JP2001525672A

JP2001525672A - 組換えタンパク質の収率を増大させるための方法

Info

Publication number: JP2001525672A
Application number: JP54949098A
Authority: JP
Inventors: ナザン，ランガ; カドニー，ヘンリック
Original assignee: セルトリックスファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2001-12-11
Also published as: AU737927B2; WO1998051780A3; WO1998051780A2; AU7484398A; US5914390A; WO1998051780B1; CA2288456A1; EP0981599A2

Abstract

(57)【要約】組換えタンパク質の収率を増大させるための方法が開示される。１つ以上の保護薬剤（例えば、硫酸化化合物（ヘパリン、ヘパリン硫酸、ドデシル硫酸ナトリウムなどを含む）、ヒアルロン酸、またはデオキシコレート）の組換えタンパク質生成プロセスへの添加が開示される。保護薬剤の組換え生成プロセスへの添加は、組換えタンパク質収率の増大をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】組換えタンパク質の収率を増大させるための方法発明の背景組換え生成は治療タンパク質の大規模な製造を可能にすると同時に、天然供給源からのタンパク質精製の困難および危険の多くを回避する。ヒトタンパク質の場合、しばしば、組換え製造は、治療産物の市販に必要とされるタンパク質量を生じるための唯一の実際的な方法である。組換え生成はまた、ヒト体液および組織への作業者の暴露を排除し、これは感染因子（例えば、ウイルス）への潜在的な暴露を回避する。組換え製造は、組換え宿主細胞における所望のタンパク質をコードするDNA構築物の発現を含む。宿主細胞は、原核生物（例えば、細菌（例えば、Escherichi a coli））または真核生物（例えば、酵母もしくは哺乳動物細胞株）のいずれかであり得る。大規模な組換え製造のために、細菌または酵母宿主細胞は、これらの生物の操作および増殖の容易さのため、およびまたこれらの生物が比較的単純な増殖培地を必要とするので、最も一般的に使用される。しかし、組換え製造は難点がある。発現構築物は、特定のタンパク質および宿主細胞に対して最適化されなければならない。宿主細胞における組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質を、組換えタンパク質を改変するかまたは分解しさえし得る新たなセットの宿主細胞酵素（例えば、プロテアーゼ）に暴露する。もちろん、組換えタンパク質の改変および分解は、収率を減少させ、そして組換えタンパク質精製を面倒にし得るので望ましくない。プロタミン硫酸は、所望でないDNAを溶液から除去することにおける使用のための、組換えタンパク質生成分野で周知の化合物である。プロタミン硫酸が所望でないDNAを除去するために使用される場合、これは、約0.1〜0.2％(w/v)の濃度で、清澄化溶解物（すなわち、宿主細胞溶解および細胞破片除去から生じる溶液）に添加される。プロタミン硫酸の添加はDNAの沈殿を引き起こし、これは濾過または遠心分離による容易な除去を可能にする。清澄化溶解物段階前のプロタミン硫酸の添加は、通常、望ましくないと考えられ：プロタミン硫酸が清澄化溶解物段階前に添加された場合、生じる沈殿DNAは、（可溶性形態で蓄積するタンパク質については）清澄プロセスを面倒にし得るか、または（不溶性形態で蓄積するタンパク質については）「封入体」を汚染し得る。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）は、組換え宿主細胞膜を溶解するために（特に、大きなプラスミドの単離のために）時々使用される、硫酸化界面活性剤である。しかし、組換えタンパク質回収のための宿主細胞溶解におけるSDSの使用は、SDSがタンパク質に結合し（通常、それらを変性し）、そして除去することが非常に困難であり得るので、一般的に避けられる。宿主細胞のプロテアーゼ活性を阻害することにより組換えタンパク質収率を増大させる多数の化合物が利用可能である。不運なことに、これらの化合物（例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)）は毒性であり得、従って、ヒトまたは他の生きている生物への投与用の産物を製造するためのプロセスにおける含有に望ましくない。毒性でない他のプロテアーゼインヒビター（例えば、トリペプチド）は利用可能であるが、これらの化合物は、一般的に、それらを商業的な製造プロセスにおける含有について実施不可能にするほど高価である。