JP2002112765A - ウイルス不活化法 - Google Patents
ウイルス不活化法Info
- Publication number
- JP2002112765A JP2002112765A JP2001233936A JP2001233936A JP2002112765A JP 2002112765 A JP2002112765 A JP 2002112765A JP 2001233936 A JP2001233936 A JP 2001233936A JP 2001233936 A JP2001233936 A JP 2001233936A JP 2002112765 A JP2002112765 A JP 2002112765A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- protein
- solution
- heating
- factor xiii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】蛋白溶液の加熱によるウイルス不活化方法にお
いて、蛋白の変性、不活性化率を低く抑え、高い収率で
ウイルスが不活化された製剤を得る方法の提供。 【解決手段】加熱処理を不活性雰囲気下または減圧下に
実施することにより課題を解決した。
いて、蛋白の変性、不活性化率を低く抑え、高い収率で
ウイルスが不活化された製剤を得る方法の提供。 【解決手段】加熱処理を不活性雰囲気下または減圧下に
実施することにより課題を解決した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルス夾雑の危
惧のある蛋白溶液の加熱によるウイルス不活化の際、蛋
白の変性、失活の割合が極めて低く、且つウイルス不活
化後も蛋白の性状が安定であるウイルス不活化法に関す
る。
惧のある蛋白溶液の加熱によるウイルス不活化の際、蛋
白の変性、失活の割合が極めて低く、且つウイルス不活
化後も蛋白の性状が安定であるウイルス不活化法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】蛋白、特に生体由来の蛋白、より具体的
には血液由来の蛋白は、エイズウイルス、各種肝炎ウイ
ルス、ヒトパルボウイルスＢ１９などの種々のウイルス
に汚染されている可能性がある。したがって、これらを
原料とした治療剤の製造に際しては、ウイルスを十分に
除去または不活化する工程を組み込むことが必須であ
る。血液由来の製剤、すなわち血液製剤に夾雑してくる
ウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加
熱処理法（以下、液状加熱法という。）がMurrayら（Th
e New York Academy of Medicine, ３１巻（５）３４１
〜３５８（１９５５））により提案され、それ以来この
方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用され
ている。しかし、この液状加熱法に耐え得る熱に対する
安定性の高い蛋白質としてはアルブミンなどごく一部に
限られ、他の多くの血漿蛋白は熱に不安定で、この方法
によっては変性、失活する割合が高い。そこでこの液状
加熱法とは別に、蛋白を乾燥状態で加熱する乾燥加熱法
（特開昭５８−２１３７２１号）、特殊な溶媒と洗浄剤
を用いるソルベントデタージェント（ＳＤ）法（特開昭
６０−５１１１６号）なども提案されている。一方、血
液製剤に夾雑してくるウイルスを除去する方法として
は、血液凝固第VIII因子製剤中のウイルスを再生セルロ
ース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除
去する方法（特開平２−１６７２３２号）や、免疫グロ
ブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルタ
ーによる工程を導入し、混入したウイルスを除去する方
法（Japanese Journal of Transfusion Medicine, ３４
巻（６）６１５〜６１７（１９８８））が報告されてい
る。また、従来法であるアフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィーにっよってもウイ
ルスの除去が可能であることも報告されている（ Devel
opments in Biological Standardization, vol. 81, 19
9〜209(1993))。これらのいずれの方法も一長一短があ
り、１つの方法で各種ウイルスの完全不活または完全除
去は期し難く、従って複数の方法を組み合わせて用いる
ことが有効であると考えられるが、そのためには個々の
処理工程における蛋白の変性、不活性化を極力抑え、収
率の低下を防ぐことが工業的生産の見地から重要となっ
てくる。
には血液由来の蛋白は、エイズウイルス、各種肝炎ウイ
ルス、ヒトパルボウイルスＢ１９などの種々のウイルス
に汚染されている可能性がある。したがって、これらを
原料とした治療剤の製造に際しては、ウイルスを十分に
除去または不活化する工程を組み込むことが必須であ
る。血液由来の製剤、すなわち血液製剤に夾雑してくる
ウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加
熱処理法（以下、液状加熱法という。）がMurrayら（Th
e New York Academy of Medicine, ３１巻（５）３４１
〜３５８（１９５５））により提案され、それ以来この
方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用され
ている。しかし、この液状加熱法に耐え得る熱に対する
安定性の高い蛋白質としてはアルブミンなどごく一部に
限られ、他の多くの血漿蛋白は熱に不安定で、この方法
によっては変性、失活する割合が高い。そこでこの液状
加熱法とは別に、蛋白を乾燥状態で加熱する乾燥加熱法
（特開昭５８−２１３７２１号）、特殊な溶媒と洗浄剤
を用いるソルベントデタージェント（ＳＤ）法（特開昭
６０−５１１１６号）なども提案されている。一方、血
液製剤に夾雑してくるウイルスを除去する方法として
は、血液凝固第VIII因子製剤中のウイルスを再生セルロ
ース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除
去する方法（特開平２−１６７２３２号）や、免疫グロ
ブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルタ
ーによる工程を導入し、混入したウイルスを除去する方
法（Japanese Journal of Transfusion Medicine, ３４
巻（６）６１５〜６１７（１９８８））が報告されてい
る。また、従来法であるアフィニティークロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィーにっよってもウイ
ルスの除去が可能であることも報告されている（ Devel
opments in Biological Standardization, vol. 81, 19
9〜209(1993))。これらのいずれの方法も一長一短があ
り、１つの方法で各種ウイルスの完全不活または完全除
去は期し難く、従って複数の方法を組み合わせて用いる
ことが有効であると考えられるが、そのためには個々の
処理工程における蛋白の変性、不活性化を極力抑え、収
率の低下を防ぐことが工業的生産の見地から重要となっ
てくる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前述した液状加熱法
は、ウイルスの不活化という点では優れた方法の１つで
はあるが、蛋白が液状で比較的長時間（約１０時間）６
０℃前後の高い温度に曝される結果、アルブミン等熱に
安定な数少ない蛋白を除き、多くの血漿蛋白は溶液状態
では加熱に不安定で、変性、失活する率が高い。血漿蛋
白の中でもトランスグルタミナーゼの１つである血液凝
固第XIII因子は、熱に不安定であるので、液状加熱法に
よる収率低下を防ぐためこれまでにも種々の提案がなさ
れてきた。その方法として、たとえば第XIII因子含有溶
液にグリシン、アラニン等のアミノ酸、グルコース、マ
ンニトールなどの糖類を１０〜２０重量％添加する方法
（特開昭５３ー５９０１８号）、グリシンと蔗糖を併用
する方法（特開昭５５ー１４５６１５号）などが報告さ
れているが、これらの方法も加熱による蛋白の変性や失
活を充分に抑制することはできず、またこれらの変性体
や不活性体が最終製品の品質に何らの影響を及ぼす万能
性も否定し得ない。
は、ウイルスの不活化という点では優れた方法の１つで
はあるが、蛋白が液状で比較的長時間（約１０時間）６
０℃前後の高い温度に曝される結果、アルブミン等熱に
安定な数少ない蛋白を除き、多くの血漿蛋白は溶液状態
では加熱に不安定で、変性、失活する率が高い。血漿蛋
白の中でもトランスグルタミナーゼの１つである血液凝
固第XIII因子は、熱に不安定であるので、液状加熱法に
よる収率低下を防ぐためこれまでにも種々の提案がなさ
れてきた。その方法として、たとえば第XIII因子含有溶
液にグリシン、アラニン等のアミノ酸、グルコース、マ
ンニトールなどの糖類を１０〜２０重量％添加する方法
（特開昭５３ー５９０１８号）、グリシンと蔗糖を併用
する方法（特開昭５５ー１４５６１５号）などが報告さ
れているが、これらの方法も加熱による蛋白の変性や失
活を充分に抑制することはできず、またこれらの変性体
や不活性体が最終製品の品質に何らの影響を及ぼす万能
性も否定し得ない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、液状加熱
法における蛋白の変性、失活率を極力低く抑えるという
課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、生体由来
蛋白、特に血漿蛋白、さらに具体的にはトランスグルタ
ミナーゼの液状加熱法において、処理雰囲気を不活性雰
囲気下または減圧下で行うことにより、蛋白の変性、失
活率を大幅に低減しうることを見出し、さらに検討を重
ねて本発明を完成した。すなわち本発明は、（１）ウイ
ルス夾雑の危険性のある蛋白溶液を不活性雰囲気下また
は減圧下に加熱処理するウイルス不活化法、（２）不活
性雰囲気下が窒素雰囲気下である前記（１）記載のウイ
ルス不活化法、（３）蛋白が生体由来のものである前記
