JP2002071672A

JP2002071672A - 透過性試験装置及び試験方法

Info

Publication number: JP2002071672A
Application number: JP2000256627A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Tamura; 徹也田村
Original assignee: Pfizer Pharmaceuticals KK; Pfizer Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Pfizer Japan Inc; Pfizer Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2000-08-28
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2002-03-12

Abstract

(57)【要約】【課題】透過性試験において小室の底部分と縦孔内の培
養培地との間に空気の気泡が混入することを防止し、ま
た小室内の溶液の殆ど全部を吸引可能にする。【解決手段】透過性試験装置の傾斜ステージは、上部
プレート５及び下部プレート６を垂直断面において水平
方向から所定角度傾斜させて支持する構造を備える。ロ
ボットは、上部プレート５をその水平方向の角度を変え
ることなく、１つの下部プレート６から持ち上げ、他方
の下部プレート６上へ移動可能である。傾斜した上部プ
レート５の小室５２を水平の下部プレート６の縦孔６２
へ下降する場合、小室５２の底部分５４と縦孔６２内の
液体６４の表面との間の気泡６６が傾斜した底部分５４
に案内され底部分の下方から逃げ、気泡は、底部分下方
に捕らわれない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、薬物（被験化合
物）の細胞に対する透過性を調べるための透過性試験装
置及び試験方法、特にＣａｃｏ−２細胞を用いた薬物の
透過性試験装置及び試験方法に関する。Ｃａｃｏは、Ｈ
ｕｍａｎＣｏｌｏｎＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌの
略称である。

【０００２】

【従来の技術】医薬品の開発においては薬剤化合物につ
いて多くの特性を評価する必要がある。その中には培養
された細胞を使用する透過性試験が含まれる。ＷＯ９９
／２８４３７は、模擬生物学的溶解及び吸収装置及び方
法を開示する。この装置は、溶解室及び管状フィルター
を含む細胞培養室を備える。管状フィルターは、媒体を
透過し、その内部に細胞の単層を支持することができ
る。管状フィルターの内部が頂端細胞室を形成し、管状
フィルターと細胞培養室の内壁の間に代謝室が形成され
る。フィルターは、細胞培養室を通る媒体の流れに平行
な軸線のまわりに回転される。溶解室から流出する媒体
が薬剤組成を含み、頂端細胞室へ供給される。基礎室か
ら流出する媒体中の薬剤活性化合物の現出速度が薬剤活
性化合物の吸収を決定するために分析される。

【０００３】他の公知の透過性試験においては、多数の
縦孔を備える下部プレート及び下部プレートの各縦孔内
へ挿入可能な底部分を有する多数の小室を備える上部プ
レートを含むプレートセットを用いる。上部プレートの
小室の底部分は所定細胞の単層の配列を含み、必要に応
じてその細胞の単層の配列は小径の孔を有する膜で支持
される。試験装置は、プレートセット又は下部プレート
が載置される水平ステージ、プレートセット又は上部プ
レートを移動するためのロボット、及び縦孔又は小室へ
液体を供給する又は縦孔又は小室の液体を吸引除去する
吸引分注器を備える。図１０は、そのような試験におけ
る１つの縦孔６２、小室５２、細胞５５の配置を示す。
図１０において、小室５２の内部は、細胞５５を覆うよ
うに薬剤活性化合物５７を含む溶液が収容され、縦孔６
２内に小室の底部分を囲むように緩衝液６６が収容され
る。この状態において所定時間培養器（インキュベー
タ）において細胞の培養した後の縦孔６２内の緩衝液６
６を分析し、薬剤化合物５７の細胞に対する透過性のデ
ータを得る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】多数の縦孔を備える下
部プレート及び下部プレートの各縦孔内へ挿入可能な底
部分を有する多数の小室を備える上部プレートを用い
て、図１０のように各小室及び縦孔にそれぞれ薬剤活性
化合物を含む溶液及び培養培地を収容し透過性試験を行
うとき、生体により近い状態を想定し、縦孔内の培養培
地（緩衝液）を新しくして薬剤活性化合物の浸透してい
ないものとし、常に血流等により薬剤活性化合物の濃度
が希釈される状態に似せることが行われている。そのた
めには細胞を収容する小室を緩衝液を収容した縦孔へ入
れ替えねばならないが、この入れ替えに伴い、小室５２
の底部分と縦孔内の培養培地６６との間に気泡が混入す
ると、正しい試験結果が得られない。本発明の第１の目
的は、このような気泡の混入をなくすることである。本
発明の他の目的は、透過性試験に使用される上部プレー
トの多数の小室又は下部プレートの多数の縦孔内からマ
ルチピペットを使用して溶液を吸引する場合に残留液を
少なくすることを可能にすることである。本発明のその
他の目的及び利点は、以下の説明において明らかにされ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の透過性試験装置
と協働するプレートセットは、多数の縦孔を備える下部
プレート及び下部プレートの各縦孔内へ挿入可能な底部
分を有する多数の小室を備える上部プレートを含み、上
部プレートの小室の底部分は所定細胞の単層の配列を含
む。また必要に応じて上記細胞の単層は適当な部材で補
強されていても良い。このような補強部材として、小径
の孔を有する薄膜が使用できる。透過性試験装置は、プ
レートセットまたは下部プレートが載置される水平ステ
ージ及び傾斜ステージ、プレートセットまたは上部プレ
ートを移動するためのロボット、及び縦孔又は小室へ液
体を供給する又は縦孔又は小室の液体を吸引除去する吸
引分注器を備える。傾斜ステージは、プレートセットま
たは下部プレートを水平方向から所定角度傾斜させて支
持する構造を備え、水平ステージは、プレートセットま
たは下部プレートを水平方向に支持する構造を備える。
ロボットは、プレートセットまたは上部プレートをその
水平方向の角度を変えることなく、プレートセットにお
いて上部プレートを下部プレートから持ち上げ、他方の
下部プレート上へ移動可能である。本発明の透過性試験
装置は、プレートセットを収容可能な培養器を備えるこ
とができる。また傾斜ステージが有する所定角度は、１
〜２．５°である。

