JP2002503959A

JP2002503959A - アルファ−アミラーゼに抵抗性のある食物グレードの澱粉

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Publication number: JP2002503959A
Application number: JP50255799A
Authority: JP
Inventors: ポールエー．セイブ; キュングスーウー
Original assignee: カンザスステイトユニバーシティリサーチファウンデーション
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 2002-02-05
Also published as: NZ501723A; US5855946A; WO1998054973A1; EP0986307A1; CA2293537A1; AU730595B2; AU7697798A; KR20010013449A

Abstract

(57)【要約】 α−アミラーゼ消化に対して高い耐性を有し、食物繊維源としてパンまたはクラッカーなどの製品中の低カロリー食品添加物として有用な、化学的に変性されたＲＳ₄デンプンを提供する。本発明のデンプンはどのようなデンプン原料（たとえば小麦、トウモロコシ、オーツ麦、米、タピオカ、緑豆、ジャガイモまたは高アミロースデンプン類）からでも製造することができるが、リン酸化処理されたリン酸２デンプンエステルが好ましい。好ましいリン酸化剤は、塩化または硫酸ナトリウムの存在下、トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）とトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）との混合物である。該デンプンの製造は、塩基性ｐＨで適度に加熱する水系スラリー反応で行うことが有利である。

Description

【発明の詳細な説明】アルファーアミラーゼに抵抗性のある食物グレードの澱粉発明の背景発明の分野本発明は、広く、α−アミラーゼによる消化に高い抵抗性のある化学的に変成された澱粉、そのような変成澱粉を含む食品、および、その澱粉の製造方法に関する。詳細には、本発明は、様様なRS，の澱粉で、α−アミラーゼによる消化に対し、少なくとも約２０％の抵抗性を示すような澱粉に属し、これらの澱粉は、低カロリーの食物繊維源を提供するパンやクラッカーといった、イーストによりまたは化学的に発酵させた食品中に混合しても良い。このような澱粉は、多官能リン酸化剤（例えば、トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）もしくはＳＴＭＰとトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の混合物）を使用して、澱粉を架橋して調製されるのが好ましい。従来の技術の説明澱粉は植物の中で食物の貯蔵するものとして働き、ヒトの食物の中で重要な成分である。澱粉の消化は、唾液と、膵臓のα−アミラーゼによって仲介されて行われ、これらの触媒作用によって、マルトース、マルトトリオース、および、デキストリンが形成される。後者の生成物は、小腸の刷子縁でＤ−グルコースにさらに加水分解される。α−アミラーゼ（分子量５０，０００−６０，０００ドルトン）は澱粉を構成するアミロースとアミロペクチン分子の中のα−１，４結合の加水分解に触媒作用を及ぼす内部作用酵素である；それらは、α−１，６−結合を加水分解せずに迂回してしまう。グルコアミラーゼとα-グルコシダーゼは、Ｄ−グルコースのα−１，４、およびα−１，６結合の両方を開裂する外部作用酵素である。１９８０年代の初期、ある澱粉が消化に抵抗性があることが分かった。その代わりに、結腸に入り、そこでバクテリアにより発酵される。上部胃腸管での澱粉の消化に対する抵抗性は、食物の物理的状態やその調製や貯蔵を含む、固有の要素、および、澱粉の消化に影響を与える生理学上の状態である外来の要素に依存すると理解されている。結腸に入った澱粉は、上部胃腸管に入った澱粉、すなわちエネルギーを与えるＤ−グルコースの生成だけであるのに比較して、たくさんの異なった生理学上の影響（下記参照）を及ぼす。１９８７年、英国ケンブリッジのＭＲＣダン臨床栄養センターのエングリスト（Ｅｎｇｌｙｓｔ）とカミングス（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ）は、生体内（インビボ）での予想される消化における特性に基づいた澱粉の分類を提案した。かれらは、澱粉の消化における種々の特性を模倣する実験上（インビトロ）の分析方法を考案した。食物（ダイエタリー）澱粉の３分類が提案された：（１）消化されるのが速い澱粉（ＲＤＳ）。ＲＤＳはヒトの小腸内で消化されるのが速いと予想される；例として、新しく調理された米、ジャガイモと、いくつかのインスタントの朝食用シリアルが含まれる。（２）消化されるのが遅い澱粉（ＳＤＳ）。ＳＤＳは小腸でゆっくりではあるが完全に消化されると予想される；例として、生のシリアルの澱粉と調理したパスタが含まれる。（３）抵抗性を示す澱粉（ＲＳ）。ＲＳは小腸での消化に抵抗性を持つと予想される。それゆえ、ＲＳは健康な個体の小腸では吸収されないと予想される澱粉と澱粉の分解生成物を併せたものとして定義される。ＲＳは抵抗性を示す原因により４つのカテゴリーに細分される（エングリスト等、１９９２、アーリンゲン（Ｅｅｒｌｉｎｇｅｎ）等、１９９３）。ＲＳ₁。例えば部分的に挽かれた穀物もしくはついばまれた後のさやといったたんぱく質のマトリックス中もしくは植物細胞壁内の細粒に入っているために物理的にアクセス（処理）することができない澱粉。ＲＳ₂。ジャガイモあるいは緑のバナナ由来のものといった、生の澱粉の細粒で、細粒の表面に小孔を持たないためかもしれないが、α−アミラーゼによる消化に抵抗性を示すもの。ＲＳ₃。ジャガイモやコーンフレークを調理し／冷ます時に起こるような、澱粉もしくは澱粉を含む食物を熱／湿気により扱うことにより形成される戻り（凝集した）アミロース。ＲＳ₄。アルファーアミラーゼによる消化に抵抗する、アセチル化、ヒドロキシプロピル化、あるいは架橋された澱粉といった、化学的に変成された澱粉。変成された澱粉は、ＲＳの実験室（インビトロ）における分析により見つけることができよう。しかし、あるＲＳ₄では結腸内で発酵しないであろう。ＲＳ₁、ＲＳ₂、ＲＳ₃は、澱粉を物理的に変成した形であり、水酸化ナトリウムもしくはジメチルスルホキシド中での可溶化によりα−アミラーゼによる消化ができるようになる。ＲＳ₄は化学的に変成されており、例え分解されてもα −アミラーゼによる消化に対し抵抗性を有したままである。ＲＳは、食物成分としてますます興味あるものとなっている。通常の食物繊維源と異なり、ＲＳはたくさんの水を保有せず、したがって、クッキーとかクラッカーといった低湿分製品中に使用するのに好ましい繊維源であろう。また、ＲＳは、ベタベタした感じがなく、従来の繊維源と異なり、食物の香りやきめの特性を著しく代えることがない。これらの特徴は、ＲＳが添加されたときに焼いたり加工成形するといった、食物の加工と質を改善することができる。さらに、ＲＳは食物繊維を構成し、カロリーはゼロであろう。ＲＳは食物中の食物繊維の断片とみなされ、ヒトの消化管において繊維として機能すると信じられている。ヒトの胃腸管におけるRSの減じられた生物学的利用能は、グルコース（ブドウ糖）のゆっくりとした放出や血中の脂質をより低くすることと共に食後の血糖の応答がより低くなるといった重要な生理学的な効果をもつ。RSが結腸に到達すると、結腸の病気を防止するという有益といわれる効果を伴って、水素、メタン、二酸化炭素、乳酸（一時的）、および短鎖の脂肪酸（アセテート、プロピオネートとブチレート）に発酵される。デンプンの消化は、加工と貯蔵の状態によって影響されうることが知られている。デンプンの化学的変成は、変成の程度とおそらく変成のタイプに関係する抑制の範囲において、それらの試験管中（インビトロ）での消化を抑制することが示されている。そのバリエーションは、澱粉の植物上の由来、使用された変成剤、その結果としての化学結合と形成される誘導体、細粒のゼラチン化の程度、と酵素の選択による（Anonymous 1972、Filer 1971）。