JP2002500179A - 皮膚科学におけるＰＰＡＲ−γアクチベーターの使用 - Google Patents

皮膚科学におけるＰＰＡＲ−γアクチベーターの使用

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Abstract

(57)【要約】 製薬学的組成物の調製のためのＰＰＡＲ−γ型のレセプターの少なくとも一つのアクチベーターの使用であり、表皮細胞の分化の異常に関する皮膚疾患を治療することを企図する組成物の提供。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、製薬学的組成物の調製のためのＰＰＡＲ−γ型のレセプターの少な
くとも一つのアクチベーターの使用に関し、該組成物は、表皮細胞の分化の異常
に関する皮膚疾患を治療することを企図する。
【０００２】
【従来の技術】
表皮細胞の分化の異常に関する多くの皮膚疾患が存在する；例として、乾癬、
湿疹、皮膚炎、一般的な挫瘡、魚鱗癬を含む角質症、及び皮膚ガンが挙げられる
。表皮細胞の分化の異常は一般的に、表皮細胞の過剰増殖に伴って生じる。これ
らの疾患を治療するために、各種の製薬学的アプローチが考慮されている。しか
しながら、現時点で完全に満足する治療は存在しない。かくして存在する治療を
改良する必要性が存する。
【０００３】 ペルオキシソームは、ミトコンドリアに緊密に関連し、過酸化水素の代謝に特
徴的である一連の酵素（カタラーゼ、ウレートオキシダーゼ、D-アミノ酸オキシ
ダーゼ）、及び脂肪酸β−酸化酵素を含む小器官である。ペルオキシソーム増殖
因子は、主にクロフィブレートのような低脂血症因子、除草剤、及びフタル酸エ
ステルのような工業プラスチックを含む化学的産物の群である。これらのペルオ
キシソーム増殖因子は、ＰＰＡＲと称され、ステロイド核レセプタースーパーフ
ァミリーの一部であるレセプターを活性化する、非遺伝子毒性発ガン因子である
。これらのレセプターは、ペルオキシソーム増殖因子によって活性化でき、また
天然の脂肪酸によっても活性化でき、それ故ペルオキシソーム及びミトコンドリ
アのβ−酸化に関与する酵素をコードする、または代わりにＰ４５０−４Ａ６脂
肪酸β−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の発現を刺激する。
【０００４】 一連の参考文献は、脂質の代謝の調節及びホメオスタシスにおけるＰＰＡＲの
役割を示唆する。
【０００５】 ＰＰＡＲレセプターは、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲと称される）とのヘ
テロダイマーの形態において、ペルオキシソーム増殖因子応答エレメント（ＰＰ
ＲＥ）と称されるＤＮＡ配列エレメントに対する結合によって転写を活性化する
。
【０００６】 ヒトＰＰＡＲの３種のサブタイプが同定され記載されている：ＰＰＡＲα、Ｐ
ＰＡＲγ及びＰＰＡＲδ（またはＮＵＣ１）。
【０００７】 特許出願WO 96/33724において、プロスタグランジンＪ２またはＤ２のような ＰＰＡＲγに対して選択的な化合物が、肥満症および糖尿病を治療するための潜
在的な活性剤であることが記載されている。
【０００８】 さらに、特許出願WO 95/35108において、チアゾリジンジオン、とりわけシグ リタゾン(ciglitazone)が、ケラチノサイトの増殖を阻害することによって乾癬 の治療において活性を有することが記載されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本出願人は、ヒトケラチノサイトの分化が、高カルシウム濃度で誘導された場
合、ＰＰＡＲ、とりわけＰＰＡＲγの発現のレベルが増大することを発見した。
また本出願人は、乾癬病変皮膚において、ＰＰＡＲ、とりわけＰＰＡＲγの発現
のレベルが、非病変皮膚のそれに対して顕著に減少することを観察した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
かくして、本発明の主題は、製薬学的組成物の調製のためのＰＰＡＲ−γ型の
レセプターの少なくとも一つのアクチベーターの使用であり、該組成物は、表皮
細胞の分化の異常に関する皮膚疾患を治療することを企図する。
【００１１】
【発明の実施の形態】 製薬学的組成物は、好ましくは皮膚科学的組成物である。
【００１２】 本発明に従って、「ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーター」は、Klie
wer等, Nature 358, 771-774, 1992に記載されたトランス活性化試験において、
１μＭ以下のＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０を有するいずれかの化合物を意味す
るように企図される。
【００１３】 好ましくは、ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターは、２００ｎＭ以
下、有利には５０ｎＭ以下のＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０を有する。
【００１４】 好ましくは、ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターは特異的である、
即ち、１０-1以下である、ＰＰＡＲαに関するＡＣ５０に対するＰＰＡＲ−γに
関するＡＣ５０の比Ｒ１を有する。好ましくは、Ｒ１は０．０５以下であり、よ
り有利には０．０２以下である。
