JP2001525672A - 組換えタンパク質の収率を増大させるための方法 - Google Patents
組換えタンパク質の収率を増大させるための方法Info
- Publication number
- JP2001525672A JP2001525672A JP54949098A JP54949098A JP2001525672A JP 2001525672 A JP2001525672 A JP 2001525672A JP 54949098 A JP54949098 A JP 54949098A JP 54949098 A JP54949098 A JP 54949098A JP 2001525672 A JP2001525672 A JP 2001525672A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- recombinant
- igfbp
- protective agent
- host cells
- heparin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4743—Insulin-like growth factor binding protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
組換えタンパク質の収率を増大させるための方法が開示される。1つ以上の保護薬剤(例えば、硫酸化化合物(ヘパリン、ヘパリン硫酸、ドデシル硫酸ナトリウムなどを含む)、ヒアルロン酸、またはデオキシコレート)の組換えタンパク質生成プロセスへの添加が開示される。保護薬剤の組換え生成プロセスへの添加は、組換えタンパク質収率の増大をもたらす。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えタンパク質の収率を増大させるための方法
発明の背景
組換え生成は治療タンパク質の大規模な製造を可能にすると同時に、天然供給
源からのタンパク質精製の困難および危険の多くを回避する。ヒトタンパク質の
場合、しばしば、組換え製造は、治療産物の市販に必要とされるタンパク質量を
生じるための唯一の実際的な方法である。組換え生成はまた、ヒト体液および組
織への作業者の暴露を排除し、これは感染因子(例えば、ウイルス)への潜在的
な暴露を回避する。
組換え製造は、組換え宿主細胞における所望のタンパク質をコードするDNA構
築物の発現を含む。宿主細胞は、原核生物(例えば、細菌(例えば、Escherichi
a coli))または真核生物(例えば、酵母もしくは哺乳動物細胞株)のいずれか
であり得る。大規模な組換え製造のために、細菌または酵母宿主細胞は、これら
の生物の操作および増殖の容易さのため、およびまたこれらの生物が比較的単純
な増殖培地を必要とするので、最も一般的に使用される。
しかし、組換え製造は難点がある。発現構築物は、特定のタンパク質および宿
主細胞に対して最適化されなければならない。宿主細胞における組換えタンパク
質の発現は、組換えタンパク質を、組換えタンパク質を改変するかまたは分解し
さえし得る新たなセットの宿主細胞酵素(例えば、プロテアーゼ)に暴露する。
もちろん、組換えタンパク質の改変および分解は、収率を減少させ、そして組換
えタンパク質精製を面倒にし得るので望ましくない。
プロタミン硫酸は、所望でないDNAを溶液から除去することにおける使用のた
めの、組換えタンパク質生成分野で周知の化合物である。プロタミン硫酸が所望
でないDNAを除去するために使用される場合、これは、約0.1〜0.2%(w/v)の濃度
で、清澄化溶解物(すなわち、宿主細胞溶解および細胞破片除去から生じる溶液
)に添加される。プロタミン硫酸の添加はDNAの沈殿を引き起こし、これは濾過
または遠心分離による容易な除去を可能にする。清澄化溶解物段階前のプロタ
ミン硫酸の添加は、通常、望ましくないと考えられ:プロタミン硫酸が清澄化溶
解物段階前に添加された場合、生じる沈殿DNAは、(可溶性形態で蓄積するタン
パク質については)清澄プロセスを面倒にし得るか、または(不溶性形態で蓄積
するタンパク質については)「封入体」を汚染し得る。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は、組換え宿主細胞膜を溶解するために(特
に、大きなプラスミドの単離のために)時々使用される、硫酸化界面活性剤であ
る。しかし、組換えタンパク質回収のための宿主細胞溶解におけるSDSの使用は
、SDSがタンパク質に結合し(通常、それらを変性し)、そして除去することが
非常に困難であり得るので、一般的に避けられる。
宿主細胞のプロテアーゼ活性を阻害することにより組換えタンパク質収率を増
大させる多数の化合物が利用可能である。不運なことに、これらの化合物(例え
ば、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF))は毒性であり得、従って、ヒ
トまたは他の生きている生物への投与用の産物を製造するためのプロセスにおけ
る含有に望ましくない。毒性でない他のプロテアーゼインヒビター(例えば、ト
リペプチド)は利用可能であるが、これらの化合物は、一般的に、それらを商業
的な製造プロセスにおける含有について実施不可能にするほど高価である。
従って、毒性化合物または法外に高価な化合物の使用なく組換えタンパク質収
率を増大させる方法についての、当該分野における必要性がある。
発明の要旨
1つの局面において、本発明は、1つ以上の保護薬剤を組換え生成プロセスに
添加することにより、組換えタンパク質の収率を改善するための方法を開示する
。保護薬剤は、宿主細胞の溶解前に宿主細胞懸濁物に添加される。保護薬剤の宿
