KR20010013449A - 알파-아밀라제에 대해 내성을 가지는 식품급 전분 - Google Patents

알파-아밀라제에 대해 내성을 가지는 식품급 전분 Download PDF

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Abstract

본 발명은 α-아밀라제 소화에 대해 높은 대해 내성을 가지는 화학적으로 변성된 RS4전분에 관한 것이다. 본 발명의 전분은 식이섬유공급원으로서 빵이나 크랙커와 같은 식품에 저칼로리 식품 첨가물로서 역할을 할 수 있다. 본 발명의 변성 전분은 에떠한 종류의 출발 전분(예를 들면,밀, 옥수수, 귀리, 쌀, 타피오카, 멍빈, 감자 또는 고함량 아밀로즈 전분)으로부터 제조될 수 있으며, 인산화 디스타치 포스포디에스테르 형태인 것이 바람직하다. 바람직한 인산화제는 황산나트륨이나 염화나트륨 존재하의 트리메타인산나트륨(STMP)과 트리폴리인산나트륨의 혼합물이다. 본 전분은 염기성 pH, 중온의 온도에서 수성 슬러리 반응으로 제조되는 것이 바람직하다.

Description

알파-아밀라제에 대해 내성을 가지는 식품급 전분{FOOD GRADE STARCH RESISTANT TO ALPHA-AMYLASE}
발명의 배경
본 발명은 α-아밀라제 소화에 대해 높은 내성을 가지는 화학적으로 변성된 전분, 이러한 변성된 전분을 함유하는 식품, 및 이러한 전분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 RS4변종으로서, α-아밀라제 소화에 대해 적어도 20% 내성을 가지는 전분에 관한 것이다. 이러한 전분은 저칼로리의 식이 섬유 공급원으로서 빵 및 그랙커와 같은 효모-발효 또는 화학-발효 식품에 혼입될 수 있다. 이러한 전분은 작용기가 여러개인 인산화제(예를 들면, 트리메타인산 나트륨(STMP) 또는 STMP와 트리폴리인산나트륨(STPP)의 혼합물)를 사용하여 가교결합시킴으로써 제조될 수 있다.
종래 기술
전분은 식물체 내에서 생성되는 예비 식품으로서, 사람이 섭취하는 식품에 있어서 중요한 성분이다. 전분은 침이나 췌장에서 분비되는 α-아밀라제 효소의 촉매 작용에 의해 말토즈와 덱스트린으로 소화된다. 이 덱스트린은 소장의 브러쉬보더 내에서 더 가수분해되어 D-글루코즈로 된다. α-아밀라제(분자량 50,000 ~ 60,000달톤)는 전분을 구성하고 있는 아밀로즈와 아밀로펙틴에 존재하는 α-1,4 결합을 가수분해하는데 촉매작용을 하는 내효소이다. 이 효소는 α-1,6 결합의 가수분해에는 관여하지 않는다. 글루코아밀라제와 α-글루코시다제는 D-글루코즈사이의 α-1,4결합 및 α-1,6 결합을 분할시키는 외효소이다.
1980년대 초기에, 특정 전분이 소화에 대해 내성을 가진다는 것이 밝혀졌다. 그 대신 이 전분은 대장으로 들어가서, 박테리아에 의해 분해된다. 상부 위장관에서의 소화에 대한 전분의 내성은 식품의 물리적 상태 및 제조방법과 저장 상태와 같은 내적 요인, 및 전분 소화에 영향을 미치는 생리학적 조건과 같은 외적 요인에 따라 달라진다는 것이 알려졌다. 대장으로 들어가는 전분은 위장관 상부에서의 전분과 비교할 때, D-글루코즈 형성으로 에너지를 제공하는 등의 많은 다른 생리학적인 결과를 나타낸다.
1987년에 영국의 캠브리지에 있는 MRC Dunn Clinical Nutrition Center의 Englyst와 Cummings는 생체내에서의 소화 특성을 기본으로 한 전분 분류에 대해 제안을 하였다. 또한 그들은 전분의 다양한 소화 특성을 나타내 보이기 위한 생체내 분석법을 제시하였다. 그들은 식이성 전분을 다음과 같이 3가지 등급으로 분류하였다.
(1) 신속히 소화되는 전분(RDS). RDS는 사람의 소장내에서 신속하게 소화된다. 예를 들면, 금방 조리된 쌀과 감자, 및 일부 아침식사용 인스턴트 시리얼 제품.
(2) 천천히 소화되는 전분(SDS). RDS는 소장내에서 천천히, 그러나 완전히 소화된다. 예를 들면,생 곡물 전분 및 조리된 파스타.
(3) 내성 전분(RS). RS는 소장에서의 소화에 대해 내성을 가진다. 따라서 RS는 건강한 사람의 소장에서 흡수되지 않는 것으로 생각되는 전분 분해 산물과 전분의 합으로서 정의된다. RS는 내성의 원인에 따라서 다음과 같이 네가지 범주로 다시 분류될 수 있다(Englyst 외.1992; Eerlingen 외.1993).
*RS1: 과립이 단백질 기질내부나 식물 세포벽 내부로 빠져들어서 물리적으로 분해불가능한 전분, 예를 들면, 부분 밀링된 곡식이나 조리후의 레줌(lesume).
*RS2: 과립이 표면에 미공을 거의 가지고 있지 않기 때문에 α-아밀라제에 의한 소화에 대해 내성을 가지는 전분, 예를 들면, 감자나 그린 바나나와 같은 생 전분 입자.
*RS3: 전분이나 전분 식품을 열/수분처리함으로써 생성되는 역행성 아밀로즈. 예를 들면,조리/냉동 감자 및 콘프레이크에서 발견된다.
*RS4: 아세틸화되거나 히드록시프로필화되거나 가교결합됨으로써 α-아밀라제에 의한 소화에 대해 내성을 가지는 화학적으로 변성된 전분. 이러한 변성된 전분은 RS에 대한 시험관내 분석에 의해 검출될 수 있다. 그러나 일부 RS4는 대장 내에서 분해되지 않는다.
RS1, RS2및 S3는 물리적으로 변형된 형태이기 때문에, 수산화나트륨이나 디메틸 술폭사이드내에 용해시키면 α-아밀라제에 의한 소화가 가능해진다. 그러나 RS4는 화학적으로 변성된 것이기 때문에 용해시켜도 α-아밀라제에 의한 소화에 대해 내성을 가진다.
RS는 식품 성분으로서 중요한 물질이다. RS는 일반적인 식이 섬유 공급원과는 달리, 물을 많이 함유하고 있지 않기 때문에, 쿠키나 그랙커와 같은 저수분 식품에 사용되는 섬유질공급원으로서 바람직하다. 또한 RS는 입속에서 가루가 섞인 것 같은 느낌이 없기 때문에, 통상적인 섬유질공급원과는 달리, 식품이 가지고 있는 맛과 고유 특성을 크게 바꾸지 않는다. 이러한 특성은 RS를 함유하는 굽거나 압출생산한 것과 같은 식품의 질 및 가공성을 향상시킬 수 있다. 더군다나 RS는 식이 섬유을 구성하는 성분으로서, 제로 칼로리가 가능하다.
RS는 식품 중 식이 섬유 프랙션에 포함되며, 사람의 소화관내에서 섬유질로서 작용을 하는 것으로 생각된다. 사람의 위장관 내에서 RS의 낮은 생체이용가능성은 생리학적으로 중요한 효과를 가진다. 예를 들면, 글루코즈의 방출이 서서히 이루어지고, 식후 혈액속의 지질과의 혈당 반응이 보다 낮게 이루어진다. RS가 대장에 도달되면, 수소, 메탄, 이산화탄소, 유산(일시적) 및 단쇄 지방산으로 분해되어, 대장 질환 예방에 기여하는 하는 것으로 알려져 있다.
전분의 소화성은 가공 및 저장 조건에 의해 영향을 받을 수 있다고 알려져 있다. 전분의 화학적 변성은 전분의 생체내에서의 소화를 억제하는 것으로 알려져 있으며, 그 억제 정도는 가능한 변성 형태 및 변성 정도와 관계가 있다. 변성은 전분의 식물학적 특성, 사용되는 변성제 및 그 이후의 화학 결합, 생성되는 유도체, 과립 젤라틴화 정도, 및 효소의 선택에 따라 좌우된다(Anonymous 1972, Filer 1971). Bank 등(1973)은 전분의 치환 정도가 히드록시에틸 아밀로즈에 대한 전분분해성 공격의 정도 및 속도를 결정한다고 보고하였다.
Leegwater 및 Lutten(1971)는 판크레아틴에 의한 히드록시프로필 치환 전분의 소화성을, 치환도를 0.45%HP 까지 증가시킴으로써 지수적으로 감소시킬 수 있다고 보고하였다. Janzen(1969)은 0.05% 및 0.1% POCl3를 사용하여 가교결합시킨 감자 전분 포스페이트는 소화 후의 잔량의 중량을 측정한 결과, 판크레아틴에 의한 생체내 소화에 아무런 영향을 받지 않는다는 것을 보고하였다. Hood 및 Arneson(1976)는 히드록시프로필 디스타치포스페이트 변성은 비젤라틴화 전분의 소화는 증가시키지만 젤라틴화 전분의 소화는 감소시킨다는 것을 보고하였다. 가교결합의 도입은 과립구조를 안정화시키고 팽창도를 제한하는 경향이 있다. 가교결합의 정도가 높아지면, 과립 겔상의 미공이 너무 작아져서 큰 분자를 수용할 수 없다. 몇몇 사람은 포스페이트 가교결합이 변성안된 전분에 비해, 효소작용에 의한 가수분해를 다소 감소시키거나, 가수분해에 아무런 영향을 주지 않는다고 보고하고 있다(Anonymous 1972, Osrergard, 1988; Bjock 등.,1988). 히드록시프로필 디스타치포스페이트, 히드록시프로필 스타치 및 디스타치포스페이트를 섭취한 쥐에서의 내부 미소식물의 변화는 에테르 결합을 함유하는 전분은 포스페이트 결합만을 함유하는 전분보다 소화되기 어렵다는 것을 보여주는 것이다(Hood, 1976). 감자 전분의 히드록시프로필 디스타치포스페이트 유도체는 쥐의 경우 생체내 소화율이 50%이다(Bjorck 등., 1988).
