JP2002156379A - 溶液で安定でかつ効率的に活性化するａｐｔｔ測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】希釈直線性、溶液状態での安定性に優れ、プレ
カリクレインの反応性の高いＡＰＴＴ測定用試薬組成物
を提供すること。 【解決手段】ＡＰＴＴ測定用試薬にアルミニウム化合物
を含有させること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査に用いら
れる血液凝固能測定用試薬及び血液凝固能の検査用試薬
に関する。より詳しくは、活性化部分トロンボプラスチ
ン時間（以下ＡＰＴＴという）測定用試薬組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ＡＰＴＴの測定は、内因性凝固機序に関
係する、凝固第VIII因子、IX因子、XI因子、XII因子等
の血液凝固因子の異常を鋭敏に反映し、内因系止血異常
のスクリーニングとして必須の検査手段である。体外診
断薬で用いられるＡＰＴＴ測定用試薬は、古くからタン
ニン酸から誘導させるエラグ酸、カオリン、又はセライ
ト等を活性化剤として用いている。調製方法として、エ
ラグ酸溶液に銅、ニッケル、コバルト類を混合させて活
性化する方法が報告されている（米国特許3,486,981、
R.E.Speckら、特表平５−５０６３０９、R.E.Speck
ら）。また、銅を用いる方法は、既にP.E.Bockらにより
報告されている（Biochemistry,8,7258,1981.）。しか
し、これらの金属イオンを用いてエラグ酸を活性化させ
るＡＰＴＴ測定用試薬を調製する方法は、溶液での安定
性、検体の希釈直線性の面とプレカリクレインに対する
反応性で劣ることが問題となっている。

【０００３】

【解決すべき課題】本発明の課題は、ＡＰＴＴ測定用試
薬にあって、検体の希釈直線性、溶液状態での安定性に
優れ、プレカリクレインの反応性の高い試薬組成物を提
供することである。

【０００４】

【課題を解決する手段】本発明者らは種々添加物の検討
を行い鋭意研究を重ねた結果、ＡＰＴＴ測定用試薬にあ
って、アルミニウム化合物を含有させることにより上記
課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。

【０００５】つまり、本発明は、 １．アルミニウム化合物を含有させることを特徴とする
活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬組成物、 ２．アルミニウム化合物が少なくとも塩化アルミニウム
を含む前項１記載の試薬組成物、 ３．アルミニウム化合物を、試薬組成物の保存安定化有
効量添加した前項１又は２記載の試薬組成物、 ４．アルミニウム化合物の添加する濃度が、10〜100μm
ol/Lである前項１〜３の何れか１に記載の試薬組成物、 ５．前項１〜４のいずれか１に記載の試薬組成物を用い
た活性化部分トロンボプラスチン時間の測定方法、から
なる。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明の試薬は、広く既知のＡＰ
ＴＴ測定用試薬に適用できる。ＡＰＴＴ測定用試薬と
は、ＰＴＴ（部分トロンボプラスチン）測定用試薬（セ
ファリン含有）に、カオリン、セライト、エラグ酸等の
活性化剤を添加した試薬である。

【０００７】本発明の試薬は、内因系凝固因子を効率的
に活性化し、さらに、調製後のＡＰＴＴ測定用試薬の溶
液安定性、検体の希釈直線性、そしてプレカリクレイン
に対する反応性を確保しうる、エラグ酸等を活性化させ
る物質が添加される。このエラグ酸等による内因系凝固
因子を活性化させる物質として、好ましくはアルミニウ
ム化合物が使用される。アルミニウム化合物としては、
広く公知のアルミニウム化合物、例えば塩化アルミニウ
ム、臭化アルミニウム、水酸化アルミニウム、ヨウ化ア
ルミニウム、硝酸アルミニウム、リン酸アルミニウム、
硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム等が挙げ
られ、好適には塩化アルミニウムが挙げられる。

【０００８】その使用量は、試薬組成物の液状での保存
安定化効果の確認により選定され、保存安定化有効量添
加される。液状での添加の好ましい態様としては、1〜1
000好ましくは10〜100μmol/Lの添加量である。

【０００９】組成物は、アルミニウム化合物単独の添加
でもよいが、他の金属化合物との併用も可能である。そ
のような金属化合物としては、好ましくは銅化合物（硫
酸銅等）、鉄化合物（塩化第二鉄等）、マンガン化合物
（塩化マンガン等）が例示され、より好適な化合物は銅
化合物が挙げられる。

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。

【００１０】

【実施例１】（ＡＰＴＴ測定用試薬の調製方法）エラグ
酸は、東京化成、SIGMA、FLUKA、和光純薬、ICNから市
販品として購入することができる。エラグ酸を0.025gを
秤量し、0.001M水酸化ナトリウム液１Lで溶解した。こ
れに50μmol/Lになるように各種重金属を混合し、さら
に、この溶液にトリスを0.22g、ヘペスを1.45g溶解させ
てエラグ酸溶液とした。別のガラス容器にウサギ脳由来
セファリン（Bell and Alton法、Nature,174,880(195
4)）を0.01g秤量し、上記エラグ酸溶液でセファリンを
溶解してＡＰＴＴ測定用試薬を調製した。尚、セファリ
ンは、精製リン脂質または合成リン脂質を用いても調製
することができる。

【００１１】（凝固アッセイ方法）試料50μLを採取し3
7℃で60秒間加温した。調製されたＡＰＴＴ測定用試薬
を50μL混合し、さらに37℃で180秒間加温活性化した。
20mM塩化カルシウム液を50μL混合し、凝固時間を測定
した。尚、本測定は全自動血液凝固分析装置Coagrex-70
0を用いて行った。