主細胞懸濁物への添加は、精製プロセス間の組換えタンパク質の分解および/ま
たは改変を妨げる。
別の局面において、保護薬剤(単数または複数)は、組換え宿主細胞に由来す
る清澄化溶解物に添加され、それにより目的の組換えタンパク質の収率を増大さ
せる。
さらなる局面において、保護薬剤は、目的の組換えタンパク質の可溶化および
リフォールディング後に添加され、それにより目的の組換えタンパク質の収率を
増大させる。
特定の実施態様において、目的の組換えタンパク質は、インシュリン様増殖因
子結合タンパク質-3(IGFBP-3)である。
発明の詳細な開示
本発明者らは、保護薬剤(すなわち、硫酸化化合物、デオキシコレート、およ
びグリコサミノグリカン)は、組換えタンパク質の収率を改善し得ることを見出
した。単一薬剤または組み合せのいずれかとしての保護薬剤の組換えタンパク質
精製スキームへの添加は、組換えタンパク質の収率を増大させる。保護薬剤(単
数または複数)は、組換えタンパク質精製の任意の段階で添加され得る。1つの
好ましい実施態様において、保護薬剤(単数または複数)は、好ましくは、組換
え宿主細胞の溶解前に添加される。別の実施態様において、保護薬剤(単数また
は複数)は、「清澄化溶解物」段階で(すなわち、宿主細胞溶解および細胞破片
除去の後に)精製プロセスに添加される。さらなる実施態様において、保護薬剤
は、リフォールディング反応に添加される。
本明細書中で使用する用語「保護薬剤」は、硫酸化化合物、グリコサミノグリ
カン、またはデオキシコレートである化学化合物をいう。
本明細書中で使用する用語「硫酸化化合物」は、その構造の一部として少なく
とも1つの硫酸部分を有する化学化合物をいう。硫酸化化合物は、ドデシル硫酸
ナトリウム(SDS)、コンドロイチン硫酸(CS)、プロタミン硫酸(PS)、ヘパリ
ン(低分子量形態のヘパリン)、ヘパリン硫酸(HS)、および硫酸アンモニウム(A
S)を含むが、それらに限定されない。
本明細書中で使用する用語「グリコサミノグリカン」は、アミノ糖を含む多糖
である化学化合物をいう。グリコサミノグリカンの例は、CS、ヘパリン、HS、デ
ルマタン硫酸、ケラタン硫酸、およびヒアルロン酸を含む。
本明細書中で使用する用語「組換え宿主細胞」は、所望の組換えタンパク質を
発現するように操作された宿主細胞をいう。組換え宿主細胞を創作する方法は、
当該分野で周知である。例えば、Sambrookら(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY
MANUAL(Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Har
bor,1989))、Ausubelら(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubelら編
、John Wiley&Sons,New York,1987))、または国際特許出願番号WO 96/40722を
参照のこと。好ましくは、組換え宿主細胞は、WO 96/40722に示される開示に従
って構築される。
本明細書中で使用する用語「組換えタンパク質」は、組換えDNA技術を用いて
製造され得る任意の目的のタンパク質をいう。
組換え宿主細胞は、組換えタンパク質生成に使用される任意の宿主細胞(細菌
、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞株を含むが、それらに限定されない)であ
り得る。好ましくは、組換え宿主細胞は細菌である。より好ましくは、組換え宿
主細胞は、Escherichia coli(E.coli)株(例えば、E.coli W3110DE3株)である
。
組換え宿主細胞は、宿主細胞を、目的の組換えタンパク質をコードするDNAを
含む発現ベクターで形質転換することにより作られ得る。組換え宿主細胞は、当
該分野で周知の種々の技術(例えば、細菌もしくは酵母の宿主細胞については塩
化カルシウム、昆虫もしくは哺乳動物宿主細胞についてはリン酸カルシウムを含
むが、それらに限定されない)により形質転換され得るか、、またはエレクトロ
ポレーションは。組換え宿主細胞の形質転換のための方法は、Sambrookら(MOLEC
ULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Sambrookら編、Cold Spring Harbor Labora
tory Press,Cold Spring Harbor,1989))、およびAusubel(CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY(Ausubelら編、John Wiley&Sons,New York,1987))において
見出され得る。
目的の組換えタンパク質をコードするDNAを含む発現構築物は、当該分野で周
知の標準的な方法により構築され得る。目的の組換えタンパク質をコードするDN
Aは、天然供給源(例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリー)から得られ得るか
、または化学的に合成され得る。発現構築物は、一般的に、目的の組換えタンパ
ク質をコードするDNAと作動可能に結合した制御配列を含む。制御配列は、宿主
細胞において天然に生じ得るか(例えば、E.coliにおけるlacもしくはtrpオペロ
ン、酵母におけるα接合因子プロモーター、または哺乳動物細胞におけるDHFRプ
ロモーター)、天然に生じるプロモーターの改変体(例えば、E.coliにおけるla
cuv5
オペロンまたはtacプロモーター)であり得るか、あるいはウイルスプロモータ
ー(例えば、T7プロモーター)であり得る。発現構築物は、複製可能ベクター(
