JP2002238386A - 植物の中位鎖チオエステラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なチオエステラーゼによるラウレートが
嵩化された油などの提供。 【解決手段】 中位鎖脂肪酸に特異的なチオエステラー
ゼを用いて中位脂肪酸、例えばラウレート、が嵩化され
た脂肪酸又はそれを含む油を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景 いくつかの植物の族の構成員は特殊化された貯蔵組織の
中に大量の主として中位鎖（Ｃ８−Ｃ14）のトリアシル
グリセロール類を合成し、それらのあるものは重要な食
物または工業用の中位鎖脂肪酸の生産のために収穫され
る（F. D. Gunstone, The Lipid Handbook（Chapman &
Hall, ニューヨーク，1986）pp. 55−112)。例えば、ラ
ウレート（Ｃ12：０）は、現在、熱帯の樹木の種子から
毎年百万トンに近づく割合で抽出されている (Battey
ら、Tibtech) (1989)71： 122−125)。

【０００２】偏在する長鎖脂肪酸の合成が特殊化された
中位鎖の生産に切り替えられるメカニズムは、多年にわ
たって考察の主題であった(Harwood, Ann. Rev. Plant.
Mol. Biology (1988)39： 101−138)。最近、Pollard
ら（Arch. of Biochem. andBiophys.(1991) 284：１−
７）は、カルフォルニア・ゲッケイジュ、Umbellularia
californica, の発育する脂肪種子の中に中位鎖アシル
−ACP チオエステラーゼ活性を同定した。この活性は、
発育する子葉がラウロイル（12：０）およびカプロイル
（10：０）の脂肪酸とのトリグリセリドのほぼ独占的な
生産を行うときにのみ、現れる。

【０００３】この研究は植物における中位鎖脂肪酸の合
成についてのメカニズムの最初の証拠を提供した：延長
の間、脂肪酸はアシル−キャリアータンパク質(ACP) 。
チオエステルが早期に加水分解される場合、延長は中位
鎖脂肪酸の解放により停止される。ゲッケイジュ(Bay）
チオエステラーゼは引き続いてDaviesら（Arch. Bioche
m. Biophys.(1991)290：37−45）により精製され、これ
は対応するcDNAのクローニングを可能としそして関係す
るクローンを得るためにかつ植物のトリグリセリドを変
性するためにそれを使用されることが記載された(WO 91
／1421) 。

【０００４】発明の要約 本発明によれば、植物の中位鎖チオエステラーゼのそれ
以上の性質および使用が提供される。第１の態様におい
て、本発明は植物の種子およびその種子から誘導化され
た油に関し、前記油は通常ラウレートを含有しないが、
ラウレートを含有することが今回発見された。 1.0％程
度に少ないラウレートを有する種子は、種子のトリグリ
セリド油中に自然にラウレートを貯蔵しない野生型植物
種と有意に異なる。最小15％より多いラウレート、33％
のラウレートまたは50％のラウレートを有する種子を以
後考える。少なくとも２つの脂肪酸ラウロイルアシル基
をもつ種子の中の、あるいは種子から誘導化されたトリ
グリセリドを同様に考える。 1.0％より多いラウレート
を含有するブラシカ (Brassica) の種子およびこのよう
な種子から誘導化された油はことに好ましい。

【０００５】なお異なる態様において、本発明は特定の
中位鎖チオエステラーゼの配列、ゲッケイジュ(Bay) の
中位鎖チオエステラーゼのDNA 配列および宿主細胞の中
のこの酸素の発現のためのDNA 構成体に関する。とく
に、この配列について従来報告された開始部位より上流
の構造遺伝子配列の開始部位を記載する。

【０００６】本発明の他の面は、植物の中位鎖チオエス
テラーゼを使用する方法に関する。中位鎖脂肪酸を生産
する細菌細胞の中の植物の中位鎖チオエステラーゼの発
現が提供される。この方法により、ある量のこのような
脂肪酸を細菌から結晶質の形態で収穫することができ
る。この出願において、ゲッケイジュ・チオエステラー
ゼの使用を例示する；fadD大腸菌 (Escherichia coli)
突然変異株はとくに好ましい。さらに、改良されたラウ
レートの生産のための温度範囲を記載する。

【０００７】植物の中位鎖チオエステラーゼを使用して
不飽和中位鎖チオエステラーゼを生産する方法を、ま
た、ここに記載する。ある量の飽和中位鎖アシル−ACP
脂肪酸をもっぱら生産しかつトリグリセリドの中に組み
込む植物においてさえ、チオエステラーゼは同一長さの
不飽和脂肪酸に対して活性を有することができることが
今回発見された。

【０００８】発明の詳細な説明 中位鎖植物チオエステラーゼを包含する植物のチオエス
テラーゼは、WO91／16421 (PCT／US91／02960)およびUS
SN07／824, 247（これらの開示の全体をここに引用によ
って加える) に記載されている。本発明の植物の中位鎖
チオエステラーゼは、植物酵素の反応の条件下にＣ８−
Ｃ14脂肪酸アシル−ACP 基質から１種または２種以上の
遊離脂肪酸の生産を触媒する能力を証明する植物源から
得ることができるアミノ酸、ペプチド、ポリペプチドま
たはタンパク質の任意の配列を包含する。「酵素反応の
条件」とは、酵素を機能化させる環境（すなわち、温
度、pH、阻害物質の欠如のような因子）において、任意
の必要な条件が利用可能であることを意味する。

【０００９】植物のチオエステラーゼは、ここにおいて
かつ関係する源から提供される、特定の例示する配列か
ら得ることができる。例えば、クヘア (Cuphea) 属の中
のいくつかの種、例えば、プロクンベンス (procumben
s) 、ルテア (lutea)、フッケリアナ (hookeriana) 、
ハイソピフォリア (hyssopifolia) 、ライチイ (wright
ii) およびインフラタ (inflata)は、それらの種子の中
に中位鎖脂肪酸を含有するトリグリセリドを蓄積する。
中位鎖脂肪酸の他の天然の植物源は、クスノキ科(Laura
ceae)の族、例えば、ピサ (Pisa)(Actinodophne hooker
i) およびゲッケイジュ (Laurus nobilis) の種子であ
る。他の植物源は、ニレ科 (Ulmaceae)(ニレ) 、ニクズ
ク科 (Myristicaceae)、ニガキ科 (Simarubaceae) 、ボ
チシアセアエ (Vochysiaceae) およびニレ科 (Salvador
aceae)、およびＣ14脂肪酸を蓄積すると報告されたエリ
スマ (Erisma) 、ピクランニア (Picramnia)およびビロ
ラ (Virola) の雨林の種を包含する。

【００１０】前述したように、その中に中位鎖脂肪酸が
有意に存在するタンパク質は、天然に誘導化された中位
鎖の好ましい植物のチオエステラーゼを得るための好ま
しい候補である。しかしながら、また、中位鎖脂肪酸が
その中に有意に存在しない他の植物源を他の酵素源とし
て容易にスクリーニングできることを理解すべきであ
る。さらに、内因性中位鎖の好ましい植物のチオエステ
ラーゼの間およびより長いおよび／またはより短い鎖の
好ましい植物のチオエステラーゼの間の比較は、合成の
中位鎖の好ましい植物のチオエステラーゼならびに前述
のものをつくるためのタンパク質のモデル化または他の
修飾のための見識を生ずることができる。

【００１１】当業者は容易に認識するように、抗体、核
酸のプローブ (DNA およびRNA)などを調製し、そして種
々の植物源からの「相同的」または「関係する」チオエ
ステラーゼをスクリーニングしそして回収することがで
きる。免疫学的クローニング法のために、モノクローナ
ルまたはポリクローナルの抗体調製物を利用する。検出
のために、抗体を放射線で標識化するか、あるいは商業
的に入手可能な種々の第２抗体／酵素接合体系の任意の
１つを使用して抗体を標識化する。入手可能な抗体の検
出系のいくつかの例は、Oberfilder（Focus(1989) BRL
Life Technolgies, Inc.,11：１−５）により記載され
ている。

【００１２】配列の同一性が存在するとき、相同配列が
見いだされ、この同一性は配列の情報、核酸またはアミ
ノ酸を比較するか、あるいは既知のチオエステラーゼと
候補源との間のハイブリダイゼーション反応により決定
することができる。保存的変化、例えば、 Glu／Asp, V
al／Ile, Ser／Thr, Arg／Lys および Gln／Asn をまた
アミノ酸配列の相同性の決定において考慮することがで
きる。アミノ酸配列は２つの完全な成熟タンパク質の間
の25％程度に少ない配列の同一性により相同性であると
考えられる。（一般に、Doolttle, R.F., OF URFS and
ORFS (University Science Books、カリフォルニア州、
1986を参照のこと、）。典型的には、存在しうるが、な
お関係すると考えられる欠失を排除する、問題の所定の
植物のチオエステラーゼと標的配列との間で、長い核酸
配列は50〜60％程度に少ない配列の同一性、より好まし
くは少なくとも約70％の配列の同一性を示すことができ
る。

【００１３】問題の候補の植物源から調製されたゲノム
または他の適当なライブラリーを植物のチオエステラー
ゼからの保存された配列でプロービングして、相同的に
関係する配列を同定することができる。ことに高度に保
存された配列を同定できるとき、より短いプローブはポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR) のためにしばしばとくに有用
である。より長い核酸断片 (＞100bp)をプローブとして
使用するとき、ことに完全なまたは大きいcDNA配列を使
用するとき、低いストリンジェンシイ (例えば、プロー
ブの融点より40〜50℃低い) でスクリーニングして、20
〜50％の偏りをもつ標的試料、すなわち、相同配列から
シグナルを得る。（Beltz ら、Methods in Enzymology
(1983) 100： 266−285 を参照のこと）。

【００１４】当業者に知られている方法を使用して、ト
ランスジェニック植物の生産のための植物細胞を包含す
る、酵素の発現のために選択した宿主細胞の中に導入す
ることができる構成体の中に、植物の中位鎖チオエステ
ラーゼをコードするDNA 配列を挿入することができる。
こうして、タンパク質の宿主細胞は原核生物および真核
生物の両者の細胞を包含する。宿主細胞は単細胞である
か、あるいは意図する用途に依存して多細胞の分化した
または未分化の生物の中に見いだすことができる。本発
明の細胞は、その中に存在する野生型細胞に対して外来
の植物のチオエステラーゼを有することによって、例え
ば、その中に植物のチオエステラーゼをコードする組み
換え核酸の構成体を有することによって区別することが
できる。

【００１５】また、宿主に依存して、ウイルス、プラス
ミドまたは染色体の遺伝子などを包含する調節領域は変
化するであろう。原核生物または真核生物の微生物、と
くに単細胞の宿主の中の発現のために、広範な種類の構
成的または調節可能なプロモーターを使用することがで
きる。記載した転写開始領域の中に、細菌または酵母の
宿主、例えば、大腸菌 (E.coli) 、枯草菌 (B.subtili
s) 、サッカロミセス・セレビシアエ (Saccharomyces c
erevisiae) からの、遺伝子、例えば、β−ガラクトシ
ダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥなどを包
含する、領域が存在する。

【００１６】大部分について、植物の宿主細胞の中の発
現を望むとき、構成体は植物の中で機能的である調節領
域（プロモーターおよび終結領域）を含むであろう。植
物のチオエステラーゼまたはその機能的断片をコードす
るオープンリーディングフレームは、その５末端におい
て、転写開始調節領域、例えば、チオエステラーゼ構造
遺伝子より上流の５′に天然に見いだされる野生型配列
に接合されるであろう。広範な種類の構成的または調節
可能な、例えば、誘発可能な、構造遺伝子機能の転写を
提供する、多数の他の転写開始領域が入手可能である。
植物のために使用する転写開始領域には、構造遺伝子、
例えば、CaMV35S およびノパリンまたはマンノパインシ
ンターゼに関連する領域、あるいはナピン、ACP ポリメ
ラーゼなどに関連する。このような構造遺伝子に対応す
る転写／転写開始領域は、それぞれの開始コドンに対し
て直ぐ５′上流に見いだされる。

【００１７】特定のプロモーター、例えば、問題の植物
の宿主に対して天然のプロモーターまたは修飾されたプ
ロモーター、すなわち、１つの遺伝子源から誘導化され
た転写開始領域および異なる遺伝子源から誘導化された
転写開始領域を有するプロモーター、問題の植物のチオ
エステラーゼをコードする配列を含むプロモーター、ま
たは増強されたプロモーター、例えば、二重35S CaMVプ
ロモーターを望む場合、配列は標準の技術を使用して一
緒に接合することができる。植物の中の中位鎖チオエス
テラーゼの発現を望む大部分の応用のために、種子特異
的プロモーターの使用は好ましい。細菌または異種植物
細胞の中で発現させるとき、植物の中位鎖チオエステラ
ーゼは生物学的に活性であることが今回観察された。

【００１８】とくに、通常中位鎖脂肪酸を遊離脂肪酸と
して、あるいはトリグリセリド分子の中に組み込んで、
含有しない植物の種子は、このような中位鎖脂肪酸を含
有することを発見することができることが今回見られ
た。中位鎖脂肪酸を通常含有しない種子とは、全体の脂
肪酸の中の 0.1モル％より少ない所定の中位鎖脂肪酸を
含有する種子を意味する。こうして、全体の脂肪酸の中
の最小 1.0モル％の所定の中位鎖脂肪酸を含有する任意
の植物の種子は有意に修飾される。「全体の脂肪酸の中
のモル％」は、全体の脂肪酸含量のうちの中位鎖脂肪酸
の相対比を記載するために使用する。これらの数値は必
要に応じて重量％に変換することができる。

【００１９】全体の脂肪酸の 1.0モル％のラウレートか
ら全体の脂肪酸の50.0モル％のラウレートまでの中位鎖
脂肪酸の含量を測定した。植物の種子の全体の脂肪酸
は、胚、内胚乳および種子の外穀脂質を包含する。さら
に、中位鎖脂肪酸を含有する種子において、全体の脂肪
酸の中のラウレートの含量はトリアシルグリセリドのラ
ウレート含量に直接対応することが認められる。こうし
て、全体の脂肪酸の含量を同様によく「全体の抽出可能
な油」として考えることが適当である。

【００２０】中位鎖脂肪酸を組み込んだトリアシルグリ
セリドに関すると、グリセロールの主鎖のどの位置が関
係するかは明らかではない。しかしながら、測定した中
位鎖脂肪酸の高いレベルに基づくと、トリアシルグリセ
リドの少なくとも２つの位置が関係することが明らかで
ある。

【００２１】アラビドプシス(Arabidopsis) およびブラ
シカ (Brassica) の種子を含有する中位鎖をここにおい
て例示する。とくに、種子特異的プロモーターの調節コ
ントロール下の異種中位鎖チオエステラーゼの構造遺伝
子の発現の結果として、新規な脂肪酸の組成を含有する
トランスジェニックアラビドプシス(Arabidopsis) およ
びブラシカ (Brassica) の種子を記載する。カルフォル
ニア・ゲッケイジュ (Umbellularia californica)(ゲッ
ケイジュ) から得られる中位鎖チオエステラーゼをコー
ドするDNA 配列の発現により、ラウレートはこれらのそ
れぞれの種子の抽出可能な油の中に今回発見された。ラ
ウレートの存在が増加するとき、オレイン酸 (18：１)
の対応する減少が観察される。ラウレートの増加に伴う
他の脂肪酸組成の変化はミリステート (14：０) の増加
および、より少ない程度に、リノールネート (18：３)
およびパルミテート (16：０) の量の減少を含む。

【００２２】アラビドプシス (Arabidopsis)において、
100個の種子のプールの分析は形質転換された植物の同
定に導き、形質転換された植物の種子は、対照の種子に
おいて測定されたほぼ０％のラウレートに比較して、2
3.5モル％までのラウレートを含有した。Ｔ１植物（も
との形質転換体）からの成熟種子であるＴ２種子は、分
離する集団を表すので、Ｔ２種子から成長した第２世代
の植物（Ｔ２）からの種子において、なおより高いレベ
ルのラウレートが期待されるであろう。

【００２３】ゲッケイジュ・チオエステラーゼの遺伝子
を発現するトランスジェニックブラシカ (Brassica) 種
子 (25〜30個の種子のプール) の分析は、それらの種子
が37モル％までのラウレートを含有する形質転換体の同
定を与える。これらの植物の単一および半分の種子のTA
G の分析は、分離する種子の集団の中のラウレートのレ
ベルが少なくとも50モル％程度に高いことを証明する。
半分の種子のTAG の分析は、最高のラウレートを生産す
るＴ２種子の同定を可能とし、そして引き続いて残留す
る種子の部分は発芽して所望の高いラウレートの種子を
もつ第２世代の植物を生産することを明らかにする。

【００２４】全体の脂肪酸の中の中位鎖脂肪酸のモル％
と遺伝子のコピー数との間の相関関係が観察された。し
たがって、測定された全体の脂肪酸の中の中位鎖脂肪酸
の最小のモル％はほぼ50.0モル％であるが、より多くの
遺伝子をさらに挿入することによって中位鎖脂肪酸のレ
ベルを増加することができる。このような技術は遺伝子
操作または植物の育種法を包含することができる。

【００２５】中位鎖脂肪酸を増加するいくつかの遺伝子
操作のアプローチは、植物のチオエステラーゼの構造遺
伝子をコードする追加のDNA 配列の細胞の中への挿入、
より高いmRNAのコピー数を証明する転写開始領域の使
用、あるいは、例えば、基質の利用可能性によりよく対
応する改良されたタイミングの特異性のプロフィルを包
含する。例えば、ブラシカ (Brassica) 植物の種子の中
の、ナピンプロモーターの調節コントロール下の、ラウ
レート生産の時間過程の分析は、中位鎖チオエステラー
ゼの出現が貯蔵油の合成の開始よりほぼ５〜７日間遅れ
ることを証明する。計算により、中位鎖チオエステラー
ゼが有意の衝撃をなす前に、全体の脂肪酸の約20％が既
に合成されていることが示される。こうして、チオエス
テラーゼ遺伝子が胚の発育のより早い段階で発現される
場合、実質的により高いラウレートのレベル (10〜20
％) を得ることができるであろう。

【００２６】さらに、翻訳の効率を増加する手段は、中
位鎖チオエステラーゼ遺伝子の完全な構造のコーディン
グ配列の使用を包含することができる。こうして、図３
〜図４に示すゲッケイジュ・チオエステラーゼのコード
配列の完全な５′領域はラウレートの生産を改良するこ
とができる。あるいは、中位鎖チオエステラーゼが異常
なトランシットペプチド配列、すなわち、色素体チラコ
イドのターゲッティングとの類似性を示すもの、例え
ば、ゲッケイジュ・チオエステラーゼとともに見いださ
れるものを有する場合、いっそう典型的な植物トランシ
ット、例えば、ベニバナの中に見いだされるもの（図14
〜図24）、アシルキャリアータンパク質またはssu の使
用を置換することができる。

