JP5363006B2 - 架橋反応 - Google Patents

Description

本発明は、トリメタリン酸ナトリウムによって、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムの組み合わせによって架橋された澱粉を製造するプロセスに関する。

澱粉は、Ｄ−アンヒドログルコース単位がアルファ‐１，４‐Ｄグルコシド結合によって連結されたほぼ線状の可撓性ポリマーであるアミロースと、アルファ‐１，６‐Ｄグルコシド結合によって連結された直鎖の枝分かれポリマーであるアミロペクチン、という二つのタイプの多糖分子から構成される複雑な炭水化物である。

研究文献は、高繊維澱粉及び／又は難消化性澱粉が、いろいろな有益な効果を有すること、例えば、結腸の健康に有益であり、さらに低カロリーなどの有益な効果を有することを示している。さらに、澱粉は、食物の炭水化物の量を減らし、血糖反応及びインシュリン反応を低下させ、満腹感を生じ、持続的なエネルギー放出、体重管理、低血糖、高血糖、糖調節異常、インシュリン抵抗性症候群、ＩＩ型糖尿病の制御、並びに、運動能力、精神集中及び記憶力の改善に寄与する。

トリメタリン酸ナトリウムとの、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムの組み合わせとの架橋など、化学的、酵素的、及び物理的な変性を含む、特定の澱粉処理操作が澱粉の食物繊維含有量を増加させることが知られている。これらの反応物質による架橋は当業者には公知である。しかし、この架橋反応は効率的でない。多くの技術者が、反応物質の量を増やして反応を促進し、結合したリンを高レベルで含む澱粉を生産しようとしている。残念ながら、それは使用されない反応物質を高レベルで含む排出物を生ずるという結果になっている。

このたび、驚くべきことに、澱粉とトリメタリン酸ナトリウム、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムの組み合わせとの化学的架橋は、反応の間ｐＨを１１．５から１２．０までに維持することによってもっと効率的に行われるということが見出された。この効率の向上によって、技術者はより少ない反応物質を用いて排出物における反応物質のレベルを減らすことができる。

本発明は、トリメタリン酸ナトリウム、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムの組み合わせによって、架橋された澱粉を製造するプロセスに関する。この反応は、標準的な架橋プロセスに比べて効率が高く、かつ／又はリンの排出を減少させる。

“全食物繊維含有量”（ＴＤＦ）という用語は、人間の栄養消化酵素による加水分解（消化）に抵抗する植物物質の多糖類及び残留物であって、例えば、非澱粉多糖類、難消化性澱粉、リグリン、及びワックス、クチン及びスベリンなどの少量成分を意味する。本明細書で用いられる場合、ＴＤＦとは、ＡＯＡＣ法（Association of Official Analytical Chemists, International) ９９１．４３ (Journal of AOAC, Int., 1992, v. 75, No. 3, p.395-416) に記載された方法によって記述されるように、濾過で分離された未消化物質の重量で測定されるものと定義される。全食物繊維は乾燥質量で報告される。この試験については、以下の実施例の節で記述する。

“難消化性澱粉（resistant starch) （ＲＳ）”という用語は、健康な個体の小腸で吸収されない澱粉及び澱粉分解生成物の総量と定義され、当業者に公知のいろいろな試験によって測定できる。本明細書では、難消化性澱粉は後記の実施例の節で記述される試験で、膵臓アルファ・アミラーゼによる処理で測定されるものと定義される。

本明細書で用いられる場合、“高アミロース澱粉”とは、後記の実施例の節で詳述される電位差滴定法によって測定されるようなその澱粉の重量で、コムギ又はコメ澱粉或いはフラワー（flour）では少なくとも約２７％のアミロースを、他の源では少なくとも約４０％のアミロースを含む、澱粉又はフラワーを意味するものとする。

本明細書で用いられる場合、“顆粒性澱粉”とは、その顆粒状構造を保持し、多少の結晶性を有し、複屈折及び偏光の下でのマルタクロス（Maltese cross）が破壊されていない澱粉を意味する。

本明細書で用いられる場合、食物製品とは、人間及び／又は動物が消費する、全ての可食製品を含むものであって、そして全ての飲料を含む。

［発明の詳細な説明］
本発明は、トリメタリン酸ナトリウム、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムの組み合わせによって架橋された澱粉を製造するプロセスに関する。この反応は、標準的な架橋プロセスに比べて効率が高く、排出されるリンが少ない。

本発明の調製を行うのに用いられる澱粉は、天然の源から得られる任意の澱粉であってよい。本明細書で用いられる場合、天然の澱粉とは、天然に見出されるような澱粉である。また、標準的な育種方法、例えば交雑、転座、倒置、形質転換、挿入、照射、化学的又はその他の誘導変異、又は変異を含めるための遺伝子又は染色体工学のその他の方法によって得られた植物からの澱粉も適する。さらに、誘導変異から生育した植物から得られる澱粉及び公知の変異育種の標準的な方法で生成される上記一般的な組成の変種も適する。

