MX2011005176A - Antagonistas de la trayectoria hedgehog de piridazinas tetrasustituidas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona nuevos antagonistas de la trayectoria de hedgehog de piridazina tetrasustituida útiles en el tratamiento de cáncer.

Description

ANTAGONISTAS DE LA TRAYECTORIA HEDGEHOG DE PIRIDAZINAS TETRASUST TUIDAS La presente invención se refiere a antagonistas de la trayectoria Hedgehog y, más específicamente, a nuevas piridazinas tetrasustituidas y uso terapéutico de las mismas. La trayectoria de señalización Hedgehog (Hh) juega un papel importante en la formación del patrón embriónico y mantenimiento del tejido en adultos dirigiendo la diferenciación y proliferación celular. La familia de la proteína Hedgehog (Hh) , la cual incluye Hedgehog Sónica (Shh) , Hedgehog India (Ihh), y Hedgehog Desierto (Dhh) son glicoproteínas secretadas que sufren modificaciones post-traduccionales, incluyendo escisión autocatalítica y acoplamiento de colesterol al péptido amino terminal para formar el fragmento que posee actividad de señalización. Hh enlaza a la proteína de transmembrana de doce pasos Ptch (Ptchl y Ptch2), aliviando la supresión mediada por Ptch de Smoothened (Smo). La activación de Smo activa una serie de eventos intracelulares que culminan en la estabilización de los factores de transcripción Gli (Glil, Gli2, y Gli3) y la expresión de los genes dependientes de Gli que son responsables de la proliferación celular, supervivencia celular, angiogénesis e invasión.

La señalización de Hh recientemente ha atraído interés considerable con base en el descubrimiento que la activación aberrante de la señalización de Shh conduce a la formación de varios tumores, por ejemplo, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma de célula basal, cáncer de pulmón de células pequeñas, y cáncer de próstata. Varios antagonistas de Hh se han reportado en la técnica, tal como el compuesto alcaloide esteroideo IP-609; el compuesto aminoprolina CUR61414; y el compuesto tiazol 2 , -disustituido JK18. O2005033288 describe ciertos compuestos de ftalazina 1, 4-disustituida que se afirma son antagonistas de hedgehog. De manera similar, WO2008110611 describe ciertos compuestos de ftalazina 1, 4-disustituida relacionados con el diagnóstico y tratamiento de patologías relacionadas con la trayectoria de hedgehog.

Aún existe una necesidad de inhibidores potentes de la trayectoria de hedgehog, particularmente aquellos que tienen perfiles farmacodinámicos, farmacocinéticos y de toxicología deseables. La presente invención proporciona nuevas piridazinas tetrasustituidas que son antagonistas potentes de esta trayectoria.

La presente invención proporciona un compuesto de la siguiente fórmula: en donde, R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; y R2 y R3 son independientemente metilo o hidrógeno; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Se entenderá por el artesano experto que los compuestos de la presente invención comprenden una porción amina terciaria y son capaces de reaccionar con un número de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Tales sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables y la metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, P. Stahl, et. al. HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS : PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol . 66, No. 1, Enero 1977.

Las modalidades específicas de la invención incluyen compuestos de Fórmula I, o una sal de los mismos farmacéuticamente aceptable, en donde: (a) R1 es hidrógeno; y (b) El compuesto de la reivindicación 1 o 2 en donde uno de R2 y R3 es hidrógeno y el otro es metilo .

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en combinación con un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos de la presente invención son preferiblemente formulados como composiciones f rmacéuticas administradas por una variedad de rutas. Preferiblemente, tales composiciones son para administración oral o intravenosa. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHAR ACY (A. Gennaro, et al., eds . , 19th ed., Mack Publishing Co., 1995) .