（１）記載のウイルス不活化法、（４）蛋白がトランス
グルタミナーゼである前記（１）記載のウイルス不活化
法、（５）蛋白が血液凝固第XIII因子である前記（１）
記載のウイルス不活化法、および（６）加熱処理が、４
５〜８０℃、１〜４８時間の処理である前記（１）記載
のウイルス不活化法、である。
法における蛋白の変性、失活率を極力低く抑えるという
課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、生体由来
蛋白、特に血漿蛋白、さらに具体的にはトランスグルタ
ミナーゼの液状加熱法において、処理雰囲気を不活性雰
囲気下または減圧下で行うことにより、蛋白の変性、失
活率を大幅に低減しうることを見出し、さらに検討を重
ねて本発明を完成した。すなわち本発明は、（１）ウイ
ルス夾雑の危険性のある蛋白溶液を不活性雰囲気下また
は減圧下に加熱処理するウイルス不活化法、（２）不活
性雰囲気下が窒素雰囲気下である前記（１）記載のウイ
ルス不活化法、（３）蛋白が生体由来のものである前記
（１）記載のウイルス不活化法、（４）蛋白がトランス
グルタミナーゼである前記（１）記載のウイルス不活化
法、（５）蛋白が血液凝固第XIII因子である前記（１）
記載のウイルス不活化法、および（６）加熱処理が、４
５〜８０℃、１〜４８時間の処理である前記（１）記載
のウイルス不活化法、である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明のウイルス不活化法の対象
となる蛋白は、生体成分由来のものであれば特に限定さ
れず、ウイルスの夾雑が危惧される蛋白、たとえば血
漿、尿、胎盤、皮膚、骨、肺などの生物由来の蛋白、細
胞培養由来の蛋白が例としてあげられる。本発明は、液
状加熱に対して不安定なトランスグルタミナーゼ、特に
第XIII因子の処理に好適である。蛋白溶液における蛋白
の濃度は特に限定されないが、通常０．０１〜３０．０
重量％、好ましくは０．０３〜１０．０重量％である。
蛋白が第XIII因子である場合の濃度は０．０５〜３．０
重量％であることが好ましい。蛋白溶液には、必要に応
じ、蛋白の安定化剤としてグリシン、アラニン等のアミ
ノ酸を０．１〜３モル濃度、グルコース、マンニトー
ル、蔗糖などの糖類を１０〜５０重量％程度添加しても
よい。その他緩衝液として、たとえばクエン酸緩衝液を
添加してもよい。蛋白溶液のｐＨは、通常 ５．０〜１
０．０、好ましくは６．０〜８．５である。たとえば血
漿から第XIII因子の含有溶液を調製するための具体的な
方法としては次の方法があげられる。まず、コーン低温
エタノール分画の画分Ｉを採取し、０．０２Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ミキサーで画分を十分に
攪拌して溶解させる。この溶液を遠心分離器により３０
００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得る。この
上清に、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をゆっくり
と加え、攪拌後2０℃で１時間放置する。この溶液を再
び遠心分離器にて３０００ｇ、１０℃で１５分遠心分離
して沈殿物を濾別する。この沈殿物に、クエン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて溶解し、５６℃、３分間加熱処
理して熱変性物を遠心分離して上清を得る。この上清を
陰イオン交換クロマトグラフで処理し、吸着画分から第
XIII因子含有溶液を得る。
となる蛋白は、生体成分由来のものであれば特に限定さ
れず、ウイルスの夾雑が危惧される蛋白、たとえば血
漿、尿、胎盤、皮膚、骨、肺などの生物由来の蛋白、細
胞培養由来の蛋白が例としてあげられる。本発明は、液
状加熱に対して不安定なトランスグルタミナーゼ、特に
第XIII因子の処理に好適である。蛋白溶液における蛋白
の濃度は特に限定されないが、通常０．０１〜３０．０
重量％、好ましくは０．０３〜１０．０重量％である。
蛋白が第XIII因子である場合の濃度は０．０５〜３．０
重量％であることが好ましい。蛋白溶液には、必要に応
じ、蛋白の安定化剤としてグリシン、アラニン等のアミ
ノ酸を０．１〜３モル濃度、グルコース、マンニトー
ル、蔗糖などの糖類を１０〜５０重量％程度添加しても
よい。その他緩衝液として、たとえばクエン酸緩衝液を
添加してもよい。蛋白溶液のｐＨは、通常 ５．０〜１
０．０、好ましくは６．０〜８．５である。たとえば血
漿から第XIII因子の含有溶液を調製するための具体的な
方法としては次の方法があげられる。まず、コーン低温
エタノール分画の画分Ｉを採取し、０．０２Ｍクエン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ミキサーで画分を十分に
攪拌して溶解させる。この溶液を遠心分離器により３０
００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得る。この
上清に、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をゆっくり
と加え、攪拌後2０℃で１時間放置する。この溶液を再
び遠心分離器にて３０００ｇ、１０℃で１５分遠心分離
