ｔ３）またはレチノイン酸（ＲＡ）のごときリガンドに結合することに
よって活性化される亜鉛フィンガー転写因子をコードするほぼ１ダースの区別さ
れる遺伝子を含む。

【０１２２】 III．本発明の例示的化合物 さらに後記するごとく、主題の方法は種々の異なるステロイドアルカロイド、
ならびに、例えば、本明細書に記載されるかかる薬物スクリーニングアッセイに
よって容易に同定できる、非ステロイド小分子を用いて行うことができる。前記
にも拘わらず、好ましい具体例においては、本発明の方法および組成物は、ステ
ロイドアルカロイド環系を有する化合物を利用する。ステロイドアルカロイドは
かなり複雑な窒素含有核を有する。主題の方法で使用されるステロイドアルカロ
イドの２つの例示的クラスはソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）タイプおよびベラトラ
ム（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）タイプである。

【０１２３】 Ｖｅｒａｔｕｒｍ ｓｐｐ．の植物中で生じるベラトラミン、シクロパミン、
シクロポジン、ジェルビン、およびムルダミンを含めた５０を超える天然に生じ
るベラトラムアルカロイドがある。Ｚｉｇａｄｅｎｕｓ ｓｐｐ．のｄｅａｔｈ
ｃａｍａｓ（リシリソウ）もまたジガシンを含めたステロイドアルカロイドの
いくつかのベラトラム−タイプを生じる。一般に、ベラトラムアルカロイドの多
く（例えば、ジェルビン、シクロパミンおよびシクロポジン）はフランピペリジ
ンにスピロ結合した修飾されたステロイド骨格よりなる。典型的なベラトラム−
タイプのアルカロイドは：

【化２２】 によって表すことができる。

【０１２４】 ソラナムタイプの例はソラニジンである。ステロイドアルカロイドは、ジャガ
イモで見いだされる２つの重要なグリコアルカロイド、ソラニンおよびチャコニ
ンのための核（例えば、アグリコン）である。種々のナス、フユサンゴおよびト
マトを含めたナス科における他の植物もまたソラナム−タイプのグリコアルカロ
イドを含有する。グリコアルカロイドはアルカロイドのグリコシドである。典型
的なソラナム−タイプのアルカロイドは：

【化２３】 によって表すことができる。

【０１２５】 これらの構造、および構造のいくつかの操作によってある種の望まない副作用
が減少することができる可能性に基づいて、広い範囲のステロイドアルカロイド
が主題の方法で使用される可能なヘッジホッグアンタゴニストとして考えられる
。例えば、主題の方法で有用な化合物は、一般式（Ｉ）またはその不飽和形態お
よび／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体：

【化２４】 式中、原子価および安定性が許容するごとく、 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、各々が結合した環に対する１以上の置換基を
表し、各出現につき、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アル
キニル、アリール、ヒドロキシル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコキシ、シリルオキシ、ア
ミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート
、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、アンヒドリド、
シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、
セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８
を表し； Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ’_７は存在しないか、あるいは独立して、ハロゲン、アル
キル、アルケニル、アルキニル、アリル、ヒドロキシル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコキ
シ、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホス
ホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシア
ミド、アンヒドリド、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、
アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または
−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し、 Ｒ６およびＲ７、またはＲ７およびＲ’７は一緒になって、例えば、置換され
ているまたは置換されていない環または多環を形成し、 但し、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ’７のうちの少なくとも１つは存在し、第一級も
しくは第二級アミンを含み、 Ｒ_８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環を
表し、および ｍは包括的に０ないし８の範囲の整数である によって表されるステロイドアルカロイドを含む。

【０１２６】 好ましい具体例において、 Ｒ２およびＲ３は、各出現につき、−ＯＨ、アルキル、−Ｏ−アルキル、−Ｃ
（Ｏ）−アルキル、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_８であり； Ｒ４は、各出現につき、存在しないか、あるいは−ＯＨ、＝Ｏ、アルキル、−
Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８を表し； Ｒ６、Ｒ７、およびＲ’７は、各々、独立して、水素、アルキル、アルケニル
、アルキニル、アミン、イミン、アミド、カルボニル、カルボキシル、カルボキ
シアミド、エーテル、チオエーテル、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を
表し、または Ｒ７およびＲ’７は一緒になってペルヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン、ピ
ラノピペリジン、キノリン、インドール、ピラノピロール、ナフチリジン、チオ
フラノピペリジン、またはチオピラノピペリジンのごときフラノピペリジンを形
成し、 但し、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ’７のうち少なくとも１つは存在し、第一級アミ
ンまたは第二級アミンを含み、 Ｒ８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環で
あり、好ましくは、Ｒ８はピペリジン、ピリミジン、モルホリン、チオモルホリ
ン、ピリダジンを表す。

【０１２７】 ある好ましい具体例において、前記で概説した定義は、および主題の化合物は
一般式Ｉａまたはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ
−誘導体：

【化２５】 によって表される。

【０１２８】 好ましい具体例において、主題のヘッジホッグアンタゴニストは以下の一般式
（II）のうちの１つで表されるステロイドアルカロイド、またはその不飽和形態
および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体によって表すことができ
る。

【０１２９】

【化２６】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ’７は前記定義に同じ
であって、ＸはＯまたはＳを表すが、好ましくはＯを表す］ ある好ましい具体例において、前記で概説した定義が適用され、主題の化合物
は、一般式（IIａ）、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−
またはホモ−誘導体によって表される。

【０１３０】

【化２７】 ある具体例において、主題のヘッジホッグアンタゴニストは、一般式（III）
またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体：

【化２８】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ８は前記定義に同じであり； ＡおよびＢは単環または多環基を表し； Ｔは１−１０結合長さのアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、エステル
、アミド、エーテルまたはアミン結合を表し； Ｔ’は存在しないか、あるいは１−３結合長さのアルキル、アミノアルキル、
カルボキシル、エステル、アミド、エーテルまたはアミド結合を表し、ここにも
しＴおよびＴ’が一緒に存在すれば、ＴおよびＴ’は環ＡまたはＢと一緒になっ
て５−８環原子の共有結合閉環を形成し； Ｒ９は環ＡまたはＢに対する１以上の置換基を表し、これは、各出現につき、
独立して、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキ
シル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコキシ、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、ア
ミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、
カルボキシル、カルボキシアミド、アルデヒド、シリル、エーテル、チオエーテ
ル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アル
デヒド、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し；および ｎおよびｍは、独立して、０、１または２を表し； 但し、ＡおよびＲ_９、またはＴ、Ｔ’、ＢおよびＲ_９は一緒になって少なくと
も１個の第一級または第二級アミンを含む］ によって表される。

【０１３１】 ある好ましい具体例において、前記で概説した定義が適用され、主題の化合物
は一般式IIIａまたはその不飽和形態および／またはセコ−、ノル−またはホモ
−誘導体：

【化２９】 によって表される。

【０１３２】 例えば、主題の方法は、例えば、一般式（IV）またはその不飽和形態および／
またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体：

【化３０】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は前記定義に同じであり、 Ｒ２２は存在しないか、あるいはアルキル、アルコキシルまたは−ＯＨを表す
］ によって表すことができる、ベラトラム−タイプのステロイドアルカロイドのジ
ェルビン、シクロパミン、シクロポジン、ムキアミンまたはベラトラミンに基づ
いてヘッジホッグアンタゴニストを利用することができる。

【０１３３】 ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は、
一般式IVａまたはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ
−誘導体：

【化３１】 によって表される。

【０１３４】 なおより好ましい具体例において、主題のアンタゴニストは、一般式（Ｖ）ま
たはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体：

【化３２】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ９は前記定義に同じである］ によって表される。

【０１３５】 ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は、
一般式Ｖａまたはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ
−誘導体：

【化３３】 によって表される。

【０１３６】 もう１つのクラスのヘッジホッグアンタゴニストは、例えば、一般式（VI）ま
たはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体：

【化３４】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ９は前記定義に同じ］ で表されるベルティシンおよびジガシンに似たベラトラム−タイプのステロイド
アルカロイドに基づくことができる。

【０１３７】 ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は一
般式VIａまたはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−
誘導体：

【化３５】 によって表される。

【０１３８】 さらにもう１つのクラスの可能なヘッジホッグアンタゴニストは、一般式（VI
I）またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導
体：

【化３６】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ９は前記定義に同じ］ で表さすことができるソラナム−タイプのステロイドアルカロイド、例えば、ソ
ラニジンに基づくことができる。

【０１３９】 ある好ましい具体例において、前記概説の定義が適用され、主題の化合物は一
般式VIIａまたはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ
−誘導体：

【化３７】 によって表される。

【０１４０】 ある具体例において、主題のアンタゴニストはヘッジホッグ経路についてのそ
の選択性に基づいて選択することができる。この選択性は、（テストステロンま
たはエストロゲン媒介活性のごとき）ヘッジホッグ経路−対−他のステロイド−
媒介経路のためであり得、ならびに特定のヘッジホッグ経路のための選択性、例
えばヘッジホッグ（例えば、Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｄｈｈ）またはパッチド受容体（
例えば、ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２）に特異的なそのイソタイプであり得る。例え
ば、主題の方法は、それらの活性がｐｔｃ関連シグナリングと無関係である限り
、アルドステロン、アンドロスタン、アンドロステン、アンドロステンジオン、
アンドロステロン、コレカルシフェロール、コレスタン、コール酸、コルチコス
テロン、コルチゾール、コルチゾール酢酸、コルチゾン、コルチゾン酢酸、デオ
キシコルチコステロン、ジギトキシゲニン、エゴカルシフェロール、エルゴステ
ロール、エストラジオール−１７−α、エストラジオール−１７−β、エストリ
オール、エストラン、エストロン、ヒドロコルチゾン、ラノステロール、リソコ
ール酸、メストラノール、β−メタゾン、プロドニソン、プレグナン、プレゲノ
ロン、プロゲステロン、スピロノラクトン、テストステロン、トリアムシノロン
およびその誘導体のごときステロイドの生物活性と実質的に干渉しないステロイ
ドアルカロイドを使用することができる。

【０１４１】 １つの具体例において、本発明で使用される主題のステロイドアルカロイドは
、１μＭより大の、より好ましくは１μＭより大の核ホルモン受容体スーパーフ
ァミリーのメンバーについてのｋｄを有し、例えば、それはエストロゲン、テス
トステロン受容体等に結合しない。好ましくは、主題のヘッジホッグアンタゴニ
ストは（例えば、１ｎｇ−１ｇ／ｋｇの範囲の）生理学的濃度のエストロゲン活
性、例えば、１ｍＭを超えるＥＤ５０を有しない。

【０１４２】 このようにして、ステロイドアルカロイドのある種のメンバーと関連し得る不
都合な副作用を減少させることができる。例えば、本明細書に記載された薬物ス
クリーニングアッセイを用い、ステロイドアルカロイドに対する組合せおよび医
学化学の適用は、個人変化、短縮された寿命、心血管病および血管閉塞、器官毒
性、高血糖症および糖尿病、クッシュノイド特徴、「消耗性」症候群、ステロイ
ド緑内障、高血圧、消化性潰瘍、および感染に対する増大した罹患性を含めた望
まない陰性副作用を減少させるための手段を提供する。ある具体例では、例えば
、精子形成を選択的に阻害するための主題の方法の使用において、ジェルビンに
対して奇形発生活性を低下させるのが便宜であろう。

【０１４３】 好ましい具体例において、主題のアンタゴニストはスピロソラン、トマチジン
、ジェルビン等以外のステロイドアルカロイドである。

【０１４４】 ある好ましい具体例において、主題の阻害剤は１ｍＭ以下の、より好ましくは
１μＭ以下の、なおより好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ５０でもってヘッジホッグ
シグナル変換経路を阻害する。

【０１４５】 ある具体例において、主題の阻害剤は１ｍＭ以下の、より好ましくは１μＭ以
下の、なおより好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ５０でもってヘッジホッグシグナル
変換経路を阻害する。

【０１４６】 特別の具体例において、ステロイドアルカロイドは、それが次のものよりも１
つのヘッジホッグイソ形態につきより選択的である、例えば、もう１つのものよ
りも１つのヘッジホッグ経路（Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｄｈｈ）につき１０倍、より好
ましくは少なくとも１００または１０００倍選択的であるゆえに選択される。同
様に、ステロイドアルカロイドは、それが次のものよりも１つのパッチドイソ形
態につきより選択的である、例えば、もう１つのものよりも１つのパッチド経路
（ｐｔｃ−１、ｐｔｃ−２）につき１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍
または１０００倍より選択的であるゆえに選択することができる。

【０１４７】 IV．方法および組成物の例示的適用 本発明のもう１つの態様は、ヘッジホッグ蛋白質に応答する、あるいは主題の
方法に従ってヘッジホッグアンタゴニストと細胞とを接触させることによってヘ
ッジホッグシグナリング経路の異常活性化を含む表現型を有し、状況が許すこと
ができる細胞の分化状態、生存および／または増殖を変調する方法に関する。例
えば、脊椎動物における分化した組織の秩序立った空間的配置の形成におけるヘ
ッジホッグ蛋白質の見かけ上広い関与の本知見に照らして、主題の方法はイン・
ビトロおよびイン・ビボ双方で異なる脊椎動物組織のアレイを発生する。および
／または維持するプロセスの一部として使用することができる。所与の組織の増
殖または分化に関して誘導性であるかまたは抗−誘導性であるかを問わず、ヘッ
ジホッグアンタゴニストは、適当には、ベラトラム−タイプのアルカロイドおよ
びソラヌム−タイプのアルカロイドを含めた、前記調製物のいずれかであり得る
。

【０１４８】 例えば、本発明の方法は、細胞培養技術に適用することができる。イン・ビト
ロニューロン培養系は神経発生の研究、ならびに神経成長因子（ＮＧＦ）、線毛
栄養因子（ＣＮＴＦ）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のごとき神経栄
養因子の同定のための基本的かつ必須のツールであることが判明した。一旦ニュ
ーロン細胞が末端まで分化すれば、それは、典型的には、もう１つの末端まで分
化した細胞タイプまで変化しないであろう。しかしながら、ニューロン細胞はそ
れにも拘わらずその分化状態を容易に喪失できる。これは、それらが成体組織か
ら培養中で増殖した場合、およびそれらが再生の間に芽体を形成する場合に通常
に観察される。本発明の方法は、分化の種々の段階にニューロン細胞を維持する
ための適当に制限された環境を確保するための手段を提供し、例えば、他の栄養
因子の特異的活性をテストするように設計された細胞培養で使用することができ
る。主題の方法のかかる具体例において、培養された細胞は本発明のヘッジホッ
グアゴニストと接触させて、培養中のニューロン幹細胞の増殖速度を変化させお
よび／または分化の速度を変化させることができ、あるいは分化の喪失を防止す
ることによって末端まで分化したニューロン細胞の培養の一体性を維持すること
ができる。例示的具体例において、主題の方法を用いて、例えば、感覚ニューロ
ン、あるいは運動ニューロンを培養することができる。かかるニューロン培養は
便宜なアッセイ系として、ならびに治療的処置について移植可能な細胞の源とし
て使用することができる。例えば、ヘッジホッグポリペプチドは米国特許第５，
３１８，９０７号等に記載された嗅覚ニューロン培養を確立し維持するのに有用
である。

【０１４９】 本発明によると、非常に多数の非腫瘍形成神経原細胞はイン・ビトロで永続さ
せることができ、増殖および／または分化の速度は本発明のヘッジホッグアンタ
ゴニストとの接触によって変化させられる。一般に、動物から神経原細胞を単離
し、好ましくは成長因子の存在下でそれらの細胞をイン・ビトロまたはイン・ビ
ボで永続させ、該細胞をヘッジホッグアンタゴニストと接触させることによって
これらの細胞の特定の神経表現型、例えば、ニューロンおよび膠細胞への分化を
調製する工程を含む方法が提供される。

【０１５０】 原細胞は、分子が要求されるまで、先祖を抑制された状態に維持する緊張性阻
害性影響の下にあると考えられる。しかしながら、末端まで分化し、従って、非
分裂性であるニューロンとは異なり、これらの細胞が増殖するのを可能とする最
近の技術が提供された。それらは無制限に生産でき、神経変性病を持つ異種およ
び自己宿主への移植に高度に適している。

【０１５１】 「先祖」とは、制限なくして特定の条件下で分裂することができるオリゴ能お
よび多能性幹細胞を意味し、ニューロンおよび膠細胞へのごとき末端まで分化す
る娘細胞を生産することができる。これらの細胞は異種および自己宿主への移植
に使用することができる。異種とは、原細胞が元来由来した動物以外の宿主を意
味する。自己とは、細胞が元来由来する同一の宿主を意味する。

【０１５２】 細胞はいずれかの動物からの胚性、誕生後、若いまたは成体神経組織から得る
ことができる。動物とは、神経組織を含有する多細胞動物を意味する。より詳細
には、それは魚類、爬虫類、鳥類、両生類または哺乳動物等を意味する。最も好
ましいドナーは哺乳動物、特にマウスおよびヒトである。

【０１５３】 異種ドナー細胞の場合において、動物を安楽死させ、滅菌手法を用いて脳およ
び注目する特異的領域を摘出する。特に注目する脳領域は、宿主の脳の変性領域
に対する機能を回復するように働く原細胞が得ることができるいずれの領域も含
む。これらの領域は、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、脊髄および心室組織を含め
た中枢神経系（ＣＮＳ）の領域、頸動脈小体および副腎髄質を含めた末梢神経系
（ＰＮＳ）の領域を含む。より詳細には、これらの領域は基底核における領域、
好ましくは尾状核および被殻よりなる線条、または淡蒼球のごとき種々の細胞群
、視床下部核、アルツハイマー病患者において変性していることが見いだされた
基底核、またはパーキンソン病患者で変性していることが見いだされた黒質緻密
部を含む。

【０１５４】 ヒト異種神経原細胞は堕胎から得られた胎児組織、または誕生後、若年または
成体器官ドナーに由来することができる。自己神経組織はバイオプシーによって
、または特に癲癇外科手術の間に、より特別には一時的ロベクトミーおよび海馬
切開の間に神経組織が摘出される神経手術を受ける患者から得ることができる。

【０１５５】 細胞は組織の結合する細胞外マトリックスからの個々の細胞の解離によってド
ナー組織から得ることができる。解離は、トリプシン、コラゲナーゼ等のごとき
酵素での処理を含めたいずれかの公知の手法を用いて、または平滑器具でのごと
き解離の物理的方法を用いることによって得ることができる。胎児細胞の解離は
組織培養培地で行うことができ、他方、若年および成体細胞の解離用の好ましい
培地は人工大脳脊髄流体（ａＣＳＦ）である。正規ａＣＳＦは１２４ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、２６ｍ
Ｍ ＮａＨＣＯ_３、および１０ｍＭ Ｄ−グルコースを含有する。低Ｃａ^２＋
ａＣＳＦは３．２ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および０．１ｍＭの濃度のＣａＣｌ_２ を除いて同一成分を含有する。

【０１５６】 解離した細胞は、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび
トランスフェリンのごとき有用な蛋白質のような細胞代謝に必要な補足物を含有
する、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２等を含めた細胞増殖を支持するこ
とができるいずれかの公知の培養培地に入れることができる。培地は、酵母、細
菌およびペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等のごとき菌類での
汚染を防ぐための抗生物質を含有することができる。いくつかの場合において、
培地はウシ、ウマ、ニワトリ等に由来する血清を含有することができる。特に好
ましい細胞用培地はＤＭＥＭおよびＦ−１２の混合物である。

【０１５７】 培養条件は生理学的条件に近くあるべきである。培養培地のｐＨは生理学的ｐ
Ｈ、好ましくはｐＨ６−８、より好ましくはｐＨ７近く、なおさらに特別には約
ｐＨ７．４であるべきである。細胞は生理学的温度、好ましくは３０℃−４０℃
の間、より好ましくは３２℃−３８℃の間、最も好ましくは３５℃−３７℃の間
近くの温度で培養すべきである。

【０１５８】 細胞は懸濁液または固定化基質の上で増殖することができるが、先祖の増殖が
懸濁液中で好ましくは行って、「神経球」の形成によって非常に多数の細胞を生
じる（例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１
０７０−１７０９；およびＰＣＴ公開 ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９
１１９、ＷＯ９４／１０２９２、およびＷＯ９４／６７１８参照）。懸濁液細胞
の増殖（または分裂）の場合において、フラスコをよく震盪し、神経球をフラス
コの底部中央に沈降させる。次いで、球を５０ｍｌ遠心管に移し、低速で遠心す
る。培地を吸引し、細胞を少量の成長因子を含む培地に再懸濁させ、細胞を機械
的に解離させ、培地の別のアリコットに再懸濁させた。

【０１５９】 培養培地中の細胞懸濁液に、先祖の増殖を可能とするいずれかの成長因子を補
足し、好ましくは培養フラスコまたはローラーボトル中で前記したが細胞を維持
できるいずれかの容器に接種する。細胞は、典型的には、３７℃のインキュベー
ター中で３−４日間増殖し、増殖は、細胞の解離および成長因子を含有する新鮮
な培地中への再懸濁によってその後のいずれかの時点で再開することができる。

【０１６０】 培養基の不存在下で、細胞はフラスコの床から浮き上がり、懸濁液中で増殖を
続け、未分化細胞の中空球を形成する。イン・ビトロでのほぼ３−１０日後、ゆ
るやかな遠心および成長因子を含有する培地への再懸濁によって、増殖クラスタ
ー（神経球）を２−７日毎に、より特別には２−４日毎に養分を供給される。

【０１６１】 イン・ビトロでの６−７日後、神経球中の個々の細胞を、平滑器具での神経球
の物理的解離によって、より特別には神経球をピペットでトリチュレートするこ
とによって分離することができる。解離された神経球からの単細胞を成長因子を
含有する培養培地に懸濁させ、細胞の分化を、ヘッジホッグアンタゴニストの不
存在下で細胞を平板培養（または再懸濁）させることによって培養中で制御する
ことができる。

【０１６２】 主題のヘッジホッグアンタゴニストの他の使用を説明するためには、大脳内グ
ラフティングが中枢神経系療法へのさらなるアプローチとして出現した。例えば
、損傷した脳組織を修復する１つのアプローチは、胎児または新生児動物からの
細胞の成体脳への移植を含む（Ｄｕｎｎｅｔｔら（１９８７） Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｂｉｏｌ． １２３：２６５−２８９；およびＦｒｅｎｄら（１９８５） Ｊ
． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５：６０３−６１６）。種々の脳領域からの胎児ニュ
ーロンは成体脳に首尾よく取り込むことができ、かかるグラフトは行動学的障害
を軽減することができる。例えば、基底神経節へのドーパミン発射の病巣によっ
て誘導された運動障害は、胚ドーパミン作動性ニューロンのグラフトによって予
防できる。新皮質の病巣後に損傷した複雑な認識機能もまた胚皮質細胞のグラフ
トによって部分的に修復することができる。主題の方法を用いて、培養中の増殖
状態を調節したり、あるいは胎児組織を用いる場合、特に新生児幹細胞を用いて
幹細胞の分化の速度を調節することができる。

【０１６３】 本発明で有用な幹細胞は一般的に知られている。例えば、いくつかの神経稜細
胞が同定されており、それらのいくつかは万能でおそらく神経稜細胞のかわりを
していると思われる、その他のものは感覚ニューロンのごとき細胞の１つのタイ
プのみを生じさせることができ、同様に明確な原細胞を表す。幹細胞のごとき培
養に対する本発明で使用されるヘッジホッグアンタゴニストの役割は、中立原細
胞の分化を調節し、あるいは末端まで分化したニューロン細胞となることに向け
られた明確な原細胞の発育運命のさらなる制限を調節することができる。例えば
、本発明の方法を用いてイン・ビトロで神経稜細胞の神経膠細胞、シュワン細胞
、クロム親和性細胞、コリン作動性交感神経または副交感神経ニューロン、なら
びにペプチド作動性およびセロトニン作動性ニューロンへの分化を調節すること
ができる。ヘッジホッグアンタゴニストは単独で用いることができるか、あるい
はニューロン原細胞の特別の分化運命をより特別に増強することができる他の神
経栄養因子と組み合わせて用いることができる。

【０１６４】 主題のヘッジホッグアンタゴニストの存在下で培養した細胞の移植に加えて、
本発明のさらにもう１つの態様は、中枢神経系および末梢神経系双方におけるニ
ューロンおよび他のニューロン細胞の成長状態を調節するためのヘッジホッグア
ンタゴニストの治療的適用に関する。神経系の発生の間の、およびおそらくは成
体状態におけるニューロン分化を調節するためのヘッジホッグ蛋白質の能力は、
ある場合には、主題のヘッジホッグアンタゴニストが正常細胞の維持、機能的実
行、および老化；化学的または機械的に傷つけられた細胞における修復および再
生プロセス；およびある種の病理学的状態における変性の治療に関して成体ニュ
ーロンの制御を容易とすることが予測できる。この理解に照らして、本発明では
、特に、（ｉ）感染性／炎症性および腫瘍−誘導損傷と共に外傷損傷、化学的損
傷、血管損傷および（発作に由来する虚血症のごとき）欠乏を含めた神経系に対
する急性、亜急性、または慢性負傷；（ｉｉ）アルツハイマー病を含めた神経系
の老化；（ｉｉｉ）パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮側索硬化症等
、ならびに旧小脳変性などの神経系の慢性神経変性疾患；および（ｉｖ）多発性
硬化症を含めた神経系の影響に由来する神経系の慢性免疫学的疾患（の重症度の
予防および／または低下）の治療プロトコルへの主題の方法の適用が考えられる
。主題のアンタゴニストは、ヘッジホッグアゴニストを含む療法と組み合わせて
使用して、患部ニューロン細胞の増殖および／または分化のタイミングおよび速
度を制御することができる。

【０１６５】 適当には、主題の方法は、中枢および末梢神経損傷の修復のための神経補綴を
得るのに使用することもできる。特に、破砕されたまたは切断された軸索が補綴
デバイスの使用によって挿管され、ヘッジホッグアゴニストおよびアンタゴニス
トを補綴デバイスに添加して樹状突起の成長および再生の速度を調節することが
できる。例示的神経ガイダンスチャンネルは米国特許第５，０９２，８７１号お
よび第４，９５５，８９２号に記載されている。

【０１６６】 もう１つの具体例において、主題の方法は、中枢神経系で起こり得るように、
新形成または過形成形質転換の治療で使用することができる。例えば、ヘッジホ
ッグアンタゴニストを利用してかかる形質転換細胞が分裂後またはアポトーシス
とすることができる。従って、本発明の方法は、例えば、悪性神経膠腫、髄芽腫
、神経外胚葉腫瘍、および上衣腫のための治療の一部として使用することができ
る。

