JP2001523093A - β−アミロイドペプチド結合タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトβ−アミロイドペプチドに結合する新規なタンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びこれらのタンパク質の製造方法が提供される。また、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを用いる診断、治療及びスクリーニング方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 β−アミロイドペプチド結合タンパク質 及びそれらをコードするポリヌクレオチド 本願は１９９７年４月１６日に出願された米国仮出願６０／０６４，５８３の 利益を請求し、その内容は引用することにより本願に組み込まれる。発明の分野 本発明は新規なポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドによりコー ドされるタンパク質並びにこれらのポリヌクレオチド及びタンパク質の治療、診 断及び研究有用性に関する。特に、本発明はポリヌクレオチド及びそのようなポ リヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、それらのタンパク質が アルツハイマー病と関係するアミロイド沈着物の主要構成成分の一つのβ−アミ ロイドペプチドに結合するものに関する。発明の背景 アルツハイマー病（ＡＤ）は脳の一連の構造異常を特徴とする中高年層の進行 性痴呆疾患である。中枢神経系（ＣＮＳ）の多数の領域のニューロンが機能障害 になり、死滅し、シナプス入力の改変をもたらす。これらの傷つきやすいニュー ロンの細胞体及び近位樹状突起はペアードヘリカルフィラメントからなる神経原 繊維変化を含み、それらの主要成分はリン酸化された微小管結合タンパク質、す なわちτである。疾病の特徴の一つは老人（または神経突起）斑と呼ばれる脳内 の沈着物を含むアミロイドの蓄積である。アミロイド斑の主要成分はβ−アミロ イドペプチド（以下「ＢＡＰ」、Ａβ、βＡＰ等とも文献において呼ばれる）で あり、それはＡＤの進行中に密な集合体を形成する。 ＢＡＰはアミロイド前駆体タンパク質（以下「ＡＰＰ」）のタンパク質分解開 裂により得られる３９−４３アミノ酸ペプチドであり、ＡＰＰの膜貫通ドメイン の一部及び管腔／細胞外ドメインからなる。４２アミノ酸を含んでなるＢＡＰペ プチド（ＢＡＰ４２）がおそらくヒトにおけるいっそう有毒な集合型であると考 えられる。ＡＰＰはいくつかのＢＡＰ含有アイソフォームとして生じる。主要な 型は６９５、７５１及び７７０アミノ酸からなり、後者の２つのＡＰＰはクニッ ツ型セリンプロテアーゼインヒビターと構造的及び機能的相同性を共有するドメ インを含有する。正常個体では、ＢＡＰは蓄積せず、循環する体液から迅速に取 り除かれる。しかしながら、ペプチドは異栄養性樹状突起及び軸索、ミクログリ ア並びに反応性アストロサイトの表面上に斑を形成することができる。神経突起 斑におけるＢＡＰの集合及び沈着はＡＤの開始事象の一つとみなされている。Ｂ ＡＰの発現及び結果をもたらす事象並びにＡＤにおけるそれらの個々の役割の研 究は神経科学研究の主要な焦点である。特に、ＢＡＰに結合するタンパク質の発 見は、疾病の病因の理解を進めるため及びおそらく新規な治療標的を導入するた めにきわめて重要である。 本発明まで、ヒトＢＡＰと結合し、そしてＡＤにおけるＢＡＰの生物学的作用 に関与する可能性があるタンパク質及びそれらのフラグメントは同定されていな い。発明の要約 本発明はヒトβ−アミロイドペプチド（ＢＡＰ）アミノ酸配列に選択的に結合 する遺伝子産物をコードする新規な単離されたポリヌクレオチ ドを提供する。 一つの態様として、本発明は： （ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｂ）受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌの β−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んで なるポリヌクレオチド； （ｃ）受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌの ｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質 （ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド； （ｄ）ヌクレオチド２０２からヌクレオチド８０７までの配列番号：１のヌク レオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｅ）受託番号ＡＴＣＣ ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のβ −アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含んでな るポリヌクレオチド； （ｆ）受託番号ＡＴＣＣ ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６のｃ ＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリ ヌクレオチド； （ｈ）配列番号：２のアミノ酸６８からアミノ酸２６９までのアミノ酸配列を 含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド結合活性を 有する配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるタンパク質をコ ードするポリヌクレオチド、； （ｊ）上記の（ａ）−（ｆ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であるポ リヌクレオチド； （ｋ）上記の（ｇ）−（ｉ）のタンパク質の種相同物をコードするポリヌクレ オチド；及び （ｌ）（ａ）−（ｈ）において特定されたポリヌクレオチドのいずれかに厳し い条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、 よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提 供する。 好ましくは、そのようなポリヌクレオチドは配列番号：１のヌクレオチド配列 ；受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−ア ミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列；または受託番 号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサ ートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコ ードするポリヌクレオチドを含んでなる。別の態様は配列番号：１のｃＤＮＡ配 列に対応する遺伝子を提供する。 他の態様として、本発明はタンパク質を含んでなる組成物を提供し、その場合 、該タンパク質は： （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列： （ｂ）アミノ酸６８からアミノ酸２６９までの配列番号：２のアミノ酸配列； （ｃ）受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌの ｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列； （ｄ）配列番号：２のアミノ酸１８５からアミノ酸２１７までのアミノ酸配列 を含んでなる配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント、 よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。 好ましくは、そのようなタンパク質は配列番号：２のアミノ酸配列またはアミ ノ酸６８からアミノ酸２６９までの配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる。 また、融合タンパク質も本発明において請求される。 ある好ましい態様として、ポリヌクレオチドを発現制御配列に機能的に連結す る。また、本発明はそのようなポリヌクレオチド組成物で形質転換された、バク テリア、酵母、昆虫及び哺乳類細胞を初めとする、宿主細胞も提供する。 また、（ａ）適当な培養培地中で請求の範囲３の宿主細胞の培養物を増殖させ ；そして（ｂ）培養培地からタンパク質を精製することを含んでなるＢＢＰの製 造方法も提供する。 また、そのようなＢＢＰと特異的に反応する抗体を含んでなる組成物も本発明 により提供される。 ヒトＢＡＰの異常な発現を特徴とする疾病状態を検出するための方法及び診断 プロセス並びにＢＢＰの活性を調節する化合物を同定するための方法が提供され る。 本発明の別の態様は発現制御配列に機能的に連結されたＢＢＰをコードするポ リヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック動物を含む。図面の簡単な説明 以下の図面は本発明のある一定の態様を示す。それらは具体的に説明するため のものにすぎず、他の本明細書に開示される本発明を限定しない。 図１：酵母２−ハイブリッドスクリーニング設計． 記述したように、ＢＡＰ₄₂ に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＡＰ^BD；ＴＲＰ１マーカーを含 有するプラスミド）及び非融合ＢＡＰ₄₂（ＢＡＰ；ＵＲＡ３マーカーを含有する プラスミド）を発現するＹ２Ｈ宿主株をＧａｌ４活性化ドメイン融合タンパク質 （未知^AD）を発現するＹ２Ｈヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ＬＥＵ２マーカ ーを含有するプラスミド）で形質転換した。従って、株は示したタンパク質を発 現する円で表される３個のエピソームプラスミドを含有した。陽性のタンパク質 −タンパク質相互作用は上流活性化配列（ＧＡＬ_UAS）でＧａｌ４活性を再構成 し、それによりレポーター遺伝子ＨＩＳ３の転写を誘導した。 図２：ＢＢＰ１／ＢＡＰ結合の証明． 記述したように、１０倍連続希釈を作 製し、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジンを欠き、２５ｍＭ ３−アミノ− トリアゾールを含有する合成寒天培地上に５μｌを置くことによりヒスチジン原 栄養に関してＹ２Ｈ株をアッセイした。