して沈殿物を濾別する。この沈殿物に、クエン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて溶解し、５６℃、３分間加熱処
理して熱変性物を遠心分離して上清を得る。この上清を
陰イオン交換クロマトグラフで処理し、吸着画分から第
XIII因子含有溶液を得る。
【０００６】また、胎盤由来の第XIII因子含有溶液を調
製する具体的な方法としては次の方法があげられる。ま
ず凍結した人の胎盤に０．５％食塩溶液を添加後抽出
し、組織を含まない上澄みからアクリジン塩基を用いて
第XIII因子を析出させる。２．５％食塩水を用いてアク
リジン付加物を溶解させ、セチルピリジニウムクロリド
により第XIII因子含有溶液から酸性の付加蛋白と脂質を
除く。再度アクリジン塩基を用いて第XIII因子を析出さ
せ、２．５％食塩で抽出し、抽出液を硫酸アンモニウム
を用いる沈殿及びゲル濾過により精製する。第XIII因子
活性フラクションを合し、濾過または中性塩沈殿法によ
りさらに濃縮して第XIII因子濃縮物とする。第XIII因子
含有溶液の活性は、例えばダンシルカダベリン法（Trom
b. Res., ３６巻、１２３〜１３１頁（１９８４））、
クロット溶解法（J. Biol. Chem., ２３６巻、２６２５
〜２６３３（１９６１））などの方法により測定するこ
とができる。このようにして調製された蛋白溶液を不活
性雰囲気下または減圧下に加熱処理する。不活性雰囲気
としては、ヘリウム、アルゴンなどの希ガスや窒素ガス
などの不活性ガスによる置換率が、通常７０％以上、好
ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のも
のをいう。減圧下とは、その圧力が通常１０４Pa以下、
好ましくは１０３Pa以下、更に好ましくは１０２Pa以下
をいう。加熱温度は４５〜８０℃、好ましくは５０〜７
０℃、加熱時間は１〜４８時間、好ましくは５〜２４時
間程度である。この加熱処理の際、攪拌、振盪等の物理
的衝撃をなるべく与えない条件下で実施することにより
更に本発明の効果が高められる。
製する具体的な方法としては次の方法があげられる。ま
ず凍結した人の胎盤に０．５％食塩溶液を添加後抽出
し、組織を含まない上澄みからアクリジン塩基を用いて
第XIII因子を析出させる。２．５％食塩水を用いてアク
リジン付加物を溶解させ、セチルピリジニウムクロリド
により第XIII因子含有溶液から酸性の付加蛋白と脂質を
除く。再度アクリジン塩基を用いて第XIII因子を析出さ
せ、２．５％食塩で抽出し、抽出液を硫酸アンモニウム
を用いる沈殿及びゲル濾過により精製する。第XIII因子
活性フラクションを合し、濾過または中性塩沈殿法によ
りさらに濃縮して第XIII因子濃縮物とする。第XIII因子
含有溶液の活性は、例えばダンシルカダベリン法（Trom
b. Res., ３６巻、１２３〜１３１頁（１９８４））、
クロット溶解法（J. Biol. Chem., ２３６巻、２６２５
〜２６３３（１９６１））などの方法により測定するこ
とができる。このようにして調製された蛋白溶液を不活
性雰囲気下または減圧下に加熱処理する。不活性雰囲気
としては、ヘリウム、アルゴンなどの希ガスや窒素ガス
などの不活性ガスによる置換率が、通常７０％以上、好
ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のも
のをいう。減圧下とは、その圧力が通常１０４Pa以下、
好ましくは１０３Pa以下、更に好ましくは１０２Pa以下
をいう。加熱温度は４５〜８０℃、好ましくは５０〜７
０℃、加熱時間は１〜４８時間、好ましくは５〜２４時
間程度である。この加熱処理の際、攪拌、振盪等の物理
的衝撃をなるべく与えない条件下で実施することにより
更に本発明の効果が高められる。
【０００７】
【実施例】以下に実施例、比較例および試験例をあげて
本発明を具体的に説明する。 実施例１ コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、
これに５リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を加え、ミキサーにて画分Ｉを十分に攪拌しな
がら溶解した。この溶液を遠心分離器により３０００
ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得た。この上清
に、２．５リットルの１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌをゆっくりと添加攪拌し、２０℃で１時
間放置した。この溶液を再び遠心分離器にて３０００
ｇ、１０℃で１５分間遠心分離して沈殿物を採取した。
この沈澱物に３リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加え溶解し、５６℃、３分間加熱処理
をおこない、遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１
５分間遠心分離して上清を得ることで熱変性物を分離し
た。この上清を陰イオン交換クロマトグラフで処理し、
吸着画分から第XIII因子含有溶液を得る。この溶液を液