【０１６７】 好ましい具体例において、主題の方法は髄芽腫および他の主要ＣＮＳ悪性神経
外胚葉腫瘍のための治療法の一部として使用することができる。

【０１６８】 ある具体例において、主題の方法は、髄芽腫のための治療プログラムの一部と
して使用される。主要脳腫瘍である髄芽腫は子供において最も普通の脳腫瘍であ
る。神経外胚葉腫は後頭窩で生起する原始的神経外胚葉腫瘍である。それらは全
ての小児科脳腫瘍のほぼ２５％を占める（Ｍｉｌｌｅｒ）。組織学的には、それ
らは真のロゼットに通常配置された小さな丸い細胞腫瘍であるが、神経膠星状細
胞、上衣細胞またはニューロンへのいくつかの分化を呈することができる（Ｒｏ
ｒｋｅ；Ｋｌｅｉｈｕｅｓ）。ＰＮＥＴは松果線（松果体芽腫）および大脳を含
めた脳の他の領域で生起することもある。テント上の領域で生起するものは、一
般に、そのＰＦカウンターパートよりも悪くなる。

【０１６９】 髄芽腫／ＰＮＥＴは切除後のＣＮＳにおいて再発することが知られており、骨
に転移することができる。予備処理評価は、従って、脊髄の調査を含み、「降下
した転移」の可能性を排除するべきである。ガドリニウム−増強ＭＲＩはこの目
的でミエログラフィーにかわって使われ、ＣＳＦサイトロジーはルーチン的手法
として手術後に行われる。

【０１７０】 他の具体例においては、主題の方法は上衣腫のための治療プログラムの一部と
して使用される。上衣腫は子供における小児科脳腫瘍のほぼ１０％を占める。全
体的に、それらは、心室の上衣腫ライニングから生起する腫瘍であり、顕微鏡的
にはロゼット、管および脈管周囲ロゼットを形成する。上衣腫で報告された５１
人の子供のＣＨＯＰシリーズにおいて、３／４が組織学的に良性である。第４心
室の領域からほぼ２／３が生起した。１／３はテント上領域で発現した。ＳＥＥ
ＲデータならびにＣＨＯＰからのデータによって示されるごとく、発現の年齢は
、０才および４才の間がピークとなる。メジアン年齢は約５才である。この病気
を持つかなり多くの子供は赤ん坊で、かつしばしば複数モード療法を要するから
である。

【０１７１】 本発明のさらにもう１つの態様は、ヘッジホッグ蛋白質は、他の皮膚内パター
ンニング、ならびに中胚葉および内胚葉分化プロセス双方において見掛けの役割
を有する、前記したごときニューロン分化に加えて、他の脊椎器官形成経路に関
与する形態発生シグナルであるという当該分野における観察に関する。かくして
、ヘッジホッグアンタゴニストを含む組成物は、非ニューロン組織の発生および
維持に関する細胞培養および治療方法双方で利用することができることが本発明
で考えられる。

【０１７２】 １つの具体例において、本発明は、Ｓｏｎｉｃ ヘッジホッグのごときヘッジ
ホッグ蛋白質が、原腸に由来する消化管、肝臓、肺および他の器官の形成の原因
である幹細胞の発生を制御することに見かけ上関与しているという発見を利用す
る。Ｓｈｈは皮膚内から中胚葉への誘導性シグナルとして働き、これは腸形態発
生に非常に重要である。従って、例えば、本方法のヘッジホッグアンタゴニスト
は、正常肝臓の複数代謝機能を有することができる人工肝臓の発生および維持を
調製するのに使用することができる。例示的具体例において、主題の方法を用い
て、消化管幹細胞の増殖および分化を調節して肝臓細胞培養を形成することがで
き、これは細胞外マトリックスを集団形成させるのに使用できるか、あるいは生
体適合性ポリマー中にカプセル化して、移植可能および体外人工肝臓双方を形成
することができる。

【０１７３】 もう１つの具体例において、ヘッジホッグアゴニストの治療組成物は、かかる
人工肝臓、ならびに胚肝臓構造の移植と組み合わせて利用して、腹腔内移植の摂
取、血管形成、およびグラフト化肝臓組織のイン・ビボ分化および維持を調節す
ることができる。

【０１７４】 さらにもう１つの具体例において、主題の方法は、物理的、化学的または病理
学的傷害後にかかる器官を調節するのに治療的に使用することができる。例えば
、ヘッジホッグアンタゴニストを含む治療組成物は部分的肝臓切開に引き続いて
肝臓修復で利用することができる。

【０１７５】 胚腸からの膵臓および小腸の発生は、腸の皮膚内および中胚葉の間の細胞内シ
グナリングに依存する。特に、腸中胚葉から平滑筋への分化は、隣接内胚葉細胞
からのシグナルに依存することが提案されている。胚後腸における内胚葉に由来
するシグナルの１つの候補メディエーターはＳｏｎｉｃ ヘッジホッグである。
例えば、Ａｐｅｌｑｖｉｓｔら（１９７７） Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ７：８０１
−４参照。Ｓｈｈ遺伝子は胚腸内胚葉を通じて発現され、例外は、膵臓芽内胚葉
であり、これはその代わりに高レベルのホメオドメイン蛋白質１ｐｆ１／Ｐｄｘ
１（インスリンプロモーター因子１／膵臓および十二指腸ホメオボックス１）、
初期膵臓発育の必須レギュレーターを発現する。Ａｐｅｌｑｖｉｓｔら、前掲、
は胚腸管中のＳｈｈの分化発現が、小腸および膵臓の特殊化された中胚葉誘導体
への周囲中胚葉の分化を制御するか否かを調べた。これをテストするために、彼
らはＩｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈ遺伝子のプロモーターを用いて、発生する膵臓
上皮細胞においてＳｈｈを選択的に発現させた。Ｉｐｆ１／Ｐｄｘ１−Ｓｈｈト
ランスジェニックマウスにおいて、膵臓中胚葉は膵臓間葉および脾臓へではなく
、腸に特徴的な、平滑筋およびＣａｊａｌの腸細胞に発育した。また、Ｓｈｈに
暴露された膵臓外植片は腸分化の同様のプログラムを受けた。これらの結果は、
内胚葉的に由来するＳｈｈの異なる発現が腸管の異なる領域において隣接する中
胚葉の運命を制御する証拠を提供する。

【０１７６】 本発明の意味において、従って、主題のヘッジホッグ阻害剤を用いて、イン・
ビボおよびイン・ビトロ双方において膵臓組織の増殖および／または分化を制御
し調節することができる。

【０１７７】 本発明の阻害剤が、例えば、異常インスリン発現、または分化の変調である一
般的戦略でもって、治療利点を提供することができる非常に種々の病理学的細胞
増殖および分化の条件がある。しかしながら、より一般的には、本発明は細胞を
主題の阻害剤に接触させることによって、分化状態を誘導しおよび／または維持
し、生存を増強しおよび／または膵臓細胞の増殖に影響する方法に関する。例え
ば、膵臓組織の秩序だった空間的配置の形成においてヘッジホッグ蛋白質の適当
な関与に徴して、主題の方法は、かかる組織をイン・ビトロおよびイン・ビボ双
方で創製しおよび／または維持する技術の一部として使用することができること
が本発明によって考えられる。例えば、ｐｔｃの機能の変調は、β−細胞の発生
および維持に関与する細胞培養および治療方法双方において、消化管、脾臓、肺
、および原腸から由来する他の器官からの組織の発育および維持を制御するにお
けるごとく、恐らくは非膵臓組織のために使用することができる。

【０１７８】 例示的具体例において、本方法は、膵臓組織に影響する過形成および新形成障
害、特に膵臓細胞の異常増殖によって特徴付けられるものの治療で使用すること
ができる。例えば、膵臓癌は、膵臓のインスリン分泌の改変の結果となり得る膵
臓細胞の異常増殖によって特徴付けられる。例えば、膵臓癌のごときある膵臓過
形成はβ−細胞または減少した膵臓細胞塊の機能不全による過小インスリン血症
の結果となり得る。異常ヘッジホッグシグナリングが病気進行で示され得る程度
に、主題の阻害剤を用いて、抗−腫瘍治療後に組織の再生を増強することができ
る。

【０１７９】 さらに、ＰＴＣシグナルの操作の異なる時点において、イン・ビボおよびイン
・ビトロ双方において膵臓組織を再形成／修復するための戦略の一部として有用
であり得る。１つの具体例において、本発明は膵臓組織の発育を調節するにおい
てヘッジホッグの見掛けの関与を利用する。一般的に、主題の方法は治療的に使
用して、物理的、化学的または病理学的損傷後に膵臓を調節するのに治療的に使
用することができる。さらにもう１つの具体例において、主題の方法は細胞培養
技術に適用することができ、特に、補綴膵臓組織デバイスの初期発生を増強する
のに使用することができる。例えば、ｐｔｃ活性を改変することによる、膵臓組
織の増殖および分化の操作は培養された組織の特徴をより注意深く制御する手段
を提供することができる。例示的具体例において、主題の方法は、例えば、Ａｅ
ｂｉｓｃｈｅｒらの米国特許第４，８９２，５３８号、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの
米国特許第５，１０６，６２７号、Ｌｉｍの米国特許第４，３９１，９０９号お
よびＳｅｆｔｏｎの米国特許第４，３５３，８８８号に記載されたカプセル化デ
バイスで使用できるごとく、β−島細胞を要する補綴デバイスの増加生産で使用
することができる。膵臓島に対する初期原細胞は多機能的であり、それらが最初
に出現する時点から島−特異的遺伝子の全ては見掛け上共活性である。発生が進
行するにつれて、インスリンのごとき島−特異的ホルモンの発現は成熟島細胞に
特徴的な発現のパターンに制限されるようになる。しかしながら、成熟島細胞の
表現型は、成熟β−細胞における胚特性の再出現が観察できるごとく、培養で安
定ではない。ｐｔｃシグナル変換を改変する剤を利用することによって、分化経
路に対する内因性ヘッジホッグ蛋白質の作用および細胞の増殖指標を調節するこ
とができる。

【０１８０】 さらに、膵臓組織の分化状態の操作は、移植、脈管形成、およびグラフト化組
織のイン・ビボ分化および維持を促進するために、人工膵臓の移植と組み合わせ
て利用することができる。例えば、組織分化に影響するｐｔｃ機能の操作はグラ
フト生存性を維持する手段として利用することができる。

【０１８１】 Ｂｅｌｌｕｓｃｉら（１９９７） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５：５３は
、Ｓｏｎｉｃ ヘッジホッグがイン・ビボで肺間葉細胞増殖を調節することを報
告している。つまりこの方法は、肺組織の再生を調節する Ｆｕｊｉｔａら（１９９７）（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ
Ｃｏｍｍｕｎ ２３８：６５８）は、Ｓｏｎｉｃ ヘッジホッグがヒト肺偏平細
胞癌および腺癌細胞で発現されることを報告した。Ｓｏｎｉｃ ヘッジホッグの
発現はヒト肺偏平細胞癌組織でも検出されたが、同一患者の正常肺組織では検出
されなかった。また、彼らはＳｏｎｉｃ ヘッジホッグがＢｒｄｕの癌細胞への
取り込みを刺激し、それらの細胞増殖を刺激し、他方、抗−Ｓｈｈ−Ｎはそれら
の細胞増殖を阻害したことを観察した。これらの結果は、Ｓｏｎｉｃ ヘッジホ
ッグシグナルがかかる形質転換肺組織の細胞増殖に関与し、従って、主題の方法
が肺癌および腺癌、および肺上皮細胞を含む他の増殖性疾患の治療の一部として
使用することができることを示す。

【０１８２】 本発明のさらにもう１つの具体例において、ヘッジホッグアンタゴニストを含
む組成物は、骨格形成性幹細胞からのごとき骨格組織のイン・ビトロ発生、なら
びに骨格組織欠陥のイン・ビボ治療で使用することができる。本発明では、特に
、軟骨形成および／または骨形成の速度を調節するためのヘッジホッグアンタゴ
ニストの使用が考えられる。「骨格組織欠陥」とは、どのように欠陥が由来しよ
うとも、例えば、外科的介入、腫瘍の除去、潰瘍、インプラント、骨折、または
他の外傷または変性疾患の結果としてを問わず、骨または結合組織を回復するの
が望ましいいずれかの部位における骨または他の骨格結合組織における欠陥を意
味する。

【０１８３】 例えば、本発明の方法は軟骨機能を結合組織に回復するための方法の一部とし
て用いることができる。かかる方法は、例えば、関節炎の結果となるもののごと
き変性疲労の結果である軟骨組織における欠陥または病巣の修復、裂かれた半月
組織の置換、半月切開、裂かれた靭帯、関節の悪性による、または遺伝病による
関節のゆるみのごとき、組織に対する外傷によって引き起こされ得る他の機械的
障害で有用である。また、本発明の回復方法は、プラスチックまたは再構成外科
手術、ならびに歯周外科手術におけるごとき軟骨マトリックスを再形成するのに
有用である。本発明は、例えば、半月、靭帯、または軟骨の外科的修復に続き、
従前の回復手法の改良にも適用することができる。さらに、それは、もし外傷後
十分に早く適用すれば、変性病の開始または昂進を妨げることができる。

【０１８４】 本発明の１つの具体例において、主題の方法は、治療上十分量のヘッジホッグ
アンタゴニスト、特に、インディアンヘッジホッグにつき選択的なアンタゴニス
トで罹患結合組織を処置して、組織に埋没した軟骨細胞の分化および／または増
殖の速度を管理することによって結合組織における軟骨修復応答を調節すること
を含む。関節軟骨、関節内軟骨（半月）、（真の肋骨および胸骨を結合する）肋
骨軟骨、靭帯、および腱のごとき結合組織は、主題の方法を用いる再構成および
／または再生療法における治療に特に適合する。本明細書で用いるごとく、再生
療法は、組織の損傷が明白に発現される地点まで進行した変性状態の治療、なら
びに変性がその最も早期段階または危急にある組織の予防的治療を含む。

【０１８５】 例示的具体例において、主題の方法は、臑、踝、肘、尻、手首、指または足指
の中手節関節、または下顎関節のごとき、二関節の軟骨の治療での治療的介入の
一部として用いることができる。該治療は関節の半月、関節の関節軟骨、または
双方に向けることができる。さらに説明すると、主題の方法を用いて、外傷負傷
（例えば、スポーツ負傷または過剰疲労）または骨関節炎の結果であり得るもの
のごとき、膝の変性障害を治療することができる。主題のアンタゴニストは、例
えば、関節鏡検査針での関節への注射として投与することができる。いくつかの
場合において、注射された剤は前記したヒドロゲルまたは他の徐放ビヒクルの形
態として、治療された組織と剤とのより延長されたおよび正規の接触を可能とす
ることができる。

【０１８６】 本発明では、さらに、軟骨移植および補綴デバイス療法の分野での主題の方法
の使用が考えられる。しかしながら、例えば、軟骨および線維軟骨の特徴は関節
、半月軟骨、靭帯、および腱のごとき異なる組織の間で、同一靭帯または腱の２
つの端部の間で、および組織の表層および深層部分の間で変化するゆえに問題が
生じる。これらの組織の帯状配置は機械的特性における漸次の変化を反映するこ
とができ、それらの条件下で分化しなかった移植組織が適切に応答する能力を欠
く場合に失敗が起こる。例えば、半月軟骨を用いて前方十字形靭帯を修復する場
合、組織は純粋な繊維状組織に対する化生を受ける。軟骨形成の速度を調節する
ことによって、主題の方法を用いて、新しい環境において移植細胞を適切に制御
し、組織のより早期の発生段階の肥大性軟骨細胞に効果的に似せることを助ける
ことによって、この問題に特別に立ち向かうことができる。

【０１８７】 同様に、主題の方法を、補綴軟骨デバイスの生成の増強およびその移植に適用
することができる。改良された治療の必要性は、コラーゲン−グリコサミノグリ
カン鋳型（Ｓｔｏｎｅら（１９９０） Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ
Ｒｅｄ ２５２：１２９）、単離された軟骨細胞（Ｇｒａｎｄｅら（１９８９
） Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ７：２０８；およびＴａｋｉｇａｗａら（１
９８７） Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ ２：４４９）、および天然または合成ポリマ
ーに付着した軟骨細胞（Ｗａｌｉｔａｎｉら（１９８９） Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊ
ｔ． Ｓｕｒｇ ７１Ｂ：７４；Ｖａｃａｎｔｉら（１９９１） Ｐｌａｓｔ
Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ ８８：７５３；ｖｏｎ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら（
１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ２５：３２９；
Ｆｒｅｅｄ（１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． ２
７：１１；およびＶａｃａｎｔｉらの米国特許第５，０４１，１３８号）に基づ
く新しい軟骨の創製を狙った研究を動機づけてきた。例えば、軟骨細胞はポリグ
リコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル、またはポリマー骨格の無害モノマーへ
の加水分解の関数として経時的に分解する他のポリマーのごときポリマーから形
成された生分解性、生体適合性の高度に多孔性スカフォールド上での培養で増殖
することができる。マトリツクスは、グラフト化が起こるまで、細胞に対する適
切な栄養素およびガス交換を可能とするように設計される。細胞は、適切な細胞
容量および密度が移植されるべき細胞のための開発されるまでイン・ビトロで培
養することができる。マトリツクスの１つの利点は、最終生成物が患者自身の（
例えば）耳または鼻と非常に似るか、あるいは関節におけるごとく、移植の時点
における操作を可能とする柔軟なマトリツクスを用いることができるように、そ
れは個々に基づいて所望の計上に注型または成形することができる。

【０１８８】 主題の方法の１つの具体例において、インプラントを培養プロセスのある段階
の間にヘッジホッグアンタゴニストと接触させて、培養中の軟骨細胞の分化の速
度および肥大性軟骨細胞の形成を管理する。

【０１８９】 もう１つの具体例において、移植されたデバイスはヘッジホッグアンタゴニス
トで処理して、移植されたマトリツクスを能動的に再形成させ、それをその意図
された機能により適したものとする。組織移植に関して前記したごとく、人工移
植は、マトリツクスが移植された現実の機械的環境に匹敵する状況において誘導
されない同一欠陥に悩む。主題の方法によってマトリツクス中の軟骨細胞を調節
する能力は、置き換えることが意図される組織と同様の特徴をインプラントが獲
得するのを可能とすることができる。

【０１９０】 さらにもう１つの具体例において、主題の方法を用いて、補綴デバイスの付着
を増強させる。説明すると、主題の方法を歯周補綴の移植で用いることができ、
ここに、周囲の結合組織の治療は補綴の回りの歯周靭帯の形成を刺激する。

【０１９１】 なおさらなる具体例において、主題の方法を、動物における部位の骨の発生（
骨形成）のための方法の一部として使用することができる。インディアンヘッジ
ホッグは、骨芽細胞によって最後には置き換えられる肥大性軟骨細胞と特に会合
する。例えば、本発明のヘッジホッグアンタゴニストの投与は、対象において骨
喪失の速度を調節する方法の一部として使用することができる。例えば、ヘッジ
ホッグアンタゴニストを含む製剤を使用して、例えば、骨化のための「モデル」
の形成で軟骨細胞の骨化を制御することができる。

【０１９２】 本発明のさらにもう１つの具体例において、ヘッジホッグアンタゴニストを用
いて精子形成を調節することができる。ヘッジホッグ蛋白質、特にＤｈｈは、睾
丸生殖細胞の分化および／または増殖および維持に関与することが示されている
。Ｄｈｈ発現は、Ｓｒｙの活性化後まもなくＳｅｒｔｏｌｉ細胞前駆体で開始し
、成体中の睾丸に執拗に存在する。成熟精子の完全な不存在のため、男性は生存
するが不妊である。異なる遺伝的バックグラウンドでの発生する睾丸の調査は、
Ｄｈｈが精子形成の初期および後期段階双方を調節することを示唆する。Ｂｉｔ
ｇｏｏｄら（１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６：２９８。主題の方法は
天然に生じるヘッジホッグ蛋白質の作用をブロックすることができる。好ましい
具体例において、ヘッジホッグアンタゴニストは精子形成に関して砂漠ヘッジホ
ッグの生物学的活性を阻害し、避妊薬として使用することができる。同様にして
、主題の方法のヘッジホッグアンタゴニストは正常卵巣機能を変調するのに有用
である。

【０１９３】 また、主題の方法は、障害を受ける上皮組織の治療または予防に対する、なら
びに化粧品用途における広い適用性を有する。一般に、該方法は、治療した上皮
組織の成長状態を改変するのに効果的な量のヘッジホッグアンタゴニストを動物
に投与する工程を含めることに特徴がある。投与様式および投与法は治療すべき
上皮組織に依存して変化するであろう。例えば、治療された組織が皮膚または粘
膜組織のごとき上皮組織である局所処方が好ましいであろう。

【０１９４】 「創傷治癒を促進する」方法により、類似の創傷が治療しないで治癒するより
も治療を行ったほうが早く創傷は治癒する。「創傷治癒の促進」はまた、本方法
が特にケラチノサイトの増殖および／または成長を制御するか、または創傷が、
瘢痕、創傷、およびコラーゲン沈着を減少させ、より広い表皮領域を治癒するこ
とを意味する。特定の例において、「創傷治癒の促進」はまた、本発明の方法と
共に用いた場合、創傷治癒の特定の方法が成功率（例えば、皮膚移植片の獲得率
）を改善することも意味する。

【０１９５】 再建外科技術の顕著な進歩にもかかわらず、瘢痕は正常な機能を回復し、治癒
された皮膚が出現する上で、非常に重要な障壁であり得る。手および顔のケロイ
ドまたは過形成性瘢痕などの病理学的瘢痕が機能的能力障害または身体の変形を
引き起こした場合、これは特に当てはまる。最も重篤な環境では、このような瘢
痕は心理社会的ストレスおよび経済的困窮を起こし得る。創傷治癒には、止血、
炎症、増殖、およびリモデリング段階が含まれる。増殖段階には、線維芽細胞な
らびに内皮細胞および上皮細胞の増殖が含まれる。本方法の使用によって、創傷
内および創傷に近位の上皮細胞の増殖速度が調節され、創傷の閉鎖および／また
は瘢痕細胞形成の最小化が促進される。

【０１９６】 本発明はまた、例えば、放射線および／または化学療法による経口および口腔
傍の潰瘍治療のための養生法の一部として有効であり得る。このような潰瘍は、
一般に、化学療法および放射線治療後数日以内に発症する。これらの潰瘍は、通
常、繊細な灰色の壊死膜に覆われ、炎症組織を取り囲んでいる小さな、有痛性の
不規則な形の病変から始まる。多くの例では、治療の欠如が、炎症の基となる病
変の周囲を取り囲む組織の増殖をもたらす。例えば、潰瘍に接する上皮は、通常
増殖活性を示し、上皮表面の連続性の欠如をもたらす。これらの損傷は、そのサ
イズおよび上皮の完全性の欠如のために、身体に潜在的な二次感染を起こす傾向
がある。食物および水の通常の経口接種で非常に痛みを伴い、潰瘍が消化管全体
に増殖している場合、通常、下痢やその他の合併症がおこる。本発明によれば、
ヘッジホッグアンタゴニストの適用を含むこのような潰瘍の治療により、患部上
皮の異常な増殖および分化を減少させ、その後の炎症の重篤度の減少の一助とな
り得る。

【０１９７】 本発明の方法および組成物を使用して、皮膚病（乾癬などの自己免疫疾患由来
の病変など）の原因となる創傷も治療することができる。アトピー性皮膚炎とは
、花粉、食物、鱗屑、昆虫毒および植物毒などのアレルゲンを原因とする免疫応
答に関与するアレルギー由来の皮膚の外傷をいう。

【０１９８】 他の実施形態では、ヘッジホッグアンタゴニストの抗増殖性調製物を使用して
、外嚢白内障摘出手術後の合併症を防止するために水晶体上皮細胞増殖を阻害す
ることもできる。白内障は難治性の眼病であり、白内障治療に関する種々の研究
が行われている。しかし、現在、白内障治療は、外科手術によって達成されてい
る。白内障の手術は長い間行われており、種々の手術法が試験されている。水晶
体外嚢摘出法が、白内障を取り除くために選択される方法となりつつある。水晶
体内嚢摘出術に対するこの技術の主な医学的利点は、無水晶体類嚢胞様黄斑浮腫
および網膜剥離の発症率が低いことである。水晶体外嚢摘出術はまた、現在ほと
んどの症例で選択される後眼房タイプの眼内レンズの移植にも必要とされる。

【０１９９】 しかし、水晶体外嚢摘出術の欠点は、後嚢混濁（しばしば続発性白内障と呼ば
れる）の発症率が高いことであり、これは手術後３年以内に５０％の症例で起こ
り得る。続発性白内障は、水晶体外嚢摘出術後に残存した水晶体の赤道部分およ
び前部の上皮細胞の増殖により引き起こされる。これらの細胞が増殖して、ゼン
メリング輪（Ｓｏｍｍｅｒｌｉｎｇ ｒｉｎｇ）を生じ、後嚢上に蓄積および出
現する線維芽細胞とともに後嚢の混濁化を起こし、視覚を妨害する。続発性白内
障の予防治療を行うことが好ましい。続発性白内障の形成を阻害するために、本
発明の方法は、残存した水晶体上皮細胞の増殖を阻害する手段を提供する。例え
ば、このような細胞は、水晶体の除去後の前眼房にヘッジホッグのアンタゴニス
ト調製物を含む溶液を注入することによって静止状態の維持を誘導することがで
きる。さらに、その溶液は、眼の前眼房に注入するとき最小有効量を得るために
浸透圧のバランスを取っていくらか特異的に嚢下上皮細胞増殖を阻害することが
できる。

【０２００】 本発明の方法は、角膜上皮細胞増殖によって特徴づけられる角膜疾患（例えば
、眼表面の上皮の下方成長または扁平上皮癌などの眼上皮疾患）の治療に使用す
ることができる。

【０２０１】 Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１７：
６２７７には、ヘッジホッグタンパク質が脊椎動物の網膜における有糸分裂誘発
および光受容体の分化を調節することができ、Ｉｈｈが網膜前駆細胞の増殖およ
び光受容体の分化を促進するための色素上皮由来の候補因子であることが示され
ている。同様に、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ、１９９７、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ、１２４：３６３は、ソニック・ヘッジホッグタンパク質のアミノ末端フラグ
メントを用いた周産期のマウスの網膜細胞培養物の処理により、全細胞数ならび
に杆状光受容体、アマクリン細胞、およびＭｕｌｌｅｒグリア細胞におけるブロ
モデオキシウリジンを組み込んだ細胞の割合が増加し、これは、ソニック・ヘッ
ジホッグが網膜前駆細胞の増殖を促進していることが示唆されるということを示
した。従って、本発明の方法は、網膜細胞の増殖疾患の治療に使用して、光受容
体の分化を調節することができる。

