JP2002238595A - 無細胞蛋白質の完全翻訳後修飾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 細胞培養法ではなく無細胞完全翻訳後修飾蛋
白質生産法で、治療用、研究用及び産業用価値をもつ翻
訳後修飾の必要な蛋白質を生産する方法の提供。 【解決手段】 完全翻訳後修飾蛋白質を生産するための
方法において、（ａ）目的蛋白質の遺伝情報を持つＤＮ
Ａ、又はＲＮＡを細胞抽出物に添加する工程、（ｂ）核
酸を上記抽出物に添加する工程、及び（ｃ）完全翻訳後
修飾蛋白質の製造を刺激するのに十分な量の、小胞体
（ＥＲ）／ゴルジ体又は小胞体／ゴルジ体／細胞膜、或
いはこれらに加えて他の細胞小器官のような翻訳後修飾
マシーナリーを上記抽出物に添加する工程からなる結合
無細胞完全翻訳後修飾蛋白質合成法、を経由することを
特徴とする完全翻訳後修飾蛋白質の生産方法により提
供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、無細胞蛋白質生産
（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ）と無細胞完全翻訳後修飾（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ
ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉ
ｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を組み合わせた
完全翻訳後修飾蛋白質（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｐｏｓ
ｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）の生産方法に関する。また、本発明は、
治療用、研究用および産業用価値をもつ翻訳後修飾の必
要な蛋白質を、細胞培養法（ｃｅｌｌ ｃｕｌｕｒｅ
ｍｅｔｏｏｄ）ではなく、無細胞完全翻訳後修飾蛋白質
生産法（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｐ
ｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）で生産する方法
に関する。さらに詳しく説明すると、蛋白質生産のマシ
ーナリー（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を含む細胞抽出物と完
全翻訳後修飾のマシーナリーを含む細胞の膜成分抽出物
とからなる無細胞完全翻訳後修飾蛋白質生産法を利用し
て有用な蛋白質が生産される。

【０００２】医薬品などで使用される多くの蛋白質は、
活性のために、糖鎖付加（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏ
ｎ）、りん酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、
アミド化（ａｍｉｄａｓｉｏｎ）などの翻訳後修飾を受
ける。その上、動物細胞から分泌される多くの蛋白質
も、このような翻訳後修飾を受けた蛋白質である。多く
の蛋白質は、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔ
ｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ））、ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐ
ｐａｒａｔｕｓ）および細胞膜で構成された分泌経路
（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓ）を経る間に、
糖鎖付加をはじめとする翻訳後修飾されたものと成る。
蛋白質の翻訳後修飾には、蛋白質にりん酸が付くりん酸
化、蛋白質の鎖の末端にアミド基が導入されるアミド化
および蛋白質に炭水化物からなる糖鎖が付く糖鎖付加反
応などがある。この中で、一番多くの酵素が関与する複
雑な反応が、糖鎖付加反応である。そのため、糖蛋白
は、全ての生物の広範に分布する生物学的化合物の中
で、最も多様な化合物である。これらは、細胞外基質や
細胞間にある溶液内と同じように、可溶性であり膜結合
性でもある細胞内で起こり、これらの化合物にさまざま
な機能を与える。

【０００３】糖鎖付加蛋白質は、蛋白質を構成するアミ
ノ酸の一種のアスパラギン(Ａｓｎ)の側鎖に糖鎖が付く
（“アスパラギン−結合型”（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−
ｌｉｎｋｅｄ）、または“Ｎ−結合型”（Ｎ−ｌｉｎｋ
ｅｄ））糖鎖付加と、セリンやスレオニンの側鎖に糖鎖
が付く（“Ｏ−結合型”（Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ））糖鎖付
加に大別される。普通、糖蛋白質は、Ｎ−結合型糖鎖構
造だけを持っていたり、Ｏ−結合型糖鎖構造だけを持っ
ていたりまたは両方とも持っている。Ｎ−結合型糖鎖構
造は、高マンノース形（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ ｔ
ｙｐｅ）、混合形（ｈｙｂｉｒｄ−ｔｙｐｅ）および複
合形（ｃｏｍｐｌｅｘ−ｔｙｐｅ）に分けられる。糖蛋
白の糖質のユニットは、単糖または二糖や、２０種もの
単糖残基から構成される分枝したオリゴ糖に分類できる
が、サイズや構造において、かなりのバリエーションを
呈する。

【０００４】要約すると、Ｎ−結合型糖鎖形成は、脂質
が結合したオリゴ糖部分の合成と、その小胞体（ＥＲ）
内の発生期ポリペプチド鎖への一体転位（ｔｒａｎｓｆ
ｅｒｅｎ ｂｌｏｃ）とともに始まる。結合は、Ａｓ
ｎ、一般的にはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｅのトリペプ
チド認識シーケンスを通して起こる。ここで、Ｘは自然
に発生するアミノ酸のうちの任意のアミノ酸である。一
連の切断反応（ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
は、ＥＲ内にあるエキソグリコシダーゼ（ｅｘｏｇｌｙ
ｃｏｓｉｄａｓｅ）によって触媒される。哺乳類の細胞
によるＮ−結合型オリゴ糖の次の処理は、ゴルジ体の区
画内で続けられる。そこでは、エキソグリコシダーゼや
グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｒｙｃｏｓｙｌｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅ）のシーケンスに触媒された反応
が、高マンノース、混合型または複合型のオリゴ糖構造
を生成する。

【０００５】このような、糖蛋白質を含む、翻訳後修飾
された生物学的に活性な蛋白質を、生物学的生産方法で
製造するためには、糖鎖付加反応を含む翻訳後修飾が可
能な真核生物細胞の培養が必要である。しかし、真核生
物細胞培養で有用な蛋白質を生産する場合には、培地費
用、運転費用、設備費用など、コストが莫大となる。ま
た、この方法は大変時間がかかるため、工程を単純化
し、時間を節約するために、多数の無細胞蛋白質生産法
が開発された。

【０００６】無細胞蛋白質生産法は、宿主細胞（ｈｏｓ
ｔ ｃｅｌｌ）への毒性の問題のために生体内（インビ
ボ；ｉｎ ｖｉｖｏ）で合成できない蛋白質を、試験管
内（インビトロ；ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で遺伝子発現させ
る研究のための実験の手段として利用されてきた。さら
に、２０種の天然アミノ酸に加えて、さまざまな合成ア
ミノ酸を、特別に意図された目的のために、この方法で
効率的に蛋白質の骨格内に組み込むことができる（Ｎｏ
ｒｅｎ Ｃ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１８２−１８８（１９８９））。さらに、無細
胞蛋白質生産法は、最近、商業的に重要な組換え型蛋白
質製造の代替として再評価されている。それは、主に、
最近の新しい反応器の開発や、反応実行条件の最適化に
よる（（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３９：８８１−８８６（１９９
６）；Ｋｉｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ． ４４２：１５−１９（１９９９））。そのた
め、無細胞蛋白質生産法の開発は、次世代に入っている
といえる。つまり、商業規模での活性蛋白質の生産であ
る。

【０００７】従って、これらの無細胞蛋白質生産法に翻
訳同時修飾と初期段階の翻訳後修飾に関連する細胞小器
官（ｏｒｇａｎｅｌｌｓ）を加えることにより、翻訳同
時修飾蛋白質（ｃｏ−ｔｒａｎｌａｔｉｏｎａｌｌｙ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）と、初期段階の翻
訳後修飾蛋白質（ｉｎｉｔｉａｌ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎ
ｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）とを生産するためのいくつかの方法が開発され
た。ところで、初期段階の翻訳後修飾には蛋白質の生産
と同時に起こる機構もあるから、このような機構を区分
して、翻訳同時修飾（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａ
ｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と名称するのが正しい
が、本発明ではこれらもすべて”翻訳後修飾”という。
無細胞蛋白質生産法による初期段階の翻訳後修飾の代表
例として、米国特許第６，１０３，４８９号は、翻訳後
修飾蛋白質の無細胞アッセイシステムが、粗面ミクロソ
ーム（ｒｏｕｇｈ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ）と真核細胞の
無細胞翻訳システムとを結合することによって構築され
ることを開示している。もう1つの方法では、ＥＲのよ
うな翻訳成分や翻訳後修飾成分を含んだ抽出物が単一原
料からの一段階抽出により調製された（Ｈｉｒｏｓｈ
ｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｅｎｇ． ５：
５０８−５１３（２０００））。