状加熱用サンプルとした。調製した液状加熱用サンプル
に蔗糖及びグリシンをそれぞれ３０％重量および１．５
Ｍとなるように添加し、容器内空間を窒素ガスでに置換
した（置換率約９８％）後、６０℃で１５時間加熱し
た。加熱後の残存第XIII因子力価を測定し、加熱前の第
XIII因子力価から加熱による活性収率を算出した。その
結果を〔表１〕に示した。
本発明を具体的に説明する。 実施例１ コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、
これに５リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を加え、ミキサーにて画分Ｉを十分に攪拌しな
がら溶解した。この溶液を遠心分離器により３０００
ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得た。この上清
に、２．５リットルの１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）１００ｍｌをゆっくりと添加攪拌し、２０℃で１時
間放置した。この溶液を再び遠心分離器にて３０００
ｇ、１０℃で１５分間遠心分離して沈殿物を採取した。
この沈澱物に３リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加え溶解し、５６℃、３分間加熱処理
をおこない、遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１
５分間遠心分離して上清を得ることで熱変性物を分離し
た。この上清を陰イオン交換クロマトグラフで処理し、
吸着画分から第XIII因子含有溶液を得る。この溶液を液
状加熱用サンプルとした。調製した液状加熱用サンプル
に蔗糖及びグリシンをそれぞれ３０％重量および１．５
Ｍとなるように添加し、容器内空間を窒素ガスでに置換
した（置換率約９８％）後、６０℃で１５時間加熱し
た。加熱後の残存第XIII因子力価を測定し、加熱前の第
XIII因子力価から加熱による活性収率を算出した。その
結果を〔表１〕に示した。
【０００８】実施例２ コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、
実施例１と同様にして液状加熱用サンプルを得た。調製
した液状加熱用サンプルに蔗糖及びグリシンをそれぞれ
３０重量％及び１．５Ｍとなるように添加した。サンプ
ルを密封タンクに移しバキュームポンプで２０分間脱気
し、容器内を０．０１気圧（１０３Pa）の減圧状態にし
た後６０℃で１５時間加熱した。加熱後の残存第XIII因
子力価を血液凝固試験用標準ヒト血漿（ヘキスト社）を
標準としてダンシルカタベリン法により測定し、加熱前
の第XIII因子力価から加熱による活性収率を算出した。
その結果を〔表１〕に示した。 比較例１ コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、
実施例１と同様にして液状加熱用サンプルを得た。調製
した液状加熱用サンプルに蔗糖及びグリシンをそれぞれ
３０％及び１．５Ｍとなるように添加した。６０℃で１
５時間加熱後残存第XIII因子力価を血液凝固試験用標準
ヒト血漿（ヘキスト社）を標準としてダンシルカタベリ
ン法により測定し、加熱前の第XIII因子力価から加熱に
よる活性収率を算出した。その結果を〔表１〕に示し
た。
実施例１と同様にして液状加熱用サンプルを得た。調製
した液状加熱用サンプルに蔗糖及びグリシンをそれぞれ
３０重量％及び１．５Ｍとなるように添加した。サンプ
ルを密封タンクに移しバキュームポンプで２０分間脱気
し、容器内を０．０１気圧（１０３Pa）の減圧状態にし
た後６０℃で１５時間加熱した。加熱後の残存第XIII因
子力価を血液凝固試験用標準ヒト血漿（ヘキスト社）を
標準としてダンシルカタベリン法により測定し、加熱前
の第XIII因子力価から加熱による活性収率を算出した。
その結果を〔表１〕に示した。 比較例１ コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、
実施例１と同様にして液状加熱用サンプルを得た。調製
した液状加熱用サンプルに蔗糖及びグリシンをそれぞれ
３０％及び１．５Ｍとなるように添加した。６０℃で１
５時間加熱後残存第XIII因子力価を血液凝固試験用標準
ヒト血漿（ヘキスト社）を標準としてダンシルカタベリ
ン法により測定し、加熱前の第XIII因子力価から加熱に
よる活性収率を算出した。その結果を〔表１〕に示し
た。
【０００９】
【表１】 〔表１〕から明らかなように、実施例１および２の方法
により加熱されたサンプルはいずれも９５％以上の高い
活性収率が得られたのに対し、比較例１は約７０％の活
性収率しか得られず、沈殿物が生じるなど性状にも変化
が見られた。このことから本発明の方法が蛋白の変性、
不活化体の生成を低く抑え、収率を向上させることが明
らかとなった。 試験例１ i）ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の不活化試験 比較例１で調製した加熱前試料９容に対し、ブタパルボ
ウイルス液１容を加えて少量のモデル実験を実施した。
すなわち、ウイルス含有試料を窒素置換した群及び窒素