La presente invención también proporciona un método para tratar cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma en un paciente que comprende administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Se entenderá que la cantidad del compuesto actualmente administrado será determinada por un médico bajo las circunstancias relevantes, incluyendo la afección a ser tratada, la ruta de administración elegida, el compuesto o compuestos actuales administrados, la edad, peso, y respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente. Las dosificaciones por día normalmente caen dentro del intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo antedicho pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores. Por lo tanto, el intervalo de dosificación anterior no se propone para limitar el alcance de la invención en alguna forma. Esta invención también proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para uso como un medicamento.

Adicionalmente, esta invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la manufactura de un medicamento para tratar cáncer. En particular, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma .

Además, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Fórmula I, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, como un ingrediente activo para tratar cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma.

Los compuestos de Fórmula I, o sales de los mismos, se pueden preparar por una variedad de procedimientos conocido en la técnica, así como también aquellos descritos en los Esquemas de reacción, Preparaciones y Ejemplos posteriores. Las etapas sintéticas específicas para cada una de las rutas descritas se pueden combinar en diferentes formas, o en conjunto con las etapas de diferentes esquemas de reacción, para preparar los compuestos de Fórmula I, o sales de los mismos.

Los sustituyentes, a menos que se indique de otra forma, son como se definieron previamente. Los reactivos y materiales de partida son generalmente fácilmente disponibles para uno de experiencia ordinaria en la técnica. Se pueden hacer otros por técnicas estándares de química orgánica y heterocíclica, técnicas las cuales son análogas a las síntesis de compuestos estructuralmente similares conocidos, y los procedimientos descritos en las Preparaciones y Ejemplos los cuales siguen incluyendo cualquiera de los procedimientos nuevos.

Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados indicados: "boc" o "t-boc" se refiere a ter-butoxicarbonilo; "EDCI" se refiere a clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida; "Et20" se refiere a éter dietílico; "HOBT" se refiere a hidrato de 1-hidroxibenzotriazol; "DMF" se refiere a N, N-dimetilformamida; "D SO" se refiere a metilsulfóxido; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "MeOH" se refiere a metanol; "TFA" se refiere a ácido trifluoroacético"; "SCX" se refiere a intercambio catiónico fuerte; e "IC50" se refiere a la concentración de un agente que produce 50% de la respuesta inhibitoria máxima posible para este agente.

Esquema de Reacción 1 Un compuesto de Fórmula I se puede preparar de conformidad con las reacciones representadas en el Esquema de reacción 1.

En el Esquema de reacción 1, la 3, 6-dicloro-4, 5-dimetilpiridazina (1) se coloca con una piperazina sustituida protegida por mono-boc (2) en una reacción de sustitución aromática nucleofilica (SNAr) para proporcionar una 3-cloro-4, 5-dimetil-6-piridazina (sustituida) de fórmula (3). Por ejemplo, en la Etapa 1, un cloruro de (1) se puede hacer reaccionar con una piperazina protegida por mono-boc sustituida en un solvente aprótico polar tal como DMSO en la presencia de una base orgánica tal como diisopropiletilamina . En la Etapa 2, el cloruro remanente en la dimetilpiridazina (3) se puede hacer reaccionar con un ácido fenil borónico (4) en una reacción de acoplamiento cruzado Suzuki-Miyaura para producir la 4 , 5-dimetil-5-fenilpiridazina sustituida-3-piperazina sustituida (5) correspondiente. El artesano experto reconocerá que existe una variedad de condiciones útiles para facilitar tales reacciones de acoplamiento cruzado. Las condiciones de reacción hacen uso de un solvente adecuado tal como dioxano o dioxano/agua y se realizan en la presencia de una base tal como fluoruro de cesio. La reacción toma lugar en la presencia de un catalizador de paladio tal como cloruro de (1,1'-bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio ( II ) , bajo una atmósfera inerte a una temperatura de aproximadamente 80-160°C para producir un compuesto de fórmula (5) . La amina se puede desproteger por métodos de desprotección estándares. Los métodos para introducir y remover los grupos protectores nitrógeno son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Green and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)). Por ejemplo, la desproteción boc de la piperazina de fórmula (5) se puede realizar bajo condiciones ácidas, tal como con cloruro de hidrógeno en un solvente adecuado tal como metanol o dioxano para producir un compuesto de fórmula (6) . La acilación de la amina en la Etapa 4 se puede realizar con un carbamato de tricloroetilo sustituido (7) usando una base orgánica tal como trietilamina en un solvente aprótico polar tal como DMSO y calentamiento a aproximadamente 90-110°C. Los compuestos de Fórmula I se pueden convertir a una sal tal como la sal de HC1 por métodos conocidos por un experto en la técnica tal como agregar HC1 en Et20 para producir compuestos de Fórmula I.

El carbamato de tricloroetilo sustituido se puede preparar como se muestra en el Esquema de reacción 2.

Esquema de reacción 2 HCI (8) (7) El clorhidrato de 4 , -difluorociclohexilamina (8) se acila con carbonoclorhidrato de 2, 2, 2-tricloroetilo (9) usando una base orgánica tal como trietilamina en un solvente inerte tal como diclorometano para producir 4,4-difluorociclohexilcarbamato de 2, 2, 2-tricloroetilo, (7), Etapa 1.

Alternativamente, la 3, 6-dicloro- , 5-dimetilpiridazina se puede alquilar con bencil etilendiamina la cual se puede elaborar para la piperazina ciclizada como se muestra en el Esquema de reacción 3.

Esquema de reacción 3 Un cloruro de (1) se puede desplazar con benciletilendiamina (10) usando una base orgánica tal como diisopropilamina en un solvente aprótico polar tal como DMSO con calentamiento a 110-130°C como se muestra en la Etapa 1, Esquema de reacción 3 para producir la etilendiamin piridazina protegida de fórmula (11). El segundo cloruro se puede hacer reaccionar como de describió antes con un ácido borónico (4) mostrado en la Etapa 2 para producir un compuesto de fórmula (12) . El nitrógeno de bencilo se acila con ácido 2-cloropropiónico (13) usando una base orgánica tal como trietilamina y un reactivo de acoplamiento adecuado tal como EDCI con HOBT para producir un compuesto de fórmula (14) como se muestra en la Etapa 3. La ciclización para formar la piridazina se realiza con hidruro de sodio en un solvente inerte tal como THF para producir un compuesto de fórmula (15) , Etapa 4. Un agente reductor tal como borano-sulfuro de metilo reduce la cetona para producir un compuesto de fórmula (16) , Etapa 5. Por ejemplo, un compuesto de fórmula (15) se puede tratar con complejo de borano-sulfuro de metilo en un solvente inerte tal como THF. La mezcla se puede calentar a 40-60°C para producir la piperazina sustituida de fórmula (16) . La desprotección de la piperazina se realiza, bajo condiciones de hidrogenación de 40-70 psi de gas hidrógeno con un catalizador tal como 10% Pd/C usando un solvente polar tal como etanol para producir un compuesto de fórmula (6), Etapa 6. La acilación de la amina en la Etapa 7 se puede realizar con un carbamato de tricloroetilo sustituido (7) usando una base orgánica tal como trietilamina en un solvente aprótico polar tal como D SO y calentamiento a aproximadamente 90-110°C para producir los compuestos de Fórmula I los cuales se pueden convertir a una sal tal como la sal de HC1 por métodos conocidos por un experto en la técnica, tal como agregar HC1 en EtjO.

Las siguientes Preparaciones y Ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención con detalle adicional y representan síntesis típicas de los compuestos de Fórmula I. Los nombres de los compuestos de la presente invención generalmente se proporciona por ChemDraw Ultra® 10.0.