【０００８】細胞内では、適切な処理のため、多くの蛋
白質の生物学的合成には、ＥＲと呼ばれる細胞小器官の
膜を透過する同時翻訳的な翻訳が必要である。無細胞シ
ステムでは、ＥＲの代わりに、ミクロソームの膜が利用
される。これは、それらは遠心分離できるＥＲの膜を高
いパーセンテージで含み、ＥＲと等価のものだからであ
る。これらの再構成された高等真核生物の蛋白質翻訳の
評価や初期段階の翻訳後修飾蛋白質のためのアッセイシ
ステムは、膜透過反応（転位置反応：ｔｒａｎｌｏｃａ
ｔｉｏｎａｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）装置を特殊化さ
せ、また、膜蛋白のトポロジーの決定やＮ−結合型中心
糖鎖付加反応（ｃｏｒｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏ
ｎ）に積極的に使用されてきた。しかし、これらでは完
全な糖鎖付加などを含む完全な翻訳後修飾蛋白質の生産
は不可能である。つまり、このような方法により生産さ
れた蛋白質は、完全な構造を持っていないので、蛋白質
の効能および特性の研究に利用することができないだけ
でなく、治療用蛋白質への応用にも適合しない。不完全
な形態の糖鎖構造を持つ糖蛋白質や翻訳後修飾が欠乏し
た蛋白質は、生物学的活性が無いかまたは大変低いの
で、治療目的で使用するには適合しない。このような不
完全な形態の翻訳後修飾を持つ蛋白質だけを生産できる
従来の無細胞蛋白質生産法は、完全な構造の蛋白質を生
産できないので、糖鎖付加反応などの翻訳後修飾の関連
研究や、遺伝子の機能研究に使用するには不十分であ
る。

【０００９】一方、ヒューマンゲノムプロジェクト（Ｈ
ｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ）から多くの
遺伝情報が得られている。近い将来には、完全なヒトの
遺伝子地図（ｇｅｎｏｍｅ ｍａｐ）が完成するであろ
う。現在、我々は、新しい遺伝子を探す段階から、それ
らの遺伝子や、それがエンコードする蛋白質の機能を探
求する段階に研究の目的が変わってきている。この目的
のために、コンピュータープログラムを利用する遺伝子
序列分析法でその遺伝子から生成された蛋白質の機能を
予測する生物情報学（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）
が利用されている。この方法によって予測された蛋白質
の構造と遺伝子のシーケンスから、その蛋白質の機能を
明らかにすることができる。得られた蛋白質の機能は、
予測されたものであるため、実際と異なる可能性が大変
高く、十分に満足できる方法ではない。そのため、さら
に正確で完璧な方法が必要だが、その方法とは直接その
蛋白質を生産して、実験を通じて機能を調査することで
ある。この時生産される蛋白質は、翻訳後修飾がよく遂
行されて完全な形態と構造を持っていなければならな
い。このような蛋白質を生産するためには、上述したよ
うに、遺伝子を高等細胞から発現することが必要であ
る。これには大変多くの時間と労働が必要であるが、プ
ロセスを簡略化したり時間を節約するために、無細胞蛋
白質生産法が利用できる。現在までに、完全に翻訳後修
飾ができる無細胞蛋白質生産法は開発されていない。そ
のため、完全な翻訳後修飾が行われた蛋白質を生産でき
る無細胞蛋白質生産法を開発する必要があった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、無細
胞蛋白質生産法が完全な翻訳後修飾蛋白質を生産できな
いという、従来技術の問題点を解決するために、より進
歩した無細胞蛋白質生産法によって、特に、無細胞蛋白
質生産法と無細胞完全翻訳後修飾蛋白質生産法の組み合
わせにより、完全に翻訳後修飾された蛋白質を生産する
方法を提供することにある。さらには、本発明の目的
は、上述した方法で翻訳後修飾された蛋白質の発現およ
び翻訳後修飾キット（ｋｉｔ）などを提供することにあ
る。

【００１１】本発明の無細胞蛋白質生産法は、蛋白質の
機能分析や治療に重要な蛋白質の大量生産のために用い
られる、完全翻訳後修飾蛋白質を合成するための有用な
手段になるばかりでなく、蛋白質の機能および修飾後翻
訳のメカニズムを解明するためのモデルシステムになり
うるものと思われる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】このような目的達成のた
めに、本発明は、次に示す結合無細胞完全翻訳後修飾蛋
白質合成法（ｃｏｕｐｌｅｄ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｃ
ｏｍｐｌｅｔｅｌｙｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉｏｎａ
ｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ）又は非結合無細胞完全翻訳後修飾蛋白質合成法
（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅｌｙ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉｏｎａｌ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）を経由することを特徴とする、完全翻訳後修飾蛋白
質を生産する方法を提供する。すなわち、本発明の結合
無細胞完全翻訳後修飾蛋白質合成法は、以下の（ａ）〜
（ｃ）工程からなる； （ａ）目的蛋白質の遺伝情報を持つＤＮＡ（ＤＮＡ ｔ
ｅｍｐｌａｔｅ）を細胞抽出物に添加する工程、（ｂ）
核酸（リボヌクレオチド三リン酸塩；ｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）を上記抽出
物に添加する工程、および（ｃ）完全翻訳後修飾蛋白質
の製造を刺激するのに十分な量の、小胞体（ＥＲ）／ゴ
ルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ）又は小胞体
／ゴルジ体／細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ）、あるいはこれらに加えて他の細胞小器官（ｏｒｇ
ａｎｅｌｌｓ）のような翻訳後修飾マシーナリー（ｍａ
ｃｈｉｎｅｒｙ）を上記抽出物に添加する工程。さら
に、本発明の非結合無細胞完全翻訳後修飾蛋白質合成法
は、以下の（ａ’）〜（ｂ’）工程からなる； （ａ’）目的蛋白質の遺伝情報を持つＲＮＡを細胞抽出
物に添加する工程、および（ｂ’）完全翻訳後修飾蛋白
質の製造を刺激するのに十分な量の、小胞体（ＥＲ）／
ゴルジ体又は小胞体／ゴルジ体／細胞膜、あるいはこれ
らに加えて他の細胞小器官のような翻訳後修飾マシーナ
リー（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を上記抽出物に添加する工
程。

【００１３】幾つかの酵素を必要とする最も複雑な翻訳
後修飾プロセスが糖鎖付加反応である。そのため、糖鎖
付加反応がよく起こると、これは大多数のほかの翻訳後
修飾も可能なことを意味する。

【００１４】細胞内の蛋白質の糖鎖付加反応を調べてみ
ると、大部分の真核細胞で起こる糖鎖付加反応は、一般
に小胞体（ＥＲ）内で起こる。つまり、酵母菌、昆虫、
植物および哺乳類の細胞が、ＥＲ内で、Ｎ−結合型オリ
ゴ糖の機能を分け与えている。つまり、小胞体だけを通
過した糖蛋白質の糖鎖構造は、ほとんど同じであるけれ
ども、小胞体での初期糖鎖付加反応だけから成る糖蛋白
質は、最後の目的糖蛋白質の特性をあまり反映できない
し、このような初期糖鎖付加反応だけでは生産される糖
蛋白質に治療剤の効能を付与できない。