バンク等（1973）は、置換の程度が、ヒドロキシメチルアミロースへの澱粉分解の攻撃の割合と範囲を決めることを示した。リーグウォーターとルーテン（1971）は、ヒドロキシプロピルの0.45％までの置換率の増加にともない、ヒドロキシプロピルで置換された澱粉の、パンクレアチンによる消化が指数的に低減することを報告した。ジャンセン（1969）は、0. 05と0.1％のＰＯＣｌ₃と共に架橋されたジャガイモの澱粉のリン酸塩は、消化後の残渣の重量により決められた、試験管内（インビトロ）でのパンクレアチンによる消化にはなんら影響がないが、しかし、0.05と1.51％のＰＯＣｌ₃で変成された場合は、加水分解が著しく抑制されることを報告した。フッドとアーヌソン（1976）はヒドロキシプロピルジスターチフォスフェート変成はゼラチン化されていない澱粉の消化を増進するが、しかし、ゼラチン化された澱粉の消化は低減することを報告している。架橋の導入は、細粒の構造を安定化し膨張（水吸収による膨張）を制限しがちである。架橋率が高いと、細粒のゲル相の孔が、大きな分子を通すには小さすぎるのであろう。リン酸塩架橋は、変成されていない澱粉と比較すると、酵素による加水分解をわずかに低減するか、もしくは全く加水分解に効果はないといういくつかの報告がある。（Anonymous 1972、Ostergard 1988；Bjorck等 1988）。ヒドロプロピルジスターチフォスフェート、ヒドロキシプロピルスターチ、および、ジスターチフォスフェートを食べたラットの腸内微生物の変化は、エーテル結合を持つ澱粉は、リン酸塩結合のみ持つ澱粉よりも消化が難しいことを示す（フッド1976）。ジャガイモの澱粉のヒドロキシプロピルジスターチフォスフェート誘導体は、ラットでは生体内（インビボ）で50 ％消化性であることを示す（Bjorck等1988）。一般的に食物繊維の健康上の利益と、ＲＳ₄の潜在的な更なる有利な特性という観点から、化学的に変成された澱粉の低コストの製造方法と同様に、α-アミラーゼに対する高度の抵抗性をもつＲＳ₄澱粉の改善技術が求められている。本発明の要約本発明は、上記概説した問題を克服し、米国分析化学協会（ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｓ， AOAC）の992.16（1995）の方法を使って測定した、α-アミラーゼの消化に対する少なくとも約20％の抵抗性を示す化学的に変成された澱粉を提供する。前述の方法を使って、α-アミラーゼの消化に対し、さらに好ましくは、澱粉は少なくとも35％の抵抗性を有し、最も好ましくは少なくとも50％の抵抗性を有する。例えば、シリアル、根、塊茎、さやおよび高アミロース澱粉からなる群より選ばれる澱粉等の、幅広い多様な天然の澱粉は、本発明の化学的に変成された澱粉を調製するのに利用できる。好ましい澱粉の特別な例には、小麦、とうもろこし、オート麦、米、タピオカ、緑豆およびジャガイモの澱粉が挙げられる。アセチル、スクシニル、および、フォスフオリル基は、α-アミラーゼによる消化に対する抵抗を高めるであろうが、好ましい澱粉は、架橋されたものである。架橋された澱粉は、ジスターチフォスフェートジエステル類を形成するためにリン酸化されているのが最も好ましく、少なくとも0.1重量％の残留リンを含み、さらに好ましくは0.2重量％含む。最も好ましいリン酸化剤は、STMP単独かもしくはSTMPとSTPPの混合物である。一般には、混合物が使用される場合、約1-20 重量％のSTMP（最も好ましくは約5-12重量％のSTMP）と約0.01-0.2重量％のSTPP（最も好ましくは0.05-0.12重量％のSTPP）を含むべきである。 STMP／STPP混合物は、最初の変成していない澱粉の重量を100重量％として、約1 -20重量％、さらに好ましくは5-12重量％のレベルで有利に用いられる。STMP単独で用いる場合も、上記広い範囲や好ましい範囲が採用できる。このほかの有用なリン酸化剤は、塩化フォスフォリルである。さらに、アジピン酸やエピクロロヒドリンといった他の架橋剤も使用できる。本発明の化学的に変成された澱粉は、パンやクラッカーといった、特にイーストによりまたは化学的に発酵させた、小麦ベースの、焼いたもしくは揚げた食物の食品添加物として特に有用である。この意味で、本発明の澱粉は、低カロリーの食物繊維源もしくは抵抗性の澱粉として役立つ。一般に、変成澱粉は、食品中、約25重量％まで、さらに好ましくは約15重量％まで含まれて使用されるであろう。35重量％まで含むことができる。化学的に変成された澱粉は、出発物質である澱粉（普通、天然の変成されていない）を、前述のα-アミラーゼ消化特性をもつ変成澱粉を生成するためのpHと温度の条件下で、水の存在下、架橋剤と反応させることで調製される。好ましい調製方法は、最初に、水に出発物質の澱粉をいれたスラリーを作って、スラリーに架橋剤をいれることを含む。スラリーは、典型的には、約15-60重量％、さらに好ましくは約30-50重量％の澱粉を有する。好ましいリン酸化架橋剤は、先に記載したSTMP単独かもしくはSTMPとSTPPの混合物であろう。好ましい反応条件は、塩基性のpH(好ましくは約10-13で、さらに好ましくは11-12)で、約25-70℃、さらに好ましくは30-50℃の反応温度である。反応は、必要な程度のα-アミラーゼの消化に対する抵抗をもたらすのに十分な時間だけ行われるのが必要で、この時間は、普通、約1/6-24時間、さらに好ましくは約1-3時間であろう。リン酸化試薬として、STMP単独かもしくはSTMPとSTPPの混合物が用いられる場合、硫酸ナトリウムもしくは塩化ナトリウムを（最初の澱粉の重量を100重量％として、約0.1-20重量％）スラリーに加えると好ましい。これらの塩の一つがあると、反応中でのゲル生成を遅らせ、澱粉細粒により吸収される塩基を増加させることで反応を加速するのに役立つ。図面の簡単な説明図１は、α-アミラーゼを用いたRSについてのAOAC測定に含まれるステップを図式的に表したものである。図２は、豚の膵臓のα-アミラーゼを用いたRS測定の変形した方法を図式的に表したものである。図３Ａは、澱粉重量に対し、10重量％の硫酸ナトリウムと、99/1（重量／重量）のSTMP/STPPの混合物を総合レベルで1.2重量％の存在下、pH11.5、45℃で３時間で、澱粉スラリー（40％）から作った変成した澱粉のリン酸塩の経時曲線である（10％澱粉スラリー）。図３Ｂは、澱粉重量に対し、10重量％の硫酸ナトリウムと、99/1（重量／重量）のSTMP/STPPの混合物を総合レベルで0.6重量％の存在下、pH11.5、45℃で３時間で、澱粉スラリー（40％）から作った変成した澱粉のリン酸塩の経時曲線である（10％澱粉スラリー）。図４Ａは、ハムスターの試験での摂取した試料対時間を示すグラフで、試験では、ハムスターは4種の試験食物、すなわち、セルロース（CL）、ノベロース(NOV)、ＲＳ₄‐小麦-39、および、ＲＳ₄‐小麦-76を与えられ、全ての食物は同レベルの繊維、抵抗性澱粉（AOAC、10％）、蛋白質（15％）、脂肪（10％）およびコレステロール（0.5％）を含む。図４Ｂは、ハムスターの試験での体重対時間を示すグラフで、試験では、ハムスターは4種の試験食物、すなわち、セルロース（CL）、ノベロース(NOV)、ＲＳ₄ ‐小麦-39、および、ＲＳ₄‐小麦-76を与えられ、全ての食物は同レベルの繊維、抵抗性澱粉（AOAC、10％）、蛋白質（15％）、脂肪（10％）およびコレステロール（0.5％）を含む。図５は、ノベロース（Ｎｏｖｅｌｏｓｅ）という名で販売される市販で手に入る抵抗性澱粉のX1000走査電子顕微鏡での像（SEM）である。図６は、クリスタリーン（ＣｒｙｓｔａＬｅａｎ）という名で販売される市販で手に入る抵抗性澱粉のX1000SEMである。図７は、未処理の小麦の澱粉のX1000SEMである。図８は、本発明に従った化学的に変成された澱粉、ＲＳ₄‐小麦-76のX1000SEM である。図９は、未処理のとうもろこしの澱粉のX1000SEMである。図１０は、本発明に従った化学的に変成された澱粉、ＲＳ₄‐とうもろこし-58 のX1000SEMである。図１１は、未処理のジャガイモの澱粉のX1000SEMである。図１２は、本発明に従った化学的に変成された澱粉、ＲＳ₄‐ジャガイモ-73の X1000SEMである。