例えば、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体など)にあり得るか、または組
換え宿主細胞の染色体に組込まれ得る(例えば、国際特許出願番号WO 96/40722
を参照のこと)。好ましくは、発現構築物は、組換え宿主細胞染色体に組込まれ
る。
組換え宿主細胞は、当該分野で周知の方法を用いて、炭素、窒素、および無機
塩の同化可能供給源を含む液体培地中で培養される。形質転換された昆虫または
哺乳動物細胞は、炭素、窒素、および無機塩の同化可能供給源を含み、必要に応
じて、ビタミン、アミノ酸、増殖因子、および当該分野で公知の他のタンパク質
培養補充物を含む、液体培地中で培養される。宿主細胞培養のための液体培地は
、必要に応じて、所望でない微生物の増殖を妨げるための抗生物質もしくは抗真
菌物質、および/または発現構築物を含む宿主細胞を選択するための化合物(抗
生物質を含むが、それに限定されない)を含み得る。
発現構築物は、好ましくは誘導性である(すなわち、化合物の増殖培地への添
加が、目的の組換えタンパク質の発現および蓄積を誘導する)。種々の誘導系が
当該分野で周知である。当業者は、当該分野で標準であるように、目的の組換え
タンパク質の的確な要求に基づいて特定の誘導系を選択する。
目的の組換えタンパク質を含む培養された組換え宿主細胞は、当該分野で公知
の任意の技術(例えば、濾過または遠心分離)により増殖培地から採集され得る
。好ましくは、組換え宿主細胞は、遠心分離により収集される。
次いで、収集された組換え宿主細胞は、溶解緩衝液に再懸濁される。溶解緩衝
液の正確な組成は、正確な組換え宿主細胞および目的の組換えタンパク質の特性
に依存する。溶解緩衝液は、当業者に明らかなように、一般的に、pHを維持する
ための緩衝化化合物を含み、そして種々の塩、酸、塩基、および他の化合物を含
み得る。本発明の1つの実施態様において、保護薬剤(単数または複数)は溶解
緩衝液に含まれるか、または組換え宿主細胞の再懸濁後に溶解緩衝液に添加され
る。この実施態様は、目的の組換えタンパク質が、可溶性形態で組換え宿主細胞
内で蓄積する場合に好ましい。好ましくは、保護薬剤(単数または複数)は、少
なくとも0.01%(w/v)に添加される。より好ましくは、保護薬剤(単数または複
数)は、少なくとも0.03%(w/v)まで添加される。保護薬剤(単数または複数)
の、溶解緩衝液に再懸濁された組換え宿主細胞への添加は、精製プロセス間の目
的の組換えタンパク質の分解および/または改変を低減し、それにより精製タン
パク質の収率を増大させる。
組換え宿主細胞は、当該分野で公知の任意の方法(超音波処理、マイクロフル
イダイザー(microfluidizer)における破壊などを含む)により溶解され得る。好
ましくは、組換え宿主細胞は、マイクロフルイダイザーにおいて溶解される。
目的の組換えタンパク質が、可溶性形態で組換え宿主細胞において蓄積する場
合、細胞破片は、清澄化溶解物を得るために、溶解後に除去される。細胞破片は
、当該分野で公知の任意の方法(例えば、濾過または遠心分離)により除去され
得る。好ましくは、細胞破片は、遠心分離により除去される。別の実施態様にお
いて、保護薬剤(単数または複数)は、清澄化溶解物に添加される。保護薬剤(
単数または複数)の清澄化溶解物への添加は、精製プロセス間の目的の組換えタ
ンパク質の分解および/または改変を低減し、それにより精製タンパク質の収率
を増大させる。
目的の組換えタンパク質が、組換え宿主細胞において不溶性形態で蓄積する場
合、目的の組換えタンパク質は収集され、洗浄され、そして再可溶化されなけれ
ばならない。不溶性タンパク質は、一般的に分解および改変に耐性であり、従っ
て、保護薬剤(単数または複数)は、目的の組換えタンパク質が可溶化されるま
で精製プロセスに添加される必要はない。目的の不溶性組換えタンパク質の収集
、洗浄、および再可溶化は、当該分野で公知の任意の方法(例えば、米国特許第
4,518,526号、同第4,512,922号、同第4,511,502号、同第4,511,503号、同第4,62
0,948号、または同第4,599,197号に記載される方法)により達成され得る。さら
なる実施態様において、保護薬剤(単数または複数)は、目的の組換えタンパク
質の再可溶化前に、可溶化緩衝液に添加される。この実施態様は、目的の組換え
タンパク質が組換え宿主細胞において不溶性形態で蓄積する場合に好ましい。保
護薬剤(単数または複数)の可溶化緩衝液への添加は、可溶化の間および後の目
的の組換えタンパク質の分解および/または改変を減少させ、目的の組換えタン
パ
ク質の収率の増大をもたらす。
目的の組換えタンパク質が、細胞において非天然立体配座で蓄積する場合、目
的の組換えタンパク質は、その天然立体配座にリフォールディングされなければ
ならない。組換え生成されたタンパク質のリフォールディングは当該分野で周知
であり、そして一般的に、不適切なジスルフィド結合を破壊するために変性タン
パク質溶液を還元すること、次いで鎖内ジスルフィド結合の再形成を可能にする
ために酸化剤を添加することからなる。正確なリフォールディングプロトコルは
、当業者に明らかなように、各々の特定のタンパク質について最適化されるが、
指針は、米国特許第4,511,502号、同第4,511,503号、および同第4,512,922号に
見出され得る。目的のタンパク質が不溶性形態で蓄積する好ましい実施態様の1
つである、別の実施態様において、保護薬剤(単数または複数)は、リフォール
ディング反応に添加される。保護薬剤(単数または複数)は、還元剤と共に、酸
化剤と共に、またはリフォールディング反応とは別の添加剤として添加され得る
。
清澄化溶解物の調製後に(可溶性形態で、および天然立体配座で蓄積するタン