置換しない群に分け６０℃、１０、１５、２０、２５時
間加熱処理を施した後、下記に示すブタパルボウイルス
感染価測定方法に従って試料中のウイルス感染価を測定
した。その結果を容器内雰囲気の窒素置換有無とブタパ
ルボウイルス（ＰＰＶ）感染価との関係として〔図１〕
に示した。 ii）ウイルス感染価の測定 マイクロプレートを用い、３７℃、５％炭酸ガス培養器
で培養したＥＳＫ（Embryonic Swine Kidney)細胞でブ
タパルボウイルスの感染価の測定を行った。試料は日本
薬局方注射用水で溶解した。ウイルス感染価の測定とし
てはブタパルボウイルスのＥＳＫ細胞に対する細胞変性
効果を確認することにより行った。すなわち、ウイルス
を含む試料をＥＳＫ細胞培養培地で１０倍段階希釈して
ＥＳＫ細胞に接種した。引き続き炭酸ガス培養器で７日
間培養し細胞変性効果を観察してウイルス感染価ＴＣ
ＩＤ50／ｍｌを測定した。
により加熱されたサンプルはいずれも９５％以上の高い
活性収率が得られたのに対し、比較例１は約７０％の活
性収率しか得られず、沈殿物が生じるなど性状にも変化
が見られた。このことから本発明の方法が蛋白の変性、
不活化体の生成を低く抑え、収率を向上させることが明
らかとなった。 試験例１ i）ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の不活化試験 比較例１で調製した加熱前試料９容に対し、ブタパルボ
ウイルス液１容を加えて少量のモデル実験を実施した。
すなわち、ウイルス含有試料を窒素置換した群及び窒素
置換しない群に分け６０℃、１０、１５、２０、２５時
間加熱処理を施した後、下記に示すブタパルボウイルス
感染価測定方法に従って試料中のウイルス感染価を測定
した。その結果を容器内雰囲気の窒素置換有無とブタパ
ルボウイルス（ＰＰＶ）感染価との関係として〔図１〕
に示した。 ii）ウイルス感染価の測定 マイクロプレートを用い、３７℃、５％炭酸ガス培養器
で培養したＥＳＫ（Embryonic Swine Kidney)細胞でブ
タパルボウイルスの感染価の測定を行った。試料は日本
薬局方注射用水で溶解した。ウイルス感染価の測定とし
てはブタパルボウイルスのＥＳＫ細胞に対する細胞変性
効果を確認することにより行った。すなわち、ウイルス
を含む試料をＥＳＫ細胞培養培地で１０倍段階希釈して
ＥＳＫ細胞に接種した。引き続き炭酸ガス培養器で７日
間培養し細胞変性効果を観察してウイルス感染価ＴＣ
ＩＤ50／ｍｌを測定した。
【００１０】〔図１〕から明らかなように、本発明の方
法により窒素雰囲気下に加熱処理した試料は、従来の窒
素置換しない方法に比べ何ら遜色なくウイルスの不活化
ができることが証明された。すなわち、〔表１〕と〔図
１〕から、本発明は従来にない蛋白の安定化効果を示す
と同時に、ウイルスの不活化も十分なされることが証明
された。
法により窒素雰囲気下に加熱処理した試料は、従来の窒
素置換しない方法に比べ何ら遜色なくウイルスの不活化
ができることが証明された。すなわち、〔表１〕と〔図
１〕から、本発明は従来にない蛋白の安定化効果を示す
と同時に、ウイルスの不活化も十分なされることが証明
された。
【００１１】試験例２ 実施例１におけると同様の操作により蔗糖およびグリシ
ン含有液状加熱用試料を調製した。この加熱前試料９容
に対し、ウシ下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）液１容を加
え、ウイルス含有試料を窒素置換した群及び窒素置換し
ない群に分け、６０℃で加熱処理を施し一定時間経過後
に、下記に示すＢＶＤＶ感染価測定方法に従って試料中
のウイルス感染価を測定した。その結果を〔表２〕に示
した。 ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）感染価の測定方法 マイクロプレートを用い３７℃、５％炭酸ガス培養器で
培養したＢＴ（BovineTestis）細胞でウシ下痢症ウイル
スの感染価の測定を行った。試料は日本薬局方注射用水
で溶解した。ウイルス感染価の測定方法としてはウシ下
痢ウイルスのＢＴ細胞に対する細胞変性効果を確認する
ことによっておこなった。すなわち、ウイルスを含む試
料をＢＴ細胞培養培地で１０倍段階希釈してＢＴ細胞に
接種した。引き続き炭酸ガス培養器で７日間培養し細胞
変性効果を確認してウイルス感染価ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
を測定した。
ン含有液状加熱用試料を調製した。この加熱前試料９容
に対し、ウシ下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）液１容を加
え、ウイルス含有試料を窒素置換した群及び窒素置換し
ない群に分け、６０℃で加熱処理を施し一定時間経過後
に、下記に示すＢＶＤＶ感染価測定方法に従って試料中
のウイルス感染価を測定した。その結果を〔表２〕に示
した。 ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）感染価の測定方法 マイクロプレートを用い３７℃、５％炭酸ガス培養器で
培養したＢＴ（BovineTestis）細胞でウシ下痢症ウイル
スの感染価の測定を行った。試料は日本薬局方注射用水