図１３は、水20部中の澱粉を沸騰させ、ついで、37℃で16時間、豚の膵臓のα-アミラーゼ(PPA)を使って１０⁵U/gの該澱粉を消化させた後に分離された市販ノベロース澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図１４は、水20部中の澱粉を沸騰させ、ついで、37℃で16時間、豚の膵臓のα -アミラーゼ(PPA)を使って１０⁵U/gの該澱粉を消化させた後に分離された市販クリスタリーン澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図１５は、水20部中の澱粉を沸騰させ、ついで、37℃で16時間、豚の膵臓のα -アミラーゼ(PPA)を使って１０⁵U/gの該澱粉を消化させた後に分離されたＲＳ₄ ‐小麦-76澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図１６は、水２０部中の澱粉を沸騰させ、ついで、37℃で16時間、豚の膵臓の α-アミラーゼ(PPA)を使って１０⁵U/gの該澱粉を消化させた後に分離されたＲＳ₄ ‐とうもろこし-58澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図１７は、水２０部中の澱粉を沸騰させ、ついで、37℃で16時間、豚の膵臓の α-アミラーゼ(PPA)を使って１０⁵U/gの該澱粉を消化させた後に分離されたＲＳ₄ ‐米85澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図１８は、水２０部中の澱粉を沸騰させ、ついで、３７℃で１６時間、豚の膵臓のα-アミラーゼ(PPA)を使って１０³U/gの該澱粉を消化させた後に分離された市販ノベロース澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図１９は、水２０部中の澱粉を沸騰させ、ついで、３７℃で１６時間、豚の膵臓のα-アミラーゼ(PPA)を使って１０³U/gの該澱粉を消化させた後に分離された市販クリスタリーン澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図２０は、水２０部中の澱粉を沸騰させ、ついで、３７℃で１６時間、豚の膵臓のα-アミラーゼ(PPA)を使って１０³U/gの該澱粉を消化させた後に分離されたＲＳ₄‐小麦-76澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。図２１は、水２０部中の澱粉を沸騰させ、ついで、３７℃で１６時間、豚の膵臓のα-アミラーゼ(PPA)を使って１０³U/gの該澱粉を消化させた後に分離されたＲＳ₄‐とうもろこし-58澱粉の残渣のX2000SEMであり、該残渣は遠心分離で分離され、エタノールで洗浄され風乾される。発明を実施するための最良の形態実施例下記の実施例において、ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰおよび他の架橋剤で、デンプン（小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、コメ、タピオカ、緑豆、オーツ麦）をリン酸化することにより研究を行い、Ｐの濃度が０．４％までの値をとるデンプン製品中のＲＳ₄の濃度を測定し、ＲＳ₄含有飼料およびセルロースを与えた成長期のハムスター中の血清コレステロール反応および盲腸短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）濃度を調べた。材料および方法原料以下の品目を、シグマケミカル(Sigma Chemical)社（セントルイス）から購入した：トウモロコシ、ジャガイモ、およびコメのデンプン、トリメタリン酸ナトリウム、エピクロロヒドリン、アミログルコシダーゼ溶液（カタログ番号Ａ９９１３）、プロテアーゼ溶液（カタログ番号Ｐ３９１０）。ＩＶ−Ｂタイプ α−アミラーゼ（カタログ番号Ａ３１７６）、並びにコレステロールおよびＨＤＬコレステロール診断キット（それぞれ、カタログ番号３５２および３５２−３）。緑豆デンプンは、地元のアジア食品店で購入した。ブタのすい臓のα−アミラーゼ（ＰＰＡ）は固体分２３単位／ｍｇを含み、一単位は、ｐＨ６．９、２０℃で、３分の間にデンプンから１．０ｍｇのマルトースを遊離する。小麦デンプン（ミドソール(Midsol)５０）を、ミッドウエストグレインプロダクト(Midwest Grain Product)社（カンザス州アトキソン(Atchison)から調達し、タピオカデンプンおよびノベロース(Novelose)（耐性デンプン）を、ナショナルスターチアンドフード(National Starch and Food)社（ニュージャージー州ブリッジウォーター）から、クリスタリーン(CrystaLean)(耐性デンプン）を、オプタフードイングリーディエンツ(Opta Food Ingredients)社（マサチューセッツ州ベッドフォード）から調達した。塩化ホスホリルをアルドリッチケミカル(Aldrich Chemical)社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から得た。熱的に安定なα−アミラーゼである、タームアミル(termamyl)を溶液状で、ノボ(N OVO)(ノースキャロライナ州フランクリントン、ノボノルディスク(Novo Nordisk，Franklinton,NC)）から得た。タームアミルは、９．７８×１０³単位／ｍｌの酵素活性を有し、ロビート(Robyt)とウエラン(Whelan)（１９６８）により定義された一単位により、最適なｐＨ、２５℃で、２０ｍｇ／ｍｌの可溶性デンプン溶液中、１分あたり１μｍｏｌの分解基を遊離する。グルコース酵素分析キット（試験組合せ、カタログ番号７１６２５１）を、ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)（インディアナ州インディアナポリス）から購入し、雄の離乳したゴールデンシリアン(golden Syrian)ハムスターを、サスコ(Sasko)社（ネブラスカ州オマハ）から、セルロース（ＣＬ、ソルカーフロック(Solka-Floc)）をＦＳ＆Ｄ社（オハイオ州ウラバナ）から購入した。一般的な方法すべての化学的分析は、特に指摘しない限り３回行った。蛋白質は、ケルダール窒素（ＡＡＣＣ法４６−１３）によって分析され、灰は、乾燥燃焼（ＡＡＣＣ法０８−０１）によって、水分は、サンプルを１３０℃で１時間オーブン乾燥する（ＡＡＣＣ法４４−１５）ことにより分析された。デンプン中（５〜１０ｇのサンプル量）のリン(phosphorus)の量は、スミス(Smith)とカルソ(Caruso)の手順、”炭水化物の化学の方法”４：４２（１９６４）により測定された。特に指摘しない限り、リンの量には、もともとデンプンに存在するリン酸塩、およびデンプンとエステル化したリン酸塩を含めた。デンプンの粘性挙動を、７００ｃｍ・ｇ、７５ｒｐｍにおけるブラベンダー粘性グラフ（Ｃ．Ｗ．ブラベンダー機器(C.W.Brabender Instruments)ニュージャージー州ハッケンサック）で調べた。デンプンの水性スラリー（８％、乾燥基準）を１．５℃／秒の速度で、３０から９５℃まで昇温し、９５℃で３０分間保持して、５０℃まで冷却し、５０℃で３０分間保持した（マズラス等(Mazurs et al)１９５７、チップル(Tipples)１９８０)。粘性曲線が再現性をよく二度描けた。ジメチルスルホキシドへのデンプンの溶解は、水浴中で振盪させながら、デンプン（０．５ｇ）を５５℃で９０％ＤＭＳＯ（１００ｍｌ）と混合させることにより行った（リビー等(Libby et al)１９７０）。３０分後、不溶性のデンプンを遠心分離（８，０００×ｇ１５分間）により回収し、上澄みを傾斜して、沈殿したデンプンをエタノール（２×１００ｍｌ）で洗い、その後、４０℃で乾燥させた。ＤＭＳＯの不溶性を測定するため、乾燥した残留物の重さを測った。２３℃、９５％の相対湿度で、２４時間貯蔵したサンプルについて、デンプンのＸ線回折を行った。Ｘ線回折は、３５ＫＶ、２０ｍＡで駆動するフィリップス（Philips）（モデル４２２７３）Ｘ線回折計（ニュージャージー州マーワー(Ma hwah)、フィリップス）で測定した。