일반적으로, 알려져 있는 식이 섬유의 건강적 효과와 식품에 있어서 RS4의 또 다른 잠재적인 이점을 고려할 때, α-아밀라제 소화에 대해 높은 대해 내성을 가지는 개선된 RS4전분 뿐만 아니라, 이러한 화학적으로 변성된 전분을 저비용으로 제조하는 방법에 대한 필요성이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 상술한 문제점을 해소시킨 것으로서, 미국 분석 화학자 협의회(AOAC) 방법 992.16(1995)에 의해 측정했을 때, α-아밀라제 소화에 대해 적어도 약 20%의 내성을 가지는 화학적으로 변성된 전분을 제공한다. 본 발명의 전분은 바람직하게는 상기 방법에 의해 측정했을 때, 적어도 약 35%의 내성을 가지며, 특히 바람직하게는 적어도 약 50%의 내성을 가진다. 본 발명의 화학적으로 변성된 전분의 제조에는 원전분의 다양한 변종을 사용할 수 있다. 이러한 원전분은 예를 들면, 곡물, 근채류, 괴경(감자류), 레줌(콩과류) 및 고함량 아밀로즈 전분 중에서 선택될 수 있다. 바람직한 전분의 특정 예를 들면, 밀, 옥수수, 귀리, 쌀, 타피오카, 멍빈(mung bean) 및 감자 전분 등이 있다.
아세틸, 숙시닐, 및 포스포릴기가 α-아밀라제 소화에 대한 내성을 증가시킬 수 있으나, 바람직한 전분은 가교결합된 전분이다. 가장 바람직한 가교결합된 전분은 인산화되어 디스타치포스페이트 디에스테르를 형성하며, 적어도 0.1중량%, 보다 바람직하게는 0.2중량%의 잔류 인을 함유한다. 가장 바람직한 인산화제는 STMP, 또는 STMP와 STPP의 혼합물이다. 혼합물이 사용되는 경우, 일반적으로, STMP는 약 1 ~ 20중량%(보다 바람직하게는 약 5 ~ 12중량%)이고, STPP는 약 0.01 ~ 0.2중량%(보다 바람직하게는 약 0.05 ~ 0.12중량%)이다. STMP/STPP 혼합물은 출발물질인 변성안된 전분의 중량을 100중량%로 할 때, 약 1 ~ 20중량%, 보다 바람직하게는 약 5 ~ 12중량%의 양으로 사용되는 것이 유리하다. STMP 만을 사용하는 경우에도, 상기 명시한 일반적인 범위 및 바람직한 범위를 사용할 수 있다. 또 다른 유용한 인산화제로는 포스포릴 클로라이드가 있다. 또한, 또 다른 가교결합제, 예를 들면 아디프산 또는 에피크롤로히드린도 사용될 수 있다.
본 발명의 화학적으로 변성된 전분은 특히 효모-발효 또는 화학-발효 식품, 밀을 주원료로 하는 식품, 빵이나 크랙커와 같이 굽거나 프라잉한 식품의 식품 첨가물로서 유용하다. 본 발명의 전분은 저칼로리의 식이 섬유공급원 및 내성 전분으로서 작용한다. 일반적으로, 변성 전분은 식품에 약 25중량% 이하의 양으로, 보다 바람직하게는 15중량%이하의 양으로 사용될 수 있다. 그러나 35중량% 까지의 양으로 사용하는 것이 가능하다.
화학적으로 변성된 전분은 상기 제시한 α-아밀라제 소화 특성을 가지는 변성 전분을 생성시킬 수 있는 pH 및 온도 조건하에서, 물의 존재하에 출발 전분(변성안된 원전분)을 가교제와 함께 반응시킴으로써 제조된다. 바람직한 제조방법은 우선 물 속에서 출발 전분의 슬러리를 형성시킨 다음, 이 슬러리에 가교결합제를 첨가하는 단계를 포함한다. 이 슬러리는 일반적으로 약 15 ~ 60중량%, 보다 바람직하게는 약 30 ~ 50중량%의 전분을 함유한다. 바람직한 인산화 가교결합제는 상술한 바와 같은 STMP이거나 또는 STMP/STPP 혼합물이다. 바람직한 반응 조건은 염기성 pH (바람직하게는 약 10 ~ 13, 보다 바람직하게는 약 11 ~ 12)이며, 반응 온도는 약 25 ~ 70℃, 바람직하게는 약 30 ~ 50℃이다. 반응에 필요한 시간은 원하는 정도의 α-아밀라제 소화에 대한 내성을 얻기에 충분한 시간이면 되며, 바람직한 반응시간은 약 1/6 ~ 24시간, 보다 바람직하게는 약 1 ~ 3시간 정도이다. 인산화제로서 STMP 또는 STMP/STPP 혼합물이 사용되는 경우에는, 필요에 따라 슬러리에, 변성안된 출발 전분의 중량을 100중량%로 할 때, 약 0.1 ~ 20중량%의 황산 나트륨이나 염화나트륨을 첨가하는 것이 바람직하다. 이러한 염들 중에 하나를 첨가시킴으로써, 반응중에 겔이 형성되는 것을 억제할 수 있고, 전분 과립에 염기의 흡착을 증가시킴으로써 반응을 촉진시킬 수 있다.
도 1 은 α-아밀라제를 사용하는 RS에 대한 AOAC 측정 방법에 포함되는 단계를 도시한 개략도이다.
도 2 는 돼지췌장 α-아밀라제를 사용하는 수정된 RS 측정 방법을 도시한 개략도이다.
도 3A 는 pH 11.5, 45℃에서 3시간 동안, 전분의 중량을 기준으로 총 1.2중량%의 STMP/STPP 99/1(w/w)혼합물과 10% 황산나트륨 존재하에 밀 전분 슬러리(40%)를 반응시켜 제조된 변성 전분 포스페이트의 페이스팅 곡선(10% 전분 슬러리)을 도시한 것이다.
도 3B 는 pH 11.5, 45℃에서 3시간 동안, 전분의 중량을 기준으로 총 0.6중량%의 STMP/STPP 99/1(w/w)혼합물과 10% 황산나트륨 존재하에 밀 전분 슬러리(40%)를 반응시켜 제조된 변성 전분 포스페이트의 페이스팅 곡선(10% 전분 슬러리)을 도시한 것이다.
도 4A는 햄스터에게 4가지 다이어트식, 즉, 셀룰로오스(CL), 노벨로즈(NOV), RS4-밀-39, 및 RS4-밀-76을 먹이는 실험에서, 시간에 따른 식사 섭취량을 도시한 그래프이다. 여기서 모든 다이어트식은 같은 양의 섬유질 또는 내성 전분(AOAC, 10%), 단백질(15%), 지방(10%) 및 콜레스테롤(0.5%)을 함유하였다.
도 4B는 햄스터에게 4가지 다이어트식, 즉, 셀룰로오스(CL), 노벨로즈(NOV), RS4-밀-39, 및 RS4-밀-76을 먹이는 실험에서, 시간에 따른 체중을 도시한 그래프이다. 여기서 모든 다이어트식은 같은 양의 섬유 또는 내성 전분(AOAC, 10%), 단백질(15%), 지방(10%) 및 콜레스테롤(0.5%)을 함유하였다.
도 5 는 노벨로즈(Novelose)라는 상품명으로 시판되는 내성 전분을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 6 은 크리스타린(CrystaLean)이라는 상품명으로 시판되는 내성 전분을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 7 은 프라임 밀 전분을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 8 은 본 발명에 따르는 화학적으로 변성된 전분인 RS4-옥수수-76을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 9 는 프라임 옥수수 전분을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 10 은 본 발명에 따르는 화학적으로 변성된 전분인 RS4-옥수수-58을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 11 은 프라임 감자 전분을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 12 는 본 발명에 따르는 화학적으로 변성된 전분인 RS4-감자-73을 1000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다.
도 13 은 시판 중인 노벨로즈 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 14 는 시판 중인 크리스타린 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 15 는 RS4-옥수수-76 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 16 은 RS4-옥수수-58 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지 췌장의 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 17 은 RS4-쌀-85 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 18 은 시판 중인 노벨로즈 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 103U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 19 는 시판 중인 크리스타린 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 103U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 20 은 RS4-밀-76 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
도 21 은 RS4-옥수수-58 전분을 20중량부의 물 속에서 끓인 다음, 37℃에서 16시간동안 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용하여 전분 1g에 대해 105U/g으로 소화시켜 분리한 전분 잔류물을 2000배 확대시킨 전자현미경 사진(SEM)이다. 여기서 잔류물은 원심분리한 다음, 에탄올로 세척하고 공중 건조시킴으로써 분리하였다.
본 실시예에서는, 전분(밀, 옥수수, 감자, 쌀, 타피오카, 멍빈, 귀리)을 STMP/STPP 및 또 다른 가교결합제로 인산화시킴으로써 제품을 제조하였다. 인 함량이 0.4%까지로 서로 다른 전분 제품 중 RS4의 양을 측정하였으며, RS4와 셀룰로오스를 함유하는 다이어트식을 먹인 햄스터의 혈청 콜레스테롤 반응 및 맹장 단쇄 지방산(SCFA)양을 평가하였다.
재료 및 방법
재료
옥수수, 감자, 및 쌀 전분, 트리메타인산나트륨, 에피클로로히드린, 아밀로글루코시다제 용액(Cat.No.A9913), 프로테아제 용액(Cat.No.A9913), IV-B 타입 α-아밀라제(Cat.No.A3176), 및 콜레스테롤과 HDL 콜레스테롤 진단키트(각각 Cat.No. 352 및 352-3)는 Sigma Chemical Co.(St.Louis)사로부터 구입하였다. 멍빈 전분은 지방의 아시아 식품점에서 구입하였다. 돼지 췌장의 α-아밀라제(PPA)는 고체 1 mg 당 23U를 함유하는데, 여기서 1U란 pH6.9, 20℃에서 3분동안 전분으로 부터 1.0mg의 말토즈를 생성시키는 양을 의미한다. 밀 전분(Midsol)은 Midwest Grain Products Co.(Atchison, KS)사로부터 구입하였으며, 타피오카 전분과 노벨로즈(내성 전분)는 National Starch and Food Co(Bridgewater, NJ)사로부터, 크리스타린은 Opta Food Ingredients,Inc.(Bedford, MA)사로부터 구입하였다. 포스포릴 클로라이드는 Aldrich Chemical Company(Milwaukee)사로부터 구입하였다. 열에 안정한 α-아밀라제인 터마밀(Termamyl)은 NOVO(Novo Nordisk, Franklinton,NC)사로부터 용액으로 구입하였다. 터마밀은 용액 1㎖ 당 9.78 ×103U이며, 1U는 Robyt 및 Whelan(1968)에 의해 설명된 바에 따르면, 최적 pH, 25℃에서 1분에 수용성 전분 용액 ㎖ 당 20mg의 농도에서 1μmol의 환원기를 생성시킨다. 글루코즈 효소 분석키트(테스트 콤비네이션, Cat.No.716251)는 Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)사로부터 구입하였다. 젖을 뗀 금색 수컷 시리아 햄스터는 Sasko,Inc(Omaha,NE)사로부터 구입하였으며, 셀룰로오스(CL,Solka-Floc)는 FS ＆ D Corp.(Urbana, OH)사로부터 구입하였다.