パク質の場合)、またはリフォールディング後に(不溶性形態で蓄積するか、も
しくは非天然立体配座を有して可溶性形態で蓄積するタンパク質の場合)、次い
で、目的の組換えタンパク質は、さらに精製され得る。精製のための正確な工程
および条件は、当業者に明らかなように、正確な目的の組換えタンパク質および
このようなタンパク質に望ましい使用に依存する。
実施例 実施例1
種々の化合物を、分解活性を含むことが知られるE.coli細胞抽出物による分解
から成熟IGFBP-3を保護するそれらの能力について試験した。E.coli抽出物は、E
.coli W3110DE3株に由来した。E.coli W3110DE3株を増殖させ、遠心分離により
収集し、50mM Tris(pH8.0)、1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および5mMジ
チオスレイトール(DTT)を含む溶解緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロフルイダ
イザーを用いて溶解して、全細胞抽出物を得た。全細胞抽出物を遠心分離により
清澄化して、分解活性供給源を得た。
精製成熟IGFBP-3を、種々の濃度の潜在的に保護的な化合物を含むE.coli抽出
物と混合した。混合物を37℃で2時間インキュベートし、そしてドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分析した。ヘパリ
ン、プロタミン硫酸、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリエチレングリコール(
PEG)、トリペプチド、およびデオキシコレートを、このアッセイにおいて試験し
た。ヘパリンは、0.01%(試験された最も低い濃度)ほどの低い濃度でIGFBP-3
を分解から保護することが見出され、そして0.03%以上の濃度でIGFBP-3の分解
からの完全な保護を証明した。デオキシコレートは0.1%以上で保護的であり、
分解からの完全な保護は1%以上であった。プロタミン硫酸は、0.5%以上の濃度
でIGFBP-3を破壊から保護し、完全な保護は2%以上の濃度であった。SDSもまた
0.5%以上の濃度でIGFBP-3を破壊から保護した。PEGおよびトリペプチド(Lys-T
yr-Lys、Gly-Gly-Ala、Gly-Leu-Tyr、Lys-Lys-Lys)は、保護活性を示さなかっ
た。実施例2
ヒトインシュリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-3)の発現をコードする
誘導性発現構築物を有するE.coli宿主株を、流加(batch-fed)発酵により10リッ
トルファーメンターにおいて増殖させ、IGFBP-3を発現するように誘導し、そし
て遠心分離により採集した。これらの細胞により発現されるIGFBP-3は、E.coli
DsbA変異体およびヒトライノウイルス14プロテアーゼ3C(3Cプロテアーゼ)により
切断され得るDsbAとIGFBP-3との間のリンカー配列を含む、融合タンパク質であ
る。DsbA/IGFBP-3融合タンパク質は、宿主細胞において可溶性形態で蓄積する。
宿主細胞を、50mM Tris(pH8.0)、1mM EDTA、および5mM DTTの溶解緩衝液に
再懸濁した。3つの異なる溶解緩衝液を使用し、1つは0.5%ヘパリンを含み、
1つは0.5%デオキシコレートを含み、そして1つは添加剤を含まなかった。再
懸濁された宿主細胞をマイクロフルイダイザー(Microfluidics Corp.,Model 11
0-F)を用いて溶解し、そして得られた溶解物を遠心分離により清澄化した。清
澄化溶解物のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAG
E)分析は、添加剤を含まない溶解緩衝液を用いて作られた清澄化溶解物と比較し
て、ヘパリンおよびデオキシコレートを含む緩衝液を用いて作られた清澄化溶解
物中のIGFBP-3融合タンパク質のより高い収率を示した。
次いで、IGFBP-3融合タンパク質を、融合タンパク質のDsbAおよびリンカー成
分のタンパク質分解除去によりさらにプロセシングした。3Cプロテアーゼを発現
するE.coli株に由来する清澄化溶解物を清澄化溶解物に添加し、そしてNaCl濃度
を1Mに調節した。切断を、室温で最低2時間続けさせた。切断後、成熟IGFBP-3
を遠心分離により収集し、そして6M塩酸グアニジン(GuHCl)、50mM Tris(pH8.0)
、20mM DTT、および4mM EDTAを含む可溶化緩衝液に再懸濁した。再可溶化後、
混合物を50mM Tris(pH8.0)で4倍希釈し、そしてシスタミンを5mMまで添加して
、リフォールディング反応を開始した。リフォールディング反応を、室温で少な
くとも2時間行った。
リフォールディングされた成熟IGFBP-3溶液を、20mMリン酸カリウム(pH7.0)
、0.3M NaCl、および0.5M AS(緩衝液A)への透析により緩衝液交換し、そして
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラム(Toyopearlフェニル-650M)
にロードした。成熟IGFBP-3を、50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)、0.3M NaClの緩衝
液で溶出し、次いでプールし、そしてSulfopropyl Sepharose(SP-FF)カラム(Pha
rmacia)にロードした。精製成熟IGFBP-3を、50mM酢酸ナトリウム(pH5.5)、1M N