典型的な澱粉の源は、穀物、塊茎及び根、豆果、及び果実である。天然の源は、トウモロコシ、ポテト、スイートポテト、オオムギ、コムギ、米、サゴ、アマランス、タピオカ、クズウコン、カンナ、エンドウ豆、バナナ、エンバク、ライムギ、トリティカレ（triticale）及びモロコシ類、並びにそれらの低アミロース（ワクシー（waxy））及び高アミロース変種、などであってよいが、それだけに限定されない。低アミロース又はワクシー変種とは、澱粉の重量で、１０％未満のアミロース、ある実施形態では５％未満のアミロース、別の実施形態では２％未満のアミロース、さらに別の実施形態では１％未満のアミロースを含む澱粉又はフラワーを意味するものとする。高アミロース澱粉又はフラワーは、全て重量で、ある実施形態では少なくとも約５０％のアミロースを、第二の実施形態では少なくとも約７０%のアミロースを、第三の実施形態では少なくとも約８０％のアミロースを、そして第四の実施形態では少なくとも約９０％のアミロースを含む。

その澱粉は、トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の組み合わせ（ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ）を用いて変性される。リン酸化は当業者に公知の方法、例えば、Modified Starches: Properties and Uses, Ed. Wurzburg, CRC Press, Inc., Florida (1986) に記載されている方法を用いて行われる。ただし、その方法が１１．５〜１２．０のｐＨで行われ、反応の間そのｐＨが実質的に一定の状態に維持されるという形に変更されている。ある実施形態では、この方法は、さらに変更されて、濃アルカリ溶液が用いられ、その結果高固体分の反応混合物を生ずる。その変更の程度は、望ましい性質及び全食物繊維含有量が得られるように変えることができる。

澱粉は、水の存在下で、及び所定のｐＨ及び温度条件の下で、ＳＭＴＰ及び／又はＳＴＰＰと澱粉を反応させることによって化学的に変性されて、変性された澱粉を生ずる。ある反応の方法は、最初に水中に澱粉のスラリーを形成するステップと、架橋剤をスラリーに加えるステップを含む。スラリーは、重量で約１５〜６０％澱粉であり、ある場合には重量で約３０〜５０％澱粉である。反応温度は約２５℃から７０℃までであり、ある場合には約３０℃から５０℃までである。反応混合物のｐＨは、反応の開始前に１１．５と１２．０の間に調整し、反応の間ずっとそのレベルに維持される。これは、架橋反応の正常な進行、並びに反応物質の加水分解で生成される酸によってｐＨが１１．５から１２．０までの範囲より低く下がる傾向があるが、それに対抗することになる。

反応は、約１０分から３０時間まで、ある場合には約１６〜２４時間、所望の架橋度が達成されるのに十分な時間だけ行えばよい。熟練した技術者であれば、低い架橋度を達成するための反応時間は、短くなることが認識されるであろう。ある実施形態では、スラリーに澱粉重量の約０．１〜２０％の硫酸ナトリウム又は塩化ナトリウムがスラリーに加えられる。これらの塩の存在は、反応の間のゲル形成を遅らせ、澱粉顆粒が吸着する塩基を増やして反応を加速する役目をする。

リン酸化物質は、ＳＴＭＰ、並びにＳＴＭＰとＳＴＰＰの混合物から成る群から選択され、ある場合にはＳＴＭＰとＳＴＰＰの混合物である。一般に、混合物が用いられる場合、それは約１〜２０重量％のＳＴＭＰを含み、ある場合には約５〜１６重量％のＳＴＭＰを含み、かつ約０．０１〜０．２重量％のＳＴＰＰを含み、ある場合には約０．０５〜０．１６重量％のＳＴＰＰを含む。ＳＴＭＰとＳＴＰＰの混合物は、澱粉の重量に基づいて、約１〜２０重量％のレベルで、ある場合には約５〜１６重量％のレベルで有利に用いられる。ＳＴＭＰだけが用いられる場合も、上記の範囲を用いることができる。

これらの澱粉は、リン酸化で架橋されて、モノ置換リン酸基も増加するが、ジスターチ・フォスフェート・エステルを形成し、少なくとも０．１重量％の結合した（残留）リンを含む。ある実施形態では、澱粉の重量で、結合したリンは少なくとも約０．２％であり、別の実施形態では少なくとも約０．３％であり、さらに別の実施形態では少なくとも約０．３５％である。さらに別の実施形態では、澱粉の重量で、結合したリンは０．１〜０．４％の範囲にある。