일반적인 방법
모든 화학적 분석은 별도의 설명이 없는 한, 3번 행해졌다. 단백질에 대해서는 Kjeldahl 질소법(AACC법, 46-13)에 의해 분석하였으며, 회(ash)에 대해서는 건조 연소법(AACC법, 08-01), 수분에 대해서는 샘플을 130℃에서 1시간동안 오븐-건조법(AACC법, 44-15)에 의해 분석하였다. 전분(샘플 크기 5 ~ 10g) 중 인 함량은 Smith 와 Caruso의 "탄수화물 화학법"의 방식에 따라 측정하였다. 별도의 설명이 없는 한, 인 함량은 전분 속에 들어있는 천연적인 인과 전분으로 에스테르화된 인을 합한 것이다.
전분의 페이스팅(pasting) 특성은 700cm.g, 75rpm에서 브라벤더 비스코그래프-E(C.W.Brabender Instruments,Hackensack,NJ)내에서 조사하였다. 전분(8%, 건조물 기준)의 수성 슬러리를 1.5℃/분의 속도로 30 ~ 95℃에서 가열한 다음, 30분간 95℃에서 유지시킨 후, 50℃로 냉각시키고 30분간 50℃에서 유지시켰다(Mazurs 등 1957, Tipple 1980). 패스팅 곡선은 2회 수행되었는데 거의 같은 형태였다..
55℃에서 전분(0.5g)을 90% DMSO(100㎖)와 함께 수조속에서 흔들어 주면서 반응시킴으로써, 디메틸 술폭사이드에서의 전분의 용해도를 조사하였다(Libby 등 1970). 30분 후에 용해안된 전분을 원심분리(8,000 ×g, 15분)에 의해 회수한 다음, 그 상청액은 따라 버리고, 침강된 전분을 에탄올(2 ×100㎖)로 세척한 다음, 40℃에서 건조시켰다. 이 건조된 잔류물의 무게를 달아봄으로써, DMSO에 대한 불용해도를 측정하였다.
상대습도 95%에서 24시간 동안 23℃로 저장시킨 샘플에 대해 전분 X-선 회절을 수행하였다. 35KV, 20mA에서 작동시킨 X-선 회절계인 필립스(Model 42273; Philips,Mahwah,NJ)를 사용하여 X-선 회절그래프를 얻었다. 전분의 X-선 회절 도형은 여과된 Cu/Ni 호일(Ka복사)에 의해서 취해졌다. 1분당 2°×2θ수준으로 2θ(회절각)범위 5 ~ 35°에서 샘플을 주사하였다. 스텝간 간격은 0.01°θ이고, 측정시간은 1초였다.
20kV의 가속 전위에서 Perkin-Elmer Elec-Autoscan U-1 전자현미경에 의해 주사 전기현미경 사진(SEM)을 취하였다. 전분 샘플을 시료스텁 상부에 있는 양면 테이프에 뿌리고 난 다음, 금으로 코팅하였다.
100℃에서 AOAC법에 의한 RS의 측정(RS-AOAC)
RS는 공식적인 식이섬유 측정법(AOAC법, 1995)에 의해 결정되었다. 이 방법에 대해서는 도 1에 도시하였다. 400㎖ 키큰 형태의 비이커 속에서 0.05M MES-Tris 완충액(pH 8.2) 40㎖에 전분(1g)을 분산시킨 다음, 저속으로 교반시키면서 터마밀 α-아밀라제 용액(50㎕, 489U)을가하였다. 이 비이커를 아루미늄 호일로 싸서, 게속 교반시키면서 100℃에서 30분간 수조에 넣어 두었다. 이것을 60℃로 냉각시킨 다음, 프로테아제(100㎕)를 가하고, 이 혼합물을 계속 교반시키면서 30분간 배양시켰다. 이 용액에 0.561M NaOH 용액 5㎖를 가하여 pH를 4.0 ~ 4.7로 조절한 다음, 아밀로글루코시다제 용액(300㎕)을 가하였다. 이것을 30분간 배양시킨 후에, 소화물을 실온으로 냉각시키고, 여과산으로서 셀라이트(1g)의 건조베드를 사용하여, 무게를 단 소결 유리도가니(Porosity No.2)에 의해 여과시켰다. 이 불용성 잔류물을 증류수(2 ×15㎖), 78% 에탄올, 순수 에탄올 및 아세톤으로 세척하였다. 잔류물을 함유하는 도가니를 강재통풍 오븐 속에서 105℃로 밤새 건조시킨 다음, 실온으로 냉각시킨 후에, 무수황산칼슘을 사용하는 건조기 속에서 무게를 달았다. RS는 건조 중량을 기준으로 한 전분 중 퍼센트로서 표현되는 불용성 잔류물이다.
37℃에서 돼지췌장 α-아밀라제에 의한 RS의 측정(RS-PPA)
다음은 RS(PPA)라고 불리우는 Englyst(1982)에 의해 발표된 방법에 수정을 가한 것이다. 이 방법에 대해서는 도 2에 도식적으로 나타내었다.
스크루-캡 원심분리관(50㎖,28.5 ×114.3mm,Nalgene,Cat.No.3139-0050) 속에서, 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)(1.0870g)를 함유하는 0.1M(pH6.9)인산염 완충액(25㎖)에 전분(0.25g)을 가하였다. 이 PPA의 양은 전분 1g당 효소 100,000U에 해당한다. 이 반응 혼합물을 자석 교반바(3 ×12.7mm)로 철저히 교반시키면서 37℃에서 16시간 동안 배양시켰다. 이 소화물을 냉각시킨 다음, 원심분리(3,000 ×g)시키고, 분량(0.5㎖)의 맑은 상청액을 아밀로글루코시다제 용액(9.5㎖)로 60℃에서 60분간 배양시켰다. 이 아밀로글루코시다제 용액은 공급된 시제를 0.lM 초산나트륨 완충액(pH4.0) 20용량으로 희석시킴으로써 미리 제조해 놓은 것이다. 글루코아밀라제에 의한 소화 후에, 이 샘플을 원심분리시킨 다음(3,000 ×g, 10분간), 분량(0.1㎖)의 상청액을, 25℃에서 3분간 글루코즈 분석 키트의 시제I(3.2M 황산암모늄 용액(pH7.6)중의 NADP와 ATP의 혼합물, 1.0㎖)와 물(1.9㎖)와 혼합하였다. 그 다음, 여기에 분석 키트의 시제II(3.2M 황산암모늄 중의 헥소키나제와 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제의 혼합물, 0.02㎖)를 가한 후에, 15분 후 이 용액의 흡광도를 340nm에서 측정하였다. 이 분석에서, 글루코즈는 과량의 헤소키나제(HK)와 아데노신 5-트리포스페이트(ATP)의 존재하에 글루코즈-6-포스페이트(G-6-P)로 변화된다. 그리고 나서, 이 G-6-P는 니코틴아미드-아데닌디뉴클레오티드 포스페이트(NADP)에 의해 산화되어 환원된 니코틴아미드-아데닌디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH)를 생성시키면서 글루코네이트-6-포스페이트로 된다. 이 반응에서 생성된 NADPH의 양은 340nm에서의 흡광도를 측정함으로써 확인된 결과, D-글루코즈의 양과 화학량론적으로 부합된다. 340nm에서의 흡광도에 대해 블랭크 보정을 하였으며, 글루코즈는 전분으로 전환시켰다(글루코즈 1g이 전분 0.9g에 해당됨). 블랭크 샘플은 전분을 사용하지 않고 같은 효소 소화 방법에 따라 제조하였다.
조리후 전분의 소화성을 알아보기 위해, 스크루-캡 원심분리관(50㎖, Nalgene) 속에서 전분(0.25g)을 물(5㎖)과 혼합하였다. 스크루 캡을 꽉 조인 다음, 이 밀봉한 원심분리관을 30분동안 끓는 물 수조속에 넣어둔 후에, 이 뜨거운 혼합물에 곧 바로 0.125M(pH 6.9)인산염 완충액(10㎖)를 가하였다. 이 혼합물의 온도가 37℃가 되었을 때, 0.125M(pH 6.9) 인산염 완충액(10㎖) 중의 돼지췌장 α-아밀라제(1.0870g, 25,000U) 용액을 가한 다음, 이 소화물을 37℃에서 16시간 동안 철저히 교반시켰다. 그리고 전분 1g당 50,000, 10,000, 1,000U를 사용하여 또 다릉 소화 절차를 수행하였다. 각각의 소화물을 원심분리시킨 다음, 분량(0.5㎖)의 상청액을 앞서 기술한 바와같이 글루코아밀라제로 소화시켰다. 생성된 글루코즈는 뵈링거-만하임 키트에 의해 측정하였으며, 소화안된 전분은 차에 의해 결정하였다.
몇몇 조리된 전분의 내성 잔류물의 주사 전자현미경사진(SEM)을 취하였다. 이 잔류물은 원심분리에 의해 분리한 다음, 물로 세척하고 나서, 공중 건조시켰다. 이 샘플을 터브에 올려놓고, 금박막으로 코팅한 다음, 현미경으로 조사하였다.