従って、毒性化合物または法外に高価な化合物の使用なく組換えタンパク質収率を増大させる方法についての、当該分野における必要性がある。発明の要旨１つの局面において、本発明は、１つ以上の保護薬剤を組換え生成プロセスに添加することにより、組換えタンパク質の収率を改善するための方法を開示する。保護薬剤は、宿主細胞の溶解前に宿主細胞懸濁物に添加される。保護薬剤の宿主細胞懸濁物への添加は、精製プロセス間の組換えタンパク質の分解および／または改変を妨げる。別の局面において、保護薬剤（単数または複数）は、組換え宿主細胞に由来する清澄化溶解物に添加され、それにより目的の組換えタンパク質の収率を増大させる。さらなる局面において、保護薬剤は、目的の組換えタンパク質の可溶化およびリフォールディング後に添加され、それにより目的の組換えタンパク質の収率を増大させる。特定の実施態様において、目的の組換えタンパク質は、インシュリン様増殖因子結合タンパク質-3（IGFBP-3）である。発明の詳細な開示本発明者らは、保護薬剤（すなわち、硫酸化化合物、デオキシコレート、およびグリコサミノグリカン）は、組換えタンパク質の収率を改善し得ることを見出した。単一薬剤または組み合せのいずれかとしての保護薬剤の組換えタンパク質精製スキームへの添加は、組換えタンパク質の収率を増大させる。保護薬剤（単数または複数）は、組換えタンパク質精製の任意の段階で添加され得る。１つの好ましい実施態様において、保護薬剤（単数または複数）は、好ましくは、組換え宿主細胞の溶解前に添加される。別の実施態様において、保護薬剤（単数または複数）は、「清澄化溶解物」段階で（すなわち、宿主細胞溶解および細胞破片除去の後に）精製プロセスに添加される。さらなる実施態様において、保護薬剤は、リフォールディング反応に添加される。本明細書中で使用する用語「保護薬剤」は、硫酸化化合物、グリコサミノグリカン、またはデオキシコレートである化学化合物をいう。本明細書中で使用する用語「硫酸化化合物」は、その構造の一部として少なくとも１つの硫酸部分を有する化学化合物をいう。硫酸化化合物は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、コンドロイチン硫酸（CS）、プロタミン硫酸(PS)、ヘパリン（低分子量形態のヘパリン）、ヘパリン硫酸(HS)、および硫酸アンモニウム(A S)を含むが、それらに限定されない。本明細書中で使用する用語「グリコサミノグリカン」は、アミノ糖を含む多糖である化学化合物をいう。グリコサミノグリカンの例は、CS、ヘパリン、HS、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸を含む。本明細書中で使用する用語「組換え宿主細胞」は、所望の組換えタンパク質を発現するように操作された宿主細胞をいう。組換え宿主細胞を創作する方法は、当該分野で周知である。例えば、Sambrookら(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Har bor,1989))、Ausubelら(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubelら編、John Wiley＆Sons,New York,1987))、または国際特許出願番号WO 96/40722を参照のこと。好ましくは、組換え宿主細胞は、WO 96/40722に示される開示に従って構築される。本明細書中で使用する用語「組換えタンパク質」は、組換えDNA技術を用いて製造され得る任意の目的のタンパク質をいう。組換え宿主細胞は、組換えタンパク質生成に使用される任意の宿主細胞（細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞株を含むが、それらに限定されない）であり得る。好ましくは、組換え宿主細胞は細菌である。より好ましくは、組換え宿主細胞は、Escherichia coli(E.coli)株（例えば、E.coli W3110DE3株）である。組換え宿主細胞は、宿主細胞を、目的の組換えタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換することにより作られ得る。組換え宿主細胞は、当該分野で周知の種々の技術（例えば、細菌もしくは酵母の宿主細胞については塩化カルシウム、昆虫もしくは哺乳動物宿主細胞についてはリン酸カルシウムを含むが、それらに限定されない）により形質転換され得るか、、またはエレクトロポレーションは。組換え宿主細胞の形質転換のための方法は、Sambrookら(MOLEC ULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Sambrookら編、Cold Spring Harbor Labora tory Press,Cold Spring Harbor,1989))、およびAusubel(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubelら編、John Wiley＆Sons,New York,1987))において見出され得る。