Preparación 1 ( 6-Cloro-4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) -2-metilpiperazin- carboxilato de ( S) - ter-butilo Calentar una mezcla de 1, 4-dicloro-2, 3-dimetilpiridazina (6.06 g, 34.2 mmol), éster ter-butílico del ácido (S) -2-metil-piperazin-l-carboxílico (6.88 g, 34.4 mmol) y diisopropiletilamina (30 mi, 172 mmol) en DMSO (30 mL) a 120 °C por 5 d. Enfriar y tratar la mezcla con éster ter-butílico del ácido ( S) -2-metil-piperazin-l-carboxílico adicional (3.74 g, 18.7 mmol), y reanudar el calentamiento a 120 °C por unos 2 d adicionales. Diluir la mezcla de reacción con EtOAc y lavar con H20 y salmuera. Secar sobre Na2SC>4, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 20 a 50% EtOAc en hexanos) para proporcionar el compuesto del título como una espuma amarilla pálida (7.36 g, 63%). ES/MS m/z (35C1) 341.0 (M+l).

Preparación 2 4- (4, 5-Dimetil-6-fenilpiridazin-3-il ) -2-metilpiperazin-l- carboxilato de (S) - ter-butilo Tratar una mezcla desgasificada con N2 de 4- (6-Cloro-4, 5-dimetilpiridazin-3-il) -2-metilpiperazin-l-carboxilato de ( S) - er-butilo (3.03 g, 8.87 mmol) , ácido fenilborónico (1.62 g, 13.3 mmol), y CsF (4.09 g, 26.9 mmol) en 1,4-dioxano (120 mL) con cloruro de (1,1'-bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio (II) (1.08 g, 1.32 mmol) . Calentar la mezcla de reacción a 95 °C durante la noche. Enfriar la reacción, y dividir entre EtOAc y H2O. Lavar la capa orgánica con salmuera, secar sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 15 a 85% EtOAc en hexanos) para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (2.93 g, 86%). ES/MS m/z 383.0 (M+l) .

Preparar las dimetil piridazinas sustituidas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la Preparación 2, usando el ácido fenilborónico apropiado .

Preparación 5 (S) -4, 5-Dimetil-3- ( 3-metilpiperazin-l-il ) -6-fenilpiridazina Tratar una solución de 4- (4, 5-Dimetil-6-fenilpiridazin-3-il) -2-metilpiperazin-l-carboxilato de (S)- ter-butilo (2.93 g, 7.66 mmol) en MeOH (20 mL) con HC1 4 M en 1,4-dioxano (10 mL, 40.0 mmol) . Agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida. Disolver el residuo en MeOH, y verter en una columna SCX (Varían, 10 g) . Enjuagar la columna con MeOH. Eluir el producto deseado con NH3 2M/MeOH. Concentrar bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo (2.07 g, 95%) . ES/MS m/z 283.0 (M+1) .

Preparar las piperazinas desprotegidas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en la Preparación 5, usando la piperazina protegida con boc apropiada con tiempos de reacción de 3 h y usando 1,4-dioxano en lugar de MeOH como el solvente.

Preparación 8 -Bencil-A/2- (6-cloro-4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) etan-1, diamina Calentar una mezcla de 3 , 6-dicloro- , 5-dimetilpiridazina (6.90 g, 39.0 mmol) , W-benciletilendiamina (8.78 g, 58.5 mmol), y diisopropiletilamina (25.2 g, 195 mmol) en DMSO (78 mL) a 120 °C por 3 d. Enfriar la mezcla de reacción, verter en H20, y extraer la mezcla con Et20. Lavar la capa orgánica con H20, secar sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo usando cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 5% NH3 2 M/MeOH en CH2CI2) para obtener el compuesto del título como un sólido ceroso (6.41 g, 57%) . ES/MS m/z 291.2 (M+l) .

Preparación 9 Z\fl.-Bencil-W2- (6- ( -fluorofenil ) -4, 5-dimetilpiridazin-3- il ) etan-1 , 2-diamina Tratar una mezcla desgasificada con N2 de NI-bencil-W2- (6-cloro-4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) etan-1, 2-diamina (6.40 g, 22.0 mmol) , ácido 4-fluorofenilborónico (9.24 g, 66.0 mmol) y CsF (10.0 g, 66.0 mmol) en 1,4-dioxano (220 mL) con cloruro de ( 1 , 11 -bis (difenilfosfino) ferroceno) paladio ( II ) (2.70 g, 3.30 mmol) . Calentar la mezcla de reacción a 95 °C durante la noche. Enfriar, y dividir entre NaHCC saturado (ac) y EtOAc. Separar las capas, y extraer la capa acuosa con EtOAc. Combinar las capas orgánicas, secar sobre Na2SC , filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de O a 6% NH3 2M/MeOH en CH2CI2) para proporcionar el compuesto del título como un sólido ceroso (4.91 g, 64%). ES/MS m/z 351.2 (M+l) .