デンプンのＸ線回折パターンは、Ｃｕ／Ｎｉ箔をフィルターにして、Ｋα線で測定した。サンプルは２θ（回折角）で、５〜３５°の範囲で、１分あたり２°×２θで記録した。ステップ間隔０．０１° θ、カウント時間１秒を採用した。走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を、パーキン−エルマーイーテックオートスキャン(Perkln-Elmer Etec-Autoscan)Ｕ−１顕微鏡を用いて、加速電位２０ｋｖでとった。標本スタブ上面の両面粘着テープの上にデンプンサンプルをふりかけ、金で被覆した。１００℃におけるＡＯＡＣ法によるＲＳの測定（ＲＳ−ＡＯＡＣ）食物繊維を測定する公式な方法（ＡＯＡＣ１９９５）によりＲＳを測定した。この技術は図１に例示される。４００ｍｌのトール型ビーカーで、デンプン（１ｇ）をｐＨ８．２である４０ｍｌの０．０５ＭＭＥＳ−ＴＲＩＳ緩衝溶液中に分散させ、低速度でかき混ぜながら、タームアミルα−アミラーゼ溶液（５０μ Ｌ、４８９単位）を加えた。ビーカーをアルミニウム箔で覆い、連続的に振盪させながら、１００℃の水浴中に３０分間静置した。６０℃まで冷却した後、プロテアーゼ（１００μｌ）を加え、連続的に振盪させながら、混合物を３０分間保温した。５ｍｌの０．５６１ＭＮａＯＨ溶液を加えて、この溶液をｐＨ４．０〜４．７に調整し、アミログルコシダーゼ溶液（３００μｌ）を加えた。３０分間保温後、消化産物を室温まで冷やし、秤量焼結ガラスるつぼ（多孔度２番）上に、濾過補助器具である乾燥したセライト床（１．０ｇ）で濾過した。不溶性の残留物を蒸留水（２×１５ｍｌ）、７８％エタノール、無水アルコールおよびアセトンで洗浄した。残留物のあるるつぼを、１０５℃の強制通風式オーブンで一晩乾燥させ、室温まで冷やし、無水硫酸カルシウム上の乾燥器中で、室温まで冷えた後の重さを量った。ＲＳは、不溶性残留物であり、乾燥基準で、デンプンの割合として表現される。３７℃でのブタのすい臓のα−アミラーゼによるＲＳの測定（ＲＳ−ＰＰＡ）以下は、エングリスト(Englysl)（１９８２）に発表された方法を修正したものであり、ＲＳ（ＰＰＡ）と呼ぶ。この方法は、図２で図解されている。スクリュー栓付き遠心分離管（５０ｍｌ容量、２８．５×１１４．３ｍｍ；ナルジェン(Nalgene)、カタログ番号３１３９−００５０）中で、デンプン（０．２５ｇ）を、ブタのすい臓のα−アミラーゼ（ＰＰＡ）（１．０８７０ｇ）含有０．１Ｍ（ｐＨ６．９）リン酸塩緩衝溶液（２５ｍｌ）に加えた。ＰＰＡの濃度は、デンプン１ｇあたり、１００，０００単位の酵素と同等であった。反応混合物はマグネットスターラー（３×１２．７ｍｍ）で強くかき混ぜながら、３７℃ で１６時間保温した。消化産物を冷却し、遠心分離し（３，０００×ｇで１０分間）、透明な上澄みの分液（０．５ｍｌ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝試薬（ｐＨ４．０）２０容を希釈して前もって調製した９．５ｍｌのアミログルコシダーゼ溶液と共に、６０℃で６０分間保温した。グルコアミラーゼ消化の後、サンプルは遠心分離し（３．０００×ｇで１０分間）、上澄みの分液（０．１ｍｌ）を、水（１．９ｍｌ）と、グルコース分析キットの試薬Ｉ（３．２Ｍ硫酸アンモニウム溶液、ｐＨ７．６，１．０ｍｌ中でのＮＡＤＰとＡＴＰとの混合物）とで、２５℃、〜３分間混合した。続いて、分析キット試薬ＩＩ（３．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．０２ｍｌ中でのヘキソキナーゼとグルコース−６−リン酸脱水素酵素との混合物）を加え、１５分後、この溶液の３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。この分析で、過剰なヘキソキナーゼ（ＨＫ）およびアデノシン５−三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で、グルコースはグルコース−６−リン酸（Ｇ−６− Ｐ）に変わる。Ｇ−６−Ｐは、続いて、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）により、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸の還元体（ＮＡＤＰＨ）を伴って、グルコネート−６−リン酸に酸化される。３４０ｎｍにおける吸光度により測定された、この反応で形成されたＮＡＤＰＨの量は、化学量論的に、Ｄ−グルコースの量に相当する。３４０ｎｍにおける吸光度はブランクで修正し、グルコースをデンプンに換算した（グルコース１ｇは、デンプン０．９ｇに等しい）。デンプンを入れないで、同じ酵素消化手順をふむことにより、ブランクサンプルを調製した。調理後のデンプンの消化性を測定するため、スクリュー栓付きナルジェン遠心分離管（５０ｍｌ）中でデンプン（０．２５ｇ）を水（５ｍｌ）と混合した。スクリュー栓を締めた後、密閉した管を、沸騰した水浴中に３０分間静置し、この高温の混合物に直ちに、０．１２５Ｍ（ｐＨ６．９）リン酸塩緩衝溶液（１０ｍｌ）を加えた。混合物が３７℃にまでなった時、０．１２５Ｍ（ｐＨ６．９）リン酸塩緩衝溶液（１０ｍｌ）にブタのすい臓のα−アミラーゼ（１．０８７０ｇ、２５，０００単位）溶液を加え、消化産物を３７℃で１６時間、強くかき混ぜた。他の消化を、デンプン１ｇあたり、５０，０００、１０，０００および１，０００単位で行った。各消化産物は遠心分離し、上澄みの分液（０．５ｍｌ）を、上述したグルコアミラーゼで消化した。分離されたグルコースを、ベーリンガーマンハイムキットで測定し、消化されなかったデンプンは、差で測定した。いくつかの調理済みデンプンからの耐性残留物の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を撮った。この残留物を、遠心分離で分離し、水で洗浄して、空気乾燥した。このサンプルは、スタブの上に配置し、金の薄膜で覆い、顕微鏡で観察した。実施例１ＡＳＴＭＰ／ＳＴＰＰまたはＳＴＭＰを用いた水性スラリー中でのデンプンのリン酸化小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、トリメタリン酸ナトリウム（５．９４ｇ、１１．８８％、デンプン基準で（以下、”ｂｏｓ”という））、ＳＴＰＰ（０．０６ｇ、０．１２％、ｂｏｓ）とともに、または抜きで、および硫酸ナトリウム（５ｇ、１０％、ｂｏｓ）を丸底フラスコ内に静置し、この混合物を、１．０Ｍの水酸化ナトリウム（〜２５ｍｌ）を加えて、ｐＨ１１．５に調整した。このスラリーを連続的にかき混ぜ、４５℃まで温め、４５℃で３時間保持した。この時間の後、このスラリーのｐＨは、〜０．２〜０．３ｐＨ単位だけ落ちていた。このスラリーに、１．０Ｍ塩酸を、通常〜２０ｍｌ未満加えてｐＨ６．５に調整し、デンプンを遠心分離により回収し、水（４×１００ｍｌ）で洗浄し、４０℃で乾燥させた。リン酸化したデンプンは、０．３８％のリンを含み、その収率（および他のすべてのリン酸化したデンプンの収率）は〜９９％より大きかった。ＡＯＡＣ法により測定したＲＳの濃度は、７６％であり、この生成物を、ＲＳ₄−小麦−７６（表Ｉ）と呼ぶ。同様にして、３．９６％ＳＴＭＰと０．０４％ＳＴＰＰを用いて反応させた小麦デンプンでは、ＡＯＡＣによるＲＳ濃度は３９％となり、これをＲＳ₄−小麦−３９と呼ぶ。追加試験として、ＳＴＭＰとＳＴＰＰとの比率を変えたものを使用して行い（表ＩＩ）、また、反応条件を変えて行った（表ＩＩＩ）。トウモロコシ、ジャガイモおよびコメ、並びに緑豆デンプンも、９９：１ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ混合物を、それぞれ全部で、１２％、１４％、９％および１２％用いて、同様の方法でリン酸化し、１００％収率で、ＲＳ₄−トウモロコシ−５８、ＲＳ₄−ジャガイモ−７３、およびＲＳ₄−コメ−５、並びにＲＳ₄−緑豆− ９８を得た（即ち、ＡＯＡＣＲＳ濃度で、それぞれ５８％、７３％、５％および９８％）。Ｂ他のデンプンのリン酸化法、およびデンプン架橋法リン酸化することにより、耐性デンプンを製造するいくつかのその他の方法が考え出された。１．１０％（ｂｏｓ）硫酸ナトリウム存在下で、温度勾配を伴ったリン酸化。