ラベルＢＡＰで示されるように、全ての 株はＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミドｐＥＫ１６２を含有する。最初の列（ ベクター）はｐＥＫ１６２及び関係のない融合タンパク質を発現するベクターｐ ＡＣＴ２を保有する独立して得られた株を含む。標的タンパク質を発現する株と の比較のバックグラウンドの基準としてこれらを用いる。本文中に記述したよう に、ＢＢＰ１Δｔｍで示したカラムはｐＥＫ１９８から短くしたＢＢＰ １を発現する。ＢＡＰとＢＢＰ１Δｔｍ融合タンパク質の相互作用はＧａｌ４活 性を再構成し、コントロール株に比較して増大した原栄養増殖として見られる、 ＨＩＳ３レポーター遺伝子の誘導をもたらす（図１参照）。 図３：Ｇ_αタンパク質とのＢＢＰ１相互作用を示すバイオアッセイ． Ｇａｌ ４活性化ドメイン融合タンパク質として発現されるラットＧ_αs、Ｇ_αoまたはＧ_αi2 の部分と共にＢＢＰ１の予測される細胞内ドメインをＧａｌ４ ＤＮＡ結合 ドメインとして発現させた。各株の２つの独立して得られたクローンのＹ２Ｈ反 応をＧタンパク質成分を欠いている細胞の反応（ベクター）に比較した。プロト コルは図２に対する説明文において記述したとおりである。 図４：ＢＢＰ１とＢＡＰの相互作用の部位． 本文に記述したようにＢＢＰ１ Δｔｍを２つの重複するセグメントに分けた。これらのタンパク質、ＢＢＰ１Δ ＣまたはＢＢＰ１ΔＮをＢＡＰとの相互作用に関してアッセイした。アッセイ方 法及びベクターまたはＢＢＰ１Δｔｍで示される株は図２に対する説明文におい て記述したとおりである。ＢＢＰ１ΔＣまたはＢＢＰ１ΔＮで示される株は、示 したＢＢＰ１セグメントを融合タンパク質として発現する。 図５：ヒト組織（Ａ）及び脳領域（Ｂ）におけるＢＢＰ１ ｍＲＮＡの発現． 示した組織から単離した２μｇのサイズ分画したポリ−ＡＲＮＡをブロットし たナイロン膜をＣＬＯＮＴＥＣＨから入手した。これらに放射性標識したＢＢＰ １ ｃＤＮＡプローブを記述したようにハイブリダイズさせた。１．２５ｋｂ（ 分子量マーカー（示されない）から決定した）に相当する顕著なバンドが全ての レーンにおいて見られた。 より高分子量のバンドはおそらくヘテロ核ＲＮＡに相当し；ＢＢＰ１遺伝子はい くつかのイントロンを含む。ブロットをはがし、積載及びＲＮＡ保全性コントロ ールとしてβ−アクチンで再検出し；全てのレーンは同等なシグナルを示した（ データは示されない）。 図６：海馬の細胞におけるＢＢＰ１及びＡＰＰの発現． ヒト海馬及び嗅内皮 質におけるＢＢＰ１（Ａ）及びＡＰＰ（Ｂ）発現のパターンを示すインサイチュ ーハイブリダイゼーションオートラジオグラムの像。これらの像を生成するため に用いた切片を２人の異なる患者から得られた死後標本から作った。略語：ＤＧ ＝歯状回；ＣＡ１＝海馬部分体（ｓｕｂｆｉｅｌｄ）；ＥＣ＝嗅内皮質。 図７：ヒトまたは齧歯類ＢＡＰとのＢＢＰ１相互作用の比較． 本文中に記述 したように齧歯類ＢＡＰを作製し、融合タンパク質として発現させた。ヒトＢＡ Ｐで示す株は図２において示したものと同一である。齧歯類ＢＡＰで示す株はＧ ａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物として齧歯類ＢＡＰを発現する。ベクターは ＢＡＰ融合タンパク質に対比させるベクターのみを含有するコントロール株を示 し；ＢＢＰ１はＢＢＰ１Δｔｍ融合タンパク質を発現する株を示す。発明の詳細な説明 本発明はヒトβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ１）の単離及び クローニングに関する。酵母２ハイブリッドアッセイにおいて融合タンパク質と してＢＢＰ１はＢＡＰの４２アミノ酸フラグメント（ＢＡＰ４２）に結合すると 特性化された。ＢＢＰ１の発現はヒト組織及び特定の脳領域において示された（ 図５）。重要なことに、ＢＢＰ１は齧歯類ＢＡＰに比較した場合に酵母２ハイブ リッド系においてヒトＢＡＰ １を選択的に結合することが示された。これらの結果は、アルツハイマー病の診 断及び処置に、そして脳におけるアミロイド含有斑の蓄積を調節するための薬剤 の評価及びスクリーニングのために本発明のＢＢＰ１を用いることができるとい う前提を裏付ける。ＢＢＰ１コーディング配列 ＢＡＰのおそらくより有毒な型のヒトＢＡＰ₄₂と相互作用するタンパク質を同 定するために開発された酵母２−ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）遺伝子スクリーニング を用いることにより、最初のヒトＢＢＰ１クローン（クローン１４と称した）を 得た。ＢＡＰ₄₂を酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合して発現させ、また 遊離ペプチドとしても発現させた（図１）。この株をヒト胎児脳ｃＤＮＡ Ｙ２ Ｈライブラリーで形質転換した。約１０⁶の別個の形質転換体から、＃１４で示 される単一クローンが一貫したレポーター遺伝子活性化を示し、ＧＡＬ４ドメイ ンのものと連続した実質的なオープンリーディングフレームを含有した。ｃＤＮ Ａインサートはポリ−Ａ領域で終わる９８４塩基対を含んでなった。この配列は 細胞膜を横切るために十分な長さ及び疎水性の２つの領域を有する２０１（→２ ０２？）アミノ酸（配列番号：２のアミノ酸６８ないしアミノ酸２６９）をコー ドした。