Preparación 10 -W-Bencil-2-cloro-W- (2- (6- ( -fluorofenil ) -4, dimetilpiridazin-3-ilamino) etil) propanamida Tratar consecutivamente una solución de NL-bencil-N2- {6- ( 4-fluorofenil ) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-il ) etan-1 , 2-diamina (4.90 g, 13.98 mmol) en CH2C12 (70 mL) con ácido {R)~ ( + ) -2-cloropropiónico (1.84 mL, 20.97 mmol), trietilamina (2.92 mL, 20.97 mmol), HOBT (3.21 g, 20.97 mmol), y clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil ) -3-etilcarbodiimida (4.02 g, 20.97 mmol). Agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente durante la noche. Lavar la mezcla de reacción con NaHC03 acuoso saturado. Extraer la capa acuosa con CH2C12. Combinar las capas orgánicas, secar sobre Na2SC>4, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (20% EtOAc en hexanos) para proporcionar el compuesto del título como una espuma amarilla (4.59 g, 74%) . ES/MS m/z 441.2 (M+l) .

Preparación 11 l-Bencil-4- (6- ( -fluorofenil ) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) -3- metilpiperazin-2-ona Tratar una solución a 0°C de (R) -W-bencil-2-cloro-N- ( 2- ( 6- ( 4-fluorofenil ) -4 , 5-dimetilpiridazin-3-ilamino) etil) propanamida (4.59 g, 10.4 mmol) en THF (104 mL) con NaH (60%, 625 mg, 15.6 mmol) . Permitir que la mezcla de reacción se caliente a temperatura ambiente y agitar durante la noche. Enfriar la reacción a 0 °C, y tratar con NaH adicional (60%, 208 mg, 5.20 mmol) . Permitir que la mezcla de reacción se caliente a temperatura ambiente y agitar por 3 d. Dividir la mezcla de reacción entre salmuera y EtOAc. Separar la capa orgánica, secar sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 2% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) para proporcionar el compuesto del título como una espuma blanca (3.64 g, 86%) . ES/MS m/z 405.2 (M+l) .

Preparación 12 3- ( -Bencil-2-metilpiperazin-l-il ) -6- (4-fluorofenil)-4, 5- dimetilpiridazina fluorofenil) -4, 5-dimetilpiridazin-3-il ) -3-metilpiperazin-2-ona (2.84 g, 7.02 mmol) en THF (70 mL) con complejo de borano-sulfuro de metilo (1.96 mL, 21.1 mmol). Calentar la mezcla resultante a 50 °C por 2 h. Enfriar la mezcla de reacción en un baño de hielo, agregar eOH (20 mL) vía un embudo de goteo seguido por HC1 4 M en 1,4-dioxano (20 mL) . Calentar la mezcla resultante a 65 °C por 1 h. Concentrar la mezcla bajo presión reducida. Dividir el residuo entre CH2C12 y NaHCC>3 saturado (ac) . Separar las capas, y extraer la capa acuosa con CH2CI2. Combinar las capas orgánicas, secar sobre Na2SC>4, filtrar, y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 3% NH3 2 M/MeOH en CH2C12) para proporcionar el compuesto del título como un sólido ceroso (2.45 g, 89%). ES/ S m/z 391.2 (M+l) .