【０００６】本明細書において、「緩衝液」は、器官に
おける粘膜側（ａｐｉｃａｌ）と基底膜側（ｂａｓｏｌ
ａｔｅｒａｌ）の生化学的な状態をそれぞれ再現するた
めに用いられるように調製された水溶液のことを意味す
る。本発明の透過性試験装置に使用されるプレートセッ
トにおいては、その上部プレート小室に粘膜側液を、ま
た下部プレートの縦孔に基底膜側液をそれぞれ注入して
用いる。「粘膜側緩衝液」としては任意の水素イオン濃
度（例えばｐＨ６．５付近）に調整されたＭＥＳ−ＨＢ
ＳＳが挙げられる。一方、「基底膜側緩衝液」としては
任意の水素イオン濃度（例えばｐＨ７．４付近）に調整
されたＨｅｐｅｓ−ＨＢＳＳが挙げられる。これら緩衝
液には、所望により塩化ナトリウム、塩化カルシウムま
たは塩化マグネシウム等の電解質；グルコース等の糖
質；能動輸送蛋白質の阻害剤；および蛍光色素等を含ん
でもよい。本明細書において、「培養培地」は、上部プ
レートの小室の底面に単層で配置された所定細胞の培養
に使用されるものである。「培養培地」としては、ＦＢ
Ｓ（胎児ウシ血清、ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒ
ｕｍ）及び非必須アミノ酸を含む、Ｄ−ＭＥＭ（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｌｅＥａｇｌｅＭｅｄ
ｉｕｍ）等を使うことが出来る。

【０００７】本発明の透過性試験方法は、多数の縦孔を
備える下部プレート、下部プレートの各縦孔内へ挿入可
能な底部分を有する多数の小室を備える上部プレート、
プレートセットまたは下部プレートを水平方向から所定
角度傾斜させて支持する構造の傾斜ステージ、及びプレ
ートセットまたは下部プレートを水平方向に支持する構
造の水平ステージを用いる。本発明の透過性試験方法
は、次の工程を含む。Ｓ１：上部プレートの小室の底面に配置した所定細胞の
単層の配列が、その下面を下部プレートの縦孔内の培養
培地に小径の孔を有する膜を介して接し且つその所定細
胞の上面を上部プレートの小室内に収容した培養培地に
接した状態のプレートセットを傾斜ステージ上に配置す
る工程。なお、本工程におけるプレートセットの配置
は、手動で行っても良い。Ｓ２：水平ステージ上に配置された下部プレートの縦孔
に緩衝液を添加する工程。なお、本工程における下部プ
レートの配置は、手動で行っても良い。Ｓ３：前記小室に培養培地を収容した傾斜ステージ上の
上部プレートを所定角度傾斜させた状態で持ち上げ、水
平ステージ上の緩衝液を添加した下部プレートの上方へ
移動し、上部プレートを所定角度傾斜させた状態で下降
させ、下部プレート上に最初部分的に接触させ次第に変
位させ水平方向に載置し、新たなプレートセットを形成
する工程。Ｓ４：前記上部プレートの小室の培養培地ＣＵを緩衝液
ＡＬに交換する工程。