【００１５】中途の糖蛋白の製造は、完全な翻訳後修飾
を経ておらず、ゴルジ体のような後期糖鎖付加反応マシ
ーナリーの欠如によって起こりうる。別の言葉でいえ
ば、異なったタイプの細胞によるオリゴ糖の処理は、ゴ
ルジ体によって異なるであろう。哺乳類細胞におけるＯ
−型糖鎖付加反応（Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）
の初期段階は、セリンまたはスレオニンへの、Ｎ−型ア
セチルガラクトサミンの共有的な結合である。どんなＯ
−型糖鎖付加反応のシーケンスも、Ｎ−型糖鎖付加反応
（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に必要とされる、
Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの鋳型（ｔｅｍｐｌａｔ
ｅ）と類似していない。Ｎ−型糖鎖付加反応とのさらな
る相違として、前もって形成されない、脂質共役オリゴ
糖前駆体が初期の哺乳類Ｏ−型糖鎖付加反応に含まれて
いる。糖のヌクレオチドは、Ｏ−結合型プロセスにおけ
る、最初のそしてその後起こる全ての工程の基質とな
る。続いてセリンまたはスレオニンへのＮ−型アセチル
ガラクトサミンの共有的な結合が起こり、いくつかの異
なった処理の経路が、ゴルジ体における哺乳類のＯ−結
合型オリゴ糖に可能である。糖蛋白のオリゴ糖の構造
は、人間の治療用途に決定的な性質、血漿クリアランス
度、抗原性、免疫原性、比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃ
ｔｉｖｉｔｙ）、溶解度、熱による非活性化に対する抵
抗およびプロテアーゼの攻撃への抵抗に、重要な影響を
及ぼす。ゆえに、糖蛋白の大量生産に適用する無細胞蛋
白質生産法のために、および、安定性、形態、蛋白質と
糖鎖形成反応の機構の関係を理解するための蛋白質の糖
鎖付加反応の役割の急速な洞察のために、蛋白質が完全
に翻訳後修飾されるような、能率的な完全翻訳後修飾無
細胞蛋白生産法が開発される必要があった。

【００１６】本発明は、完全な構造の糖鎖が付加された
糖蛋白質を生産するために、適切な無細胞蛋白質生産法
を構築し、これと、細胞から分離した翻訳後修飾関連細
胞内マシーナリーを利用した、無細胞糖鎖付加反応（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の適切
な組み合わせを目的とする。このような概念の無細胞翻
訳後修飾蛋白質生産法は、今までに報告されたことがな
い、新しい方法である。これは、特に翻訳後修飾が必要
な蛋白質の大量生産に大変好適である。また、このよう
な方法は、糖鎖付加反応以外の、翻訳後修飾が必要な蛋
白質の生産にも、直接応用することができる。

【００１７】

【発明の実施の形態】原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ
ｓ）は、翻訳後修飾が欠乏しているから、本発明の無細
胞翻訳後修飾に利用される無細胞蛋白質生産系は、真核
細胞由来の無細胞蛋白質生産系でなければならない。今
まで、菌類、哺乳類細胞（例；網状赤血球、内皮細胞お
よびリンパ球）を含むさまざまな真核生物可溶化液（蛋
白質合成マシーナリー）、不死化株細胞（例；ガン株細
胞等）および植物細胞（コムギ胚芽または胚細胞など）
の原料を利用してきた。そして、効率的な真核細胞の転
写−翻訳結合無細胞蛋白質生産法（ｃｏｕｐｌｅｄ ｃ
ｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ；ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）がバクテリオフ
ァージＲＮＡポリメラーゼとウサギ網状赤血球可溶化液
（ＲＲＬ）を用いて開発された（米国特許第５，３２
４，６３７号）。このように転写と翻訳が連続的に結合
された無細胞蛋白質生産法を“転写−翻訳結合無細胞蛋
白質生産法”という一方、転写と翻訳が別個の反応に区
分されて起こる場合、つまり転写反応でＤＮＡからｍＲ
ＮＡを製造し、このｍＲＮＡを分離して、別個の翻訳反
応でｍＲＮＡから蛋白質を生産する無細胞蛋白質生産法
を“転写−翻訳非結合無細胞蛋白質生産法”（ｕｎｃｏ
ｕｐｌｅｄ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）という。

【００１８】上述したように、小胞体だけの添加は、完
全に翻訳後修飾された蛋白質を形成できない。これはゴ
ルジ体のような後期糖鎖付加反応（ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）をはじめとする後期翻訳
後修飾に関連するマシーナリーの欠乏のためである。無
細胞蛋白質生産反応混合物に、信号識別粒子（ｓｉｇｎ
ａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、
ＥＲ、ゴルジ体、原形質膜等を含む翻訳後修飾マシーナ
リーを添加すると、完全翻訳後修飾蛋白質の生産が活性
化される。完全な培養混合物（無細胞蛋白質生産と翻訳
後修飾マシーナリーの複数の成分を含む）は、完全翻訳
後修飾蛋白質を与える。翻訳後修飾過程はインビトロで
忠実に再現しうる。本発明に記載した結果は、治療用の
蛋白質のインビボ生産の代替としての無細胞蛋白質生産
の可能性を開き、無細胞蛋白質生産法の理解を深めるも
のである。

【００１９】無細胞蛋白質生産のための細胞抽出物製造
用細胞と翻訳後修飾のための細胞内膜成分抽出物製造用
細胞は、同じでも異なっていてもかまわない。同じ細胞
を使用する場合にも、蛋白質生産用抽出物と翻訳後修飾
用細胞内マシーナリーを別々に準備しても一緒に使用し
てもよい。

【００２０】翻訳後修飾マシーナリーは、組織細胞や培
養した株細胞（ｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
ｓ）から製造することができる。糖鎖付加反応の場合、
糖鎖付加反応関連酵素の発現を増進させるためや、及び
／又は糖鎖付与反応で糖供与者（ｓｕｇｅｒ−ｄｏｎｏ
ｒ）の役割をする糖−核酸（ｓｕｇｅｒ−ｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ）複合体の量を増加させるためには、遺伝子
工学技術者にとって細胞源（ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ）
の方が有利である。このような遺伝子操作は、本発明が
属する分野で通常の知識を持つ者（当業者）が容易に実
施できるので、詳しい説明は省略する。

【００２１】無細胞蛋白質生産法における細胞抽出物を
得る例としては、ヌクレアーゼ処理されたウサギ由来の
赤血球破砕物（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔ
ｅｌｙｓａｔｅ；ＲＲＬ）の詳しい製造方法が実施例１
に記載されている。また、糖鎖付加反応を含む翻訳後修
飾に関連されたいろいろな細胞内マシーナリーを分離す
るために、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎ
ｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ；ＣＨ
Ｏ ｃｅｌｌ）から細胞初期破砕物（ｃｒｕｄｅ ｈｏ
ｍｏｇｅｎａｔｅ）を製造する詳しい製造方法が実施例
２に記載されている。さらに、上記細胞初期破砕物から
信号認識因子を含有する小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、さ
らには細胞膜を分離する方法は、実施例３、実施例４お
よび実施例５に各々記載されている。

【００２２】場合によって、本発明の転写−翻訳結合無
細胞蛋白質生産法および転写−翻訳非結合無細胞蛋白質
生産法で生産された糖蛋白質は、糖転移酵素（ｇｌｙｃ
ｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、糖切断酵素（ｇｌ
ｙｃｏｓｉｄａｓｅ）および糖置換酵素（ｔｒａｎｓｇ
ｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）などの糖鎖構造変更関連酵素に
よって酵素的糖付加反応、糖切断反応、糖置換反応など
を経て変形されることができる。つまり、新しい糖の添
加や除去が可能であるので、一般的な糖鎖構造で発見さ
れない糖の導入や、新しい糖鎖構造合成が可能である。
そのため、新しい糖蛋白質の開発も可能である。例とし
て、糖鎖付与反応液自体、または、これから分離したＥ
ＰＯは、糖置換酵素のひとつのトランス−シリアダーゼ
によって糖鎖末端にシアル酸をさらに付加することがで
きるし、糖鎖末端にシアル酸の付加が増加するほど、一
般的に糖蛋白質の薬効が増加する。