【００２７】本発明は、また、植物細胞を包含する宿主
細胞の中で不飽和脂肪酸を生産する機会を提供する。植
物の中位鎖チオエステラーゼは、不飽和中位鎖脂肪酸を
もたない植物からのものでさえ、このような基質に対し
て活性である。それゆえ、植物の中位鎖チオエステラー
ゼを使用して不飽和中位鎖脂肪酸を提供することができ
る。

【００２８】例えば、大腸菌 (E.coli) の中のゲッケイ
ジュ・チオエステラーゼの発現は、ラウレート (Ｃ12：
０）、ミリステート (Ｃ14：０) およびまた中位鎖脂肪
酸の不飽和種 (Ｃ12：１およびＣ14：１）の生産を生ず
る。大腸菌 (E.coli) の中の不飽和脂肪酸の生産は、β
−ヒドロキシデカノイルチオエステルデヒドラーゼによ
り触媒される。このデヒドラーゼの配列は発表され（Cr
onanら、J.Biol.Chem.(1988) 263：4641−4646）そし
て、こうして、中位鎖チオエステラーゼと関連して使用
するために、植物細胞を包含する問題の宿主細胞の中に
挿入することができる。

【００２９】植物の中位鎖チオエステラーゼは細菌細
胞、とくに脂肪酸を効率よく分解することができない細
菌細胞の中で発現するとき、豊富な中位鎖脂肪酸を生産
し、そして細胞から収獲することができる。ある場合に
おいて、中位鎖脂肪酸は結晶を形成し、これらの結晶は
細菌細胞から容易に分離することができる。アシル−Co
A シンターゼを欠如する細菌の突然変異株、例えば、大
腸菌 (E.coli) fadDおよびfadEを使用することができ
る。fadD突然変異株を使用する研究において、ベクター
の形質転換された対照に関するfadDゲッケイジュ・ チ
オエステラーゼ形質転換体の成長は37℃において非常に
遅延し、そして25〜30℃においてそれほど遅延しない。

【００３０】より低い温度で成長する液体培養物は沈澱
を蓄積し、そしてペトリ皿上に形成したコロニーは25℃
において大量のラウレートの結晶をことに表面に堆積し
た。これらの堆積物は、FAB 質量スペクトルで同定した
とき、ラウレートとして同定された。ガスクロマトグラ
フィーによる分離および定量後、ペトリ皿上にfadD−ゲ
ッケイジュ・チオエステラーゼにより堆積されたラウレ
ート結晶は、生産する細菌の合計の乾燥重量の約30〜10
0 ％を表すことが推定される。

【００３１】中位鎖チオエステラーゼの発現を植物細胞
の中で望むとき、問題の種々の植物は次のものを包含す
るが、これらに限定されない：菜種 (CanolaおよびHigh
Erucic Acid変種) 、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クヘ
ア (Cuphea) 、ダイズ、ナンキンマメ、ココナツおよび
ギネアアブラヤシおよびトウモロコシ。組み換え構成体
を宿主細胞の中に導入する方法に依存して、他のDNA 配
列を必要とすることがある。重要なことには、本発明は
双子葉および単子葉の種に同様によく適用することがで
き、そして新しいおよび／または改良された形質転換お
よび調節の技術に容易に適用することができる。

【００３２】いずれの場合においても、形質転換の方法
は本発明に対して臨界的ではない；植物の形質転換の種
々の方法を現在利用可能である。より新しい方法を利用
して作物を形質転換することができるが、それらは以後
において直接適用することができる。例えば、癌腫菌(A
grobacterium) の感染に対して自然に感受性である多数
の植物種は、癌腫菌(Agrobacterium) 仲介形質転換の三
部分または二部分ベクターの方法により首尾よく形質転
換することができる。さらに、種々の単子葉および双子
葉の植物種の形質転換を可能とする、マイクロインジェ
クション、DNA粒子の衝撃、エレクトロポレイションの
技術が開発された。次の実施例によって、本発明をさら
に説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。

【００３３】

【実施例】実施例１ − アシル−ACP チオエステラー
ゼのcDNA配列 全長のゲッケイジュ中位鎖チオエステラーゼcDNAクロー
ン、pCGN3822、（３Ａ−17) の配列は、図１〜図２に表
されている。位置 145−147 におけるATG コドンで開始
するゲッケイジュ・チオエステラーゼの翻訳されたアミ
ノ酸配列は図３〜図６に示されている。このATG は、植
物の翻訳開始のルールに合致し、したがってin vivo で
利用される開始コドンであると思われる配列により取り
囲まれている。開始のためにbp145 におけるATG を使用
して、 382アミノ酸のポリペプチドをゲッケイジュ・チ
オエステラーゼmRNAから翻訳することができる。ゲッケ
イジュ・チオエステラーゼ遺伝子の第２クラスのDNA 配
列は、図８〜図13に記載されている。

【００３４】発育する種子から単離された、成熟ゲッケ
イジュ・チオエステラーゼのＮ−末端配列は、誘導化さ
れたタンパク質配列のアミノ酸残基84において開始す
る。したがって、Ｎ−末端の83アミノ酸はトランシット
ペプチドの配列を表す。この配列は、通常40〜100 アミ
ノ酸長さの間である、色素体トランシットペプチドに共
通の特徴を有する（Keegstraら、Ann. Rev. Plant. Phy
siol. and Plant Mol. Biology (1989) 40 ： 471−50
1) 。このトランシットペプチド領域のヒドロパシーの
プロットは、トランシット配列の各末端に疎水性ドメイ
ンを明らかにする。他のトランシットペプチドの配列は
同様な疎水性Ｎ−末端ドメインを含有することが示され
た。このＮ−末端ドメインの意味は知られていないが、
ある種の実験が示唆するように、脂質仲介結合はあるタ
ンパク質の色素体の取り入れのために重要である（Frie
dmanおよびKeegstra，Plant Physiol.(1989)89： 993−
999)。

【００３５】Ｃ−末端ドメインに関すると、既知の葉緑
体のストロマのタンパク質のトランシットペプチドのヒ
ドロパシーのプロットの比較（Keegstraら、前掲) によ
り、これらのトランシットペプチドはＣ−末端ドメイン
に疎水性ドメインをもたないことが示される。しかしな
がら、葉緑体のチラコイドのルーメンに予定されたプレ
プロタンパク質は、それらのトランシットペプチドのＣ
−末端にアラニンに富んだ疎水性ドメインを有する（Sm
eekensら、TIBS (1990)15：73−76）。ゲッケイジュ・
チオエステラーゼのトランシット配列の中のこのような
ドメインの存在は、それがチラコイド同等体のルーメン
に、あるいは膜間の空間にこの酵素をターゲッティング
する二重ドメインのトランシットペプチドを有すること
を示唆する。これは予期せざることである。

【００３６】なぜなら、アシル−ACP はストロマにおい
て検出されたからである（Ohlroggeら、Proc. Natl. Ac
ad．Sci. (1979) 76：1194−1198）。ゲッケイジュ・チ
オエステラーゼのプレプロタンパク質の中のこのような
ドメインの存在について別の説明は、それが精製したと
き切断され、人工的Ｎ−末端の配列の決定に導く成熟タ
ンパク質の膜のアンカーを表すことができるということ
である。次いで、成熟チオエステラーゼタンパク質のin
vivo Ｎ−末端は、アミノ酸配列の分析により示される
よりさらに上流の位置に存在するであろう。

【００３７】誘導されたアミノ酸配列を使用して遺伝子
バンクのサーチは、脊椎動物の中位鎖アシル−ACP チオ
エステラーゼIIを包含する、いかなるエントリートの有
意な合致も明らかにしない（Naggert ら、Biochem. J.
(1987) 243： 597−601)。また、ゲッケイジュ・チオエ
ステラーゼは脂肪酸シンターゼチオエステラーゼ活性部
位のモチーフに類似する配列を含有しない (Aitken,199
0,Identification ofProtein Concensus Sequence, Act
ive Site Motifs, Phosphorylation and other Post-tr
anslational Modification (Ellis Horwood, チチェス
ター，ウェストサセックス, 英国, pp. 40−147)。

【００３８】比較のために、長鎖アシル−ACP チオエス
テラーゼの単離および配列を提供する。ベニバナの34お
よび40kDのチオエステラーゼのタンパク質の臭化シアン
ペプチド配列からの配列の情報を分析して、ベニバナ・
チオエステラーゼのペプチド地図を得る。これらのペプ
チドとゲッケイジュ・チオエステラーゼのアミノ酸配列
との相同性の比較は、ベニバナ・チオエステラーゼのペ
プチド地図を確証する。縮重オリゴヌクレオチドのプラ
イマーをベニバナ・チオエステラーゼのペプチドの配列
のアミノ酸配列から設計し、そしてポリメラーゼ連鎖反
応 (PCR)においてプライマーとして使用してベニバナ・
チオエステラーゼ遺伝子の断片を得る。

【００３９】本発明のチオエステラーゼのPCR 遺伝子生
産物をゲル精製し、そしてプローブとして使用してベニ
バナ胚cDNAライブラリーをスクリーニングする。６クロ
ーンを単離する；制限マッピングはそれらが２つの遺伝
子のクラスの中に入ることを示す。各クラスからの代表
的なもの、pCGN3264 (２−１）およびpCGN3265 (５−
２）のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列は、
図14〜図19および図20〜図24に表されている。Ｎ−末端
アミノ酸配列の情報に基づいて、成熟ベニバナ・チオエ
ステラーゼのアミノ末端を図14〜図19および図20〜図24
における翻訳されたアミノ酸配列のアミノ酸61のアラニ
ン残基に帰属させる。

【００４０】２つのアシル−ACP チオエステラーゼのcD
NAクローンの推定されたアミノ酸配列の比較は、成熟タ
ンパク質が82％であるが、対応するDNA 配列が80％の同
一性を共有することを示す。２つのタンパク質の等電点
のコンピューターの推定はかなり異なる。２−１により
コードされる成熟タンパク質について推定されたpIは5.
8であるが、５−２によりコードされるタンパク質のそ
れは 8.1である。

【００４１】ベニバナ・チオエステラーゼの精製の結果
は、ベニバナ・チオエステラーゼの潜在的にいくつかの
形態が存在することを示した。２つの明確な分子量のク
ラス、ならびにクロマトフォーカシングからの２つの別
々のピーク分画が観察された。両者の分子量種は各活性
ピークの中に表される。しかしながら、各形態のタンパ
ク質配列の分析は、これらのイソフォームが同様に単一
のタンパク質の生産物であることを示す。各種のＮ−末
端の配列は同一であり、そして内部のCNBr断片のいかな
るもののタンパク質配列においても差が観察されなかっ
た。異なる分子量種は、in vitroの処理によるか、ある
いは抽出または精製の間の、多分酸沈澱段階の間の減成
の結果であることがある。

【００４２】ペプチドの配列の証拠はベニバナ・チオエ
ステラーゼの精製において観察されたイソフォームのす
べてを同一タンパク質から誘導化することができること
を示すが、cDNAの２つの高度に相同性であるが、明確な
クラスがベニバナ胚cDNAライブラリーから単離された。
両者のクラスは、大腸菌 (E.coli) の中の発現に基づく
Ｃ18：１基質に対する優先の活性を有するアシル−ACP
チオエステラーゼをコードする。しかしながら、ペプチ
ド配列のデータは２−１コードされたタンパク質からの
翻訳されたアミノ酸配列のみと合致し (アミノ酸の配列
決定のための小さい不一致を許容する) 、そして５−２
遺伝子によりコードされるチオエステラーゼに独特に相
当するペプチドは発見されなかった。

【００４３】多分、５−２によりコードされるタンパク
質は量が少なく、そして配列決定について考慮すべき十
分に優勢のバンドではなかった。あるいは、５−２によ
りコードされるタンパク質は消化された試料の小さい成
分であることがあるので、その結果SDS-PAGEおよびエレ
クトロブロッエィング後に検出するために十分な量でCN
Br断片が存在しなかった。２つのタンパク質生産物の予
測されたpIの検査は５−２が２−１より非常にいっそう
塩基性のタンパク質をコードすることを示すので、５−
２に相当するタンパク質は精製における沈澱工程の間に
排除されることがある。

【００４４】実施例２ − 大腸菌 (E.coli) の中のア
シル−ACP チオエステラーゼの発現実施例２Ａ 大腸菌 (E.coli) の中のゲッケイジュ・チオエステラー
ゼのタンパク質の発現を記載する。切頭ゲッケイジュ
(1200bp) cDNAを大腸菌 (E.coli) 宿主細胞の中で30kD
のタンパク質として発現させ、そしてcDNA断片が形質転
換体に増加したＣ12アシル−ACP チオエステラーゼ活性
を与えることを証明するデータを提供する。

【００４５】pET3a ベクター（Rosenberg ら、Gene (19
87) 56： 125−135)を、大腸菌 (E.coli) BL21株（Stud
ier およびMoffat, J.Mol. Biol.(1986) 198： 113−13
0)宿主の中でこの研究のために使用した。pET3a ベクタ
ーはプロモーターおよびバクテリオファージＴ７の33bp
の５′リーディングフレームを含有する。Ｔ７ポリメラ
ーゼは、大腸菌 (E.coli) BL21 (DE3)株の中に見いださ
れるイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトプラノシド
(IPTG) 誘発可能なlac UV5 プロモーターの調節コント
ロール下にある。こうして、pET3a で形質転換された大
腸菌 (E.coli) BL21 (DE3)へIPTGを添加することによっ
て、Ｔ７プロモーターは活性化されるであろう。

【００４６】BamHI／EcoRI 断片を欠失し、そしてチオ
エステラーゼ配列の置換により、リーディングフレーム
で融合された第１図切頭cDNAを含有する構成体を調製す
る。大腸菌 (E.coli) をチオエステラーゼ(pET3a−TH1
0) を含有するpET3a 構成体および対照として非修飾pET
3a で形質転換する。大腸菌 (E.coli) を37℃において
液体培地の中で成長させ、そして発現を１mM IPTG の添
加により誘発させる。１時間インキュベーションした
後、細胞を遠心により収獲し、アッセイ緩衝液の中に再
懸濁させ、そして超音波処理により溶解する。細胞の破
片をそれ以上の遠心により除去し、そして上澄み液を活
性のアッセイにおいて、Pollard ら、Arch.Biochem. &
Biophys.(1991) 281： 306−312 に記載されているよう
に使用した。

【００４７】

【表１】

【００４８】これらの結果が示すように、対照大腸菌
（E.coli) 細胞のリゼイトは、長鎖基質を参照して、試
験したすべてのアシル−ACP 基質に対して加水分解活性
を含有する。 pET3a−TH10の結果を対照の結果と比較す
ると、明らかなように、基質の好ましさのパターンは異
なる。形質転換体のリゼイトは、対照のリゼイトと比較
したとき、他の基質に関して12：０−ACP との大きく増
加した活性を示す。この増加した12：０−ACP 活性は、
このcDNA断片が大腸菌（E.coli) 細胞の中で活性酵素を
生産するために十分なゲッケイジュ12：０−ACP チオエ
ステラーゼ遺伝子を含んでなることを証明する。

【００４９】さらに、全体の成熟ゲッケイジュ・チオエ
ステラーゼのタンパク質は大腸菌（E.coli) 細胞の中で
lac 融合体として発現される。実施例1 に記載する、全
長のゲッケイジュ・チオエステラーゼcDNA, pCGN3822、
の配列の分析は、塩基394 におけるXbaI部位を明らかに
する。このXbaI部位における消化は、アミノ酸位置72に
おけるロイシンを表すコドンの直ぐ５′のコーディング
領域を切断する。このロイシンは、実施例１ａに記載す
るようにアミノ末端残基のために候補として同定され
た。

【００５０】pCGN3822 cDNA のほぼ1200bpの断片を、前
述したように、仮定した成熟タンパク質の開始部位にお
いて切断するXbaIで消化することによって、cDNAの３′
末端をフランキングするベクター配列の中で、発生させ
る。XbaI断片をブルースクライブ（Bluscribe)Ｍ13（＋
／−)(また、pBS ＋／−）クローニングベクター（Stra
tagene、サンジエゴ、カリフォルニア州）のマイナスバ
ージョンのXbaI消化物上でクローニングする。成熟タン
パク質がブルースクライブ（Bluscribe)ベクターのlacZ
遺伝子の部分とリーディングフレームの中にかつlacプ
ロモーターのコントロール下にあるように、チオエステ
ラーゼ遺伝子のクローンを挿入する。

【００５１】生ずる構成体pCGN3823、および反対の向き
で挿入されたゲッケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子を
有する対照ブルースクライブ（Bluscribe)構成体を大腸
菌（E.coli) の中に形質転換する。大腸菌（E.coli) 細
胞を37℃において液体培地の中で成長させ、そしてIPTG
を0.1mM IPTGの最終濃度に添加することによって、lac
プロモーターからの発現を誘発する。誘発の１時間後、
切頭ゲッケイジュ・チオエステラーゼについて前述した
ように、細胞を収獲し、溶解しそして測定する。

【００５２】

【表２】

【００５３】これらの残留物が証明するように、仮定し
た成熟ゲッケイジュ・チオエステラーゼ酵素を発現する
大腸菌（E.coli) 細胞からのリゼイトは、変化する炭素
鎖長の他の ACP基質に対するより、12：０−ACP 基質に
対して有意により大きい活性を有する。さらに、この活
性は切頭ゲッケイジュ・チオエステラーゼを発現する大
腸菌(E.coli)細胞のリゼイトにおけるより２桁大きい。
大腸菌（E.coli) 細胞の中のゲッケイジュ・チオエステ
ラーゼのタンパク質の発現がこれらの細胞の脂肪酸組成
に作用を有するかどうかを決定するために、研究を実施
している。

【００５４】初期の研究は、ゲッケイジュ・チオエステ
ラーゼを含有する大腸菌（E.coli)細胞の脂肪酸複合体
の実質的な変化を同定することができなかった。しかし
ながら、後述するように、ペレット化した形質転換され
た細胞又は形質転換された細胞をペレット化した成長培
地のより大きい試料の分析は、形質転換された細胞の脂
肪酸のプロフィルの変化を示す。Ｃ12脂肪酸は、非形質
転換対照細胞に比較して、ゲッケイジュ・チオエステラ
ーゼを含有する細胞の中でより高い量で生産される。