【００１５】 ＡＣ５０は、ＰＰＡＲレセプターの一つ、とりわけＰＰＡＲ−αまたはＰＰＡ
Ｒ−γ型を介した「アクチベーター」化合物による活性化のレポーターである酵
素活性（ルシフェラーゼ）の５０％を与えるのに必要な「アクチベーター」化合
物の濃度である。
【００１６】 本発明においてとり分け使用される化合物は、以下のものである： 5-{4-[2-(メチルピリド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジ
オン； 3-{4-[2-(ベンゾオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エト
キシプロピオン酸； (+)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-
エトキシプロピオン酸； (-)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-
エトキシプロピオン酸； 15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンＪ２（１５−ｄ ＰＧＪ２）。
【００１７】 5-{4-[2-メチルリピド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4- ジオン、及び１５−ｄ ＰＧＪ２のような本発明において使用される化合物のい くつかは、ケラチノサイトの増殖に対する弱い阻害活性を有する、または全くそ
の阻害活性を有さないので、本発明において使用される化合物が、この型の皮膚
疾患を治療することは、全くより驚くべきことである。
【００１８】 好ましくは、使用されるＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターは、１
００ｎＭ以下の濃度で使用される場合、２０％以下のケラチノサイト増殖の阻害
のパーセントを有する（以下の実施例参照）。
【００１９】 本発明に従った製薬学的組成物は、生理学的に許容可能な媒体を含む。
【００２０】 本発明の他の特徴、態様、主題及び利点は、以下に続く記載、並びにそれを説
明することを企図した非制限的である各種の具体的な実施例を読むことで、より
明らかとなるであろう。
【００２１】 表皮細胞、とりわけケラチノサイトの分化の異常に関連した疾患としては、と
りわけ乾癬、湿疹、扁平苔癬、狼瘡と関連する皮膚病変、アトピー性、脂漏性ま
たは日光皮膚炎のような皮膚炎、脂漏性角化症、老年性、化学線性、光誘発性ま
たは小胞性角化症のような角化症、一般的な挫瘡、ケロイド、母斑、いぼ、魚鱗
癬及び皮膚ガンが挙げられる。
【００２２】 表皮細胞の分化の異常に関連した疾患としては、アトピー性皮膚炎、湿疹及び
乾癬のような障壁機能の異常が好ましくは挙げられる。
【００２３】 本発明に従った組成物の投与は、腸内の、全身的なまたは局所的な経路を経て
実施できる。好ましくは、製薬学的組成物は、局所的な経路を経た適用に適した
形態で実装される。
【００２４】 腸内経路を経て、該組成物、とりわけ製薬学的組成物は、錠剤、ゼラチンカプ
セル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、パウダー、顆粒、エマルション、ミク
ロスフェア若しくはナノスフェア、または制御された放出が可能である脂質性若
しくはポリマー状ベシクルの形態で存在し得る。全身経路を経て、該組成物は、
点滴または注射のための溶液または懸濁液の形態で存在し得る。
【００２５】 本発明に従って使用される化合物は一般的に、約０．００１ｍｇ／体重のｋｇ
から１００ｍｇ／体重のｋｇの一日の投与量で、１から３回の投与の取り込みで
投与される。
【００２６】 局所的経路を経て、本発明に従った製薬学的組成物は、とりわけ皮膚及び粘膜
の治療のために企図され、ペースト状軟膏、クリーム、乳液、クリーム状軟膏、
パウダー、しみ込ませたパッド、溶液、ゲル、スプレー、ローションまたは懸濁
液の形態で存在し得る。それはまた、制御された放出を可能にするミクロスフェ
ア、若しくはノナスフェア、または脂質性若しくはポリマー状ベシクルまたはポ
リマー状パッチ及びヒドロゲルの形態で存在し得る。この局所的経路組成物は、
無水形態または水性形態の何れでも存在し得る。
【００２７】 該組成物は、該組成物の全重量に対して、一般的に０．００１から１０重量％
の間、好ましくは０．０１から１重量％の間の濃度で局所的経路を経て使用され
る。
【００２８】 上述の組成物は、もちろん不活性な若しくは薬力学的に活性な添加剤、または
これらの添加剤の組み合わせをも含むことができ、上記添加剤は特に、湿潤剤；
ヒドロキノン、アゼライン酸、コーヒー酸またはコウジ酸のような脱色素剤；皮
膚軟化剤；グリセリン、ＰＥＧ−４００、チアモルホリノン及びそれらの誘導体
、または代わりに尿素のような水和剤；S-カルボキシメチルシステイン及びS-ベ
ンジルシスタミン及びそれらの塩若しくは誘導体、または過酸化ベンゾイルのよ
うな抗脂漏剤または抗挫瘡剤；ケトコナゾールまたはポリ-4,5-メチレン-3-イソ
チアゾリドンのような抗真菌剤；抗細菌剤、カロテノイド及び特にβ−カロチン
；アントラリン及びその誘導体のような抗乾癬剤；エイコサ-5,8,11,14-テトラ イン酸及びエイコサ-5,8,11-トリイン酸、それらのエステル及びアミド、並びに
最後にレチノイドである。
【００２９】 これらの組成物はまた、芳香剤、パラ-ヒドロキシ安息香酸エステルのような 防腐剤、安定剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、乳化剤、ＵＶ−Ａ及びＵ