【０００８】Ｓ５：前記小室に緩衝液を収容したプレー
トセットを培養器へ移動し第１所定時間（例えば１時
間）だけ保温し、一方、Ｓ１で傾斜ステージ上に配置さ
れた下部プレートを廃棄する工程。Ｓ６、Ｓ７：水平ステージ上に下部プレートを更に配置
し（Ｓ６）その縦孔に緩衝液ＢＬを添加する（Ｓ７）工
程。Ｓ８：培養器から第１所定時間経過後のプレートセット
を取出し傾斜ステージ上に配置する工程。Ｓ９：Ｓ８で前記培養器から取出された傾斜ステージ上
のプレートセットから上部プレートを所定角度傾斜させ
た状態で持ち上げ、水平ステージ上の緩衝液を添加した
下部プレートの上方へ移動し、上部プレートを所定角度
傾斜させた状態で下降させ、下部プレート上に最初部分
的に接触させ次第に変位させ水平方向に載置し新たなプ
レートセットを形成する工程。Ｓ１０：前記新たなプレートセットの上部プレートの小
室の緩衝液ＡＬを被験化合物混合液ＣＬに交換する工
程。

【０００９】Ｓ１１：前記小室に被験化合物混合液ＣＬ
を収容したプレートセットを培養器へ移動し第２所定時
間（例えば１時間）だけ保温し、一方、Ｓ８で傾斜ステ
ージに配置された下部プレートを廃棄する工程。Ｓ１２、１３：水平ステージ上に下部プレートを更に配
置し（Ｓ１２）、その縦孔に緩衝液ＢＬを添加する（Ｓ
１３）工程。Ｓ１４：培養器から第２所定時間経過後のプレートセッ
トを取出し傾斜ステージ上に配置する工程。Ｓ１５：Ｓ１４で前記培養器から取出されたプレートセ
ットの上部プレートを所定角度傾斜させた状態で持ち上
げ、水平ステージ上の緩衝液を添加した下部プレートの
上方へ移動し、上部プレートを所定角度傾斜させた状態
で下降させ、下部プレート上に最初部分的に接触させ次
第に変位させ水平方向に載置し新たなプレートセットを
形成する工程。Ｓ１６：前記新たなプレートセットを培養器７へ移動し
第３所定時間（例えば１時間）だけ保温し、一方、Ｓ１
４で傾斜ステージに配置された下部プレートの緩衝液Ｂ
Ｌを採取しその下部プレートを廃棄する工程。Ｓ１７、１８：水平ステージ上に下部プレートを更に配
置し（Ｓ１７）、その縦孔に緩衝液ＢＬを添加する工程
（Ｓ１８）。Ｓ１９：培養器から第３所定時間経過後のプレートセッ
トを取出し傾斜ステージ上に配置する工程。

【００１０】Ｓ２０：前記培養器から第３所定時間経過
後のプレートセットを取り出しその上部プレートを所定
角度傾斜させた状態で持ち上げ、水平ステージ上の緩衝
液を添加した下部プレートの上方へ移動し、上部プレー
トを所定角度傾斜させた状態で下降させ、下部プレート
上に最初部分的に接触させ次第に変位させ水平方向に載
置し新たなプレートセットを形成する工程。Ｓ２１：前記上部プレートの小室の被験化合物混合液Ｃ
Ｌを蛍光色素混合液ＲＬに交換する工程。Ｓ２２：前記小室に蛍光色素混合液ＲＬを収容したプレ
ートセットを培養器へ移動し第４所定時間（例えば１時
間）だけ保温し、一方、Ｓ１９で傾斜ステージに配置さ
れた下部プレートの緩衝液ＢＬを採取しその下部プレー
トを廃棄する工程。Ｓ２３：第４所定時間後のプレートセットを培養器から
取出す工程。Ｓ２４、２５：取出されたプレートセットの下方プレー
トの緩衝液ＢＬを採取し（Ｓ２４）、全てのプレートを
廃棄する（Ｓ２５）工程。蛍光色素は、細胞単層膜を介
してのその下部プレート中の緩衝液への透過を定量する
ことにより、当該細胞単層膜の状態を評価すること（Ｖ
ａｌｉｄａｔｉｏｎ）ができる。ここでいう蛍光色素と
して、ルシフェルイエロー（ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌ
ｏｗ）が挙げられる。透過性評価には、この他に放射性
同位体を含む物質（例えば¹⁴Ｃ−マンニトール：¹⁴Ｃ−
Ｍａｎｎｉｔｏｌ等）も用いられる。なお、これらの工
程同士または各工程を形成している工程は上記順番に限
定されるものではない。プレートセットの温度が常に培
養器内部設定温度に極力近く保たれるよう、または一連
の工程を全て実行するために要する時間を短縮するため
に、工程の順番を適宜設定することが出来、また必要と
有れば２以上の工程を並行して行うこともできる。ま
た、所望であれば各工程でプレートセットの上部プレー
ト上部を蓋で覆って、異物の混入を防止、または上部プ
レート内の緩衝液の蒸散を防止することも出来る。