【００５５】プラスミドベクターブルースクライブ（Bl
uscribe)（Stratagene、サンジエゴ、カリフォルニア
州）で形質転換された大腸菌（E.coli)対照細胞および
成熟チオエステラーゼ構成体で形質転換された細胞のほ
ぼ 100mlを、ECLB（大腸菌（E.coli) Luria ブロス）培
地の中でほぼ 0.6の光学密度に成長させ、そして遠心に
よりペレット化した。細胞および培地を次のようにして
酸性方法を使用して抽出する。ペレット化した細胞を４
mlのメタノール中の５％（ｖ／ｖ）H₂SO₄ の中に再懸濁
させる。この培地を遠心後に回収し、そして10mlの酢酸
を添加する。試料を50mlのエーテルと激しく震盪する。
相を分離し、そして下の層を廃棄する。エーテル層を一
夜蒸発させて、１〜２mlの残留溶液を得る。４mlのメタ
ノール中の５％（ｖ／ｖ）H₂SO₄ を残留する培地溶液に
添加する。

【００５６】次の工程を前述の培地の溶液およびペレッ
ト化した細胞の両者の脂肪酸分析適用する。細胞および
H₂SO₄ ／メタノールの中の培地の試料をねじ込みキャッ
プの管に移し、そして 0.5mg／mlのＣ17標準を含有する
２mlのトルエンを添加する。管にキャップをきつく閉
め、管を90℃において２時間インキュベーションし、次
いで４mlの 0.9％（ｗ／ｖ）NaClおよび２mlのヘキサン
を添加する。次いで、各試料の上層（ヘキサン）をテー
ブルトップの遠心機で1000rpm において５分間遠心し
て、大腸菌（E.coli) 細胞の層内に捕捉されることがあ
る抽出された脂肪酸メチルエステルを分離した。

【００５７】試料を気液クロマトグラフィー（GC）によ
り温度のプログラムを使用して分析して、10個またはそ
れより少ない炭素原子を有する成分の分離を増強する。
使用した温度のプログラムは、 140℃の温度について３
分間、次いで 230℃に到達するまでの５℃／分の温度増
加を提供し、そして 230℃を11分間維持する。試料をヘ
ウレット−パッカード（Hewlett-Packard) 5890 (Palo
Alto、カリフォルニア州）のガスクロマトグラフで分析
する。脂肪酸含量の計算は内部Ｃ17標準に基づく。

【００５８】GC分析は、形質転換された細胞からの培地
中の脂肪酸のほぼ70％がＣ12脂肪酸であることを示す。
これは対照細胞からの培地中のＣ12脂肪酸の約２％のレ
ベル上と比較される。さらに、非形質転換細胞の含量を
越えた形質転換された細胞の含量のほぼ２倍の増加が観
察される。

【００５９】Pollard ら、前掲に記載されているように
発育する種子から精製されたゲッケイジュ・チオエステ
ラーゼ酵素の基質の分析をまた実施する。結果を下表３
に表す。

【表３】

【００６０】大腸菌（E.coli) 抽出物の中および発育す
るゲッケイジュ種子から精製されたチオエステラーゼの
基質の分析の結果を比較すると、２つの源からの酵素の
活性のプロフィルはＣ８，10，12, 14および16 ACP基質
に関して本質的に同定であることが明らかである。胚か
ら精製された酵素はＣ18：１基質で大腸菌（E.coli)発
現されたチオエステラーゼよりわずかに活性であるが、
この差は中位鎖チオエステラーゼから完全には除外され
なかった長鎖ゲッケイジュ・チオエステラーゼの活性の
ためであると信じられる。

【００６１】１）ラウレートの生産 それ以上の研究のために、ゲッケイジュ・チオエステラ
ーゼ発現プラスミド（pCGN3823）を、中位鎖特異的アシ
ル−CoA シンターゼを欠如し（Overanら、Eur.J. Bioch
em. (1969) ７： 559−574)、したがって、ラウレート
を分解することができない大腸菌（E.coli）fadD株の中
で確立した。ベクター形質転換された対照に関するfadD
ゲッケイジュ・チオエステラーゼ形質転換体の成長を25
℃, 30℃および37℃において研究した。液体培養におい
て、ゲッケイジュ・チオエステラーゼ形質転換されたfa
dD細菌は、すべての３つの温度において、指数的成長相
の間に対照とほぼ同一速度で増殖する。しかしながら、
37℃において、ゲッケイジュ・チオエステラーゼのプラ
スミドを収容するfadD細胞は成長の定常期に近い培養物
から回収することができない。対照的に、プラスミドは
数日間より低い温度において安定に含有され、そしてこ
れらの定常期の培養物はメタノールまたはエーテルの中
に可溶性の有意な量の沈澱を生産する。

【００６２】寒天上のfadD−ゲッケイジュ・チオエステ
ラーゼのコロニーの成長は37℃において厳しく遅延され
たるが、より低い温度においてはほんのわずかである。
25℃においてペトリ皿上に形成したコロニーは、大量の
結晶を、ことに表面において、堆積するが、また細胞不
含寒天マトリックスの中または表面において堆積する。
これらの結晶の堆積は（FAB)質量スペクトル測定により
カリウムラウレートと同定された。ガスクロマトグラフ
ィーにより分離および定量後、ラウレートの結晶は生産
する細菌の合計の乾燥重量の30％までを表すと推定され
る。

【００６３】２）不飽和脂肪酸基へのチオエステラーゼ
活性 さらに、いくつかの新しいメチルエステルのピークがfa
dD−ゲッケイジュ・チオエステラーゼの中に存在する
が、対照大腸菌（E.coli) fadD細胞の中に存在しない。
分析はこれらのピークの２つが12：１および14：１脂肪
酸を表すことを示す。こうして、ゲッケイジュ・チオエ
ステラーゼは、大腸菌（E.coli) の中に存在する両者の
飽和および不飽和の脂肪酸シンターゼの経路から脂肪族
アシル−ACP を加水分解することができる。

【００６４】飽和の経路は後期対数期において 100％遮
断され、そして不飽和の経路は約70％遮断される。これ
により、主として16：１および18：１の置換された、細
胞のリン脂質の中の飽和の減少が生ずる。蓄積された1
2：１／14：１の比はほぼ 0.9／１であるが、12：０／1
4：０の蓄積の比はほぼ９／１である。これにより示す
ことができるように、不飽和脂肪族アシルACP のチオエ
ステラーゼの鎖長さの特異性は飽和の基質のそれと異な
るか、あるいは14：１−ACP プールは12：１−ACP プー
ルより非常に大きい。さらに飽和の経路のほぼ完全な遮
断は成長の定常期の間に飽和脂肪酸の連続的合成を生ず
る。

【００６５】fadD＋形質転換体とfadD形質転換体との間
のラウレート蓄積レベルの顕著な差は、ゲッケイジュ・
チオエステラーゼの基質の特異性の研究と一致する(Pol
lardら、前掲）。fadD＋大腸菌（E.coli) の中の導入さ
れたゲッケイジュ・チオエステラーゼにより発生したラ
ウレートは、ゲッケイジュ・チオエステラーゼの非常に
効果に劣る基質である、CoA にエステル化し、そして引
き続いてβ−酸化により分解するか、あるいは脂肪酸合
成のために再循環させることができる。したがって、小
さい部分だけが蓄積し、そして培地の中に逃げることが
できる。fadD株において、ラウレートはCoA にエステル
化されず、そして再循環されることはない。観察された
わずかの成長の遅延は、このような高いレベルへのラウ
レートの蓄積が大腸菌（E.coli) 宿主細胞への毒性作用
を生ずることを示しうる。

【００６６】37℃において、fadD株の中のラウレートシ
ンターゼは指数的成長の間にのみ許容される。対数期の
終わりにおけるゲッケイジュ・チオエステラーゼのプラ
スミドを含有する細胞の力価の急速な損失は、ラウレー
トの毒性の温度依存性を反映するか、あるいは導入され
たゲッケイジュ・チオエステラーゼの活性を致死的とさ
せる、定常期の代謝への生理学的シフトを反映すること
がある。大腸菌（E.coli) の脂肪酸組成は老化する培養
物の中で変化し、そしてより低い温度における飽和脂肪
酸の要求の減少はこれらの温度におけるゲッケイジュ・
チオエステラーゼの発現のマイナスの衝撃を低下させる
ことができる。大腸菌（E.coli) の中の不飽和脂肪酸の
ための経路はＣ10段階において発散し、そしてゲッケイ
ジュ・チオエステラーゼにより遮断される可能性は最も
少ないであろう。

【００６７】培地の中のラウレートの蓄積は、より少量
のカプレート（10：０）の堆積により達成される。これ
はチオエステラーゼ活性と接触しており、ここで14：０
−ACP 加水分解は10：０−ACP の加水分解よりいっそう
有意である。これらの細胞の中の高い量のゲッケイジュ
・チオエステラーゼはアシル−ACP のin vivo のプール
の大きさ≧12：０を効果的に減少するので、14：０より
小さいアシルACP 基質は有効である。大腸菌（E.coli)
の中のゲッケイジュ・チオエステラーゼによるカプレー
トの生産は、この酵素がゲッケイジュ種子の中の10：０
および12：０の両者の脂肪酸の堆積に関係することを示
すことができる。

【００６８】実施例２Ｂ 大腸菌（E.coli) の中のベニバナ・チオエステラーゼの
タンパク質の発現を記載する。ベニバナのアシル−ACP
チオエステラーゼのクローンpCGN3264およびpCGN3265
を、部位特異的突然変異誘発により変更して、これらの
クローンの成熟タンパク質コーディング領域の開始にす
ぐに接してSalIおよびNcoI部位を挿入する。cDNAクロー
ンの中の成熟コーディング領域＋３′非翻訳配列をNcoI
／SmaI断片として除去し、そしてBamHI で消化しかつDN
A ポリメラーゼのクレノー断片で処理して平滑末端をつ
くったpET8c (Studierら、1990）の中に挿入し、次いで
NcoIで切断する。

【００６９】生ずる発現構成体、pCGN3270（２−１）お
よびpCGN3271（５−２）をＴ７プロモーターから直接成
熟ベニバナアシル−ACP チオエステラーゼcDNA配列を発
現するように設計する。発現の分析のために、構成体を
イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）
誘導可能な lacUV５プロモーターのコントロール下にＴ
７RNA ポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌（E.coli)
BL21（DE３）株の中に転移する(Studierら、Methods En
zymol.（1990)185 ：60−89) 。

【００７０】チオエステラーゼ活性の測定のために、pC
GN3270, pCGN3271または対照としてpET8c を含有する細
胞を37℃において 0.4％のグルコースおよび 300μｇ／
mlのペニシリンを含有する２YT（16ｇトリプトン、10ｇ
酵母エキス、５ｇNaCl／ｌ，pH7.0)中で約 0.5のOD₆₀₀
に成長させる。IPTGを 0.4mMに添加しそしてさらに 1.5
時間成長させることによって誘発を達成する。培養物の
10mlのアリコートを遠心により収獲し、そして沈澱した
細胞を−70℃において貯蔵した。測定の前に、ペレット
を 500μｌのチオエステラーゼ測定緩衝液の中に再懸濁
させ、そして各20秒の３回のバーストで超音波処理す
る。タンパク質濃度をバイオ−ラド(Bio−Rad)タンパク
質アッセイを使用して決定する。

【００７１】pCGN3270およびpCGN3271を含有する大腸菌
（E.coli) の全体のタンパク質のプロフィルを SDS−PA
GEにより分析する。各場合において、新しいタンパク質
のバンドがIPTG誘発した培養物の中にpET8c対照に関し
て観察される。２−１および５−２によりコードされた
タンパク質のコンピューターで予測した分子量は非常に
類似するが、pCGN3270およびpCGN3271から発現されたこ
れらのタンパク質の移動性は有意に異なる。pCGN3270に
よりコードされたタンパク質はほぼ40kDの移動性を有す
るが、pCGN3271によりコードされたタンパク質はほぼ36
kDである。誘発されたタンパク質をＮ−末端の配列決定
にかけて、それらの同一性を確証する。各場合におい
て、タンパク質の配列はcDNAにより予測された配列と合
致した。さらに、pCGN3271における５−２インサートの
３′領域のヌクレオチド配列を再配列決定して、早期の
停止コドンがクローニング工程の間に導入されなかった
ことを確実にする。

【００７２】pET8c(対照) 、pCGN3270またはpCGN3271を
発現する細胞の全体の抽出物を18：１−ACP を使用して
チオエステラーゼ活性について測定する。pCGN3270およ
びpCGN3271を含有する細胞の中の18：１−ACPチオエス
テラーゼ活性は、対照細胞における活性より、それぞれ
約 100倍および50倍より高い。ベニバナのアシル−ACP
チオエステラーゼを特性決定するために、cDNAクローン
から発現されたチオエステラーゼ活性の鎖長さ特異性を
種々のアシル−ACP 基質について試験し、そして大腸菌
（E.coli) および粗製のベニバナ胚抽出物の対照のチオ
エステラーゼ活性と比較する。

【００７３】pCGN3270およびpCGN3271の培養物は、ベニ
バナ胚の特徴を示すチオエステラーゼ活性、すなわち、
対照の大腸菌（E.coli) に比較して18：１−ACP ／18：
０−ACP について非常により高い優先性を含有する。２
つのベニバナのチオエステラーゼのクローンの間で、pC
GN3271から発現された活性は飽和18：０−ACP および1
6：０−ACP 基質についてわずかにより広い特異性を表
す。

【００７４】実施例３ − 植物の形質転換の構成体お
よび方法 Ａ．ファゼオリン、ナピン、CaMV35S およびBce ４プロ
モーター領域を利用する植物細胞のゲッケイジュ・チオ
エステラーゼの発現のための構成体を次のようにして調
製する。

【００７５】ファゼオリン／チオエステラーゼ BalIおよびSalIで消化することによって、pCGN3822（３
Ａ−17）の1.45kgの断片を形成する。BalI部位はcDNAイ
ンサートの位置 149に位置し、そしてSalI部位はcDNAイ
ンサートに対して３′に位置するポリリンカーの中に存
在する。こうして、この断片は全体のチオエステラーゼ
コーディング領域および、塩基1447−1452に位置するポ
リアデニル化シグナル、AAATAA、を含む全体のcDNA３′
領域を含有し、そしてまたcDNAに対して３′に直接位置
する制限消化部位KpnI，SmaI，XbaIおよびSalIを含有す
る。

【００７６】β−ファゼオリン５′非コーディング領域
の850bs のBglII 断片をp8.8pro (Hoffmanら（1987）EM
BO J. ６：3213−3221) から形成し、そしてpUC ９（Vi
eiraおよびMessing 、前掲）の中にBamHI 部位にクロー
ニングしてpTV796を生成した。pTV796の中のファゼオリ
ン断片を配向して、pUC ９のSmaI部位がファゼオリンプ
ロモーターに対して３′に位置するようにした。pTV796
をHindIII およびSmaIで消化して約850bp の断片を発生
させ、そしてゲル精製する。

【００７７】ファゼオリンプロモーター(HindIII／Sma
I）およびチオエステラーゼコーディング領域（BalI／S
alI）を、HindIII およびSalIで消化したブルースクリ
プト（Bluescript）（Stratagene）クローニングベクタ
ーの中への３方結合により接合する。生ずるプラスミド
は、５′BamHI 部位および３′KpnI部位を含む、種々の
制限部位によりフランキングされた HindIII／SalI断片
上に、ファゼオリンプロモーター／チオエステラーゼ構
成体を含有する。

【００７８】チオエステラーゼ断片はポリアデニル化シ
グナルを含有するので、追加の植物３′コーディング領
域は提供されない。ファゼオリンプロモーター／チオエ
ステラーゼ断片は、BamHI およびKpnIで消化するか、あ
るいはXbaIで部分的に消化することによって発生させ、
そして適当なバイナリーベクター、例えば、pCGN1557ま
たはpCGN1558(McBrideおよびSummerfelt, (1990) Plant
Mol. Biology 14： 269−276)の中に、植物の形質転換
のために、結合することができる。BamHI およびKpnI消
化から生ずる、ファゼオリンプロモーター／チオエステ
ラーゼ断片をpCGN1558の中に結合すると、pCGN3821が生
ずる。

【００７９】35Ｓ／チオエステラーゼ／mas ほぼ1200bpを含有し、そして全体のコーディング領域を
含む、チオエステラーゼcDNA３Ａ−17のBalI／PstI断片
を、制限酵素BalIおよびPstIで部分的に消化しそして12
00bpの断片をゲル精製することによって得る。この断片
をプラスミドのクローニングベクター、例えば、PstIお
よびBamHI で消化し、そしてDNA ポリメラーゼＩのクレ
ノー断片を使用してBamHI 部位をフィルインしたブルー
スクリプト（Bluescript）ベクター（Stratagene Cloni
ng System ；ラジョラ、カリフォルニア州）の中に結合
する。この手順において、BamHI部位はチオエステラー
ゼcDNAのBalI部位への結合により回復される。

【００８０】生ずるプラスミドのBamHI およびEcoRI で
部分的に消化して、ほぼ1200bpのチオエステラーゼ断片
を得る。次いで、この断片をほぼ4.4kb のBamHI ／EcoR
I DNA断片の中にクローニングし、後者の断片はカリフ
ラワーモザイク（CaMV）35Ｓ遺伝子からのほぼ0.94kbの
５′非コーディング配列（BamHI 部位にすぐに接して
５′）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens)モノパインシンターゼ(mas）遺
伝子からのほぼ0.77kbの３′非コーディング配列（EcoR
I 部位にすぐに接して３′）およびpUC19 (NewEngland
Biolabs 、ベバリー、マサチュセッツ州）主鎖を含有す
る。BamHI ／EcoRI DNA断片を、より大きいプラスミド
ベクターの部分的消化および所望の 4.4kbの断片のゲル
精製により得る。

【００８１】35Ｓの５′領域はCM1841株(Gardnerら（19
81) Nucl. Acids Res. 9：9871−2887）の塩基6492−74
33であり、これは転写開始部位に関して約− 640〜約＋
２である。mas ３′非コーディング領域はオクトパイン
TiプラスミドpTiA６の約塩基19,239〜18,474である（番
号はBakerら（Plant Mol. Biology (1983) ２：335−35
0)）が報告するpTi15955に密接に関係する番号に相当す
る））。生ずる35Ｓ／チオエステラーゼ／mas プラスミ
ドをフランキングBglII において消化し、そしてBamHI
消化したバイナリーベクター、例えば、pCGN1557または
pCGN1578 (McBride およびSummerfelt、前掲）の中にク
ローニングする。