で溶解した。ウイルス感染価の測定方法としてはウシ下
痢ウイルスのＢＴ細胞に対する細胞変性効果を確認する
ことによっておこなった。すなわち、ウイルスを含む試
料をＢＴ細胞培養培地で１０倍段階希釈してＢＴ細胞に
接種した。引き続き炭酸ガス培養器で７日間培養し細胞
変性効果を確認してウイルス感染価ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
を測定した。
【００１２】
【表２】
【００１３】〔表２〕から明らかなように、窒素置換な
しの場合と、窒素置換ありの場合とでは、ＢＶＤＶ感染
価に関しては両者に殆ど差がなかった。
しの場合と、窒素置換ありの場合とでは、ＢＶＤＶ感染
価に関しては両者に殆ど差がなかった。
【００１４】
【発明の効果】本発明によれば、ウイルス混在のおそれ
のある蛋白の液状加熱によるウイルス不活化を、蛋白の
変性、不活性化を極力抑えて実施することができるの
で、工業的有利にウイルスが不活化された製剤を得るこ
とができる。また、本法により得られた蛋白溶液は、そ
の後の精製工程の操作性を高め、最終品質の安全性を高
めることができる。
のある蛋白の液状加熱によるウイルス不活化を、蛋白の
変性、不活性化を極力抑えて実施することができるの
で、工業的有利にウイルスが不活化された製剤を得るこ
とができる。また、本法により得られた蛋白溶液は、そ
の後の精製工程の操作性を高め、最終品質の安全性を高
めることができる。
【図１】：雰囲気の窒素置換の有無とブタパルボウイル
ス（ＰＰＶ）感染価との関係を示す。 〔符号の説明〕 ●：窒素置換下の加熱処理 ▲：窒素置換しない加熱処理
ス（ＰＰＶ）感染価との関係を示す。 〔符号の説明〕 ●：窒素置換下の加熱処理 ▲：窒素置換しない加熱処理
フロントページの続き (72)発明者 大嶋 一紀 千葉県成田市新泉３番地の１ 日本製薬株 式会社成田工場内 Ｆターム(参考） 4B065 AA95X BD08 BD44 CA44
Claims (6)
- 【請求項１】ウイルス夾雑の危険性のある蛋白溶液を不
活性雰囲気下または減圧下に加熱処理するウイルス不活
化法。 - 【請求項２】不活性雰囲気下が窒素雰囲気下である請求
項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項３】蛋白が生体由来のものである請求項１記載
のウイルス不活化法。 - 【請求項４】蛋白がトランスグルタミナーゼである請求
項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項５】蛋白が血液凝固第XIII因子である請求項１
記載のウイルス不活化法。 - 【請求項６】加熱処理が、４５〜８０℃、１〜４８時間
の処理である請求項１記載のウイルス不活化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001233936A JP2002112765A (ja) | 2000-08-01 | 2001-08-01 | ウイルス不活化法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-233214 | 2000-08-01 | ||
| JP2000233214 | 2000-08-01 | ||
| JP2001233936A JP2002112765A (ja) | 2000-08-01 | 2001-08-01 | ウイルス不活化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002112765A true JP2002112765A (ja) | 2002-04-16 |
Family
ID=26597167
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001233936A Pending JP2002112765A (ja) | 2000-08-01 | 2001-08-01 | ウイルス不活化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002112765A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5359018A (en) * | 1976-11-10 | 1978-05-27 | Green Cross Corp:The | Concentrated xiii-th blood coagulating factor derived from human placentaand its preparation |
| JPS55145615A (en) * | 1979-04-25 | 1980-11-13 | Behringwerke Ag | Blood coagulation factor and its manufacture |
| JP2001031698A (ja) * | 1999-07-23 | 2001-02-06 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | 精製アンチトロンビン−ｉｉｉおよびその製法 |