【０２０２】 本発明のさらに別の態様は、発毛を調節するための本発明の方法の使用に関す
る。毛髪は、基本的には、丈夫で不溶なタンパク質であるケラチンからなり、そ
の強さは主にシスチンのジスルフィド結合による。各々の毛髪は、円柱状の毛幹
および毛根からなり、フラスコのような皮膚の窪みである毛包を含む。毛包の下
には、毛乳頭と呼ばれる指様突起物を含み、この毛乳頭はそこから発毛し、細胞
に栄養分を供給する血管が通っている結合組織からなる。毛幹は、表皮から外側
へ伸長している部分であるのに対して、毛根は、毛髪の埋もれた部分であると説
明されている。毛根の基底には毛球が伸びており、毛乳頭の上に存在する。毛髪
が産生されている細胞は、毛乳頭の毛球で成長する。細胞は、毛乳頭で増殖する
につれて繊維状に伸長する。毛髪の「成長」とは、分裂細胞によって毛髪線維が
形成されて伸長することをいう。

【０２０３】 当該分野で周知のように、一般的な毛周期は、３つの段階：成長期、退行期、
および休止期に分類される。活発な段階（成長期）の間、毛乳頭細胞の上皮幹細
胞は迅速に分裂する。娘細胞が上方へ移動し、分化して毛髪自体の同心状の層を
形成する。移行期である退行期は、毛乳頭中の幹細胞の有糸分裂の休止によって
特徴付けられる。休止している段階は休止期として公知であるが、新毛がその下
に出現する前の数週間頭皮内に毛髪が保持されているが、その毛包から休止期の
毛幹が発毛する前段階である。このモデルから、毛髪細胞に分化する分化幹細胞
のプールが大きいほどより大量の発毛が起こることが明らかになっている。従っ
て、発毛を増加または減少させる方法は、これらの幹細胞の増殖をそれぞれ増強
するか阻害することによって達成することができる。

【０２０４】 特定の実施形態では、本方法は、カット、シェービング、脱毛による従来の毛
髪の除去とはまったく異なるヒトの毛髪の発毛を抑制する方法として使用するこ
とができる。例えば、本方法は、異常に急速で密度の高い発毛として特徴付けら
れる毛髪症（例えば、多毛症）の治療に使用することができる。実施形態の例と
して、ヘッジホッグアンタゴニストを使用して、異常な多毛で特徴づけられる男
性型多毛症を取扱うことができる。本方法はまた、脱毛の継続時間を延長する方
法を提供する。

【０２０５】 さらに、ヘッジホッグアンタゴニストは、しばしば上皮細胞に細胞傷害的とい
うよりもむしろ細胞増殖抑制性であるので、このような因子を使用して細胞周期
のＳ期への進行を必要とする細胞傷害性因子（例えば放射線で誘導された毛髪の
死）から毛包細胞を保護する効果をねらうことができる。本方法による治療は、
例えばＳ期に入る細胞を阻害して毛包細胞を静止させて保護することによって、
毛包細胞の有糸分裂の失敗およびプログラム細胞死を防止することができる。例
えば、ヘッジホッグアンタゴニストは、通常脱毛を起こす化学療法および放射線
療法を受けた患者に使用することができる。このような治療の間の細胞周期の進
行を阻害することによって、本発明の治療は細胞死プログラムの活性化の原因で
あるかもしれない死から毛包細胞を保護することができる。治療が完了した後、
本方法も終了され、毛包細胞増殖の阻害も軽減される。

【０２０６】 本方法はまた、脱毛性毛包炎、網状瘢痕性紅斑性毛包炎、またはケロイド毛包
炎などの毛包炎の治療に使用することができる。例えば、ヘッジホッグアンタゴ
ニストの化粧品調製物を、偽毛包炎（首の顎下領域に最も頻繁に起こる髭剃りに
よる慢性疾患で、埋没毛を含んだ紅斑性丘疹および膿疱病変を特徴とする）の治
療に局所的に適用することができる。

【０２０７】 本発明の別の態様では、本方法を使用して上皮由来の組織の分化を誘導するこ
とができる。これらの分子の形態は、上皮組織を含む過形成性および／または腫
瘍性疾患の治療のための分化治療の基礎を提供することができる。例えば、この
ような調製物は皮膚細胞の異常な増殖または成長を有する皮膚病の治療に使用す
ることができる。

【０２０８】 例えば、本発明の薬学的調製物は、角化症などの過形成上皮疾患の治療ならび
に種々の皮膚癌の急速な増殖によって特徴づけられる腫瘍性上皮疾患（例えば、
基底細胞癌または扁平細胞癌）への治療が意図される。本方法はまた、皮膚に発
症する自己免疫疾患（特に、例えば、乾癬またはアトピー性皮膚炎によって生じ
る、表皮の病的な増殖および／または角質化を含む皮膚科学的疾患）の治療に使
用することができる。

【０２０９】 乾癬、扁平細胞癌、ケラトアカントーマ、および光線性角化症などの一般的な
皮膚疾患の多くは、異常な局所的増殖および成長によって特徴づけられる。例え
ば、乾癬は皮膚上に増殖した鱗状で赤色のもりあがった斑であり、ケラチノサイ
トは正常な細胞より急速に増殖するが分化が不完全であることが公知である。

【０２１０】 １つの実施形態では、本発明の調製物は、炎症性成分および非炎症性成分のい
ずれかによって特徴づけられる皮膚細胞の異常増殖を引き起こす角化症に関連す
る皮膚科学的軽症の治療に適切である。例証として、静止および分化を促進する
ヘッジホッグアンタゴニストの治療調整物を使用して、乾癬の種々の形態（皮膚
状、粘膜状、および爪状）を治療することができる。上記のように、乾癬は、典
型的には、「再生」経路に従った顕著な増殖活性化および分化を示す上皮のケラ
チノサイトによって特徴づけられる。本方法の抗増殖的な実施形態による治療を
用いて、病理学的な上皮の活性化を後退させ、疾患を継続的に軽減させるための
基礎を提供することができる。

【０２１１】 種々の他の角化性病変もまた、本発明の方法を用いた治療の候補である。例え
ば、光線性の角質は、太陽光線に曝され、照射された皮膚上に生じる表皮の炎症
性前悪性腫瘍である。その病変は、紅斑から種々の大きさの剥離をともなう茶色
斑に変化する。現在の治療には、切除術および冷凍手術が含まれる。しかし、こ
れらの治療には痛みを伴い、しばしば美容的に受け入れられない傷跡を残す。従
って、光線性角化症などの角化症の治療には、病変の上皮／類上皮細胞の過剰増
殖を阻害するのに十分な量のヘッジホッグアンタゴニスト組成物の、好ましくは
局所的適用が含まれ得る。

【０２１２】 座瘡は、本発明の方法によって治療することができるさらに別の皮膚科学的軽
症の代表である。例えば、尋常性座瘡は、十代および若年成人の間で発症する最
も頻繁な多因子疾患であり、顔および体幹上部の炎症性および非炎症性病変の出
現として特徴づけられる。尋常性座瘡を引き起こす基本的な欠点は、極度に活発
な皮脂腺の過剰な角質化である。過剰な角質化は、皮膚および毛包微生物の正常
な移動を妨げ、それにより、座瘡Ｐｒｏｐｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ および、
細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓならびに、酵母Ｐ
ｉｔｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅによるリパーゼの放出が刺激される。抗増殖
性ヘッジホッグアンタゴニストの、特に局所的調製物を用いた治療は、病変形成
を誘導する管の移行性の症状（例えば、過剰な角質化）の予防に有用であり得る
。本発明の治療には、例えば、抗生物質、レチノイド、および抗アンドロゲンを
さらに含むことができる。

【０２１３】 本発明はまた、種々の形態の皮膚炎の治療法を提供する。皮膚炎は、掻痒性、
紅斑性、鱗状、水疱状、啼泣性の、亀裂性、または塊状のいずれかである明確に
区別することができない病変をいう用語である。これらの病変は、任意の種々の
原因から生じる。最も一般的な皮膚炎のタイプは、アトピー性皮膚炎、接触性皮
膚炎およびオムツ皮膚炎である。例えば、脂漏性皮膚炎は、慢性で、通常掻痒性
の、紅班性、乾燥性、湿潤性、または脂肪性の剥離および種々の領域（特に、頭
皮）に過剰量の乾燥剥脱物の剥脱を伴う黄色い塊のパッチを伴う皮膚炎である。
本発明の方法はまた、鬱滞性皮膚炎（しばしば慢性で、通常湿疹性の皮膚炎）の
治療に使用することができる。光線性皮膚炎は、太陽光線、紫外線またはＸ線も
しくはγ線照射などの光線照射への暴露に由来する皮膚炎である。本発明によれ
ば、本方法は、上皮細胞の所望でない増殖から生じる特定の皮膚炎の症状の治療
および／または予防に使用することができる。これらの種々の形態の皮膚炎に対
する治療法には、局所的および全身的コルチコステロイド、プリン拮抗薬、およ
び抗生物質を含むことができる。

【０２１４】 本発明の方法によって治療することができる軽症は、非ヒトに特異的な疾患（
例えば、疥癬）も含まれる。

【０２１５】 さらに別の実施形態では、本発明の方法は、ヒト癌（特に、基底細胞癌および
皮膚などの上皮組織の他の癌）の治療に使用することができる。例えば、本方法
において、基底細胞母班性症候群（ＢＣＮＳ）ならびに他のヒト癌、腺癌、肉腫
などに対する治療の一部として、ヘッジホッグアンタゴニストを使用することが
できる。

【０２１６】 好ましい実施形態では、本発明の方法は、基底細胞癌の治療（または予防）の
ための予防的養生法の治療の一部として使用される。ｐｔｃシグナル経路の調節
解除は、ｐｔｃ変異によって発症する基底細胞癌の一般的な特徴であり得る。ヒ
トｐｔｃ ｍＲＮＡの一貫した過剰発現は、インサイツハイブリッド形成法によ
って同定した、家族性および散発性ＢＣＣの腫瘍において記載されている。ｐｔ
ｃを不活化する変異体は、ｐｔｃがネガティブな自己制御を示すので、変異体Ｐ
ｔｃの過剰発現を起こすと予想することができる。以前の研究では、ヘッジホッ
グタンパク質の過剰発現が腫瘍形成も誘導し得ることが示されている。マウスの
腫瘍形成に役割を果たすこのソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）は、皮膚の形成
のわずか２、３日後、トランスジェニックマウスの皮膚における過剰発現Ｓｈｈ
がＢＣＮＳの特徴（皮膚表面全体にわたる多発性のＢＣＣ様上皮増殖が含まれる
）を発症していることが本発明者らの研究によって示唆されている。ＢＣＣ由来
のヒトＳｈｈ遺伝子における変異もまた記載されており、それには、ヒトにおけ
るＳｈｈまたは他のＨｈ遺伝子がヒトにおいて優性な癌遺伝子として作用し得る
ことが示唆されていた。散発性ｐｔｃ変異はまた、その他の正常な固体由来のＢ
ＣＣについて記載されており、そのいくつかはＵＶ識別変異である。散発性ＢＣ
Ｃの最近の研究では、ｐｔｃ変異を含むと同定された１５個の腫瘍のうち、ＣＴ
またはＣＣＴＴのいずれかが変化した５つのＵＶ識別変異が見出された。ＢＣＣ
および神経外胚葉性腫瘍における散発性ｐｔｃ変異における最近の別の分析は、
ＢＣＣで見出された３つのｐｔｃ変異のうちの１つが１つのＣＴ変化を示してい
た。例えば、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
７７：１１０９〜１３、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．、５７：２３６９〜７２、Ｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２７６：８１７〜２１、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｇｅｎｅｓ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ、１８：３０５〜９、Ｓｔｏｎｅ ｅｔ
ａｌ．、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８４：１２９〜３４、およびＪｏｈｎｓｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２：１６６８〜７１を参照
のこと。

【０２１７】 本発明の方法はまた、例えば、ｐｔｃ機能の欠損または滑化機能の獲得の結果
であり得る疾患のＢＣＣまたは他の影響を予防するための、ＢＣＮＳを有する患
者を治療するために使用することができる。基底細胞母斑症候群は、若年で発症
する多発性ＢＣＣによって特徴づけられる稀な常染色体優性疾患である。ＢＣＮ
Ｓ患者は、これらの腫瘍を発症しやすく、出生後２０年間で主に皮膚の太陽光線
に曝された領域で腫瘍が多数認められている。この疾患はまた、多数の発達異常
（肋骨、頭部および顔の変形ならびにしばしば多指症、合指症、および脊髄破裂
が含まれる）を起こす。それらはまた、ＢＣＣに加えて多数の腫瘍型（卵巣およ
び心臓の線維腫、皮膚および顎の嚢胞、ならびに中枢神経系においては髄芽細胞
腫および髄膜腫）を発症する。本発明の方法を用いて、このような腫瘍型を予防
または治療することができる。ＢＣＮＳ患者の研究によって、患者がｐｔｃ遺伝
子における遺伝性および散発性変異の両方を有することが示されており、これら
の変異がこの疾患の決定的な原因であることが示唆される。

【０２１８】 １つの態様では、本発明は、巨核球由来の細胞の形成および／または巨核球由
来の細胞の機能パフォーマンスを調節するための薬学的調製物および方法を提供
する。例えば、種々の過形成性疾患または新生物形成疾患を起こす血小板の治療
または予防に本明細書中で開示の特定の組成物を適用することができる。

【０２１９】 本発明の方法において使用するためのヘッジホッグアンタゴニストは、水、緩
衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、
液体ポリエチレングリコールなど）またはそれらの適切な混合物などの生物学的
に受容可能な媒体を用いた投与用に便利に処方することができる。選択した培地
における至適な有効成分の濃度は、医化学者に周知の手順に従って経験的に決定
することができる。本明細書中で使用される用語「生物学的に受容可能な媒体」
には、薬学的調製物の所望の投与経路に適切であり得る任意および全ての溶媒お
よび分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質用のこの媒体の使用は、当該分
野で公知である。任意の従来の媒体および薬剤の範囲外ではヘッジホッグアンタ
ゴニストの活性と適合しないので、本発明の薬学的調製物において使用する際は
熟考すべきである。適切な賦形剤、および、他のタンパク質を含んだ処方物は、
例えば、書籍、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｉｃａｌ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ
、Ｐａ．、ＵＳＡ、１９８５）に記載されている。これらの賦形剤には、注射可
能な「沈殿処方物」が含まれる。

【０２２０】 本発明の薬学的処方物には、獣医学的組成物（家畜または家庭内の、例えば、
イヌなどの動物の治療用など、獣医学的用途に適切なヘッジホッグアンタゴニス
トの薬学的調製物）も含むことができる。

【０２２１】 移入法には、再装填可能なデバイスまたは生分解性デバイスもある。近年、薬
物送達を調製するための種々の低速放出重合デバイスを開発してｉｎ ｖｉｖｏ
で試験されており、それには、タンパク質様生物薬剤が含まれる。生分解性およ
び非分解性ポリマーの両方を含む生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使
用して、特定の標的部位でヘッジホッグアンタゴニストを持続的に放出させるた
めの移植片を形成することができる。

【０２２２】 本発明の調製物は、経口、非経口、局所、または直腸投与ができる。勿論、調
製物は各投与経路に適切な形態で投与される。例えば、調製物は、錠剤またはカ
プセル形態、注射、吸入、点眼液、軟膏、座薬など（例えば、注射、注入または
吸入による投与、ローションまたは軟膏による局所投与、および座薬による直腸
投与）で投与される。経口投与および局所投与が好ましい。

【０２２３】 本明細書中で使用される用語「非経口投与」および「非経口で投与された」と
は、通常注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉
内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管
支内、皮下、皮内、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内注射なら
びに注入が含まれるがそれらに限定されない。

【０２２４】 本明細書中で使用される用語「全身投与」、「全身に投与された」、「末梢投
与」および「末梢に投与された」とは、患者の系に入って代謝および他の同様の
プロセス（例えば、非経口投与）を受けやすくなるような中枢神経系への直接投
与以外の化合物、薬物、または他の物質の投与を意味する。

【０２２５】 これらの化合物は、治療のために任意の適切な投与経路（経口、経鼻（例えば
、スプレー）、直腸、膣内、非経口、嚢内、および頬側および舌下を含む局所（
例えば、粉末、軟膏、またはドロップ）、）によってヒトおよび他の動物に投与
することができる。

【０２２６】 選択された投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用できる本発明の化合物
および／または本発明の組成物は、以下の記載または当業者に公知の従来の方法
によって薬学的に受容可能な剤形に処方される。

【０２２７】 本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成
物、および投与様式によって患者に毒性をもたらすことなく所望の治療的反応を
達成するための有効成分の有効量を得るために変化させることができる。

【０２２８】 選択された投薬レベルは、以下の種々の因子に依存する；本発明で使用した特
定の化合物もしくはそのエステル、塩、またはアミドの活性、投与経路、投与時
間、使用した特定の化合物の排泄率、治療の持続時間、特定のヘッジホッグアン
タゴニストと組み合わせて使用した他の薬物、化合物および／または物質、年齢
、性、体重、病状、身体全体の健康、および治療する患者の以前の病歴、ならび
に医学分野で公知の類似の因子。

【０２２９】 当該分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、要求される薬学的組成物
の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は
、薬学的組成物中で使用する本発明の化合物の用量を所望の治療効果を達成する
ために必要とされるよりも低いレベルで開始し、その後所望の効果が達成される
まで段階的に投薬量を増加させることができるであろう。

【０２３０】 一般に、本発明の適切な化合物の一日量は、治療効果を得るのに有効な最低化
合物量である。このような有効化合物量は、一般に上記の因子に依存する。一般
に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、脳室内、および非経口投与量は、約
０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。

【０２３１】 所望であるならば、有効成分の有効な一日量は、適切な間隔を置いて、１日あ
たり２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の回数のサブ用量に分け、必
要に応じた単位投薬形態で投与することができる。

【０２３２】 用語「治療」は、予防、治療、および治癒を含むことが意図される。

【０２３３】 この治療を受ける患者は、治療が必要な以下の任意の動物が含まれる；霊長類
（特に、ヒト）ならびにウマ、ウシ、ブタおよびヒツジなど哺乳類、家禽類およ
び一般的なペットなど。

【０２３４】 本発明の化合物は、単独で、あるいは薬学的に受容可能なキャリアと混合して
投与することができ、さらに、ペニシリン類、セファロスポリン類、アミノグリ
コシド類およびグリコペプチド類などの他の抗菌剤と一緒に投与することができ
る。従って、混合療法には、最初に投与された化合物の治療効果が完全に消失し
ていないうちに次の化合物が投与される方法で、活性化合物を、連続的に、同時
に、そして個別に投与することが含まれる。

【０２３５】 Ｖ．薬学的組成物 本発明の化合物は単独で投与することができるが、薬学的配合物（組成物）と
して本発明の化合物を投与することが好ましい。本発明によるヘッジホッグアン
タゴニストは、ヒトまたは動物の医療において使用される任意の都合のよい方法
で投与するために配合することができる。

【０２３６】 従って、本発明の別の局面により、１つまたは複数の薬学的に受容可能なキャ
リア（添加剤）および／または希釈剤とともに配合された１つまたは複数の上記
化合物の治療有効量を含む薬学的に受容可能な組成物が提供される。下記に詳し
く記載されているように、本発明の薬学的組成物は固体形態または液体形態で投
与するために特別に配合することができる。これには下記に適した組成物が含ま
れる：（１）経口投与、例えば、水剤（水性または非水性の溶液または懸濁物）
、錠剤、ボーラス剤、粉剤、顆粒、舌に投与されるペースト；（２）例えば、無
菌の溶液または懸濁物として、例えば、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射
による非経口投与；（３）例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏またはスプ
レー剤としての局所的適用；または（４）例えば、膣坐剤、クリームまたはフォ
ームとしての膣内用または直腸内。しかし、特定の実施形態においては、本発明
の化合物を無菌水に単に溶解または懸濁することができる。

【０２３７】 本明細書中で使用されている用語「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用
可能な合理的な利益／リスク比で、動物体内の細胞の少なくとも部分集団におけ
るヘッジホッグのシグナル変換経路を阻害し、それによって、処置細胞における
そのような経路の生物学的結果を阻止することによって何らかの所望する治療効
果が得られるのに効果的な、本発明の化合物を含む化合物、物質または組成物の
量を意味する。

【０２３８】 用語「薬学的に受容可能な」は、本明細書中では、妥当な医学的判断の範囲内
において、合理的な利益／リスク比に対応して過度な毒性、刺激、アレルギー応
答あるいは他の問題または合併症を伴うことなくヒトおよび動物の組織と接触し
た使用に適するそのような化合物、物質、組成物および／または剤形を示すため
に用いられている。

【０２３９】 本明細書中で使用されている用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本発明
のアンタゴニストを特定の器官または身体部分から別の器官または身体部分運搬
または輸送させること関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶
媒またはカプセル化物質などの薬学的に受容可能な物質、組成物または賦形剤を
意味する。それぞれのキャリアは、配合物のそれ以外の成分と配合可能であると
いう意味で「受容可能」でなければならず、そして患者に有害であってはならな
い。薬学的に受容可能なキャリアとして使用できる物質のいくつかの例には下記
が含まれる：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２
）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；（３）カ
ルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセル
ロースおよびその誘導体；（４）粉末化トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチ
ン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐薬用ワックスなどの賦形剤；（
９）ピーナッツオイル、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および
ダイズ油などのオイル；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（
１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール
などのポリオール類；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどの
エステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニ
ウムなどの緩衝化剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンを含まない水
；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；
（２０）リン酸緩衝化溶液；および（２１）薬学的配合物において用いられる他
の非毒性の配合可能な物質。

【０２４０】 上記に示されているように、本発明のヘッジホッグアンタゴニストの特定の実
施形態はアミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含み、従って、薬学
的に受容可能な酸との薬学的に受容可能な塩を形成することができる。これに関
連して、用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合物の比較的毒性のない
無機酸付加塩または有機酸付加塩をいう。このような塩は、本発明の化合物の最
終的な単離および精製を行っている途中のその場で、あるいはその遊離塩基形態
で精製された本発明の化合物を適切な有機酸または無機酸と個々に反応させて、
そのようにして得られた塩を単離することによって調製することができる。代表
的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢
酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸
塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、
フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプト
ン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば
、Ｂｅｒｇｅ他（１９７７）「薬学的塩」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１
〜１９を参照のこと）。

【０２４１】 本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩には、例えば、非毒性の有機酸または
無機酸に由来する本発明の化合物の従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が
含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、
スルファミン酸、リン酸、硝酸など無機酸から誘導される塩；および酢酸、プロ
ピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、
クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸
、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−
アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタ
ンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製される塩が含ま
れる。

【０２４２】 別の場合には、本発明の化合物は、１つまたは複数の酸性官能基を含むことが
でき、従って、薬学的に受容可能な塩基との薬学的に受容可能な塩を形成するこ
とができる。この場合における用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合
物の比較的毒性のない無機塩基付加塩および有機塩基付加塩をいう。このような
塩は、同様に、本発明の化合物の最終的な単離および精製を行っている途中のそ
の場で、あるいはその遊離酸形態で精製された本発明の化合物を、薬学的に受容
可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩などの適切な塩基と、
またはアンモニアと、または薬学的に受容可能な有機の第一級アミン、第二級ア
ミンもしくは第三級アミンと個々に反応させることによって調製することができ
る。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、リチウム塩、ナト
リウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩な
どが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミ
ン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、ピペラジンなどが含まれる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ他（上記）を参照のこと
）。

【０２４３】 湿潤化剤、乳化剤および滑剤（ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マ
グネシウムなど）もまた、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤お
よび芳香剤、保存剤および抗酸化剤と同様に、組成物中に含有させることができ
る。

【０２４４】 薬学的に受容可能な抗酸化剤の例には下記が含まれる：（１）アスコルビン酸
、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリ
ウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロ
キシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン
、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（３）
クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン
酸などの金属キレート化剤。

【０２４５】 本発明の配合物には、経口投与、鼻腔投与、局所投与（口内および舌下を含む
）、直腸投与、膣内投与および／または非経口投与に適した配合物が含まれる。
そのような配合物は、都合よいことに単位投薬形態物で提供することができ、製
薬分野でよく知られている任意の方法で調製することができる。単回投薬形態物
を作製するためにキャリア物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処
置されている宿主、特定の投与様式に依存して変化する。単回投薬形態物を作製
するためにキャリア物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般には
、治療効果が得られる化合物のそのような量である。一般には、１００パーセン
トの内、この量は、有効成分が約１パーセント〜約９９パーセントの範囲であり
、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセントの範囲であり、最も好ましくは
約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲である。

【０２４６】 このような配合物または組成物の調製方法には、キャリアおよび必要に応じて
使用される１つまたは複数の補助成分を用いて本発明の化合物を一緒にする工程
が含まれる。一般に、配合物は、液体キャリア、または細かく分割された固体キ
ャリア、またはその両方を用いて本発明の化合物を均一かつ十分に一緒にし、そ
の後、必要な場合には製品の形状にすることによって調製される。

【０２４７】 経口投与に好適な本発明の配合物は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、トロ
ーチ剤（好ましい基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカン
トが使用される）、粉剤、顆粒の形態であり、あるいは水性液体または非水性液
体での溶液または懸濁物として、あるいは水中油型または油中水型の液体乳剤と
して、あるいはエリキシル剤またはシロップとして、あるいは香剤（ゼラチンお
よびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤が使
用される）として、かつ／または口内洗浄剤などとして存在し得る。これらはそ
れぞれ、有効成分として、所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の化合物
はまた、ボーラス剤、舐剤またはペーストとして投与することができる。