目的の組換えタンパク質をコードするDNAを含む発現構築物は、当該分野で周知の標準的な方法により構築され得る。目的の組換えタンパク質をコードするDN Aは、天然供給源（例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリー）から得られ得るか、または化学的に合成され得る。発現構築物は、一般的に、目的の組換えタンパク質をコードするDNAと作動可能に結合した制御配列を含む。制御配列は、宿主細胞において天然に生じ得るか（例えば、E.coliにおけるlacもしくはtrpオペロン、酵母におけるα接合因子プロモーター、または哺乳動物細胞におけるDHFRプロモーター）、天然に生じるプロモーターの改変体（例えば、E.coliにおけるla c_uv5 オペロンまたはtacプロモーター）であり得るか、あるいはウイルスプロモーター（例えば、T7プロモーター）であり得る。発現構築物は、複製可能ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体など）にあり得るか、または組換え宿主細胞の染色体に組込まれ得る（例えば、国際特許出願番号WO 96/40722 を参照のこと）。好ましくは、発現構築物は、組換え宿主細胞染色体に組込まれる。組換え宿主細胞は、当該分野で周知の方法を用いて、炭素、窒素、および無機塩の同化可能供給源を含む液体培地中で培養される。形質転換された昆虫または哺乳動物細胞は、炭素、窒素、および無機塩の同化可能供給源を含み、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸、増殖因子、および当該分野で公知の他のタンパク質培養補充物を含む、液体培地中で培養される。宿主細胞培養のための液体培地は、必要に応じて、所望でない微生物の増殖を妨げるための抗生物質もしくは抗真菌物質、および／または発現構築物を含む宿主細胞を選択するための化合物（抗生物質を含むが、それに限定されない）を含み得る。発現構築物は、好ましくは誘導性である（すなわち、化合物の増殖培地への添加が、目的の組換えタンパク質の発現および蓄積を誘導する）。種々の誘導系が当該分野で周知である。当業者は、当該分野で標準であるように、目的の組換えタンパク質の的確な要求に基づいて特定の誘導系を選択する。目的の組換えタンパク質を含む培養された組換え宿主細胞は、当該分野で公知の任意の技術（例えば、濾過または遠心分離）により増殖培地から採集され得る。好ましくは、組換え宿主細胞は、遠心分離により収集される。次いで、収集された組換え宿主細胞は、溶解緩衝液に再懸濁される。溶解緩衝液の正確な組成は、正確な組換え宿主細胞および目的の組換えタンパク質の特性に依存する。溶解緩衝液は、当業者に明らかなように、一般的に、pHを維持するための緩衝化化合物を含み、そして種々の塩、酸、塩基、および他の化合物を含み得る。本発明の１つの実施態様において、保護薬剤（単数または複数）は溶解緩衝液に含まれるか、または組換え宿主細胞の再懸濁後に溶解緩衝液に添加される。この実施態様は、目的の組換えタンパク質が、可溶性形態で組換え宿主細胞内で蓄積する場合に好ましい。好ましくは、保護薬剤（単数または複数）は、少なくとも0.01％(w/v)に添加される。より好ましくは、保護薬剤（単数または複数）は、少なくとも0.03％(w/v)まで添加される。保護薬剤（単数または複数）の、溶解緩衝液に再懸濁された組換え宿主細胞への添加は、精製プロセス間の目的の組換えタンパク質の分解および／または改変を低減し、それにより精製タンパク質の収率を増大させる。組換え宿主細胞は、当該分野で公知の任意の方法（超音波処理、マイクロフルイダイザー(microfluidizer)における破壊などを含む）により溶解され得る。好ましくは、組換え宿主細胞は、マイクロフルイダイザーにおいて溶解される。目的の組換えタンパク質が、可溶性形態で組換え宿主細胞において蓄積する場合、細胞破片は、清澄化溶解物を得るために、溶解後に除去される。細胞破片は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、濾過または遠心分離）により除去され得る。好ましくは、細胞破片は、遠心分離により除去される。別の実施態様において、保護薬剤（単数または複数）は、清澄化溶解物に添加される。保護薬剤（単数または複数）の清澄化溶解物への添加は、精製プロセス間の目的の組換えタンパク質の分解および／または改変を低減し、それにより精製タンパク質の収率を増大させる。目的の組換えタンパク質が、組換え宿主細胞において不溶性形態で蓄積する場合、目的の組換えタンパク質は収集され、洗浄され、そして再可溶化されなければならない。