【００８２】Bce ４／チオエステラーゼ 1.45kbのチオエステラーゼcDNA BalI ／SalI断片を前述
したように調製する。初期の種子発育において優先的な
発現を提供するBce４発現カセットであるpCGN1870は、
同時係属米国特許出願第07／494,722 号（開示をここに
引用によって加える）に記載されている。pCGN1870をXb
aIおよびXhoIで消化し、そして生ずる１kbの断片をゲル
精製することによって、その３′末端がBce ４開始コド
ンにすぐに接しているBce ４の５′非コーディング領域
のほぼ１kbの断片を得る。

【００８３】Bce ４プロモーター（XbaI／XhoI）および
チオエステラーゼコーディング領域（BalI／SalI）を、
XbaIおよびSalIで消化したブルースクライブ（Bluscrib
e)（Stratagene）クローニングベクターの中への３方結
合により接合する。生ずるプラスミドは、５′BamHI 部
位および３′KpnI部位を含む、種々の制限部位によりフ
ランキングされたXbaI／SalI断片上に、Bce ４プロモー
ター／チオエステラーゼ構成体を含有する。チオエステ
ラーゼ断片はポリアデニル化シグナルを含有するので、
追加の植物３′非コーディング領域が得られる。

【００８４】Bce ４プロモーター／チオエステラーゼ断
片は、BamHI を使用する消化およびKpnI（または同一の
認識配列を有するAsp718）を使用する部分的消化による
か、あるいはXbaIを使用する部分的消化により得ること
ができ、そして植物の形質転換のために、適当なバイナ
リーベクター、例えば、pCGN1557またはpCGN1558（McBr
ide およびSummerfelt、前掲）の中に結合することがで
きる。BamHI およびKpnIの消化から生ずる、Bce ４プロ
モーター／チオエステラーゼ断片をpCGN1578の中に結合
すると、pCGN3820が生ずる。

【００８５】ナピン／チオエステラーゼ／ナピン ナピン発現カセットであるpCGN1808は、同時係属米国特
許出願第07／550,804号（開示をここに引用によって加
える）に記載されている。pCGN1808をフランキング制限
部位を含有するように修飾して、抗生物質耐性マーカー
ではなく発現配列のみがバイナリーベクター、例えばpC
GN1557へ動くことができるようにする（McBride および
Summerfelt、前掲）。KpnI，NotIおよびHindIII 制限部
位を含有する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし
そしてpCGN1808の独特HindIII 部位に結合し、こうして
ただ１つのHindIII 部位が回復されるようにする。生ず
るプラスミドpCGN3200は、配列分析により確証されるよ
うに、ナピン３′−調節配列の３′末端に独特HindIII,
NotIおよびKpnI制限部位を含有する。

【００８６】ナピン発現カセットの大部分をpCGN3200か
らHindIII およびSacIで消化しそしてHindIII およびSa
cI消化したpICI19R (Marshら（1984）Gene 32： 481−
485)に結合することによってサブクローニングしてpCGN
3212をつくる。鋳型としてpCGN3200およびSacI部位と、
ナピン５′−プロモーターおよびpCGN1808構成体からの
pCGN3200のpUC 主鎖との接合とをフランキングする２つ
のプライマーを使用するPCR により、ナピンプロモータ
ー領域の極端の５′−配列を再構成する。前方プライマ
ーはClaI, HindIII ，NotIおよびKpnI制限部位ならびに
ナピン５′−配列のヌクレオチド 408−423 (EcoRV部位
から）を含有し、そして逆プライマーは５′−プロモー
ターの中に独特SacI部位を含むナピン配列 718−739 に
対する補体を含有する。PCR は製造業者の仕様書に従い
パーキン・エルマー／セツス（Perkin Elmer／Cetus)サ
ーモサイクラーを使用して実施した。

【００８７】PCR 断片を平滑末端の断片としてHincIIで
消化したpUC ８（VieiraおよびMessing (1982) Gene 1
9： 259−268 ）の中にサブクローニングしてpCGN3217
を得た。ナピンの挿入を横切るpCGN3217の配列決定は、
不適切なヌクレオチドが PCRにより導入されなかったこ
とを評価する。pCGN3217の中のナピン５−配列をナピン
発現カセットの残部に、ClaIおよびSacIを使用する消化
およびClaIおよびSacIで消化したpCGN3212への結合によ
り結合する。生ずる発現カセットpCGN3221をHindIII で
消化し、そしてナピン発現配列をゲル精製し、そしてHi
ndIII で消化したpIC20H(Marsh、前掲）に結合した。最
終の発現カセットはpCGN3223であり、これはpCGN1808の
中に見いだされるのと本質的に同一の 1.725ナピン５′
および 1.265 ３′調節配列をアンピシリン耐性バック
グラウンドの中に含有する。調節領域はHindIII ，NotI
およびKpnI制限部位でフランキングされており、そして
独特SalI, BglII ，PstIおよびXhoIクローニング部位は
5 ′および3 ′非コーディング領域の間に位置する。

【００８８】前述の1200bpのBalI／PstIチオエステラー
ゼcDNA断片を、SacIで消化したナピン発現カセットpCGN
3223の中にクローニングし、そしてSalI部位をDNA ポリ
メラーゼＩのクレノー断片を使用してフィルインし、次
いでPstIで消化する。SalI部位をこの結合において再構
成する。

【００８９】これらの操作により発生したナピン／チオ
エステラーゼ／ナピンプラスミドをBamHI で消化しそし
てKpnIで部分的に消化して、ほぼ 3.3kbの断片を発生さ
せる。この断片を約 1.7kbのナピン５′非コーディング
配列、約1200bpのBalI／PstIチオエステラーゼcDNA断片
および約0.33kbの３′ナピン非コーディング領域を含有
し、ナピン３′の 1.265kbの残部はこの領域におけるBa
mHI 部位のために欠失されていた。植物の形質転換のた
めに、約 3.3kbの断片をKpnI／BamHI 消化したpCGN1557
またはpCGN1578(McBrideおよびSummerfelt、前掲）に結
合する。約 3.3kbの断片をpCGN1578の中に挿入するとpC
GN3816が生ずる。

【００９０】ナピン／チオエステラーゼ pCGN3822をBamHI およびKpnIで部分的に消化し、引き続
いて生ずる 1.5kbの断片をゲル精製することによって、
全長のチオエステラーゼcDNAのほぼ 1.5kbの断片を得
る。BamHI 部位はcDNA配列のヌクレオチド74に存在し、
KpnI部位はcDNAインサートに対して３′に位置するベク
ターのポリリンカーの中に存在する。こうして、この断
片は位置 145−147 にATG コドンを含む全体のチオエス
テラーゼコーディング領域、および前述したようにポリ
アデニル化シグナルを含有する全体のcDNA３′領域を含
有する。pCGN3223（前述した）をHindIII およびBglII
で消化し、引き続いて 1.7kbの断片をゲル精製すること
によって、ナピン５′非コーディング領域のほぼ 1.7kb
の断片を得る。

【００９１】ナピンプロモーター(HindIII／BglII)およ
びチオエステラーゼコーディング領域(BamHI／KpnI）
を、HindIII およびKpnIで消化したバイナリーベクタ
ー、例えば、pCGN1557またはpCGN1578の中への３つの断
片を結合することによって接合する。この領域におい
て、BamHI およびBglII 部位の相補的オーバーハンギン
グ末端は、チオエステラーゼ断片の５′末端へのナピン
断片の３′末端の融合を可能とする。pCGN1578，pCGN38
24の中への結合から植物の形質転換のために生ずるプラ
スミドは、ナピンプロモーターの調節コントロールドに
発現のために位置するチオエステラーゼcDNAを含有す
る。チオエステラーゼ断片はポリアデニル化シグナルを
含有するので、追加の植物３′非コーディング領域は得
られない。

【００９２】ナピン／チオエステラーゼ／ナピン ナピンプロモーターおよび３′転写停止領域の転写およ
び翻訳のコントロール下にチオエステラーゼの発現の構
成体を、次のようにしてつくる。図１に示すゲッケイジ
ュ・チオエステラーゼ配列の位置140 (ATG開始コドンか
ら５塩基上流）におけるチミジンヌクレオチドにすぐに
接して５′にBamHI 部位を挿入するPCR技術により、pCG
N3822（前述した）を操作して、pCGN3826を生成する。
全体のチオエステラーゼをコードする領域を含有するほ
ぼ1225bpの断片をBamHI −PstI断片としてpCGN3826から
形成し、そしてBglII ／PstI消化したpCGN3223、前述の
ナピン発現カセット、の中に結合してpCGN3827を生成す
る。pCGN3828をKpnIおよびBamHI で部分的に消化し、そ
してナピン５′／チオエステラーゼ／ナピン３′構成体
を含有するほぼ 3.2kbの断片をKpnI／BamHI消化pCGN157
8（McBride およびSummerfelt、前掲）の中にクローニ
ングすることによって、植物の形質転換のためにベクタ
ーであるpCGN3828を構成する。

【００９３】構成体pCGN3837を調製し、この構成体はpC
GN3828に類似するが、ベニバナ・チオエステラーゼのト
ランシットペプチドをコードする配列と置換したゲッケ
イジュ・トランシットペプチド領域およびクローン２−
１からの成熟ベニバナ・チオエステラーゼの６アミノ酸
を有する。この構成体のためのベニバナ断片はPCR 技術
を使用して便利な制限消化部位を得るように調製するこ
とができる。ナピン５′および３′調節領域を有する他
の構成体を調製し、これはゲッケイジュ・チオエステラ
ーゼのトランシットペプチドおよび成熟ゲッケイジュ・
チオエステラーゼのタンパク質の最初の11アミノ酸をコ
ードする領域をベニバナ・チオエステラーゼのトランシ
ットペプチドおよび成熟ベニバナ・チオエステラーゼの
タンパク質の最初の31アミノ酸をコードする配列と置換
する。

【００９４】適当な癌腫菌（Agrobacterium)株をバイナ
リー構成体で形質転換し、そして形質転換されたラウレ
ート生産植物を発生させるために使用する。種子を集
め、そして前述したように分析して、色素体の輸送の効
率および油の組成を決定する。Ｂ．問題のDNA 配列を植
物宿主のゲノムの中に挿入して表現型を変化させる配列
の転写または転写および翻訳を得るために、種々の方法
が開発されてきている。

【００９５】ブラシカ（Brassica）の形質転換 ブラシカ・ナプス（Brassica napus）cv. Westarを95％
のエタノールの中で２分間ソーキングし、１滴のツイー
ン20を含有する次亜塩素酸ナトリウムの 1.0％の溶液の
中で45分間表面を滅菌し、そして無菌の蒸留水の中で３
回すすぐ。次いで、１／10の濃度のムラシゲ（Murashig
e)最小有機培地（Gibco;グランドアイランド、ニューヨ
ーク）を有し、ピリドキン（50μｇ／ｌ）、ニコチン酸
（50μｇ／ｌ）、グリシン(200μｇ／ｌ）および 0.6％
のフィタガール（Phytagar)(Gibco)を補充したマゼンタ
(Magenta）ボックスpH5.8の中に種子をプレートする。
種子を22℃においてパーシバル(Percival)チャンバーの
中で16時間の冷蛍光およびほぼ65μのアインシュタイン
ｍ² ／秒（μEm^-2Ｓ^-1）の強度の赤色光を使用する光期
間で発芽させる。

【００９６】胚軸を発芽後５〜７日の実生から切取り、
ほぼ４mmの長さの片に切り、そしてフィーダープレート
（Horschら、Science(1985)227：1229−1231）上にプレ
ートする。使用の１日前に、約30mlのMS塩塩基(Carolin
a Biological、バーリントン、ノースカロライナ州）、
100mg ／ｌのイノシトール、 1.3mg／ｌのチアミン−HC
l 、200mgのKH₂PO₄および３％のスクロース、２，４−
Ｄ(1.0mg／ｌ）、 0.6％のｗ／ｖのフィタガールを含有
しかつオートクレーブ処理前にpH5.8 に調節した(MS ０
／１／０培地）ペトリ皿(100×25mm）上に 1.0mlのタバ
コ懸濁培養物をプレートすることによって、フィーダー
プレートを調製する。

【００９７】無菌の濾紙のディスク（Whatman ３mm）を
使用前にフィーダー層の上部上に配置する。２，４−Ｄ
(0.2mg／ｌ）カイネチン(Kinetin）(0.1mg／ｌ）を有す
るフィーダープレートについて記載したように、毎週10
mlの培養物を 100mlの新鮮なMS培地の中に移すことによ
って、タバコ懸濁培養物を継代培養する。フィーダー細
胞を使用しない実験において、胚軸外植体を切断し、そ
してMS０／１／０培地上の濾紙のディスク上に配置す
る。すべての胚軸外植体を、強度30μEm^-2Ｓ^-1〜65μEm
^-2Ｓ^-1の連続的光の中で22℃においてフィーダープレー
ト上で24時間前インキュベーションする。

【００９８】バイナリープラスミドを含有するアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）EHA 1
01 株の単一のコロニーを５mlのMG／Ｌブロスに移し、
そして30℃において一夜成長させる。胚軸外植体を細菌
を１×10⁸ 細菌／mlに希釈した７〜12mlのMG／Ｌブロス
の中に浸漬し、そして10〜25分後、フィーダープレート
上に配置する。１リットル当たりブロスは５ｇのマンニ
トール、１ｇのＬ−グルタミン酸または1.15ｇのグルタ
ミン酸ナトリウム、0.25ｇのKH₂PO₄，0.10ｇのNaCl, 0.
10ｇのMgSO₄ ・７H₂O,１mgのビオチン、５ｇのトリプト
ン、および 5.5ｇの酵母エキスを含有し、そしてブロス
をpH7.0 に調節する。癌腫菌（Agrobacterium)と48時間
共インキュベーションした後、胚軸外植体を濾過滅菌し
たカルベニシリン(500mg／ｌ、オートクレーブ処理後に
添加した）および硫酸カナマイシン（Boehringer Mannh
eim ：インジアナポリス、インジアナ州）を25mg／ｌの
濃度で含有するＢ５ ０／１／０カルス誘発培地に移
す。

【００９９】65μEm^-2Ｓ^-1の連続的光において３〜７日
間培養した後、カルスの組織は切断した表面上に見るこ
とができ、そして胚軸外植体を苗条誘発培地Ｂ５BZ（Ｂ
５塩類およびビタミン類、３mg／ｌのベンジルアミノプ
リン、１mg／ｌのゼアチン、１％のスクロース、 0.6％
のフィタガールを補充しそしてpH5.8 に調節した）に移
す。この培地は、また、カルベニシリン(500mg／ｌ）お
よび硫酸カナマイシン（25mg／ｌ）を含有する。胚軸外
植体を新鮮な苗条誘発培地上に２週毎に継代培養する。

【０１００】１〜３か月後、苗条は胚軸カルスから発生
する。少なくとも１cmの高さの緑色苗条をカルスから切
取り、そしてＢ５塩類およびビタミン類、１％のスクロ
ース、カルベニシリン(300mg／ｌ）、硫酸カナマイシン
（50mg／ｌ）および 0.6％ｗ／ｖのフィタガールを含有
する培地上に配置する。２〜４週後、緑色のままである
苗条を基部で切断し、そして根誘発培地（Ｂ５塩類およ
びビタミン類、１％のスクロース、50mg／ｌの硫酸カナ
マイシンおよび 0.6％のフィタガール）を含有するマゼ
ンタボックスに移す。緑色の根が形成した苗条をチオエ
ステラーゼ活性について試験する。

【０１０１】アラビドプシス（Arabidopsis)の形質転換 トランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（Arabid
opsisthaliana）は、Valverkensら（Proc. Natl. Acad.
Sci. (1988) 85：5536−5540）により記載されている
ように、癌腫菌(Agrobacterium)仲介形質転換により得
ることができる。構成体を癌腫菌（Agrobacterium)細
胞、例えばEHA101株（Hoodら、J. Bacteriol (1986) 16
8 ：1291−1301) 細胞の中に、Holster ら(Mol. Gen. G
enet. （1978) 163 ：181 −187)により記載されている
ように形質転換することができる。

【０１０２】ナンキンマメの形質転換 問題のDNA 配列を、少なくともプロモーター領域、問題
の遺伝子および終結領域からなる発現カセットとして、
欧州特許出願公開第332,855 号および同時係属米国特許
出願第07/225,332号、1988年７月27日提出に記載されて
いるように、粒子衝撃を介して植物ゲノムの中に導入す
ることができる。簡単に述べると、 0.5μｍ〜３μｍの
範囲の大きさのタングステンまたは金の粒子を発現カセ
ットのDNA で被覆する。このDNA は水性混合物四酸化オ
スミウム乾燥DNA ／粒子の沈澱の形態であることができ
る。

【０１０３】衝撃のための標的として使用する組織を子
葉外植体、苗条分裂組織、未熟の小葉または葯からのも
のであることができる。組織とDNA 被覆粒子との衝撃は
バイオリスチクス（Biolistics^R )粒子ガン（Dupont；
ウィルミントン、デラウェア州）を使用して実施され
る。粒子をバレルの口から１cm〜14cmの範囲の可変距離
でバレルの中に入れる。衝撃すべき組織をストッピング
プレートの下に配置する；試験を組織について20cmまで
の距離で実施する。発射の瞬間に、組織をナイロンネッ
トまたはナイロンネットと10μｍ〜300μｍのメッシュ
との組み合わせで保護する。

【０１０４】衝撃後、植物をAtreyaら（Plant Science
Letters (1984) 34 ： 379−383)の方法に従い再生する
ことができる。簡単に述べると、胚軸組織または子葉の
セグメントをMS培地 (MurashigeおよびSkoog, Physio.
Plant. (1962) 15：473)（MS＋2.0mg ／ｌの６−ベンジ
ルアデニン（BA）子葉のセグメントのために）上に配置
し、そして暗所で25±２℃において１週間インキュベー
ションし、引き続いて連続的冷白色蛍光(6.8Ｗ／ｍ² ）
に移す。培養の第10日に、小植物を無菌の土を含有する
ポットに移し、日陰に３〜５日間保持し、そして最後に
温室に移す。

【０１０５】推定のトランスジェニック苗条は根を形成
する。植物ゲノムの中への外因性DNA の組み込みは、当
業者に知られている種々の方法によって実施することが
できる。Ｃ．チオエステラーゼ構成体で形質転換された
トランスジェニック植物をチオエステラーゼ活性および
脂肪酸およびトリグリセリドの組成について分析する。