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、トリメタリン酸ナトリウム（６．９３ｇ、１１．８６％、ｂｏｓ）、ＳＴＰＰ（０．０７ｇ、０．０１４％、ｂｏｓ）と共に、または除いて、および硫酸ナトリウム（５ｇ、１０％、ｂｏｓ）を丸底フラスコ内に静置し、この混合物に、１．０Ｍ水酸化ナトリウム（〜２５ｍｌ）を加えてｐＨ１１．５に調整した。このスラリーを連続的にかき混ぜ、平均速度１．１℃／分で、２５°から７０℃まで昇温し、７５℃で２０分間保持した。室温まで冷却した後、スラリーに１．０Ｍ塩酸（通常〜２０ｍｌ未満）を加えて、ｐＨ６．５に調整し、デンプンを遠心分離により回収し、水（４× １００ｍｌ）で洗浄し、４０℃で乾燥させた。２．１０％硫酸ナトリウム存在下、ｐＨ勾配を伴った、穏やかな温度でのリン酸化。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、および硫酸ナトリウム（５ｇ、１０％、ｂｏｓ）を、２つの濃度（１２％、１６％、ｂｏｓ）のＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ混合物（９９：１）と共に、丸底フラスコ内に静置した。各混合物を４５℃まで昇温し、１．０Ｍ水酸化ナトリウム（〜２５ｍｌ）を加えて、ｐＨ１１．５に調整した。このスラリーを５分間かき混ぜ、２Ｍ水酸化ナトリウムを１０ｍｌ加えた。最終的なｐＨが１２．３となるように、この水酸化ナトリウムを、５分の間隔をおいて２回以上繰り返して加えた。このスラリーを、更に１５分連続的にかき混ぜ、全反応時間を３０分とした。１．０Ｍ塩酸を加えて、スラリーをｐＨ６．５に調整し、デンプンを前述したように分離した。３．２０％硫酸ナトリウム存在下、高温（７０℃）におけるリン酸化。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、および高濃度硫酸ナトリウム（１０ｇ、２０％、ｂｏｓ）を、丸底フラスコ内に２５℃で静置し、この混合物に１．０Ｍ水酸化ナトリウム（〜２５ｍｌ）を加えて、ｐＨ１１．５に調整した。このスラリーを連続的にかき混ぜ、７０℃まで昇温し、トリメタリン酸ナトリウム（４．９６ｇ、９．９％、ｂｏｓ）、ＳＴＰＰ（０．０５ｇ、０．１％、ｂｏｓ）の混合物を加えた。７０℃で３０分間かき混ぜた後、この混合物を室温まで冷却した。このスラリーに１．０Ｍ塩酸を（通常〜２０ｍｌ未満）加えて、ｐＨ６．５に調整し、デンプンを前述したように分離した。４．１０％硫酸ナトリウム存在下、５時間かける室温におけるリン酸化。いくらかより長い反応時間（３時間に対して、５時間）かけて、反応温度を低くして（４５℃に対して、２５℃）、ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ混合物の濃度を高くして（ｂｏｓ，１２％に対して、１４％）、デンプンを室温におけるスラリー反応で、リン酸化し、ＲＳ₄−小麦−７６を調製した。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、トリメタリン酸（６．９３ｇ、１３．８６％、ｂｏｓ）、ＳＴＰＰ（０．０７ｇ、０．１４％、ｂｏｓ）および硫酸ナトリウム（５ｇ、１０％、ｂｏｓ）を、丸底フラスコ内に静置し、この混合物に１．０Ｍ水酸化ナトリウム（〜２５ｍｌ）を加えて、ｐＨ１１．５に調整した。このスラリーを連続的にかき混ぜ、室温で５時間保持し、その時間の後、反応混合物を中性にして、デンプンを前述したように分離した。５．１０％硫酸ナトリウム存在下、穏やかな温度（４５℃）における、高濃度ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰを用いたリン酸化。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、高濃度ＳＴＭＰ（９．４ｇ、１９％、ｂｏｓ）およびＳＴＰＰ（０．１ｇ、０．１９％）および硫酸ナトリウム（５ｇ、１０％）を、丸底フラスコ内に静置し、この混合物に１．０Ｍ水酸化ナトリウム（〜２５ｍｌ）を加えて、ｐＨ１１．５に調整した。このスラリーを連続的にかき混ぜ、４５℃に温め、４５℃で１時間保持し、その時間の後、反応混合物を中性にして、デンプンを前述したように分離した。６．硫酸ナトリウム不存在下、室温、高ｐＨにおけるリン酸化。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）、高濃度トリメタリン酸ナトリウム（６．９４ｇ、１１．８８％、ｂｏｓ）、ＳＴＰＰ（０．０６ｇ、０．１２％、ｂｏｓ）を、丸底フラスコ内に２５℃で静置し、５分間かき混ぜた。次いで、この混合物に１．０Ｍ水酸化ナトリウム（〜４５ｍｌ）を加えて、ｐＨ１２に調整した。この混合物を室温にて連続的に１２時間かき混ぜた。反応後、デンプンスラリーに、１ＭＨＣｌ（２０±１．５ｍｌ）を加えて、ｐＨ６．５まで中和させ、デンプンを前述したように分離した。７．エピクロロヒドリンによる架橋。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）、水（７０ｍｌ）および硫酸ナトリウム（７．５ｇ）を混合し、混合物に１．０Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ１１．５に調整した。このスラリーに、エピクロロヒドリン（０．１５、０．５および１．０ｇ）を加え、２５℃で１５時間反応をさせた。反応混合物を鉱物酸でｐＨ６．５に調整し、デンプンを前述したように分離した。８．半懸濁反応条件を採用したリン酸化。典型的な反応において、小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）を、硫酸ナトリウム５部（ｂｏｓ）およびＳＴＭＰ／ＳＴＰＰの９９／１（重量／重量）混合物を２部含む、２５℃の水（７０ｍｌ）でかき混ぜた。このスラリーに１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ１１．５に調整し、１時間かき混ぜて、１００℃で水分が１５％未満となるまで乾燥させた。この乾燥混合物を、強制対流式オーブンで、１３０℃で２時間熱した。室温まで冷却させた後、この反応混合物を蒸留水（１００ｍｌ）中に分散させ、この分散溶液に１Ｍ塩酸を加えて、ｐＨ６．５に調整した。変性したデンプンを遠心分離により回収し、水（１００ｍｌ×４）で洗浄し、乾燥させた。９．塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ₃）によるリン酸化。主にフェルトン(Felton) とショップメイヤー(Schopmeyer)（１９４３）の方法で、ＰＯＣｌ₃を用いて、デンプンの架橋を行った。小麦デンプン（５０ｇ、乾燥基準）を、水（７０ｍｌ）中で２５℃で１時間懸濁させ、硫酸ナトリウム１ｇ（２．０％、ｂｏｓ）を加えた後、１Ｍ水酸化ナトリウムを加えて、スラリーをｐＨ１１．０にした。塩化ホスホリル０．１％（重量／重量）を、マイクロリットルスポイトを用いて、デンプンスラリー中に注入し、１時間後、スラリーを１Ｍ塩酸を用いて、ｐＨ５．５に調整した。このデンプンを遠心分離（１５，０００ｇで１０分間）により回収し、水（４×ｌ００ｍｌ）で洗浄し、４０℃で乾燥させた。高ｐＨ（１２）および高濃度硫酸ナトリウム（１５％）で行う点を除いて、同様の方法で、０．１％ＰＯＣｌ₃にて、別の架橋反応を行った。２番目の一連の架橋反応は、１．０および２．０％の塩化ホスホリル（ｂｏｓ）を用いて、１５％硫酸ナトリウム（ｂｏｓ）存在下で、スラリー反応で行われた。試薬を多めに加える（０．１ｍｌ）一方で、１Ｍ水酸化ナトリウムを滴下して、ｐＨを１１．５± ０．３に維持した。デンプンを前述したように分離し、生成物中のリン酸化物の濃度および耐性デンプンの濃度を測定した。表Ｉは、異なった架橋剤を用いた変性デンプンにみられるＲＳ濃度の比較を示す。それぞれ０．１および０．３％の塩化ホスホリルおよびエピクロロヒドリンでは、ほとんど耐性デンプンを得られないが、２％であると、７５〜８５％の耐性デンプンが得られる。ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ試薬では、充分な濃度で使用すると、３時間の反応で、０．３８％の残リン量が得られ、また、高い濃度の耐性デンプンが得られる。ＳＴＭＰ．