【００２３】本発明は、医薬用、産業用及び研究用蛋白
質の生産への応用が可能である。つまり成長ホルモン
類、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン、イン
ターフェロン、トロンボポエチン（血小板産生因子；ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、組織プラスミノゲンア
クチベーター（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ヒト化モノクローナル抗体（ｈ
ｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ）などの蛋白質がすべて含まれる。また、本発明
は、翻訳後修飾された蛋白質の生産自体だけでなく、最
近新しく明かされた多くの遺伝子の機能の究明のため
の、完全な形態の蛋白質発現の研究手段および糖鎖付加
反応などを含む翻訳後修飾に対する研究手段にも使用が
可能である。また本発明は、上述した方法で生産された
翻訳後修飾蛋白質を含む蛋白質の発現および翻訳後修飾
キットなどで使用することができる。本発明の技術を利
用した蛋白質の発現および翻訳後修飾キットを利用する
と、時間、労働、費用を減らすことができる。特に膨大
な量の遺伝子の機能を調査するためには、時間を短縮で
きることが大変重要である。

【００２４】本発明の一つの実施態様では、ＥＰＯが完
全翻訳後修飾蛋白質合成法により生産される。しかし、
ＥＰＯは、ただ応用可能な治療用蛋白質のひとつの実例
として提示され、本発明がこれら特定の実施例に限定さ
れることはないし、本発明の分野における当業者によっ
て、さまざまな変形が可能であることは理解されるであ
ろう。また実施例には翻訳後修飾の一例にＥＰＯの糖鎖
付加反応だけを提示しているが、これは他の全ての翻訳
後修飾反応の代表である。それゆえ、本発明は他の翻訳
後修飾をすべて含むものである。

【００２５】ＥＰＯは、慢性腎臓疾患をはじめとする各
種疾患に聯関された貧血症を治療するために現在多く使
用される治療用糖蛋白質である。ＥＰＯは、哺乳動物お
よび鳥類の赤血球の生育に主要な調節物質である。特
に、この糖蛋白質ホルモンは、骨髄、脾臓および胎児の
肝で、赤血球幹細胞が早く生長することを促進したり、
以後循環系を循環する赤血球の最終分化に必要である。
現在、治療用ＥＰＯは動物細胞培養で生産されている。

【００２６】翻訳後修飾が導入された転写−翻訳結合無
細胞翻訳後修飾蛋白質生産法によるＥＰＯの生産は、実
施例６に詳しく記載されている。また、翻訳後修飾が導
入された転写−翻訳非結合無細胞翻訳後修飾蛋白質生産
法によるＥＰＯの生産は、実施例７に詳しく記載されて
いる。さらに、翻訳後修飾が導入された無細胞翻訳後修
飾蛋白質生産法と酵素的（インビトロ）糖付加反応を結
合した方法によるＥＰＯの生産は、実施例８に詳しく記
載されている。

【００２７】

【実施例】以下、本発明で開発された詳しい内容を次の
実施例に説明する。しかし、本発明は以下の例だけに限
定されていないし、その変形も含む。

【００２８】実施例１ヌクリアーゼ処理されたウサギ由来の赤血球破砕物の製
造 新しい周辺飼育環境と飼料に適応するように約２週間飼
育したウサギに、３日間、貧血誘発剤の１．２５％（ｗ
／ｖ）アセチルフェニルヒドラジン（ＡＰＨ）、４−５
ｍｌをえりくびに注射した。１．２５％（ｗ／ｖ）のＡ
ＰＨの貯蔵水溶液は、加温撹拌機で準備され、その後−
２０℃で保管された。ウサギは通常としてスケジュール
の８日目に採血された（最後のＡＰＨ注射の５日後ウサ
ギから採血した）。０．５ｍｌのヒプノルム（Ｈｙｐｎ
ｏｒｍ）が大腿筋に注射された。ヒプノルムが一旦効果
を示し、ウサギが麻酔にかかったら、片方の耳の縁が、
大辺縁静脈（ｔｈｅ ｂｉｇ ｍａｒｇｉｎａｌ ｖｅ
ｉｎ）が暴露するように、毛が剃られ、ヘパリンを２，
０００単位含むネムブタル（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）または
サガタル（Ｓａｇａｔａｌ）を、２−２．５ｍｌ、注射
した。動物が完全に無意識になったとき、ウサギの胸部
を９５％（ｖ／ｖ）エタノールでひたした後、毛を除去
した。胸部（ｒｉｂｃａｇｅ）が十分に暴露された時、
下部中央線から頭部中央線へ切開し、約１インチ側面に
筋肉と骨の三角形フラップができた。このフラップは開
かれるように折り畳まれ、心臓そのものまたは心臓から
でている大動脈が切開された。胸の空間が急速に血液で
満たされ、この血液を３０−５０ｍｌ、３インチのシリ
コンラバーまたはタイゴン（Ｔｙｇｏｎ）チューブのつ
いた注射器で、ヘパリンなどの血液凝固防止剤があらか
じめ少量添加された冷たい採血容器に移した。ウサギ一
匹から平均１００ｍｌの血液が得られた。

【００２９】得られた血液から毛などの不純物を除去す
るために、チーズクロスまたはナイロン布で血液を濾過
した。これを２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して
赤血球を回収した。回収された赤血球を５ｍＭのブドウ
糖が含まれている緩衝液（５．５ｍＭの酢酸カリウム、
２５ｍＭのトリス−酢酸、１３７ｍＭの塩化ナトリウ
ム、０．２８ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、１ｍ
Ｍのエチレジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭのジチ
オトレイトール（ＤＴＴ））で再懸濁させた。これをま
た２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後上清を除
去した。この過程をもう３回反復して細胞を洗浄した。
つまり、全部で４回の低速回転である。最後の洗浄後、
計測された体積の生理食塩水中で再懸濁し、全体の体積
を計測することによって、細胞の体積が決定された。最
後の遠心分離の後、細胞の体積（濃縮細胞体積として）
の１．５倍の冷たい蒸溜水で再懸濁させた。溶液を完全
に混合して細胞を破砕し、もう一度溶液を１０，０００
ｒｐｍ（約１５，０００ｇ）、２℃で２０分間遠心分離
した。上清をナイロン布（５３μｍ，Ｎｉｔｅｘ材質）
を利用して濾過して、どんなにかわ状間質の塊も可溶化
液に入るのを防いだ。それは蛋白質合成の抑制物質を含
むからである。

【００３０】この時得られた赤血球破砕物は、蛋白質合
成マシーナリーを多く持っており、これを“赤血球破砕
物”または“細胞抽出物”という。このように得られた
赤血球破砕物には多量のｍＲＮＡが存在する。このｍＲ
ＮＡの活性を除去するためにｍＲＮＡの活性を選択的に
除去するヌクリアーゼで赤血球破砕物を処理した。４０
０μｌの溶液あたり１ｍｌのへミン８μｌ、１０ｍｇ／
ｍｌのクレアチンキナーゼ４μｌ、１２５ｍＭの塩化カ
リウム３．２μｌ、および１５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍ
ｌのミクロコッカスヌクリアーゼ１６μｌを添加してよ
く混合した後、２０℃で３０分間反応した。ミクロコッ
カスヌクリアーゼの反応はカルシウムイオンを必要とす
るため、反応液にカルシウムイオンを選択的にキレート
できる５００ｍＭのエチレングリコールビス（２−アミ
ノエチルエーテル）―Ｎ，Ｎ’―四酢酸（ＥＧＴＡ）
８．８μｌを添加して反応を停止した。この溶液は約８
５μｌの適当な一定分量に分けられた。この溶液は可能
な限り急速に冷やすため、液体窒素内で凍結された。こ
の方法で貯蔵された溶液は、少なくとも３年間、どんな
活動も失わない。−７０℃冷凍庫で保管された貯蔵物
は、少なくとも数ヶ月の間良好なようであった。