【０２４８】 経口投与される本発明の固体投薬形態物（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉
剤、顆粒など）において、有効成分は１つまたは複数の薬学的に受容可能なキャ
リアと混合されるが、このようなキャリアは、例えば、クエン酸ナトリウム、リ
ン酸二カルシウムおよび／または下記のいずれかである：（１）デンプン、ラク
トース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸などの充
填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩
、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムな
どの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、
トウモロコシデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩
および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶液遅延剤；（６
）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコー
ルおよびグリセロールモノステアラートなどの湿潤化剤；（８）カオリンおよび
ベントナイト粘土などの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸化カルシウム、ス
テアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウ
ム、およびこれらの混合物などの滑剤；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤
およびピルの場合、薬学的組成物は緩衝化剤をも含むことができる。類似したタ
イプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖類ならびに高分子量ポリエチレ
ングリコールのような賦形剤を使用する軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼ
ラチンカプセルにおける充填剤として用いることができる。

【０２４９】 錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の補助成分を用いて圧縮成形または成型
を行うことによって作製することができる。圧縮成形された錠剤は、結合剤（例
えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性な
希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコラートまたは架橋
型カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用し
て調製することができる。成型された錠剤は、適切な装置において、不活性な液
体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成型することによって作製すること
ができる。

【０２５０】 本発明の薬学的組成物の錠剤および他の固体投薬形態物（糖衣剤、カプセル、
ピルおよび顆粒など）は、必要に応じて、刻み目を付けたり、薬剤配合分野でよ
く知られている腸溶性コーティングおよび他のコーティングなどのコーティング
および外皮を用いて調製することができる。本発明のそのような配合物はまた、
例えば、所望する放出特性が得られるような様々な割合のヒドロキシプロピルメ
チルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイク
ロスフェアを使用してその中の有効成分の遅い放出または制御された放出が得ら
れるように配合することができる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通
すろ過によって、あるいは使用直前に無菌水あるいは何らかの他の無菌の注射可
能な媒体に溶解することができる無菌の固体組成物の形態で殺菌剤を組み込むこ
とによって滅菌することができる。これらの組成物はまた、必要に応じて不透明
化剤を含有することができ、そして有効成分のみが、好ましくは胃腸管の特定部
分において、必要に応じて遅延様式で放出される組成物であり得る。使用され得
る包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。有効成分はま
た、適する場合には１つまたは複数の上記賦形剤を用いてマイクロカプセル化さ
れた形態にすることができる。

【０２５１】 本発明の化合物が経口投与される液体投薬形態物には、薬学的に受容可能な乳
剤、マイクロ乳剤、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。有
効成分に加えて、液体投薬形態物は、例えば、水または他の溶媒、溶解剤および
乳化剤などのこの分野で広く使用されている不活性な希釈剤を含有することがで
きる。このような希釈剤は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸
エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリ
コール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、落花生油、コー
ン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒ
ドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エ
ステル、およびこれらの混合物などである。

【０２５２】 不活性な希釈剤に加えて、経口用組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤
、甘味剤、風味剤、着色剤、芳香剤および保存剤などの補助剤を含むことができ
る。

【０２５３】 懸濁物は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコ
ール類、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソ
ルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイ
ト、寒天およびトラガカント、ならびにこれらの混合物などの懸濁剤を含有する
ことができる。

【０２５４】 コレステロールなどのステロール類はシクロデキストリン類との複合体を形成
することが知られている。従って、阻害剤がステロイダルアルカロイドである好
ましい実施形態において、阻害剤は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリンおよびγ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリンな
らびに２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキスト
リン類と配合することができる。

【０２５５】 直腸投与または膣内投与される本発明の薬学的組成物の配合物は坐薬として提
供され得る。このような坐薬は、１つまたは複数の本発明の化合物を、例えば、
カカオバター、ポリエチレングリコール、坐薬用ワックスまたはサリチル酸塩を
含む１つまたは複数の好適な非刺激性の賦形剤またはキャリアと混合することに
よって調製することができる。このような坐薬は、室温では固体であるが、体温
で液体になり、従って、直腸腔または膣腔の中で溶解して、活性なヘッジホッグ
アンタゴニストを放出する。

【０２５６】 膣投与に好適な本発明の配合物には、適切であることがこの分野で知られてい
るそのようなキャリアを含有する膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト
、フォームまたはスプレー配合物もまた含まれる。

【０２５７】 本発明の化合物が局所的または経皮的に投与される投薬形態物には、粉剤、ス
プレー剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび
吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下において、薬学的に受容可能なキ
ャリアと、そして必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤または噴射剤と混合する
ことができる。

【０２５８】 軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物
脂肪および植物脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント
、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケ
イ酸、タルク、酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有することができる。

【０２５９】 粉剤およびスプレー剤は、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケ
イ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム類およびポリアミド粉末、または
これらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレー剤は、ク
ロロフルオロ炭化水素類および揮発性の非置換炭化水素（ブタンおよびプロパン
など）などの通常の噴射剤をさらに含有することができる。

【０２６０】 経皮用パッチは、身体への本発明の化合物の制御された送達をもたらすという
さらなる利点を有する。そのような投薬形態物は、ヘッジホッグアンタゴニスト
を適切な媒体に溶解または分散させることによって作製することができる。吸収
強化剤もまた、皮膚を通過するヘッジホッグアンタゴニストの流束を増加させる
ために使用することができる。そのような流束の速度は、速度調節用メンブラン
を提供するか、あるいはポリマーマトリックスまたはゲルに化合物を分散させる
ことによって調節することができる。

【０２６１】 眼用配合物、眼軟膏、粉剤、溶液などもまた、本発明の範囲内であるとして包
含される。

【０２６２】 非経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に受容
可能な滅菌された等張の水性または非水性の溶液、分散物、懸濁物または乳化物
、あるいは無菌粉末と組み合わさった１つまたは複数の本発明の化合物を含む。
これらは、使用直前に無菌の注射可能な溶液または分散物に再構成することがで
き、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、目的とする受容者の血液に関して配合物を等張
性にする溶質、懸濁剤または増粘剤を含有することができる。

【０２６３】 本発明の薬学的配合物において用いることができる好適な水性キャリアおよび
非水性キャリアの例には、水、エタノール、ポリオール類（グリセロール、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合
物、オリーブ油などの植物オイル、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有
機エステルが含まれる。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティング
物質を使用することによって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズを維持
することによって、そして界面活性剤を使用することによって維持することがで
きる。

【０２６４】 これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を
含有することができる。微生物活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例
えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）を含めること
によって確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物
に加えることもまた望ましいことであり得る。さらに、注射可能な薬学的形態物
の持続した吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を
遅らせる薬剤を含めることによって得ることができる。

【０２６５】 場合により、薬物の作用を持続させるために、皮下注射または筋肉内注射から
の薬物吸収を遅らせることが望ましい。これは、水溶性が良好でない結晶性物質
または非晶質物質の液体懸濁物を使用することによって達成することができる。
その場合、薬物の吸収速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得るその溶解
速度に依存する。あるいは、非経口的に投与された薬物形態物の遅延吸収は、薬
物をオイル賦形剤に溶解または懸濁させることによって達成され得る。

【０２６６】 注射可能なデポ剤を、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー
で本発明の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製
することができる。薬物対ポリマー比、および用いられる特定のポリマーの性質
に依存して薬物の放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例
には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポ剤の注射
可能な配合物はまた、身体組織と適合し得るリポソームまたはマイクロエマルシ
ョンに薬物を包み込むことによって調製される。

【０２６７】 本発明の化合物が医薬品としてヒトまたは動物に投与される場合、本発明の化
合物は、単独で、あるいは薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせで、例え
ば、０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の有効成分を含有
する薬学的組成物として投与することができる。

【０２６８】 本発明の活性化合物の動物飼料への添加は、好ましくは、有効量の活性化合物
を含有する適切な飼料予備混合物を調製して、この予備混合物を混合して完全な
混合物にすることによって達成される。

【０２６９】 あるいは、有効成分を含有する中間濃縮物または飼料強化物を飼料に混合する
ことができる。そのような飼料予備混合物および完全混合物を調製し、そしてそ
れらが投与され得る方法は参考書籍に記載されている（例えば、「添加される動
物栄養物」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ ａｎｄ ＣＯ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃ
ｉｓｃｏ、米国、１９６９；あるいは「家畜用飼料および給餌」、Ｏ ａｎｄ
Ｂ ｂｏｏｋｓ、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅ、米国、１９７７）。

【０２７０】 ＶＩ．活性なアンタゴニストの合成スキームおよび同定 本発明のステロイダルアルカロイド類およびその同類物は、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｓ
ｔｉｌｌｅなどのクロスカップリング技術を用いることによって容易に調製する
ことができる。このようなカップリング反応は比較的穏和な条件のもとで行われ
、広範囲の「スペクテイター」官能基性に耐える。

【０２７１】 ａ．コンビナトリアルライブラリー 本発明の化合物、特に、様々な代表的な種類の置換基を有する変化体のライブ
ラリーはコンビナトリアル化学および他の平行的な合成スキームに適する（例え
ば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９４／０８０５１を参照のこと）。その結果は
、潜在的なヘッジホッグアンタゴニストのリード化合物を同定して、リード化合
物の特異性、毒性および／または細胞傷害的動態特性を改善するために、関連化
合物の大きなライブラリー（例えば、上記に示される化合物の多様なライブラリ
ー）を大きな処理速度のアッセイで迅速にスクリーニングできるということであ
る。例えば、上記のヘッジホッグの生物活性アッセイは、すべてのヘッジホッグ
または特定のヘッジホッグのイソ型または活性に対するアンタゴニスト活性を有
する化合物について本発明の化合物のライブラリーをスクリーニングするために
使用することができる。

【０２７２】 単に例示のためにではあるが、本発明のためのコンビナトリアルライブラリー
は、所望する特性について一緒にスクリーニングされ得る化学的に関連する化合
物の混合物である。１回の反応で多くの関連する化合物を調製することにより、
実施するのに必要とされるスクリーニング操作の回数が大きく減り単純になる。
適切な物理的特性に関するスクリーニングを従来の方法で行うことができる。

【０２７３】 ライブラリーにおける多様性を様々な相違レベルで得ることができる。例えば
、コンビナトリアル反応において使用される基質のアリール基は、中心のアリー
ル部分に関して異なり得るし、例えば、環構造に関して多様であり、かつ／また
はそれ以外の置換基に関して変化させることができる。

【０２７４】 様々な技術を、本発明のヘッジホッグアンタゴニストなどの小さな有機分子の
コンビナトリアルライブラリーを作製するためにこの分野で用いることができる
。例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ他（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ．Ｃｈ
ｅｍ．１４：８３；Ａｆｆｙｍａｘの米国特許第５，３５９，１１５号および同
第５，３６２，８９９号；Ｅｌｌｍａｎの米国特許第５，２８８，５１４号；Ｓ
ｔｉｌｌ他のＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９４／０８０５１；Ｃｈｅｎ他（１９
９４）、ＪＡＣＳ、１１６：２６６１；Ｋｅｒｒ他（１９９３）、ＪＡＣＳ、１
１５：２５２；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／１００９２、同ＷＯ９３／０
９６６８および同ＷＯ９１／０７０８７；ならびにＬｅｒｎｅｒ他のＰＣＴ国際
特許出願公開ＷＯ９３／２０２４２を参照のこと。従って、本発明のヘッジホッ
グアンタゴニストのおよそ１００〜１，０００，０００以上の変化体の様々なラ
イブラリーを合成して、特定の活性または特性についてスクリーニングすること
ができる。

【０２７５】 例示的な実施形態において、候補となるヘッジホッグアンタゴニスト変化体の
ライブラリーは、Ｓｔｉｌｌ他のＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９４／０８０５１
に記載される技術に適合したスキームを利用して、例えば、候補のアンタゴニス
トまたは合成中間体の置換基の位置の１つに位置する、例えば、加水分解可能な
基または光分解可能な基によってポリマービーズに結合させて合成することがで
きる。Ｓｔｉｌｌ他の技術に従って、ライブラリーが１組のビーズの表面で合成
される。この場合、各ビーズは、そのようなビーズ上の特定の変化体を同定する
１組の標識を含む。次いで、このビーズライブラリーを、阻害剤が探し出される
ヘッジホッグ感受性細胞の層に「播種」することができる。変化体は、例えば、
加水分解によってビーズから遊離させることができる。（例えば、外部から加え
られたヘッジホッグタンパク質に対して）ヘッジホッグ感受性がないか、または
ヘッジホッグ感受性が弱い領域によって囲まれたビーズ、例えば、「ハロー」を
選択することができ、そしてその標識を「読み取り」、特定の変化体の正体を明
かすことができる。

【０２７６】 ｂ．スクリーニングアッセイ 様々なアッセイが、ヘッジホッグにより媒介されるシグナル変換を阻害する化
合物の能力を測定するために利用することができる。その多くは、処理速度が大
きな形式で処理することができる。化合物および天然抽出物のライブラリーが調
べられる多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、一定の期間で調べられ
る化合物の数を最大にするためには、大きな処理速度のアッセイが望ましい。従
って、合成物および天然産物のライブラリーを、ヘッジホッグシグナルを阻害す
ることに関してジェルビン（ｊｅｒｖｉｎｅ）と類似する活性を有する他のステ
ロイダル化合物および非ステロイダル化合物のためにサンプリングすることがで
きる。

【０２７７】 精製されたヘッジホッグポリペプチドおよび組換えヘッジホッグポリペプチド
が利用できることによって、ヘッジホッグの正常な細胞機能のアンタゴニストで
ある小さな有機分子などの薬物について、特に、細胞の増殖および／または分化
の病理発生におけるその役割についてスクリーニングするために使用することが
できるアッセイシステムの作製が容易になる。１つの実施形態において、そのよ
うなアッセイにより、ヘッジホッグポリペプチドとｐａｔｃｈｅｄなどのヘッジ
ホッグレセプターとの結合を調節する化合物の能力が評価される。別の実施形態
では、アッセイにより、ヘッジホッグが媒介するシグナル伝達を変化させる試験
化合物の能力が単に評価されるだけである。このようにして様々なアンタゴニス
トを同定することができる。様々なアッセイ形式が可能であり、そして本開示を
考慮すれば、それらは当業者により理解される。

【０２７８】 無細胞系で行われるアッセイ、例えば、精製タンパク質または半精製タンパク
質によって得ることができるようなアッセイが、多くの場合、「一次」スクリー
ニングとして好まれる。そのようなアッセイは、試験化合物によって媒介される
分子標的における変化の迅速な発現および比較的容易な検出を可能にするように
作製され得るからである。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物利
用性の作用は、一般にインビトロ系では無視され得る。その代わり、アッセイは
、主として、レセプタータンパク質との結合親和性の変化が明らかであり得る薬
物の分子標的に対する作用に集中している。

【０２７９】 何らかの特定の理論によりとらわれるつもりはないが、ジェルビンおよび他の
ステロイダルアルカロイドは、例えば、ｐａｔｃｈｅｄのステロール感知ドメイ
ンとの相互作用を介してコレステロール由来のヘッジホッグと干渉することによ
ってヘッジホッグシグナル経路においてその活性を示すはずである（例えば、Ｌ
ｏｆｔｕｓ他（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：２３２を参照のこと）。
ヘッジホッグアンタゴニストに関する例示的なスクリーニングアッセイは、レセ
プターがヘッジホッグタンパク質または少なくともジェルビンと通常結合し得る
条件下で、目的の化合物を、ヘッジホッグレセプタータンパク質（例えば、ｐａ
ｔｃｈｅｄレセプターを発現する細胞）およびヘッジホッグタンパク質を含む混
合物と接触させることを含む。次いで、この混合物に、試験化合物を含有する組
成物が加えられる。レセプター／ヘッジホッグ複合体および／またはレセプター
／ジェルビン複合体の検出および定量によって、レセプタータンパク質とヘッジ
ホッグポリペプチドまたはジェルビンアンタゴニストとの複合体形成を阻害する
（または高める）ことにおける試験化合物の効き目を決定するための手段が提供
される。化合物の効き目は、様々な濃度の試験化合物を使用して得られたデータ
から用量応答曲線を作製して、その結果をジェルビンで得られた結果と比較する
ことによって評価することができる。さらに、コントロールアッセイもまた、比
較用の基準を得るために行うことができる。コントロールアッセイにおいて、単
離または精製されたヘッジホッグポリペプチドがレセプタータンパク質に加えら
れ、レセプター／ヘッジホッグ複合体の形成が試験化合物の非存在下で定量され
る。

【０２８０】 例示的な実施形態において、ヘッジホッグレセプターとして利用されるポリペ
プチドはｐａｔｃｈｅｄタンパク質から作製することができ、特にステロイド感
知ドメイン、例えば、機能的なステロイド感知ドメインを含むタンパク質の可溶
性部分を含む。従って、例示的なスクリーニングアッセイは、例えば、ヒトのｐ
ａｔｃｈｅｄ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ４３１４８）または他の脊椎動物源（
ニワトリｐａｔｃｈｅｄに関するＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ４００７４
およびマウスｐａｔｃｈｅｄに関するＵ４６１５５）ならびにショウジョウバエ
（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ２８９９９）または他の非脊椎動物源から
得ることができるｐａｔｃｈｅｄタンパク質のすべての部分または適切な部分を
含む。ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は、（好ましくは、細胞表面に発現させた）完
全なタンパク質として、あるいは、例えば、ステロイド感知ドメインを含む全長
タンパク質のフラグメントとして、および／または、少なくとも、ヘッジホッグ
ポリペプチドに結合する部分として、例えば、ヒトのｐａｔｃｈｅｄタンパク質
の残基Ａｓｎ１２０−Ｓｅｒ４３８および／またはＡｒｇ７７０−Ｔｒｐ１０２
７に対応する実質的な細胞外ドメインの一方または両方としてスクリーニングア
ッセイにおいて提供され得る。例えば、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は、可溶性形
態で、例えば、一方の細胞外ドメインの調製物として、あるいは非構造的なリン
カーで共有結合された両方の細胞外ドメインの調製物として提供され得る（例え
ば、Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８）、ＰＮＡＳ、８５：４８７９；および米国特許
第５，０９１，５１３号を参照のこと）。他の実施形態において、タンパク質は
リポソーム調製物の一部として提供され得るか、あるいは細胞表面で発現させる
ことができる。ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は組換え遺伝子から得ることができ、
例えば、異種の細胞で異所的に発現させることができる。例えば、タンパク質は
、卵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたは３Ｔ３など）または
酵母細胞において標準的な組換えＤＮＡ技術により発現させることができる。こ
れらの組換え細胞は、レセプター結合アッセイ、シグナル伝達アッセイまたは遺
伝子発現アッセイに使用することができる。Ｓｔｏｎｅ他（１９９６）、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３８４：１２９〜３４；およびＭａｒｉｇｏ他（１９９６）、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３８４：１７６〜９は、アフリカツメガエル卵母細胞で異所的に発現させ
たニワトリのｐａｔｃｈｅｄタンパク質などのｐａｔｃｈｅｄに対するヒトヘッ
ジホッグの結合アッセイを例示している。Ｍａｒｉｇｏ他のアッセイ系は、例え
ば、本発明の薬物スクリーニングアッセイに適合させることができる。その参考
文献に例示されているように、Ｓｈｈは、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質に選択的で
飽和した用量依存的な様式で結合する。従って、このことは、ｐａｔｃｈｅｄが
Ｓｈｈのレセプターであることを示している。

【０２８１】 ヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビンとヘッジホッグレセプターとの複
合体の形成は様々な技術で検出することができる。例えば、複合体形成の変化を
、例えば、放射能標識、蛍光標識または酵素標識されたヘッジホッグポリペプチ
ドなどの検出可能に標識されたタンパク質を使用して、免疫アッセイあるいはク
ロマトグラフィー的検出により定量することができる。

【０２８２】 典型的には、無細胞アッセイの場合、レセプター複合体を１つのタンパク質の
非複合体形態から分離することを容易にし、さらにアッセイを自動化させるため
に、ヘッジホッグレセプターまたはヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビン
分子のいずれかを固定化することが望ましい。１つの実施形態において、タンパ
ク質をマトリックスに結合させるドメインが付加された融合タンパク質が提供さ
れ得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／レセプター（ＧＳＴ
／レセプター）融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マ
イクロタイタープレートに吸着させることができる。次いで、これらは、ジェル
ビンまたはヘッジホッグポリペプチド（例えば、^３５Ｓ標識ヘッジホッグポリペ
プチド）および試験化合物と一緒にされて、複合体が形成される条件のもとで、
例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件のもとでインキュベーションされる
。しかし、それよりもわずかにストリンジェントな条件が望ましいことがある。
インキュベーション後、ビーズを洗浄して、結合していないリガンドを除き、そ
してマトリックスに結合した放射能標識が直接測定され（例えば、シンチラント
に入れたビーズ）、あるいは複合体を解離させた後の上清において測定される。
あるいは、複合体をビーズから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離して
、ビーズ画分に見出されるヘッジホッグポリペプチドまたはジェルビンのレベル
を、標準的な技術（ＨＰＬＣ、ゲル電気泳動など）を使用してゲルから定量する
ことができる。

【０２８３】 ヘッジホッグレセプター（または他のヘッジホッグ結合分子）の所望する部分
が可溶性形態で提供され得ない場合、リポソームベシクルを使用して、レセプタ
ーの操作可能で単離可能な供給源を得ることができる。例えば、ｐａｔｃｈｅｄ
タンパク質の確認された形態および組換え形態はともに、人工的な脂質ベシクル
（例えば、ホスファチジルコリンリポソーム）または細胞膜由来ベシクルで再構
成することができる（例えば、Ｂｅａｒ他（１９９２）、Ｃｅｌｌ、６８：８０
９〜８１８；Ｎｅｗｔｏｎ他（１９８３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２：
６１１０〜６１１７；およびＲｅｂｅｒ他（１９８７）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ、２６２：１１３６９〜１１３７４を参照のこと）。

【０２８４】 上記のような無細胞アッセイに加えて、本発明の化合物はまた、細胞系アッセ
イにより試験することができる。１つの実施形態において、ヘッジホッグの誘導
に対して感受性の細胞、例えば、ｐａｔｃｈｅｄを発現する細胞、またはヘッジ
ホッグの誘導に対する感受性を有する他の細胞をヘッジホッグタンパク質および
目的の試験薬剤と接触させることができ、そしてアッセイによって、試験薬剤の
存在下または非存在下での標的細胞によるヘッジホッグ誘導に応答した阻害に対
する、細胞への単なる結合に由来する何かが評価される。

【０２８５】 ｐａｔｃｈｅｄタンパク質を自ら発現する細胞を評価づけることに加えて、ｐ
ａｔｃｈｅｄを異所的に発現するように操作された細胞を薬物スクリーニングア
ッセイに利用することができる。一例として、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質の発現
が低レベルであるか、またはｐａｔｃｈｅｄタンパク質を発現しない細胞、例え
ば、アフリカツメガエル卵母細胞、ＣＯＳ細胞または酵母細胞を、ｐａｔｃｈｅ
ｄタンパク質を異所的に発現させるために、標準的な技術を使用して遺伝子操作
することができる（Ｍａｒｉｇｏ他（上記）を参照のこと）。

【０２８６】 例えば、機能的なｐａｔｃｈｅｄレセプターを発現する得られた組換え細胞を
、ヘッジホッグ結合のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためにレセプ
ター結合アッセイにおいて利用することができる。結合アッセイは細胞全体を使
用して行うことができる。さらに、本発明の組換え細胞は、ヘッジホッグに依存
するシグナル経路に関与するタンパク質をコードする他の異種遺伝子を含むよう
に操作することができる。例えば、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ｃｏｓｔａｌ−２、
ｆｕｓｅｄ、および／またはｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｆｕｓｅｄの１つま
たは複数の遺伝子産物を試薬細胞においてｐａｔｃｈｅｄと一緒に同時に発現さ
せることができる。このアッセイは、ヘッジホッグシグナル伝達カスケードの機
能的な再構成に敏感である。

【０２８７】 あるいは、再構成されたｐａｔｃｈｅｄタンパク質を使用するリポソーム調製
物を利用することができる。本来の起源および組換え起源の両方から得られる界
面活性剤抽出物から精製されたｐａｔｃｈｅｄタンパク質は人工的な脂質ベシク
ル（例えば、ホスファチジルコリンリポソーム）または細胞膜由来ベシクルにお
いて再構成することができる（例えば、Ｂｅａｒ他（１９９２）、Ｃｅｌｌ、６
８：８０９〜８１８；Ｎｅｗｔｏｎ他（１９８３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、２２：６１１０〜６１１７；およびＲｅｂｅｒ他（１９８７）、Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ、２６２：１１３６９〜１１３７４を参照のこと）。得られたリポソ
ームのラメラ構造およびサイズを、電子顕微鏡を使用して特徴づけることができ
る。再構成された膜におけるｐａｔｃｈｅｄタンパク質の外向きの配向を、例え
ば、免疫電子顕微鏡によって明らかにすることができる。候補薬剤の存在下にお
けるｐａｔｃｈｅｄ含有リポソームおよびタンパク質非含有リポソームのヘッジ
ホッグタンパク質結合活性を、ヘッジホッグ−ｐａｔｃｈｅｄ相互作用の潜在的
な調節因子を同定するために比較することができる。

【０２８８】 これらの細胞系アッセイにおいて使用されるヘッジホッグタンパク質は、精製
された供給源（起源が天然または組換え）として提供され得るか、あるいはタン
パク質を発現し、標的細胞と一緒に培養されている細胞／組織の形態で提供され
得るが、好ましくは、コレステロールに由来する形態である。結合研究に加えて
、試験薬剤と接触したｐａｔｃｈｅｄ発現細胞における第２のメッセンジャーま
たは遺伝子発現の変化などの細胞内シグナルの変化を検出することによって、候
補となるヘッジホッグアンタゴニストを同定することができる。

【０２８９】 多数の遺伝子産物がｐａｔｃｈｅｄ媒介のシグナル伝達に関与している。これ
には、ｐａｔｃｈｅｄ、転写因子のｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ（
ｃｉ）、セリン／トレオニンキナーゼのｆｕｓｅｄ（ｆｕ）、ならびにｃｏｓｔ
ａｌ−２、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｆｕｓｅ
ｄの遺伝子産物が含まれる。