ＳＴＰＰは、他の試薬が刺激物であったり、有毒および／または突然変異の発生率が高い液体であるのに比べて、これらの試薬が無害であり、容易に扱うことができる固体であるため、好適に使用される。表ＩＩは、様々な比率のＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ、またはＳＴＭＰ単独で使用した架橋についてのデータを示す；表ＩＩＩは、デンプンスラリー中でＳＴＭＰ／ＳＴＰＰを用いて、異なる反応条件を採用したときの結果を与え、表ＩＶは、半懸濁デンプンについて反応を行った結果を与える。表Ｖは、本発明の所定の変性デンプン製品との比較として、２つの市販製品（クリスタリーンおよびノベロース）の調理前後のＲＳの濃度を与える。表ＶＩは、市販のデンプンと比較した、本発明における耐性デンプンに対するα− アミラーゼ濃度の効果を示す。表ＶＩＩは、デンプンの溶解度とＳＥＭ顕微鏡写真にみられる様子の比較とともに、市販のデンプンおよび本発明のデンプンにおけるＡＯＡＣＲＳ濃度を与える。実施例２Ａ．動物給餌試験飼料はすべて、食物繊維（最終重量比率で１０％）、蛋白質（１５％）、脂肪（１０％）およびコレステロール（０．５％）の同一配合量とした。最終的に、離乳直後のハムスター（ＮＲＣ1987）の要求する栄養を加えて飼料を調製した。雄のゴールデンシリアンハムスター（Sasko Inc.ネブラスカ州オマハ）を、制御環境下（２３℃、湿度５０％）、メッシュ底の吊下型ケージ内で別々に飼育した。繊維を含まない飼料を１週間与えた後、動物の体重を測定し、ランダムに選択した４グループ（グループあたり１０匹ずつ：平均体重８０±６）に分け、４種の試験飼料のうちの１種を与えた（表VII）。餌と水は自由に摂らせた。餌の摂取量を継続的に記録し、ハムスターの体重を１週間毎に測定した。Ｂ．コレステロール分析試験用飼料を６週間与えた後、一夜（１４時間）絶食させ、次いで軽いエーテル麻酔をかけた。心臓に穴を開け、血液サンプル（〜１ｍｌ）を採取した。血液をマイクロ遠心管に装入し１０℃、１０，０００×ｇで２分間遠心分離し、血清サンプルをコレステロール分析するまで４℃で保存した。血清総コレステロール値および高密度リポ蛋白値を、それぞれシグマ（Sigma）診断薬キット３５２および３３６を使用して酵素により分析した。シグマコレステロール診断用試薬は酵素によりコレステロールを測定するものであり、アライン（Allein）らの方法（1974）を変形したものである。この方法では、コレステロールエステルをコレステロールエステラーゼ（ＥＣ3.1.1.13）により加水分解してコレステロールとし、これをコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ3.1.1.6）により酸化してコレステロール-4-エン-3-オンおよび過酸化水素とする。生成した過酸化水素を、次いで色原体の4-アミノアンチピリン（アムパイロン）およびp-ヒドロキシベンゼンスルフォネートと、ペルオキシダーゼ（ＥＣ1.11.1.7）の存在下にカップリングさせ、最大吸収波長が５００ｎｍのキノンイミン染料が得られる。発色の強度の比を、そのまま試料中の総コレステロール濃度とする。コレステロール試薬は、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、4-アミノアンチピリン、p-ヒドロキシベンゼンスルフォネート、緩衝剤および安定剤の混合物であり、これを脱イオン水に溶解して使用した。ブランク、コントロールおよびサンプル用からなる一連の試験管を用意した。直線回帰係数（ｒ₂＝0.999）を有するコレステロール既知濃度（５〜２０μｇ／Ｌ）の基準曲線を引いた。コレステロール試薬（１．０ｍｌ）を３７℃に加熱し、各試験管に分液（０．１ｍｌ）した。次いで脱イオン水０．１ｍｌ（ブランク）、コントロール溶液またはサンプルを添加し、容器を静かに倒転させて溶液を混合した。容器を３７℃で５分間保温し、全試験管の５００ｎｍの吸収を読み取った（シグマ診断薬、手順第３５２）。高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロールはキット３５２−３を使用して測定した。シグマＨＤＬコレステロール診断用試薬は、超低密度リポ蛋白および低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬおよびＬＤＬ）を選択的に沈澱させ、上澄み液からＨＤＬフラクションを回収した後、ＨＤＬフラクションのコレステロール濃度を測定するように構成されている。分析キット中の硫酸デキストランおよびマグネシウムイオンは、ＨＤＬフラクションを溶液中に残したままＬＤＬおよびＶＬＤＬを沈澱させる。次いでＨＤＬフラクションのコレステロール含量を、酵素法により分析する（シグマ手順第３５２）。硫酸デキストラン、マグネシウムイオン、緩衝剤および安定剤を含むＨＤＬコレステロール試薬を準備し、一連の試験管を用意した。各試験管に血清を分液（０．５ｍｌ）するか、または水（ブランク）を装入し、ＨＤＬコレステロール試薬５０μＬを添加した。試験管内の成分を渦撹拌器で混合し、室温で５分間静置した。渦撹拌器で再度撹拌した後、試験管を３０００ｘｇで５分間遠心分離にかけた。上清中のコレステロール値（ＨＤＬ）を、総コレステロールの測定に用いた方法と同様にして測定した。これらの試験で得られた血清コレステロールのデータを下記表IXに示す。Ｃ．盲腸中の短鎖脂肪酸量の分析各動物から全血を抜いて重量を測定し、ただちに凍結した。凍結サンプルは短鎖脂肪酸の分析を行うまで−２０℃で貯蔵した。盲腸の短鎖脂肪酸をアライザ（ Aliza）およびゼッカリア（Zecharia）（1993）の記載に準じて抽出し、チョイ（Choi）およびジェオン（Jeon）の記載（1993）に準じてガスクロマトグラフィ（ＧＣ）で分析した。１０ｍｌのビーカー中、盲腸サンプル（１００ｍｇ）と蒸留水（０．３ｍｌ）とを混合した後、内容物を水０．３ｍｌを補助的に用いてマイクロ遠心管内に移した。混合物は３％メタリン酸（０．１ｍｌ）で酸処理し、内部標準（０．１ｍＭカプリル酸）を含むエタノール（０．１ｍｌ）と３０秒間混合し、エーテル（０．８ｍｌ）と振とうした。その後、混合物を４℃で遠心分離して（１０，０００ｘｇで５分間）、上澄み液試料の一部（２μＬ）をガスクロマトグラフィー（モデル５８８０Ａ、ヒューレットパッカード社、カリフォルニア州パロアルト）に打ち込んだ。ＳＣＦＡは、１５ｍ×内径０．５３ｍｍスタビルワックス（Stabilwax）−ＤＡキャピラリーカラム（リステック社（Resteck Corp．）、ペンシルバニア州べルフォント）により、１３ｍｌ／分のヘリウム流量で分離された。カラム温度は、最初に１００℃で１分間保持し、次い１５℃／分で２００ ℃まで加熱し、最後に２００℃で１３分間保持するようにプログラムした。注入口および検出部の温度はいずれも２５０℃とした。ＧＣ分析はすべて２回実施した。上澄みの試料（２μＬ）をＧＣに打ち込み、カプリル酸に相当するそれぞれのＳＣＦＡのピーク面積を既知標準に対応して比較した。これら試験で得られたＳＣＦＡデータを表Ｘに示す。結果および考察Ａ．スラリー反応条件リン酸２デンプンＲＳ₄は、他の条件によってその反応時間が短かかったり長かったりするが、スラリー反応（具体的に固体デンプン３５〜４０％）により製造することができる。ｐＨおよび温度が、デンプンの糊化（gelatinization）条件に近いところまで高くする場合には、反応時間は１時間よりも短いことが望ましい。短時間反応での糊化を抑制し、リン酸化反応を促進するために、通常、硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを使用する。さらにＳＴＭＰ／ＳＴＰＰの濃度が高いと反応を促進する。一般的にｐＨ１１〜１２のアルカリで、温度が３５〜４５℃であると、５〜２０重量％の硫酸ナトリウムと５〜１５重量％のＳＴＭＰ／ＳＴＰＰｂｏｓとを迅速に反応させる効果がある。表IIおよびIVの結果に示されるように、リン酸化剤としては、ＳＴＰＰよりもＳＴＭＰの方が効果的である。この検討では、ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ比が９９／１（重量／重量）のときにリン酸化反応が最も進んだ。反応混合物中でのリン酸化剤の量は、製品中の残リン量が０．