【００３１】実施例２チャイニーズハムスター卵巣細胞からの天然ホモジネー
ト（細胞初期破砕物）の製造 翻訳後修飾マシーナリーの分離のために、まず、細胞内
膜成分を多量に含んでいる細胞初期破砕物を製造する。
本実施例で使用した細胞はＣＨＯ細胞である。３０個の
細胞培養プレートに、ＣＨＯ細胞を培養プレートあたり
４−６×１０^７の細胞数になるように、培養温度を３４
℃、気相を９５％空気−５％炭酸ガスとして培養した。
培養後の細胞は、蛋白質分解酵素のトリプシンの処理で
培養プレートから外す。培養プレートから培養液を除去
した後、培養プレートに付いている細胞を１０ｍｌのト
リス緩衝液（５．５ｍＭの酢酸カリウム、２５ｍＭのト
リス−酢酸、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、０．２８ｍ
ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、１ｍＭのエチレジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭのＤＴＴおよび０．５
ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフッ化物（ＰＭＳ
Ｆ）（ｐＨ７．４））で洗浄した。以後０．０５％のト
リプシンと０．０２％のＥＤＴＡが含まれているトリス
緩衝液を、各培養プレートあたり５ｍｌ加えた後、常温
で５分間放置して酵素反応を誘導した。酵素反応後、冷
たい培地を、各培養プレートあたり２ｍｌ添加して、各
培養プレートから酵素反応液を集めて、４℃、６００ｇ
で５分間遠心分離した。遠心分離後、細胞沈殿物からト
リプシンが完全に除去されるように、５０−１００ｍｌ
のトリス緩衝液で３回洗浄した。最後の遠心分離後、細
胞沈殿物の体積を測定し、細胞沈殿物を５倍の破砕緩衝
液（２５０ｍＭのスクロース、１０ｍＭのトリス−酢
酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および０．５
ｍＭのＰＭＳＦ（ｐＨ７．４））で再懸濁させた。きっ
ちりと合わせられた１５ｍｌのドウンスホモジナイザー
（Ｄｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、Ｗｈｅａｔ
ｏｎ Ｃｏ，． Ｍｉｌｌｉｖｉｌｌｅ ＮＪ）を３０
回振ることによって、細胞の懸濁液から天然ホモジネー
トが製造された。得られた天然ホモジネートは、すぐに
使用できるが、さらに都合が良いように、液体窒素で凍
結され、後の細胞成分分画のために、−８０℃で貯蔵さ
れた。

【００３２】実施例３天然ホモジネートからの内部原形質の細網を含む信号識
別粒子の製造 （細胞初期破砕物からの信号認識粒子と結合している小
胞体の分離） 実施例２の、冷凍保管された細胞初期破砕
物を、３０℃で速く解凍した後、氷に置いた。この細胞
初期破砕物を４℃、５，０００ｇで１５分間遠心分離し
た。遠心分離後上清を注意して回収し、４倍の細胞破砕
緩衝液で稀釈した後、ミトコンドリアを除去するため
に、４℃、８，５００ｇで５分間遠心分離した。遠心分
離後、上清からスクロースの密度差超遠心分離で小胞体
を分離した。超遠心分離の際、超遠心分離用試料を準備
するために、容器の下から順に、１０ｍＭのトリス酢酸
（ｐＨ７．４）を含む２．０Ｍのスクロース溶液、１０
ｍＭのトリス−酢酸（ｐＨ７．４）を含む１．５Ｍのス
クロース溶液、１０ｍＭのトリス−酢酸（ｐＨ７．４）
を含む１．３Ｍのスクロース溶液を３：４：４の体積比
（ｖ／ｖ）で満たした。このスクロース溶液の上を、先
に遠心分離で準備された小胞体を含む上清で満たした。
この試料を４℃、９０，０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ社Ｓ
Ｗ２８ローター（ｒｏｔｏｒ）使用時２３，０００ｒｐ
ｍ）で１５０分間超遠心分離した。超遠心分離後、１．
３Ｍ−１．５Ｍのスクロース溶液の界面と、１．５Ｍ−
２．０Ｍのスクロース溶液の界面から、小胞体部分を得
られた。回収した小胞体部分を３倍の稀釈緩衝液（５５
ｍＭのトリス−酢酸、５ｍＭの酢酸マグネシウム（ｐＨ
７．０））で稀釈した後、４℃、９０，０００ｇで、４
５分間、もう一度超遠心分離した。超遠心分離後、得た
小胞体の沈殿物を、５０−１００μｌの貯蔵緩衝液（５
ｍＭのトリエタノールアミン、２ｍＭのＤＴＴおよび２
５０ｍＭのスクロース）に溶解させた。

【００３３】貯蔵緩衝液に溶解した小胞体を、ブドウ球
菌ヌクリアーゼ（ＥＣ ３．１．３１．１）で処理し
て、内在ＲＮＡを除去した。つまり、０．１ｍｌの小胞
体溶液あたり１２．５ｍＭの塩化カルシウム溶液８μ
ｌ、および６０ｕｎｉｔのブドウ球菌ヌクリアーゼを添
加して２０℃で３０分間反応することによって処理し
た。３０分後、０．５ＭのＥＧＴＡ溶液（水酸化ナトリ
ウム；ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整されている）２．２
μｌを加えて反応を停止し、これを５０μｌずつ分取し
て液体窒素で急冷した後、−７０℃冷凍庫で保管した。
冷凍された小胞体溶液は、使用の前に、３０℃で急速解
凍して使用した。

【００３４】実施例４天然ホモジネート（細胞初期破砕物）からゴルジ体の分
離 実施例２の、冷凍保管された細胞初期破砕物を、３０℃
で急速解凍した後、氷に置いた。この細胞初期破砕物を
４℃、５，０００ｇで１５分間遠心分離した。最初の
５，０００ｇでの遠心分離後、ほとんどの上清が除去さ
れ、ペレットの黄褐色の部分（上部３分の１）が少量の
上清内で再懸濁された。よく混ぜた後、この溶液６ｍｌ
に１０ｍＭのトリス−酢酸（ｐＨ７．４）を含む２．３
Ｍのスクロース溶液を添加して、全体溶液のスクロース
濃度が１．４Ｍになるようにした。ここにＮａ_２ＥＤＴ
Ａの最終濃度が１ｍＭになるように添加した後、よく混
ぜて、ＳＷ２８チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れた。
この混合液を超遠心分離器に入れた。そして、その上を
１４ｍｌの１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．４）を含む
１．２Ｍのスクロース溶液で、８ｍｌの１０ｍＭトリス
−酢酸（ｐＨ７．４）を含む０．８Ｍのスクロース溶液
で、順に満たした後、４℃（ＢｅｃｋｍａｎＳＷ２８ロ
ーター、２３，０００ｒｐｍで）、９０，０００ｇで１
５０分間超遠心分離した。０．８Ｍ−１．２Ｍのスクロ
ース溶液の界面における濁った一群（ゴルジ体部分）
が、注射器の小さな穴によって、最小限の量（≦１．５
ｍｌ）得られた。この回収されたゴルジ体の部分を３倍
の稀釈緩衝液（５５ｍＭのトリス−酢酸、５ｍＭの酢酸
マグネシウム（ｐＨ７．０））で稀釈した後、４℃、９
０，０００ｇで４５分間超遠心分離した。超遠心分離後
得られたゴルジ体の沈殿物を、５０−１００μｌの貯蔵
緩衝液（５ｍＭのトリエタノールアミン、２ｍＭのＤＴ
Ｔおよび２５０ｍＭのスクロース）で溶解した。貯蔵緩
衝液に溶けさせた後、５０μｌずつ分取りして液体窒素
で急冷して−７０℃冷蔵庫で保管した。このように冷凍
したゴルジ体溶液は使用の前に３０℃で急速解凍して使
用した。

【００３５】実施例５天然ホモジネート（細胞初期破砕物）から分離した細胞
膜の製造 実施例２の冷凍保管された細胞初期破砕物を３０℃で速
く溶けさせた後、氷に置いた。この細胞初期破砕物を４
℃、２５，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を除
去して約５×１０^８の細胞数あたり１ｍｌの０．２Ｍ、
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で沈殿物を浮遊さ
せた。この溶液を６．６％のデキストランＴ５００（Ｐ
ｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と６．６％（ｖ／
ｖ）のポリエチレングリコール３３５０（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の高分子混合液および０．２
Ｍｎリン酸カリウムを含んだ、２相系（ｔｗｏ―ｐｈａ
ｓｅｓｙｓｔｅｍ）の上に加えた。これを４℃で完全に
混ぜた後、４℃、１，１５０ｇで５分間遠心分離した。
このようにして層が分離されると、細胞膜を多量に含ん
でいる上層を回収して、１ｍｌの重炭酸で稀釈し、３
０，０００ｇ、１５分間で再遠心分離した。遠心分離
後、得た細胞膜の沈殿物を５０−１００μｌの貯蔵緩衝
液で溶解した。５０μｌずつ分取し、液体窒素で急冷し
て、−７０℃冷凍庫で保管した。このように保管したゴ
ルジ体溶液は使用の前に３０℃で急速解凍して使用し
た。