そのｐＨは、反応を妨害しない食品等級のいかなる塩基を用いて、塩基性（１１．５〜１２．０）にすることができる。ある実施形態では、用いられる塩基は水酸化ナトリウムであり、澱粉重量に基づいて、別の実施形態では少なくとも０．４〜０．８％のレベルの水酸化ナトリウムが用いられ、別の実施形態では０．５５〜０．６５％のレベルの水酸化ナトリウムが用いられる。別の実施形態では、用いられる塩基は、反応混合物の希釈を抑えるように濃塩基であり、さらに別の実施形態では、少なくとも２５％のアルカリ溶液が用いられ、さらに別の実施形態では、少なくとも２５％の水酸化ナトリウム溶液が用いられる。ある実施形態では、反応混合物の固体分パーセントは、反応を損なうことなく、澱粉の著しい膨潤を生ずることなく実際的に可能な限り高く保たれる。反応混合物の固体分レベルは、用いられる特定の澱粉並びに粉砕プロセスに鋭敏である。例えば、容易に混合されるスラリーは、糯米澱粉では固体分３３％で形成できるが、同様の粘度のスラリーがタピオカやトウモロコシ澱粉では固体分４４％で形成できる。ワクシー、サゴ、及び高アミロース・タイプはこの両極端の間になる。別の実施形態では、反応混合物の固体分レベルは少なくとも３６％であり、さらに別の実施形態では、３６〜４４重量％の範囲にある。さらに別の実施形態では、反応の始まる前に行われるｐＨ調整のときに導入される水を澱粉（乾燥基準）の重量で２％以下にすることによって、反応混合物の固体分レベルが高く維持される。

反応混合物のｐＨを１１．５〜１２．０に保つこと、及び／又は反応混合物の固体分パーセントを高く保つことによって、反応の効率が改善され、少ない量のＳＴＭＰ、又はＳＴＭＰ/ ＳＴＰＰ反応物質によって所望のリン・レベルが達成できる。これによって排出される（反応しなかった反応物質からの）リンのレベルを減らすことができる。１１．５〜１２．０までの実質的に一定のｐＨを反応の間維持することによって、架橋反応に良い効果があり、架橋の量が増え、モノ置換が減る。すなわち、従来の方法に比べて形成されるジエステル（diester）が多くなる。

［実施形態］
以下の実施形態は、本発明をさらに例示して説明するためのものであって、いかなる意味でも本発明を制限するものと解釈してはならない。
１．澱粉を調製するプロセスであって、トリメタリン酸ナトリウム、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウムの組み合わせを用いて澱粉を架橋させるステップを含み、そのｐＨが、架橋反応の前に１１．５と１２．０の間に調整され、架橋反応の間ずっと１１．５から１２．０までの間に維持される、プロセス。
２．そのｐＨが１１．５に維持される、実施形態１のプロセス。
３．架橋反応の前のｐＨ調整のとき、澱粉（乾燥基準）の重量で２％以下の水が加えられる、実施形態１のプロセス。
４．その反応が少なくとも３６重量％の固体分レベルで行われる、実施形態３のプロセス。

５．その反応が３６〜４４重量％の固体分レベルで行われる、実施形態３のプロセス。
６．その反応が約２５℃から７０℃までの温度で行われる、実施形態１又は３のプロセス。
７．その反応が約３０℃から５０℃までの温度で行われる、実施形態６のプロセス。
８．その反応が約１０分から３０時間までの時間にわたって行われる、実施形態１又は３のプロセス。
９．その反応が約１６から２４時間までの時間にわたって行われる、実施形態８のプロセス。

１０．澱粉の重量で約０．１〜２０％の硫酸ナトリウム及び／又は塩化ナトリウムがその反応混合物に加えられる、実施形態１又は３のプロセス。
１１．その澱粉の重量で約１〜２０％のＳＴＭＰが用いられる、実施形態１又は３のプロセス。
１２．その澱粉の重量で約５〜１６％のＳＴＭＰが用いられる、実施形態１１のプロセス。
１３．その澱粉の重量で約０．０１から０．２％のＳＴＰＰが用いられる、実施形態１１のプロセス。
１４．その澱粉の重量で約０．０５から０．１６％のＳＴＰＰが用いられる、実施形態１１のプロセス。

１５．そのＳＴＭＰ/ ＳＴＰＰの組み合わせが澱粉の重量で約１〜２０％のレベルにある、実施形態１又は３のプロセス。
１６．そのＳＴＭＰ/ ＳＴＰＰの組み合わせが澱粉の重量で約５〜１６％のレベルにある、実施形態１５のプロセス。
１７．その反応混合物が水酸化ナトリウムを用いて塩基性にされる、実施形態１又は３のプロセス。
１８．その水酸化ナトリウムが澱粉重量の少なくとも０．４から０．８％までのレベルで用いられる、実施形態１７のプロセス。
１９．その水酸化ナトリウムが澱粉重量の０．５５から０．６５％までのレベルで用いられる、実施形態１８のプロセス。
２０．その水酸化ナトリウムが少なくとも２５％水酸化ナトリウムである、実施形態１７のプロセス。

以下の実施例は、本発明をさらに例示して説明するためのものであって、いかなる意味でも本発明を制限するものと解釈してはならない。特にそうでないと明記されている場合を除き、すべての部及びパーセンテージは重量によるものであり、すべての温度は摂氏温度（℃）である。
実施例全体にわたって、次の試験手順が用いられた。