【０１０６】pCGN3816およびpCGN3821で形質転換された
自家トランスジェニックアラビドプシス・タリアナ（A.
thaliana)植物からのアラビドプシス（Arabidopsis)種
子を、12：０および14：０アシル−ACP チオエステラー
ゼ活性について分析する。発育する種子をチオエステラ
ーゼ測定緩衝液（実施例１）で抽出し、そして可溶性分
画を測定する。トランスジェニック種子は対照を越えた
12：０チオエステラーゼ活性の有意の増加を示す。ま
た、14：０−ACP 加水分解は増加するが、より小さい規
模で、形質転換された大腸菌（E.coli) からの酵素特異
的データと一致する。

【０１０７】成熟アラビドプシス・タリアナ（A. thali
ana)種子の全体の脂肪酸分析は、対照植物の種子におい
て測定された０％のラウレートに比較して、前述の構成
体で形質転換された植物において５％までのラウレート
を明らかにする。図35が証明するように、ラウレート％
はトランスジェニック種子においてラウロイルチオエス
テラーゼ活性と直接的に相関関係を有する。また、トラ
ンスジェニック種子の中のミリステート含量は、 0.1％
（対照）から最高の発現体における 0.7％まで増加し、
そしてまたミリストイルチオエステラーゼ活性と相関関
係を有する。薄層クロマトグラフィーによるトリグリセ
リドの分析は、全体の脂肪酸分析により検出されたラウ
レートが中性の脂質分画の中に存在することを示し、ラ
ウレートがトリグリセリドの中に組み込まれた（エステ
ル化された）ことを証明する。

【０１０８】pCGN3828で形質転換されたアラビドプシス
・タリアナ（A.thaliana）植物からの成熟種子を、実施
例16において詳述するように、Browseら（Anal. Bioche
m. (1986)152： 141−145)に本質的に記載されているよ
うに全体の脂肪酸について分析する。これらの研究は、
その種子がほぼ17重量％（23.5モル％）までのラウレー
トを含有する、少なくとも１つの植物3828−13を明らか
にする。この形質転換された植物からの成熟種子を膵臓
リパーゼ消化のプロトコル（Brockerhoff (1975) Meth.
Enzymol. 35： 315−325)にかけて、sn−２およびsn−
１＋３（組み合わされた）位置のアシル組成を区別す
る。これらの分析からの予備的結果は次の通りである。

【０１０９】

【表４】

【０１１０】これらの予備的結果が示唆するように、中
位鎖脂肪酸はトリグリセリド分子のsn−１および／また
はsn−３位置に効率よく組み込まれる。合計26のpCGN38
28形質転換アラビドプシス（Arabidopsis)植物を12：０
−ACPチオエステラーゼ活性について試験し、７つが陽
性と試験された。ラウレートの発現について陰性の「形
質転換体」の存在は、アラビドプシス（Arabidopsis)の
形質転換法が根を形成する段階における選択を含まない
ので、驚くべきことではない。こうして、ラウレート陰
性植物は形質転換されない「エスケープ（escapes)」な
らびにゲッケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子を発現し
ない形質転換された植物を包含することが期待されるで
あろう。

【０１１１】これらの７つの陽性の植物からの成熟種子
(100個の種子のプール）の分析は、陽性の植物が対照の
中には存在しない有意な量の12：０を含有することを示
す。12：０の量は 2.1〜23.5モル％の範囲であり、そし
てチオエステラーゼ活性とほぼ相関関係を有する。種子
の全体の脂肪酸の含量は典型的にアラビドプシス（Arab
idopsis)において見られる範囲内であり、12：０の堆積
が油の収量に悪影響を及ぼさないことを示唆する。種子
の発育または形態に明らかな作用は観察されない。脂質
のクラスの分析(TLC）において、トリグリセリド分画が
全体の抽出可能な脂肪酸と同一比率のラウレートを含有
すること、すなわち、これらのレベルにおいて、12：０
がトリグリセリドの中に容易に組み込まれることが証明
される。

【０１１２】少量の14：０はまたトランスジェニックア
ラビドプシス（Arabidopsis)種子の中に蓄積する。種子
の中の12：０／14：０の比（６〜８）は、12：０−ACP
および14：０−ACP についてのinvitro チオエステラー
ゼ活性の比に類似する。12：０および14：０生産物の間
の一定に近い比は、多分、12：０−ACP および14：０−
ACP に向かうゲッケイジュ・チオエステラーゼの特異性
を反映し、そしてその酵素がトランスジェニック種子の
中で12：０−ACP および14：０−ACP の同様な大きさの
プールへの直接の作用によりinvivoで機能することを示
唆する。ゲッケイジュ・チオエステラーゼは10：０−AC
P に in vivo で有意の作用をもたないように思われ、
そしてほんの微量の10：０がトランスジェニック種子に
おいて検出されるだけである。

【０１１３】追加の研究を実施して、中位鎖が「天然
の」アラビドプシス（Arabidopsis)の脂肪酸のすべて
を、あるいはほんの一部分を犠牲にして合成されるかど
うかを決定した。対照アラビドプシス（Arabidopsis)植
物からの 100個の成熟種子の平均の脂肪酸組成を、トラ
ンスジェニック植物3828−13からのそれと比較した。こ
れらの標準の結果を図37に示す。２つの植物の12：０お
よび14：０の含量の差は明らかであるが、中位鎖生産の
結果、他の脂肪酸の含量の差は同定がいっそう困難であ
る。全体の脂肪酸含量はアラビドプシス（Arabidopsis)
植物の間でかなり変動し、絶対的脂肪酸レベルの比較を
非常に困難とする。これらの差を排除するためのデータ
の表示（％）（全体の脂肪酸＝100)は、解釈をさらに困
難とした。

【０１１４】こうして、独特の脂肪酸の組成を典型的な
植物間の変動と区別する１つの方法を次のようにして案
出した。26のＴ１アラビドプシス（Arabidopsis)植物か
らの成熟（Ｔ２）種子の全体の脂肪酸含量を増加する順
序で配置し、そして図38に示すように値のなめらかな広
がりを生成した。６つの最高のラウレート生産物を、対
応する重量％の12：０のデータとともに、矢印で示す。
12：０の生産のレベルと全体の脂肪酸含量の間に関係が
存在しないように思われる。図39において、データは同
一の方法であるが、３つの脂肪酸について個々に序列し
て示されている。

【０１１５】18：２および16：０についてのデータはま
たなめらかな線を形成したが、ただしラウレートが蓄積
する陽性の事象を除外する。それらの場合において、1
8：２および16：０の含量は全体の傾向より顕著に低
く、12：０がこれらの種子において18：２および16：０
を犠牲にして生産されたことを示す。これはまた18：
１,20：１および20：２について真実である。12：０の
生産により比較的影響を受けない唯一の主要な脂肪酸構
成成分は、図39に示すように、18：３であったが、低い
18：３の対照は、例えば、植物10において見いだすこと
ができる。

【０１１６】pCGN3816で形質転換されたブラシカ・ナプ
ス（Brassica napus）からの種子を、また、前述したよ
うに全体の脂肪酸について分析する。Ｔ２形質転換され
た植物からの単一の分離する種子の分析は、形質転換さ
れない対照植物からの種子における０％に比較して、０
〜14.5％の範囲のＣ16：０のレベルを明らかにする。Ｃ
16：０のレベルは、図35に証明されているように、対応
する未熟の種子におけるＣ16：０−ACP チオエステラー
ゼ活性と相関関係を有する。さらに、Ｃ14：０はまたこ
れらの種子の中にＣ16：０のレベルと相関関係を有する
レベルで検出されるが、Ｃ14：０のレベルはより低い。

【０１１７】pCGN3824（ナピン／チオエステラーゼ）お
よびpCGN3828（ナピン／チオエステラーゼ／ナピン）を
含有する形質転換されたブラシカ・ナプス（Brassica n
apus）植物を分析して、種子の脂肪酸組成を決定した。
pCGN3824で形質転換された34の植物およびpCGN3828で形
質転換された31の植物からプールした種子を分析して
（25〜50個の種子／測定）、種子の中のラウレートのレ
ベルを決定する。所定％のラウレートを有するトランス
ジェニック事象の数として表した、これらの分析の結果
を、図40及び図41に表す。pCGN3824−形質転換体は、そ
の種子が17モル％のラウレートを含有した単一の植物を
除外して、0 〜11モル％の範囲のラウレート含量を有し
た。

【０１１８】pCGN3828構成体の植物は１〜17モル％のラ
ウレート含量を有し、この範囲外の２つの代表的なもの
は37モル％のラウレート（植物3828−23）および27モル
％のラウレート（植物3828−35）を有した。さらに、こ
れらの植物の種子の油は、また、ほぼ16％のラウレート
レベルに相当する、より少ない量の14：０脂肪酸を有す
る。微量のレベルのＣ10：０が、また、典型的には１％
のラウレートレベルにおいて、観察される。追加のpCGN
3828−形質転換体をまた分析して、なおいっそう高いラ
ウレート含量を有する植物を同定する。

【０１１９】半分の種子の分析をまた実施して、形質転
換された植物からの成熟種子の中のラウレートレベルを
決定する。半分の種子の分析のために、種子をペトリ皿
の中の湿った（２〜３mlの水）濾紙のディスク上に配置
し、これを密閉しそして室温または30℃において20〜48
時間暗所に放置する。発芽した種子は種子の外殻から突
起する２〜５mmの小根を有する。微細なピンセットを使
用して各実生をその外殻から取り出し、そして外側の子
葉を裂く。細く切った子葉を４mlのバイアルの中に入
れ、そして脂肪酸の分析前に 110℃の炉内で２〜12時間
乾燥する。

【０１２０】細く切った実生を12パックの容器内の鉢植
えの土の中に直接植え、霧で覆い、透明なプラスチック
のふたでカバーし、22℃の成長チャンバーの中に 150〜
200マイクロアインシュタインｍ^-2Ｓ^-1の光強度におい
て16時間／８時間の光期間で入れ、そして成長させてＴ
２（第２世代の形質転換体）植物を生産させる。あるい
は、成熟した種子の削り取った部分を使用して半分の種
子の分析を実施する。種子を細く切るスコープの下に保
持し、そして、胚軸を回避して、種子のほぼ30％のチッ
プを取り出す。種子のチップをGCにより脂肪酸分析に使
用し、そして残りの種子の部分をマイクロタイター皿中
の水の中で５〜７日間発芽させ、土に移し、そして成長
させてＴ２種子を生産させる。

【０１２１】144 個の測定したpCGN3828−35の半分の種
子のラウレート含量は４〜42モル％の範囲である。 214
個の測定したpCGN3828−23の半分の種子のラウレート含
量は12〜50モル％の範囲である。pCGN3828−23またはpC
GN3828−35植物から分析した種子はゼロのラウレートを
もたず、これらの形質転換体がそれらのゲノムの中に３
またはそれ以上のチオエステラーゼインサートを有する
ことを示す。さらに、それらの種子の中に10〜20モル％
のラウレートを有するpCGN3828−形質転換体のほぼ60個
の半分の種子を使用する分析は、これらの植物がゲッケ
イジュ・チオエステラーゼ遺伝子の１〜２つの挿入を有
することを示す。

【０１２２】トランスジェニックブラシカ・ナプス（Br
assica napus）種子の最終結果を検査するために、２つ
のトランスジェニック植物であるpCGN3828−23およびpC
GN3828−７の成熟トランスジェニック種子から抽出した
異なる脂質クラスの脂肪酸組成を検査した。リン脂質の
TLC 分析は、ラウレートのほとんど 100％がTAG 分画の
中に存在することを示す。TAG のsn−２およびsn−１＋
３位置のアシル組成の分析を、膵臓リパーゼのプロトコ
ル（Brockerhoff (1975)、前掲）を使用して実施する。
このプロトコルを使用して理想的には、リパーゼは脂肪
酸をsn−１およびsn−３位置から切断し、そしてsn−２
位置から切断しない。

【０１２３】こうして、生ずるモノ−グリセリドの中の
脂肪酸はsn−２位置にあるものであると推定される。こ
の方法を使用するラウレート形質転換体の中のTAG の初
期の研究は、Ｃ16：０脂肪酸がsn−２位置に組み込まれ
ないことを示す。しかしながら、この方法に従いより短
い鎖の脂肪酸を有するTAG を研究しようとする従来の試
み（Entressaglesら(1964) Biochim. Biophys. Acta 8
4： 140−148)は、sn−２位置に位置するより短い鎖の
脂肪酸をこのような消化の間に急速に加水分解されるこ
とを報告し、これはジグリセリドおよびモノグリセリド
の中の外側の位置に向かう内部のより短い鎖の脂肪酸の
自発的移動の結果であるとして著者らは報告してること
が認められる。

【０１２４】pCGN3828を含有する形質転換された植物の
追加の分析を実施して、これらの植物におけるゲッケイ
ジュ・チオエステラーゼの発現を特徴づける。pCGN3828
−23形質転換体の発育する種子の中の抽出可能なＣ16：
０チオエステラーゼ活性を測定し、そしてそれは内因性
18：１チオエステラーゼ活性よりかなり高いと決定され
た。形質転換された植物における高いゲッケイジュ・チ
オエステラーゼ活性にかんがみて、ラウレートの生産を
最適化する追加の因子を研究している。

【０１２５】形質転換された3828−23の中の処理された
（35kD）ゲッケイジュ・チオエステラーゼの存在を、こ
の植物からの種子の発育の時間過程のウェスタン分析に
より研究する。ゲッケイジュ・チオエステラーゼに対す
るモノクローナル抗体およびビオチン標識化第２抗体を
使用して、実験を実施する。これらの研究において、ブ
ラシカ（Brassica）の中の主要な種子貯蔵タンパク質は
ゲッケイジュ・チオエステラーゼと同一の移動度で移動
し、非特異的バックグラウンドの染色を引き起こすこと
が示される。しかしながら、ゲッケイジュAbと反応する
ほぼ42kDの見掛けの分子量のバンドが形質転換されたラ
ウレート生産性植物の中に検出される。この見掛けの分
子量は未処理のゲッケイジュ・チオエステラーゼのそれ
と一致する。

【０１２６】非特異的バックグラウンドの染色を減少す
るために、別のウェスタン検出法が研究されている。例
えば、第２抗体をアルカリ性ホスファターゼにカップリ
ングする第２抗体法はバックグラウンドの染色を減少さ
せる。ゲッケイジュ・チオエステラーゼの蓄積は授粉後
第24日に低いレベルで検出可能であり、強いシグナルは
授粉後第30〜40日から種子の中に観察される。初期の結
果が示唆するように、シグナルの大部分は42kDの未処理
プレプロタンパク質であり、チオエステラーゼ抗原のわ
ずかに10〜20％が34kDで移動するだけである。これらの
研究が示唆するように、ゲッケイジュ・チオエステラー
ゼの異常なトランシットペプチドはブラシカ（Brassic
a）において最適でない色素体のターゲッティングを生
ずることがある。

【０１２７】上の発育時間の過程の種子試料のRNA 分析
において、ナピン誘導化ゲッケイジュ・チオエステラー
ゼmRNAは全体の内因性ナピンのメッセージと同一の反応
速度論で蓄積し、ピークの転写は27〜50日の範囲内にあ
る。こうしてゲッケイジュ・チオエステラーゼ活性は貯
蔵油の合成の開始より約５〜７日だけ遅れ、そしてゲッ
ケイジュ・チオエステラーゼのより早い発現は成熟種子
の中の全体のラウレートレベルに有意の衝撃を与えるこ
とができる。上の種子試料のACPおよびステアロイル−A
CP デサチュラーゼ転写体のノザン分析において、これ
らの遺伝子の天然の転写体はナピンプロモーターにより
生産されたゲッケイジュ・チオエステラーゼ転写体より
３〜５日だけ早く蓄積することが示される。

【０１２８】これらのデータが示唆するように、ACP お
よびステアロイル−ACP デサチュラーゼ遺伝子のプロモ
ーターはゲッケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子のより
早い発現のため有用であることがある。ブラシカ・ラパ
（Brassica rapa)のステアロイル−ACP デサチュラーゼ
のためのcDNAおよびブラシカ・ラパ（B.rapa) ACP のた
めのプロモーター領域のクローニングは記載された(Knu
tzonら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89：2624−262
8；Scherer ら(1992) Plant Mol. Biol. 18： 591−59
4)。

【０１２９】ブラシカ・ラパ（B. rapa) ACPプロモータ
ーのほぼ 1.5kbの範囲からの発現のために位置する 1.2
kbのゲッケイジュ・チオエステラーゼ遺伝子の断片を有
する構成体（pCGN3836）、およびナピン３′調節領域の
ほぼ 0.3kbを含有する、形質転換されたアラビドプシス
（Arabidopsis)植物が得られた。pCGN3836形質転換され
た植物からの種子をラウレート含量について分析する
と、ラウレートがこれらの種子において検出可能なレベ
ルに蓄積しないことが示される。しかしながら、ゲッケ
イジュ・チオエステラーゼの発現のタイミングおよびタ
ーゲッティングがトランスジェニックブラシカ（Brassi
ca）種子において最適化されるとき、少量のチオエステ
ラーゼは大量のラウレートをつくることは、ゲッケイジ
ュにおいて起こるように思われるので、可能であり、そ
してゲッケイジュ・チオエステラーゼのより低いレベル
の発現は十分であることがある。

【０１３０】実施例４ − トランスジェニック植物 チオエステラーゼ構成体で形質転換された植物を、チオ
エステラーゼ活性および脂肪酸組成およびトリグリセリ
ド組成について分析した。 Ａ．アラビドプシス（Arabidopsis) pCGN3816およびpCGN3821で形質転換された自殖トランス
ジェニックアラビドプシス・タリアナ（A. thaliana)植
物からのアラビドプシス（Arabidopsis)種子を、12：０
および14：０アシル−ACP チオエステラーゼ活性につい
て分析する。発育する種子をチオエステラーゼ測定緩衝
液(Pollardら、前掲）で抽出し、そして可溶性分画を測
定する。トランスジェニック種子は、対照を越えた、1
2：０チオエステラーゼ活性の有意の増加を示す。ま
た、14：０−ACP の加水分解は増加するが、より小さい
規模で、形質転換された大腸菌（E.coli) からの酵素特
異性のデータと一致する。

【０１３１】成熟アラビドプシス・タリアナ（A. thali
ana)種子の全体の脂肪酸分析は、対照植物の種子におい
て測定された０％のラウレートに比較して、前述の構成
体で形質転換された植物において５％までのラウレート
を明らかにする。図７が証明するように、ラウレート％
はトランスジェニック種子においてラウロイルチオエス
テラーゼ活性と直接的に相関関係を有する。また、トラ
ンスジェニック種子の中のミリステート含量は 0.1％
（対照）から最高の発現体における 0.7％まで増加し、
そしてまたミリストイルチオエステラーゼ活性と相関関
係を有する。薄層クロマトグラフィー(TLC）によるトリ
グリセリドの分析は、全体の脂肪酸分析により検出され
たラウレートが中性の脂質分画の中に存在することを示
し、ラウレートがトリグリセリドの中に組み込まれた
（エステル化された）ことを証明する。