실시예 1
A. STMP/STPP 또는 STMP을 사용한 수성 슬러리의 전분의 인산화
둥근바닥 플라스크 속에 STPP(0.06g, 전분을 기준으로["bos"] 0.12%)와 함께, 또는 STPP 없이 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖), 트리폴리인산나트륨 (5.94g,11.88%, bos) 및 황산나트륨(5g, 10%,bos)을 가한 다음, 이 혼합물에 1.0M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리를 계속해서 교반시킨 다음, 45℃로 가온 시킨 후에, 45℃에서 3시간 동안 유지시켰다. 그런 다음, 슬러리의 pH를 0.2 ~ 0.3 단위로 낮추었다. 1.0M 염산(약 20㎖ 이하의 양)을 가하여 슬러리의 pH를 6.5로 조절한 다음, 원심분리에 의해 전분을 회수한 후에, 물(4 ×100㎖)로 세척하고 40℃에서 건조시켰다. 이 인산화된 전분은 0.38%인을 함유하였으며, 그 수득량(다른 모든 인산화된 전분 포함)은 약 99%보다 많았다. AOAC법에 의해 측정된 RS 양은 76%였다. 이 제품은 RS4-밀-76(표 1)라고 표기한다. 또 같은 방법으로, 3.96% STMP 및 0.04% STPP와 함께 반응시킨 밀 전분은 AOAC RS 함량 39%를 나타내었다. 이 제품은 RS4-밀-39라고 표기한다. 또한 STMP와 STPP의 비를 달리하여(표 2), 반응 조건을 달리하여(표 3) 실험을 하였다.
각각 STMP/STPP의 99:1 혼합물을 총 12%, 14%, 9% 및 12%를 사용하여 같은 방법으로, 옥수수, 감자, 쌀 및 멍빈 전분을 인산화함으로써, 수득률 100%의 RS4-옥수수-58, RS4-감자-73, RS4-쌀-5, 및 RS4-멍빈-98 (즉, AOAC RS 함량이 각각 58%, 73%, 5% 및 98%임)을 얻었다.
B. 전분 및 가교결합 전분의 또 다른 인산화 방법
인산화에 의해 내성 전분을 제조하기 위한 몇가지 또 다른 방법을 수행하였다.
1. 10%(bos)황산나트륨 존재하에 온도를 변화시키면서 인산화하는 방법.
둥근바닥 플라스크 속에 STPP(0.07g, 0.014%,bos)와 함께, 또는 STPP 없이 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖), 트리폴리인산나트륨 (6.93g,11.86%, bos) 및 황산나트륨(5g, 10%,bos)을 가한 다음, 이 혼합물에 1.0M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리를 계속해서 교반시킨 다음, 평균 1분당 1.1℃의 속도로 25 ~ 45℃로 가열시킨 후에, 75℃에서 20분 동안 유지시켰다. 그런 다음, 이 슬러리를 실온으로 냉각시킨 다음, 1.0M 염산(약 20㎖ 이하의 양)을 가하여 슬러리의 pH를 6.5로 조절한 다음, 원심분리에 의해 전분을 회수한 후에, 물(4 ×100㎖)로 세척하고 40℃에서 건조시켰다.
2. 10%(bos)황산나트륨 존재하에 적당온도에서 pH를 변화시키면서 인산화하는 방법. 둥근바닥 플라스크 속에 두 가지 양(12%, 16% bos)의 STMP/STPP 혼합물(99:1)과 함께, 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖) 및 황산나트륨(5g, 10%,bos)을 가하였다. 각각의 혼합물을 45℃로 가열시킨 후에, 1.0M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리를 5분간 교반시킨 다음, 2.0M 수산화나트륨 10㎖을 가하였다. 5분 간격으로 2번 더 수산화나트륨을 가함으로써 슬러리의 최종 pH를 12.3으로 되게 하였다. 이 슬러리를 계속해서 15분간 더 교반시키고 총 반응 시간을 30분으로 하였다. 그 다음, 1.0M 염산을 가함으로써 이 슬러리의 pH를 6.5로 조절한 다음, 상술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리시켰다.
3. 20%(bos)황산나트륨 존재하에 고온에서 인산화하는 방법. 25℃에서 둥근바닥 플라스크 속에 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖) 및 고함량의 황산나트륨(10g, 20%,bos)을 가한 다음, 1.0M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리를 계속해서 교반시킨 다음, 70℃로 가열하고, 여기에 트리폴리인산나트륨(4.96g, 9.9%,bos)과 STPP(0.5g, 0.1%,bos)의 혼합물을 가하였다. 이 혼합물을 70℃에서 30분동안 교반시킨 후에, 실온으로 냉각시켰다. 이 슬러리에 1.0M 염산(일반적으로 약 20㎖)을 가함으로써 이 슬러리의 pH를 6.5로 조절한 다음, 상술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리시켰다.
4. 10%(bos)황산나트륨 존재하에 실온에서 5시간 동안 인산화하는 방법. 실온에서 슬러리 반응으로 전분을 인산화하였다. 반응시간은 다소 길어지고(5시간 대 3시간), 반응온도는 감소되고(25℃ 대 45℃), SMPP/STPP 혼합물의 양은 증가함으로써(14% 대 12%,bos), RS4-밀-76을 수득하였다. 둥근바닥 플라스크 속에 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖), 트리메타인산나트륨(6.93g,13.86%.bos), STPP (0.07g, 0.14%,bos) 및 황산나트륨(5g,10%,bos)을 가한 다음, 이 혼합물에 1.0M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리를 계속해서 교반시킨 다음, 45℃로 가온시킨 다음, 45℃에서 1시간동안 유지시켰다. 그 다음,이 반응 혼합물을 중화시킨 후에, 상술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리시켰다.
5. 10%(bos)황산나트륨 존재하에 중온(45℃)에서 고함량의 STMP/STPP를 사용하여 인산화하는 방법. 둥근바닥 플라스크 속에 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖) 및 고함량의 SMPP(9.4g,19%,bos)와 STPP(0.1g,0.19%) 및 황산나트륨(5g, 10%,bos)을 가한 다음, 이 혼합물에 1.0M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리를 계속해서 교반시킨 다음, 45℃로 가온시킨 다음, 45℃에서 1시간동안 유지시켰다. 그 다음,이 반응 혼합물을 중화시킨 후에, 상술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리시켰다.
6. 황산나트륨 없이 높은 pH, 실온(45℃)에서 인산화하는 방법. 25℃에서 둥근바닥 플라스크 속에 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖) 및 고함량의 트리메타인산나트륨(6.94g,11.88%.bos), STPP (0.06g, 0.12%,bos)를 5분동안 교반시켰다. 그 다음, 이 혼합물에 1.0M 수산화나트륨(약 45㎖)을 가함으로써 pH를 12로 조절하였다. 이 슬러리를 계속해서 실온에서 12시간동안 교반시켰다. 반응이 완료된 후에, 전분 슬러리에 1.0M 염산(20±1.5㎖)을 가함으로써 이 슬러리의 pH를 6.5로 조절한 다음, 상술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리시켰다.
7. 에피클로로히드린으로 가교결합시키는 방법. 밀 전분(50g, 건조 중량), 물(70㎖) 및 황산나트륨(7.5g)을 함께 혼합한 다음, 이 혼합물에 1.0M 수산화나트륨을 가함으로써 pH를 11.5로 조절하였다. 이 슬러리에 에피클로로히드린(0.15, 0.5, 및 1.0g)을 가한 다음, 반응을 25℃에서 15시간 동안 진행시켰다. 이 반응 혼합물을 무기산을 사용하여 pH 6.5로 조절한 다음, 상술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리시켰다.
8. 수분함량이 중간수준인 반응조건하에서 인산화하는 방법. 5중량부(전분 기준)의 황산나트륨 및 2중량부의 99/1(w/w) STMP/STPP혼합물을 함유하는 25℃의 물(70㎖) 속에서 밀 전분(50g, 건조 중량)을 교반시켰다. 이 슬러리에 1.0M 수산화나트륨을 가함으로써 pH를 11.5로 조절한 후에 1시간 동안 교반시키고, !00℃에서 수분함량이 15%보다 낮게 되도록 건조시켰다. 이 건조된 혼합물을 강제 대류 오븐 속에서 130℃로 2시간 동안 가열시켰다. 이 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음, 증류수(100㎖)에 분산시키고, 이 분산액에 1M 염산을 가함으로써 pH를 6.5로 조절하였다. 이 변성된 전분을 원심분리에 의해 회수한 후에, 물(100㎖ ×4)로 세척고 건조시켰다.
9. 포스포릴 클로라이드(POCl3)를 사용하여 인산화하는 방법. POCl3를 사용하여 전분을 가교결합하는 것은 기본적으로 Felton 및 Schopmeyer 방법(1943)에 의해 수행되었다. 25℃에서 1시간 동안 물(70㎖)속에서 밀 전분(50g, 건조 중량)을 슬러리화시킨 다음, 슬러리의 pH가 11.0이 될 때까지 1M 수산화나트륨(약 25㎖)을 가하였다. 이 전분 슬러리에 마이크로리터 주사기로 포스포릴 클로라이드 0.1%(w/w)를 가한 다음, 1시간 후에 1M 염산으로 슬러리의 pH 를 5.5로 조절하였다. 원심분리(15,000g, 10분)에 의해 전분을 회수한 후에, 물(4 ×100㎖)로 세척하고 40℃에서 건조시켰다. 고함량(15%,bos)의 황산나트륨 존재하에 높은 pH(12)에서, 상술한 바와 같은 방법으로 0.1% POCl3를 사용하여 또 다른 가교결합 반응을 수행하였다. 두번째 일련의 또 다른 가교결합 반응에서는, 15%(bos)의 황산나트륨 존재하에 포스포릴 클로라이드 1.0% 및 2.0%(bos)를 사용하여 슬러리 반응으로 수행되었다. 1M 수산화나트륨을 방울방울 가하면서 슬러리의 pH를 11±0.3으로 유지시키면서, 시제를 점차적으로(0.1㎖) 가하였다. 앞서 기술한 바와 같은 방법으로 전분을 분리하여, 인산화 정도 및 내성 전분의 양을 측정하였다.