aClで溶出した。精製成熟IGFBP-3を、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC
)により分析し、そして収率をクロマトグラムからのピーク領域の積分により計
算した。組換え宿主細胞1グラムあたりのIGFBP-3ミリグラムとして表される、
リフォールディングされた成熟IGFBP-3の収率を表Iに示す。これらの結果は、
ヘパリンおよびデオキシコレートが組換えIGFBP-3の収率を増大させ得ることを
示す。デオキシコレート含有緩衝液からの低い収率は、切断工程間にデオキシコ
レートにより誘導される3Cプロテアーゼ活性の低減(これは、成熟IGFBP-3収率
を低くする)のためであり得る。
表I
溶解緩衝液添加剤 RP-HPLC ピーク領域 IGFBP-3 収率
なし 129,676 1.1mg/g
ヘパリン 475,899 5.0mg/g
デオキシコレート 282,306 2.6mg/g
本発明は、直接の説明および実施例の両方により詳述された。本発明の等価物
および改変は当業者らに明らかであり、そして本発明の範囲内に含まれる。本開
示を通して引用された刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体が本明細
書中に参考として本明細書により援用される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L
S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,
BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E
E,ES,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU
,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL
,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,
SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,U
Z,VN,YU,ZW
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の収率を増大さ せるための方法であって、該方法は以下の工程: ヘパリン、グリコサミノグリカン、プロタミン硫酸、および硫酸アンモニウム からなる群より選択される少なくとも1つの保護薬剤を、組換え宿主細胞の懸濁 物に添加する工程であって、該宿主細胞は組換えIGFBP-3を含む、工程; 該組換え宿主細胞を溶解する工程;および 該組換えIGFBP-3を精製する工程、 を包含する、方法。 2.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の収率を増大さ せるための方法であって、該方法は以下の工程: 組換え宿主細胞の懸濁物を得る工程であって、該宿主細胞は組換えIGFBP-3を 含む、工程; 該組換え宿主細胞を溶解する工程; 該懸濁物から細胞破片を除去し、それにより清澄化宿主細胞溶解物を形成する 工程; ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコレート、ヘパリン、およびグリコサミノ グリカンからなる群より選択される少なくとも1つの保護薬剤を、該清澄化宿主 細胞溶解物に添加する工程;および 該組換えIGFBP-3を精製する工程、 を包含する、方法。 3.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の収率を増大さ せるための方法であって、該方法は以下の工程: 組換え宿主細胞の懸濁物を得る工程であって、該宿主細胞は、不溶性形態で該 宿主細胞に蓄積した組換えIGFBP-3を含む、工程; 該組換え宿主細胞を溶解する工程; 該不溶性組換えIGFBP-3を収集する工程; 該不溶性IGFBP-3を可溶化緩衝液に可溶化する工程であって、該可溶化緩衝液 は、ヘパリン、グリコサミノグリカン、および硫酸アンモニウムからなる群より 選択される少なくとも1つの保護薬剤を含む、工程;および 該組換えIGFBP-3を精製する工程、 を包含する、方法。 4.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の収率を増大さ せるための方法であって、該方法は以下の工程: 組換え宿主細胞の懸濁物を得る工程であって、該宿主細胞は、不溶性形態で該 宿主細胞に蓄積した組換えIGFBP-3を含む、工程; 該組換え宿主細胞を溶解する工程; 該不溶性IGFBP-3を可溶化緩衝液に可溶化し、それにより可溶化タンパク質溶 液を形成する工程;および ヘパリンおよびグリコサミノグリカンからなる群より選択される少なくとも1 つの保護薬剤を該可溶化タンパク質溶液に添加する工程;および 該組換えIGFBP-3を精製する工程、 を包含する、方法。 5.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の分解および/ または改変を妨げるための方法であって、該方法は、ヘパリン、グリコサミノグ リカン、プロタミン硫酸、および硫酸アンモニウムからなる群より選択される保 護薬剤を、組換えIGFBP-3を含む宿主細胞懸濁物に添加する工程を包含する、方 法。 6.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の分解および/ または改変を妨げるための方法であって、該方法は、ヘパリンおよびグリコサミ ノグリカンからなる群より選択される保護薬剤を、宿主細胞の清澄化溶解物に添 加する工程を包含し、該清澄化溶解物はIGFBP-3を含む、方法。 