Separar los isómeros de 3- ( 4-bencil-2-metilpiperazin-l-il) -6- ( 4-fluorofenil ) -4, 5-dimetilpiridazina por cromatografía quiral (Chiralcel OJ-H, velocidad de flujo 30 mL/min, detección 225 nm, 6:4 MeOH : acetonitrilo) . Primer pico de elución, Isómero 1: 99% ee. Segundo pico de elución, Isómero 2: 99% ee .

Preparación 15 3- ( 4-Fluorofenil ) -4, 5-dimetil-6- (2-metilpiperazin-l- il ) piridazina Agregar una solución de 3- (4-bencil-2-metilpiperazin-l-il) -6- (4-fluorofenil) -4, 5-dimetilpiridazina (200 mg, 3.25 mmol) en EtOH absoluto (15 mL) a 10% Pd/C (46.8 mg) pre-humedecido con EtOH (5 mL) . Sacudir la mezcla en una botella Parr presurizada con H2 a 60 psi por 10 h. Filtrar la mezcla de reacción, y aplicar la solución directamente a una columna SCX (Varían, 2 g) . Enjuagar la columna con MeOH y CH2CI2 . Eluir el producto con una mezcla 1:1 de NH3 2 M/MeOH y CH2CI2 . Concentrar el eluyente bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como una espuma blancuzca (142 mg, 92%). ES/MS m/z 301.2 (M+1).

Preparar las metil piperazinas desprotegidas en la siguiente tabla siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 15, usando la amina protegida apropiada.

Preparación 18 , 4-Difluorociclohexilcarbamato de 2, 2 , 2-tricloroetilo Tratar una mezcla a 0°C de clorhidrato de 4,4- difluorociclohexilamina (3.29 g, 19.2 mmol) y trietilamina (5.88 mL, 42.2 mmol) en CH2C12 (192 mL) con carbonocloridato de 2, 2, 2-tricloroetilo (2.91 mL, 21.1 mmol) por goteo.

Después de 1 h, permitir que la mezcla de reacción se caliente a temperatura ambiente y agitar durante la noche. Dividir la mezcla de reacción entre H20 y CH2C12 y separar las capas. Secar la capa orgánica sobre Na2S04, filtrar, y concentrar bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del titulo como un sólido blancuzco (5.75 g, 97%). GC/MS m/z 35C1 309 (M+) .

Ejemplo 1 Clorhidrato de ( S) -N- ( 4 , 4-difluorociclohexil ) -4- ( 4 , 5-dimetil 6-fenilpiridazin-3-il) -2-metilpiperazin-l-carboxamida HCI Tratar una mezcla de ( S) - , 5-dimetil-3- ( 3-metilpiperazin-l-il) -6-fenilpiridazina (199 mg, 0.70 mmol) y trietilamina (0.30 mi, 2.15 mmol) en DMSO (5 mi) con 4,4-difluorociclohexilcarbamato de 2, 2, 2-tricloroetilo (341 mg, 1.10 mmol). Calentar la reacción a 100 °C por 4 d. Verter la mezcla de reacción en H20, enjuagando con EtOAc. Extraer la mezcla con EtOAc. Lavar la capa orgánica dos veces con H20, luego salmuera. Secar sobre Na2SC>4 y concentrar bajo presión reducida. Purificar el residuo resultante por cromatografía instantánea en gel de sílice (gradiente de 0 a 10% MeOH en CH2CI2) . Disolver la base libre purificada en MeOH (1 mL) y tratar con HC1 1 M en Et2Ü (1 mL) . Concentrar la mezcla para proporcionar el compuesto del titulo como una espuma amarilla (256 mg, 76%) . ES/MS m/z 444.2 (M+l) .

Preparar las piperazinil ureas en la tabla posterior esencialmente siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando la piperazinilpiridazina apropiada.

Biología Hedgehog se ha implicado como un factor de supervivencia para los siguientes cánceres: carcinoma de célula basal; cánceres del tracto gastrointestinal superior (esófago, estómago, páncreas, y tracto biliar) ; cáncer de próstata; cáncer de mama; cáncer de pulmón de células pequeñas; cáncer de pulmón de células no pequeñas; linfoma de célula B; mieloma múltiple; cáncer gástrico; cáncer de ovarios; cáncer colorrectal; cáncer de hígado; melanoma; cáncer de riñón; y cáncer de cerebro.