【００１１】本発明において、小室又は縦穴内の液体を
吸引排出する工程（Ｓ４、Ｓ１０、Ｓ２１、その他）に
おいては、水平ステージ上で行うことに替えて、傾斜ス
テージ上へ上部プレート及び下部プレートの組合わせか
らなるプレートセット又は下部プレートを移動配置しそ
れらを水平方向から所定角度傾斜させて行うことによ
り、小室又は縦孔内の液が一方の隅部へ集まり残留液を
少なくすることができる。また小室内の液体を吸引排出
する工程をその直前の上部プレートの移動工程（例え
ば、Ｓ４の場合はＳ３）前の上部プレートが傾斜ステー
ジにあるときに行うことにより同様の作用効果を得るこ
とができる。なお、上部プレートを所定角度傾斜させた
状態で下降させることに替えて上部プレートの小室の底
面を水平方向から所定角度傾斜させた上部プレートを水
平状態で下降させることができる。

【００１２】

【発明の実施の態様】図１及び図２は、本発明を実施す
る透過性試験装置の概略正面図及配置図であり、図３乃
至図５は、本発明の実施に使用されるプレートセットの
分解側断面図、プレートセットの組立側断面図、及び上
部プレートの平面図である。図面において同様の部材
は、同じ符号を付し重複説明を省く。図１の試験装置
は、ロボット８０、ロボットアーム８２、上部プレート
５、下部プレート６、吸引分注器９５、プレートステー
ジ９６等を備える。プレートステージ９６の構造を除
き、テカンジャパン株式会社の製品により公知である。
図２の試験装置は、蛍光スペクトル測定部９１、４スロ
ット保温器（培養器）９２、炭酸ガス保温器（培養器）
９３、汚れ検査部９４、吸引分注器９５、プレートステ
ージ９６、プレート廃棄シュート９７、及びプレートホ
テル９８を備える。プレートステージ９６の構造を除
き、テカンジャパン株式会社の製品により公知である。
なお、炭酸ガス保温基９３及び汚れ検査部９４は所望に
より省略することが出来る。

【００１３】図３乃至図５に示すように、プレートセッ
ト３は、多数の縦孔６２を備える下部プレート６、及び
下部プレート６の各縦孔６２内へ挿入可能な底部分５４
を有する多数の小室５２を備える上部プレート５、及び
上部プレート５の上面を覆う取外し自在の蓋４を含む。
上部プレート５の小室５２の底部分５４は、図１０に示
すように、所定細胞５５の単層の配列を含む。所定細胞
は、「Ｃａｃｏ−２」であり、「Ｃａｃｏ」は、「Ｈｕ
ｍａｎＣｏｌｏｎＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌ」の
略称である。図４の組立状態に示すように、上部プレー
ト５の周囲の側壁の下端面５８は、対応する下部プレー
ト６の側壁の上端面６８と衝合し、それにより上部プレ
ート５の各小室の底部分５４と下部プレート６の対応す
る縦穴６２との相対位置が決まる。プレートセット３
は、平面図において長方形であり、図５に示すように、
上部プレート５の複数の小室６２は、同一の寸法の開口
部を有し、小室４個を含む短辺方向の列が破断され全長
が示されない上部プレートの長辺方向に６列、小室合計
２４個が配置される。しかしながら、更に多くのサンプ
ルを一度に扱うことができるように、例えば、８個を含
む列を１２列、小室合計９６個を配置することができ
る。

【００１４】図６は、下部プレート６が水平方向から所
定角度αだけ傾斜した傾斜ステージ７４上に載置され、
下部プレート６及びそれと組合った上部プレート５が水
平方向から角度α傾斜する状態を示す側断面図である。
図６の配置においては、小室５２内の液体及び縦孔６２
内の液体は、斜面の下方側において深くなるので、この
深い部分から吸引分注器（中空ニードル）９５により吸
引することにより、小室５２内の液体又は縦孔６２内の
液体は、殆ど残留分なく吸引排除される。

【００１５】図７は、傾斜した上部プレートをロボット
のロボットアームが把持した状態を示す側断面図であ
り、図６の状態における上部プレートを、図６の紙面に
平行な２本のロボットアーム８２で挟持し、水平方向の
傾斜を維持したまま、下部プレート６から上方へ上部プ
レート５を離間した状態を示す。図８は、ロボットアー
ム８２に把持された状態の傾斜した上部プレート５を水
平の下部プレート６上へ下降させる状態を示す側断面図
である。図９は、傾斜した上部プレート５の小室５２を
水平の下部プレート６の縦孔６２へ下降することにより
小室の底部分５４と縦孔６２内の液体６４との間の気泡
６６を逃がす状態を示す側断面図である。

【００１６】図９のように、傾斜した上部プレート５の
小室５２を水平の下部プレート６の縦孔６２へ下降する
場合、小室５２の底部分５４と縦孔６２内の液体６４の
表面との間の気泡６６が傾斜した底部分５４に案内され
底部分の下方から逃げ、気泡は、底部分下方に捕らわれ
ない。傾斜角度αは、１°より小さい場合は、気泡を逃
がす作用が不充分である。