표 1은 서로다른 가교결합제를 사용했을 때 변성된 전분에서 관찰되는 RS의 양을 비교한 것이다. 포스포릴 클로라이드와 에피클로로히드린을 각각 0.1% 및 0.3% 사용했을 때, 내성 전분은 거의 제로인 반면, 2%를 사용했을 때에는 75 ~ 85%의 내성 전분을 수득하였다. SMPP/STPP 시제도 또한, 3시간의 반응시간동안 0.38% 잔류 인을 얻기에 충분한 양으로 사용되었을 때, 높은 함량의 내성 전분을 수득하였다. STMP/STPP 시제는 몸에 해가 없고 취급하기가 용이한 고체인 반면, 다른 시제는 염증을 유발하고 유독하거나 돌연변이를 유발하는 액체라는 점에서 SMPP/STPP를 사용하는 것이 바람직하다. 표 2는 혼합비를 달리한 STMP/STPP 혼합물 또는 SMPP를 사용한 가교결합에 대한 데이터를 나타낸 것이다. 표 3은 STMP/STPP를 사용한 전분 슬러리에 있어서 반응조건을 달리했을 때의 결과를 나타낸 것이고, 표 4는 수분을 중간수준으로 해서 반응을 수행했을 때의 결과를 나타낸 것이다.
표 5는 본 발명의 변성된 전분 제품과, 시판중인 두 가지 제품(크리스타린 및 노벨로즈)의 조리 전과 조리 후의 RS 양을 비교해서 나타낸 것이다. 표 6은 본 발명에 따르는 내성 전분 대 시판중인 전분에 미치는 α-아밀라제 양의 효과를 나타낸 것이다. 표 7는 시판중인 전분과 본 발명의 전분의 AOAC RS 양, 뿐만 아니라 용해도 및 SEM 현미경사진에서의 외관을 비교하여 나타내었다.
여러가지 시제에 의해 제조된 가교결합된 밀전분 중 내성전분a양의 비교
가교결합 반응조건 생성물
시제 가교결합제(%,bos) pH 온도(℃) 시간(h) 황산나트륨(bos,%) 잔류인(%) RS양(%)
STMP/STPPb 12(11.90/0.1) 11.5 45 3 10 0.38 75.6±1.5
POClC 3 0.1 11.0 25 1 2 0.03 0.4±0.3
POCl3 0.1 12.0 25 1 15 0.03 0.7±0.2
POCl3 1.0 11.5 25 1 15 0.17 52.7±6.6
POCl3 2.0 11.5 25 1 15 0.28 85.6±4.5
에피클로로히드린 0.3 11.5 25 1 15 NDd 1.8±1.0
에피클로로히드린 1.0 11.5 25 1 15 NDd 57.4±3.9
에피클로로히드린 2.0 11.5 25 1 15 NDd 75.8±0.3
주 a: 내성전분(RS)의 양은 100℃에서 30분 동안 열안정 α-아밀로즈를 사용하여 AOAC법에 의해 측정됨b: STMP=트리메타인산나트륨, STPP=트리폴리인산나트륨c: POCl3=포스로릴 클로라이드d: ND=측정안됨
STMP/STPPa의 혼합비를 달리해서 제조된 디스타치포스페이트 RS4의 내성 전분(AOAC) 및 인의 함량
STMP/STPP 잔류 인(9%) AOAC법에 의한 RS(%)
1/99 0.04 1.0±0.1
25/77 0.15 21.6±2.1
50/50 0.25 56.6±1.0
75/25 0.34 63.7±1.0
99/1 0.38 75.6±1.5
100/0 0.38 75.6±1.8
주 a: 모든 반응은 10%(bos)의 황산나트륨 존재하에 pH11.5, 45℃에서, 10중량부의 트리메타인산나트륨(STMP)/트리폴리인산나트륨(STPP) 혼합물과 함께, 밀 전분 수성 슬러리(40% 전분)를 사용하여 수행되었다.
여러가지 반응조건하에 전분 슬러리에서 디스타치포스페이트의 제조
반응번호 반응조건a 생성물
pH 온도(℃) Na2SO4 총STMP+STPP 시간(h) 잔류 인(%) AOAC법에 의한 RS(%)
1 11.5 45 10 12 3 0.38 75.6±1.5
1a 11.5 45 10(NaCl) 12 3 0.70 99.6±1.0
2 11.5 25-70b 10 14 1 0.38 85.9±1.4
3 11.5-12.3c 70° 20 12 0.5 0.30 81.2±3.3
4 11.5 25° 10 14 5 0.38 83.3±0.3
5 12.0 25° 0 10 12 0.38 85.7±1.9
6 11.5 45 10 19 1 0.38 85.8±2.3
주 a: 모든 반응은 STMP/STPP 99/1(w/w)혼합물의 양을 달리하면서, 밀 전분 수성 슬러리(40% 전분)를 사용하여 수행되었다. 황산나트륨 및 총 STMP/STPP의 양(wt%)은 전분을 기준으로 한 것이다.b: 반응온도는 25℃에서 시작하여 1분당 1.1℃의 속도로 최종 온도 70℃까지 증가하였다. 총 반응시간은 1시간이었다.c: 반응은 pH 11.5에서 시작하여 5분간격으로 1M 수산화나트륨 10㎖를 3번 서서히 첨가시킴으로써 최종 pH 12.3까지 증가시켰다. 총 반응시간은 30분이었다.
STMP/STPP와 반고체 상태의 밀 전분의 반응에 의한 디스타치포스페이트 RS4의 제조
STMP/STPP 잔류 인(%) RS(5)
합계(%, bos) 비율(w/w) RS(PPA법, 조리후) RS(AOAC법)
14 1:99 0.20 12.2 0.6±0.3
16 1:99 0.20 12.4 0.8±0.1
2 99:1 0.22 14.0 40.3±2.8
4 99:1 0.43 15.6 87.8±4.5
약 0.4% 인을 함유하는 디스타치포스페이트의 RS 양. RS는 37℃에서 돼지췌장 α-아밀라제 및 100℃에서 박테리아 α-아밀라제 소화에 의해 시험관내에서 측정됨.
전분 제품 돼지췌장 α-아밀라제(RS-PPA)a 박테리아 α-아밀라제(RS-AOAC)
조리전 조리후
RS3내성전분의 시판 샘플
크리스타린 8.9±1.2 20.6±0.5 11.3±0.7
노벨로즈 51.3±0.3 43.8±0.9 32.6±0.6
밀 전분
프라임 6.64±1.2 0 0.3±0.1
디스타치포스페이트b 14.8±0.3 8.1±1.6 75.6±1.5
소과립형 밀
프라임 24.5±6.1 0 0.8±0.3
디스타치포스페이트c 31.5±6.7 0 19.8±5.2
옥수수
프라임 4.5±0.9 0 0.5±0.1
디스타치포스페이트c 38.2±0.5 10.1±1.6 57.8±1.9
감자
프라임 69.7±0.5 0 0
디스타치포스페이트c 78.8±0.4 9.1±0.7 72.8±0.8
멍빈(Mung Bean)
프라임 - 0 0.8±0.1
디스타치포스페이트c - 14.7 97.5±0.3
쌀
프라임 72.9±0.2 0 0.9±0.3
디스타치포스페이트d 81.9±0.2 11.1±0.3 84.6±4.2
타피오카
프라임 38.4±1.5 0 0.2±0.1
디스타치포스페이트d 58.7±4.5 0 31±1.0
귀리
프라임 15.1±1.6 0 0.6±0.1
디스타치포스페이트d 22.3±0.1 0 9.9±2.4
주 a: 내성 전분은 전분 1g당 105단위의 PPA를 사용하여 37℃에서 16시간동안 PPA 소화에 의해 측정되었다. 이 내성 전분은 RS(PPA)라고 명시된다.b: 내성 전분은 열에 안정한 α-아밀라제를 사용하여 100℃에서 30분동안 식이섬유의AOAC법에 의해 측정하였다. 이 내성 전분은 RS(AOAC)라고 명시된다.c: 표 2의 반응 1에 기재된 반응시간이 적당히 빠른 반응조건하에서 슬러리형태로 가교결합된 것이다.d: 표 3의 반응 5에 기재된 반응시간이 긴 반응조건하에서 슬러리형태로 가교결합된 것이다.
전분을 끓는 물 속에서 30분 가열시킨 다음 16시간 후 37℃에서 측정된 내성 전분의 양에 미치는 돼지췌장 ℃-아밀라제의 양의 영향
효소의 양(전분 1g당 U)
100,000 50,000 10,000 1,000
밀 전분
프라임 0 0 0 0
디스타치포스페이트a 9.0 7.3 7.0 37.7
옥수수 전분
프라임 0 0 0 0
디스타치포스페이트a 9.8 10.2 11.3 32.7
쌀
프라임 0 0 0 0
디스타치포스페이트a 5.8 8.2 15.6 25.0
노벨로즈 43.8 47.5 51.9 60.8
크리스타린 20.6 20.6 21.8 24.3
주 a:모든 디스타치포스페이트은 약 0.4%의 인을 함유하며, 반응시간이 적당히 빠른 인산화 반응이다.
내성 전분 샘플의 내성 전분 함량(RS, AOAC), 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 대한 용해도 및 인 함량
샘플 RS(-AOAC)(%) DMSO 용해도(%) 잔류 인(%) 과립의 외관
내성전분의 시판샘플
노벨로즈a 32.6±0.6 100±1 0.03 주름이 잡히고 융합되어 있음
크리스타린b 11.3±0.7 100±1 0.04 주름잡힌 매끄러운 타원면
새로운 내성전분
밀 전분
프라임 밀 0 100±1 0.06 매끄러운 원판형 ＆ 구형
알칼리추출 0 100±1 0 매끄러운 원판형 ＆ 구형
RS4-밀-39 38.8±25.1 0±1 0.12 매끄러운 원판형 ＆ 구형
RS4-밀-76 75.6±1.5 0±1 0.38 매끄러운 원판형 ＆ 구형
옥수수 전분
프라임 옥수수 0 100±1 0.02 매끄러운 구형 ＆ 다면체
알칼리추출 0 100±1 0 매끄러운 구형 ＆ 다면체
RS4-옥수수-58 57.8±1.9 1±1 0.39 매끄러운 구형 ＆ 다면체
감자 전분
프라임 감자 0 100±1 0.07 매끄러운 타원면
알칼리추출 0 100±1 0.06 매끄러운 타원면
RS4-감자-73 72.8±0.8 1±2 0.38 매끄러운 타원면
쌀 전분
프라임 쌀 0 100±1 0.07 매끄럽고 작은 다각형
알칼리추출 0 100±1 0 매끄럽고 작은 다각형
RS4-쌀-5 5.4±0.8 1±2 0.36 매끄럽고 작은 다각형
RS4-쌀-85 84.6±0.9 1±2 0.36 매끄럽고 작은 다각형
주 a:National Srarch and Food Company(Bridgewater, NJ)사 제품b:Opta Food Ingredient,Inc.(Bedford,MA)사 제품
실시예 2
A. 동물 먹이 테스트
모든 다이어트식은 같은 양의 식이섬유(10%, 최종 정량의 중량을 기준), 단백질(15%), 지방(10%) 및 콜레스테롤(0.5%)을 함유하였다. 다이어트식은 젖을 뗀 햄스터(NRC 1987)에게 필요한 영양소를 다 함유하고 있다.