不溶性タンパク質は、一般的に分解および改変に耐性であり、従って、保護薬剤（単数または複数）は、目的の組換えタンパク質が可溶化されるまで精製プロセスに添加される必要はない。目的の不溶性組換えタンパク質の収集、洗浄、および再可溶化は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、米国特許第 4,518,526号、同第4,512,922号、同第4,511,502号、同第4,511,503号、同第4,62 0,948号、または同第4,599,197号に記載される方法）により達成され得る。さらなる実施態様において、保護薬剤（単数または複数）は、目的の組換えタンパク質の再可溶化前に、可溶化緩衝液に添加される。この実施態様は、目的の組換えタンパク質が組換え宿主細胞において不溶性形態で蓄積する場合に好ましい。保護薬剤（単数または複数）の可溶化緩衝液への添加は、可溶化の間および後の目的の組換えタンパク質の分解および／または改変を減少させ、目的の組換えタンパク質の収率の増大をもたらす。目的の組換えタンパク質が、細胞において非天然立体配座で蓄積する場合、目的の組換えタンパク質は、その天然立体配座にリフォールディングされなければならない。組換え生成されたタンパク質のリフォールディングは当該分野で周知であり、そして一般的に、不適切なジスルフィド結合を破壊するために変性タンパク質溶液を還元すること、次いで鎖内ジスルフィド結合の再形成を可能にするために酸化剤を添加することからなる。正確なリフォールディングプロトコルは、当業者に明らかなように、各々の特定のタンパク質について最適化されるが、指針は、米国特許第4,511,502号、同第4,511,503号、および同第4,512,922号に見出され得る。目的のタンパク質が不溶性形態で蓄積する好ましい実施態様の１つである、別の実施態様において、保護薬剤（単数または複数）は、リフォールディング反応に添加される。保護薬剤（単数または複数）は、還元剤と共に、酸化剤と共に、またはリフォールディング反応とは別の添加剤として添加され得る。清澄化溶解物の調製後に（可溶性形態で、および天然立体配座で蓄積するタンパク質の場合）、またはリフォールディング後に（不溶性形態で蓄積するか、もしくは非天然立体配座を有して可溶性形態で蓄積するタンパク質の場合）、次いで、目的の組換えタンパク質は、さらに精製され得る。精製のための正確な工程および条件は、当業者に明らかなように、正確な目的の組換えタンパク質およびこのようなタンパク質に望ましい使用に依存する。実施例実施例１種々の化合物を、分解活性を含むことが知られるE.coli細胞抽出物による分解から成熟IGFBP-3を保護するそれらの能力について試験した。E.coli抽出物は、E .coli W3110DE3株に由来した。E.coli W3110DE3株を増殖させ、遠心分離により収集し、50mM Tris(pH8.0)、１mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および５mMジチオスレイトール(DTT)を含む溶解緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロフルイダイザーを用いて溶解して、全細胞抽出物を得た。全細胞抽出物を遠心分離により清澄化して、分解活性供給源を得た。精製成熟IGFBP-3を、種々の濃度の潜在的に保護的な化合物を含むE.coli抽出物と混合した。混合物を37℃で２時間インキュベートし、そしてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析した。ヘパリン、プロタミン硫酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリエチレングリコール( PEG)、トリペプチド、およびデオキシコレートを、このアッセイにおいて試験した。ヘパリンは、0.01％（試験された最も低い濃度）ほどの低い濃度でIGFBP-3 を分解から保護することが見出され、そして0.03％以上の濃度でIGFBP-3の分解からの完全な保護を証明した。デオキシコレートは0.1％以上で保護的であり、分解からの完全な保護は1％以上であった。プロタミン硫酸は、0.5％以上の濃度でIGFBP-3を破壊から保護し、完全な保護は２％以上の濃度であった。SDSもまた 0.5％以上の濃度でIGFBP-3を破壊から保護した。PEGおよびトリペプチド（Lys-T yr-Lys、Gly-Gly-Ala、Gly-Leu-Tyr、Lys-Lys-Lys）は、保護活性を示さなかった。実施例２ヒトインシュリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP-3）の発現をコードする誘導性発現構築物を有するE.coli宿主株を、流加(batch-fed)発酵により10リットルファーメンターにおいて増殖させ、IGFBP-3を発現するように誘導し、そして遠心分離により採集した。