【００１７】図８に示すプレートセット３において、ロ
ボットアーム８２に把持された状態の傾斜した上部プレ
ート５を水平の下部プレート６上へ下降させる場合、上
部プレート５の傾斜角度αが大き過ぎる場合、小室の底
部分５４が縦孔６２内の液体６４に接触する前に、衝合
面５８と支持面６８との間に係合状態６９が発生し、各
小室の底部分を傾斜した状態で縦孔６２内の液体６４の
表面へ接触させることができない。それ故、このような
プレートセット、例えば、米国ベクトン社製のＢＩＯＣ
ＯＡＴ（商標）ＨＴＳＣａｃｏ−２ＡｓｓｅｙＳ
ｙｓｔｅｍでは、傾斜角αは、２．４°以下であること
が必要である。それ故、傾斜角度αの取り得る範囲は、
１〜２．４°である。

【００１８】図１０は、下部プレート６の縦孔６２と上
部プレート５の小室５２を組立てた状態及び細胞５５が
配列を図解的に示す断面図である。この細胞の配列はそ
の底面において補強部材で保持されていてもよい。前述
の米国ベクトン社製のＢＩＯＣＯＡＴ（商標）ＨＴＳ
Ｃａｃｏ−２ＡｓｓｅｙＳｙｓｔｅｍにおいては、
この補強部材は孔径約１．０μｍの細孔を有するペット
（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａ
ｔｅ）製薄膜からなる。また、米国コーニング社製のＨ
ＴＳＴｒａｎｓｗｅｌｌ−２４においては、この補強
部材は孔径０．４乃至３．０μｍの細孔を有するポリカ
ーボネート製薄膜からなる。補強部材は、細孔を有する
疎水性であることが好ましく、その細孔径は配列された
細胞を保持でき、且つ被験化合物を透過させる範囲にあ
ることが好ましく、具体的には上記製品の細孔径の範囲
が好ましい。図１１は、本発明を実施するために使用さ
れるプレートステージ９６及び１つのプレートセットを
示す概略斜視図である。プレートステージ９６は、水平
ステージ７２、傾斜ステージ７４、位置決め部材７７，
７８を備える。図１１の傾斜ステージ７４は、左端にア
クリル棒７７を備え、全体として水平方向に対して所定
傾斜角度α傾斜されている。

【００１９】図１２は、本発明を実施するプレートセッ
トの操作工程を示すフロー図である。図１２のフロー図
において、透過性試験方法は、多数の縦孔を備える下部
プレート６、下部プレートの各小室内へ挿入可能な底部
分を有する多数の小室を備える上部プレート５、下部プ
レートを垂直断面において水平方向から所定角度傾斜さ
せて支持する構造の傾斜ステージ７４、及び下部プレー
ト６を垂直断面において水平方向に支持する構造の水平
ステージ７２、ロボット、その他を用いる。

【００２０】図１２の透過性試験方法は、上部プレート
５の小室の底面に配置した所定細胞の単層の配列が、そ
の下面を下部プレート６の縦孔内の培養培地に小径の孔
を有する膜を介して接し且つその所定細胞の上面を上部
プレートの小室内に収容した培養培地に接した状態のプ
レートセットを傾斜ステージ上に配置する工程（なお、
本工程におけるプレートセットの配置は、手動で行って
も良い）（Ｓ１）；水平ステージ上に配置された下部プ
レート６の縦孔に緩衝液ＢＬ（Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ
Ｌｉｑｕｉｄ）を添加する工程（なお、本工程におけ
るプレートセットの配置は、手動で行っても良い）（Ｓ
２）；前記小室に培養培地を収容した傾斜ステージ上の
上部プレート５を所定角度傾斜させた状態で持ち上げ、
水平ステージ上の緩衝液ＢＬを添加した下部プレート６
の上方へ移動し、上部プレートを所定角度傾斜させた状
態で下降させ、下部プレート上に最初部分的に接触させ
次第に変位させ水平方向に載置し、新たなプレートセッ
トを形成する工程（Ｓ３）；および前記上方プレートの
小室の培養培地ＣＵを緩衝液ＡＬ（ＡｐｉｃａｌＬｉ
ｑｕｉｄ）に交換する工程（Ｓ４）；を含む。