４〜０．５％以下となるように選択して配合される。その上限量は調節し、変更することができる。たとえばより高度のリン酸化処理が許容されるときは、いっそう高濃度のＲＳ₄を含むリン酸２デンプンを調製することもできる。さらにはまたＳＴＭＰのみを用いても、ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰの９９／１混合物を用いたときと大差なくリン酸化反応させることができる。ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰを用いた迅速な架橋反応は、初期ｐＨおよび温度を高くし、硫酸ナトリウムおよびＳＴＭＰの量を増加することによってだけでなく、リン酸化反応の進行に伴うｐＨおよび／または温度の急上昇によっても達成される。温度の急上昇を伴う場合には、たとえばリン酸化反応時間は１．５時間より短くてもよいかもしれない。しかしながら、リン酸化の度合は、反応が急激であるほど調節が困難になる。反応条件は硫酸または塩化ナトリウムの添加量によっても異なるが、これら塩を添加せずにリン酸２デンプンＲＳ₄を製造することもできる。その場合には、糊化を避けるために温度およびｐＨは低くする必要があり、小麦デンプンの反応時間は分単位から時単位になる。原料デンプンの糊化温度が小麦デンプンよりも高めであれば（たとえばトウモロコシおよび米のデンプン）、硫酸ナトリウム無添加のリン酸化反応は反応時間を短縮するために１０℃高い温度で開始することができる。表IIIは、残リン量０．３０〜０．３８％で、ＲＳ（ＡＯＡＣ）価が７６〜８６％であるリン酸２デンプンＲＳ₄を製造する際の小麦デンプン使用における６種のスラリ一反応条件を示す。変性デンプン中の残リン量は、反応の間中に簡単に監視する。アルカリｐＨで製造されたリン酸２デンプン中の耐性デンプンの量は、デンプンに添加されたリン酸の量そのものである。リン酸２デンプンのα− アミラーゼに対する耐性は、下記の方法によってin vitroで監視することができる。Ｂ．半懸濁反応（Semi-Moist）条件半懸濁条件反応による変性デンプンの調製は、スラリー反応で行う場合と比べて簡便ではないが、よりエネルギー集約的ではある。通常、デンプンは、アルカリｐＨのＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ水溶液中に浸漬するか、該溶液が噴霧される。その後飽和デンプンを乾燥し、強力な脱水条件下に加熱してリン酸化を行わせる。次いで反応混合物を、水中でスラリー化し、遠心分離して無機リン酸塩を洗浄除去し、変性デンプンを乾燥して市販する。Ｃ．ＲＳ価リン酸２デンプン中のＲＳ₄量をＡＯＡＣ食物繊維法により測定したとき、小麦(wheat)、細粒小麦（small granular wheat）、トウモロコシ、ジャガイモ、米、タピオカ、緑豆およびオーツ麦を原料とするデンプンのＲＳ₄は、０．９％未満であった（表Ｖ）。小麦、トウモロコシ、ジャガイモおよび緑豆から、短時間反応によって調製された残リン量０．４％以下（〜０．４％）のリン酸２デンプン試料は、ＲＳ₄（ＡＯＡＣ）が５８〜９８％であり、細粒小麦を原料とするものは２０％であった。米デンプンから長時間反応により調製された残リン量０．４％のリン酸２デンプンは、ＲＳ₄（ＡＯＡＣ）が８５％であった（表Ｖ）が、リン酸２デンプン（Ｐ＝０．４％）を同じ米デンプンから、小麦の方法と同様にして短時間で調製したもののＲＳ₄（ＡＯＡＣ）は５％しかなかった。タピオカおよびオーツ麦のデンプンから、硫酸ナトリウムなしで遅い反応工程によって調製されるリン酸２デンプン（Ｐ＝０．４％）のＲＳ₄（ＡＯＡＣ）は、それぞれ３１％と１０％であった（表IV）。退行(retrograded)またはいわゆるＲＳ₃型耐性デンプンを含む２つのＲＳ市販品のＲＳも測定した。測定されたノベローズ（Novelose）およびクリスタリーン（CrystaLean）のＲＳ₃価（ＡＯＡＣ）は、それぞれ３３と１１％であった。 in vitroでの第２のＲＳ測定方法は、ブタ膵臓のα−アミラーゼ（ＰＰＡ）を用いて37℃で実施される（図２）。イングリストら（Englyst et al，British J ．Nutrition,75:749-755(1996)）は、健康な回腸造痩被検体に投与された試料中の消化されないデンプンのin vtroでの値は、1992年に彼らが３７℃でブタ膵臓のα−アミラーゼ（ＰＰＡ）を用いてin vtroで行った方法により測定された値に一致することを報告している。1992年のイングリストらの方法は、1982年の彼らの先の方法を改訂したものである。イングリスト方法の原理は、α−アミラーゼ量、撹拌および消化時間の各条件制御下での消化性デンプンの３７℃でのα− アミラーゼ加水分解である。α−アミラーゼ消化により遊離された低分子量生成物は、次いでグルコアミラーゼで消化され、Ｄ−グルコースとなり、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼで定量される。1982年のイングリスト方法に３つの変更がなされた：（１）α−アミラーゼの量は、５０，０００シグマ単位／ｇ試料から１００，０００Ｕ／ｇに倍増された；（２）ガラスビーズおよび卓上振とう器の使用に代えて棒状マグネチックスターラーによる高速撹拌；および（３）グルコースはグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼに代えて、グルコースキナーゼ／グルコース6-リン酸デハイドロゲナーゼにより定量された。試料はデンプンのみを含むため、試料の最初の重量はデンプン合計量であり、耐性デンプンはそれとの差によって求められた。３７℃でのＰＰＡ法により耐性デンプンを測定する際には、基質（固有の性質）を考慮する必要がある。たとえば、デンプンが肉汁、スープなどの水を豊富に含み、煮沸加熱する形態中の食品成分として存在する場合には、デンプンは過剰水中で調理されるであろう。すなわち食品中のデンプンに起こることを想定してデンプン試料を、in vtro分析に先だって沸騰水中で予備調理することが望ましい。また調理された食品が冷却条件下で冷蔵される場合には、その条件を想定し、熱水中での加熱によりペースト状としたデンプン試料をin vtro分析に先だってエージングさせることが望ましい。食品が冷却されない場合には、熱デンプン―水混合物をただちに３７℃に冷却して分析することが望ましい。他の極端な例としては、クラッカーまたはクッキーなどの水が少なく、食卓塩および／または砂糖の多い食品中に存在するデンプンは、デンプン糊化を抑制する。後者の場合には、in vitroでの耐性デンプンの分析には、未調理デンプンを直接供することが望ましい。表Ｖは、沸騰水中で３０分間調理した後、ただちに３７℃に冷却して分析した種々のデンプン試料中のＲＳ₄（ＰＰＡ）量を示す。原料デンプンは、いずれもＰＰＡ１０³〜１０⁵単位／ｇデンプンでの耐性デンプンを示さなかった。小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、緑豆および米のデンプンから得られたリン量が０．４％までのリン酸２デンプン試料は、１０⁵単位／ｇで８〜１５％ＲＳ₄（ＰＰＡ）、１０³単位／ｇで２５〜３８％を示した（表VI）。ＰＰＡ１０³単位／ｇデンプンの酵素量で測定された試料中２５〜３８％の耐性デンプン値は、１０％までがＲＳ₄（ＰＰＡ）であり、１５〜２０％が緩慢な消化性のデンプンであるとみなされる。ＰＰＡ消化は、大過剰のＰＰＡを用い、３７℃で１６時間物理的撹拌することによって行われる。またＰＰＡ酵素は、細菌性α−アミラーゼ酵素よりも短い結合部位を有している。このためＰＰＡは、粒子の全領域を、細菌性酵素に取り込まれないように切断することができる。煮沸条件下では、変性デンプンの粒子表面上の孔をちようど塞ぐように膨張を起こすことが可能であろう。ＲＳ−ＡＯＡＣおよびＲＳ−ＰＰＡの最高値は、緑豆、アミロース量の増加されたデンプンからのリン酸２デンプンの調理試料で見られたことは注目すべきである。高アミロースデンプンは通常のデンプンよりも、架橋処理されたとき、より高いＲＳを与えることがわかった。デンプン試料がＲＳ分析に先立って熱水中で調理されなかったときには、トウモロコシと小麦とからの原料デンプンのＲＳ₃（ＰＰＡ）は５〜７％であり、オーツ麦１５％、細粒小麦２５％、タピオカ３８％、ジャガイモ７９％および米８２％であった。