【００３６】実施例６翻訳後修飾が導入された転写−翻訳結合無細胞蛋白質生
産法によるＥＰＯの生産 翻訳後修飾が導入された転写−翻訳結合無細胞蛋白質生
産法によるＥＰＯの生産のために、ヒトＥＰＯの遺伝子
を含んでいるベクターのｐ６４Ｔ−ＥＰＯ（Ｂｏｉｓｓ
ｅｌ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．， ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． ２６８：１５９８３−１５９９３（１９９
３））を、塩化セシウムを利用する超遠心分離法で精製
して、無細胞蛋白質生産の鋳型として使用した。無細胞
蛋白質生産の際、糖鎖付加反応関連細胞内マシーナリー
を含んでいる翻訳後修飾関連細胞内マシーナリーを添加
する。ここで翻訳後修飾関連細胞内マシーナリーとは、
実施例３から５において説明した、小胞体とゴルジ体、
または、小胞体とゴルジ体と細胞膜の調合を意味する。
反応混合物は、ヌクリアーゼで処理した５３％の細胞抽
出物（ＲＲＬ）と、その他の基本的な構成成分の最終的
な濃度は；１７ｍＭのクレアチンリン酸、４８μｇ／ｍ
ｌのクレアチンフォスフォキナーゼ、４０μＭの各アミ
ノ酸、２６０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＳＰ６ＲＮＡポリメラ
ーゼ、７５μｇ／ｍｌの環型プラスミドＤＮＡ、１．８
ｍＭのＡＴＰ、１．３ｍＭのＧＴＰ、各１ｍＭのＵＴＰ
およびＣＴＰ、５０ｍＭの酢酸カリウム、３．６ｍＭの
酢酸マグネシウム、０．４ｍＭのスペルミジン、４ｍＭ
のＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、１，６００ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｌのリボヌクリアーゼ阻害剤、２．７ｍＭの
ＤＴＴ、９．５μＭのヘミン、５７μｌ／ｍｌの子牛肝
由来のトータルｔＲＮＡ混合物、である。以上をよく混
ぜた混合液を３０℃で６０分間反応して、蛋白質合成と
同時に糖鎖付加を誘導した。

【００３７】図１には、上述した方法により翻訳後修飾
されたＥＰＯと翻訳後修飾されていないＥＰＯを、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分離してオートラ
ジオグラフで撮影した写真が示されている。レーン１
は、翻訳後修飾マシーナリーの添加のない、無細胞蛋白
質生産法で生産したＥＰＯを、レーン２は、翻訳後修飾
マシーナリーを添加して糖鎖付加を誘導して生産したＥ
ＰＯを示す。翻訳後修飾関連細胞内のマシーナリーの添
加は、生産されたＥＰＯの分子量の増加を誘導し（レー
ン２）、これは糖鎖付加が起こったことを表す。

【００３８】上記の反応後、糖鎖付加反応のために添加
したマシーナリーなどの膜成分を溶かすために、０．５
％のトリトンＸ−１００を反応液に添加して常温で１０
分間放置した後、生産されたＥＰＯをＥＰＯと特異的に
結合する単一群抗体を利用して一般的な方法で分離し
た。

【００３９】図２は、通常の細胞培養方法によって製造
されたＥＰＯと、本発明の無細胞完全翻訳後修飾法によ
って製造されたＥＰＯのウエスタンブロッティングの結
果を示している。レーン１は、通常の細胞培養法で生産
されたＥＰＯを、レーン２は、上記の翻訳後修飾が導入
された無細胞生産法で生産したＥＰＯを表す。図２か
ら、本発明の方法で生産されたＥＰＯは、従来の細胞培
養法で生産されたＥＰＯと同じ分子量であり、また、Ｅ
ＰＯと特異的に結合する抗体に対し、同様の結合性質を
持つことが分かる。

【００４０】図３は、糖切断酵素で処理したＥＰＯをオ
ートラジオグラフで撮影した写真が提示されている。つ
まり、図３は、ＥＰＯに付加された糖鎖の構造が完全な
ことを確認するために、糖鎖構造を認識して選択的に切
断する、糖切断酵素で処理した結果を示す。レーン１
は、翻訳後修飾マシーナリーの添加をせずに生産された
ＥＰＯを、レーン２とレーン３は、翻訳後修飾が導入さ
れた、無細胞翻訳後修飾蛋白質生産法で生産されたＥＰ
Ｏを、レーン４とレーン５は、無細胞翻訳後修飾蛋白質
生産法で生産されたＥＰＯを糖切断酵素Ｆで処理した試
料を、レーン６は、無細胞翻訳後修飾蛋白質生産法で生
産されたＥＰＯを糖切断酵素Ｈで処理した試料を示す。
報告されたものによると、生物学的活性を持つＥＰＯ
は、糖鎖構造が複合型である。このような複合型の糖鎖
は、糖切断酵素Ｈでは切られず、糖切断酵素Ｆで切られ
ると、知られている。図３から、無細胞翻訳後修飾蛋白
質生産法で生産されたＥＰＯは、糖切断酵素Ｈに対する
抵抗性を持つが、糖切断酵素Ｆでは切られるので，完全
な複合型の糖鎖構造をもつことが分かる。

【００４１】図２と３に示した結果から、本発明の方法
による無細胞翻訳後修飾蛋白質生産法で生産されたＥＰ
Ｏは、細胞培養法で生産されたＥＰＯと同じ構造を持つ
と結論付けることができる。

【００４２】膜の可溶化のために、反応混合物は、０．
５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で処理され
た。その後、合成されたＥＰＯは、一般的な手法を用い
て、ＥＰＯのモノクローナル抗体で、免疫的に浄化され
た（ｉｍｍｕｎｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）。

【００４３】一方、ＥＰＯを含む、分離した溶液を、リ
フォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）溶液（５０ｍＭ
のリン酸二水素ナトリウム、２％（ｖ／ｖ）のラウリル
サルコシン酸ナトリウム、４０μＭの硫酸銅）に透析し
てリフォルディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）させた後、
ＥＰＯを凍結乾燥した。分離したＥＰＯの生物学的活性
は、以下の記載のとおり測定した。

【００４４】生産されたＥＰＯのインビトロ活性は、１
０％の血清を含んでいるＲＰＭＩ１６４０の培地（Ｋｉ
ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７
３：３７５−３８０（１９８９））で培養した、ＥＰＯ
依存性生長ヒト株細胞ＴＦ−１の成長で測定した。

【００４５】インビボ活性は、ゴールドワッサーの方法
（Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ，Ｅ． ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，
Ｍ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３
７：１０９−１２１（１９７５））によりネズミの血球
細胞に導入された^５９Ｆｅを定量して測定した。

【００４６】各測定値は、平行線分析（ｐａｒａｌｌｅ
ｌ ｌｉｎｅ ａｓｓａｙ）（Ｄｕｎｎ，Ｃ.Ｄ.Ｒ．，
ａｎｄ Ｎａｐｉｅｒ， Ｊ.Ａ.Ｐ．， Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ． （Ｎ．Ｙ．） ６：５７７−５８４
（１９７８））により決定した。つまり、１試料あたり
９度測定し、各測定あたり２度の分析でインビトロ活性
を測定し、インビボ活性の測定のために、１試料あたり
３度の測定と、各測定あたり３匹のマウスを使用した。
１／５００に稀釈したＥＰＯの試料に含まれている塩の
ようなほかの物質は、生物学的活性分析に影響しなかっ
た。