7.組換えインシュリン様増殖因子結合タンパク質3(IGFBP-3)の分解および/ または破壊を妨げるための方法であって、該方法は、ヘパリンおよびグリコサミ ノグリカンからなる群より選択される保護薬剤を、組換えIGFBP-3を含むリフォ ールディング反応物に添加する工程を包含する、方法。 8.前記保護薬剤がヘパリンである、前記請求項のいずれかに記載の方法。 9.前記保護薬剤がグリコサミノグリカンである、請求項1から7のいずれかに 記載の方法。 10.前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である、請求項9に記載の方法 。 11.前記保護薬剤がプロタミン硫酸である、請求項1または5のいずれかに記 載の方法。 12.前記保護薬剤が硫酸アンモニウムである、請求項1、3、または5のいず れかに記載の方法。 13.前記保護薬剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項2に記載の方法。 14.前記保護薬剤がデオキシコレートである、請求項2に記載の方法。 15.前記保護薬剤が少なくとも0.01%(w/v)まで添加される、前記請求項の いずれかに記載の方法。 16.前記保護薬剤が少なくとも0.03%(w/v)まで添加される、前記請求項の いずれかに記載の方法。 17.前記保護薬剤が少なくとも0.5%(w/v)まで添加される、前記請求項のい ずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/855,774 US5914390A (en) | 1997-05-12 | 1997-05-12 | Methods for increasing yields of recombinant proteins |
US08/855,774 | 1997-05-12 | ||
PCT/US1998/009761 WO1998051780A2 (en) | 1997-05-12 | 1998-05-12 | Method for increasing yields or recombinant proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001525672A true JP2001525672A (ja) | 2001-12-11 |
Family
ID=25322031
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP54949098A Pending JP2001525672A (ja) | 1997-05-12 | 1998-05-12 | 組換えタンパク質の収率を増大させるための方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5914390A (ja) |
EP (1) | EP0981599A2 (ja) |
JP (1) | JP2001525672A (ja) |
AU (1) | AU737927B2 (ja) |
CA (1) | CA2288456A1 (ja) |
WO (1) | WO1998051780A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007520234A (ja) * | 2004-02-04 | 2007-07-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | E.コリ発酵によるプラスミドdnaの大規模生産のための方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6709852B1 (en) * | 1999-06-22 | 2004-03-23 | Invitrogen Corporation | Rapid growing microorganisms for biotechnology applications |
AUPR030900A0 (en) * | 2000-09-22 | 2000-10-12 | Queensland University Of Technology | Growth factor complex |
WO2004065568A2 (en) * | 2003-01-23 | 2004-08-05 | Invitrogen Corporation | Rapid growing microorganisms for biotechnology applications |
US20060127468A1 (en) | 2004-05-19 | 2006-06-15 | Kolodney Michael S | Methods and related compositions for reduction of fat and skin tightening |
US8101593B2 (en) | 2009-03-03 | 2012-01-24 | Kythera Biopharmaceuticals, Inc. | Formulations of deoxycholic acid and salts thereof |
MX363465B (es) | 2011-02-18 | 2019-03-25 | Kythera Biopharmaceuticals Inc | Tratamiento de la grasa submental. |
US8653058B2 (en) | 2011-04-05 | 2014-02-18 | Kythera Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising deoxycholic acid and salts thereof suitable for use in treating fat deposits |