Ｖ−Ｂスクリーン剤、並びにα-トコフェロール、ブチルヒドロキシアニゾール またはブチルヒドロキシトルエンのような抗酸化剤を含むことができる。
【００３０】 もちろん、当業者は、本発明に固有に備わった有利な特性が、考慮される添加
剤によって改変されない、または実質的に改変されないように、これらの組成物
に加えられる最適な化合物を選択するのに注意を払うであろう。
【００３１】 本発明を説明することを企図し、制限するものではないいくつかの実施例が与
えられるであろう。
【００３２】
【実施例】
実施例１ 上述のＰＰＡＲγ活性化産物のＡＣ５０及びＲ１ ＡＣ５０を測定するために使用した方法は、Kliewer等, Nature 358, 771-774
, 1992に記載されたものである。かくして、ＨｅＬａ細胞を、これらのレセプタ
ーをコードする発現ベクター、及びＳＶ４０ウイルスプロモーターとルシフェラ
ーゼ遺伝子の断片の上流にクローン化されたＰＰＲＥ応答エレメントを含むレポ
ータープラスミドを使用して共存トランスフェクションするトランス活性化試験
によって、ＰＰＡＲγまたはＰＰＡＲαを経た分子の活性化力を評価できる。共
存トランスフェクションされた細胞を、試験分子で２４時間処理し、ルシフェラ
ーゼ活性をルミネッセンスによって測定する。
【００３３】 表１は、その結果を集積する。各分子について、結果はＡＣ５０値によってｎ
Ｍで表され、それは最大の活性の５０％を与える試験分子の濃度を表す。
【表１】 化合物Ａ：5-{4-[2-(メチルピリド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリ ジン-2,4-ジオン； 化合物Ｂ：3-{4-[2-(ベンゾオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニ
ル}-2-エトキシプロピオン酸； 化合物Ｃ：(+)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フ
ェニル}-2-エトキシプロピオン酸； 化合物Ｄ：(-)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フ
ェニル}-2-エトキシプロピオン酸； 化合物Ｅ：15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンＪ２（１５−ｄ ＰＧＪ２ ）。
【００３４】 実施例２ ケラチノサイト増殖の測定 使用されるケラチノサイトは、整形外科手術で生じた皮膚標本から得た。それ
らは第二節で使用される。
【００３５】 １０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１０
ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１０-9Ｍのコレラ毒素を含むＭＥＭ培地において、ミ
トシン(mitocyne)で処理された３Ｔ３フィブロブラストの存在下で、Rheinwald 及びGreenの方法に従って湿潤環境（５％ＣＯ2）中で３７℃で、ケラチノサイト
を培養する。ケラチノサイトを蒔く２４時間前に、１０ｃｍ2クラスターウェル 中にｃｍ2当たり１５，０００細胞の割合で３Ｔ３細胞を蒔く。次いでケラチノ サイトを、ｃｍ2当たり４０００細胞の割合で蒔く。
【００３６】 該細胞を、ＤＭＳＯで希釈した産物で、蒔いたケラチノサイト当たり４時間処
理する。培養培地中のＤＭＳＯの最終濃度は、０．２％（ｖ／ｖ）を越えない。
培養の３日後、１／１００に希釈した5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（ＢｒｄＵ
、Boehringer ref 1 674629から得た細胞増殖キット）の溶液を、培養培地に加 える。
【００３７】 ＤＮＡの変性後、抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）抗体を、製造者の
説明書に従って加える。インキュベーションの１時間後、基質溶液を加え、光学
密度の読み取りをＥＬＩＳＡリーダーにおいて３７０ｎＭで実施する。
【００３８】 かくして、実施例１で記載された化合物Ａ及びＥは、１００ｎＭ以下の濃度で
使用された場合、２０％以下のケラチノサイト増殖の阻害の％を示す。
【００３９】 実施例３ 材料及び方法 細胞培養条件 正常なヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）を、整形外科手術の後に得られたヒト皮
膚から単離し、Rheinwald及びGreenの方法によって培養した(Rheinwald J.G.及 びGreen, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocyt
es : the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 197
5, 6, 331-343)。該細胞を、０．５ｍＭのＣａＣｌ2を含む完全培地（ＭＣＤＢ １５３）で培養した。ＭＣＤＢ１５３完全培地は、０．４％（ｖ／ｖ）ウシ脳下
垂体抽出物、５μｇ／ｍｌのインスリン、及び１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（
ＥＧＦ）を加えた基底培地（ＫＢＭ、Clonetics, San Diego, CA)より成る。細 胞が約６０％の集合体に到達したときに（０日目）、培地を０．１５ｍＭ Ｃａ Ｃｌ2（低カルシウム培地）または１．１５ｍＭ ＣａＣｌ2（高カルシウム培地 ）のそれぞれを含むＭＣＤＢ１５３完全培地に交換する。該培地は二日おきに交