【００２１】図１２の透過性試験方法は、次に小室に緩
衝液ＡＬを収容したプレートセットを培養器７へ移動し
第１所定時間（例えば１時間）だけ保温し、一方、Ｓ１
で傾斜ステージに配置された下部プレート６を廃棄（図
中Ｓ１における矢印Ｄ）する工程（Ｓ５）；水平ステー
ジ上に下部プレートを更に配置し（Ｓ６）その縦孔に緩
衝液ＢＬを添加する工程（Ｓ７）；培養器から第１所定
時間経過後のプレートセットを取出し傾斜ステージ上に
配置する工程（Ｓ８）；Ｓ８で前記培養器７から取出さ
れた傾斜ステージ上のプレートセットから上部プレート
を所定角度傾斜させた状態で持ち上げ、水平ステージ上
の緩衝液を添加した下部プレートの上方へ移動し、上部
プレートを所定角度傾斜させた状態で下降させ、下部プ
レート上に最初部分的に接触させ次第に変位させ水平方
向に載置し新たなプレートセットを形成する工程（Ｓ
９）；前記新たなプレートセットの上部プレートの小室
の緩衝液ＡＬを被験化合物混合液ＣＬに交換する工程
（Ｓ１０）；および前記小室に被験化合物混合液ＣＬを
収容したプレートセットを培養器７へ移動し第２所定時
間（例えば１時間）だけ保温し、一方、Ｓ８で傾斜ステ
ージに配置された下部プレート６を廃棄する（図中Ｓ８
における矢印Ｄ）工程（Ｓ１１）、を含む。

【００２２】図１２の透過性試験方法は、次に水平ステ
ージ上に下部プレートを更に配置し（Ｓ１２）、その縦
孔に緩衝液ＢＬを添加したする工程（Ｓ１３）；培養器
から第２所定時間経過後のプレートセットを取出し傾斜
ステージ上に配置する工程（Ｓ１４）Ｓ１４で前記培養
器から取出されたプレートセットの上部プレートを所定
角度傾斜させた状態で持ち上げ、水平ステージ上の緩衝
液ＢＬを添加した下部プレートの上方へ移動し、上部プ
レートを所定角度傾斜させた状態で下降させ、下部プレ
ート上に最初部分的に接触させ次第に変位させ水平方向
に載置し新たなプレートセットを形成する工程（Ｓ１
５）；および前記新たなプレートセットを培養器７へ移
動し第３所定時間（例えば１時間）だけ保温し、一方、
Ｓ１４で傾斜ステージに配置された下部プレートの緩衝
液ＢＬを採取しその下部プレートを廃棄（図中Ｓ１４に
おける矢印Ｓ、Ｄ）する工程（Ｓ１６）、を含む。

【００２３】図１２の透過性試験方法は、更に水平ステ
ージ上に下部プレートを配置し（Ｓ１７）、その縦孔に
緩衝液ＢＬを添加する工程（Ｓ１８）；培養器から第３
所要時間経過後のプレートセットを取出し傾斜ステージ
上に配置する工程（Ｓ１９）；前記培養器から第３所要
時間経過後のプレートセットを取り出し傾斜ステージに
配置しその上部プレートを所定角度傾斜させた状態で持
ち上げ、水平ステージ上の緩衝液を添加した下部プレー
トの上方へ移動し、上部プレートを所定角度傾斜させた
状態で下降させ、下部プレート上に最初部分的に接触さ
せ次第に変位させ水平方向に載置し新たなプレートセッ
トを形成する工程（Ｓ２０）；前記上部プレートの小室
の被験化合物混合液ＣＬを蛍光色素混合液ＲＬに交換す
る工程（Ｓ２１）；前記小室に蛍光色素混合液ＲＬを収
容したプレートセットを培養器へ移動し第４所定時間
（例えば１時間）だけ保温し、一方、Ｓ１９で傾斜プレ
ートに配置された下部プレートの緩衝液ＢＬを採取しそ
の下部プレートを廃棄（図中Ｓ１９における矢印Ｓ、
Ｄ）する工程（Ｓ２２）；第４所定時間後のプレートセ
ットを培養器から取出す工程（Ｓ２３）；および取出さ
れたプレートセットの下部プレートの緩衝液ＢＬを採取
し全てのプレートを廃棄（図中Ｓ２４および２５におけ
る矢印Ｓ、Ｄ）する工程（Ｓ２４、Ｓ２５）を含む。上
記工程において、これらの工程同士または各工程中に記
載された工程は上記の記載された順番に限定されるもの
ではない。プレートセットの温度が培養器内部設定温度
に極力近くなるよう、または１サイクルに要する時間を
短縮するために、工程の順番を適宜設定することが出
来、また２以上の工程を並行して行うこともできる。上
述した一連の工程のうち、被験化合物の細胞の透過性を
評価するために必要な各工程を必要に応じて繰り返すこ
とができる。このような工程として、例えば、Ｓ１１乃
至２１及びＳ２２における緩衝液ＢＬの採取工程が挙げ
られる。また、所望であればプレートセットの上部プレ
ート上部を蓋で覆って、異物の混入を防止、または上部
プレート内の緩衝液の蒸散を防止することも出来る。な
お、蛍光色素混合液を用いた工程は、使用した細胞単層
の配列の状態を検査するために行われる。採取された各
溶液は、生物学分野、化学分野などで通常用いられる方
法で定量される。これらの方法として、種々のクロマト
グラフィー法や蛍光強度測定法などが挙げられる。