【００１２】（実験例１）上記の調製法及びアッセイ法
を使い、各種金属化合物の添加による効果を検討した。
その結果、表１に示す各種金属化合物によるエラグ酸混
合物の活性化効果についての成績が得られた。

【００１３】表１に示すとおり、正常試料であるコアグ
トロ−ルＮを検体として、凝固時間をCoagrex-700を用
いて測定した結果、硫酸銅、塩化マンガン、塩化アルミ
ニウム、塩化第２鉄で活性化効果が認められた。さら
に、コアグトロールＮを生理的食塩水で順次希釈し、２
倍希釈液及び４倍希釈溶液を試料として、コアグトロー
ルＮの希釈直線性を最小二乗法で回帰分析した。その結
果、塩化アルミニウムの場合の希釈直線性が最も優れて
いた。また、プレカリクレイ欠乏症患者血漿では塩化ア
ルミニウムが凝固時間の延長が優れ、硫酸銅、塩化マン
ガン、塩化第２鉄は同等レベルの延長度合いの悪い反応
性を示した。一方、塩化第２鉄はエラグ酸と黒色のキレ
ートを呈し沈殿物を生じた。

【００１４】 表１ 各種金属化合物とエラグ酸の混合物の活性化効果金属化合物 凝固時間 PK-dep 希釈直線 無添加 N.D. N.D. N.D. 塩化ニッケル 175秒 194秒 N.D. 塩化亜鉛 N.D. N.D. N.D. 硫酸銅 27秒 87秒 0.9921 塩化マグネシウム N.D. N.D. N.D. 塩化第二鉄 36秒 93秒 0.9845 塩化コバルト 98秒 62秒 N.D. 塩化マンガン 35秒 57秒 0.9896 塩化カルシウム 52秒 63秒 N.D.塩化アルミニウム 31秒 218秒 0.9998 N.D.: 検出及び計算できず PK-dep: プレカリクレイン欠乏症患者血漿

【００１５】（実験例２）選択された金属化合物類で調
製されたＡＰＴＴ測定用試薬の保存安定化性を、同様に
検定した。その結果、表２に示す安定化効果についての
成績が得られた。

【００１６】 表２ 選択された金属化合物類で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の安定化効果 金属化合物 37℃, 0日 37℃, 7日 37℃,14日 硫酸銅 29.7秒 27.3秒 24.4秒 塩化アルミニウム 31.7秒 31.2秒 31.5秒 塩化マンガン 35.5秒 31.9秒 30.1秒

【００１７】表２に示すとおり、正常血漿であるコアグ
トロールＮを試料として、ＡＰＴＴ測定用試薬の37℃下
における保存安定性を観察した結果、硫酸銅と塩化マン
ガンは凝固時間の経時的変化を与えるのに対して、塩化
アルミニウムは凝固時間の変動を与えず一定した効果が
得られ、安定性が極めて優れていた。

【００１８】（実験例３）実験例２で安定性に優れてい
た塩化アルミニウムと安定性に問題があった硫酸銅で混
合調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の保存安定性を同様に
検定した。その結果、表３に示す安定化効果についての
成績が得られた。

【００１９】 表３ 塩化アルミニウムと硫酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の安定化効果 金属化合物 37℃, 0日 37℃, 7日 37℃,14日 硫酸銅 29.6秒 27.9秒 23.7秒 塩化アルミニウム 31.2秒 31.0秒 31.2秒 混合 30.5秒 30.2秒 30.1秒

【００２０】表３に示すとおり、硫酸銅と塩化アルミニ
ウムを混合してエラグ酸を活性化させた場合であっても
37℃における溶液の安定性は保持され、塩化アルミニウ
ム添加により安定化されていることが明らかとなった。

【００２１】（実験例４）塩化アルミニウムと硫酸銅で
調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の性能を検定した。その
結果、表４に示す成績が得られた。

【００２２】表４に示すとおり、塩化アルミニウムと硫
酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬を用いた場合は、
３度の試行においていずれも硫酸銅単独で調製した測定
試薬よりも優れた検体希釈直線性と安定性およびプレカ
リクレイン欠乏血漿における著しい凝固時間の延長を示
した。このことにより、アルミニウム化合物の添加によ
り、検体直希釈線性、安定性およびプレカリクレイン欠
乏血漿における著しい凝固時間の延長が保持されること
が明らかとなった。

【００２３】 表４ 塩化アルミニウムと硫酸銅で調製されたＡＰＴＴ測定用試薬の性能 試行例 希釈直線性 37℃,0日 37℃,14日 PK-dep １ 0.9994 29.9秒 30.1秒 198.3秒 ２ 0.9997 30.4秒 30.2秒 180.2秒 ３ 0.9995 29.4秒 29.8秒 202.9秒

【００２４】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば希釈直線
性、溶液状態での安定性に優れ、プレカリクレインに対
する反応性の高いＡＰＴＴ測定用試薬組成物が提供で
き、凝固時間の測定において感度の向上が可能となる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルミニウム化合物を含有させることを
   特徴とする活性化部分トロンボプラスチン時間測定試薬
   組成物。
2. 【請求項２】 アルミニウム化合物が少なくとも塩化ア
   ルミニウムを含む請求項１記載の試薬組成物。
3. 【請求項３】 アルミニウム化合物を、試薬組成物の保
   存安定化有効量添加した請求項１又は２記載の試薬組成
   物。
4. 【請求項４】 アルミニウム化合物の添加する濃度が、
   10〜100μmol/Lである請求項１〜３の何れか１に記載の
   試薬組成物。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１に記載の試薬
   組成物を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間の測
   定方法。