また、可能性のあるアルパラギン連結グリコシル化部位もある。クロー ン１４をクローンｐＥＫ１９６と称し、ＡＴＣＣ ９８３９９として寄託した。 ライブラリー由来のプラスミドをクローン１４から単離し、Ｙ２Ｈアッセイ株 を再構築するために用いた。これらの株の試験から、反応は弱いが、ＢＡＰ融合 タンパク質がクローン１４タンパク質と特異的に相互作用することが示された。 膜貫通領域のような強い疎水性のタンパク質ド メインはＹ２Ｈ反応を妨げるので（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ、未発表データ）、最 も強い疎水性の領域を除くためにクローン１４インサートを短くし（ＢＢＰ１Δ ｔｍ；さらなる説明は以下の表２を参照）、ＢＡＰとの相互作用に関して再試験 した。ＢＢＰ１Δｔｍでかなりより強いＹ２Ｈ反応が見られ、削除した配列が可 能性のある膜貫通（「ｔｍ」）アンカーをコードするという考えを裏付けた。ク ローン１４は融合タンパク質の形態で新規なＢＡＰ結合タンパク質を同定する。 可能性がある開始メチオニンコドンが存在しなかったので、クローン１４中に 含まれるＢＢＰ１ ｃＤＮＡ配列はタンパク質コーディング領域の５’末端を欠 いていると同定された。標準的な逆転写酵素を利用する通常の５’ＲＡＣＥ（ｃ ＤＮＡ末端の迅速増幅）の多数の試みは２７ヌクレオチドの付加をもたらしただ けであった。従って、以下の実施例２において記述したようなゲノムクローニン グ法を用いて５’末端を単離した。 ５’コーディング配列末端はゲノムライブラリーから得られたので、この領域 がイントロンを含有する可能性が存在した。この可能性を以下の実施例２におい て記述したような２つの方法により調べた。得られたデータから、上流配列（ゲ ノム及びｃＤＮＡ起源からの両方）並びにこの領域中にイントロンがないことが 確かめられた。全長ＢＢＰ１タンパク質コーディング領域をコードするｃＤＮＡ インサートを含有するプラスミドＢＢＰ１−ｆｌをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号９８６１７で寄託した。全 コーディング領域及び推定されるタンパク質配列を配列番号：１及び２に示す。 ３’非翻訳ヌクレオチド配列は元のクローン１４（ｐＥＫ１９６）中に 含まれる。 本発明により、適切な宿主細胞においてＢＢＰ１または機能的に活性のあるペ プチドの発現を導く組み換えＤＮＡ分子を作製するためにＢＢＰ１、そのフラグ メント、融合タンパク質または機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を用 いることができる。あるいはまた、ＢＢＰ１配列の一部にハイブリダイズするヌ クレオチド配列を核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザン及びノーザンブ ロットアッセイ等に用いることができる。 また、本発明は本明細書に開示されるポリヌクレオチドのものに相補的な配列 を有するポリヌクレオチドも含む。 また、本発明は引き下げられたストリンジェンシー条件、より好ましくは厳し い条件、最も好ましくは非常に厳しい条件下で本明細書に記述されるポリヌクレ オチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも含む。ストリンジ ェンシー条件の例を以下の表に示し：非常に厳しい条件は例えば条件Ａ−Ｆと少 なくとも同じくらい厳しいものであり；厳しい条件は例えば条件Ｇ−Ｌと少なく とも同じくらい厳しく；そして引き下げられたストリンジェンシー条件は例えば 条件Ｍ−Ｒと少なくとも同じくらい厳しい。ストリンジェンシー条件 ¹：ハイブリッドの長さはハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイ ズした領域に対して予想されるものである。未知の配列の標的ポリヌクレオチド にポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブ リダイズするポリヌクレオチドのものである と考えられる。既知の配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる場合、ポ リヌクレオチドの配列を整列させ、最適の配列相補性の領域または複数の領域を 同定することによりハイブリッドの長さを決定することができる。^H ：ハイブリダイゼーション及び洗浄バッファー中のＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０． １５Ｍ ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりにＳＳＰＥ （１ｘＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄及び１．２５ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を用いることができ；ハイブリダイゼーショ ンが完了した後に洗浄を１５分間実施する。 ＊Ｔ_B−Ｔ_R：５０塩基対未満の長さであると予想されるハイブリッドのハイブリ ダイゼーション温度はハイブリッドの融解温度（Ｔ_m）より５−１０ＥＣ低いべ きであり、その場合、Ｔ_mは以下の式により決定される。