Ａ. 結合した（残留）リンの決定
１．ほぼ１０．０ｇのサンプルを秤量してジャーに入れた。６００ｍＬの５％ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸、ナトリウム塩）溶液を加え、スラリーを５分間磁気ミキサーによって混合した。
２．２リットルのフィルター・フラスコ、ブフナー漏斗、及び１１ｃｍのワットマン濾紙＃１を用いて澱粉スラリーを濾過した。澱粉ケーキにクラックが生ずる前に、２００ｍＬアリコットの純水を４回、澱粉ケーキに連続的に注いだ。純水を入れた洗浄びんでブフナー漏斗の側面を洗い流した。
３．１．００ｇｍの澱粉ケーキをブフナー漏斗から取り出し、１２５ｍＬの三角（Erlenmeyer）フラスコに入れた（水分量はこのサンプルについて決定された）。２５ｍＬの４Ｎ塩化水素酸を３又は４個の沸騰チップと共にフラスコに加えた。
４．フラスコをホットプレートに載せてブクブクと沸騰させ、サンプルを加水分解するためにさらに７分間時々書き回しながら加熱した。加熱の間、フラスコの口を小さな時計皿で覆って蒸発を最小に抑えた。７分後、ホットプレートからおろして室温まで放置冷却した。

５．中身を２５０ｍＬの体積計量フラスコに定量的に移した。純水による数回の洗浄で、三角フラスコに残っていたものを体積計量フラスコに洗い流した。次に、体積計量フラスコに体積マークまで蒸留水を入れて希釈し、ストッパーをつけ、振とうして一様な混合物にした。
６．ほぼ１０ｍＬのこの溶液を１０ｍＬの使い捨て注射器に吸い込んだ。１３ｍｍ, ０．２μｍのジェルマン（Gelman）クロマトグラフィー・アクロディスク注射器フィルターを端に取り付けた。フィルターを通して溶液を１５ｍＬの使い捨て遠心チューブに直接移し、キャップをしてラベルを取り付けた。
７．集められた濾液を、メーカーの勧告に従って標準化されたＩＣＰ−ＡＥスペクトロメータで分析した。
８．結果を次のように％結合（残留）リンに変換した：
％リン＝［ppmリン x 希釈因子（0.25 L） x 100］／（無水サンプル重量 mg）

Ｂ. 全食物繊維含有量の決定
以下の手順は、ＡＯＡＣ法 ９９１．４３（Journal of AOAC, Int., 1992, v. 75, No. 3, p395-416）による全食物繊維含有量の決定方法の大略である。
試験はMegazyme ＡＯＡＣ９９１．４３ ＴＤＦ法 キットＫ−ＴＤＦＲを用いて行われる：
１．ブランク
反応物質から残留分への寄与を測定するために、各分析で、二つのブランクをサンプルといっしょに試験する。
２．サンプル
ａ． １．０００±０．００５ｇの重複サンプルを正確に秤量して４００ｍＬの背高ビーカーにいれる。
ｂ． ４０ｍＬの０．０５Ｍ ＭＥＳ−ＴＲＩＳブレンド緩衝溶液（ｐＨ８．２）を各ビーカーに加える。各ビーカーに磁気攪拌棒を加える。サンプルが溶液に完全に分散するまで磁気撹拌器で攪拌し続ける。

３．熱的に安定なαアミラーゼによるインキュベーション
ａ． ゆっくりと攪拌しながら、５０μＬの熱的に安定なαアミラーゼ溶液を加える。
ｂ． 各ビーカーを正方形アルミホイルでカバーする。
ｃ． カバーしたサンプルを９５〜１００℃の振とうウオーターバスに入れ、３５分間連続的に振とうしてインキュベートする。全てのビーカーが熱湯バスに入ったときから時間を計る。
４．冷却
ａ． 全てのサンプル・ビーカーを熱湯バスから取り出して６０℃まで冷却する。
ｂ． ホイル・カバーを取り除く。
ｃ． ビーカーのまわりのリングとビーカーの底のゲルを、必要ならばへらを用いてかき取る。
ｄ． ピペットを用いてビーカーの側壁とへらを１０ｍＬの蒸留水で水洗する。
ｅ． ウオーターバスの温度を６０℃に調整する。

５．プロテアーゼによるインキュベーション
ａ． １００μＬのプロテアーゼ溶液を各サンプルに加える。
ｂ． アルミホイルでカバーする。
ｃ． 振とうウオーターバスにおいて６０±１℃で連続振とうしながら３０分間インキュベートする。ウオーターバスの温度が６０℃に達したときから時間を計り始める。
６．ｐＨ調整
ａ． 振とうウオーターバスからサンプル・ビーカーを取り出す。
ｂ． カバーを除く。
ｃ． 磁気攪拌器で攪拌しながら５mＬの０．５６１Ｎ ＨＣｌ溶液をサンプルに加える。
ｄ． ４．１〜４．８になるべきｐＨをチェックする。必要ならば、追加の５％ ＮａＯＨ溶液又は５％ ＨＣｌ溶液によって、ｐＨを調整する。