Se ha afirmado que los elementos de la trayectoria de hedgehog son objetivos potenciales del fármaco para el tratamiento de cánceres. Una línea celular Daoy establecida de tumor de meduloblastoma (ATCC, HTB-186), es respondedora a ligandos Hh. Cuando estas células son tratadas con medios acondicionados con Shh agregado exógenamente, la trayectoria de señalización de Hh se activa y resulta en una expresión incrementada de Glil. Ciclopamina, un alcaloide aislado del lirio del maíz Veratrum californicum es un antagonista de hedgehog débil y se ha mostrado que suprime la expresión de Glil en respuesta a la estimulación de Shh. Recientes observaciones sugieren que la ciclopamina inhibe el crecimiento de aloinjertos y células de meduloblastoma cultivadas. Usando este sistema de modelo de célula Daoy, se pueden identificar potentes inhibidores de las trayectorias de señalización de hedgehog. Puesto que los compuestos de la presente invención son antagonistas de hedgehog, son adecuados para el tratamiento de los tipos de tumor mencionados antes.

Determinación de la IC5o de Actividad Biológica El siguiente protocolo de ensayo y resultados del mismo adicionalmente demuestran la utilidad y eficacia de los compuestos y métodos de la invención actual. Los ensayos funcionales proporcionan soporte que los compuestos de la presente invención exhiben la capacidad de inhibir la señalización de Shh. Todos los ligandos, solventes, y reactivos empleados en el siguiente ensayo están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden preparar fácilmente por un experto en la técnica.

La actividad biológica se determina usando un ensayo funcional en células de cáncer neuronal Daoy y mide los niveles de ácido ribonucleico Glil vía un sistema de ensayo de bDNA (ácido desoxirribonucleico ramificado) (Panomics, Inc., Fremont, CA) . Gli originalmente se descubrió en una linea celular de Glioblastoma y codifica una proteina de veta de zinc que se activa por señalización de Shh. La respuesta máxima se obtiene induciendo la transcripción de Glil en las células Daoy con medio acondicionado (células de riñon embriónico humano HEK-293 que expresan establemente Shh recombinante) por 24 horas y luego se mide la cantidad del transcripto Glil estimulado. La respuesta mínima es la cantidad de transcripto Glil inhibida con un compuesto de control en células Daoy que se han estimulado con medios acondicionados (células de riñon embriónico humano HEK-293 que expresan establemente Shh recombinante) por 24 horas.

Ensayo Funcional para Medir la Inhibición de Glil en Células Daoy El sistema de ensayo de bDNA utiliza la tecnología de DNA de cadena ramificada para permitir la amplificación de un ácido ribonucleico objetivo (transcripto) . La tecnología emplea tres tipos de sondas de cDNA específico de Glil, corto, híbrido, sintético que determinan la especificidad del transcripto objetivo [extensores de captura (CEs) , extensores de etiqueta (LEs) , y bloqueadores (BLs) ] que se hibridan como un complejo con los transcriptos objetivo para amplificar la señal de hibridación. La adición de un sustrato quimiolumigénico durante la etapa de amplificación permite la detección usando luminiscencia.

La línea celular Daoy obtenida de la colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) es una línea celular de tumor neuronal humano respondedora a Shh y fue establecida en 1985 a partir de un tumor de meduloblastoma cerebelar desmoplásico, una línea celular de tumor fisiológicamente relevante. Los niveles endógenos de niveles de transcriptos Glil son bajos en células Daoy pero se pueden estimular usando medios acondicionados tomados de células que establemente sobre-expresan Shh humano (una línea celular de HEK 293 establemente transfectada con hShh) .