【００４７】生物学的活性分析には、第二国際標準基準
品（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）に
より高度に精製された組替えヒトＥＰＯ（ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＥＰＯ、ｒＨｕＥＰＯ）を標
準品で使用した。生物学的活性の測定の結果、本実施例
の転写−翻訳結合無細胞翻訳後修飾蛋白質生産法で生産
されたＥＰＯをｒＨｕＥＰＯと比較すると、先に無細胞
翻訳後修飾蛋白質生産法で生産したＥＰＯが、細胞培養
で生産したＥＰＯの構造と同じであったことから予想で
きるように、インビトロ活性およびインビボ活性が、実
験誤差の範囲内でｒＨｕＥＰＯと類似した。

【００４８】実施例７翻訳後修飾が導入された転写−翻訳非結合無細胞翻訳後
修飾蛋白質生産法によるＥＰＯの生産 翻訳後修飾が導入された転写−翻訳比結合無細胞翻訳後
修飾蛋白質生産法でＥＰＯを生産するために、ヒトＥＰ
Ｏの遺伝子（ｃＤＮＡ）を含んでいるベクター（プラス
ミド）の、ｐ６４Ｔ−ＥＰＯを、塩化セシウムを利用し
た超遠心分離法で精製して、インビトロ転写反応の鋳型
として使用した。この方法では、翻訳反応と分離され
た、別個の転写反応を遂行する。

【００４９】本実施例のインビトロ転写反応に、キャッ
プ構造（^７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）をｍＲＮＡ
に導入する方法と導入しない方法を使用した。一般的に
キャップ構造を導入したｍＲＮＡを鋳型で使用した場合
のほうが、蛋白質合成反応に必要なｍＲＮＡの量が少な
い方法を利用した方法に比べて、最終蛋白質合成の面で
は不利であるが、ｍＲＮＡ生産自体が簡便で、転写反応
によるｍＲＮＡの生産量もはるかに多い。

【００５０】キャップ構造を導入しないインビトロ転写
反応の最適条件は以下のとおりである；４０ｍＭのトリ
ス−塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍＭの塩化マグネシウム、
１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各核酸（ＮＴＰ）、１００
０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリボヌクリアーゼ阻害剤、２ｍＭ
のスペルミジン、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＳＰ６
ＲＮＡ重合酵素、１０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．
１ｍｇ／ｍｌの環型のＤＮＡ（プラスミド）。そして、
キャップ構造の導入のためのインビトロ転写反応の最適
条件は、キャップ構造類似体（ｃａｐ ａｎａｌｏｇ）
の添加と使用ＧＴＰ濃度に差異があるが、以下のとおり
である；４０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、６ｍ
Ｍの塩化マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ、各１ｍＭの
ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、０．５ｍＭのＧＴＰ、１
０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリボヌクリアーゼ阻害剤、２
ｍＭのスペルミジン、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＳ
Ｐ６ＲＮＡ重合酵素の塩化ナトリウム、０．５ｍＭのキ
ャップ構造類似体および０．１ｍｇ／ｍｌの環型ＤＮＡ
（プラスミド）。

【００５１】転写反応のために以上の成分を混合すると
き、低い温度ではスペルミジンとＤＮＡが共沈するの
で、これらの間の沈殿物の形成を防止するために、ＤＮ
Ａ以外のすべての成分を混合した混合液を、３７℃であ
らかじめ温めた後に、ＤＮＡを添加した。転写反応は３
７℃で４時間遂行した。反応後、合成されたｍＲＮＡは
フェノール／クロロホルム抽出法で反応液から抽出し、
この抽出液に同量の５Ｍ塩化リチウム水溶液を加え、氷
に１時間放置してｍＲＮＡを選択的に沈殿させた。沈殿
されたｍＲＮＡを回収するために、４℃、５，０００ｇ
で１５分間遠心分離した後、得られた沈殿物を７５％
（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、ＲＮＡ分解酵素がな
い、分子生物学用純度の水に溶かした。

【００５２】転写−翻訳非結合無細胞翻訳後修飾蛋白質
生産の際に、糖鎖付加反応関連細胞内マシーナリーを含
む、翻訳後修飾関連細胞内マシーナリーを添加する。こ
こで、翻訳後修飾関連細胞内マシーナリーとは、実施例
３から５で説明した、小胞体とゴルジ体、または小胞体
とゴルジ体と細胞膜の調合物を意味する。

【００５３】反応混合物は以下ものを含む：ヌクリアー
ゼで処理した５３％（ｖ／ｖ）の細胞抽出物（ＲＲ
Ｌ）、１７ｍＭのクレアチンリン酸、４８μｇ／ｍｌの
クレアチンフォスフォキナーゼ、４０μＭの各アミノ
酸、３０μｇ／ｍｌのｍＲＮＡ、０．８ｍＭのＡＴＰ、
０．３ｍＭのＧＴＰ、５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５
ｍＭの酢酸マグネシウム、０．４ｍＭのスペルミジン、
４ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．３）、１，６０
０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのリボヌクリアーゼ阻害剤、２．７
ｍＭのＤＴＴ、９．５μＭのヘミンおよび５７μｇ／ｍ
ｌの子牛肝由来全体ｔＲＮＡ混合物である。以上をよく
混ぜた混合液を３０℃で６０分間反応して、蛋白質合成
と同時に糖鎖付加を誘導した。

【００５４】このように生産したＥＰＯも、実施例６の
方法で生産したＥＰＯと同じ構造をもつことが図４から
分かる。レーン１は翻訳後修飾関連細胞内マシーナリー
の添加なしで、無細胞蛋白質生産法で生産したＥＰＯ
を、レーン２は翻訳後修飾が導入された転写−翻訳非結
合無細胞翻訳後修飾蛋白質生産法で生産したＥＰＯを、
レーン３は翻訳後修飾が導入された転写−翻訳結合無細
胞翻訳後修飾蛋白質生産法で生産したＥＰＯを示す。つ
まり、実施例６の図３のレーン３のＥＰＯと本実施例の
図４のレーン２のＥＰＯが同じであることが分かる。

【００５５】上記の反応後、糖鎖付加反応のために添加
した膜成分を溶かすために、０．５％のトリトンＸ−１
００を反応液に添加し、常温で１０分間放置した後、合
成されたＥＰＯをＥＰＯと特異的に結合するモノクロー
ナル抗体を利用して、一般的な方法で分離した。ＥＰＯ
を含んでいる分離した溶液を、リフォルディング（ｒｅ
ｆｏｌｄｉｎｇ）溶液（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリ
ウム、２％（ｖ／ｖ）のラウリルサルコシン酸ナトリウ
ム、４０μＭの硫酸銅）に透析してリフォルディングし
た後、ＥＰＯを凍結乾燥した。

【００５６】分離したＥＰＯの生物学的活性は、実施例
６と同じ方法で測定した。転写−ｒＨｕＥＰＯと比較し
た結果、実施例６と同じく、インビトロ活性およびイン
ビボ活性がｒＨｕＥＰＯと類似していた。

【００５７】実施例８無細胞翻訳修飾蛋白質生産法と酵素的糖付加反応を結合
した方法によるＥＰＯの生産 実施例６と７に示された、転写−翻訳結合無細胞翻訳後
修飾蛋白質生産方および転写−翻訳非結合無細胞翻訳後
修飾蛋白質生産法による無細胞翻訳後修飾蛋白質生産反
応後、糖鎖付加反応のために添加した膜成分を溶かすた
めに、０．５％のトリトンＸ−１００を反応液に添加
し、常温で１０分間放置した。この反応液自体またはこ
れから分離したＥＰＯは、糖置換酵素の一種のトランス
−シアリダーゼで糖鎖末端にシアル酸をさらに付加でき
る。また、糖鎖末端のシアル酸の付加が増大するほど、
一般的に糖蛋白質の薬効が増加する。使用したトランス
−シアリダーゼは既に報告された方法により得た（Ｃａ
ｖａｌｌｅｓｃｏ，Ｒ． ａｎｄ Ｐｅｒｅｉｒａ，
Ｍ．Ｅ．Ａ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０：６
１７−６２５（１９８８）；Ｐｒｉｏｌｉ，Ｒ．Ｐ．，
ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：４
３８４−４３９１（１９９０））。