これらの細胞により発現されるIGFBP-3は、E.coli DsbA変異体およびヒトライノウイルス14プロテアーゼ3C(3Cプロテアーゼ)により切断され得るDsbAとIGFBP-3との間のリンカー配列を含む、融合タンパク質である。DsbA/IGFBP-3融合タンパク質は、宿主細胞において可溶性形態で蓄積する。宿主細胞を、50mM Tris(pH8.0)、１mM EDTA、および５mM DTTの溶解緩衝液に再懸濁した。３つの異なる溶解緩衝液を使用し、１つは0.5％ヘパリンを含み、１つは0.5％デオキシコレートを含み、そして１つは添加剤を含まなかった。再懸濁された宿主細胞をマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corp.,Model 11 0-F）を用いて溶解し、そして得られた溶解物を遠心分離により清澄化した。清澄化溶解物のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAG E)分析は、添加剤を含まない溶解緩衝液を用いて作られた清澄化溶解物と比較して、ヘパリンおよびデオキシコレートを含む緩衝液を用いて作られた清澄化溶解物中のIGFBP-3融合タンパク質のより高い収率を示した。次いで、IGFBP-3融合タンパク質を、融合タンパク質のDsbAおよびリンカー成分のタンパク質分解除去によりさらにプロセシングした。3Cプロテアーゼを発現するE.coli株に由来する清澄化溶解物を清澄化溶解物に添加し、そしてNaCl濃度を１Mに調節した。切断を、室温で最低２時間続けさせた。切断後、成熟IGFBP-3 を遠心分離により収集し、そして6M塩酸グアニジン(GuHCl)、50mM Tris(pH8.0) 、20mM DTT、および４mM EDTAを含む可溶化緩衝液に再懸濁した。再可溶化後、混合物を50mM Tris(pH8.0)で４倍希釈し、そしてシスタミンを５mMまで添加して、リフォールディング反応を開始した。リフォールディング反応を、室温で少なくとも２時間行った。リフォールディングされた成熟IGFBP-3溶液を、20mMリン酸カリウム（pH7.0）、0.3M NaCl、および0.5M AS（緩衝液Ａ）への透析により緩衝液交換し、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）カラム（Toyopearlフェニル-650M）にロードした。成熟IGFBP-3を、50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)、0.3M NaClの緩衝液で溶出し、次いでプールし、そしてSulfopropyl Sepharose(SP-FF)カラム(Pha rmacia)にロードした。精製成熟IGFBP-3を、50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)、１M N aClで溶出した。精製成熟IGFBP-3を、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC )により分析し、そして収率をクロマトグラムからのピーク領域の積分により計算した。組換え宿主細胞１グラムあたりのIGFBP-3ミリグラムとして表される、リフォールディングされた成熟IGFBP-3の収率を表Ｉに示す。これらの結果は、ヘパリンおよびデオキシコレートが組換えIGFBP-3の収率を増大させ得ることを示す。デオキシコレート含有緩衝液からの低い収率は、切断工程間にデオキシコレートにより誘導される3Cプロテアーゼ活性の低減（これは、成熟IGFBP-3収率を低くする）のためであり得る。表Ｉ溶解緩衝液添加剤 RP-HPLC ピーク領域 IGFBP-3 収率なし 129,676 1.1mg/g ヘパリン 475,899 5.0mg/g デオキシコレート 282,306 2.6mg/g 本発明は、直接の説明および実施例の両方により詳述された。本発明の等価物および改変は当業者らに明らかであり、そして本発明の範囲内に含まれる。本開示を通して引用された刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体が本明細書中に参考として本明細書により援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の収率を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：ヘパリン、グリコサミノグリカン、プロタミン硫酸、および硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１つの保護薬剤を、組換え宿主細胞の懸濁物に添加する工程であって、該宿主細胞は組換えIGFBP-3を含む、工程；該組換え宿主細胞を溶解する工程；および該組換えIGFBP-3を精製する工程、を包含する、方法。