換する。
【００４０】 １型コラーゲンの皮膚等量物上で再構成した表皮 整形外科手術の後に得られたヒト乳の皮膚から単離された成人内部小胞(inter
follicular)表皮細胞を増幅し(Rheinwald J.G. 及びGreen, H. Serial cultivat
ion of strains of human epidermal keratinocytes : the formation of kerat
inizing colonies from single cells. Cell, 1975, 6, 331-343)、 液体窒素中
で貯蔵した。細胞を解凍し、１型コラーゲンの皮膚等量物上に蒔いた(Asselinea
u, D., Bernard, B.D.及びDarmon, M. Three-dimensional culture of human ke
ratinocytes on a dermal equivalent. A model to study epidermal morphogen
esis and differentiation in vitro. In: Maibach, H., Lowe, N. (編） Model
s in Dermatology. Karger, Basle, 1987, 1987, 1-7)。培養物は、まず最初に 、一層の集合体を得るために一週間培養培地中で漬けられ（０日目）、次いで層
状化し角質化した表皮を生産するために、気体−液体界面に配置された。培養培
地は、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコル
チゾン（０．４μｇ／ｍｌ）及びコレラ毒素（１０-9Ｍ）を加えた最小必須培地
（ＭＥＭ）より成った。培地を一週間に三回交換した。
【００４１】 再構成された皮膚の形態を、ヘマラン−フロキシン−サフロン(hemalum-phlox
in-saffron)で垂直方向のパラフィン切片を染色することによって評価した。
【００４２】 生体組織片 生体組織片を、患者の同意の後に、関与した及び関与していない乾癬皮膚から
得た。生体組織片を、ＲＮＡ抽出溶液（４Ｍ グアニジンチオシアン酸）に迅速 に浸した。次いでそれを液体窒素で凍結し、使用まで−８０℃で維持した。
【００４３】 ＲＮＡの単離 培養物中のケラチノサイト、または再構成された皮膚から生じた全てのＲＮＡ
を、製造者の方法に従ってTrizol(Gibco BRL)法を使用して単離し、使用まで− ８０℃で保存した。皮膚生体組織片から生じた全てのＲＮＡを、Chomczynski及 びSaachiによって記載されたように調製した(Chromczynski, P.及びSaachi, N.
Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol
-chloroform extraction. Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159)。
【００４４】 ＲＴ−ＰＣＲ及び半定量的ＰＣＲ ＰＣＲオリゴヌクレオチドをGibco BRL(France)によって合成し、それらは以 下に記載の配列を有する： ＧＡＰＤＨセンスオリゴヌクレオチド(5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3')及びアンチ
センスオリゴヌクレオチド(5'-GTCATCATATTTGGCAGGTT-3')；ＰＰＡＲαに対する
センスオリゴヌクレオチド(5'-TCATCAAGAAGACGGAGTCG-3')及びアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド(5'-CGGTTACCTACAGCTCAGAC-3')；ＰＰＡＲγに対するセンスオリ
ゴヌクレオチド(5'-ATGACAGCGAACTTGGCAATA-3')及びアンチセンスオリゴヌクレ オチド(5'-CGAACTGGAAGAAGGGAAAT-3')；ケラチン１に対するセンスオリゴヌクレ
オチド(5'-AGTTCCAGCGTGAGGTTTGT-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'-
GGGACTGAGATTGCCACTGA-3')；ロリクリン(loricrin)に対するセンスオリゴヌクレ
オチド(5'-ACCACGGAGGCCGAAGGAGTT-3')及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(5'
-CTGGGGTTGGGAGGAGGTAGTTG-3')；トランスグルタミナーゼタイプＩ（ＴＧＩ）に
対するセンスオリゴヌクレオチド(5'-GCGGCAGGAGTATGTTCTTA-3')及びアンチセン
スオリゴヌクレオチド(5'-AGGGATGTGTCTGTGTCGTG-3')。増幅された生成物は、Ｇ
ＡＰＤＨについて５５８ｂｐ、ＰＰＡＲα、δ及びγについてそれぞれ２１１，
２８７及び３４１ｂｐ；ケラチン１について２５０ｂｐ；ロリクリンについて１
８９ｂｐ；及びＴＧＩについて４４４ｂｐに等しい。
【００４５】 培養細胞、再構成された皮膚、または皮膚生体組織片から抽出された５μｇの
ＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。７０℃で１０分間のピロカルボン
酸ジエチル処理された水における変性の後、４２℃で５０分、２０μｌの全緩衝
液容量に対して(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４，５０ｍＭ ＫＣｌ、 １．５ｍ＝ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び２０ユニッ