【００５８】シアル酸の提供者（ｄｏｎｏｒ）には、
０．２５μｍｏｌの２，３−シアリルラクトースまたは
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸を
使用し、無細胞翻訳後修飾蛋白質生産反応液１５μｌ
に、０．５μｇ／ｍｌのトランス−シアリダーゼ５μｌ
を加えた。精製した後、凍結乾燥したＥＰＯの場合は２
５−５０μｇのＥＰＯを０．２５μｍｏｌの２，３−シ
アリルラクトースまたはｐ−ニトロフェニル−α−Ｎ−
アセチルノイラミン酸が含まれた４０μｌのカコジル酸
／塩酸緩衝液（ｐＨ６．９）に溶かした後、ここに０．
５μｇ／ｍｌのトランス−シアリダーゼ１０μｌを加え
た。このように反応液を準備して、３０℃で１８時間酵
素処理した後、実施例６に使用したモノクローナル抗体
を利用した分離法で、シアル酸がさらに付加されたＥＰ
Ｏを分離した。

【００５９】分離したＥＰＯの糖鎖末端シアル酸の付加
の程度を調査するために、既に開示されているメチル化
分析法（Ｓｃｕｄｄｅｒ，Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６８：５８５−５９３
（１９８７））により分析し、生物学的活性は、実施例
６に提示された方法に従った。誘導化されたサンプル
は、０．２５ｍｍ×３０−ｍ融合（ｆｕｓｅｄ）シリカ
ＤＢ５ キャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）で準備された、ヒューレット パッカード社
の５８９０Ａキャピラリー ガス クロマトグラフィー
で分析された。そこでは、５分の保持時間の後、２℃／
分のレートで、１５０℃から２３０℃に温度上昇（ｒａ
ｍｐｅｄ）された。トランス−シアリダーゼで処理した
ＥＰＯは、シアル酸の含量が１０％増加し、生物学的活
性も１５％増加した。つまり、平均ＥＰＯ１ｍｏｌ当た
り、シアル酸が１１．９ｍｏｌから１３ｍｏｌに増加し
た。

【００６０】上記から、本発明は、効率的な矛盾の無
い、無細胞完全翻訳後修飾蛋白質生産法を提供すること
が証明された。また、本発明はここに記載された特定の
方法、示された方法および混合物の特定の使用のどれに
も限定されるものではない。前述の開示の権利におい
て、本発明分野の当業者は、その精神および観点から離
れること無しに、本発明の実行において、代用、交換ま
たは修正が可能であることは明らかであろう。

【００６１】

【発明の効果】以上のとおり、本発明は、無細胞蛋白質
生産と無細胞完全翻訳後修飾とを組み合わせた完全翻訳
後修飾蛋白質の生産方法を提供するものである。そのた
め、従来の無細胞蛋白質生産法では、部分的に翻訳後修
飾された蛋白質のみしか製造できなかったのに対し、本
発明では、翻訳後修飾のマシーナリーを採用することに
よって完全翻訳後修飾蛋白質が生産できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の方法により翻訳後修飾された
エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｔｉｎ；ＥＰ
Ｏ）と翻訳後修飾されていないＥＰＯをＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動法で分離してオートラジオグラム
で撮影した写真である。

【図２】図２は、通常の細胞培養法で生産したＥＰＯと
本発明の方法により翻訳後修飾が導入された無細胞生産
法で生産したＥＰＯのウエスタンブロッティング（ｗｅ
ｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）の結果である。

【図３】図３は、糖切断酵素で処理したＥＰＯをオート
ラジオグラムで撮影した写真である。

【図４】図４は、翻訳後修飾が導入された転写−翻訳非
結合無細胞蛋白質生産法で生産したＥＰＯと翻訳後修飾
が導入された転写−翻訳結合無細胞蛋白質生産法で生産
したＥＰＯをオートラジオグラムで撮影した写真であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サン ヒョン カン 大韓民国、ソウル、ガナク−グ、ボンチョ ン ８−ドン、1536−２ (72)発明者 テク ジン カン 大韓民国、ソウル、ガナク−グ、シリム− ドン、415−19 (72)発明者 ジ ヒョン ウー 大韓民国、インチョン、ブピョン−グ、ブ ガエ ２−ドン、106−37 (72)発明者 サン キル リー 大韓民国、ソウル、ソチョ−グ、バンポボ ン−ドン、バンポ アパート、20−109 (72)発明者 スン ウー チョ 大韓民国、ソウル、マポ−グ、ソギョ−ド ン、347−13 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DA44 FB01 FB03 FB05 FB09 4B024 AA20 BA21 CA04 CA12 HA01 HA03 HA06 HA15 4B064 AG18 CA21 CC24 CD21 DA01

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 完全翻訳後修飾蛋白質（ｃｏｍｐｌｅｔ
   ｅｌｙ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉｏｎａｌ ｍｏｄ
   ｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産するための方法に
   おいて、（ａ）目的蛋白質の遺伝情報を持つＤＮＡ（Ｄ
   ＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を細胞抽出物に添加する工
   程、（ｂ）核酸（リボヌクレオチド三リン酸塩；ｒｉｂ
   ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
   ｓ）を上記抽出物に添加する工程、および（ｃ）完全翻
   訳後修飾蛋白質の製造を刺激するのに十分な量の、小胞
   体（ＥＲ）／ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕ
   ｓ）又は小胞体／ゴルジ体／細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍ
   ｅｍｂｒａｎｅ）、あるいはこれらに加えて他の細胞小
   器官（ｏｒｇａｎｅｌｌｓ）のような翻訳後修飾マシー
   ナリー（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を上記抽出物に添加する
   工程からなる結合無細胞完全翻訳後修飾蛋白質合成法
   （ｃｏｕｐｌｅｄ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｃｏｍｐｌｅ
   ｔｅｌｙ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉｏｎａｌ ｍｏ
   ｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉ
   ｓ）、または（ａ’）目的蛋白質の遺伝情報を持つＲＮ
   Ａを細胞抽出物に添加する工程、および（ｂ’）完全翻
   訳後修飾蛋白質の製造を刺激するのに十分な量の、小胞
   体（ＥＲ）／ゴルジ体又は小胞体／ゴルジ体／細胞膜、
   あるいはこれらに加えて他の細胞小器官のような翻訳後
   修飾マシーナリー（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を上記抽出物
   に添加する工程からなる非結合無細胞完全翻訳後修飾蛋
   白質合成法（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ
   ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌｔｉ
   ｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎ
   ｔｈｅｓｉｓ）を経由することを特徴とする完全翻訳後
   修飾蛋白質の生産方法。
2. 【請求項２】 上記無細胞蛋白質合成法における細胞抽
   出物を製造するため細胞源（ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ）
   と上記翻訳後修飾マシーナリーの細胞源が、同一である
   か又は異なることを特徴とする請求項１記載の生産方
   法。
3. 【請求項３】 上記完全翻訳後修飾が糖鎖付加反応であ
   ることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
4. 【請求項４】 上記蛋白質がＥＰＯであることを特徴と
   する請求項１記載の生産方法。
5. 【請求項５】 上記翻訳後修飾マシーナリーが、組織細
   胞及び/又は培養した株細胞（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅ
   ｌｌ ｌｉｎｅｓ）から抽出されたものであることを特
   徴とする請求項１記載の生産方法。
6. 【請求項６】 糖鎖付加マシーナリーを含有しても良い
   上記翻訳後修飾マシーナリーが、糖鎖付加反応酵素の発
   現レベルの向上及び/又は糖ヌクレオチド貯蔵物（ｐｏ
   ｏｌｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）
   の濃縮のために、遺伝子工学的に培養された株細胞から
   製造されることを特徴とする請求項５記載の生産方法。
7. 【請求項７】 上記生産した糖蛋白質が、糖鎖構造変更
   関連酵素を用いた糖付加反応及び/又は糖切断反応及び/
   又は糖置換反応により追加的に修飾されることを特徴と
   する請求項４記載の生産方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方
   法で生産された翻訳後修飾蛋白質を含有することを特徴
   とする遺伝子機能を診断するためのキット。