２．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の収率を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：組換え宿主細胞の懸濁物を得る工程であって、該宿主細胞は組換えIGFBP-3を含む、工程；該組換え宿主細胞を溶解する工程；該懸濁物から細胞破片を除去し、それにより清澄化宿主細胞溶解物を形成する工程；ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコレート、ヘパリン、およびグリコサミノグリカンからなる群より選択される少なくとも１つの保護薬剤を、該清澄化宿主細胞溶解物に添加する工程；および該組換えIGFBP-3を精製する工程、を包含する、方法。３．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の収率を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：組換え宿主細胞の懸濁物を得る工程であって、該宿主細胞は、不溶性形態で該宿主細胞に蓄積した組換えIGFBP-3を含む、工程；該組換え宿主細胞を溶解する工程；該不溶性組換えIGFBP-3を収集する工程；該不溶性IGFBP-3を可溶化緩衝液に可溶化する工程であって、該可溶化緩衝液は、ヘパリン、グリコサミノグリカン、および硫酸アンモニウムからなる群より選択される少なくとも１つの保護薬剤を含む、工程；および該組換えIGFBP-3を精製する工程、を包含する、方法。４．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の収率を増大させるための方法であって、該方法は以下の工程：組換え宿主細胞の懸濁物を得る工程であって、該宿主細胞は、不溶性形態で該宿主細胞に蓄積した組換えIGFBP-3を含む、工程；該組換え宿主細胞を溶解する工程；該不溶性IGFBP-3を可溶化緩衝液に可溶化し、それにより可溶化タンパク質溶液を形成する工程；およびヘパリンおよびグリコサミノグリカンからなる群より選択される少なくとも１つの保護薬剤を該可溶化タンパク質溶液に添加する工程；および該組換えIGFBP-3を精製する工程、を包含する、方法。５．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の分解および／または改変を妨げるための方法であって、該方法は、ヘパリン、グリコサミノグリカン、プロタミン硫酸、および硫酸アンモニウムからなる群より選択される保護薬剤を、組換えIGFBP-3を含む宿主細胞懸濁物に添加する工程を包含する、方法。６．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の分解および／または改変を妨げるための方法であって、該方法は、ヘパリンおよびグリコサミノグリカンからなる群より選択される保護薬剤を、宿主細胞の清澄化溶解物に添加する工程を包含し、該清澄化溶解物はIGFBP-3を含む、方法。７．組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質３(IGFBP-3)の分解および／または破壊を妨げるための方法であって、該方法は、ヘパリンおよびグリコサミノグリカンからなる群より選択される保護薬剤を、組換えIGFBP-3を含むリフォールディング反応物に添加する工程を包含する、方法。８．前記保護薬剤がヘパリンである、前記請求項のいずれかに記載の方法。９．前記保護薬剤がグリコサミノグリカンである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。１０．前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である、請求項９に記載の方法。１１．前記保護薬剤がプロタミン硫酸である、請求項１または５のいずれかに記載の方法。１２．前記保護薬剤が硫酸アンモニウムである、請求項１、３、または５のいずれかに記載の方法。１３．前記保護薬剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項２に記載の方法。１４．前記保護薬剤がデオキシコレートである、請求項２に記載の方法。１５．前記保護薬剤が少なくとも0.01％（w/v）まで添加される、前記請求項のいずれかに記載の方法。１６．前記保護薬剤が少なくとも0.03％（w/v）まで添加される、前記請求項のいずれかに記載の方法。１７．前記保護薬剤が少なくとも0.5％（w/v）まで添加される、前記請求項のいずれかに記載の方法。