【０２９０】 ヘッジホッグタンパク質による細胞の誘導は下流のエフェクターの活性化およ
び阻害を含むカスケードを開始させ、その最終的な結果は、場合により、遺伝子
の転写または翻訳における検出可能な変化である。ヘッジホッグにより媒介され
るシグナル変換の潜在的な転写標的は、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子（Ｈｉｄａｌｇｏ
およびＩｎｇｈａｍ、１９９０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１０、２９１〜３
０１；Ｍａｒｉｇｏ他、１９９６）であり、ショウジョウバエのｃｕｂｉｔｕｓ
ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ遺伝子の脊椎動物ホモログであるＧＬＩ遺伝子（Ｈｕ
ｉ他（１９９４）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、１６２：４０２〜４１３）である。ｐａ
ｔｃｈｅｄ遺伝子の発現は、Ｓｈｈに応答する肢芽および神経板の細胞で誘導さ
れることが明らかにされている（Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）、ＰＮＡＳ、９３
：９３４６〜５１；Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１
２２：１２２５〜１２３３）。ＧＬＩ遺伝子は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ド
メインを有する仮想的な転写因子をコードしている（Ｏｒｅｎｉｃ他（１９９０
）、Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ、４：１０５３〜１０６７；Ｋｉｎｚｌｅｒ他（１９９０
）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１０：６３４〜６４２）。ＧＬＩ遺伝子の転
写は、肢芽においてヘッジホッグに応答してアップレギュレーションされること
が報告されているが、その一方で、ＧＬＩ３遺伝子の転写はヘッジホッグ誘導に
応答してダウンレギュレーションされる（Ｍａｒｉｇｏ他（１９９６）、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２：１２２５〜１２３３）。そのような標的遺伝子から
、例えば、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子またはＧＬＩ遺伝子から、ヘッジホッグシグナ
ル変換に応答するこれらの遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュ
レーションをつかさどる転写調節配列を選択して、そのようなプロモーターをレ
ポーター遺伝子に機能的に結合させることによって、ヘッジホッグが媒介するシ
グナル変換経路を変化させる特異的な試験化合物の能力に敏感な転写系アッセイ
を得ることができる。従って、レポーター遺伝子の発現は、ヘッジホッグのアン
タゴニストとして作用する化合物の開発に対する有用なスクリーニング手段を提
供する。

【０２９１】 本発明のレポーター遺伝子型アッセイは、上記の事象カスケードの最終段階（
例えば、転写による調節）を測定する。従って、アッセイの１つの実施形態を実
施する際には、レポーター遺伝子構築物が、ヘッジホッグシグナル変換に依存し
た検出シグナルを発生させるために試薬細胞に挿入される。標的遺伝子の転写調
節配列内に存在するヘッジホッグシグナル変換に応答する潜在的な調節エレメン
トを同定するために、標的遺伝子のゲノムクローンの内部欠失物を、標準的な技
術を使用して構築することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．
他（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９
８９）；米国特許第５，２６６，４８８号；Ｓａｔｏ他（１９９５）、Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ、２７０：１０３１４〜１０３２２；およびＫｕｂｅ他（１９９
５）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７：１〜７を参照のこと）。遺伝子の５’隣接領域に
由来する１組の内部欠失ＤＮＡフラグメントをルシフェラーゼ遺伝子などのレポ
ーター遺伝子の上流に配置して、ｐａｔｃｈｅｄ発現細胞におけるレポーター遺
伝子の発現を行わせるそれらの能力がアッセイされる。レポーター遺伝子構築物
で一過性にトランスフェクションされた宿主細胞を、ｐａｔｃｈｅｄに依存した
シグナル変換に応答し得る調節配列を決定するためにヘッジホッグの存在下およ
び非存在下でレポーター遺伝子の発現調節について評価することができる。

【０２９２】 アッセイの１つの実施形態を実施する際に、レポーター遺伝子構築物が、ヘッ
ジホッグタンパク質による誘導で生じる第２のメッセンジャーに依存した検出シ
グナルを発生させるために試薬細胞に導入される。典型的には、レポーター遺伝
子構築物は、ヘッジホッグ活性に応答し得る１つまたは複数の転写調節エレメン
トと機能的に連結されたレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子の発現レベ
ルによってヘッジホッグに依存する検出シグナルが得られる。レポーター遺伝子
からの転写量は、好適であることが当業者に知られている任意の方法を使用して
測定することができる。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ発現を、ＲＮ
Ａｓｅ保護ＰＣＲまたはＲＮＡ系ＰＣＲを使用して検出することができ、あるい
はレポーター遺伝子のタンパク質産物を特徴的な染色または固有の活性によって
同定することができる。次いで、レポーター遺伝子からの発現量は、試験化合物
（またはヘッジホッグ）の非存在下での同じ細胞における発現量と比較されるか
、あるいは標的のレセプタータンパク質を有さない実質的に同一の細胞における
転写量と比較することができる。転写量における何らかの統計学的な差またはそ
れ以外の大きな差は、試験化合物が何らかの方法でヘッジホッグタンパク質のシ
グナル伝達活性を変化させていること、例えば、試験化合物が潜在的なヘッジホ
ッグアンタゴニストであることを示している。

【０２９３】 下記にさらに詳しく記載されているように、好ましい実施形態において、レポ
ーターの遺伝子産物は、その生成物に伴う固有の活性によって検出される。例え
ば、レポーター遺伝子は、酵素活性によって、色、蛍光または発光に基づく検出
シグナルをもたらす遺伝子産物をコードすることができる。他の好ましい実施形
態において、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子は選択的な生育を有利にす
る。例えば、レポーター遺伝子は細胞の生存性を高め、細胞の栄養要求性を和ら
げ、かつ／または薬物抵抗性をもたらし得る。

【０２９４】 好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出できるものである。レポーター遺伝
子はまた、所望する転写調節配列を含むか、または他の望ましい特性を示す遺伝
子との融合遺伝子の形態で構築物に組み入れることができる。レポーター遺伝子
の例には下記が含まれるが、それらに限定されない：ＣＡＴ（クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ）（ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ（１９７９
）、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：８６４〜８６９）、ルシフェラーゼ、および他の酵
素検出システム、例えば、β−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅ
Ｗｅｔ他（１９８７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５〜７３７）；
細菌ルシフェラーゼ（ＥｎｇｅｂｒｅｃｈｔおよびＳｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８
４）、ＰＮＡＳ、１：４１５４〜４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎ他（１９８４）、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３：３６６３〜３６６７）；アルカリホスファター
ゼ（Ｔｏｈ他（１９８９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１〜２
３８、Ｈａｌｌ他（１９８３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）
、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＣｕｌｌｅｎおよびＭａｌｉｍ（１
９９２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２〜３６８）
。

【０２９５】 レポーター遺伝子構築物に含むことができる転写制御エレメントには、プロモ
ーター、エンハンサーならびにリプレッサー結合部位およびアクチベーター結合
部位が含まれるが、これらに限定されない。好適な転写調節エレメントは、ヘッ
ジホッグシグナル伝達経路が調節された後にその発現が誘導される遺伝子の転写
調節領域に由来し得る。転写制御エレメントが得られる好ましい遺伝子の特徴に
は下記が含まれるが、それらに限定されない：静止細胞における低い発現または
検出できないほどの発現、細胞外刺激の数分以内に生じる転写レベルでの迅速な
誘導、一過性または新しいタンパク質合成に依存しない誘導、転写のその後の遮
断により新しいタンパク質合成が必要とされること、およびこれらの遺伝子から
転写されるｍＲＮＡは半減期が短いこと。これらの特性のすべてが存在すること
は必ずしも必要ではない。

【０２９６】 さらに、多数のアッセイが、この分野ではコレステロール生合成の阻害剤を検
出するために知られており、これらは、本発明のヘッジホッグアンタゴニストが
、例えば、ステロール類の生合成および／または輸送を阻害することによってコ
レステロールホメオスタシスを破壊するかどうかを明らかにするために容易に適
応させることができる。

【０２９７】 例示すると、ステロール類とポリエン抗生物質であるアンホテリシンＢとの複
合体によって動物細胞の膜に形成された孔により、細胞は効率的に殺傷され得る
。従って、コレステロールの外部供給源が存在しない場合、コレステロール生合
成経路における酵素の阻害剤は細胞をアンホテリシンＢ抵抗性にする。しかし、
２型阻害剤の場合、コレステロールが原形質膜で増大することにより、実際には
、細胞はアンホテリシンＢによる殺傷を受けやすくなるはずである。チャイニー
ズハムスター卵巣細胞を、試験ステロイダルアルカロイドなどのジェルビンと類
似する様式で、コレステロールホメオスタシスを破壊する試験化合物と予備イン
キュベーションすることによって、細胞はアンホテリシンＢによる殺傷に感じや
すくなる。従って、これは、試験化合物をアッセイするために使用することがで
き、そして大きな処理速度のスクリーニングに適する。細胞を潜在的な阻害剤と
（１５〜２４時間）予備インキュベーションし、次いでアンホテリシンＢで（３
〜６時間）処理する簡便な２工程プロトコルが、Ｋｒｉｅｇｅｒ（１９８３）（
Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３５：３８３〜３９１）によって記載されている
。これは、コレステロール生合成の直接的（例えば、拮抗的）な阻害剤および調
節性阻害剤を検出するための高感度方法である。このプロトコルは、潜在的なヘ
ッジホッグアンタゴニストの検出において有用であることが明らかにされ得る。

【０２９８】 ＳＲＥＢＰ切断−活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）は、膜に結合したＳＲＥＢＰ
類のタンパク質分解的切断を刺激し、それによって、細胞膜からのＮＨ２末端フ
ラグメントを放出させる。放出されたフラグメントは核に進入して、コレステロ
ールおよび脂肪酸の合成および取り込みに関与する遺伝子の転写を刺激する。ス
テロール類は、明らかにＳＣＡＰの膜結合ドメインと相互作用することによって
ＳＲＥＢＰ類の切断を抑制する。１つの実施形態において、ジェルビンに類似す
る様式でステロール輸送を妨げる試験薬剤の能力を、活性化されたＳＣＡＰタン
パク質またはＳＲＥＢＰタンパク質の生成によってアッセイすることができる。
例えば、特に望ましい実施形態は、大きな処理速度のスクリーニングにおいて使
用できるために、ＳＲＥＢＰに依存する遺伝子転写を検出するレポーター遺伝子
型アッセイである。様々な遺伝子が、ＳＲＥＢＰ応答エレメントを含むとしてこ
の分野で記載されており、これらはレポーター遺伝子構築物を生成させる候補で
ある。例えば、Ｂｉｓｔ他（１９９７）（ＰＮＡＳ、９４（２０）：１０６９３
〜８）はカベオリン遺伝子におけるＳＲＥＢＰ応答エレメントの存在を記載して
いる；Ｗａｎｇ他（１９９７）（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７２：２６３６７
〜７４）はＦＡＳ遺伝子におけるそのようなエレメントを記載している；Ｍａｇ
ａｎａ他（１９９６）（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７１：３２６８９〜９４）
は脂肪酸シンターゼ遺伝子におけるＳＲＥＢＰ−ＲＥの存在を記載している；そ
して、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ他（１９９６）（ＰＮＡＳ、９３：９４５〜５０）はフ
ァルネシル二リン酸シンターゼ遺伝子におけるＳＲＥＢＰ結合部位を記載してい
る。従って、Ｗａｎｇ他（上記）によって記載されたＦＡＳプロモーター−ルシ
フェラーゼレポーター、またはＧｕａｎ他（１９９７）（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ、２７２：１０２９５〜３０２）によって記載されたスクワレンシンターゼプ
ロモーター−ルシフェラーゼレポーターのようなレポーター遺伝子構築物を、ジ
ェルビンと潜在的に同等なものを検出するアッセイにおいて利用することができ
る。簡単に記載すると、２型阻害剤の非存在下において、ステロール輸送がいく
らかの程度で生じ、そしてＳＲＥＢＰに依存する転写がある速度で生じる。ジェ
ルビンなどによるステロール移動の阻害は、原形質膜におけるステロール前駆体
の増大をもたらし、そして小胞体におけるそのような前駆体の減少をもたらす。
後者は、ＳＣＡＰ媒介によるＳＲＥＢＰの切断を活性化し、そしてＳＲＥＢＰ−
ＲＥレポーター遺伝子の発現を同時に増大させる。レポーター遺伝子の発現の検
出は、この分野で知られている広範囲の技術のいずれかにより行うことができる
。例えば、レポーター遺伝子は、ゼオシンまたはハイグロマイシンなどの薬剤耐
性を付与するものであり得る。ジェルビン、または類似する様式でコレステロー
ルホメオスタシスを阻害し得る別の化合物は、レポーター遺伝子の発現を増大さ
せるのでそのような薬剤に対する大きな抵抗性をもたらす。

【０２９９】 さらに別の実施形態において、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素
Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼの活性をもたらす試験化合物の能力は、ジェ
ルビンのようにコレステロールホメオスタシスに影響する化合物を検出するため
に使用することができる。ジェルビンのような２型阻害剤に引き起こされる小胞
体におけるコレステロールまたは他のステロール類の低い条件により、ＨＭＧ−
ＣｏＡレダクターゼは活性化される。この活性化は、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡの
増大した発現を検出することによって（Ｃｈａｍｂｅｒｓ他（１９９７）、Ａｍ
Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ、６８：３２２〜７）、あるいは基質［^１４Ｃ］ＨＭ
Ｇ−ＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼによる還元の場合（米国特許第５，７
５３，６７５号を参照のこと）のように酵素活性の増大を検出することによって
検出することができる。

【０３００】 実施例 本発明をこれまで一般的に記載してきたが、本発明は、下記の実施例を参照す
ることによってより容易に理解される。下記の実施例は、本発明の特定の局面お
よび実施形態を単に例示するためにのみ示され、本発明を限定することを目的と
していない。

【０３０１】 実施例１：ステロイダルアルカロイドはヘッジホッグのシグナル変換を破壊し
得る。

【０３０２】 Ｓｈｈシグナル変換に対する作用を明らかにするために、本発明者らは、催奇
物質によって誘導されるＨＰＥが主として研究されている齧歯類、ヒツジおよび
他の哺乳動物（１４、１５、１６、２９、３９）よりも扱いやすい実験系として
ヒヨコ（３８）を選んだ。ヒヨコの胚は容易に培養および操作され、そして図２
に示されているように、明らかな線状状態（４０）への中間段階でこれらの胚を
ジェルビンに曝すことによって、ＨＰＥに特徴的な外面の奇形が誘導された（同
様の結果がシクロパミンで得られた；結果を示さず）。これらの欠陥の重症度は
、処置した胚の中で変化した。これらは、中線構造の喪失および対になった側面
構造の接近の程度によるパネルＢ〜Ｅで認められる。従って、このような中線欠
陥は、眼胞および嗅神経プロセスと同様に下顎骨プロセスおよび上顎骨プロセス
の融合をもたらし、結果的には、最もひどく影響した胚において、単眼症、およ
び融合鼻室からなる吻様構造の形成が伴う（図２Ｅ）。

【０３０３】 図２に示されているように、卵処理において、様々な欠陥が生じたが、いくつ
かの胚は、その最大試験濃度においてさえ、正常な形態を示した（５０μＭ、ジ
ェルビン５／１０およびシクロパミン２／１０、結果を示さず）。これらの作用
の変動性は、不正確な胚段階化およびこれらの疎水性化合物を均一に加えること
の困難さによると考えられる。このような変動性を減らして、催奇性化合物のＳ
ｈｈシグナル変換に対する潜在的な作用をより良好に評価するために、本発明者
らは、正確な組織段階化を可能にし、そして催奇物質のより均一な添加を可能に
する外植片アッセイを確立した（４１）。図３Ａに示されているように、脊索を
伴った内側神経板を、ヘンセン節のすぐ口部側の領域から取り出した。この段階
で、内側神経板は、床板細胞（ＨＮＦ３β）または運動ニューロン（Ｉｓｌ−１
）のマーカーをまだ発現していない（４２、４３、データを示さず）。しかし、
脊索はＳｈｈを発現している（４４、４５、データを示さず）。図３Ｂに示され
ているように、４０時間のインキュベーションを行った後、神経板はＨＮＦ３β
およびＩｓｌ−１を発現する。これらのマーカーの発現は、インビボおよびイン
ビトロの両方でＳｈｈシグナル変換に依存していることが示されている（２、４
５）。従って、これらの中線外植片は、誘導組織および標的組織の両方を含むＳ
ｈｈシグナル変換の一体型アッセイを構成する。

【０３０４】 合成催奇物質および植物由来の催奇物質がＳｈｈシグナル変換を阻止するかど
うかを明らかにするために、本発明らは、中線外植片を、様々な濃度の薬物ＡＹ
９９４４およびトリパラノールならびにステロイダルアルカロイドのシクロパミ
ンおよびジェルビンに曝した。図３Ｄ〜３Ｋに示され得るように、これらの化合
物はすべて、Ｓｈｈシグナル変換に影響を及ぼし、ＨＮＦ３発現およびＩｓｌ−
１発現の完全な喪失が十分な高濃度によって一貫して生じた（図３Ｅ、Ｇ、Ｊ、
Ｋ）。完全な阻害に必要とされる濃度に達しない数倍の濃度で、これらの催奇性
化合物はすべて、ＨＮＦ３βの発現を阻止し得るが、Ｉｓｌ−１の発現を保持し
、多くの場合、増大させる（図３Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｈ）。これらの作用はＳｈｈシグ
ナル変換の阻害と十分に一致している（下記参照）。これに対して、構造的には
関連しているが、非催奇性のステロイダルアルカロイドのトマチジン（図１、参
考文献４６を参照のこと、データを示さず）は、ジェルビンおよびシクロパミン
の阻害濃度よりも２桁高い濃度においてさえＨＮＦ３βおよびＩｓｌ−１の発現
を阻止することができない（図３Ｃ）。

【０３０５】 阻害化合物はＳｈｈプロセシングを阻止しない。

【０３０６】 中線外植片は誘導組織および応答組織の両方を含有するので、本発明らは、こ
れらの阻害化号物のシグナル産生に対する可能な作用を、シグナル応答に対する
可能な作用に対して区別することを計画した。Ｓｈｈタンパク質は、内部切断を
含み、アミノ末端産物（すべての知られているシグナル変換活性に関与するＳｈ
ｈ−Ｎｐ）をもたらす分子内プロセシング反応を受ける。この自己プロセシング
反応の最初の段階は、前駆体内のカルボキシ末端配列によって媒介されるが、切
断部位における内部再配置を引き起こして、切れやすいペプチド結合を、Ｃｙｓ
側鎖を含むチオエステルにより置換する。第２段階において、コレステロールが
、チオエステル中間体を攻撃する求核種（その３β−ＯＨ）を提供し、そしてＳ
ｈｈ−Ｎｐに対する付加物として共有結合したままにする（１１、１３）。従っ
て、自己プロセシングは、活性なシグナルを放出するために必要とされ、そして
コレステロール付加物は、それを細胞表面に結合させることによってシグナルの
組織分布を制限する（１２、１３）。

【０３０７】 ヘッジホッグタンパク質のジオゲネシス（ｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）におけるコ
レステロールのこの役割を考えた場合、これらの化合物のＳｈｈ−Ｎｐ産生に対
する作用は特に興味のある可能性である。なぜなら、ジェルビンおよびシクロパ
ミンは構造的にコレステロールと類似し（図１）、そしてＡＹ９９４４およびト
リパラノールは特異的に後期に作用するコレステロール生合成酵素を阻害する（
１７、１８、１９、２２）。これらの化合物のＳｈｈプロセシングに対する潜在
的な作用を調べるために、本発明らは、脂質欠乏血清で培養され、そしてエクジ
ソンで誘導可能な制御のもとでのＳｈｈを発現させる安定な組込型構築物を有す
るＨＫ２９３細胞を利用した（４７）。このような細胞におけるＳｈｈタンパク
質の発現は、エクジソンアナログであるムリステロンＡを投与することによって
誘導され得る。胚で認められるように、このタンパク質は効率的にプロセシング
され（図４Ａ、レーン１および２）、前駆体（Ｍ_ｒ４５ｋＤ）の蓄積はほとんど
検出できないほどである。２４時間の誘導期間中におけるジェルビン、シクロパ
ミン、トマチジン、ＡＹ９９４４またはトリパラノールの添加は、Ｓｈｈシグナ
ル変換を完全に阻害するのに必要とされる投与量よりも５倍高い投与量において
さえ、Ｓｈｈ−Ｎ_ｐ産生を損なわず、プロセシングされない前駆体の蓄積を誘導
しなかった（図４Ａ、レーン４〜１３）。これらの化合物の存在下で生成したア
ミノ末端切断産物のすべてが、培養培地ではなく、細胞溶解物において検出され
たが（データを示さず）、コレステロール修飾Ｓｈｈ−Ｎｐと同じ電気泳動移動
度を有する。これらの観測は、アミノ末端切断産物におけるステロール付加物の
存在と一致する。なぜなら、そのような付加物が存在しないことは、培地への放
出と関連し、そして低下した電気泳動移動度と関連するからである（プロセシン
グされていないアミノ末端フラグメントはＳｈｈ−Ｎと示され、プロセシングさ
れたＳｈｈ−Ｎｐと区別される；レーン８、９、１７を参照のこと）。さらに、
本発明者らもまた、これらの化合物で処理された一過性トランスフェクションＣ
ＯＳ−７細胞またはＱＴ６細胞において、Ｓｈｈプロセシングの効率またはＳｈ
ｈ−ＮＰの挙動における変化を認めることができなかった（４８）。本発明者ら
はまた、床板誘導後にジェルビンで処理されたヒヨコ胚が床板細胞内でのＳｈｈ
タンパク質の正常な先端局在化を示していることを認めた（４９）。

【０３０８】 コレステロールとのそれらの構造的類似性により、本発明者らはまた、植物化
合物のインビトロ自己プロセシング反応に対する潜在的な作用を、精製した成分
を利用して調べた。この反応で利用されたタンパク質は、ショウジョウバエＳｈ
ｈのアミノ末端コード領域の６個のコドンを除くすべてが、ヘキサヒスチジン精
製標識をコードする配列で置換されることによって得られる（１０）。得られた
２９ｋＤａのタンパク質（Ｈｉｓ６Ｈｈ−Ｃ）は、精製された形態で、コレステ
ロールに依存する様式で自己プロセシングを受け、２５ｋＤの産物をもたらす（
５０）。図５Ａに示されているように、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチ
ジンはいずれも、コレステロールの濃度よりも２７倍高い濃度においてさえ、コ
レステロールによって刺激されるこの自己プロセシング反応を阻害しない。これ
らの各植物化合物に３β−ＯＨが存在する場合（図１）、本発明者らはまた、プ
ロセシング中に求核性基を提供する際におけるコレステロールの置換がそれらに
より可能であるかを調べた。図５Ｂに示されているように、認められるほどの切
断は、コレステロールの非存在下でこれらの化合物を添加することによって刺激
されない。

【０３０９】 ＡＹ９９４４およびトリパラノールなどのコレステロール合成阻害剤はプロセ
シングを阻害しないという観測は、処置した細胞に蓄積するコレステロール生合
成前駆体（下記参照）はこの反応に関与し得る可能性をもたらす。図５Ｃは、イ
ンビトロ反応は、コレステロールの効率と類似する効率で、デスモステロール、
７−デヒドロコレステロール（７ＤＨＣ）およびラトステロールにより進行し得
ることを示している。デスモステロールおよび７ＤＨＣは、トリパラノールおよ
びＡＹ９９４４でそれぞれ処置された細胞に蓄積することが報告されている主要
な前駆体である。その一方で、炭素が３０個のコレステロール前駆体であるラノ
ステロールは、おそらくは３−ヒドロキシルに近いＣ４炭素に結合した２つのメ
チル基による立体的障害のためにこの反応に関与することができない。このイン
ビトロ反応の他の研究において、本発明者らは、立体障害のないヒドロキシルが
ステロール核での３β位に要求されることを認めたが、ステロール核における８
位炭素の側鎖あるいは二重結合の数または位置は効率に大きく影響していないと
考えられる（５１）。これらの観測から、生合成経路における炭素が２７個の中
間体はすべて、自己プロセシング反応における潜在的な付加物であり、そして末
端の合成阻害剤の存在下でのプロセシングの弱められていない効率を説明できる
ことが示唆される。従って、培養細胞におけるＳｈｈプロセシングの程度および
インビボでのその局在化はこれらの阻害化合物によって影響を受けていない（図
４）と考えられるが、本発明者らは、ステロール付加物が異なり得る可能性およ
び異常に改変されたそのようなシグナルが異なる生物学的特性を有し得る可能性
を除外することができない。

【０３１０】 阻害化合物はＳｈｈシグナル変換に対する応答に選択的に影響する。

【０３１１】 プロセシングの本発明者らの研究によって、これらの化合物のＳｈｈシグナル
産生に対する阻害作用に関する証拠が得られるので、本発明者らは、これらの化
合物が標的組織の応答に影響を及ぼすもう一方の可能性を調べた。この研究のた
めに、本発明者らは、誘導シグナルの何らかの内因性供給源を有さない中間段階
の神経板外植片を利用した（４１、図６Ａを参照のこと）。ステロール付加物を
有さない組換えＳｈｈ−Ｎタンパク質（４５、５２、５３、５４）は、背側細胞
タイプで通常発現しているＰａｘ７などの分子マーカー抑制し（５５、図６Ｂ、
Ｃを参照のこと）、そして運動ニューロンおよび床板細胞で通常発現しているＩ
ｓｌ−１およびＨＮＦ３βなどの腹側マーカーを誘導する（図６Ｄ、Ｅ）。これ
らの細胞応答は濃度依存的様式で高められ、Ｐａｘ７の抑制が、ＨＮＦ３８の誘
導に不十分なＳｈｈ−Ｎの濃度（参考文献５５、２ｎＭ、図６Ｂ、Ｃ）で認めら
れ、Ｉｓｌ−１およびＩｓｌ−１を犠牲にして生じるＨＮＦ３βの誘導に不十分
な濃度（図６Ｄにおける６．２５ｎＭのＳｈｈ−ＮではＩｓｌ−１の誘導は６Ｅ
での２５ｎＭで押さえられていることに注意すること）で認められる。

【０３１２】 催奇性化合物は、Ｐａｘ７の抑制（２ｎＭのＳｈｈ−Ｎで；図６Ｆ〜Ｉ）なら
びにＩｓｌ−１およびＨＮＦ３βの誘導（２５ｎＭのＳｈｈ−Ｎで；図６）〜Ｓ
）を完全に阻止することができる。さらに、トマチジンは、ジェルビンおよびシ
クロパミンによる完全な阻害に必要とされる濃度よりも１００２００倍高い濃度
の場合のみを除いて部分的な阻害をもたらす（図６Ｔ）。Ｓｈｈ−Ｎに対する２
４ｎＭでの応答を完全に阻害することには、２ｎＭでの応答を完全に阻止するた
めに必要とされる用量よりも２〜４倍高い用量の催奇性化合物が必要である；Ｓ
ｈｈ−Ｎに対する応答の阻害には、Ｓｈｈの濃度が高いほど、大きな薬物濃度が
必要である。別の用量依存的作用が図６Ｋ〜Ｎに認めることができる。この場合
、２５ｎＭでの応答（ＨＮＦ３βの誘導）を完全に阻害するために必要とされる
閾値に達しない２倍の薬物濃度によりＩｓｌ−１発現の保持または拡大が生じて
いる。中間的な薬物濃度でのＩｓｌ−１の類似した拡大が、中線外植片の場合に
認められた（図３Ｄ〜Ｇ）。このことは、Ｓｈｈ−Ｎによる一定レベルの刺激に
おいて、異なる度合いの経路の活性化が異なる阻害剤濃度で生じ得ることを示し
ている。