금색 수컷 시리아 햄스터(Sasko Inc., Omaha, NE)를 조절된 환경(23℃, 50%RH)하에서 바닥이 매쉬로 된 우리 안에 각각 수용시켰다. 섬유질없는 다이어트식을 먹인지 1주일 후에, 동물의 무게를 달아서 네 그룹(그룹 당 동물 10마리; 평균 동물 무게:80±6)으로 무작위 선별하여 놓은 다음, 4가지 다이어트식 중 하나를 공급하였다(표 8). 모든 동물은 다른 식품 및 물을 섭취할 수 없도록 하여 놓았다. 공급한 것을 기록하고, 일주일 단위로 햄스터의 무게를 달았다.
테스트 다이어트식의 조성
다이어트식
셀룰로즈 노벨로즈 RS4-밀39 RS4-밀76
성분, %
옥수수 전분 56.42 41.08 41.09 55.65
셀룰로오스 10.46 0.0 0.0 0.0
내성전분 0.0 25.8 25.7 11.23
카제인 17.80 17.80 17.80 17.80
쇼트닝 7.86 7.86 7.86 7.86
기타a 7.46 7.46 7.46 7.46
최종 정량중의 양,%
단백질 15.0 15.0 15.0 15.0
지방 9.9 10.0 10.0 10.0
총 식이섬유 10.0 10.0 10.0 10.0
주 a 기타성분(%) : 콩기름(2), 무기물(3.5), 비타민(1), dl 메티오닌(0.3), 염화콜린(0.16) 및 콜레스테롤(0.5)
B. 콜레스테롤 분석
테스트 다이어트식을 먹인지 6주 후에, 동물을 밤새(14시간) 붙들어맨 다음, 에테르로 가볍게 마취시켰다. 혈액 샘플(약1㎖)은 심장 천자에 의해 회수하였다. 이 혈액을 마이크로원심분리관에 넣고 10℃에서 2분동안 10,000 ×g으로 원심분리시킨 다음, 혈청 샘플을 콜레스테롤 분석이 수행될 때 까지 4℃로 유지시켰다. 각각 시그마(SIGMA) 진단 키드 352 및 336을 사용하여 혈청의 총 콜레스테롤과 고밀도 리포단백질 콜레스테롤의 양을 효소 분석하였다. 시그마 진단 콜레스테롤 시제는 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는데 사용되는 것으로, Alliain 등의 방법(1974)에 수정을 가한 것이다. 이 방법에 따르면, 콜레스테롤 에스테르를 콜레스테롤 에스테라제(EC 3.1.1.13)에 의해 가수분해시킴으로써 콜레스테롤이 생성되게 한 다음, 이것을 콜레스테롤 옥시다제(EC 3.1.1.3.6)에 의해 산화시킴으로써 콜레스테롤-4-엔-3-온과 과산화수소가 생성되게 한다. 그 다음 여기서 생성된 과산화수소를 페록시다제(EC 1.11.1.7) 존재하에 색원체인 4-아미노안티피린(암피론) 및 p-히드록시벤젠술포네이트와 결합시킴으로써, 500nm에서 최대흡광도를 가지는 퀴노니민 염료를 수득한다. 수득된 색의 강도는 샘플중 총 콜레스테롤 농도에 직접 비례한다.
콜레스테롤 시제인, 콜레스테롤 옥시다제, 콜레스테롤 에스테라제, 페록시다제, 4-아미노안티피린, p-히드록시벤젠술포네이트, 완충액 및 안정화제의 혼합물은 탈이온수에 용해시킴으로써 제조하였다. 콜레스테롤의 공지된 농도(5-20㎍/L)에 대한 표준 곡선은 직선형 회귀계수(r2=0.999)를 가지는 형태로 얻어졌다.
콜레스테롤 시제(1.0㎖)를 37℃로 가온한 다음, 분량(0.1㎖)을 각 관에옮겼다. 그 다음, 0.1㎖의 탈이온수(블랭크), 대조용 용액 또는 샘플을 가한 후에, 이 용액을 부드럽게 뒤집으면서 혼합시켰다. 이 쿠베트(분광비색계의 흡수관)를 37℃에서 5분동안 배양시킨 다음, 모든 관의 흡광도를 500nm에서 판독하였다(시그마 진단법(Sigma diagnostic), Procedure No. 352).
키트(Kit 352-3)를 사용하여 고밀도 리포단백질(HDL) 콜레스테롤을 측정하였다. 콜레스테롤 시제인 Sigma Diagnostic HDL는 초저밀도 리포단백질과 저밀도 리포단백질(VLDL 및 LDL)을 선별적으로 침전시킨 후에 상청액에 있는 HDL프랙션을 회수하여 이 HDL 프랙션의 콜레스테롤 농도를 측정하기 위해 조성되었다. 그 다음, 이 HDL 프랙션의 콜레스테롤 농도를 효소법(Sigma, Procedure No. 352)에 의해 분석하였다.
덱스트린 술페이트, 마그네슘이온, 완충액 및 안정화제를 함유하는 HDL 콜레스테롤 시제를 제조하고 일련의 관을 마련하였다. 각각의 관에 분량(0.5㎖)의 혈청 또는 물(블랭크)을 옮기고 50㎕ HDL 콜레스테롤 시제를 가하였다. 관의 내용물을 보텍스 혼합기를 사용하여 혼합시킨 다음, 실온에서 5분동안 방치시켰다. 보텍스 혼합기를 사용하여 또 다시 혼합시킨 다음, 이 관을 3000 x g 으로 5분동안 원심분리시켰다. 총 콜레스테롤 양에 대해 사용되는 방법과 같은 방법으로 상청액(HDL) 중 콜레스테롤의 양을 측정하였다. 본 테스트에서 얻어진 혈청 콜레스테롤 데이타를 표 9에 나타내었다.
셀룰로오스 또는 내성 전분을 함유하는 다이어트식을 섭취한 햄스터의 혈청 콜레스테롤 함량
콜레스테롤(mg/dL) 다이어트식a
셀룰로즈 노벨로즈 RS4-밀-9 RS4-밀-6
합계 261±19a 262±37a 265±20a 256±27a
HDLb 139±11a 156±11b 166±12b 160±18b
VLDLC+LDLd 122 106 99 96
주 a: 횡렬안에서 같은 문자를 가지지 않은 값은 상당히 다르다(p＜0.05)b: HDL=고밀도 리포단백질c: VLDL=초저밀도 단백질d: LDL=저밀도 단백질
C. 맹장내의 단쇄 지방산 함량
각 동물로부터 완전한 맹장을 분리하여, 무게를 달고, 곧 바로 냉동시켰다. 이 냉동 샘플을 단쇄 지방산 분석을 행할 때 까지 -20℃에서 저장하였다. 맹장내의 단쇄 지방산은 Aliza 및 Zecharia(1993)에 의해 발표된 방법에 따라 추출하여, Choi 및 Joen의 방법(1993)에 따라 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 분석하였다. 맹장 샘플(100mg)를 10㎖ 비이커 속에서 증류수(0.3㎖)와 혼합시킨 다음, 이것을 0.3㎖의 물을 더 첨가시킨 마이크로원심분리관에 옮겨 넣었다. 이 혼합물을 3% 메타인산(0.1㎖)으로 산성화시킨 다음, 30초동안 내표준물질(0.1mM 카프릴산)을 함유하는 에탄올(0.1㎖)과 혼합시킨 후에, 에테르(0.8㎖)를 잘 흔들어 섞었다. 그 다음, 이 혼합물을 4℃에서 원심분리시키고(10,000 x g, 5분동안), 분량(2μL)의 상청액을 가스 크로마토그래피(Model 5880A, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)에 주입하였다. 15m x 0.53mm 크기의 모세관 칼럼인 Stabilwax-DA (Resteck Corp., Bellefonte, PA)에 분당 13㎖의 속도로 헬륨을 통과시킴으로써 SCFA를 분리하였다. 칼럼에 대한 온도 프로그램은 다음과 같았다. 즉, 초기에는 100℃에서 1분동안 유지시킨 다음, 15℃/min의 속도로 200℃ 까지 가열시킨 후에, 200℃에서 13분동안 유지시켰다. 주입부와 검출기 두 부분의 온도는 250℃였다. 모든 GC 분석은 2번씩 행해졌다. 상청액 샘플(2㎕)를 GC에 주입시킨 다음, 카프릴산에 대한 각 SCFA의 피크 영역을 이에 상응하는 공지된 표준물질과 비교하였다. 이 테스트에서 얻어진 SCFA 데이터를 표 10에 나타내었다.
다이어트식에 들어있는 셀룰로오스 및 내성 전분이 맹장내의 단쇄지방산(SCFA) 농도b(생체내)에 미치는 영향
다이어트식a
셀룰로즈 노벨로즈 RS4-밀 39 RS4-밀 76
아세트산 16.62±4.94a 8.77±5.87b 18.13±5.99a 17.04±3.81a
프로피온산 0.48±0.14a 2.88±1.46b 0.96±0.57c 1.22±0.41c
부틸산 0.12±0.19a 2.22±0.93b,c 1.46±0.88a,c 2.72±1.72b
총 SCFA 19.78±5.12a 25.94±9.02a,b 28.08±6.76b 30.25±6.97b
주 a: 주어진 지방산의 농도는 mmol/g(습윤 조직)으로 주어진다.b: SCFA=단쇄 지방산=포름산, 초산, 프로피온산, 이소낙산 및 낙산c: 횡렬안에서 같은 문자를 가지지 않은 값은 상당히 다르다(p＜0.05)
결과 및 검토
A. 슬러리 반응 조건
여러가지 변수에 따라 반응시간을 길게 하거나 짧게 하여 슬러리 반응(일반적으로 전분 고체함량;35-40%)으로, 디스타치포스페이트 RS4를 제조할 수 있다. pH 및 온도가 전분이 젤화되는 점 바로 전까지 증가되는 경우는, 1시간 이하의 짧은 반응시간이면 충분하다. 반응 시간이 짧은 반응에서는 일반적으로 젤화를 방지하고 인산화 반응을 촉진시키기 위해 황산나트륨이나 염화나트륨을 사용한다. 또한 고농도의 STMP/STPP도 반응을 촉진시켜 준다. 일반적으로, 5 ~ 20중량%의 황산나트륨과 5 ~ 15중량% STMP/STPP(bos)을 사용하는 빠른 반응에서는, 알칼리성 pH와 35-45℃의 온도가 효과적이다.