Las células Daoy crecen a confluencia en matraces T225 de cultivo de tejido en medio de crecimiento Daoy que contiene Medio Esencial Mínimo (MEM) más 10% Suero Bovino Fetal (FBS) con aminoácidos no esenciales 0.1 nM y piruvato de sodio 1 mM. Las células se remueven de los matraces T225 usando tripsina/ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , se centrifugan, resuspenden en el medio, y luego se cuentan.

Las células Daoy luego se siembran a 50,000 células por cavidad en el medio de crecimiento en placas de cultivo de tejido claras de 96 cavidades Costar y se dejan incubar durante la noche a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% (C02) . Las células se lavan una vez en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) seguido por adición de 100 \i de Medio Acondicionado con Shh (Shh-CM) para estimular los niveles de expresión de Glil. Shh-CM se diluye para lograr la estimulación máxima usando medio de crecimiento de control -0.1% FBS/DMEM (Medio Eagle Modificado con Dulbeccos) . Las células Daoy tratadas con Shh-CM luego se tratan con varias concentraciones de inhibidores de hedgehog que varían desde aproximadamente 1 µ? a 0.1 nM. Los compuestos de prueba se dejan incubar por 24 horas a 37°C bajo C02 al 5%.

La medición del transcripto Glil se realiza usando el ensayo Quantigene 2.0 Glil como se describe por el fabricante (Panomics, Inc.) . Se prepara un amortiguador de mezcla de lisis diluida (DLM), el cual incluye Proteinasa K. Después de una incubación de 24 horas con el compuesto, las células se lavan una vez con PBS y se agregan 180 µ? de DLM a las células. La placa de células que contiene el amortiguador de lisis se sella y coloca a 55°C por 30 a 45 minutos. Los lisados de célula resultantes luego son triturados 5 veces. Una serie de sonda de trabajo que contiene sondas Glil se hace diluyendo las sondas en el DLM de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego se agregan 20 µ? de la serie de sonda de trabajo a las placas de ensayo de bDNA con 80 µ? de los lisados Daoy. Las placas se sellan e incuban durante la noche a 55°C. Las placas de bDNA luego se procesan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal se cuantifica leyendo las placas en un lector Perkin Elmer Envision que detecta la luminiscencia. La señal luminiscente es directamente proporcional a la cantidad de transcripto objetivo presente en la muestra.

Los datos de señal luminiscente del ensayo funcional se usan para calcular la IC50 para el ensayo in vitro. Los datos se calculan con base en los valores de control máximos (células Daoy tratadas con Shh-CM) y el valor de control mínimo (células Daoy tratadas con Shh-CM y una concentración inhibitoria de un compuesto de control, 1 µ? de N- ( 3-lH-benzo [d] imidazol-2-il ) -4-clorofenil ) -3, 5-dimetoxibenzamida ) . Un ajuste de curva logística de cuatro parámetros se usa para generar los valores de IC50 usando programas de software ActivityBase versión 5.3, ecuación 205 (Assay Guidance Manual Versión 5.0, 2008, Eli Lilly and Company and NIH Chemical Genomics Center) .

Siguiendo el protocolo descrito, los compuestos de la invención ejemplificados en la presente exhiben una IC50 de < 15 nM. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 1 tiene una IC50 de aproximadamente 1.26 nM con un error estándar de 0.13.9 (n=3) en el ensayo descrito anteriormente. Estos resultados proporcionan evidencia que los compuestos de la presente invención son antagonistas de hedgehog y, como tal, son útiles como agentes anticáncer.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la siguiente fórmula: caracterizado porque, R1 es hidrógeno, fluoro o ciano; y R2 y R3 son independientemente metilo o hidrógeno; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es hidrógeno.

3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque uno de R2 y R3 es hidrógeno y el otro es metilo .

4. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque R1 es hidrógeno, R2 es hidrógeno y R3 es metilo, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

5. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Un método para tratar cáncer de cerebro, carcinoma de célula basal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de célula B, mieloma múltiple, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñon o melanoma en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable .

7. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado para uso como un medicamento.

8. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, caracterizado para uso en el tratamiento de cáncer .