| JP2001270900A (ja) * | 2000-03-23 | 2001-10-02 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | フィブリノゲンのウイルス不活化法 |
-
2001
- 2001-08-01 JP JP2001233936A patent/JP2002112765A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5359018A (en) * | 1976-11-10 | 1978-05-27 | Green Cross Corp:The | Concentrated xiii-th blood coagulating factor derived from human placentaand its preparation |
| JPS55145615A (en) * | 1979-04-25 | 1980-11-13 | Behringwerke Ag | Blood coagulation factor and its manufacture |
| JP2001031698A (ja) * | 1999-07-23 | 2001-02-06 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | 精製アンチトロンビン−ｉｉｉおよびその製法 |
| JP2001270900A (ja) * | 2000-03-23 | 2001-10-02 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | フィブリノゲンのウイルス不活化法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1027371B1 (en) | Process for the production of highly viral safe thrombin for forming fibrin glue from a pool of human plasma | |
| US4923815A (en) | Process for heat treating thrombin | |
| KR890000165B1 (ko) | 혈장분획을 열처리하는 방법 | |
| JPH02503676A (ja) | 精製したヘモグロビン溶液およびその製造方法 | |
| US6867285B2 (en) | Virus-free plasma protein compositions treated with porous membrane and process for producing the same | |
| JP2605102B2 (ja) | ウイルスおよびバクテリア汚染物の熱的不活性化中の生物学的および製薬的生成物の安定化 | |
| KR950010321B1 (ko) | 인간 트롬빈 제제의 가열처리방법 | |
| JPS6029687B2 (ja) | ヒト胎盤由来血液凝固第１０３因子の濃縮液の製造方法 | |
| JP2002112765A (ja) | ウイルス不活化法 | |
| JP4629831B2 (ja) | ウィルスの不活化方法 | |
| EP0179075B2 (en) | Virus risk-reduced hemoglobin and method for making same | |
| JP2002114799A (ja) | ウイルス除去方法 | |
| JP2001270900A (ja) | フィブリノゲンのウイルス不活化法 | |
| JPH0278633A (ja) | ウイルス不活化方法 | |
| JP2678193B2 (ja) | ヒト血漿由来血液凝固第ｘ▲ｉｉｉ▼因子の製造方法 | |
| JP3127232B2 (ja) | 蛋白質製剤の製造法 | |
| JP2001031698A (ja) | 精製アンチトロンビン−ｉｉｉおよびその製法 | |
| JPH09100239A (ja) | ヒト尿性トリプシンインヒビター製剤およびその製造方法 | |
| JPS588835B2 (ja) | ウロキナ−ゼの加熱安定化法 | |
| JP2005015444A (ja) | プロテインｓ含有溶液のウイルス不活化方法およびプロテインｓの調製物ならびに医薬組成物 | |
| JPS63290829A (ja) | トロンビン製剤 | |
| JPS6030293B2 (ja) | 人顆粒球の分化増殖を促進する加熱処理ｈｇｉｇｐ及びｈｇｉｇｐの加熱処理方法 | |
| JPH02304030A (ja) | 抗ｎａｎｂウイルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 | |
| JPH08169844A (ja) | 人血液凝固第ｉｘ因子含有製剤 | |
| JPH09286798A (ja) | 活性蛋白質組成物の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080404 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110112 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111012 |