７．アミログルコシダーゼによるインキュベーション
ａ． 磁気攪拌器で攪拌しながら２００μＬのアミログルコシダーゼ溶液を加える。
ｂ． アルミニウム・カバーを取り付ける。
ｃ． 振とうウオーターバスにおいて６０℃で連続振とうしながら３０分間インキュベートする。ウオーターバスの温度が６０℃に達したときから時間を計り始める。
８．ＥｔＯＨによる食物繊維の沈澱
ａ． 各サンプルに予め６０℃に加熱された２２５ｍＬの９５％ ＥｔＯＨを加える。加熱後体積を測定する。ＥｔＯＨ体積とサンプル体積の比は４：１でなければならない。
ｂ． 全てのサンプルを大きなアルミホイル・シートで覆う。
ｃ． ６０分間、室温で沈澱を形成させる。

９．濾過セットアップ
ａ. セライト（Celite）を含むるつぼの風袋を四捨五入で０．１ｍｇ単位で計る。
ｂ. 洗浄びんからの１５ｍＬの７８％ ＥｔＯＨを用いてるつぼのセライトのベッドを濡らし、再配分する。
ｃ. るつぼに吸引を作用させてセライトを吸い出してフリットガラスに均一マットにする。
１０．濾過
ａ. ステップ８からの沈澱した酵素消化物を、るつぼを通して濾過フラスコに濾過する。
ｂ. ７８％ ＥｔＯＨを含む洗浄びんを用いて、すべての残留粒子をるつぼに移す。

１１．残留物を以下の１５ｍＬ分量で二回洗う。
ａ． ７８％ ＥｔＯＨ
ｂ． ９５％ ＥｔＯＨ
ｃ． アセトン
１２．残留物を含むるつぼを１０３℃で一晩乾燥する。
１３．乾燥器中でるつぼを約１時間冷却する。残留する食物繊維とセライトを含むるつぼを四捨五入で０．１ｍｇ単位で秤量する。風袋重量、すなわち、乾燥したるつぼとセライトの重量、を引いて残留物の重量を求める。

１４．蛋白質と灰分の決定
各タイプの繊維から残留物の一つを分析して蛋白質を決定し、重複している他方の残留物を分析して灰分を決定する。
ａ． ケルダール（Kjeldahl）法（ＡＡＣＣ ４６−１０）を用いて残留物の蛋白質分析を行う。すべてのケースで因子６．２５を用いて蛋白質をグラムで計算する。
ｂ． 灰分の分析では、ＡＡＣＣ法０８−０１に記載されているように５２５℃で５時間、第二の残留物を燃やす。乾燥器中で冷却させ、四捨五入で０．１ｍｇ単位で秤量する。るつぼとセライトの重量を引いて灰分を決定する。
全食物繊維含有量は、下の式に従って計算され、別に断らない限り乾燥重量で報告される。
TDF (%) = [(R1 - R2)/2 - P - A - ブランク]/(m1 + m2)/2 x 100
ここで
ｍ１‐サンプル重量１
ｍ２‐サンプル重量２
Ｒ１‐ｍ１からの残留物重量
Ｒ２‐ｍ２からの残留物重量
Ａ‐Ｒ１からの灰分重量
Ｐ‐Ｒ２からの蛋白質重量
である。

Ｃ. 難消化性澱粉の分析
難消化性澱粉含有量はエングリスト（Englyst）ら(British Journal of Nutrition, 1996, 75, 327-337; European Journal of Clinical Nutrition, 1992, 46, S33-S50)に記載されている消化シミュレーションによって決定された。食物サンプルは、噛まれたと同様に砕かれ／細断される。粉末澱粉サンプルは篩にかけて粒子サイズを２５０ミクロン以下にする。分析に必要なサンプルの重量はその炭水化物含有量に基づいて決められる。澱粉サンプルは主に炭水化物から成ると考えられる。サンプルは測定されて、サンプルあたり５００〜６００ｍｇ＋ ０．１ｍｇの炭水化物を与える。必要な量のサンプルが秤量され、サンプル・チューブに加えられる。各チューブに１０ｍＬのＨＣｌ（０．０５Ｍ）中のペプシン（０．５％）、グアールガム（０．５％）溶液が加えられる。

ブランクとグルコース標準チューブが調製される。ブランクは０．２５Ｍの酢酸ナトリウムと０．０２％の塩化カルシウムを含む緩衝液２０ｍＬである。グルコース標準は１０ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（上述）と１０ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液を混合して調製される。標準は重複で調製される。