トのＲＮアーゼインヒビター）、「SuperScript II ＲＮアーゼＨ−逆転写キッ ト」（１０ユニット／反応, Gibco BRL)及びプライマーとして０．５μｇのオリ
ゴ（ｄＴ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。該混合物を７０℃で１
５分不活性化し、３７℃で２０分ＲＮアーゼＨで処理した。各場合において、逆
転写酵素を含まないサンプル（陰性対照）を含んだ。９４℃で１分間の変性後、
以下の条件の下で、ＰＣＲ増幅をＰＴＣ２２５機(MJ Research)を使用して実施 した；９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３
０秒の伸長、全部で３０サイクル。
【００４６】 反応混合物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１μＭ オリゴヌクレオチドプライマー、１００μ Ｍ ｄＮＴＰ、０．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰ及び１／１００に
希釈された５μｌのｃＤＮＡ混合物を含む。最終生成物を、７２℃で３分加熱し
た。各場合において、ＲＴに対する陽性対照（ＰＰＡＲをコードするｃＤＮＡを
含む）及びＰＣＲ陰性対照（ＤＮＡを含まない）を含んだ。ＰＣＲ生成物を、１
μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む２％アガロースゲル上での電気泳動によって
分離し、写真を撮り、それらの同一性をサザンブロットによって確認した。
【００４７】 ｄＮＴＰの濃度が、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、１０μＭの
ｄＣＴＰ、０．５μＣｉの[３２Ｐ]ｄＣＴＰである点を除いて、上記記載のよう
に半定量的ＰＣＲを実施した。次いでＰＣＲ生成物を、６％（重量／ｖ）のアク
リルアミドゲルを使用して分離した。各バンドの放射性活性を、ホスホルイメー
ジング法によって定量した。スクリーンを、FUJI BAS 2000を使用してスキャン し、シグナルを、イメージ分析プログラム(Tina)を使用してＰＳＴ（光刺激ルミ
ネッセンス）単位において定量した。その結果を、ＧＡＰＤＨのそれとバンドの
強度を比較して各サンプルについて分析した。ＰＣＲサイクルの最適な数は、直
線状増幅領域において決定された。ｃＤＮＡ混合物の１０倍の連続的な希釈物を
、放射性活性シグナルの強度と、ＤＮＡの初期量の間の直線的相関関係を制御す
るために作製した。
【００４８】 結果 培養物におけるＮＨＫから生じた全ＲＮＡのノーザンブロット分析を使用する
第一の実験は、ＰＰＡＲδが未分化および分化したケラチノサイトにおいてほぼ
等量で存在する一方で、ＰＰＡＲα及びγは検出されないことを示した。
【００４９】 ＰＰＡＲの発現を分析するために、ＰＰＡＲサブタイプに特異的であるオリゴ
ヌクレオチドを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＰＡＲα、δ及びγに相当
するそれぞれ２１１ｂｐ、２８７ｂｐ及び３４１ｂｐのＰＣＲ生産物が、電気泳
動の後得られた。ＰＣＲ生産物の特異性は、ＰＰＡＲをコードするｃＤＮＡを含
むプラスミドを使用して変化した。さらに、ＰＣＲ生産物を同定するためにサザ
ンブロット分析を実施した。３種のＰＰＡＲサブタイプは、低カルシウム培地に
おいて６０％の集合体で得られた未分化ＮＨＫにおいても、高カルシウム培地に
おいて４日間の培養の後得られた分化したＮＨＫにおいても検出された。
【００５０】 次に、低カルシウム培地または高カルシウム培地において培養されたＮＨＫに
おけるＰＰＡＲサブタイプの発現のレベルを比較するために、半定量的ＰＣＲ分
析を実施した。ＰＰＡＲα遺伝子の発現は、低カルシウム培地（１．７倍）及び
高カルシウム培地（２．６倍）において、０日目から４日目でゆっくりと増大す
る。４日後、ＰＰＡＲδ遺伝子の発現は、低カルシウム及び高カルシウム培地の
両者において増大した（それぞれ４．５及び５．８倍）。ＰＰＡＲγ遺伝子の発
現のレベルは、低カルシウム培地において４日間で変化しないままである一方で
、該細胞を高カルシウム培地で培養した後、３日目及び４日目の間で驚くべきこ
とに増大する（４．５倍）。
【００５１】 ケラチノサイト分化は、浸した培養条件の下で不完全であるために、我々は、
ＰＰＡＲの発現を研究するために、表皮のより完全な層状化及び角質化を示す再
構成した皮膚をin vitroで使用した。出現の２日後、わずかに２または３層のケ
ラチノサイトが存在する；２日後、ケラチノサイトは薄い複数の層の上皮を構成
し、一方で７日後、表皮は正常なヒトの表皮のように見える上皮より成る。免疫
学的蛍光による研究により、インボルクリン、フィラグリン及びＴＧＩ（トラン
スグルタミナーゼＩ）のような分化マーカーが、Asselineau, D., Bernard, B.D
., 及びDarmon, M. Three-dimensional culture of human keratinocytes on a
dermal equivalent. A model to study epidermal morphogenesis and differen
tiation in vitro. In: Maibach, H., Lowe, N. (編） Models in Dermatology.