【０１３２】pCGN3828で形質転換されたアラビドプシス
・タリアナ（A.thaliana）植物からの成熟種子を、実施
例２において詳述するように、Browseら（Anal. Bioche
m. (1986)152： 141−145)に本質的に記載されているよ
うにGCにより全体の脂肪酸について分析する。これらの
研究は、その種子がほぼ17重量％（23.5モル％) までの
ラウレートを含有する、少なくとも１つの植物3828−13
を明らかにする。この形質転換された植物からの成熟種
子を膵臓リパーゼ消化のプロトコル（Brockerhoff (197
5) Meth. Enzymol. 35： 315−325)にかけて、sn−２お
よびsn−１＋３（組み合わされた）位置のアシル組成を
区別する。これらの分析からの予備的結果は次の通りで
ある：

【０１３３】

【表５】 これらの予備的結果が示唆するように、中位鎖脂肪酸は
トリグリセリド分子のsn−１および／またはsn−３位置
に効率よく組み込まれる。（この技術のそれ以上の論考
は下に与えられている。） 異なる実験において、12：０−ACP チオエステラーゼ活
性について試験した26のpCGN3828形質転換アラビドプシ
ス（Arabidopsis)植物のうちで、７つが陽性と試験され
た。ラウレートの発現について陰性の「形質転換体」の
存在は、アラビドプシス（Arabidopsis)の形質転換法が
根を形成する段階における選択を含まないので、驚くべ
きことではない。

【０１３４】こうして、ラウレート陰性植物は形質転換
されない「エスケープ（escapes)」ならびにゲッケイジ
ュ・チオエステラーゼ遺伝子を発現しない形質転換され
た植物を包含することが期待されるであろう。これらの
７つの陽性の植物からの成熟種子(100個の種子のプー
ル) の分析は、陽性の植物が対照の中には存在しない有
意な量の12：０を含有することを示す。12：０の量は
2.1〜23.5モル％の範囲であり、そしてチオエステラー
ゼ活性とほぼ相関関係を有する。種子の全体の脂肪酸の
含量は典型的にアラビドプシス（Arabidopsis)において
見られる範囲内であり、12：０の堆積が油の収量に悪影
響を及ぼさないことを示唆する。種子の発育または形態
に明らかな作用は観察されない。脂質のクラスの分析(T
LC）において、トリグリセリド分画が全体の抽出可能な
脂肪酸と同一比率のラウレートを含有すること、すなわ
ち、これらのレベルにおいて、12：０がトリグリセリド
の中に容易に組み込まれることが証明される。

【０１３５】少量の14：０はまたトランスジェニックア
ラビドプシス（Arabidopsis)種子の中に蓄積する。種子
の中の12：０／14：０の比は、12：０−ACP および14：
０−ACP についてのin vitroチオエステラーゼ活性の比
に類似する。12：０および14：０生産物の間の一定に近
い比は、多分、12：０−ACP および14：０−ACP に向か
うゲッケイジュ・チオエステラーゼの特異性を反映し、
そしてその酵素がトランスジェニック種子の中で12：０
−ACP および14：０−ACP の同様な大きさのプールへの
直接の作用によりin vivo で機能することを示唆する。
ゲッケイジュ・チオエステラーゼは10：０−ACP にin v
ivo で有意の作用をもたないように思われ、そしてほん
の微量の10：０がトランスジェニック種子において検出
されるだけである。

【０１３６】追加の研究を実施して、中位鎖が「天然
の」アラビドプシス（Arabidopsis)の脂肪酸のすべて
を、あるいはほんの一部分を犠牲にして合成されるかど
うかを決定した。対照アラビドプシス（Arabidopsis)植
物からの 100個の成熟種子の平均の脂肪酸組成を、トラ
ンスジェニック植物3828−13からのそれと比較した。こ
れらの標準の結果を図37に示す。２つの植物の12：０お
よび14：０の含量の差は明らかであるが、中位鎖生産の
結果、他の脂肪酸の含量の差は同定がいっそう困難であ
る。全体の脂肪酸含量はアラビドプシス（Arabidopsis)
植物の間でかなり変動し、絶対的脂肪酸レベルの比較を
非常に困難とする。これらの差を排除するためのデータ
の表示（％）（全体の脂肪酸＝100)は、解釈をさらに困
難とした。

【０１３７】こうして、独特の脂肪酸の組成を典型的な
植物間の変動と区別する１つの方法を次のようにして案
出した。26のＴ１アラビドプシス（Arabidopsis)植物か
らの成熟（Ｔ２）種子の全体の脂肪酸含量を増加する順
序で配置し、そして図38に示すように値のなめらかな広
がりを生成した。６つの最高のラウレート生産物を、対
応する重量％の12：０のデータとともに、矢印で示す。
12：０の生産のレベルと全体の脂肪酸含量の間に関係が
存在しないように思われる。図39において、データは同
一の方法であるが、３つの脂肪酸について個々に序列し
て示されている。

【０１３８】18：２および16：０についてのデータはま
たなめらかな線を形成したが、ただしラウレートが蓄積
する陽性の事象を除外する。それらの場合において、1
8：２および16：０の含量は全体の傾向より顕著に低
く、12：０がこれらの種子において18：２および16：０
を犠牲にして生産されたことを示す。これはまた18：
１,20：１および20：２について真実である。12：０の
生産により比較的影響を受けない唯一の主要な脂肪酸構
成成分は、図39に示すように、18：３であったが、低い
18：３の対照は、例えば、植物10において見いだすこと
ができる。

【０１３９】Ｂ．ブラシカ（Brassica） pCGN3816で形質転換されたブラシカ・ナプス（Brassica
napus）からの種子を、また、前述したように全体の脂
肪酸についてGCにより分析する。形質転換された植物
（Ｔ１植物）からの単一の分離する種子（Ｔ２種子）の
分析は、形質転換されない対照植物からの種子における
０％に比較して、０〜14.5％の範囲のＣ16：０のレベル
を明らかにする。Ｃ16：０のレベルは、図35に証明され
ているように、対応する未熟の種子におけるＣ16：０−
ACP チオエステラーゼ活性と相関関係を有する。さら
に、Ｃ14：０はまたこれらの種子の中にＣ16：０のレベ
ルと相関関係を有するレベルで検出されるが、Ｃ14：０
のレベルはより低い。

【０１４０】ラウレートを含有するTAG の分析に使用し
たGC温度のプログラムに対して小さい変更を行うことが
できる。追加の有用な温度サイクルは次の通りである：
160℃で３分間、次いで５°／分で 240℃の温度への温
度の傾斜、 240℃の温度を６分間保持する；これは26分
の合計の実施時間を生ずる。

【０１４１】pCGN3824（ナピン／チオエステラーゼ）お
よびpCGN3828（ナピン／チオエステラーゼ／ナピン）を
含有する形質転換されたブラシカ・ナプス（Brassica n
apus）植物を分析して、種子の脂肪酸組成を決定した。
pCGN3824で形質転換された34の植物およびpCGN3828で形
質転換された31の植物からプールした種子を分析して
（25〜50個の種子／測定）、種子の中のラウレートのレ
ベルを決定する。所定％のラウレートを有するトランス
ジェニック事象の数として表した、これらの分析の結果
を、図40及び図41に表す。pCGN3824−形質転換体は、そ
の種子が17モル％のラウレートを含有した単一の植物を
除外して、０〜11モル％の範囲のラウレート含量を有し
た。pCGN3828構成体の植物は１〜17モル％のラウレート
含量を有し、この範囲外の２つの代表的なものは37モル
％のラウレート（植物3828−23）および27モル％のラウ
レート（植物3828−35）を有した。ラウレートを含有す
ることに加えて、これらの植物の種子の油は、また、ほ
ぼ16％のラウレートレベルに相当する、より少ない量の
14：０脂肪酸を有する。

【０１４２】半分の種子の分析をまた実施して、形質転
換された植物からの成熟種子の中のラウレートレベルを
決定する。半分の種子の分析のために、種子をペトリ皿
の中の湿った（２〜３mlの水）濾紙のディスク上に配置
し、これを密閉しそして室温または30℃において20〜48
時間暗所に放置する。発芽した種子は種子の外殻から突
起する２〜５mmの小根を有する。微細なピンセットを使
用して各実生をその外殻から取り出し、そして外側の子
葉を裂く。細く切った子葉を４mlのバイアルの中に入
れ、そして脂肪酸の分析前に 110℃の炉内で２〜12時間
乾燥する。

【０１４３】細く切った実生を12パックの容器内の鉢植
えの土の中に直接植え、霧で覆い、透明なプラスチック
のふたでカバーし、22℃の成長チャンバーの中に 150〜
200マイクロアインシュタインｍ^-2Ｓ^-1の光強度におい
て16時間／８時間の光期間で入れ、そして成長させてＴ
２（第２世代の形質転換体）植物を生産させる。あるい
は、成熟した種子の削り取った部分を使用して半分の種
子の分析を実施する。種子を細く切るスコープの下に保
持し、そして、胚軸を回避して、種子のほぼ30％のチッ
プを取り出す。

【０１４４】種子のチップをGCにより脂肪酸分析に使用
し、そして残りの種子の部分をマイクロタイター皿中の
水の中で５〜７日間発芽させ、土に移し、そして成長さ
せてＴ２植物を生産させる。15の代表的なpCGN3828−23
の半分の種子の全体の脂肪酸のモル％として脂肪酸組成
を与えるチャートを表６に示す。形質転換しない再生さ
れた植物から集めた単一の種子からの同様なデータを表
７に示す。データは前述したようにGCの半分の種子の分
析からのものである。

【０１４５】

【表６】

【０１４６】

【表７】

【０１４７】144 個の測定したpCGN3828−35の半分の種
子（Ｔ１植物から得たＴ２種子）のラウレート含量は４
〜42モル％の範囲である。 214個の測定したpCGN3828−
23の半分の種子のラウレート含量は12〜50モル％の範囲
である。pCGN3828−23またはpCGN3828−35植物から分析
した種子はゼロのラウレートをもたず、これらの形質転
換体がそれらのゲノムの中に３またはそれ以上のチオエ
ステラーゼインサートを有することを示す。Ｔ２世代か
ら生産された種子の分析はさらにこの結果を確証するで
あろう。さらに、それらの種子の中に10〜20モル％のラ
ウレートを有するpCGN3828−形質転換体のほぼ60個の半
分の種子を使用する分析は、これらの植物がゲッケイジ
ュ・チオエステラーゼ遺伝子の１〜２つの挿入を有する
ことを示す。

【０１４８】トランスジェニックブラシカ・ナプス（Br
assica napus）種子の最終結果を検査するために、２つ
のトランスジェニック植物であるpCGN3828−23およびpC
GN3828−７の成熟トランスジェニック種子から抽出した
異なる脂質クラスの脂肪酸組成を検査した。リン脂質の
TLC 分析は、ラウレートのほとんど 100％がトリアシル
グリセリド(TAG）分画の中に存在することを示す。TAG
のsn−２およびsn−１＋３位置のアシル組成の分析を、
膵臓リパーゼのプロトコル（Brockerhoff (1975)、前
掲）を使用して実施する。このプロトコルを使用して理
想的には、リパーゼは脂肪酸をsn−１およびsn−３位置
から切断し、そしてsn−２位置から切断しない。こうし
て、生ずるモノ−グリセリドの中の脂肪酸はsn−２位置
にあるものであると推定される。

【０１４９】この方法を使用するラウレート形質転換体
の中のTAG の初期の研究は、Ｃ16：０脂肪酸がsn−２位
置に組み込まれないことを示す。しかしながら、この方
法に従いより短い鎖の脂肪酸を有するTAG を研究しよう
とする従来の試み（Entressaglesら（1964）Biochim. B
iophys. Acta 84 ： 140−148)は、sn−２位置に位置す
るより短い鎖の脂肪酸をこのような消化の間に急速に加
水分解されることを報告し、これはジグリセリドおよび
モノグリセリドの中の外側の位置に向かう内部のより短
い鎖の脂肪酸の自発的移動の結果であるとして著者らは
報告しいることが認められる。

【０１５０】pCGN3828構成体を含む形質転換された植物
の付加的な分析を、これらの植物内でのゲッケイジュ・
チオエステラーゼの発現をさらに特徴づけするべく実施
する。pCGN3828−23形質転換体の種子を発達させる上で
の抽出可能なＣ12：０チオエステラーゼの活性が測定さ
れ、内因性18：１チオエステラーゼ活性よりもかなり高
いものであることが見極められる。遺伝子導入植物にお
ける高いゲッケイジュ・チオエステラーゼ活性を考慮し
て、ラウリン酸塩の産生の最適化のため付加的な因子が
調査されつつある。

【０１５１】形質転換を受けた3828−23植物中の処理さ
れた（34kD）ゲッケイジュ・チオエステラーゼの存在
は、この植物からの種子の発達過程のウェスタン分析に
より調査される。ゲッケイジュ・チオエステラーゼに対
するポリクローナル抗体及びビオチンで標識付けされた
第２の抗体を用いて実験が実施される。これらの研究
は、アブラナ内の主要な種子貯蔵タンパク質がゲッケイ
ジュ・チオエステラーゼと同じ易動度で移動し、非特異
的バックグラウンド染色をひき起こすことを示してい
る。しかしながら、形質転換を受けたラウリン酸塩産生
植物内では、月桂樹抗体と反応する約42kDの見かけの分
子量のバンドが検出される。この見かけの分子量は未処
理のゲッケイジュ・チオエステラーゼのものと一致して
いる。

【０１５２】非特異的バックグラウンド染色を低減する
ため、代替的なウェスタン検出方法が研究されつつあ
る。例えば、第２の抗体がアルカリ性ホスファターゼに
結合されている第２の抗体方法は、結果としてバックグ
ラウンド染色を低減させる。ゲッケイジュ・チオエステ
ラーゼの蓄積は、受粉後24日目で低レベルで検出でき、
受粉後30日目〜40日目で種子内に強いシグナルが観察さ
れる。最初の結果は、大部分のシグナルが42kDの未処理
プレタンパク質であり、チオエステラーゼ抗体のうちわ
ずか10〜20％だけが34kDで移動していることを示唆して
いる。これらの研究は、ゲッケイジュ・チオエステラー
ゼの尋常でないトランジットペプチドがアブラナ内の最
適でないプラスチド（有色体）ターゲティングという結
果をもたらしうるということを示唆している。

【０１５３】上述の発達過程の種子試料のRNA 分析は、
27〜50日の範囲内でのピーク転写を伴ってナピン駆動の
ゲッケイジュ・チオエステラーゼmRNAが完全内因性ナピ
ンメッセージと同じ動態で蓄積することを示している。
従って、ゲッケイジュ・チオエステラーゼ活性は、約５
〜７日だけ貯蔵油合成の開始より遅れ、ゲッケイジュ・
チオエステラーゼのより早い発現が成熟種子内の合計ラ
ウリン酸塩レベルに対し重大な影響を与えることができ
る。上述の種子試料内のACP 及びステアロイル−ACP デ
サチュラーゼ転写物のノーザン分析は、これらの遺伝子
の未変性転写物がナピンプロモータにより産生された月
桂樹チオエステラーゼ転写物よりも３〜５日早く蓄積す
ることを示している。

【０１５４】これらのデータは、ACP 及びステアロイル
−ACP デサチュラーゼ遺伝子プロモータがゲッケイジュ
・チオエステラーゼ遺伝子のより早い発現にとって有用
でありうることを示唆している。Brassica rapa ステナ
ロイル−ACP デサチュラーゼのためのcDNA及びB.rapa A
CPのためのプロモータ領域のクローニングについて記述
されてきた（Krutzon et al. (1992) Proc. Nat. Acad.
Sci, 89：2624−2628；Scherer et al.(1992) Plant M
ol. Biol 18 ： 591−594)。

【０１５５】B.rapa ACPプロモータの約 1.5kbの領域及
びナピン３′調節領域の約 0.3kbから発現のために位置
づけされた 1.2kbの月桂樹チオエステラーゼ遺伝子フラ
グメントをもつ構成体（pCGN3836）を含む形質転換され
たArakids-psis植物が得られた。pCGN3836形質転換植物
からの種子のラウリン酸塩含有量についての初期の分析
は、ラウリン酸塩がこれらの種子中で検出可能なレベル
で蓄積しないことを示している。しかしながら、遺伝子
導入アブラナ種子内でゲッケイジュ・チオエステラーゼ
の発現タイミング及びターゲティングが最適化された場
合、ゲッケイジュ・において起こると思われるとおり少
量のチオエステラーゼが大量のラウリン酸塩を作り、ゲ
ッケイジュ・チオエステラーゼのより低いレベルの発現
で充分でありうるということが可能である。

【０１５６】例５−その他の植物チオエステラーゼの獲
得 Ａ．植物チオエステラーゼの付加的な供給源 前述の例で同定されたゲッケイジュ・及びサフラワーチ
オエステラーゼに加えて、その他の植物も脂肪アシル鎖
の長さ及び飽和度に関して変化する特異性を有する望ま
しいチオエステラーゼの供給源である。このような付加
的な植物のチオエステラーゼは、さまざまな植物油のト
リアシルグリセリド組成を分析すること及び適切なアシ
ル−ACP 基質を用いて検定により確認される特異的チオ
エステラーゼの存在によって同定できる。

【０１５７】望ましいトリエステラーゼ酵素を有し得る
その他の植物としてはニレ（Ulmaceae）及び樟脳(Cinna
momum camphora) がある。ニレの種子内にはかなりのパ
ーセントの10：０脂肪酸が検出され、樟脳からの種子中
には10：１及び12：０の脂肪酸の両方が顕著である。樟
脳及びニレからの発達中の胚芽内のチオエステラーゼ活
性についてテストするための生化学検定の結果が以下の
表８に示されている。

【０１５８】

【表８】

【０１５９】ニレの場合、より長鎖の基質での有意な活
性に加えて、Ｃ10：０−ACP 基質でチオエステラーゼ活
性のピークが見られる。この事実は、Ｃ10：０−ACP 基
質に向かっての特異的活性を伴うチオエステラーゼがニ
レの胚芽の中に存在するということを示唆している。Ｃ
12：０−ACP 基質に向かっての有意な活性が樟脳の抽出
物の中に検出されている。さらに、樟脳抽出物は、月桂
樹の胚芽からの類似の抽出物に比べてＣ10：０−ACP 基
質に向かってのより大きな活性を立証している。この事
実はＣ10：０−ACP 及びＣ12：０ACP 基質に向かっての
特異性を有する中位鎖アシル−ACP チオエステラーゼが
樟脳の胚芽内に存在するということを示唆している。