酵素混合物は８５ｍＬの脱イオン水にブタのパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７５４５）を加え、よく混合し、３０００ｇで１０分間遠心分離して調製される。上澄みを集め、４００ｍｇの乾燥インバーターゼ(invertase)（Ｓｉｇｍａ Ｔ−４５０４）と１．０ｍＬ ＡＭＧ Ｅ又はＡＭＧ ３００Ｌ(Novozymes)が加えられる。

サンプル・チューブは３７℃で３０分間プレインキュベートされ、バスから出され、１０ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液が、ガラスボール／マーブル（振とうでサンプルの物理的分解を助けるため）と合わせて加えられる。

５ｍＬの酵素混合物がサンプル、ブランク、及び標準に２０〜３０ｓｅｃ間隔で加えられる。チューブは３７℃のウオーターバスでほぼ１８０ストローク／分で振とうされる。“ゼロ”は最初のチューブに酵素混合物を最初に加えたときである。

２０分後及び１２０分後に、０．５ｍＬの分量がインキュベートしているサンプルから（同じ２０〜３０ｓｅｃ間隔で）取り出され、１９ｍＬ ６６％エタノール（反応停止のため）を含む別々のチューブにそれぞれ入れられる。１時間後、ある分量がミクロ遠心分離チューブで、１０分間３０００ｇで遠心分離される。

各チューブのグルコース濃度がグルコース・オキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法（Megazyme Glucose Assay Procedure GLC9/96）によって測定される。３ｍＬのＧＯＰＯＤを培養チューブに入れ、０．１ｍＬのサンプル分量を加え、よく混合し（軽渦セッティング）、その後２０分間５０℃でインキュベートされる。インキュベートされたサンプルはＵＶスペクトロメータを用いて５１０での吸収能が試験される。これは測色手順である。

澱粉の消化の度合は、グルコース濃度をグルコース標準に対して換算因子０．９を用いて計算することによって決定される。難消化性澱粉（ＲＳ）は、全澱粉（ＴＳ）のうち１２０分（ＧＲ １２０）の時点で消化されなかった部分である。パーセント難消化性澱粉は、ＲＳ (％ ｄｂ) = ＴＳ − ＧＲ１２０ x １００として計算される、ここでＴＳ は １００であり、ＧＲ１２０ は １２０分で消化されたＴＳのパーセントである。

Ｄ. アミロース分析
アミロース含有量の電位差計測定
約０．５ｇの澱粉（１．０ｇの砕いた粒から得られた）のサンプルが１０ｍＬの濃塩化カルシウム（重量で約３０％）中で９５℃に３０分間加熱された。サンプルは室温まで冷却され、５ｍＬの２.５％酢酸ウラニル溶液で希釈され、よく混合され、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離された。次にサンプルを濾過して透明な溶液を得た。澱粉濃度は分極セルを用いて分極測定で決定された。ある分量（普通、５ｍＬ）のサンプルが、プラチナ電極をＫＣｌ基準電極で用いて電位を記録しながら、標準化された０．０１Ｎヨウ素溶液で直接滴定された。屈曲点に達するために必要なヨウ素の量が結合したヨウ素として直接測定される。アミロースの量は１．０グラムのアミロースが２００ミリグラムのヨウ素と結合すると仮定して計算された。

実施例１
本実施例では、反応のｐＨが架橋の度合（ＴＤＦに直接関係する）に及ぼす影響が実証された。

トウモロコシ澱粉（２ｋｇ）が３０００ｍＬの水道水でスラリーにされた。これに１００ｇｍのＮａ₂ＳＯ₄ （澱粉の5%）と十分な２５％ ＮａＯＨが加えられ（澱粉の膨潤を防止するために高剪断ミキサーによって加える）、ｐＨが１０．０に達するようにした。トリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）とトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の９９：１ブレンド２００ｇｍ（澱粉の１０％）がスラリーに加えられ、スラリーのｐＨはｐＨコントローラ（Bamant Digital pH Controller Model No. 501-3400）によってｐＨ １０．０に維持された。このコントローラは、蠕動式ポンプを制御してｐＨを設定点（１０．０）に維持するように、３％ ＮａＯＨ溶液を加えた。別の同様の反応もセットされたが、ｐＨは１０．０でなく１１．５に維持された。

両方の反応からサンプルが時間的に採取されて、結合したリンが決定された。ｐＨ １０．０の反応からの４８時間サンプルは結合したリンが０．２０６％であると決定されたが、ｐＨ １１．５の反応からの４時間サンプルは結合したリンが０．２２５％であると決定された。

これらのサンプルの両方についてＴＤＦが分析された。ｐＨ １１．５サンプル（４時間の反応）はＴＤＦが４１という値になったが、ｐＨ １０サンプル（４８時間の反応）では３２であった。ｐＨ １１．５反応は結合したリンのレベルがｐＨ １０サンプルよりも９．２％高く、そのＴＤＦは２８％高かった。このことは、ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ反応の間ｐＨを高いレベルに維持することで、同じような結合リン・レベルでＴＤＦは改善されるということを示している。これは、反応の間ｐＨが下へドリフトすることを（米国特許第5,855,946号におけるように）放置するのに対して、反応の間ずっと高いｐＨを維持した反応では、結合したリンがモノエステルではなく架橋リンクとして存在している可能性が大きいことを示す証拠である。