Karger, Basle, 1987, 1-7に記載されているように発現し位置することが示さ れた。
【００５２】 上皮の再構成の間の３種のＰＰＡＲサブタイプの発現のレベルは、以下のよう
なものである： ＰＰＡＲα ＲＮＡは、出現の７日後でわずかに増大する（２倍）。ＰＰＡＲδ のレベルは、０日目から７日目で一定に維持される。これに対して、ＰＰＡＲγ
の発現は、０日目と７日目の間で７倍に増大する。
【００５３】 皮膚の再構成の間のＰＰＡＲサブタイプの発現の態様を、ケラチノサイト分化
マーカーのそれと比較した。ケラチン１，ロリクリン、及びＴＧＩの最大の発現
は、出現の７日後に観察された。
【００５４】 ヒト皮膚におけるＰＰＡＲサブタイプの発現を分析するために、全ＲＮＡを、
非病変または病変乾癬表皮から調製し、ＲＴ−ＰＣＲ半定量的分析にかけた。Ｐ
ＰＡＲαの発現は、病変皮膚においてわずかにのみ減少する一方で、ＰＰＡＲγ
の発現は、顕著に減少する（約３．５倍）。しかしながら、ＰＰＡＲδの発現は
、非病変表皮に対して病変表皮において増大する。
【００５５】 議論 ３種のＰＰＡＲサブタイプは、両生類、齧歯類及びヒトにおいて記載されてい
る。(Issemann, I. 及びGreen, S. Activation of a member of the steroid ho
rmone receptor superfamily by peroxisome proliferators. 1990, Nature, 34
7, 647-650 - Sher, T., Yi, H.-F., McBride, O.W.及びGonsalez, F.J. cDNA c
loning, chromosomal mapping, and functional characterization of the huma
n peroxisome proliferator activated receptor. Biochemistry, 1993, 32, 55
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ning of a new member of the peroxisome proliferator-activated receptor g
ene family from mouse liver. J. Biol. Chem., 1993, 268, 26817-26820 - Gr
eene, M.E., Blumberg, B. McBride, O.W., Yi, H.F., Kronquist, K., Kwan, K
., Hsieh, L., Greene, G. 及びNimer, S.D. Isolation of the human peroxiso
me proliferator activated receptor gamma cDNA : expression in hematopoie
tic cells and chromosomal mapping. Gene Expression, 1995, 4, 281-299 - E
lbrecht, A., Chen, Y., Cullinan, C.A., Hayes, N., Leibowitz, M.D., Molle
r, D.E., 及びBerger, J. Molecular clonin g, expression and characterization of human 1 and γ2. Biochem. Biophys.
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eroxisome-proliferator-activated receptor-γ is activated by inducers of
adipogenesis, including thiasolidinedione drugs, Eur. J. Biochem., 1996
, 239, 1-7 - Schmidt, A., Endo, N., Rutledge, S.J., Vogel, R., Shinar, D
.及びRodan, G.A. Identification of a new member of a steroid hormone rec
eptor superfamily that is activated by a peroxisome proliferator and fat
ty acids. Mol. Endocrinol., 1992, 6, 1634-1641 - Kliewer, S.A., Forman,
B.M., Blumberg, B., Ong, E.S., Borgmeyer, U., Mangelsdorf, D.J., Umesoto
, K.及びEvans, R.M. Differential expression and activation of a family o
f murine peroxisome proliferator-activated receptor. Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 1994, 91, 7355-7359 - Amri, E.-Z, Bonino F., Ailhaud, G., Abumr
ad, N.A.及びGrimaldi, P.A. Cloning of a protein that mediated transcript
ional effects of fatty acids in preadipocytes. J. Biol. Chem., 1995, 270
, 2367-2671 - Dreyer, C., Krey, G., Keller, H., Givel, F., Helftenbein,
G., 及びWahli, W. Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a
novel family of nuclear hormone receptors. Cell, 1992, 68, 879-887)。Ｐ
ＰＡＲαは、肝臓、心臓、腎臓、及び腸のような脂肪酸酸化及びペルオキシソー
ム代謝の高いレベルを示す組織で強力に発現される。ＰＰＡＲδは、豊富に且つ
遍在的な態様で発現される一方、ＰＰＡＲγの発現は、白色脂肪組織のような活
発な脂質生成を有する組織で著しいが、免疫系の細胞においても見出される(Iss
emann, I.及びGreen, S. Activation of a member of the steroid hormone rec