US10317376B2 (en) | 2012-04-11 | 2019-06-11 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods of detecting glycosaminoglycans |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4599197A (en) * | 1982-12-22 | 1986-07-08 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
GR79124B (ja) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
EP0295859B1 (en) * | 1987-06-15 | 1994-11-17 | Southern Cross Biotech Pty.Ltd. | Production of proteins in active forms |
EP0321601A1 (en) * | 1987-12-22 | 1989-06-28 | Kishimoto, Tadamitsu, Prof. | Soluble recombinant Fc-Epsilon-receptor, the preparation and the use thereof |
DE3787654D1 (de) * | 1987-12-23 | 1993-11-04 | Immuno Ag | Zellulaere amphipatische proteine in aggregierten formen und verfahren zur herstellung und reinigung diese proteine. |
US5258287A (en) * | 1988-03-22 | 1993-11-02 | Genentech, Inc. | DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53 |
JP2508808B2 (ja) * | 1988-06-20 | 1996-06-19 | 東洋紡績株式会社 | フラクト―ス脱水素酵素の製造方法 |
US5130418A (en) * | 1989-05-02 | 1992-07-14 | California Biotechnology Inc. | Method to stabilize basic fibroblast growth factor |
US5408038A (en) * | 1991-10-09 | 1995-04-18 | The Scripps Research Institute | Nonnatural apolipoprotein B-100 peptides and apolipoprotein B-100-apolipoprotein A-I fusion peptides |
DE4204313A1 (de) * | 1992-02-13 | 1993-08-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von proteinen |
FR2692898B1 (fr) * | 1992-06-30 | 1995-06-02 | Centre Nat Rech Scient | Procédé d'obtention de protéines membranaires, et utilisation de ces protéines dans un but de diagnostic ou de vaccination. |
US5605691A (en) * | 1992-09-17 | 1997-02-25 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Immunologically active proteins from inclusion bodies |
AU6028094A (en) * | 1993-01-26 | 1994-08-15 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Compositions containing transforming growth factor beta stabilized by glycosaminoglycans |
US5861273A (en) * | 1993-12-21 | 1999-01-19 | Celtrix Phamraceuticals, Inc. | Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells |
US5789547A (en) * | 1995-06-07 | 1998-08-04 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Method of producing insulin-like growth factor-I (IGF-I) and insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) with correct folding and disulfide bonding |
ATE358684T1 (de) * | 1995-06-07 | 2007-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Waessrige formulierung enthaltend tfpi und lösungsvermittlers |