実施例２
米国特許第5,855,946号に示されている反応条件に従って、トウモロコシ澱粉（１０００ｇ, 乾燥質量）、水（１４００ｍＬ）、ＳＴＭＰ（トリメタリン酸ナトリウム、１１８．８ｇ, 乾燥澱粉を基準として１１．８８％）、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ, １．２ｇ, 乾燥澱粉を基準として０．１２％）、及び硫酸ナトリウム（１００ｇ, 乾燥澱粉を基準として１０％）を合体し、３％水酸化ナトリウム溶液を加えて混合物のｐＨを１１．５に調整した。このスラリーが連続的に攪拌され、４５℃に温められ、４５℃に保たれた。サンプルは３時間後と２４時間後に採取された。ｐＨは３時間後に１１．０６、２４時間後に８．９６に低下したことが認められた。

サンプリング後、各スラリーは、蒸留水／塩酸の３:１ブレンドを加えてｐＨを６．５に調整し、濾過によって澱粉が集められ、水で洗浄され（１５００ｍＬで４回）、室温で乾燥された。

反応は繰り返されたが、ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰレベルは全体で１２％から８％（７．９２％ ＳＴＭＰ／０．０８％ＳＴＰＰ）に減らされた。初期アルカリ度／ｐＨ調整は、（膨潤を防ぐために）高剪断攪拌下で加えられる２５％ ＮａＯＨを用いて行われた。２５％ ＮａＯＨを用いてアルカリ度は、５０ｍＬのスラリー中のアルカリを中和するために必要な０．１Ｎ ＨＣｌの量で５０ｍＬに相当するレベルに調整された。このアルカリ度はｐＨ １１．９となった。スラリーは連続的に攪拌され、４５℃に温められ、４５℃に保たれた。その後、ｐＨは２４時間の反応の間１１．５〜１１．９に（３％ ＮａＯＨを用いて）維持された。サンプルは３時間後と２４時間後に採取された。結果は下の表１にまとめられた。

ｐＨの小さな上昇、反応の間このｐＨを維持すること、及び２５％固体ＮａＯＨを使用することによる希釈の減少という組み合わせによって、３時間後の反応物のＴＤＦは（米国特許第5,855,946号）３０から７８に１６％増加して改善された。しかし、本発明の条件を用いると、２４時間後の反応物のＴＤＦはさらに９６％に増加した（２１％の増加）。最も重要なことは、これらのＴＤＦの改善が、使用されるＳＴＭＰ／ＳＴＰＰの量の減少によって得られたことである。

スタート時のｐＨに到達するために２５％固体分ＮａＯＨを用いたことによってスラリーの希釈が減少した。３％ ＮａＯＨを使用した場合、スタート時の反応物に約１７６グラムの水を追加することになったであろう。ｐＨを１１．５と１１．９の間に維持するために３％ ＮａＯＨを追加しても、スラリーはｐＨコントロールを開始してから約３時間後までは米国特許第5,855,946号で用いられている固体分までは希釈されない。その時点でＴＤＦは最終的な値の約８０％に到達していた。

実施例３
本発明が反応物のｐＨの維持だけに依存していないことを実証するために、米国特許第5,855,946号の実施例１の条件を用いて一連の反応物を（コムギ、トウモロコシ、ポテト、及びＨｙｌｏｎ（登録商標）ＶＩＩ（高アミロース・トウモロコシ）澱粉をベースとして）調製した。澱粉（１０００ｇ, 乾燥基準）、水（１４００ｍＬ）、ＳＴＭＰ（トリメタリン酸ナトリウム、１１８．８ｇ, 乾燥澱粉を基準として１１．８８％）、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ, １．２ｇ, 乾燥澱粉を基準として０．１２％）、及び硫酸ナトリウム（１００ｇ, 乾燥澱粉を基準として１０％）を合体し、混合物に３％水酸化ナトリウム溶液を加えて混合物のｐＨを１１．５に調整した。スラリーは連続的に攪拌され、４５℃に温められ、４５℃に保たれた。サンプルは３時間後と２４時間後に採取された。

各スラリーは、蒸留水／塩酸の３:１ブレンドを加えることによってｐＨ ６．５に調整され、濾過によって澱粉が集められ、水で洗浄され（１５００ｍＬで４回）、室温で乾燥された。
２４時間の反応の間、反応物は３％ ＮａＯＨを用いてｐＨを１１．５に維持するという変更だけで繰り返された。
その後、サンプルの結合したリン及びＴＤＦが分析された。結果は表２に示されている。