eptor superfamily by peroxisome proliferators. 1990, Nature, 347, 647-65
0 - Kliewer, S.A., Forman, B.M., Blumberg, B., Ong, E.S., Borgmeyer, U.,
Mangelsdorf, D.J., Umesoto, K.及びEvans, R.M. Differential expression a
nd activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated re
ceptor. Proc. Natl. Sci. USA. 1994, 91, 7355-7359 - Lehmann, J.M., Moore
, L.B., Smih-Oliver, T.A., Wilkinson, W.O., Wilson, T.M.及びKliewer, S.A
. An antidiabetic thiasolidinedione is a high affinity ligand for peroxi
some proliferator activated receptors γ (PPARγ) J. Biol. Chem., 1995,
270, 12953-13956 - Braissant, O., Foufelle, F., Scotto, C., Dauca, M.及 びWahli, W. Differential expression of proxisome proliferator-activated
receptor (PPARs) : tissue distribution of PPAR-α, -β and -γ in the ad
ult rat, Endocrinology, 1996, 137, 354-366 - Tontonoz, P., Hu, E., Grave
s, R.A., Budavari, A.I. 及びSpiegelman, B.M. mPPARγ2n tissue-specific r
egulator of an adipocyte enhancer. Genes Dev., 1994, 8, 1224-1234)。３種
のＰＰＡＲサブタイプの組織特異的配置は、それらの異なる生理学的機能を説明
するであろう。ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγは、脂質ホメオスタシスの二つの部門
、即ちそれぞれ脂肪酸代謝及び脂質生成を調節するようである。一方でＰＰＡＲ
δの遍在的な発現は、一般的であるが未だ未知の生物学的機能を示唆する。
【００５６】 表皮のケラチノサイトの分化の工程は、表皮の障壁機能の形成に関与する特異
的な脂質の蓄積を伴う。しかしながら、表皮におけるＰＰＡＲサブタイプの発現
のレベルまたは役割については、ほとんど未知である。最近の研究により、マウ
スの表皮の基底上の細胞におけるＰＡＲαのドミナントネガティブ突然変異体の
構成的な発現が、皮膚の減少した障壁機能を引き起こすことが示されている(Ima
kado, S., Bickenbach, J.R., Bundman, D.S., Rothnagel, J.A., Attar, P.S.,
Wany, X.-J., Walczak, V.R., Wisniewski, S., Pote,J., Gordon, J.S., Heym
an, R.A., Evans, R.M.,及びRoop, D.R., Targeting expression of a dominant
-negative retinoic acid receptor mutant in the epidermis of trangenic mi
ce results in loss of barrier fuction. Genes Dev., 1995, 9, 317-329)。突
然変異ＰＡＲαは、ＲＸＲを引き離すことが可能であり、それはＰＰＡＲ−ＲＸ
Ｒヘテロダイマーの形成に必要である(Keller, H., Dreyer, C., Medin, J., Ma
hfoudi, A., Ozato, K.及びWahli, W. Fatty acids and retinoids control lip
id metabolism through activation of peroxisome proliferator-activated re
ceptor - retinoid X receptor heterodimers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1
993; 90; 2160-2164 - Issemann, I., Prince, R.A. Tugwood, J.D.及びGreen,
S. The retinoid X receptor enhances the function of the peroxisome proli
ferator activated receptor. Biochimie, 1993, 75, 251-256)。これは、ＰＰ ＡＲαの不活性化が、トランスジェニックマウスにおける表皮の障壁機能の損失
に部分的に関与していることを示す。
【００５７】 かくして我々は、３種のＰＰＡＲサブタイプが、ヒトケラチノサイトにおいて
発現されることをここで示す。ＰＰＡＲδは最も高いレベルの発現を示す一方で
、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγは低レベルで発現される。ラットの内部小胞ケラチ
ノサイトで報告されているＰＰＡＲ遺伝子の発現の存在しないこと(Braissant,
O., Foufelle, F., Scott, C., Dauca, M. 及びWahli, W. Differential expres
sion of proxisome profirator-activated receptor (PPARs) : tissue distrib
ution of PPAR-α, -β and -γ in the adult rat, Endocrinology, 1996, 137
, 354-366)は、ハイブリダイゼーション法の不十分な感受性、及び／または研究
された種における差異のためであろう。
【００５８】 我々の研究は、ＰＰＡＲγの発現、及びある程度のＰＰＡＲαの発現が、ケラ
チノサイトの分化に関与することを示す。高カルシウム培地において４日間培養