【００２４】上記工程の内、小室又は縦穴内の液体を吸
引排出する工程（Ｓ４、Ｓ１０、Ｓ２１その他）におい
ては、水平ステージ上で行うことに替えて、傾斜ステー
ジ上へプレートセット又は下部プレートを移動配置しそ
れらを水平方向から所定角度傾斜させて行うことによ
り、小室又は縦孔内の液が一方の隅部へ集まり残留液を
少なくすることができる。また小室内の液体を吸引排出
する工程をその直前の上部プレートの移動工程（例え
ば、Ｓ４の場合はＳ３）前の上部プレートがプレートセ
ットとして傾斜ステージにあるときに行うことにより同
様の作用効果を得ることができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、多数の縦孔を備える下
部プレート及び下部プレートの各縦孔内へ挿入可能な底
部分を有する多数の小室を備える上部プレートの各小室
及び縦孔にそれぞれ薬剤活性化合物を含む溶液及び緩衝
液を収容する透過性試験において、小室を新しい緩衝液
を収容した縦孔へ適宜に入れ替えるその際に、小室の底
部分と縦孔内の緩衝液との間に空気の気泡が混入するこ
とを防止することができる。また透過性試験に使用され
る上部プレートの多数の小室又は下部プレートの多数の
縦孔内から中空間が垂直方向に配置されるマルチピペッ
トを使用して溶液を吸引する場合、傾斜ステージ上にお
いて行うことにより残留液を少なくすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を実施する透過性試験装置の概略斜視
図。