【０３１３】 これらの化合物の特異性をさらに調べるために、本発明者らは、ＢＭＰ７によ
る神経堤様表現型の誘導に対するそれらの作用を調べた。ＢＭＰ７シグナル変換
タンパク質は神経板に隣接する外胚様細胞で発現し、神経堤の誘導および背側神
経管細胞の運命において機能しているようである９５６）。内因性の横からのシ
グナルの混入を避けるために、この研究に使用された外植片は腹側神経板から採
取され、脊索および中線を除いた（図７Ａ）。ＢＭＰ７タンパク質を添加すると
、神経堤細胞に特徴的な特徴（５６）であるＨＮＫ−１表面抗原を発現する遊走
性細胞の形成を誘導した（図７Ｂ、Ｃを比較のこと）。細胞遊走およびＨＮＫ−
１の発現はいずれも、１０μＭのジェルビンの添加によって阻止されなかった（
図７Ｄ）。この濃度は、Ｓｈｈ−Ｎシグナル変換を完全にするために必要とされ
る濃度を越えている。類似する結果がトマチジンおよびシクロパミンを用いて得
られた。これらの化合物はまた、背側神経板を含有する外植片、およびＢＭＰ活
性の内因性供給源（５６）として作用する連続する上皮性外胚様からの遊走性Ｈ
ＮＫ−１陽性細胞の形成を阻害しなかった（４９）。

【０３１４】 コレステロールホメオスタシスに対する薬物の作用。

【０３１５】 これまでの報告により、トリパラノールおよびＡＹ９９４４は、コレステロー
ル前駆体（主として、デスモステロールおよび７−デヒコレステロール（７ＤＨ
Ｃ））の蓄積が、コレステロール生合成の後期で作用する酵素（それぞれ、デス
モステロールΔ２４レダクターゼおよび７ＤＨＣΔ７レダクターゼ；１７、１８
、１９、２２）を特異的に阻害することによって生じることが示されている。さ
らに、ジェルビンの予備的な分析によって、コレステロール生合成に対する作用
もまた明らかにされた（３０）。これらの化合物のヒト初代リンパ芽球培養物に
対する作用を直接比較すること（５７）によって、トマチジンを含むこれらはす
べて、コレステロールレベルの相対的な減少を引き起こし、そして他のステロー
ル類のレベルを増大させていることが明らかにされた（表Ｉ、参考文献５８）。

【０３１６】 表Ｉ。催奇性化合物は培養細胞でのコレステロールホメオスタシスを破壊する
。コレステロール生合成は、催奇性化合物およびトマチジンの存在下で培養され
た初代ヒトリンパ芽球において阻害される（５８）。これらの培養物から得られ
るステロール特性（５７）によって、コレステロールの、炭素が２７個、２８個
および２９個の多数のステロール前駆体が蓄積していることが明らかにされる（
５９、６０）。肝ガン細胞でのＰＭ標識された［３Ｈ］コレステロールのエステ
ル化もまた、これらの化合物のすべてによって阻害される（６３）。

【０３１７】

【表１】 ステロール類の蓄積には、主として、コレステロール生合成経路の明らかにさ
れた中間体、またはジオシンセティック（ｇｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）酵素のこ
れらの中間体に対する作用により生成し得る非常に関連する化学種が含まれる（
５９）。トマチジンは、比較的高レベルの異常なステロール類が蓄積するととも
に（６０）、この一般則に対する例外であると考えられる。

【０３１８】 コレステロール生合成前駆体の蓄積と共役したコレステロールレベルの減少は
、コレステロール生合成の２型阻害剤と呼ばれている一群の化合物について認め
られる作用である（６１、６２）。このような化合物は、原形質膜（ＰＭ）と小
胞体（ＥＲ）との間でのステロール流束を阻害することによって作用しているこ
とが考えられる。コレステロール生合成酵素はＥＲに局在化し、コレステロール
のステロール前駆体はＰＭにおいて非常に濃縮されているので、輸送におけるそ
のような阻止はコレステロールレベルの全体的な減少をもたらす。本発明者らは
、外部から加えられた３Ｈ標識コレステロールのエステル化（ＰＭコレステロー
ルのＥＲへの輸送を必要とするプロセス）に対する合成化合物および植物化合物
の作用を測定した（６３）。本発明者らは、これらの化合物について２５〜７５
％の範囲にわたるレベルのエステル化の阻害を認めた。ＡＹ９９４４のステロー
ル輸送に対する作用が以前に報告されている（２３）。しかし、これは、本発明
者らがエステル化の阻害において調べた化合物の最も小さな活性である。従って
、本発明者らのデータは、多数のコレステロール生合成前駆体の一般的な蓄積と
一致して、輸送の阻害はステロール特性に対するこれらのすべての化合物の作用
における１つの要因であり得ることを示唆している。しかし、さらに、ＡＹ９９
４４およびトリパラノールは、７ＤＨＣΔ７レダクターゼ酵素およびデスモステ
ロールΔ２４レダクターゼ酵素に対するこれらの化合物のよく知られた作用と一
致して、それぞれ、７ＤＨＣおよびデスモステロールの高レベルの蓄積を引き起
こす。

【０３１９】 考察 コレステロール生合成の末端阻害剤の催奇性作用は知られており、３０年以上
にわたって研究されている（１４、１５）。同様に、シクロパミンおよびジェル
ビンは、ある種の植物Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍの催奇性作
用に関与する植物化合物として約３０年前に同定された（２８、２９）。これら
の化合物の最も劇的な催奇性作用は、単眼症および重篤な全前脳症（ＨＰＥ）の
他の特徴の誘導である；ＨＰＥはネズミおよびヒトの遺伝子座での変異によって
も生じるという最近の発見によって、これらの化合物がＳｈｈシグナル変換経路
を阻止するように作用し得る可能性が示唆された。本発明者らの研究により、ヒ
ヨコの胚におけるこれらの化合部のＨＰＥ誘導性が確認された。本発明者らは、
これらの催奇性作用の初期の分子的相関をさらに調べ、これらの化合物がヒヨコ
の神経板外植片における腹側細胞タイプのＳｈｈタンパク質による誘導を阻止す
ることを明らかにした。

【０３２０】 コレステロール生合成に対するこれらの催奇物質の阻害作用（１７、１８、１
９、２２、３０、上記参照）にもかかわらず、本発明者らは、これらの化合物は
いずれも、培養細胞におけるＳｈｈプロセシングを妨げないようであり、そして
これらの植物アルカロイドは、精製した成分を利用するインビトロでのＨｈタン
パク質の自己プロセシング反応に関与もせず、阻害もしないことを見出した。そ
の代わり、外部から加えられたＳｈｈ−Ｎが催奇性化合物の存在下で腹側細胞タ
イプを誘導しないことによって示されているように、影響を及ぼすのはＳｈｈシ
グナル変換に対する応答である。さらに、外部から加えられたＳｈｈ−Ｎタンパ
ク質は神経板外植片における内因性Ｓｈｈの遺伝子発現を誘導し得る（６４、６
５）が、本発明者らは、床板細胞の誘導が起こらず、従って、内因性Ｓｈｈの発
現をもたらさない濃度である２ｎＭのＳｈｈ−Ｎにおいて、これらの催奇物質に
よる応答の完全な阻害を明らかにした。これらの化合物の阻害作用は、下記から
明らかなように用量依存的である：（１）Ｉｓｌ−１中間体の運命は、完全な阻
害に必要とされる濃度よりも低い中間の阻害剤濃度で維持され、または拡大さえ
されること；および（２）従って、Ｓｈｈ−Ｎタンパク質の増大したレベルに対
する応答を阻害するためには、より高濃度の催奇性化合物が必要とされること。
これらの作用の特異性によってさらに示されることは、これらの化合物は、遊走
、Ｐａｘ７またはＨＮＫ−１の発現、あるいはＳｈｈシグナル変換に対する応答
を完全に阻止する濃度でのＢＭＰ７などの他の誘導シグナルに対する応答などの
細胞挙動を阻止できないことである。

【０３２１】 ステロール合成およびステロール輸送の本発明者らの研究は、これらの化合物
はコレステロール生合成の２型阻害剤として作用していることを示唆している（
６１）。しかし、いくつかの理由により、コレステロールレベルの単純な減少は
、これらの化合物のＳｈｈシグナル変換に対する作用を説明することができない
ようである。最初に、非催奇性化合物であるトマチジンもまた、コレステロール
生合成に対する強力な阻害作用を示す。第２に、外植片におけるＳｈｈシグナル
変換は、デノボでのコレステロール生合成を阻害するヒドロキシステロールであ
る２５−ヒドロキシコレステロールによって阻害されない（６６）。本発明者ら
はまた、薬物処理した細胞内に蓄積し得る特異的なステロール前駆体に対する阻
害的役割を除外し得る。なぜなら、２５−ヒドロキシコレステロールを阻害化合
物とともに添加することによって、ステロール前駆体の合成がなくなるはずであ
り、Ｓｈｈシグナル変換に対する応答能が依然として回復しないからである（６
７）。コレステロールの単純な減少に対する別の機構は、細胞内輸送の破壊であ
ると考えられる。

【０３２２】 本発明者らは、トリパラノール、ジェルビンおよびシクロパミンが、２型阻害
剤としてそれらが分類されることと一致して、ＰＭコレステロールのエステル化
の強力な阻害剤であることもまた明らかにした。Ｓｈｈシグナル変換を阻害する
際の薬物作用の機構としての輸送破壊と一致して、本発明者らは、いくつかの他
の以前に特徴づけられた２型化合物もまた外植片におけるＳｈｈシグナル変換に
対する応答を阻害し得ることを見出した（６８）。しかし、トマチジンもまたエ
ステル化を阻止する。このことは、この輸送経路の一般的な阻害はＳｈｈ応答に
対する阻害作用にとって十分でないことを示している。本発明者らは、現在、こ
の経路が、トマチジンおよび催奇性化合物によって示差的に影響を受ける多数の
工程を含む可能性、およびＳｈｈ応答に必須でないそのような工程のみがトマチ
ジンによる影響を受ける可能性を検討している。トマチジンで処理された細胞に
蓄積する異常なステロール類は、細胞内ステロール輸送に対するトマチジンのそ
のような示差的な作用と一致して、ペルオキシソームのステロール代謝と関連し
ている（６０）。

【０３２３】 コレステロールホメオスタシスに対するこれらの薬物作用を考慮すれば、Ｓｈ
ｈシグナル変換経路の重要な調節因子であるＰｔｃにおけるステロール感知ドメ
イン（ＳＳＤ）の存在に注目することは興味深いことである（３３）。Ｐｔｃの
ＳＳＤは、最初に、Ｃ型ニーマン−ピック病（ＮＰ−Ｃ）遺伝子に対する類似性
領域として検出された（３１、３２）。ＰｔｃとＮＰ−Ｃタンパク質との類似性
は、Ｐｔｃの１２個の提案されている膜貫通領域のすべてを含むように、ＳＳＤ
の５つの膜貫通領域にまたがって広がっている。この配列相同性の意味は不明で
あり、ＮＰ−ＣにおけるＳＳＤの役割は明らかにされていないが、このタンパク
質は、細胞内移動を調節することが提案されており、その機能喪失はリソソーム
のコレステロール蓄積をもたらす（６９）。他のタンパク質のＳＳＤは、高レベ
ルおよび低レベルの細胞内ステロールに対して示唆的な応答をもたらす。従って
、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ酵素は、ステロール濃度の増加とともに、安定性を
３倍〜５倍低下させる。この挙動はＳＳＤの存在に依存している。ＳＣＡＰ調節
因子タンパク質は、（高濃度ではなく）低いステロール濃度で、Ｓ２Ｐメタロプ
ロテアーゼの活性を刺激し、ＳＲＥＢＰ転写因子の切断および活性化をもたらす
。

【０３２４】 ２型コレステロール合成阻害剤の調べられた阻害剤は、ＨＭＧＣｏＡレダクタ
ーゼの活性を増大させて、ＳＲＥＢＰの切断を刺激することが考えられる。これ
らの２つのタンパク質がＥＲに局在化していることを考えれば、この作用に対し
て考えられる機構は、２型化合物によるＰＭからＥＲへのステロール輸送の破壊
により、全体的な細胞ステロール類のより高い濃度にもかかわらず、これらのＥ
Ｒタンパク質における「低コレステロール」状態が誘導されることである。この
場合、研究された催奇性化合物はすべて、コレステロール合成およびコレステロ
ール輸送に影響を及ぼしている。従って、そのような化合物は、細胞内画分にお
けるステロールの正常な分布を変化させていることが考えられる。Ｐｔｃの機能
が特定の画分におけるステロール濃度に大きく依存している場合、そのような画
分における歪んだステロール分布は、Ｐｔｃの機能を、そのＳＳＤを介して乱す
ように作用し得る。もう１つの可能性は、Ｓｈｈシグナル変換におけるＰｔｃの
機能は、関連するＮＰ−Ｃタンパク質について提唱されているように、細胞内輸
送の調節を含むことである。これが正しいとすれば、これらの催奇性化合物によ
って生じる輸送の乱れは、Ｓｈｈシグナル変換を阻害するような様式でＰｔｃの
輸送機能に影響を及ぼし得る。

【０３２５】 実施例１の参考文献 １．Ｍ．Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ、Ａ．Ｂｒｏｏｋ、Ａ．Ｐ．ＭｃＭａｈｏ
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【０３３９】 １５．Ｃ．Ｒｏｕｘ、Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．１６０、１３５３〜１３５７
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【０３４０】 １６．Ｄ．Ｂ．Ｄｅｈａｒｔ、Ｌ．Ｌａｎｏｕｅ、Ｇ．Ｓ．Ｔｉｎｉｔ、Ｋ．Ｋ
．Ｓｕｌｉｋ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．６８、３２８〜３３７（１９９
７）。

【０３４１】 １７．Ｍ．Ｋｒａｍｌ、Ｊ．Ｆ．Ｂａｇｌｉ、Ｄ．Ｄｖｏｒｎｉｋ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．１５、４５５〜４５
７（１９６４）。

【０３４２】 １８．Ｊ．Ａｖｉｇａｎ、Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、Ｈ．Ｅ．Ｖｒｏｍａｎ、Ｍ
．Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｅ．Ｍｏｓｅｔｔｉｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
３５、３１２３〜３１２６（１９６０）。

【０３４３】 １９．Ｒ．Ｂ．Ｃｌａｙｔｏｎ、Ａ．Ｎ．Ｎｅｌｓｏｎ、Ｉ．Ｄ．Ｆｒａｎｔｚ
Ｊｒ．、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４、１６６〜１７８（１９６３）。

【０３４４】 ２０．Ｊ．Ａｕｆｅｎａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｐｉｌｌ、Ｋ．Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒ、Ｆ
．Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｒｅｓ．１７、６１２〜６
１３（１９８６）。

【０３４５】 ２１．Ｊ．Ａｕｆｅｎａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｐｉｌｌ、Ｆ．Ｈ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｋ
．Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５、９１１〜
９１６（１９８６）。

【０３４６】 ２２．Ｇ．Ｐｏｐｊａｋ、Ａ．Ｍｅｅｎｅａｎ、Ｅ．Ｊ．Ｐａｒｉｓｈ、Ｗ．Ｄ
．Ｎｅｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、６２３０〜６２３８（１９８９）
。

【０３４７】 ２３．Ｈ．Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖｅ．１３、１１５〜１２０
（１９９１）。

【０３４８】 ２４．Ｒ．Ｉ．Ｋｅｌｌｅｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｏｆ Ｍｅｄ．Ｇｅｎ．６６、４７
８〜４８４（１９９６）。

【０３４９】 ２５．Ｇ．Ｓ．Ｔｉｎｔ他、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３０、１０７〜１１３（１９９４）。

【０３５０】 ２６．Ｔ．Ｅ．Ｗｉｌｌｎｏｗ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、９３、８４６０〜８４６４（１９９６）。

【０３５１】 ２７．Ｓ．Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ、Ｄ．Ａ．Ｃｈａｐｐｅｌｌ、Ｋ．Ｍ．Ａｒｇ
ｒａｖｅｓ、Ｄ．Ｋ．Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ、Ｗ．Ｓ．Ａｒｇｒａｖｅｓ、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１９４１７〜１９４２１（１９９５）。

【０３５２】 ２８．Ｗ．Ｂｉｎｎｓ、Ｌ．Ｆ．Ｊａｍｅｓ、Ｊ．Ｌ．Ｓｈｕｐｅ、Ｇ．Ｅｖｅ
ｒｅｔｔ、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２４、１１６４〜１１７４（１９６３）
。

【０３５３】 ２９．Ｒ．Ｆ．Ｋｅｅｌｅｒ、Ｗ．Ｂｉｎｎｓ、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ、１、５
〜１０（１９６８）。

【０３５４】 ３０．Ｐ．Ａ．Ｂｅａｃｈｙ他、ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６
２、印刷中（１９９７）。

【０３５５】 ３１．Ｅ．Ｄ．Ｃａｒｓｔｅａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、２２８〜２３１（
１９９７）。

【０３５６】 ３２．Ｓ．Ｋ．Ｌｏｆｔｕｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、２３２〜２３５（１
９７７）。

【０３５７】 ３３．Ｌ．Ｖ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｌ．Ｍｉｌｅｎｋｏｖｉｃ、Ｋ．Ｍ．Ｈｉｇ
ｇｉｎｓ、Ｍ．Ｐ．Ｓｃｏｔｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、１１０９〜１１１３
（１９９７）。

【０３５８】 ３４．Ｈ．Ｋｕｍａｇａｉ、Ｋ．Ｔ．Ｃｈｕｎ、Ｒ．Ｄ．Ｓｉｍｏｎｉ、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１９１０７〜１９１１３（１９９５）。

【０３５９】 ３５．Ｇ．Ｇｉｌ、Ｊ．Ｒ．Ｆａｕｓｔ、Ｄ．Ｊ．Ｃｈｉｎ、Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄ
ｓｔｉｅｎ、Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ、Ｃｅｌｌ、４１、２４９〜２５８（１９８５
）。

【０３６０】 ３６．Ｘ．Ｈｕｓ、Ａ．Ｎｏｈｔｕｒｆｆｔ、Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｍ
．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ、Ｃｅｌｌ、８７、４１５〜４２６（１９９６）。

【０３６１】 ３７．Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｉｅｎ、Ｃｅｌｌ、８９、３
３１〜３４０（１９９７）。

【０３６２】 ３８．Ｍ．Ｍ．Ｂｒｙｄｅｎ、Ｃ．Ｐｅｒｒｙ、Ｒ．Ｆ．Ｋｅｅｌｅｒ、Ｔｅｒ
ａｔｏｌｏｇｙ、８、１８〜２８（１９７３）。

【０３６３】 ３９．Ｍ．Ｌ．Ｏｍｎｅｌｌ、Ｆ．Ｒ．Ｐ．Ｓｉｍ、Ｒ．Ｆ．Ｋｅｅｌｅｒ、Ｌ
．Ｃ．Ｈａｒｎｅ、Ｋ．Ｗ．Ｂｒｏｗｎ、Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ、４２、１０５
〜１１９（１９９０）。

【０３６４】 ４０．ヒヨコ受精卵（白色レグホン）を回転トレーに入れて、３７．５℃の加湿
孵卵器に１４時間置いた。卵の気室部に穴を開けて、２５０μｌの超音波処理し
た１ｍｇ／ｍｌジェルビン溶液（ライボビッツＬ１５培地、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
）を殻膜下に加えた。穴にテープを貼り、さらに４日間、卵をインキュベーショ
ンした。胚をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）中で解剖した。頭
部を胴から心臓の上部境界部で除き、３％グルタルアルデヒド（ＥＭグレード、
Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（
Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、３ｍＭのＣａＣｌ_２（ｐＨ７．４）中
、４℃で一晩固定した。０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で洗浄し
て、２％四酸化オスミウム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、０．１Ｍ
カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中に２時間置き、水で洗浄した。次いで、
サンプルを、５０％、７０％、９０％および１００％のエタノールで順次脱水し
た。サンプルの液体ＣＯ_２での臨界点乾燥（ＣＰＤモデル１０、Ｐｏｌａｒｏｎ
）を行い、金−パラジウムでのスパッタリングコーティング（Ｄｅｎｔｏｎ Ｄ
ｅｓｋ ＩＩユニット）を行い、２０ｋＶで操作されたＡｍｒａｙ１８１０ＳＥ
Ｍで観察した。

【０３６５】 ４１．ハンバーガーおよびハミルトン段階９〜１０（８〜１０体節）の胚をすべ
ての外植片アッセイに使用した。解剖をライボビッツＬ１５培地（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）中で行った。ヘンセン節のすぐ口部側にあり、最終体節の十分な尾部側
にある中線組織を細いはさみで取り出した。神経外胚様を側板中胚様から分離し
て、ジスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、グレードＩＩ、２
．４Ｕ／ｍｌ）で内胚様を処理し、次いでＬ１５で洗浄した。中線外植片、中間
神経板外植片および背側神経板外植片を、図３Ａ、図６Ａおよび図７Ａに示され
ているようにタングステン針でさらに切開した。切開した組織をチャンバー型カ
バーガラスに移して、１Ｘ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および２４
ｍＭのＮａＨ_２ＣＯ_３（最終ｐＨ７．４〜７．６）を含有する１滴のコラーゲン
（ビトロゲン１００、Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）に入れ、（ＣＯ_２の非存在下）３７．５℃に３０分間加温し
てゲル化させた。外植片を、Ｎ−２補充物（１Ｘ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）ならび
に１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンを
含有する、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を加えた４００μｌのＦ１２栄養
培地（ハム）において、５％ＣＯ_２、３７℃の加湿インキュベーターで培養した
。ＡＹ９９４４、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミンおよびトマチジン
（水溶性のＡＹ９９４４を除き、すべて、９５％エタノールの１０ｍＭストック
溶液からである）、精製されたＳｈｈ−ＮおよびＢＭＰ７を培養開始時に加えた
。すべての外植片を４０〜４８時間培養したが、Ｐａｘ７抑制についてアッセイ
される中間神経板外植片は２０〜２２時間培養した。インキュベーション期間が
終了したとき、外植片を、４．０％ホルムアルデヒド（ＥＭグレード、Ｐｏｌｙ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を含むＰＢＳ中、４℃で１時間固定して、ＰＢＳ
で洗浄し、そして二次抗体を用いて室温で２時間染色した。ウサギ抗ラットＨＮ
Ｆ３β（Ｋ２）を１：２０００に、マウス抗ＩＳＬ−１（４０．２Ｄ６）を１：
１０００に、マウス抗ｐａｘ７を１：１０に、マウス抗ラットＨＮＫ−１／Ｎ−
ＣＡＭ（Ｓｉｇｍａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：１０００に、ＦＩＴＣ結
合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：１００に、そしてＬＲＳＣ結合ロバ抗
ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：３００にＰＢＴＳで希釈した。外植片を、開口
数が１．４のプラナポ対物鏡を使用するオリンパスＩＸ６０倒立顕微鏡を用いて
調べた。像を、４８８ｎｍおよび５６８ｎｍで励起するクリプトン−アルゴンレ
ーザーを有し、４５０〜５５０ｎｍおよび５５０〜６５０ｎｍでの発光を伴う共
焦点レーザー走査顕微鏡により、そしてＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉ
ｎｃ．社製プラットホームでのＩｎｔｅｒｖｉｓｓｉｏｎソフトウエアを有する
Ｏｚを利用することによって得た。

【０３６６】 ４２．Ａ．Ｒｕｉｚ Ｉ Ａｌｔａｂａ、Ｍ．Ｐｌａｃｚｅｋ、Ｍ．Ｂａｌｄａ
ｓｓａｒｅ、Ｊ．Ｄｏｄｄ、Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７
０、２９９〜３１３（１９９５）。

【０３６７】 ４３．Ｊ．Ｅｒｉｃｓｏｎ、Ｓ．Ｔｈｏｒ、Ｔ．Ｅｄｌｕｎｄ、Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓ
ｓｅｌｌ、Ｔ．Ｙａｍａｄａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１５５５〜１５６０（
１９９２）。

【０３６８】 ４４．Ｙ．Ｅｃｈｅｌａｒｄ他、Ｃｅｌｌ、７５、１４１７〜１４３０（１９９
３）。

【０３６９】 ４５．Ｈ．Ｒｏｅｌｉｎｋ他、Ｃｅｌｌ、８１、４４５〜４５５（１９９５）。

【０３７０】 ４６．Ｗ．Ｇａｆｆｉｅｌｄ、Ｒ．Ｆ．Ｋｅｅｌｅｒ、Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ Ｔ
ｏｘｉｎｓ、５、２５〜３８（１９９６）。

【０３７１】 ４７．エクジソン誘導の哺乳動物発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用
してＳｈｈで安定的にトランスフェクションされたＨＫ２９３細胞を、６ウエル
培養プレート（Ｆｌａｃｏｎ、ウエル面積９．６ｃｍ^２）内のダルベッコ改変イ
ーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４００
μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１
００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３５０μ
ｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３０〜４０％のコンフルエンス
で置床して３７℃で生育させた。翌日、培地を、１０％の脱脂質化血清（Ｋ．Ｍ
．Ｇｉｂｓｏｎ他、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１,５１５（１９９０））およ
び１％のＩＴＳ（Ｓｉｇｍａ）、そしてそれ以外は上記と同じものを含有する培
地に変えた。２４時間後、細胞を、１μＭのムリステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）の添加によりＳｈｈを発現するように誘導した。ＡＹ９９４４、トリパラ
ノール、ジェルビン、シクロパミンおよびトマチジン（水溶性のＡＹ９９４４を
除き、すべて、９５％エタノールの１０ｍＭストック溶液からである）を誘導時
に培養物に加えた。コントロール細胞には、５０μＭステロイダルアルカロイド
処理における最大エタノール濃度に等しい０．４７５％のエタノールを与えた。
さらに２４時間後、培養上清を除き、細胞を、プレート内で、３ＸＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ細胞溶解緩衝液（３％ＳＤＳ）中で溶解し、水で２倍に希釈して煮沸した。
溶解物サンプル（および別の実験では、上清サンプル、これに関するデータは示
されていない）を分析のためにＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲルに負荷し
、Ｓｈｈ−Ｎおよびアクチンに対する一次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および西洋
ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で免疫ブロットし、そして発
光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。