표 2 및 표 4에 나타낸 데이터에서 알수 있는 바와 같이, STMP가 STPP에 비해 보다 효과적인 인산화제이다. 이 실험에서 대부분의 인산화 반응은 STMP/STPP 비가 99/1(w/w)에서 수행되었다. 기재된 반응 혼합물 중에 함유되는 인산화제의 양은 생성물의 잔류 인 함량이 0.4-0.5%보다 낮도록 선택되었다. 함유량 상한선은 조절가능한 것이어서, 여기에 변화를 가하였다. 인산화 정도를 높이면, 고함량의 RS4를 함유하는 디스타치포스페이트도 제조될 수 있다. 또한 인산화 반응은 STMP/STPP의 99/1 혼합물의 사용으로 인한 변화없이, STMP만을 사용하여 수행될 수 있다.
STMP/STPP에 의한 신속한 가교결합은 초기의 pH 및 온도를 증가시키고, 황산나트륨과 STMP의 양을 증가시킴으로써 뿐만 아니라 인산화 반응이 진행되는 동안 온도나 pH를 변화시킴으로써 성취될 수 있다. 예를 들면, 온도를 변화시켜 줌으로써, 인산화에 요구되는 반응시간을 1시간 반이하로 낮출 수 있다. 그러나, 반응이 가속화되고 있을 때, 인산화 정도를 조절하는 것은 보다 어려워진다.
황산나트륨이나 염화나트륨의 방출로 인해 환경 문제가 발생하는 곳에서는 어디든지, 이러한 염을 첨가하지 않고 디스타치포스페이트 RS4를 제조할 수 있다. 이 경우, 젤화를 방지하기 위해 온도 및 pH는 감소시켜야 하며, 밀 전분 반응시간은 분 대신 시간으로 늘려야 한다. 출발 전분이 밀 전분보다 높은 겔화 온도를 가지는 경우(예를 들면, 옥수수 및 쌀 전분)에는, 황산 나트륨을 사용하지 않는 인산화 반응은 반응시간을 동일하게 하고 반응 온도를 약 10℃ 높여서 수행할 수 있다.
표 3은 모두 인 함량이 0.30 ~ 0.38%이고 RS(AOAC)함량이 76 ~ 86%인 디스타치포스페이트 RS4를 제조하기 위해, 밀 전분에 대해 사용한 6가지의 서로다른 슬러리 반응 조건을 보여준다. 변성된 전분의 잔류 인 함량은 반응기간에 걸쳐 쉽게 모니터링될 수 있다. 알칼리성 pH에서 제조된 디스타치포스페이트의 내성 전분 함량은 전분에 가해진 인의 양과 직접 관계가 있다. 디스타치포스페이트의 α-아밀라제에 대한 내성은 앞서 기술한 바와 같이 두 가지 방법에 의해 시험관내에서 모니터링될 수 있다.
B. 수분이 중간 수준인 반응 조건
수분이 중간 수준인 조건하에서의 반응에 의해 변성된 전분을 제조하는 방법은 슬러리 반응과 비교해서 간편한 것이 아니며, 보다 에너지가 많이 든다. 일반적으로, 전분을 알칼리성 pH에서 STMP/STPP 수용액에 침지시키거나 이 수용액으로 분무시킨다. 그 다음, 침지된 전분을 건조시키고, 강한 탈수 조건하에 가열시킴으로써 인산화를 진행시킨다. 그 다음, 이 반응 혼합물을 물에 슬러리화시키고, 원심분리시킴으로써 무기 인산염을 제거하고 난 후에, 이 변성 전분을 건조시켜서 시판용으로 분류한다.
C. RS 함량
AOAC 식이섬유법을 이용하여 디스타치포스페이트의 RS4의 양을 측정하는 경우, 프라임 밀 전분, 소과립형 밀, 옥수수, 감자, 쌀, 타피오카, 멍빈 및 귀리는 0.9%보다 낮은 양의 RS4(표 5)를 함유하였다. 반응시간이 짧은 반응에 의해 밀, 옥수수, 감자 및 멍빈 전분으로부터 제조된 약 0.4%의 잔류 인을 함유하는 디스타치 포스페이트 샘플은 58 ~ 98%의 RS4(AOAC)를 함유하였으며, 소과립형 밀 전분으로 부터 제조된 샘플은 20%의 RS4(AOAC)를 함유하였다. 또 반응시간이 긴 반응에 의해 쌀 전분으로부터 제조된 약 0.4%의 잔류인을 함유하는 디스타치포스페이트 샘플은 85%의 RS4(AOAC)를 함유하였으나, 밀, 옥수수 및 감자 전분에서 사용된 경우와 같은 반응시간이 짧은 반응에 의해 동일한 쌀 전분으로부터 제조된 디스타치포스페이트 (P=0.4%)는 5%의 RS4(AOAC) 만을 함유하였다. 황산나트륨을 사용하지 않고 반응시간이 긴 반응에 의해 타피오카 및 귀리 전분으로부터 제조된 디스타치포스페이트 (P=0.4%)는 각각 31% 및 10%의 RS4(AOAC)을 함유하였다(표 6). 역행 아밀로즈 또는 소위 RS3타입 내성 전분을 함유하는 시판중인 두가지 RS 제품에 대해서도 RS에 대한 측정을 수행하였다. 노벨로즈와 크리스타린에 대해 측정된 RS3(AOAC)의 양은 각각 33% 및 11%였다.
시험관 내에서 RS를 측정하기 위한 두번째 방법은 돼지췌장 α-아밀라제 (PPA)를 사용하여 37℃에서 수행되었다. Englyst 등의 "British J. Nutrition"[75:749-755(1996)]는, 회장누공설치술이 행해진 건강한 동물에게 공급된 다이어트식에서 소화되지 않은 전분의 양(시험관 내)이 37℃에서 돼지췌장 α-아밀라제(PPA)를 사용한 Englyst 등의 시험관 내 방법(1992)에 의해 측정된 양과 일치한다는 것을 보여주고 있다. Englyst 등의 방법(1992)은 그들의 초기 방법 (1982)을 최신의 것으로 새롭게 한 것이다. Englyst 등의 방법의 원리는 α-아밀라제의 양, 교반상태 및 소화시간이 조절된 조건하에 37℃에서 가수분해가능한 전분을 α-아밀라제에 의해 가수분해시키는 것이다. α-아밀라제 소화에 의해 생성된 저분자량의 생성물은 그 다음 글루코아밀라제 소화에 의해 D-글로코즈로 되며, 이는 글루코즈 옥시다제/페록시다제에 의해 정량화될 수 있다. Englyst의 1982년 방법에 수정을 가한 새로운 방법에서는 3가지 변화가 있다. 즉, (1) α-아밀라제의 양을 샘플 g당 Sigma 5,000U 에서 100,000 U/g으로 2배 증가시켰다. (2)유리 구슬과 테이블-톱 쉐이커 대신에 자석 교반 바를 사용하여 신속한 교반을 행하였다. (3) 글루코즈 옥시다제/페록시다제 대신에 글루코즈 키나제/글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제에 의해 글루코즈를 정량화하였다(도 2). 샘플은 전분만을 함유하기 때문에, 샘플의 초기 무게가 총 전분의 양이며, 내성 전분은 그 차로서 결정되었다.
37℃에서 PPA 법에 의해 내성 전분을 측정하는 경우, 기질물질의 상태(고유특성)가 고려되어져야 한다. 예를 들면, 전분이 물이 풍부한 제품(예를들어 그레이비나 수프와 같이 끓여서 사용하는 제품)중에 식품 성분으로서 존재하는 경우, 전분은 과량의 물 속에서 조리될 것이다. 따라서, 식품속에 전분의 존재를 그대로 실현하기 위해서, 전분 샘플을 시험관 내 분석에 앞서 끓는 물에서 미리 조리해야 한다. 만일 조리된 식품을 냉각하여 선선한 상태로 저장한 경우에는, 그 상태를 실현하기 위해서, 시험관 내 분석에 앞서 그 전분 샘플을 뜨거운 물 속에서 가열하여 형성된 페이스트를 37℃가 되도록 한다. 식품을 냉각시키지 않은 경우에는, 뜨거운 전분-물 혼합물이 37℃까지 식었을 때 바로 분석을 수행하여야 한다. 또 다른 경우, 전분은 크랙커나 쿠키와 같이 물은 적고 식탁용 소금 및/또는 설탕이 많이 들어간 식품에 존재할 수 있다. 두 경우 모두 전분이 젤라틴화되는 것을 방지할 수 있다. 후자의 경우에는 조리안된 전분을 내성 전분 분석 실험에 바로 사용할 수 있다.
표 5는 끓는 물 속에서 30분간 조리한 후 37℃로 냉각시켜 바로 분석을 행한 여러가지 전분 샘플의 RS4(PPA)의 양을 나타낸 것이다. 프라임 전분 중 그 어느 것도 전분 1g 당 103~ 105단위의 PPA를 사용하였을 때 내성 전분을 함유하지 않았다. 밀, 옥수수, 감자, 멍빈 및 쌀 전분으로부터 제조된 약 0.4%의 잔류인을 함유하는 디스타치포스페이트 샘플은 105단위/g를 사용하였을 때 8 ~ 15% RS4(PPA)를 함유하였으며, 103단위/g를 사용하였을 때 25 ~ 38% RS4(PPA)를 함유하였다(표 6). 효소를 103단위/g의 양으로 사용하여 측정된 25 ~ 38%의 내성 전분 함량은 15 ~ 20%의 서서히 소화되는 전분에 기인하는 것이며, 이는 샘플 중 약 10%의 RS4(PPA)를 수반한다. PPA에 의한 소화는 37℃에서 과량의 PPA를 사용하여 물리적으로 교반시키면서 수행된다. 또한 PPA 효소는 박테리아 효소의 경우는 불가능한 과립내의 영역을 통해서 절단시킨다. 끓이는 조건은 변성 전분의 과립 표면상에 있는 조밀한 세공을 충분하게 팽창시켜 준다. 주목할 점은 아밀로즈 함량이 높은 전분인 멍빈으로부터 제조된 조리된 샘플의 디스타치포스페이트에 높은 함량의 RS-AOAC 및 RS-PPA가 존재한다는 점이다. 따라서 아밀로즈 함량이 높은 전분은 일반 전분보다 가교결합시, 보다 많은 RS를 함유하는 것으로 생각된다.