【図２】本発明を実施する透過性試験装置の要素配置
図。

【図３】本発明の実施に使用されるプレートセットの分
解側断面図。

【図４】本発明の実施に使用されるプレートセットの組
立側断面図。

【図５】本発明の実施に使用される上部プレートの平面
図。

【図６】傾斜した上部プレートの小室から垂直方向の中
空ニードルからなる分注器により液体を吸引する状態を
示す側断面図。

【図７】傾斜した上部プレートをロボットアームからな
るロボットが把持した状態を示す側断面図。

【図８】ロボットアームに把持された状態の傾斜した上
部プレートを下部プレート上へ下降させる状態を示す側
断面図。

【図９】傾斜した上部プレートの小室を下部プレートの
縦孔へ下降することにより小室の底部分と縦孔内の液体
との間の気泡を逃がす状態を示す側断面図。

【図１０】下部プレートの縦孔と上部プレートの小室を
組立てた状態及び細胞の配列を図解的に示す断面図。

【図１１】本発明を実施するために使用されるステージ
を示す概略斜視図。

【図１２】本発明を実施するプレートセットの操作工程
を示すフロー図である。

【符号の説明】

３：プレートセット、４：蓋、５：上部プレート、６：
下部プレート、７：保温器、８：ロボット、５２：小
室、５４：底面、５５：細胞、５６：溶液、５７：試験
物質、５８：下端面、６２：縦孔、６６：培養培地、６
８：上端面、７２：水平ステージ、７４：傾斜ステー
ジ、７５：アクリル棒、７７、７８：ストッパ、８０：
ロボット、８２：ロボットアーム、９１：蛍光スペクト
ル測定部、９２：４スロット保温器、９３：炭酸ガス保
温器、９４：汚れ検査部、９５：吸引分注器、９６：プ
レートステージ、９７：プレート廃棄シュート、９８：
プレートホテル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 35/02 Ｇ０１Ｎ 35/02 Ｆ 35/04 35/04 Ｇ 35/10 21/88 Ｋ // Ｇ０１Ｎ 21/88 35/06 ＡＦターム(参考） 2G043 AA03 BA17 CA03 DA01 DA04 EA01 GA25 GB18 GB21 2G045 AA40 CB01 DA80 FB06 FB12 JA07 2G051 AA90 AB20 CB10 2G058 BB15 CC02 CC09 CD23 EA02 EA11 ED02 GA02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プレートセットと協働する透過性試験装
置であって、プレートセットは、多数の縦孔を備える下
部プレート及び下部プレートの各縦孔内へ挿入可能な底
部分を有する多数の小室を備える上部プレートを含み、
上部プレートの小室の底部分は所定細胞の単層の配列を
含み、透過性試験装置は、プレートセット又は下部プレートが
載置される水平ステージ及び傾斜ステージ、プレートセ
ット又は上部プレートを移動するためのロボット、及び
縦孔又は小室へ液体を供給する又は縦孔又は小室の液体
を吸引除去する吸引分注器を備え、水平ステージは、プレートセット又は下部プレートを水
平方向に支持する構造を備え、傾斜ステージは、プレー
トセット又は下部プレートを水平方向から所定角度傾斜
させて支持する構造を備え、ロボットは、プレートセットを水平ステージから培養器
へ又は培養器から水平ステージ又は傾斜ステージへ、又
は上部プレートをその水平方向の角度を変えることな
く、１つの下部プレートから持ち上げ、他方の下部プレ
ート上へ移動可能である透過性試験装置。
【請求項２】透過性試験装置は、プレートセットを収
容可能な培養器を備える請求項１の透過性試験装置。
【請求項３】前記所定角度は、１〜２．５°である請
求項１又は２の透過性試験装置。
【請求項４】多数の縦孔を備える下部プレート及び下
部プレートの各縦孔内へ挿入可能な底部分を有する多数
の小室を備える上部プレートを含むプレートセット、プ
レートセット又は下部プレートを水平方向に支持する構
造の水平ステージ、及びプレートセット又は下部プレー
トを水平方向から所定角度傾斜させて支持する構造の傾
斜ステージを用いる透過性試験方法であって、上部プレートの小室の底面に配置した所定細胞の単層の
配列が、その下面を下部プレートの縦孔内の培養培地に
小径の孔を有する膜を介して接し且つその上面を上部プ
レートの小室内に収容した培養培地に接した状態のプレ
ートセットを傾斜ステージ上に配置する工程、水平ステージ上に配置された下部プレートの縦孔に緩衝
液を添加する工程、前記小室に培養培地を収容した傾斜ステージ上の上部プ
レートを所定角度傾斜させた状態で持ち上げ、水平ステ
ージ上の緩衝液を添加した下部プレートの上方へ移動
し、上部プレートを所定角度傾斜させた状態で下降さ
せ、下部プレート上に最初部分的に接触させ次第に変位
させ水平方向に載置する工程、前記上部プレートの小室の培養培地を緩衝液に交換する
工程、前記上部プレート小室に緩衝液を収容したプレートセッ
トを培養器へ移動し第１所定時間だけ保温する工程、傾斜プレート上の下部プレートを廃棄する工程、水平ステージ上に下部プレートを更に配置しその縦孔に
緩衝液を添加する工程、培養器から第１所定時間経過後の上記プレートセットを
取出し傾斜ステージ上に配置する工程、前記培養器から取出された傾斜ステージ上のプレートセ
ットの上部プレートを所定角度傾斜させた状態で持ち上
げ、水平ステージ上の緩衝液を添加した下部プレートの
上方へ移動し、上部プレートを所定角度傾斜させた状態
で下降させ、下部プレート上に最初部分的に接触させ次
第に変位させ水平方向に載置する工程、前記上部プレー
トの小室の緩衝液を被験化合物混合液に交換する工程、前記上部プレートの小室に被験化合物混合液を収容した
プレートセットを培養器へ移動し第２所定時間だけ保温
する工程、第２所定時間後の培養器から取出されたプレートセット
の下部プレートの緩衝液を採取し、下部プレートを廃棄
する工程、を含む透過性試験方法。
【請求項５】請求項４の透過性試験方法であって、更
に水平ステージ上に下部プレートを更に配置し縦孔に緩
衝液を添加する工程、培養器から第２所定時間経過後のプレートセットを取出
し傾斜ステージ上に配置する工程、前記培養器から取出された上部プレートを所定角度傾斜
させた状態で持ち上げ、水平ステージ上の緩衝液を添加
した下部プレートの上方へ移動し、上部プレートを所定
角度傾斜させた状態で下降させ、下部プレート上に最初
部分的に接触させ次第に変位させ水平方向に載置する工
程、前記工程で組合わされたプレートセットを培養器へ移動
し第３所定時間だけ保温する工程、上記傾斜ステージに配置されている下部プレートの緩衝
液を採取しその下部プレートを廃棄する工程、水平ステージ上に下部プレートを更に配置しその縦孔に
緩衝液を添加する工程、培養器から第３所定時間経過後のプレートセットを取出
し傾斜ステージ上に配置する工程、前記培養器から取出され傾斜ステージに配置されたプレ
ートセットの上部プレートを所定角度傾斜させた状態で
持ち上げ、水平ステージ上の緩衝液を添加した下部プレ
ートの上方へ移動し、上部プレートを所定角度傾斜させ
た状態で下降させ、下部プレート上に最初部分的に接触
させ次第に変位させ水平方向に載置する工程、前記上部プレートの小室の被験化合物混合液を蛍光色素
混合液に交換する工程、前記小室に蛍光色素混合液を収容したプレートセットを
培養器へ移動し第４所定時間だけ保温する工程、上記傾斜ステージに配置された下方プレートの緩衝液を
採取しその下部プレートを廃棄する工程、前記第４所定時間後のプレートセットを培養器から取出
し水平ステージに配置しその上部プレートを廃棄する工
程、取出されたプレートセットの下部プレートの緩衝液を採
取し下部プレートを廃棄する工程、を含む透過性試験方
法。
【請求項６】前記小室の液体を交換する工程において
小室の液体の吸引排出が傾斜ステージ上で行われる請求
項４又は５の透過性試験方法。
【請求項７】前記所定角度は、１〜２．５°である請
求項４乃至６のいずれか１項の透過性試験方法。