【０３７２】 ４８．一過性トランスフェクション細胞におけるＳｈｈプロセシングは非効率で
あり、５０〜８０％のＳｈｈタンパク質がプロセシングされない前駆体として蓄
積する。このような状況のもとでさえ、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチ
ジンのＳｈｈプロセシング効率に対する作用は全く認められなかった。

【０３７３】 ４９．未発表データ ５０．Ｈｈ自己プロセシングのインビトロ研究には、ショウジョウバエＨｈタン
パク質の細菌発現誘導体を使用した（Ｐｏｒｔｅｒ ９６Ａ）。反応を記載（Ｐ
ｏｒｔｅｒ ９６Ｂ）に従って行ったが、ステロール類およびステロイダルアル
カロイド類をエタノールストックまたはクロロホルムストックから乾燥させ、そ
して０．２％のトリトンＸ−１００溶液に浴型超音波器で再懸濁して、反応混合
物に加えた。

【０３７４】 ５１．コレステロールに対して同様な効率で反応に関与する他のステロールは、
β−シトステロール、５−アンドロステン−３β−オール、エルゴステロール、
４β−ヒドロキシコレステロール、１９−ヒドロキシコレステロール、２０α−
ヒドロキシコレステロール、２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ
）−ヒドロキシコレステロールおよび２５−ヒドロキシコレステロールである。
エピコレステロール、酢酸コレステロール、α−エクジソン、２０−ＯＨエクジ
ソンおよびチオコレステロールは反応に関与することができない。

【０３７５】 ５２．Ｃ．−Ｍ．Ｆａｎ、Ｍ．Ｔｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ、Ｃｅｌｌ、７
９、１１７５〜１１８６（１９９４）。

【０３７６】 ５３．Ｍ．Ｈｙｎｅｓ他、Ｎｅｕｒｏｎ、１５、３５〜４４（１９９５）。

【０３７７】 ５４．Ａ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ
、５，７９１〜７９６（１９９５）。

【０３７８】 ５５．Ｊ．Ｅｒｉｃｓｏｎ、Ｓ．Ｍｏｒｔｏｎ、Ａ．Ｋａｗａｋａｍｉ、Ｈ．Ｒ
ｏｅｌｉｎｋ、Ｔ．Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｃｅｌｌ、８７、６６１〜６７３（１
９９６）。

【０３７９】 ５６．Ｋ．Ｆ．Ｌｉｅｍ、Ｇ．Ｔｒｅｍｍｌ、Ｈ．Ｒｏｅｌｉｎｋ、Ｔ．Ｍ．Ｊ
ｅｓｓｅｌｌ、Ｃｅｌｌ、８２，９６９〜９７９（１９９５）。

【０３８０】 ５７．集めたヒトリンパ芽球を無血清ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、次いで３５
ｍｍマイクロウエル内の１５％脱脂質化ＦＢＳ（Ｇｉｂｓｏｎ ９０）含有ＲＰ
ＭＩ−１６４０に置床して、３７℃、５％ＣＯ_２加湿雰囲気下で１２時間培養し
た。次いで、ＡＹ９９４４、トリパラノール、ジェルビン、シクロパミンまたは
トマチジンを加えて、細胞を５日間インキュベーションした。その後、中性ステ
ロール類を抽出して、Ｒ．Ｉ．Ｋｅｌｌｅｙ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、
２３６、４５（１９９５））の記載に従って分析した。簡単に記載すると、ペレ
ット化した細胞を、６０℃で、４％（ｗ／ｖ）ＫＯＨを含み、キャリアとしてエ
ピコプロスタノールを含む９０％エタノール中で加水分解し、等量の水と混合し
て、ヘキサンで３回抽出した。ヘキサン抽出物を窒素下で乾固し、そしてビスト
リメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用い
てピリジン中で誘導体化して、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）５８９
０Ａのスプリットレス注入ポート、０．２ｍｍＸ２５ｍのＨＰ−１メチルシリコ
ーン（０．３３μｍ液相）キャピラリーカラム、および７０ｅＶの電子衝撃モー
ドで操作され、２００℃のイオン源温度のＨＰ５９７０Ａ質量選択的検出器を利
用して、選択的なイオンをモニターするガスクロマトグラフィー／質量分析法（
ＳＩＭ−ＧＣ／ＭＳ）によって分析した。

【０３８１】 ５８．ステロール組成に対するそれらの作用を明らかにするために、ＡＹ９９４
４およびトリパラノールを０．５μＭで使用し、ジェルビン、シクロパミンおよ
びトマチジンを１０μＭで使用した。用量がこれらよりも低いほど、正常なステ
ロール特性が得られた；これらよりも大きな用量はコレステロール前駆体の相対
的レベルを増大したが、このアッセイの５日間のインキュベーション期間中の細
胞生育を低下させた。

【０３８２】 ５９．ステロール１ａ、１ｃ〜１ｇ、２ａ、２ｂ、３ａおよび３ｂはすべて、正
常なコレステロール生合成の中間体であり、１ｂは１ａに由来すると考えられて
いる（Ｇ．Ｓａｌｅｎ他、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３７、１１６９（１９９６
９））。

【０３８３】 ６０．ステロール１ｈは、ペルオキシソームのステロール合成に関与し、トマチ
ジンで処理された細胞において特に顕著である。ステロール４は、トマチジンで
処理された正常細胞においてのみ認められるが、ペルオキシソーム類を有さない
ツェルウェガー症候群患者のトマチジン処理細胞では認められない。ステロール
４は、その構造がまだ完全に解明されていないジヒドロキシ−ケトステロールと
考えられる。

【０３８４】 ６１．Ｙ．Ｌａｎｇｅ、Ｔ．Ｌ．Ｓｔｅｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９
、２９３７１〜２９３７４（１９９４）。

【０３８５】 ６２．Ｙ．Ｌａｎｇｅ、Ｔ．Ｌ．Ｓｔｅｃｋ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．６、２０５〜２０８（１９９６）。

【０３８６】 ６３．肝ガン細胞における原形質膜［^３Ｈ］コレステロールのエステル化をＬａ
ｎｇｅおよびＳｔｅｃｋに従ってアッセイした。簡単に記載すると、ＡＨ２２肝
ガン細胞を、２５ｃｍ^２フラスコにおいて約８９〜９０％の混合率にまで、ＤＭ
ＥＭ、１０％ＦＢＳ中、３７℃の条件で培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次い
で１．３８μＣｉ［^３Ｈ］コレステロール（３．１７ｘ１０^−５ｍｍｏｌコレス
テロール）を用いて、ＰＢＳ中、３７℃で１０分間標識した。［^３Ｈ］コレステ
ロールを、２．５％のトリトンＷＲ−１３３９、２．５ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ７
．５）および０．１２５Ｍのスクロースの攪拌した溶液に入れた。次いで、細胞
を０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで洗浄して、１．
５時間、３７℃で、ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ中、ＡＹ９９４４、トリパラノール
、ジェルビン、シクロパミンまたはトマチジンの存在下または非存在下でインキ
ュベーションした。細胞をトリプシンで剥がし、洗浄して、１ｍｌのＰＢＳに懸
濁した。次いで、ステロール類を２．５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：
１）で抽出して、高速真空濃縮器で乾固し、そして５０μｌのクロロホルムに再
懸濁して、シリカゲルＧがコーティングされたＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ）に
スポットした。コレステリルエステル類およびコレステロールをヘプタン：エー
テル：酢酸溶媒（２０：５：１）で分画化して乾固し、そしてＩ_２蒸気で可視化
して、かき取り、水性シンチレーション計数カクテル（Ｅｃｏｎｏ−Ｓａｆｅ、
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ
．）中で直接計数した。

【０３８７】 ６４．Ｅ．Ｍａｒｔｉ、Ｄ．Ａ．Ｂｕｍｃｒｏｔ、Ｒ．Ｔａｋａｄａ、Ａ．Ｐ．
ＭｃＭａｈｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３７５、３２２〜３２５（１９９５）。

【０３８８】 ６５．Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．Ｊｅｓｓｅｌｌ、私信 ６６．２ｎＭまたは２５ｎＭのＳｈｈ−Ｎによる処置に対する外植片の応答はい
ずれも、２５μＭの２５−ＯＨコレステロールを加えることによって影響を受け
なかった。２５−ＯＨコレステロールは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの強力な
阻害剤であり、濃縮状態で、ヒヨコ胚および培養細胞システムにおけるデノボで
のコレステロール合成を阻止する（データ不明；Ｓ．Ｃ．ＭｉｌｌｅｒおよびＧ
．Ｍｅｌｎｙｋｏｖｙｃｈ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２５、９９１（１９８４
）；Ｊ．Ｊ．Ｂｅｌｌ、Ｔ．Ｅ．ＳａｒｇｅａｎｔおよびＪ．Ａ．Ｗａｔｓｏｎ
、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２５１、１７４５（１９７６）。

【０３８９】 ６７．２５μＭの２５−ヒドロキシコレステロールを外植片培養物に加えること
によって、どの催奇性化合物の阻害作用も逆転しなかった。

【０３９０】 ６８．２型コレステロール合成阻害剤は、投与濃度で、ＢＭＰ７：Ｕ１８６６６
Ａ０．２５μＭ、クロロキン５０μＭ、イミプラミン７５μＭ、プロゲステロン
２０μＭによるシグナル変換にを発生することなく、中間神経板外植片の２５μ
ＭのＳｈｈ−Ｎに対する応答を阻止する。

【０３９１】 ６９．Ｐ．Ｇ．Ｐｅｎｔｃｈｅｖ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１２２５、２３５〜２４３（１９９４）。

【０３９２】 実施例２：毛包形態形成時におけるＳｏｎｉｃヘッジホッグの主な役割 毛包は、上皮幹細胞の供給源であり、いくつかのタイプの皮膚腫瘍の発生源で
ある。濾胞が一連の誘導性組織相互作用によって生じることは明らかであるが、
このプロセスを司るシグナル変換分子の同定は依然として皮膚生物学における主
要な課題である。本研究において、本発明者らは、毛包発達時における分泌型モ
ルフォゲンＳｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）の必須的な役割を報告している。
表皮プラコードおよび会合した皮膚縮合体を含む毛胚が、コントールおよびＳｈ
ｈ−／−の両方の胚で検出されたが、濾胞発達のその後の段階を抜ける進行は変
異皮膚では阻止されていた。ＧｌｉｌおよびＰｔｃ１の発現はＳｈｈ−／−の皮
膚縮合体において減少しており、それらは毛包乳頭にまで発達しなかった。この
ことは、隣接する間充織はプラコードを発生源とするＳｈｈの重要な標的である
ことを示している。毛包形態形成の完全な阻害にもかかわらず、後期の濾胞分化
マーカーが、Ｓｈｈ−／−の皮膚移植片において、同様にＳｈｈシグナル変換を
阻止するためにシクロパミンで処理された培養触毛外植片において検出された。
本発明者らの発見により、毛胚期から先の段階に発達が正常に進行するためにＳ
ｈｈが必要であるという毛包形態形成時のＳｈｈの本質的な役割が明らかにされ
る。

【０３９３】 緒言 器官形成の初期段階は、隣接する上皮における間充織縮合体および限局的な細
胞塊の出現、すなわち、プラコードの出現によって特徴づけられる。このプロセ
スは、上皮細胞集団と間充織細胞集団との間を移動する一連の誘導シグナルによ
って完了するまで続き、最終的には成体構造をもたらす（Ｇｕｒｄｏｎ（１９９
２）；Ｔｈｅｓｌｅｆｆ他（１９９５）における総説）。触毛および毛包などの
皮膚付属物において、組織組換えの詳細な研究により、少なくとも３つの形態形
成シグナルの存在が明らかにされている：胚の真皮は、上に重なる外胚様にプラ
コード形成を開始するように指示する；プラコードは、毛包誘発成分によって皮
膚縮合体を生じさせるシグナルを発する；次に、縮合体がシグナルを発生期の濾
胞ケラチノサイトに送り、その増殖、発達時における真皮への下方成長、および
成熟した濾胞を形成するための再組織化を刺激する（Ｓｅｎｇｅｌ（１９７６）
；Ｈａｒｄｙ（１９９２）における総説）。濾胞の上皮成分および間充織成分は
、成熟した毛球のごく近くに留まり、その場所で、皮膚乳頭は、毛包の毛幹およ
び内部毛根鞘における少なくとも６つの表現型的に異なる上皮細胞タイプを生じ
させるマトリックス細胞によって囲まれている。生後、濾胞上皮は、活発な成長
（成長期）、その後の退行（退行期）および不活性（休止期）の期間による周期
を繰り返す（Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓ（１９９７）における総説）。休止期から成
長期に移行させる形態形成プログラムは、胚発生中の濾胞発達との類似性を有す
る。このことにより、この機構は、成体動物における器官形成の特定の局面を研
究するための独特のモデルになる。非常に多数の遺伝子が毛包発達および毛包周
期の様々な段階で関与している（ＲｏｓｅｎｑｕｉｓｔおよびＭａｒｔｉｎ（１
９９６）；Ｓｔｅｒｍ他（１９９６）；Ｗｉｄｅｌｉｔｚ他（１９９７）；Ｍｉ
ｌｌａｒ（１９９７）における総説）。しかし、濾胞形成をもたらす誘導シグナ
ルの分子的性質はほとんど知られていない。

【０３９４】 潜在的なモルフォゲンをコードする転写物のインサイチュ局在化によって、表
皮のプラコード、および初期の発達段階にあるいくつかの他の上皮におけるＳｕ
ｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）の限局的な発現が明らかにされ、そして仮想的な
ＳｈｈレセプターをコードするＰｔｃｌ転写物もまた隣接する間充織細胞に存在
していた（ＢｉｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５；Ｉｓｅｋｉ他、１
９９６；Ｏｒｏ他、１９９７；Ｍｏｔｏｙａｍａ他、１９９８）。これらの発見
は、様々な発達プロセスにおける分泌型ヘッジホッグタンパク質に対する極めて
重要な役割を示す蓄積された証拠（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ他（１９９７）
における総説）と結びつけることによって、本発明者らに、毛包の形態形成にお
けるこの経路の潜在的な関与を検討させるきっかけとなった。濾胞は皮膚の幹細
胞の供給源であり、いくつかの上皮皮膚ガンの発生源と考えられる（Ｃｏｔｓａ
ｒｅｌｉｓ他、１９９０；Ｌａｖｋｅｒ他、１９９３；Ｒｏｃｈａｔ他、１９９
４；ＨａｎｓｅｎおよびＴｅｎｎａｎｔ、１９９４）ので、この器官の発生生物
学を理解することによって、正常な皮膚機能ならびに傷害治癒および腫瘍形成に
関する見通しを得ることができ、そして他の構造体を含む器官形成の基本的な局
面も同様に解明することができる。

【０３９５】 方法 動物および皮膚移植 Ｓｈｈ変異マウスの作製および同定を記載（Ｃｈｉａｎｇ他、１９９６）に従
って行った。胚皮膚を、以前に記載された技術（Ｄｌｕｇｏｓｚ他、１９９５）
の改良型を使用した、保護シリコーンチャンバーの下部で、ヌードマウスの背側
筋膜に移植した。移植した１１〜１２日後にチャンバーを除き、さらに１〜４週
間経った後に組織を分析のために採取した。動物の取り扱いはＮＩＨのガイドラ
インに従った。

【０３９６】 免疫組織化学 ケラチン類（ＫＩ、Ｋ１０、Ｋ５、Ｋ１４およびＫ１７）、ロリクリンおよび
フィラグリンを検出するために、組織をＣａｒｎｏｙ液またはＢｏｕｉｎ液で一
晩固定した：中性緩衝化ホルマリンによる固定を、Ｌｅｆ−１抗体、Ｋｉ６７抗
体および毛ケラチン（ＡＥ１３）抗体で免疫染色される組織に使用した。サンプ
ルをパラフィンに包埋して、８ｍ切片を免疫染色のために切断した。ホルマリン
固定切片における抗原の免疫反応性を、沸騰した０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６）にスライドを１０分間浸すことによって回復させた。その後、一次抗体を
、免疫染色のために指示された希釈度で使用した：ウサギ抗ケラチンＫ１、Ｋ１
０、Ｋ５およびＫ１４（１：５００）（Ｒｏｏｐ他、１９８４）、ロリクリンお
よびフィラグリン（１：５００）（Ｒｏｏｐ他、１９８７）、これらはＳｔｕａ
ｒｔ Ｙｕｓｐａ博士により提供された；ウサギ抗Ｋ１７（１：１０００）（Ｍ
ｃＧｏｗａｎおよびＣｏｕｌｏｍｂｅ、１９９８）、これはＰｉｅｒｒｅ Ｃｏ
ｕｌｏｍｂｅ博士により提供された；ウサギ抗Ｌｅｆ−１（１：２００）（Ｔｒ
ａｖｉｓ他、１９９１）、これはＲｕｄｏｌｆ Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ博士から
贈与された；ウサギ抗Ｋｉ６７、ＮＣＬ−Ｋｉ６７ｐ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｕｐｏｎ Ｔｙｎ
ｅ、英国）（１：２００）；およびＩ型毛ケラチンを含有するマウスモノクロー
ナルＡＥ１３ハイブリドーマ上清（１：５）（Ｌｙｎｃｈ他、１９８６）、これ
はＴｕｎｇ−Ｔｉｅｎ Ｓｕｎ博士により提供された）。組織切片を、１％ウシ
血清アルブミンを含有するトリス緩衝化生理食塩水で希釈した一次抗体と、通常
は１〜２時間、室温でインキュベーションした。その後の免疫染色手順を、製造
者の説明書に従い、ペルオキシダーゼＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ
）および基質としての３，３’−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ、ＭＯ）を使用して行った。切片をヘマトキシリンで対比染色し、Ｐｅｒ
ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐ
Ａ）を使用して固定した。

【０３９７】 インサイチュハイブリダイゼーション 非放射性ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを、主には記載（Ｇｒｏ
ｖｅｓ他、１９９５）に従い、Ｇｌｉｌ（Ｗａｌｔｅｒｈｏｕｓｅ他、１９９３
）、Ｐｔｃｌ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ他、１９９６）およびＢＭＰ−４（Ｊｏｎｅｓ
他、１９９１）の以前に記載された配列を使用して５ｍ切片で行った。

【０３９８】 触毛濾包外植片 触毛濾包外植片を、以前に記載されたものに少々改良を加えたプロトコル（Ｈ
ｉｒａｉ他、１９８９）に従い、妊娠１３．５日目のＣＤ−１マウス胚を使用し
て成立した。触毛パッドをＮｕｃｌｅｐｏｒｅフィルター（１３ｍｍ、８ｍ孔）
に移し、６ウエルプレートに入れた２ｍｌの培地［ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）＋ハムＦ１２培地上（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１：１）、１％のＦＣＳ（Ｉｎｔｅｒ
ｇｅｎ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）、ペニシリン（５０ユニット／ｍｌ）および
ストレプトマイシン（５０ｇｇ／ｍｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）］に浮かせた。類似する結果が、ＤＭＥＭ基本培地を使用して、ハムＦ１２を
添加することなく得られた。外植片に新鮮な培地を２日毎に与えた。顕微解剖を
ニコンＳＭＺ−２Ｔ立体顕微鏡のもとで行い、顕微鏡写真を、オリンパスＯＭ−
４カメラを使用して撮影した。シクロパミンは、−２０℃で、９５％ＥｔＯＨの
１０ｍＭストックとして保存した。

【０３９９】 ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ ＴｒｉＺｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）では、単体の外植片を溶解し、
また同社の推奨通り単離する事によってＲＮＡを取得した：ｃＤＮＡを、ランダ
ムプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにＳｕｐｅｒＳｃ
ｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｎａｓｅ Ｈ逆転写酵素を使用して合成し、ＲＴ−ＰＣＲを
、下記のプライマーを使用して行った：ＭＨＫＡ１（３１８ｂｐの産物）、（順
方向５’−ＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧ−３’および逆方向５’
−ＴＣＡＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＧＧＴＴＣＡＧ−３’）；ｈａｃｌ−１（３０８
ｂｐの産物）（順方向５’−ＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＣ−３お
よび逆方向５’−ＡＧＡＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧ−３’）；プロフ
ィラグリン（３３０ｂｐの産物）（順方向５’−ＧＣＴＴＡＡＡＴＧＣＡＴＣＴ
ＣＣＡＧ−３’および逆方向５’−ＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＴＴＧＣＡＧＧ−３
’）（Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ他、１９９５）；Ｐアクチン（４２１ｂｐの産物）
（順方向５’−ＴＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡ−３’および逆方
向５’−ＣＡＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧ−３’）（Ｗａｌｔｅｒ
ｈｏｕｓｅ他、１９９３）。下記のＰＣＲ条件をＭＨＫＡ１、Ｈａｃｌ−１およ
びアクチンに対して使用した：９５ｘ３分「ホットスタート」；９５ｘ５０秒、
５８ｘ３０秒および７２ｘ６０秒、２５サイクル（アクチン）または３５サイク
ル（ＨＭＫＡ１およびＨａｃｌ−１）；プロフィラグリンプライマーに対する７
２ｘ７分のＰＣＲ条件は以前の記載（Ｂｉｃｋｅｎｂａｃｈ他、１９９５）の通
りであった。反応産物を１．５％アガロースゲルに流し、臭化エチジウムで可視
化した。

【０４００】 結果および考察 毛包発達の初期段階はコントロールおよびＳｈｈ−／−の胚で類似していた。
皮膚縮合体を伴う発達中の真皮に突き出た円柱状の基底ケラチノサイトのクラス
ターからなる毛胚が、変異胚および妊娠１５．５日目の胚の両方の皮膚で検出さ
れた（図８Ａ、Ｂ）。コントロール毛胚とＳｈｈ欠損の毛胚との類似した形態に
もかかわらず、遺伝子の発現パターンにおける非常に大きな差が、インサイチュ
ハイブリダイゼーションによって明らかにされた。ＧｌｉｌのｍＲＮＡレベルは
、Ｓｈｈ−／−の始原毛胚の上皮成分および間充織成分の両方で著しく減少して
いた（図８Ｃ、Ｄ）。さらに、いくつかのプラコードはバックグラウンドよりも
わずかに大きなレベルを含有していたもののＰｔｃｌの発現はＳｈｈ変異毛胚に
おいて減少していた（図８Ｅ、Ｆ）。これらの発見は、ＳｈｈがＧｌｉｌおよび
Ｐｔｃｌの両方の正の調節因子として同定された以前の報告（Ｍａｒｉｇｏおよ
びＴａｂｉｎ、１９９６；Ｍａｒｉｇｏ他、１９９６；Ｌｅｅ他、１９９７；Ｓ
ａｓａｋｉ他、１９９７）と一致しており、Ｓｈｈが発達中の濾胞の上皮細胞お
よび間充織細胞の両方でシグナル変換していることを示唆している。Ｇｌｉｌお
よびＰｔｃｌとは対照的に、ＢＭＰ−４のｍＲＮＡは、変異胚およびコントロー
ル胚の縮合体において明らかに検出可能であった（図８Ｇ、Ｈ）。これは、ＢＭ
Ｐ−４発現の誘導の際にはＳｈｈが必要であることに対する反証である。従って
、Ｓｈｈは毛包発達を開始させるために必要ではなく、Ｓｈｈ変異皮膚において
生じる始原毛胚は、少なくともいくつかのＳｈｈ標的遺伝子が発現していない。

【０４０１】 コントロールの胚において、Ｅ１５．５とＥ１７．５との間は、濾胞上皮の塊
が７倍増大することおよび異なる細胞画分への再組織化を伴う濾胞の急激な増殖
および発達中の真皮への下方成長によって特徴づけられる。大部分の成熟した濾
胞において、成熟した濾胞において外側毛根鞘を生じさせる最も末梢側の細胞層
におけるケラチノサイトは、発達中の濾胞の長軸に直交する円柱状配置を取って
いる；中央に位置する細胞は、この段階では一定した配向を有していないが、最
終的には、内側毛根鞘細胞の３つの同心的な層、および毛幹を含む３つの細胞タ
イプによって置換される；濾胞の最深部の上皮細胞、すなわち、将来の毛球は、
この段階では、間充織細胞の明瞭なクラスターである皮膚乳頭を囲んでいる（図
９Ａ、矢印）。ほとんど成熟していない濾胞でさえ、間充織細胞の組織化された
「キャップ」がその陥入端に示されている（図９Ａ、矢じり部）。著しく対照的
に、Ｅ１７．５での変異胚に由来する皮膚の毛包は、Ｅ１５．５で認められる毛
胚期よりも先に発達しなかった（図９Ｂ）。濾胞上皮はその成長がないために最
も明らかに影響を受けたが、組織化中の皮膚縮合体および皮膚乳頭は変異皮膚に
は明らかに存在していなかった。これらの結果は、上皮に由来するＳｈｈ（Ｂｉ
ｔｇｏｏｄおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９５；Ｉｓｅｋｉ他、１９９６；Ｏｒｏ
他、１９９７；Ｍｏｔｏｙａｍａ他、１９９８）は、毛包の間充織成分の発達を
調節するパラクリンシグナルとして機能しているという考えと一致する。濾胞形
成の阻害は、皮膚発達の一般的な破壊によるためであるとは考えられない。なぜ
なら、顆粒状の角質化した細胞層の出現によって特徴づけられる表皮形態形成が
コントロール胚および変異胚の両方でＥ１７．５までに生じたからである（図９
Ａ、Ｂ）。