-
1997
- 1997-05-12 US US08/855,774 patent/US5914390A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-05-12 AU AU74843/98A patent/AU737927B2/en not_active Ceased
- 1998-05-12 WO PCT/US1998/009761 patent/WO1998051780A2/en not_active Application Discontinuation
- 1998-05-12 JP JP54949098A patent/JP2001525672A/ja active Pending
- 1998-05-12 CA CA002288456A patent/CA2288456A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-12 EP EP98922251A patent/EP0981599A2/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007520234A (ja) * | 2004-02-04 | 2007-07-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | E.コリ発酵によるプラスミドdnaの大規模生産のための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU737927B2 (en) | 2001-09-06 |
WO1998051780A3 (en) | 1999-03-25 |
WO1998051780A2 (en) | 1998-11-19 |
AU7484398A (en) | 1998-12-08 |
US5914390A (en) | 1999-06-22 |
WO1998051780B1 (en) | 1999-04-29 |
CA2288456A1 (en) | 1998-11-19 |
EP0981599A2 (en) | 2000-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3929777B2 (ja) | 組換えタンパク質をリフォールディングするための凡用的な手順 | |
JPS611393A (ja) | Il−2の回収及び精製方法 | |
TW200813093A (en) | Refolding of recombinant proteins | |
JP2646081B2 (ja) | 生物学的に活性な蛋白質の回収方法 | |
JP2001519149A (ja) | 双性イオン性低分子量物質の使用によるタンパク質の再生方法 | |
JP2001525672A (ja) | 組換えタンパク質の収率を増大させるための方法 | |
EP0315650B1 (en) | Purification of recombinant interleukin-1 | |
EP1194445B1 (en) | Methods for purifying recombinant growth hormone antagonist proteins using aqueous two-phase extraction | |
JP2001512745A (ja) | インスリンc−ペプチドの組換え発現 | |
JP2517100B2 (ja) | ヒト顆粒球コロニ―刺激因子活性を有する蛋白質の精製法 | |
JP2003500049A (ja) | トロンビンの再生方法 | |
JPH01502556A (ja) | イー・コリにおいて発現したピー・ファルシパラム・csタンパク質ワクチンの単離および精製方法 | |
EP3374376B1 (en) | Industrially scalable process for recovering biologically active recombinant carrier proteins | |
JP2003500059A (ja) | 生物活性タンパク質およびペプチドのファージ依存大量生成 | |
EP1439191B1 (en) | Process for the purification of bacterially expressed proteins | |
RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
CN111434676A (zh) | 一种乙型肝炎病毒HBV来源HBx蛋白的制备方法 | |
JP2003504313A (ja) | 水性溶媒中での貯蔵中の複合混合物のタンパク質の安定化法 | |
RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
JP3737252B2 (ja) | 上皮細胞増殖因子活性を有するタンパク質の回収精製法 | |
JPH11508453A (ja) | Il―16活性を有するプロセスされたポリペプチド、それらの製法、及びそれらの使用 | |
JP3040190B2 (ja) | タンパクの精製方法 | |
KR0138581B1 (ko) | 재조합 대장균으로부터 플레이오트로핀을 정제하는 방법 | |
JPH03240800A (ja) | 成長ホルモン様糖タンパク質 | |
US7125696B2 (en) | Method for preparing a polypeptide soluble in an aqueous solvent in the absence of detergent |