【０１６０】同様にして、より長鎖の脂肪アシルチオエ
ステラーゼ（Ｃ16又はＣ18）も得ることができる。例え
ば、ナンキンハゼ（SapiumSekiferum)の種子の獣脂（タ
ロー）層及び綿（Gossypium hirsutum）の種子油の中に
かなりの割合（45％）の16：０脂肪酸が見られる。（Gu
nstone, Harwood and Padley eds. The Lipid Handbook
(1986）Chapman and Hall, Ltd., The University Pre
ss, Cambridge)。

【０１６１】発達中のナンキンハゼの組織、綿の胚芽
（var. Stoneville 506 、開花後21日目）又はBrassica
napusの胚芽（cv. Delta 、開花後28日目）を各々約 2
50mgずつ、液体窒素下で乳鉢、乳棒で細粉末になるまで
摩砕し、モーター駆動の乳棒の備わったガラスホモシナ
イザー内で１mlの50mMリン酸ナトリウムpH7.5 、２mMの
ジチオトレイトール、2 mMのアスコルビン酸ナトリウ
ム、20％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１％ｗ／ｖの PVP
−10及び５mMのジエチルジチオカルバミン酸塩の中で均
質化することによって抽出する。マイクロ遠心分離管内
で15分間ホモジネートを遠心分離し、上清分画のアリコ
ートを以下のとおりチオエステラーゼ活性について検定
する。

【０１６２】ガラス製のネジトップ式バイアルの中で70
μｌの検定緩衝液に対し、検定緩衝液（７mMのリン酸カ
リウム、pH8.0, 20 ％ｖ／ｖのグリセロール、0.02％ｗ
／ｖのトリトンＸ−100,１mMのジチオトレイトール）中
の上清の１／20希釈液25μｌを付加する。反応を開始す
るため50pmolesの〔14Ｃ〕−放射線標識づけされたアシ
ル基質を付加する。基質は、ラウロイル−ACP について
Pollard, et al, （前出）に記されているように合成さ
れた、ミリストイル−ACP(14：０−ACP)、パルミトイル
−ACP(16：０−ACP)、ステアロイル−ACP（18：０−AC
P)又はオレオイル−ACP(18：１−ACP)である。

【０１６３】バイアルを30分、30℃でインキュベートす
る。反応を酢酸で停止させ、 0.5mlの10％（ｖ／ｖ）低
温（４°）酢酸を付加し数分間氷上に反応混合物を置く
ことによりエーテルで遊離脂肪酸を抽出する。２mlのジ
エチルエーテルを付加し勢いよく混合することにより、
加水分解酵素作用の脂肪酸産物を加水分解されていない
基質から抽出する。エーテルを、シンチレーション計数
のため５mlのシンチレーション流体へと移送させる。望
ましい場合には活性をさらに精確に測定するため、残留
微量産物を回収するため付加的エーテル抽出を行なうこ
ともできる。綿、ナンキンハゼ及びアブラナに関する基
質特異性分析の結果を表９に示す。

【表９】

【０１６４】綿とナンキンハゼの両方において16：０−
ACP 基質ならびに18：１−ACP 基質で活性ピークが見ら
れるのに対し、アブラナの種子は18：１−ACP で有意な
活性を示しているにすぎない。16：０脂肪−アシルACP
に対する特異性をもつアシル−ACP チオエステラーゼ
が、ナンキンハゼ及び綿のトリアシルグリセリド組成を
説明しているように思われる。

【０１６５】ヘパリン−アガロース上でクロマトグラフ
ィに付した綿の胚芽の抽出物中にチオエステラーゼ活性
の２つのピークが観察される。このクロマトグラフィ
は、２つの異なるチオエステラーゼ、すなわちゲッケイ
ジュ・抽出物からの18：１チオエステラーゼと12：０−
ACP チオエステラーゼを分離するものであることが立証
されている（Pallard, et al., Areh. Biochem, Biophy
s, (1991) 284 ： 306−312)。綿抽出物のクロマトグラ
フィから観察された活性の２つのピークのうち、第１の
ピークは16：０活性よりも高い18：１活性を有し、第２
のピークは18：１活性よりも高い16：０活性を有する。
このデータは、綿の中に全く異なる特異性をもつ２つの
酵素が存在することを示唆している。

【０１６６】さらに、マンゴー (Mangifera indica）の
仁の油は、トリアシルグリセロール中に24〜49％のステ
アリン酸及び６−18％のパルミチン酸を含んでおり、こ
の油は、カカオ脂の代用品として使用できることが示唆
されてきた（Osman, S.M.,「マンゴー脂肪」、New Sour
ces of Fats and Oils( 新たな油脂供給源）内、（1981
年）、Pryde, E.H, Princin, L.H.,及びMukherjee, K.
D., American Oil Chemist Society)。上述の例と同様
に、胚芽抽出物の生化学検定により18：０−ACP特異性
をもつチオエステラーゼを立証することができる。

【０１６７】Ｂ．チオエステラーゼ遺伝子の分離 ゲッケイジュ・及びサフラワーのチオエステラーゼの配
列（アミノ酸及びDNA)を獲得した後、上述のもののよう
なその他の植物供給源からの類似の遺伝子も容易に分離
することができる。この例では、その他のチオエステラ
ーゼ遺伝子を分離するのに２つの方法が記述される：す
なわちゲッケイジュ・及びサフラワーチオエステラーゼ
遺伝子からの配列又はペプチド配列情報を利用した DNA
ハイブリダイゼーション技術による方法及び（２）プロ
ーブとしてゲッケイジュ・タンパク質に対する抗体を用
いた免疫学的交叉感受性による方法である。

【０１６８】これらの技術のいずれにおいても、望まれ
る植物からのcDNA又はゲノミックライブラリが必要とさ
れる。cDNA又はゲノミックライブラリを構築する数多く
の方法がManiatis et al. の第８章及び第９章において
提供されている（MolecularCloning ：A Laboratory Ma
nual(分子クローニング、研究室マニュアル）第２版（1
989）Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, New York)。

【０１６９】その他の植物チオエステラーゼ遺伝子を分
離するべく DNAハイブリダイゼーションにおいて使用す
るためのプローブは、提供されたゲッケイジュ・及びサ
フラワーのチオエステラーゼ遺伝子配列から、又は代替
的にはチオエステラーゼペプチド配列からのオリゴヌク
レオチドを用いたPCR によって得ることができる。この
例においては、プローブとしてPCR で生成した DNAフラ
グメントを用いる。適当なハイブリダイゼーション条件
を決定するため望ましい植物の種からの胚芽RNA のノー
ザン分析を行なう。ホルムアルデヒド／アガロースゲル
内でRNA を電気泳動し、Fourney, et alにより記述され
ているように、ナイロン膜フィルターへ移送させる（Fo
cus (1988) Bethesda Research Laboratories ／Life T
echnologies, Inc., 10：５−７）。50％のホルムアミ
ド、６×SSC（又は６×SS PE)、５×デンハート試薬、
0.5％のSPS 及び 100μｇ／mlの変性サケ精子DNA フラ
グメントを含むハイブリダイゼーション溶液に³²Ｐ−標
識付けされたプローブ（Random Primed DNA（ランダム
プライムドDNA)標識付けキット、Boehringer Manheim,I
ndiana-polis, IN)を付加する。

【０１７０】標識付けされたプローブを含むハイブリダ
イゼーション溶液を18時間以上約40℃でノーザンフィル
ターを用いてインキュベートして相同（50〜80％）の配
列に至るまでプローブをハイブリダイゼーションさせ
る。次にフィルターを低ストリンジェント性で洗浄する
（約１×SSC 内で室温から42℃まで）。Belty et al.
(Methods in Enzymology（酵素学方法)(1983)100： 266
−285) で論述されているようにプローブの予測融点に
基づいて、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を調
整することができる。さらなる試験においては、ハイブ
リダイゼーション又は洗浄段階のいずれかで温度を上昇
させ、及び／又は塩含有量を低下させて特異的ハイブリ
ダイゼーション配列の検出を改善する。

【０１７１】上述のように有用なプローブ及び適切なハ
イブリダイゼーション及び洗浄条件を識別した後、³²Ｐ
標識付けフラグメント及び最適化された条件を用いてcD
NAライブラリをスクリーニングする。例えば、チオエス
テラーゼクローンpCGN3263の〜600bp Bam HI／XhoIフラ
グメントを放射線標識付けし、B.campestris胚芽cDNAラ
イブラリからチオエステラーゼクローンを分離するため
非相同プローブとしてこれを使用する。アブラナチオエ
ステラーゼcDNAクローンのDNA 配列は図31〜図34に示さ
れている。又、提案されるATG 開始コドンからの翻訳さ
れたアミノ酸配列も共に示されている。DNA 配列内に幾
分かの変動を示す付加的なアブラナクローンも同様に分
析されている。

【０１７２】プローブとして非相同チオエステラーゼ遺
伝子を用いる直接ハイブリダイゼーション技術に加え
て、ハイブリダイゼーションのためのプローブを作り出
すため又は望まれる植物供給源からのmRNA又はDNA から
チオエステラーゼコーディング配列を生成するために、
PCR技術を使用することもできる。例えば、樟脳 (Cinna
momum camphora）チオエステラーゼクローンを、月桂樹
及びサフラワーチオエステラーゼクローンからのアミノ
酸及び核酸配列情報を用いて分離することができる。発
達中の樟脳胚芽から分離したRNA に対するゲッケイジュ
・チオエステラーゼcDNAクローンの相同性を、以下のと
おりノーザン分析により観察する。「Current Protocol
sin Molecular Biology(分子生物学における現行のプロ
トコル）」Ｐ4.3.1 〜4.3.4(Ausubel et al., eds.(198
7), John Wiley & Sons）に記述されている SDS／フェ
ノール抽出方法を適合させることによって、発達中の樟
脳胚芽１ｇから全RNA を分離する。

【０１７３】この抽出のための摩砕緩衝液は、 100mMの
LiCl, 100mM のTrispH９，10mMのEDTA，１％のSDS 及び
0.5％のβ−メルカプトエタノールを含む。１ｇの胚芽
からの抽出のためには、pH８に平衡化した３mlのフェノ
ールと10mlの摩砕緩衝液を粉末化された胚芽に付加す
る。ホモジナイゼーション段階は、公表された方法にお
いてそうであるようにポリトロンを用いてではなく乳鉢
の中で行なうこともでき、この方法でホモジナイゼーシ
ョンに続く加熱段階は省かれる。遠心分離、試料のフェ
ノール／クロロホルム抽出及びRNA のLiCl沈降は、記述
されているとおりである。

【０１７４】ホルムアルデヒド／アガロースゲル内で全
RNA(10〜20μｇ）を電気泳動させ、Fourney et al.（前
出）が記述しているとおり、ナイロン膜フィルターへと
移送する。ノーザンフィルタのハイブリダイゼーション
のためのプローブを、約1300bpフラグメントを生成する
べくサフラワーチオエステラーゼcDNA配列に対しオリゴ
ヌクレオチドを用いてPCR により全長ゲッケイジュ・チ
オエステラーゼcDNAであるpCGN3822の SalI 消化物から
調製する。順方向プライマーはサフラワーチオエステラ
ーゼcDNA配列(SEQ ID NO：38）のヌクレオチド 212〜22
8 を含み、逆方向プライマーは、cDNA配列のヌクレオチ
ド1510〜1526に対する相補体である。

【０１７５】フラグメントは、Prep-A-Gene DNA 精製キ
ット（BioRad；Richmond, CA）を用いてゲル精製され、
Boehringer Manheim (Indiana-polis, IN)ランダムプラ
イミング標識付けキットを用いて放射線標識づけされ
る。ノーザンフィルターを、30℃で、50％のホルムアミ
ド、５×SSC ，50mMのリン酸ナトリウム（pH7)，５×デ
ンハート溶液、 0.1％のSDS, ５mMのEDTA及び 0.1mg／
mlの変性DNA の中で一晩ハイブリダイゼーションさせ
る。 0.1×SSC, 0.1％のSDS の中でフィルタを２度（毎
回15分）洗浄する。ハイブリダイズされたフィルタのオ
ートラジオグラフィは、樟脳の胚芽試料内で約1300bpの
RNA バンドまでの強いハイブリダイゼーションシグナル
を明らかにする。このバンドは、ゲッケイジュのmRNAと
ほぼ同じサイズである。

【０１７６】樟脳チオエステラーゼ遺伝子のフラグメン
トを得るためには、樟脳及びサフラワーのチオエステラ
ーゼの間に保存されたペプチドに対してオリゴヌクレオ
チドを用いてPCR を行なう。サフラワー及びゲッケイジ
ュのチオエステラーゼの翻訳されたアミノ酸配列の比較
を図36に示す。鋳型として逆転写された樟脳RNA を用い
てポリメラーゼ連鎖反応を行なう。これらの反応は、以
下のサイクルにプログラミングしたBiosycler Oven(Bio
s Corp；New Haven, CT)内で行なわれる。

【０１７７】

【表１０】

【０１７８】サイクルＮを６回実行反復し、その後、サ
イクルＰを37回実行反復する。PCR 産物のアガロースゲ
ル電気泳動により約 500〜600bp バンドが識別される。
これは、月桂樹チオエステラーゼ配列内のペプチドの間
の距離の分析から予測されたおおよそのフラグメントサ
イズである。PCR フラグメントを、適切なクローニング
ベクターへとクローニングさせ、チオエステラーゼ配列
を確認するためそのDNA 配列を決定する。樟脳のPCR フ
ラグメントは、図25〜図30に示されている。次に、樟脳
チオエステラーゼクローンを分離するため樟脳cDNA又は
ゲノミックライブラリーをスクリーニングするのにこの
フラグメントを用いることができる。

【０１７９】遺伝子ライブラリをスクリーニングするこ
とに代わって、全チオエステラーゼエンコーディング配
列を回収するのに付加的なPCR 技術を用いることができ
る。例えば、樟脳チオエステラーゼPCR フラグメント配
列を用いて付加的な樟脳チオエステラーゼエンコーディ
ング配列を生成する。３′からPCR フラグメントの配列
については、Frohman et al.のRACE手順が利用される
（Proc. Nat. Acad Sci.(1988) 85：8998−9002) 。要
するに、cDNAは、200ng のRNA 、ポリ（Ｔ）オリゴヌク
レオチド（ＥcoRI, XhoI及びSalTについて５′の制限部
位を伴う）、及び逆転写酵素を用いて、樟脳の内胚乳ポ
リ（Ａ）＋RNA から生成される。この反応の産物はEcoR
I, XhoI 及びSalI認識部位をコードするオリゴヌクレオ
チド及び図25の樟脳遺伝子フラグメントのヌクレオチド
443−463 を表わすオリゴヌクレオチドと共にPCR ３′
RACEにおいて用いられる。反応は、以下のプログラムで
Biosycler オーブン内で実行される：

【０１８０】

【表１１】

【０１８１】この要領で、樟脳チオエステラーゼ遺伝子
配列の３′部分を表わす約700bp のフラグメントが得ら
れる。さらに、PCR を用いて、樟脳チオエステラーゼコ
ーディング配列の５′配列も同様に得ることができる。
この反応のために、基本的にFrohman et al.（前出）に
よって記述されているような逆転写反応においてランダ
ム六量体オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、樟脳
内胚乳ポリ（Ａ）＋RNA に対するcDNAが生成される。こ
の反応のcDNA産物は、末端デオキシヌクレオチドトラン
スフェラーゼを用いてＡ−テイリングされ、PCR におい
て使用される。この反応のためのオリゴヌクレオチドプ
ライマは、図１内のゲッケイジュ・チオエステラーゼ配
列のヌクレオチド 140−155 及び５′Bam HI認識部位を
含むMET-1-2898、及び図25の樟脳チオエステラーゼ遺伝
子フラグメントのヌクレオチド 115−126 に対して相補
的な配列を含む縮重オリゴヌクレオチドである2356であ
る。反応は以下のプログラムでBiosycler オーブン内で
実行される：

【０１８２】

【表１２】

【０１８３】この要領で樟脳チオエステラーゼ遺伝子配
列の５′部分を表わす約450bp のフラグメントが得られ
る。PCR 手順から挿入されたような制限部位を用いて適
当なクローニングベクターの形にさまざまな樟脳チオエ
ステラーゼ遺伝子フラグメントを組合わせる。この要領
で生成された樟脳チオエステラーゼ遺伝子の予備核酸配
列及び翻訳されたアミノ酸配列が、図25〜図30に示され
ている。

【０１８４】Cupheaチオエステラーゼに相応するDNA 配
列も同様に、PCR 方法を用いて得ることができる。プラ
イマとして使用するための縮重オリゴヌクレオチドは、
ゲッケイジュ・サフラワー及び樟脳のチオエステラーゼ
cDNAクローンの間で保存されたペプチドフラグメントか
ら指定できる。順方向プライマTECu3 は、ゲッケイジュ
（図５）及び樟脳（図28）チオエステラーゼタンパク質
のアミノ酸 283〜288及び図17のサフラワーチオエステ
ラーゼのアミノ酸 282−287に対する考えられる全ての
コーディング配列に相応する18のヌクレオチドを含む。

【０１８５】逆方向プライマーTECu4Aは、月桂樹（図
６）及び樟脳（図29）チオエステラーゼタンパク質のア
ミノ酸 315−320及び図８のサフラワーチオエステラー
ゼのアミノ酸 314−319 に対する考えられる全てのコー
ディング配列に相応する17のヌクレオチドを含んでい
る。さらに、順方向及び逆方向プライマは、それぞれ
５′末端にBamXI 又はXhoI制限部位を又３′末端にイノ
シンヌクレオチドを含んでいる。３′末端におけるイノ
シン残基は、縮重オリゴヌクレオチドプライマからの増
幅を強化するものであることが報告されている（Batzer
et al. (1991) Nucl.Acids Res. 19：5081）。サフラ
ワーペプチドは、指定されたペプチド領域の各々の中の
１つのアミノ酸においてゲッケイジュ及び樟脳の配列と
異なっており、従ってオリゴヌクレオチドプライマーの
縮重は、サフラワー及びゲッケイジュ／樟脳の両方の配
列をコードするようなものである。