【０４０２】 さらなる研究を、Ｓｈｈが胚皮膚における上皮分化マーカーの発現に影響して
いるかどうかを明らかにするために行った。発達中の毛包におけるケラチノサイ
トは、周囲の表皮基底細胞に豊富に存在するケラチン類であるＫ５およびＫ１４
が相対的に欠乏していることによって識別することができる（Ｋｏｐａｎおよび
Ｆｕｃｈｓ、１９８９；Ｂｙｒｎｅ他、１９９４）。Ｅ１７．５胚の免疫組織化
学的染色により、コントロールの胚における正常な濾胞を含む細胞の部分集団で
のＫ１４レベルは、Ｓｈｈ−／−の胚で認められる原始濾胞と同様に大きく減少
しているか、または検出できないほどであることが明らかにされた（図９Ｃ、Ｄ
；矢印）。さらに、濾胞内表皮では通常は検出されず、発達中の毛包および成熟
した毛包で発現しているＫ１７（Ｐａｎｔｅｌｙｅｖ他、１９９７；ＭｃＧｏｗ
ａｎおよびＣｏｕｌｏｍｂｅ、１９９８）が、コントロールおよび変異の両方の
皮膚における濾胞上皮に局在化していた（図９Ｅ、Ｆ）。従って、Ｓｈｈ−／−
の皮膚における毛包の形態形成は毛胚期よりも先に進行しないが、これらの構造
体は、発達中の濾胞ケラチノサイトに特徴的な最終の分化プログラムを開始して
いる上皮細胞を含有している。図９Ａおよび９Ｂの形態学的な発見と一致して、
Ｓｈｈ−／−皮質表皮に特異的な分化マーカー（ケラチン１および１０、ロリク
リンならびにフィラグリン）の発現レベルは、免疫組織化学的染色に基づいて、
コントロールの表皮に類似しているか、またはそれよりも大きかった（データを
示さず）。

【０４０３】 Ｓｈｈ−／−マウスは生存できないので、変異皮膚の生後分析を、ヌードマウ
スへの移植後に行った。コントロールマウスから得られた皮膚は大量に色素沈着
した毛をもたらしたが、移植されたＳｈｈ−／−皮膚は、検出できるほどの毛を
生成させることができず、ドナーの皮膚の系統と一致して、色素沈着した移植部
位が認められた（図１０Ａ）。コントロール皮膚移植片の組織学により、無数の
毛包および皮脂腺を含む、正常なマウス皮膚に認められる代表的な構造体が明ら
かにされた（図１０Ｂ）。驚くべきほど対照的に、変異皮膚では、正常な外観を
有する濾胞、毛幹または皮脂腺が得られず、いくつかの場合（全部で７つのＳｈ
ｈ−／−移植片の内、３つ）において、角質増殖症の限局的な領域を伴う肥厚し
た表皮が認められた（図１０Ｃ）。貧弱な細胞質を有する好塩基性細胞の著しい
塊がこれらの変異移植片の皮膚−表皮接合部で検出された（図１０Ｃ、矢印）。
注目されることに、Ｓｈｈ欠乏ケラチノサイト塊における細胞の形態は、コント
ロールの毛球における細胞を連想させるものである。さらなる分析により、生化
学的類似性が明らかにされた。これらの塊内の細胞はＫ５抗体と反応せず（図１
０Ｄ、矢印）、核でのＬｅｆ−１の多量の発現を示し（図１０Ｅ）（Ｚｈｏｕ他
、１９９５）、そしてＫｉ６７の免疫染色によって検出される大きな割合の増殖
細胞を含有していた（データを示さず）。注目されることに、発育不全の毛幹に
似ている短い円柱状構造体には、Ｓｈｈ変異のケラチノサイト塊のいくつかが伴
っていた。さらに、これらの構造体は、毛に特異的なケラチンを発現していた（
図１０Ｆ）。このことは、濾胞分化プログラムの進行した段階が、正常な形態形
成が大きく破壊されたにもかかわらず達成されたことを示している。希ではある
が、図１０Ｅに示されているように、間充織細胞の小さなクラスターがケラチノ
サイト塊の基部を伴って認められた。この場合、これらの細胞はＬｅｆ−１抗体
で免疫染色される。これらの発見は、未発達の皮膚乳頭が、Ｓｈｈ変異移植片に
おいて認められる毛胚の少なくともいくつかに存在することを示唆している。

【０４０４】 濾胞発達中のＳｈｈの一時的な要求性をより十分に明らかにするために、組織
培養研究を、シクロパミンを使用して行った（ＧａＴｉｅｌｄおよびＫｅｅｌｅ
ｒ、１９９６）。シクロパミンは、最近、神経板外植片でのＳｈｈシグナル変換
を阻止することが明らかにされている（Ｃｏｏｐｅｒほか、１９９８；Ｉｎｃａ
ｒｄｏｎａ他、１９９８）。外植片を、妊娠１３．５日のマウスから得られた触
毛パッドを使用して樹立した（Ｈｉｒａｉ他、１９８９）。６〜８日間培養して
生育させた場合、外植片は活発な形態形成を行い、伸びた極めて正常な外観を有
する触毛濾胞が得られた（図１１Ａ）。これらの濾胞は毛幹を含有し、マウスの
毛ケラチンＡ１（ＭＨＫＡ１）（Ｋａｙｔｅｓ他、１９９１）および毛皮質に特
異的なマーカーＨａｃｌ−１（Ｈｕｈ他、１９９４）をコードする遺伝子を発現
していた。これらはＲＴ−ＰＣＲで検出された（図１１Ｂ）。シクロパミンによ
る外植片の処理によって、形態形成は驚くべきほど阻害された。このことは、Ｓ
ｈｈシグナル変換が、触毛の濾胞発達の毛胚期の期間中またはその直後に必要と
されることを示している（図１１Ｃ）。Ｓｈｈ変異皮膚を使用して得られた本発
明者らの結果と一致して、毛に特異的な転写物が、シクロパミンで処理された外
植片において、その変化した発達にもかかわらず検出された（図１１Ｂ）。これ
は、濾胞の生化学的分化はその形態形成と必ずしも連携していないという考えを
裏付けるものである。コントロールの外植片およびシクロパミン処理した外植片
はともにプロフィラグリンｍＲＮＡを蓄積する。このことは、Ｓｈｈシグナル変
換の破壊によって表皮の分化は阻害されないことを示している。

【０４０５】 まとめると、本発明者らの結果は、毛包の形態形成が毛胚期の発達よりも先に
進行する際のＳｈｈに対する必須的な役割を明らかにする。Ｓｈｈ−／−の皮膚
縮合体におけるＰｔｃ１およびＧｌｉｌの低下した発現は、認識可能な皮膚乳頭
に進化しないことと一緒になって、Ｓｈｈは毛包の間充織成分の発達を調節する
ことに関与していることを示しているが、濾胞の上皮成分におけるＳｈｈシグナ
ル変換が必要であることを除外することができない。皮膚乳頭の非存在下では、
正常な毛包の形態形成は進行しない。このことにより、発達中の濾胞上皮の成長
および再構築に対するこれらの細胞が有する重大な影響が強く示される（Ｊａｈ
ｏｎｄａ他、１９８４；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ他、１９９３）。注目されることに、
濾胞の生化学的分化が正常な形態形成の非存在下で生じ得る。このことは、この
２つのプロセスがこの器官では独立して調節されていることを意味する。さらな
る実験が、発達中の濾胞のどの成分がＳｈｈ−／−の胚において機能的に弱めら
れているかを明確にするために、そしてＳｈｈが、濾胞発達の後期あるいは毛周
期中においてさらなる役割を有しているかどうかを決定するために必要である。
本発明者らは、これらの研究は、究極的には、ケラチノサイトでのＳｈｈシグナ
ル変換経路の構成的な活性化が基底細胞ガンの形成にどのように寄与しているか
を説明するのに役立ち得ると考える（Ｊｏｈｎｓｏｎ他、１９９６；Ｈａｈｎ他
１９９６；Ｏｒｏ他、１９９７；Ｆａｎ他、１９９７；Ｘｉｅ他、１９９８）。

【０４０６】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】 実施例３：ｐｔｃの機能喪失表現型の回復 上記の結果に基づいて、本発明者らは、シクロパミンが作用するＳｈｈシグナ
ル変換経路での部位を決定すること、従って、本発明の化合物で潜在的に処置す
ることができ、Ｓｈｈ経路を活性化する病変によって引き起こされる腫瘍の範囲
をよりよく理解することを試みた。

【０４０７】 この研究には、ｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃ）＋／−の交配から得られたＥ８．５
の胚をトリプシン消化することによって作製されたマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥ
Ｆ）の使用が含まれる。マウスのｐｔｃ遺伝子を、エキソン１の一部およびエキ
ソン２のすべてが細菌のｌａｃＺ遺伝子によって置換される相同組換えにより破
壊した（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ他（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７：１１０９
）。Ｐｔｃタンパク質はＳｈｈシグナル変換を抑制するので、その機能喪失によ
ってＳｈｈシグナル変換経路が活性化される。Ｓｈｈシグナル変換は、一連の事
象を介して、Ｇｌｉ転写因子により媒介される。Ｓｈｈシグナル変換の標的遺伝
子の１つはｐｔｃであり、ｐｔｃプロモーター領域内のＧｌｉ結合部位を介する
。これは、シグナル変換のダウンレギュレーションに対するフィードバック機構
として作用する。従って、このｐｔｃ−／−胚において、Ｓｈｈシグナル変換経
路は多くの組織で活性化され、ｌａｃＺ遺伝子産物のβ−ガラクトシダーゼが経
路活性化のレポーターとしてそのような組織のすべてで発現する。

【０４０８】 本発明者らは、シクロパミンがＰｔｃまたはこのカスケードの別の成分に作用
してＳｈｈシグナル変換を阻害するかどうかを明らかにするためにこのようなＭ
ＥＦを得た。シクロパミンの標的がＰｔｃであるならば、Ｓｈｈ経路がｐｔｃ機
能の喪失により活性化されたときに、Ｓｈｈ経路はシクロパミンでもはや阻害さ
れ得ないことが予想される。図１２は、Ｓｈｈシグナル変換経路が細胞培養中の
このような繊維芽細胞で活性化され得ること、およびβ−ガラクトシダーゼの活
性レベルが経路活性化の程度を反映していることを示している。ＭＥＦ株２３−
４はｐｔｃ−ｌａｃＺに関してヘテロ接合型である。従って、経路の抑制された
状態を維持し得る１つの機能的なｐｔｃ対立遺伝子を含有するが、Ｓｈｈタンパ
ク質の添加によって経路が活性化されたときにｌａｃＺを発現する（図１２参照
）。

【０４０９】 これに対して、ｐｔｃ−ｌａｃＺに関してホモ接合型であるＭＥＦ（細胞株２
３−１）のβ−ガラクトシダーゼ活性は、この細胞の場合、経路が機能的なｐｔ
ｃ対立遺伝子の喪失により構成的に活性化されているために著しく上昇している
（図１３）。この細胞をシクロパミンとともに培養すると、β−ガラクトシダー
ゼ活性は低下する。このことは、Ｓｈｈシグナル変換経路がＰｔｃ抑制により調
節されていない場合、Ｓｈｈシグナル変換経路は、シクロパミン阻害に対して依
然として感受性であることを示している。β−ガラクトシダーゼ活性の低下は、
細胞毒性からではなく、むしろＳｈｈシグナル変換の特異的な阻害から生じてい
ると考えられる。なぜなら、酵素活性はサンプルの総タンパク質含有量に対して
規格化されているからである。さらに、β−ガラクトシダーゼ活性の低下を、平
均的な細胞周期よりも短い期間にわたってシクロパミンに曝すことによって得る
ことができる。従って、β−ガラクトシダーゼ活性の低下は細胞増殖の阻害のた
めだけであるとは考えられない（図１４）。

【０４１０】 本発明がＳｈｈシグナル変換の特異的な阻害を示す最後のものは、Ｓｈｈシグ
ナル変換が、阻害性ではないが、構造的に関連する化合物のトマチジンで阻害さ
れ得ないことである（図１５）。

【０４１１】 上記に引用された参考文献はすべて、それらにより参考として本明細書中に援
用される。

【０４１２】 均等物 当業者により、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書中に記載されている
本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物が認識されるか、または見出され
得る。そのような均等物は、添付した請求項によって包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、植物ステロイドアルカロイドジェルビン、シクロパミンおよびトマチ
ジンの、およびコレステロールの合成化合物ＡＹ９９４４およびトリパラノール
の構造を示す

【図２】 図２は、ジェルビン（４）に暴露されたニワトリ胚で誘導された全前脳を示す

【図３】 図３は、合成および植物由来テトラジェンが外植ニワトリ組織における外因性
Ｓｈｈシグナリングをブロックする（４１）ことを示す

【図４】 図４は、奇形発生化合物がイン・ビボでＳｈｈ自己プロセッシングを阻害しな
い（４７）ことを示す

【図５Ａ】 図５Ａは、〜２５ｋＤ Ｈｈ−Ｃ産物（レーン２−２７）および〜５ｋＤ Ｎ
Ｈ_２−末端産物（このゲルでは解像されず）を生じさせるためにステロールを添
加せず（レーン１）または１２μＭコレステロールを添加して３０℃で３時間イ
ンキュベートしたバテリカリに発現されたＨｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ蛋白質（〜２９ｋＤ
）のイン・ビトロ自己プロセッシング反応を示すクーマシーブル−染色ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルを示す

【図５Ｂ】 図５Ｂは、ステロールの不存在下で行う場合（レーン１）、またはこれらのス
テロイドアルカロイドの３２４μＭ濃度においてさえ（レーン５、９および１３
）、ジェルビン（レーン２−５）、シクロパミン（レーン６−９）およびトマチ
ジン（レーン１０−１３）の存在下で、Ｈｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ自己切断反応が進行し
ないことを示すクーマシーブルー−染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを
示す

【図５Ｃ】 図５Ｃは、５０ｍＭジチオスレイトール（レーン２）、１２μＭコレステロー
ル（レーン３）、１２μＭ ７デヒドロコレステロール（レーン４）、１２μＭ
デスモステロール（レーン５）、１２μＭムリステロン（レーン９、１０）にて
、ステロールの不存在下で（レーン１）行ったＨｉｓ_６Ｈｈ−Ｃ自己切断反応の
クーマシーブルー−染色ＳＤＳ０ポリアクリルアミドゲルを示す

【図６】 図６は、奇形形成化合物が外因性Ｓｈｈ−Ｎ蛋白質に対する神経外胚葉応答を
阻害する（４１）ことを示す

【図７】 図７は、ジェルビンがＢＭＰ７に対する神経外胚葉を阻害しない（４１）こと
を示す

【図８】 図８は、対照およびＳｈｈ−／−初代毛髪胚芽の形態学および遺伝子発現パタ
ーンを示す

【図９】 図９は、Ｓｈｈ−／−マウス皮膚における毛包形態発生の阻害を示す

【図１０Ａ】 図１０Ａは、移植後６週間のヌードマウス移植部位の大きな出現を示す

【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、Ｈ＆Ｅ染色を示す

【図１０Ｃ】 図１０Ｃは、Ｈ＆Ｅ染色を示す

【図１０Ｄ】 図１０Ｄは、免疫組織化学を示す

【図１０Ｅ】 図１０Ｅは、免疫組織化学を示す

【図１０Ｆ】 図１０Ｆは、免疫組織化学を示す

【図１１】 図１１は、シクロパミンは外植体において鼻毛嚢形態発生を損なうことを示す

【図１２】 図１２は、ＳｈｈＮｐと共に５日間インキュベートしたＰｔｃ＋／−ＭＥＦの
グラフを示す

【図１３】 図１３は、シクロパミンで３日間培養したＰｔｃ−／−ＭＥＦ_ｓ２３−１のグ
ラフを示す

【図１４】 図１４は、シクロパミンで１６時間培養したＰｔｃ−／−ＭＥＦ_ｓ２３−４の
グラフを示す

【図１５】 図１５は、トマチジンで１６時間培養したＰｔｃ−／−ＭＥＦ_ｓ２１−４のグ
ラフを示す

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ １１１ Ｃ０７Ｊ 71/00 Ｃ０７Ｊ 71/00 (31)優先権主張番号 ０９／０９０，６２２ (32)優先日 平成10年６月４日(1998．6．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ポーター，ジェフリー エイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02178 ベルモント ウィリー ロード 24 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 DA08 DA12 MA63 NA14 ZA01 ZA51 ZA59 ZA75 ZA89 ZA92 ZA94 ZA96 ZB21 ZB26 4C091 AA01 AA08 BB01 BB06 CC01 CC02 QQ01 QQ02 QQ06 QQ09 QQ15 QQ18

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘッジホッグ蛋白質に感受性の細胞を、ヘッジホッグ蛋白質
   に対する該細胞の感受性を減少させるのに十分な量のヘッジホッグアンタゴニス
   トに接触させる工程を含み、ここに、該ヘッジホッグアンタゴニストが７５０ａ
   ｍｕ未満の分子量を有する有機分子であることを特徴とするヘッジホッグ蛋白質
   によって生産されるパラクリンおよび／またはオートクラインシグナルの阻害方
   法。
2. 【請求項２】 ｐｔｃ機能喪失表現型または平滑化機能獲得表現型を有する
   細胞を、改変成長状態を阻害するのに十分な量のｐｔｃアゴニストと接触させる
   工程を含み、ここに、該ｐｔｃアゴニストが７５０ａｍｕ未満の分子量を有する
   有機分子であることを特徴とする該細胞の改変成長状態の阻害方法。
3. 【請求項３】 ヘッジホッグアンタゴニストが一般式（Ｉ）で表されるステ
   ロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−
   またはホモ−誘導体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 【化１】 ［式中、原子価および安定性が許容するごとく、 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、各々が結合した環に対する１以上の置換基を
   表し、各出現につき、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アル
   キニル、アリール、ヒドロキシル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコキシル、シリルオキシ、
   アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネー
   ト、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、アンヒドリド
   、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル
   、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ
   ８を表し； Ｒ６、Ｒ７およびＲ’７は存在しないか、あるいは独立して、ハロゲン、アル
   キル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキシル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコ
   キシ、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホ
   スホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシ
   アミド、アンヒドリド、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル
   、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、また
   は−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し、 Ｒ６およびＲ７、またはＲ７およびＲ’７は一緒になって、例えば、置換され
   ているまたは置換されていない環または多環を形成し、 但し、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ’７のうちの少なくとも１つは存在し、第一級も
   しくは第二級アミンを含み、 Ｒ８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環を
   表し、および ｍは包括的に０ないし８の範囲の整数である］
4. 【請求項４】 Ｒ２およびＲ３が、各出現につき、−ＯＨ、アルキル、−Ｏ
   −アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８であり； Ｒ４が、各出現につき、存在しないか、あるいは−ＯＨ、＝Ｏ、アルキル、−
   Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ８を表し； Ｒ６、Ｒ７、およびＲ’７は、各々、独立して、水素、アルキル、アルケニル
   、アルキニル、アミン、イミン、アミド、カルボニル、カルボキシル、カルボキ
   シアミド、エーテル、チオエーテル、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を
   表し、または Ｒ７およびＲ’７は一緒になってペルヒドロフロ［３，２−ｂ］ピリジン、ピ
   ラノピペリジン、キノリン、インドール、ピラノピロール、ナフチリジン、チオ
   フラノピペリジン、またはチオピラノピペリジンのごときフラノピペリジンを形
   成し、 但し、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ’７のうち少なくとも１つは存在し、第一級アミ
   ンまたは第二級アミンを含み、 Ｒ８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環で
   あり、好ましくは、Ｒ８はピペリジン、ピリミジン、モルホリン、チオモルホリ
   ン、ピリダジンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 ヘッジホッグアンタゴニストが一般式（II）で表されるステ
   ロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−
   またはホモ−誘導体である請求項１または２記載の方法。 【化２】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ’７は前記定義に同じ
   であって、ＸはＯまたはＳを表すが、好ましくはＯを表す］
6. 【請求項６】 前記ステロイドヘッジホッグアンタゴニストが一般式（III
   ）、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導
   体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 【化３】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ８は前記定義に同じであり； ＡおよびＢは単環または多環基を表し； Ｔは１−１０結合長さのアルキル、アミノアルキル、カルボキシル、エステル
   、アミド、エーテルまたはアミン結合を表し； Ｔ’は存在しないか、あるいは１−３結合長さのアルキル、アミノアルキル、
   カルボキシル、エステル、アミド、エーテルまたはアミン結合を表し、ここにも
   しＴおよびＴ’が一緒に存在すれば、ＴおよびＴ’は環ＡまたはＢと一緒になっ
   て５−８環原子の共有結合閉環を形成し； Ｒ９は環ＡまたはＢに対する１以上の置換基を表し、これは、各出現につき、
   独立して、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキ
   シル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコキシル、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、
   アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル
   、カルボキシル、カルボキシアミド、アルデヒド、シリル、エーテル、チオエー
   テル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、ア
   ルデヒド、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し；および ｎおよびｍは、独立して、０、１または２を表し； 但し、ＡおよびＲ９、またはＴ、Ｔ’、ＢおよびＲ９は一緒になって少なくと
   も１個の第一級または第二級アミンを含む］
7. 【請求項７】 前記ヘッジホッグアンタゴニストが一般式（IV）で表される
   ステロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノ
   ル−またはホモ−誘導体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 【化４】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ９は前記定義に同じであり、 Ｒ２２は存在しないか、あるいはアルキル、アルコキシルまたは−ＯＨを表す
   ］
8. 【請求項８】 前記ヘッジホッグアンタゴニストが一般式（Ｖ）で表される
   ステロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノ
   ル−またはホモ−誘導体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 【化５】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６およびＲ９は前記定義に同じである］
9. 【請求項９】 ヘッジホッグアンタゴニストが一般式（VI）で表されるステ
   ロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−
   またはホモ−誘導体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 【化６】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ９は前記定義に同じ］
10. 【請求項１０】 ヘッジホッグアンタゴニストが一般式（VII）で表される
    ステロイドアルカロイド、またはその不飽和形態および／またはそのセコ−、ノ
    ル−またはホモ−誘導体であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 【化７】 ［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ９は前記定義に同じ］
11. 【請求項１１】 該ステロイドアルカロイドがアルドステロン、アンドロス
    タン、アンドロステン、アンドロステンジオン、アンドロステロン、コレカルシ
    フェロール、コレスタン、コール酸、コルチコステロン、コルチゾール、酢酸コ
    ルチゾール、コルチゾン、酢酸コルチゾン、デオキシコルチコステロン、ジギト
    キシゲニン、エルゴカルシフェロール、エルゴステロール、エステラジオール−
    １７−α、エステラジオール−１７−β、エストリオール、エストラン、エスト
    ロン、ヒドロコルチゾン、ラノステロール、リトコール酸、メストラノール、β
    −メタゾン、プロドニソン、プレグナン、プレグネノロン、プロゲステロン、ス
    ピロノラクトン、テストステロン、トリアムシノロンおよびその誘導体などのス
    テロイドの生物学的活性を実際に妨害しないことを特徴とする請求項３から１０
    のいずれか１項記載の方法。
12. 【請求項１２】 ステロイドアルカロイドが前記ホルモン受容体に特異的に
    結合しないことを特徴とする請求項３から１０いずれか１項記載の方法。
13. 【請求項１３】 ステロイドアルカロイドがエストロゲンまたはテステロン
    受容体に特異的に結合しないことを特徴とする請求項３から１０いずれか１項記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 ステロイドアルカロイドが治療濃度においてエストロゲン
    活性を有しないことを特徴とする請求項３から１０いずれか１項記載の方法。
15. 【請求項１５】 ヘッジホッグアルカロイドが１ｍＭ以下のＥＤ５０でもっ
    てヘッジホッグ−媒介シグナル変換を阻害することを特徴とする請求項１から１
    ０いずれか１項記載の方法。
16. 【請求項１６】 ヘッジホッグアンタゴニストが１μＭ以下のＥＤ５０でも
    ってヘッジホッグ−媒介シグナル変換を阻害することを特徴とする請求項１から
    １０いずれか１項記載の方法。
17. 【請求項１７】 ステロイドアルカロイドが１ｎＭ以下のＥＤ５０でもって
    ヘッジホッグ−媒介シグナル変換を阻害することを特徴とする請求項１から１０
    いずれか１項記載の方法。
18. 【請求項１８】 細胞をイン・ビトロでヘッジホッグアンタゴニストと接触
    させることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
19. 【請求項１９】 細胞をイン・ビボでヘッジホッグアンタゴニストと接触さ
    せることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
20. 【請求項２０】 ヘッジホッグアンタゴニストが治療または化粧適用の一部
    として投与されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
21. 【請求項２１】 ヘッジホッグアンタゴニストが神経組織の調節、骨および
    軟骨形成および修復、精子形成の調節、平滑筋の調節、原始腸に由来する肺、肝
    臓および他の器官の調節、造血機能の調節、皮膚および毛髪成長の調節等よりな
    る群から選択される疾患を治療するために投与されることを特徴とする請求項１
    ９または２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 ヘッジホッグアンタゴニストが皮膚への局所処方として適
    用されて上皮細胞の異常増殖を阻害することを特徴とする請求項１から７いずれ
    か１項記載の方法。
23. 【請求項２３】 ヘッジホッグアンタゴニストが患者に投与されて基底細胞
    癌の増殖を阻害することを特徴とする請求項１から１７または２２いずれか１項
    記載の方法。
24. 【請求項２４】 一般式（Ｉ）で表されるステロイドアルカロイド、または
    その不飽和形態および／またはそのセコ−、ノル−またはホモ−誘導体を含むこ
    とを特徴とする医薬製剤。 【化８】 ［式中、原子価および安定性が許容するごとく、 Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、各々が結合した環に対する１以上の置換基を
    表し、各出現につき、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アル
    キニル、アリール、ヒドロキシル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコキシル、シリルオキシ、
    アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、アミド、ホスホリル、ホスホネー
    ト、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキシアミド、アンヒドリド
    、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル
    、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、または−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ
    ８を表し； Ｒ６、Ｒ７およびＲ’７は存在しないか、あるいは独立して、ハロゲン、アル
    キル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキシル、＝Ｏ、＝Ｓ、アルコ
    キシル、シリルオキシ、アミノ、ニトロ、チオール、アミン、イミン、イミド、
    ホスホリル、ホスホネート、ホスフィン、カルボニル、カルボキシル、カルボキ
    シアミド、アンヒドリド、シリル、エーテル、チオエーテル、アルキルスルホニ
    ル、アリールスルホニル、セレノエーテル、ケトン、アルデヒド、エステル、ま
    たは−（ＣＨ_２）ｍ−Ｒ８を表し、 Ｒ６およびＲ７、またはＲ７およびＲ’７は一緒になって、例えば、置換され
    ているまたは置換されていない環または多環を形成し、 但し、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ’７のうちの少なくとも１つは存在し、第一級も
    しくは第二級アミンを含み、 Ｒ８はアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、または多環を
    表し、および ｍは包括的に０ないし８の範囲の整数である］
25. 【請求項２５】 局所適用のために処方されたことを特徴とする請求項２４
    記載の製剤。
26. 【請求項２６】 異常活性化ヘッジホッグ経路を有する細胞の増殖を防止す
    るための滅菌医薬を形成するための医薬上許容される賦形剤中のヘッジホッグシ
    グナル変換経路のステロイドアルカロイド阻害剤を処方することを特徴とする医
    薬の製法。