生（非加熱）のジャガイモデンプン粒子はα−アミラーゼ消化しにくいことはよく知られており、イングリストの用語に従えばＲＳ₂と称されるタイプの耐性デンプンである。生米デンプンおよびある程度の生のタピオカデンプンもまた、ＲＳ₂タイプ耐性を示した（表Ｖ）。ＲＳ₂タイプ耐性は、粒子表面に細孔サイズの開口がないたためと説明されている。我々が調製した非加熱リン酸２デンプン試料は、ＰＰＡに対して７〜３３％の耐性増加を示したが、これはＲＳ₄型耐性によると考えられる（表Ｖ）。ＲＳ₃を含む２つの市販サンプルについて、サンプルの熱水中での調理前および後にＲＳ（ＰＰＡ）の値が測定された。ＲＳ₃（ＰＰＡ）価は、未調理サンプルで〜９および５１％であり、調理後、それぞれ〜２１％に上昇と〜４４％に減少した。クリスタリーンの水中での煮沸は、そのＲＳ値を上昇させる；製造時の製品中のアミロースの不完全な退行のためである。退行アミロースは、１００℃ で溶融し、水中での試料の煮沸はさらなる退行アミロースをもたらすことが知られている。Ｄ．新規な耐性デンプンの特徴走査型電子顕微鏡によれば、本発明のリン酸２デンプンＲＳ₄デンブンは、そのデンプン源と同一形状を有し、表面が滑らかであることがわかった（図７と８、９と１０、および１１と１２を比較）。２つの市販耐性デンプンは、あるものは融解粒子状を示すが、多くはその表面が収縮した形状であった（図５と６、表 VII）。さらに、水中での煮沸、次いでＰＰＡ１０⁵Ｕ／ｇ（図１３〜１７）および１０³Ｕ／ｇ（図１８〜２１）で消化後、分離されたα−アミラーゼ耐性残渣のＳＥＭ顕微鏡写真に見られる形状は、クリスタリーンおよびノべロースの形状とは異なっていた。ＲＳ₄型デンプンの残渣は、クリスタリーンおよびノベロースのそれよりも繊維性で、構造的ではなかった。増加された量のリンを含むリン酸２デンプンＲＳ₄試料は、実際、ジメチルスルホキサイドに溶解せず、一方、リン含量０．０４％未満の２つの市販ＲＳ₃試料は、ジメチルスルホキサイドに１００％溶解した（表VII）。Ｘ線回折分析では、穀物およびジャガイモのデンプンから得られたリン酸２デンプンＲＳ₄は、それぞれＡおよびＢ−多形晶パターンを示した。トウモロコシデンプンから得られた市販ＲＳ₃試料は、Ｂ−多形晶Ｘ線パターンまたは無定形であった。図３は、＜０．１％リンで置換されたリン酸２デンプンＲＳ₄の特徴を示す長粘稠性カーブである。ＲＳ₄デンプンは、ベースラインのままの粘稠性カーブを示した。Ｅ．リン酸２デンプンＲＳに対するハムスターの生理学的反応３つの耐性デンプン成分（表VII）を成長ハムスターに給餌し、選択的生理学的反応への効果をセルロースのそれと比較した（表IXおよびＸ）。４種の飼料は、いずれも１５．０％蛋白質、９．９％脂肪、１０％食物繊維または１０％ＲＳ（ＡＯＡＣ）および０．５％コレステロールを含有するものであった。セルロース飼料を与えた動物グループは、多くの飼料を摂取し、種々の耐性デンプンを摂取したものよりも体重が増加した（図４）。ＲＳ₃型（ノベロース）の耐性デンプンを摂取した動物は、最も飼料量が少なく、このため体重増加量も最も少なかった。総血清コレステロールは、動物がセルロースまたは耐性デンプンのどちらを摂取するかに拘らず４グループのハムスターがすべて同値であった（表IX）。一般に、セルロースおよび小麦ふすまなどの食物繊維の非溶解性成分は、総血清コレステロールにほとんど影響を及ぼさないとされている。しかしながら、本発明では、耐性デンプンを摂取した動物は、血清中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）フラクョンのコレステロール（“善玉”コレステロール）上昇値を含み、超低密度および低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）（“悪玉”コレステロール）の組合せフラクション中のコレステロール値は下げるという結果を示した。耐性デンプンＲＳ₃およびＲＳ₄を摂取した動物グループは、セルロース飼料のものよりも盲腸中の短鎖脂肪酸をより産生し、絡酸値はかなり高かった（表Ｘ）。これらの結果はＲＳの発酵により他の生成物中で短鎖脂肪酸を産生することを示している。絡酸は腸の健康に好ましいと考えられ、腸ガンの危険性を低減する。ＳＣＦＡはすべて腸のｐＨを下げ、細菌数を減らすのに役立つ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）、およびトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）とトリポリリン酸（ＳＴＴＰ）との混合物からなる群より選ばれる試薬でリン酸化されたデンプンであって、ＡＯＡＣ法992.16（1995）によるα− アミラーゼ消化に対して少なくとも約２０％の耐性を示すリン酸化デンプン。２．前記デンプンが、穀物、根菜、塊茎、豆果および高アミロースからなるデンプン群から選ばれる請求項１に記載のデンプン。３．前記デンプンが、小麦、トウモロコシ、オーツ麦、米、タピオカ、緑豆およびジャガイモからなるデンプン群から選ばれる請求項２に記載のデンプン。４．前記デンプンが、小麦およびトウモロコシからなるデンプン群から選ばれる請求項１に記載のデンプン。５．前記デンプンが、少なくとも約０．１重量％の残リン量を含む請求項１に記載のデンプン。６．前記混合物が、約１〜２０重量％のＳＴＭＰ、および約０．０１〜０．２重量％のＳＴＰＰを含む請求項１に記載のデンプン。７．前記デンプンが、前記混合物を未変性デンプン原料の重量１００重量％に対して約１〜２０重量％使用して架橋されたものである請求項１に記載のデンフン。８．前記デンプンが２デンプンのリン酸ジエステル体である請求項１に記載のデンプン。９．ＡＯＡＣ法992.16（1995）によるα−アミラーゼ消化に対して少なくとも約２０％の耐性を示すように化学的に変性されたデンプンを主要成分量で含む食料品。１０．前記デンプンを３５重量％までの量で含有する請求項９に記載の食料品。１１．前記食料品が、イースト発酵または化学発酵し、ベーキングまたは油調理した食物の群から選ばれる請求項９に記載の食料品。１２．前記デンプンの化学的変性がリン酸化である請求項１１に記載の食料品。１３．前記リン酸化剤を用い、ｐＨが塩基性でかつ約２５〜７０℃の温度条件下に、水の存在下、ＡＯＡＣ法992.16（1995）によるα−アミラーゼ消化に対して少なくとも約２０％の耐性を示す化学的変性されたデンプンが得られるまでデンプンを反応させる工程からなり、該リン酸化剤はトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）、およびトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）とトリポリリン酸（ＳＴＴＰ）との混合物からなる群より選ばれるとともに、最初に水と前記デンプンとからなるスラリーを調製し、次いで該スラリーに塩基を添加する工程を含むデンプンの化学的変性方法。１４．前記リン酸化剤を前記スラリーに添加する工程を含む請求項１３に記載の方法。１５．前記スラリーが約１５〜６０重量％の量でデンプンを含有する請求項１４に記載の方法。１６．前記デンプン含有量が約３０〜５０重量％である請求項１５に記載の方法。１７．前記混合物が、未変性デンプン原料の重量を１００重量％とするとき、約１〜２０重量％のＳＴＭＰと、約０．０１〜０．２重量％のＳＴＰＰとを含む請求項１３に記載の方法。１８．前記デンプンが、前記混合物を、未変性デンプン原料の重量１００重量％に対して約１〜２０重量％使用してリン酸化されたものである請求項１３に記載の方法。１９．前記ｐＨが約１０〜１３である請求項１３に記載の方法。２０．前記温度が約３０〜５０℃である請求項１３に記載の方法。２１．前記反応時間が１／６〜２４時間である請求項１３に記載の方法。２２．反応系に硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを添加する工程を含む請求項１３に記載の方法。２３．前記デンプンが少なくとも約０．１重量％の残リン量を有する請求項１３に記載の方法。２４．前記デンプンが、小麦、トウモロコシ、オーツ麦、米、タピオカ、緑豆およびジャガイモからなるデンプン群から選ばれる請求項１３に記載の方法。