【０１８６】ポリメラーゼ連鎖反応試料(100μｌ）は、
鋳型として逆転写されたCuphea hookeriana RNA 及び各
オリゴヌクレオチドプライマー１μＭずつを用いて調製
される。試料を５分間沸とうさせ、Taq 酵素を付加する
前に75℃まで冷却する。PCRを、以下の温度サイクルに
プログラミングされたPerkin-Elmerサーモサイクラーの
中で行なう: １分間94℃ １秒間65℃ ２分、40℃まで低下 30秒間40℃に保持 １分、72℃まで上昇 １秒、94℃まで上昇 サイクルを40回反復する。 次に72℃で２分の終了サイクルを実行する。

【０１８７】PCR 産物をアガロースゲル電気泳動により
分析し、チオエステラーゼペプチド配列からの予測され
たサイズである約120bp のDNA フラグメントを観察す
る。DNA フラグメントを分離し、PCR で挿入されたBam
HI及びXhoI制限消化物部位を用いて適当なプラスミドベ
クターへとクローニングする。クローニングしたフラグ
メントを配列決定し、（プライマーによりコードされた
12個のアミノ酸を含む）相応するゲッケイジュ（図３〜
図６）チオエステラーゼ配列の38個のうちの21個のアミ
ノ酸と整合する３つのクローンを同定する。

【０１８８】さらに１つのクローン、CuPHEA-14-2 を比
較することにより、相応する月桂樹Ｄ（図８〜図13）領
域内の25個のアミノ酸、樟脳チオエステラーゼ中22個、
そしてサフラワー２−１及び５−２でコードされたチオ
エステラーゼ配列内のそれぞれ22及び23個のアミノ酸
と、翻訳されたペプチド配列が整合しているということ
がわかる。CuPHE A-14-2クローンのDNA 配列及びチオエ
ステラーゼコード領域のアミノ酸翻訳は図42に示されて
いる。チオエステラーゼコードフラグメントは標識づけ
され、相応するチオエステラーゼcDNAを分離するためCu
phea hookerianacDNAライブラリをスクリーニングする
のに用いられる。

【０１８９】チオエステラーゼ配列の分析 DNA ハイブリダイゼーション又は免疫学的スクリーニン
グ技術を用いて識別されたクローンを次に精製し、Mani
atis et al. （前出）で提供されているような技術を用
いてDNA を分離する。クローンが関係するチオエステラ
ーゼをコードすることを確認するため、遺伝子のDNA 配
列を決定する。代替的には、E.coli内でタンパク質を発
現させてそれが望ましい活性を有することを示す。上述
の技術を用いてその他の植物種からチオエステラーゼの
ための遺伝子を分離するため、新たに分離した植物のチ
オエステラーゼ配列を使用することも可能である。

【０１９０】例えば、ゲッケイジュ、樟脳及びサフラワ
ーのチオエステラーゼのアミノ酸及び核酸配列の比較
は、付加的なチオエステラーゼ遺伝子の分離にとって役
立つ相同性を明らかにしている。ゲッケイジュ及び樟脳
のクローンは、特にアミノ酸レベルで広範な相同性を示
し、Cuphea、ニレ、ニクズクなどの類似の短鎖又は中位
鎖アシル−ACP 基質をもつその他のチオエステラーゼの
分離にとって有用でありうる。同様に、充分な相同性を
もつサフラワー又はアブラナの長鎖チオエステラーゼ遺
伝子は、16：０脂肪−アシルACP 及びマンゴー（18：
０）に対する特異性をもつナンキンハゼ又は綿から同定
されたものといった、より長鎖のアシル−ACP 基質に対
する特異性をもつ植物チオエステラーゼの分離のために
有用でありうる。

【０１９１】さらに、長鎖チオエステラーゼタンパク質
及び短鎖又は中位鎖特異チオエステラーゼタンパク質の
領域も同様に相同性を示す。これらの相同性領域は、付
加的な植物チオエステラーゼを分離するべくPCR におい
て使用するための縮重オリゴヌクレオチドを指定するの
に有用である。例えば上述のように、ゲッケイジュ及び
サフラワーのチオエステラーゼ領域に対するオリゴヌク
レオチドは、樟脳チオエステラーゼコーディング配列を
得るのに使用された。

【０１９２】この保存された領域は、それぞれ図４及び
図26内のゲッケイジュ及び樟脳のアミノ酸配列のアミノ
酸 113−119 及び図15内のサフラワーアミノ酸のアミノ
酸 108−114 に相応する。同様にして、ゲッケイジュ及
び樟脳の 174〜188 及びサフラワーの 169〜183 内、ゲ
ッケイジュ及び樟脳の 219−229 及びサフラワーの 214
−224 ；及びゲッケイジュ及び樟脳の 138−145 及びサ
フラワーの 133−140内といったように、ゲッケイジ
ュ、樟脳及びサフラワーのアミノ酸配列（それぞれ図３
〜15、図12〜図30及び図20〜図24に示されているよう
な）の中に、その他の保存領域が見られる。

【０１９３】上述の植物アシル−ACP チオエステラーゼ
は、カルボキシ又はアミノ末端のいずれかにおいてより
もタンパク質の中心に向かってより高レベルで保存され
ている。保存された領域は、酵素の触媒部位に関連する
部域を表わす可能性があり、又、観察された基質の特異
性の差異をポリペプチド鎖のいずれかの末端における領
域内のアミノ酸配列の差異に関連づけることもできる。
植物アシル−ACP チオエステラーゼタンパク質配列は、
動物及び酵母のチオエステラーゼ及びその他の脂肪酸合
成酵素内に見られる活性部位コンセンサス配列(GHS×
Ｇ）又はシステインベースの加水分解酵素の活性部位モ
チーフを含んでいない（Aitken (1990) 、「タンパク質
のコンセンサス配列の同定」中、Ellis Horwood, Londo
n ，pp81−91) 。阻害物質の研究により、植物のチオエ
ステラーゼ酵素がＮ−エチルマレイミドといったスルフ
ヒドリル特異試薬に対して感受性をもつことがわかって
いるため、システイン残基が活性部位で関与している可
能性がある。

【０１９４】従って、上述の方法によってその他の植物
チオエステラーゼ遺伝子を分離し、植物チオエステラー
ゼの発現のためにこれを用いることが可能である。特
に、これらのチオエステラーゼのアシル鎖の長さ特異性
を確認するためにはE.coli内での発現が有用であり、改
質油を製造するためには植物の種子内での発現が有用で
ある。

【０１９５】例６−植物内の植物チオエステラーゼとデ
ヒドラーゼ ここではデヒドラーゼとも呼ぶ酵素３−ヒドロキシデカ
ノイル−〔アシル−担体−タンパク質〕デヒドラターゼ
（EC4.2.1.60）は、細菌内での不飽和脂肪酸の産生にお
ける主要な段階である２−デセノイル−ACP(Ｃ10：１−
ACP)への３−ヒドロキシデカノイル−ACP（Ｃ10：０−A
CP) の脱水を触媒する。植物の種子内でのこの酵素の発
現は、ゲッケイジュの中位鎖アシル−ACP チオエステラ
ーゼ遺伝子をも含む植物中の不飽和中位鎖アシル−ACP
の産生にとって有利である。このようにして、Ｃ12：１
及びＣ14：１基質上のゲッケイジュ・チオエステラーゼ
の加水分解活性の結果として中位鎖不飽和遊離脂肪酸が
形成される。

【０１９６】植物の種子内のデヒドラーゼの発現にとっ
て有用な構成体が、ナピンプロモータ領域の制御下での
植物種子組織内での酵素の発現を提供する。さらに、プ
ラスチド内へのデヒドラーゼ酵素のトランスロケーショ
ンのためのトランジットペプチド領域が提供される。

【０１９７】デヒドラーゼ酵素の最初のMet アミノ酸以
外全てをコードするE.coliデヒドラーゼ遺伝子からのデ
ヒドラーゼ核酸配列（Cronan etal. (1988) J.Biol Che
m. 263 ：4641−4646)を構築する。トランジットペプチ
ド及びデヒドラーゼ配列が同じ読取り枠内にくるよう
に、成熟サフラワーチオエステラーゼ（クローン２−１
から）の６つのアミノ酸及びサフラワーチオエステラー
ゼトランジットペプチドをコードするPCR DNA フラグメ
ントがデヒドラーゼに対する５′に真近に挿入される。
サフラワーチオエステラーゼトランジット／デヒドラー
ゼ配列は、５′と３′のナピン調節配列の間でナピン発
現カセットpCGN3223内に挿入される。

【０１９８】デヒドラーゼ発現構成体は、植物の形質転
換のため二元性構成体へと形質転換される。カナマイシ
ン以外の選択的標識をコードするベクターが好まれる。
このようにして、挿入されたチオエステラーゼ構成体
（例４に記されているようなもの）の結果として中位鎖
アシル−ACP 脂肪酸を産生する遺伝子導入アブラナ植物
を、デヒドラーゼ発現構成体で再度形質転換することが
できる。例えば、抗生物質ハイグロマイシンＢに対する
耐性をコードするデヒドラーゼ発現構成体を二元性ベク
ターpCGN2769（以下で記述する）の中に挿入することが
可能である。結果として得られる構成体を含むAgrobact
erium 細胞が得られ、例３に記されているようにアブラ
ナ形質転換方法において利用される。

【０１９９】二元ベクターpCGN2769は、Agrobacterium
T-DNA の右及び左のボーダーを、又これらのボーダーの
間には形質転換された植物細胞の選択のための 35S／ハ
イグロマイシン／tr7 構成体を含んでいる。このベクタ
ーは、交互の選択可能な標識の使用以外、Mc Bride及び
Summer felt(前出）が記述している二元性ベクターと直
接相似性をもつように構築された、ハイグロマイシンＢ
ホスホトランスフェラーゼをコードするhph 遺伝子につ
いてはGritz and Davies（遺伝子（1983）25：179−18
8)によって記述されている。

【０２００】次に続くhph 及び植物調節配列を含むDNA
XhoIフラグメントが、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用い
て構築された：すなわちCaMV35S プロモータの−289〜
＋114(転写開始部位との関係において）；植物コンセン
サス翻訳開始配列を提供するための、配列ATCATGAAA 内
に含まれるATG 開始コドンを伴うhph コーディング領域
ヌクレオチド 211−1236（Gritz and Davies isupra)(K
ozak (1989) J.Cell.Biol.108： 229−241)；Barker et
al. (Plant Mol.Biol.(1983) 2： 335−350)により番
号づけされているT-DNA のヌクレオチド2921−2402から
のAgrobacterium 転写物７(tr7）転写終結領域、であ
る。

【０２０１】pTiA6T-DNAの左側ボーダー、hph 発現構成
体、425bp E.coli lac alpha コーディング領域を含む
HaeII フラグメント及びpTiA6T-DNAの右側ボーダを含む
BglII フラグメントをもつpCGN2768を生み出すためXhoI
hph発現フラグメントをpCGN1541に連結させた（T-DNA
ボーダー及びlac-α領域についてはMcBride et al.（前
出）に記述されている)。上述のBalII フラグメント
は、pCGN1532 (McBride et al.（前出)) のユニークBam
HI フラグメントにクローニングされ、pCGN2769を結果
として生じる。

【０２０２】あるいは、デヒドラーゼ発現構成体及びゲ
ッケイジュ・チオエステラーゼ発現構成体（例えばpCGN
3828）を両方共、カナマイシン耐性植物の選択のための
標識を含むMcBride et al.（前出）ベクターといった単
一の二元性ベクターの中に挿入することができる。これ
らの方法のいずれにおいても、中位鎖不飽和及び飽和脂
肪酸を産生することのできる植物が生み出される。

【０２０３】本明細書内で言及されている全ての公報及
び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術水準を例
示するものである。全ての公報及び特許出願は、それが
参考として特定的にかつ個別に例示されている場合と同
じ範囲で本書に参考として内含される。上述の発明は、
明確に理解することを目的として例を用いて或る程度詳
細に記述されてきたが、添付のクレームの範囲内で幾分
かの変更及び修正を行なうことができるということは明
白である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ゲッケイジュのチオエステラーゼをコ
ードするDNAの塩基配列を示す。

【図２】図２は、ゲッケイジュのチオエステラーゼをコ
ードするDNAの塩基配列を示す。

【図３】図３は、ゲッケイジュのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列を示す。

【図４】図４は、ゲッケイジュのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列を示す。

【図５】図５は、ゲッケイジュのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列を示す。

【図６】図６は、ゲッケイジュのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列を示す。

【図７】図７は、Ａ．タリアナ (thaliana) の種子中の
アシル12：０の蓄積とのラウロイル・チオエステラーゼ
活性との相関関係が提供される。チオエステラーゼ活性
は、異なる独立のトランスジェニック植物の発育する種
子の中で測定する。12：０％値は、定量的ガスクロマト
グラフィーにより測定した、全体の脂肪酸抽出物中のラ
ウロイルアシル基を反映する。

【図８】図８は、ゲッケイジュのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図９】図９は、ゲッケイジュのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図１０】図１０は、ゲッケイジュのチオエステラーゼ
のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を
示す。

【図１１】図１１は、ゲッケイジュのチオエステラーゼ
のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を
示す。

【図１２】図１２は、ゲッケイジュのチオエステラーゼ
のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を
示す。

【図１３】図１３は、ゲッケイジュのチオエステラーゼ
のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を
示す。

【図１４】図１４は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3264）を示す。

【図１５】図１５は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3264）を示す。

【図１６】図１６は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3264）を示す。

【図１７】図１７は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3264）を示す。

【図１８】図１８は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3264）を示す。

【図１９】図１９は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3264）を示す。

【図２０】図２０は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3265）を示す。

【図２１】図２１は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3265）を示す。

【図２２】図２２は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3265）を示す。

【図２３】図２３は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3265）を示す。

【図２４】図２４は、ベニバナのチオエステラーゼのア
ミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列（クロ
ーンpCGN3265）を示す。

【図２５】図２５は、ショウノウのチオエステラーゼの
アミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図２６】図２６は、ショウノウのチオエステラーゼの
アミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図２７】図２７は、ショウノウのチオエステラーゼの
アミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図２８】図２８は、ショウノウのチオエステラーゼの
アミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図２９】図２９は、ショウノウのチオエステラーゼの
アミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図３０】図３０は、ショウノウのチオエステラーゼの
アミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列を示
す。

【図３１】図３１は、ブラシカ.カンペストリスのチオ
エステラーゼのアミノ酸配列及びそれをコードするDNA
の塩基配列を示す。

【図３２】図３２は、ブラシカ.カンペストリスのチオ
エステラーゼのアミノ酸配列及びそれをコードするDNA
の塩基配列を示す。

【図３３】図３３は、ブラシカ.カンペストリスのチオ
エステラーゼのアミノ酸配列及びそれをコードするDNA
の塩基配列を示す。

【図３４】図３４は、ブラシカ.カンペストリスのチオ
エステラーゼのアミノ酸配列及びそれをコードするDNA
の塩基配列を示す。

【図３５】図３５は、トランスジェニックＢ．ナプス
(napus)からの種子についてのラウロイルのレベルおよ
びＣ12：０−ACP のチオエステラーゼ活性が表されてい
る。

【図３６】図３６は、ベニバナおよびゲッケイジュのチ
オエステラーゼのアミノ酸配列の比較が表されている。
上部の線は、図20〜図24におけるベニバナ・チオエステ
ラーゼのアミノ酸配列のアミノ酸61−385 を表す。下部
の線は、図４〜図６におけるゲッケイジュ・チオエステ
ラーゼのアミノ酸配列のアミノ酸84−382 を表す。

【図３７】図３７は、アラビドプシス (Arabidopsis)植
物3828−13からの 100個の種子の脂肪酸組成を、対照ア
ラビドプシス (Arabidopsis)植物からの種子の脂肪酸組
成に対して比較されている。

【図３８】図３８は、26のトランスジェニックアラビド
プシス (Arabidopsis)植物の脂肪酸含量を、増加する脂
肪酸含量の順序で記載する。検出可能なレベルのラウレ
ートを生産する形質転換体を示す。

【図３９】図３９は、26のトランスジェニックアラビド
プシス (Arabidopsis)植物の脂肪酸含量を、増加する脂
肪酸含量の順序でこれらの植物の中のＣ18：３, Ｃ18：
２およびＣ16：０脂肪酸の含量を示す。

【図４０】図４０は、トランスジェニック・ブラシカ・
ナプス(Brassica napus)の発育する種子の中のラウレー
ト含量のモル％を、示したラウレートのレベルを生ずる
トランスジェニック事象の数としてを表す。pCGN3824形
質転換体からの結果を示す。

【図４１】図４１は、トランスジェニック・ブラシカ・
ナプス(Brassica napus)の発育する種子の中のラウレー
ト含量のモル％を、示したラウレートのレベルを生ずる
トランスジェニック事象の数としてを表す。pCGN3828形
質転換体からの結果を示す。

【図４２】図４２は、クヘア (Cuphea) チオエステラー
ゼ遺伝子のPCR 断片のDNA 配列を表す。クヘア (Cuphe
a) のチオエステラーゼ遺伝子に相当する領域における
翻訳されたアミノ酸配列をまた示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ８２４２４７ (32)優先日 平成４年１月22日(1992．1．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA11 CA04 DA01 EA10 FA02 4B065 AA88X AA88Y AB01 CA13 CA31 CA41 4H059 BA33 BB02 BB06 BC13

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 全脂肪酸中最低 1.0モル％のラウリン酸
   塩を含む植物の種子において、トリグリセリド分子の少
   なくとも１つの位置に取り込まれており、この植物の野
   生型種子は脂肪酸中 1.0モル％未満のラウリン酸塩を含
   んでいる植物種子。
2. 【請求項２】 脂肪酸中最低約15モル％のラウリン酸塩
   を含む、請求の範囲第１項に記載の種子。
3. 【請求項３】 脂肪酸中最低約33モル％のラウリン酸塩
   を含む、請求の範囲第１項に記載の種子。
4. 【請求項４】 脂肪酸中最低約50モル％のラウリン酸塩
   を含む、請求の範囲第１項に記載の種子。
5. 【請求項５】 トリグリセリド分子の少なくとも２つの
   位置に前記ラウリン酸塩が見い出される、請求の範囲第
   １項に記載の種子。
6. 【請求項６】 請求の範囲第１項に記載の種子から誘導
   された油。
7. 【請求項７】 トリグリセリド分子の少なくとも１つの
   位置に取り込まれた脂肪酸中最低15.0モル％のラウリン
   酸塩を含むアブラナの種子。
8. 【請求項８】 脂肪酸中最低50モル％のラウリン酸塩を
   含む請求の範囲第７項に記載のアブラナの種子。
9. 【請求項９】 請求の範囲第７項に記載の種子から誘導
   された油。