RS 분석에 앞서, 전분 샘플을 뜨거운 물속에서 조리하지 않은 경우, 옥수수 및 밀의 프라임 전분은 5 ~ 7% RS3(PPA), 귀리의 경우는 15%, 소과립형 밀의 경우는 25%, 타피오카의 경우는 38%, 감자의 경우는 79% 및 감자의 경우는 82%를 함유하였다. 생감자 전분 과립은 α-아밀라제 소화에 대해 내성을 가지는 것으로 잘 알려져 있으며, 이러한 종류의 내성 전분은 Englyst의 명명법에 따르면 RS2라고 표기된다. 생쌀 전분 및 일부 생타피오카 전분도 또한 RS2타입의 내성을 보여준다(표 5). RS2타입의 내성은 과립 표면에 세공 크기의 개구부가 없기 때문인 것으로 설명된다.우리가 제조한 생물질 디스타치포스페이트 샘플은 PPA에 대한 내성이 7 ~ 33% 증가되었음을 보여준다. 이는 RS4-타입 내성을 보여준다(표 5).
RS3를 함유하는 두 가지 시판중인 샘플에 대해서도 RS(PPA)의 양을 측정하였다.이 샘플을 끓는 물속에서 조리하기 전과 후에 측정을 하였다. 조리하지 않은 샘플 중의 RS3(PPA)의 양은 각각 약 9% 에서 21%로 증가하였고, 조리한 후에는 51%에서약44% 로 감소하였다. 아마도 제조시에는 크리스타린에 들어있는 아밀로즈가 불완전하게 역행되어 있기 때문에, 이 크리스타린을 물 속에서 끓이면 RS3의 양이 증가되는 것으로 생각된다. 역행 아밀로즈는 100℃보다 높은 온도에서 융해되는 것으로 알려져 있으므로, 샘플을 물 속에서 끓이면 보다 많은 역행 아밀로즈가 생기게 된다.
D. 신규한 내성 전분의 특성
주사 전자현미경사진은 본 발명의 디스타치포스페이트 RS4전분이 모전분과 같은 매끄러운 표면을 가지고 있다(도 7과 8, 도 9와 10, 도 11과 12를 비교)는 것을 보여준다. 시판 중인 두 가지 내성 전분은 때때로 합쳐진 과립형태를 보여주며, 항상 그 표면이 주름잡힌 외관을 보여준다(도 5 및 6, 표 7). 또한 전분을 물속에서 끓인 다음 105U/g(도 13 ~ 17) 및103U/g(도 18 ~ 21)의PPA에 의해 소화시켜 분리한 α-아밀라제 내성 잔류물은 SEM현미경사진에서, 크리스타린 및 노벨로즈와 다른 외관을 보여준다. RS4타입 전분으로부터의 잔류물은 조직화되지 않은 형태를 보이는 크리스타린 및 노벨로즈의 것보다, 섬유질이 많은 형태를 보인다.
디스타치포스페이트 RS4샘플은 인함량이 높으며, 디메틸 술폭사이드에 사실상 용해되지 않는 반면, 두 가지의 시판 RS3샘플은 인 함량이 0.04%보다 낮고, 디메틸 술폭사이드에 100% 용해되었다(표 7). X-선 회절 분석으로부터, 곡물 및 감자 전분으로부터 제조된 디스타치포스페이트 RS4는 각각 A- 및 B-다형 결정 형태를 가진다는 것을 알 수 있다. 또 옥수수 전분으로 된 시판 RS3샘플은 X-선 회절에 의한 형태가 B-다형 형태이거나 무정형 형태인 것을 알 수 있다. 도 3은 0.1% 미만의 인으로 치환된 디스타치포스페이트 RS4에 대한 전형적인 페이스팅 곡선을 도시한 것이다. RS4전분은 기본선을 초과하지 않는 페이스팅 곡선을 제공한다.
E. 디스타치 포스페이트 RS4에 대한 햄스터의 생리학적 반응
3가지의 내성전분 공급원(표 8)을 성장하고 있는 햄스터에게 공급하고, 그것의 선별된 생리학적 반응에 대한 효과를 셀룰로오스의 경우와 비교하였다(표 6 및 7). 4가지의 모든 다이어트식은 단백질 15.0%, 지방 9.9%, 식이섬유 10% 또는 RS(AOAC) 10% 및 콜레스테롤 0.5%를 함유하였다.
셀룰로오스 다이어트식을 섭취한 동물그룹은, 여러가지 내성 전분을 섭취한 동물그룹보다 많은 먹이를 소비하였으며 체중이 더 많이 나갔다(도 4). RS3-타입(노벨로즈)의 내성전분을 섭취한 동물은 최소량의 식품을 섭취하였기 때문에 최소량의 체중을 가졌다.
총 혈청 콜레스테롤치는 4그룹의 햄스터 모두 동일하였으며, 또한 셀룰로오스를 섭취한 동물이든 내성전분을 섭취한 동물이든 무관하였다(표 9). 셀룰로오스 및 밀겨와 같은 불용해성 식이 섬유 공급원은 총혈청 콜레스테롤에 거의 영향을 주지 않았다는 것을 잘 보여준다. 그러나 본 결과는 혈액혈청 중의 고밀도 리포단백질(HDL) 프랙션이 셀룰로오스를 섭취한 동물과 비교할 때 내성전분을 섭취한 동물의 경우, 고함량의 콜레스테롤(콜레스테롤 "good" )을 함유하였으며, 초저밀도 및 저밀도 리포단백질(VLDL+LDL)(콜레스테롤 "bad") 혼합프랙션은 콜레스테롤 함량이 위와 반대라는 것을 보여준다.
RS3및 RS4타입의 내성전분을 섭취한 동물그룹은 셀룰로오스 다이어트식을 섭취한 동물그룹에 비해 맹장내에서의 단쇄지방산 함량이 높았으며, 낙산의 양이 훨씬 높았다(표 10). 이 데이터로부터, RS는 분해되어 단쇄 지방산을 생성한다는 것을 알 수 있다. 낙산은 대장의 건강에 도움을 주고 대장암이 발생할 위험을 감소시켜주는 것으로 생각된다. 모든 SCFA는 대장의 pH를 낮추는데 기여함으로써 박테리아 수를 제거시킬 수 있다.

Claims (24)

  1. AOAC법 992.16(1995)을 이용한 α-아밀라제 소화에 대해 적어도 약 20%의 내성을 나타내는 인산화된 전분으로서, 상기 전분은 트리메타인산나트륨(STMP)과, 트리메타인산나트륨(STMP)과 트리폴리인산나트륨의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질에 의해 인산화 되는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 전분은 곡물, 근채류, 괴경류, 레줌 및 고함량 아밀로즈 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 전분은 밀, 옥수수, 귀리, 쌀, 타피오카(tapioca), 멍빈(mung bean) 및 감자전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 전분은 밀과 옥수수 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 전분은 적어도 약 0.1중량%의 잔류 인을 함유하는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 혼합물은 약 1 ~ 20중량%의 STMP와 약 0.01 ~ 2중량%의 STPP를 함유하는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 전분은 변성안된 출발 전분의 중량을 100%로 하여, 약 1-20중량%의 상기 혼합물로 가교결합되는 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 전분은 디스타치 포스페이트 디에스테르의 형태인 것을 특징으로 하는 인산화된 전분.
  9. 화학적으로 변성된 전분을 함유하는 식품으로서, 상기 화학적으로 변성된 전분은 AOAC법 992.16(1995)을 이용한 α-아밀라제 소화에 대해 적어도 약20%의 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 식품.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 전분을 약 35중량%까지 함유하는 것을 특징으로 하는 식품.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 식품은 효모발효 또는 화학발효시킨, 굽거나 프라이한 식품으로 구성되는 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식품.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 화학적으로 변성된 전분은 인산화된 것을 특징으로 하는 식품.
  13. AOAC법 992.16(1995)을 이용한 α-아밀라제 소화에 대해 적어도 약 20%의 내성을 나타내는 화학적으로 변성된 전분을 생성하기에 충분한 시간동안 약 25-70℃의 온도와 염기성 pH의 조건하에서 전분을 물의 존재하에 인산화제와 함께 반응시키는 단계를 포함하며, 상기 인산화제는 트리메타인산나트륨(STMP)과, 트리메타인산나트륨(STMP)과 트리폴리인산나트륨의 혼합물로 구성되는 군 중에서 선택되고, 물과 상기 전분으로 구성되는 슬러리를 먼저 형성한 다음, 이 슬러리에 염기를 부가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 전분의 화학적 변성방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 인산화제를 상기 슬러리에 부가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 슬러리는 전분함량이 약 15 ~ 60중량%인 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 전분함량이 약 30 ~ 50중량%인 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 혼합물은 변성안된 출발 전분의 중량을 100%로 하여, 약 1 ~ 20중량%의 STMP와 약 0.01 ~ 0.2중량%의 STPP를 함유하는 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  18. 제 13 항에 있어서,
    상기 전분은 변성안된 출발 전분의 중량을 100%로 하여, 약 1 ~ 20중량%의 상기 혼합물로 인산화된 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  19. 제 13 항에 있어서,
    상기 pH는 약 10 ~ 13인 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  20. 제 13 항에 있어서,
    상기 온도는 약 30 ~ 50℃인 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  21. 제 13 항에 있어서,
    상기 반응은 약 1/6 ~ 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  22. 제 13 항에 있어서,
    상기 반응에 황산나트륨 또는 염화나트륨을 부가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  23. 제 13 항에 있어서,
    상기 전분은 적어도 약 0.1중량%의 잔류 인을 함유하는 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
  24. 제 13 항에 있어서,
    상기 전분은 밀, 옥수수, 귀리, 쌀, 타피오카, 멍빈 및 감자 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 전분의 화학적 변성방법.
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