ＴＤＦ及び結合したリンはいくつかのケースでｐＨのコントロールによってわずかに改善されたが、一般に出発点における１１．５というｐＨを維持することはＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ反応物質によって生ずる架橋を顕著に改善するものではなかった。ｐＨの維持と反応の間のスラリー固体分の増加（初期ｐＨの調整で２５％ ＮａＯＨを用いることによる）という決して明らかでない組み合わせによってはじめて、ＴＤＦと結合したリンの両方で顕著な改善が得られた。すなわち、米国特許第5,855,946号で得られたようなＴＤＦ又は結合したリンのレベルを達成するために、１／３少ないＳＴＭＰ／ＳＴＰＰ反応物質を使用するだけでよかった。

実施例４
反応物のｐＨ維持と最初のアルカリ度調整のための２５％ ＮａＯＨの使用の組み合わせの有効性を実証するために、別の一連の製品がトウモロコシ、コムギ、ポテト、及びＨｙｌｏｎ（登録商標）ＶＩＩ澱粉をベースとして調製された。

澱粉（１０００ｇ, 乾燥基準）、水（１４００ｍＬ）、ＳＴＭＰ（トリメタリン酸ナトリウム、７９．２ｇ, 乾燥澱粉を基準として７．９２％）、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ, ０．８ｇ, 乾燥澱粉を基準として０．０８％）、及び硫酸ナトリウム（１００ｇ, 乾燥澱粉を基準として１０％）を合体させた、混合物に３％水酸化ナトリウム溶液を加えて混合物のｐＨを１１．５に調整した。スラリーは連続的に攪拌され、４５℃に温められ、４５℃に保たれた。サンプルは３時間後と２４時間後に採取された。Ｈｙｌｏｎ（登録商標）ＶＩＩ澱粉、トウモロコシ、及びポテト・スラリーはｐＨ １１．５（アルカリ度５０ｍＬ）に、コムギはｐＨ １１．３（アルカリ度３０ｍＬ）に、２５％水酸化ナトリウムを加えることによって調整された。２５％水酸化ナトリウムは（膨潤を防ぐために）高剪断攪拌下で加えられた。その後、ｐＨは２４時間の反応の間、（３％ ＮａＯＨ溶液を用いて）スタート時のｐＨに維持された。サンプルは３時間後と２４時間後に採取された。結果は下の表３にまとめられた。

これらの結果は、実施例３で同じ基本澱粉から調製されたサンプルと比較しなければならない。実施例３では、５０％高いレベルのＳＴＭＰ／ＳＴＰＰが米国特許第5,855,946号の実施例１と同様のプロセスで用いられ、反応の間最初のｐＨが維持された。

表４はこれらの二つの実施例の間の比較を示す。

ＳＴＭＰ／ＳＴＰＰレベルが５０％高く（全体で１２％、これに対して本実施例では全体で８％）、スラリーｐＨを維持しても、最初のアルカリ度調整で２５％ ＮａＯＨを用いたときの２４時間後の反応物は、米国特許第5,855,946号のように低い（３％）固体分ＮａＯＨを用いたときに比べて、結合したリンが高く、ＴＤＦ値も高くなった。３時間後の反応物は、Ｈｙｌｏｎ（登録商標）ＶＩＩ澱粉及びポテト澱粉をベースとしたものは、２５％固体分ＮａＯＨを使用したことで改善を示さなかったが、コムギ及びトウモロコシ澱粉では、本発明のプロセスを用いてＴＤＦ値が１８〜２５％高くなった。

澱粉を２４時間反応させた後、最初のｐＨ調整で２５％ ＮａＯＨを用いて作られた澱粉は、米国特許第5,855,946号に記載されているように３％ ＮａＯＨを用いた反応物に比べてＴＤＦ値が７〜２２％高くなった。

以下の特許請求の範囲で用いられる“含む（comprises）”又は“含んでいる（comprising）”という用語は、それに続く要素を含むことを意味するが、その他の要素を排除するものではなく、変更可能である。

Claims (3)

1. トウモロコシ又はコムギ澱粉を調製する方法であって、トリメタリン酸ナトリウム（STMP）、又はトリメタリン酸ナトリウムとトリポリリン酸ナトリウム（STPP）の組み合わせを用いてトウモロコシ又はコムギ澱粉を架橋する工程を含み、そこで
   ａ）pHが、該架橋反応の前に少なくとも25％のアルカリ溶液を用いて11.5と12.0の間に調整され、該架橋反応の間11.5〜12.0に維持され；
   ｂ）前記架橋反応の前の前記pH調整の間に前記澱粉（乾燥基準）の重量で２％以下の水が添加され；
   ｃ）前記トリメタリン酸ナトリウム（STMP）が、前記澱粉の約５〜16重量％の量で使用され；そして
   ｄ）前記反応が、少なくとも36重量％の固体レベルにおいて行われる；
   ことを特徴とする方法。
2. 前記反応が25℃から70℃までの温度で行われ、前記反応が10分から30時間までの時間にわたって行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記澱粉の重量で0.01から0.2％までのトリポリリン酸ナトリウム（STPP）が用いられる、請求項１に記載の方法。