されたＮＨＫにおけるＰＰＡＲγの発現は、著しく増大する。
【００５９】 この観察は、ＰＰＡＲγの発現が表皮の層状化及び角質化の間で増大する再構
成された皮膚のモデルを使用して確認された。ＰＰＡＲの発現を、正常な表皮の
基底上の区画において通常発現される各種のマーカー（ケラチン１，ＴＧＩ及び
ロリシン）における増大と比較した。これは、ＰＰＡＲ−γの発現が、ヒト表皮
の基底上の層で生じ、ＮＨＫの分化と関連することを強力に示唆する。
【００６０】 ＰＰＡＲサブタイプの発現をまた、病変及び非病変乾癬表皮において測定した
。ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγのレベルの減少が、過剰増殖病変表皮において観察
され、２種のサブタイプの発現が、表皮の分化状態に依存することをもう一度示
す。ＰＰＡＲδの発現は、病変表皮において増大し、このことは、このサブタイ
プの発現が、ケラチノサイト増殖と関連するであろうという示唆を導く。
【００６１】 結論として、しみ込ませたまたは空気にさらした培養物を使用して、ＰＰＡＲ
α及び−γ遺伝子の発現が、ケラチノサイト分化の間で増大する一方で、ＰＰＡ
Ｒδの発現は、改変されないことを、我々は示した。過剰増殖乾癬表皮において
、ＰＰＡＲ−γの発現は減少し、それはこのタイプが、ケラチノサイト分化に関
与することを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 17/04 17/04 17/06 17/06 17/08 17/08 17/12 17/12 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ // Ｃ０７Ｄ 263/56 Ｃ０７Ｄ 263/56 417/12 417/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 セルジュ・ミシェル フランス・Ｆ−06330・ロクフォール・ レ・パン・シデックス・25・ビス・ルー ト・ドゥ・ヴァルボンヌ・757 Ｆターム(参考） 4C056 CA09 CC01 CD01 4C063 AA01 BB07 CC62 DD12 EE01 4C084 AA17 NA14 ZA891 ZB132 ZB212 ZB261 ZC522 4C086 AA01 AA02 BC70 BC82 DA03 GA08 GA10 MA01 MA04 NA14 ZA89 ZB13 ZB21 ZB26 ZC52

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 製薬学的、とりわけ皮膚科学的組成物を調製するためのＰＰ
    ＡＲ−γ型のレセプターの少なくとも一つのアクチベーターの使用であり、該組
    成物が、表皮細胞の分化の異常に関連する皮膚疾患の治療を企図したものである
    使用。
  2. 【請求項２】 ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、２００ｎ
    Ｍ以下、有利には５０ｎＭ以下の、ＰＰＡＲ−γに関するＡＣ５０を有すること
    を特徴とする請求項１記載の使用。
  3. 【請求項３】 ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、特異的で
    あることを特徴とする請求項２記載の使用。
  4. 【請求項４】 ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、０．０５
    以下、有利には０．０２以下のＰＰＡＲαに関するＡＣ５０に対する、ＰＰＡＲ
    −γに関するＡＣ５０の比Ｒ１を有することを特徴とする請求項３記載の使用。
  5. 【請求項５】 ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、5-{4-[2-
    (メチルピリド-2-イルアミノ)エトキシ]ベンジル}チアゾリジン-2,4-ジオン；3-
    {4-[2-(ベンゾオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキ
    シプロピオン酸；(+)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2-イルメチルアミノ)エト キシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；(-)-3-{4-[2-(ベンズオキサゾール-2
    -イルメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-エトキシプロピオン酸；15-デオキシ
    -Δ12,14-プロスタグランジンＪ2（１５−ｄ ＰＧＪ２）から選択されることを 特徴とする請求項１から４のいずれか一項記載の使用。
  6. 【請求項６】 使用されるＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが
    、１００ｎＭ以下の濃度で使用された場合、２０％以下のケラチノサイト増殖の
    阻害のパーセントを有することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項記載
    の使用。
  7. 【請求項７】 表皮細胞の分化の異常に関連する疾患が、乾癬、湿疹、扁平
    苔癬、狼瘡と関連する皮膚病変、アトピー性、脂漏性または日光皮膚炎のような
    皮膚炎、脂漏性、老年性、化学線性、光誘発性または小胞性角化症のような角化
    症、一般的な挫瘡、ケロイド、母斑、いぼ、魚鱗癬及び皮膚ガンから選択される
    ことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項記載の使用。
  8. 【請求項８】 製薬学的組成物が、局所的経路を経た適用に適した形態で実
    装されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項記載の使用。
  9. 【請求項９】 ＰＰＡＲ−γ型のレセプターのアクチベーターが、該組成物
    の全重量に対して、一般的に０．００１から１０重量％の間、好ましくは０．０
    １から１重量％の間の濃度で使用されることを特徴とする請求項８記載の使用。
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