１８塩基対未満の長さ のハイブリッドでは、Ｔ_m（ＥＣ）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の 数）。１８ないし４９塩基対の間の長さのハイブリッドでは、Ｔ_m（ＥＣ）＝８ １．５＋１６．６｛ｌｏｇ₁₀［Ｎａ⁺］｝＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／ Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ⁺］はハイ ブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣ の［Ｎａ⁺］＝０．１６５Ｍ）。 ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらな る例は、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． 、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、第９及 び１１章並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、節２．１０及び６．３−６．４中に与え られる。 好ましくは、各々のそのようなハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それ がハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（よ り好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％）である長さ を有し、そしてそれがハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドと少なくと も６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好まし くは少なくとも９０％または９５％の同一性）を有し、その場合、配列同一性は 、配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にするように整列し た場合にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列を比較することにより決定 される。ＢＢＰ１の発現 タンパク質を組み換え的に生産するために、Ｋａｕｆｍａｎ等、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、４４８５−４４９０（１９９１）中に開示され たｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのような発現制御配列に本発明の単離され たポリヌクレオチドを機能的に連結することができる。多数の適当な発現制御配 列が当該技術分野において知られている。また、組み換えタンパク質を発現させ る一般法も知られており、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ１８５ 、５３７−５６６（１９９０）中に例示されている。本明細書に定義され る場合「機能的に連結された」は、連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列 で形質転換（トランスフェクト）されている宿主細胞によりタンパク質が発現さ れるように本発明の単離されたポリヌクレオチドと発現制御配列がベクターまた は細胞内に位置していることを意味する。ＢＢＰ１の発現系 多数の型の細胞がタンパク質発現のための適当な宿主細胞の役割を果たすこと ができる。哺乳類宿主細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスタ ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏ ｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系 、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から得られた細胞系、一次移植片 、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたは Ｊｕｒｋａｔ細胞を含む。 あるいはまた、酵母のような下等真核生物またはバクテリアのような原核生物 においてタンパク質を生産することが可能である。潜在的に適当な酵母株はサッ カロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ （Ｃａｎｄｉｄａ）または異種起源のタンパク質を発現することができるあらゆ る酵母株を含む。潜在的に適当なバクテリア株はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ ｔ ｉｌｉｓ ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ ）または異種起源のタンパク質を発現することができるあらゆるバ クテリア株を含む。タンパク質が酵母またはバクテリアで作られる場合、機能的 タンパク質を得るために、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によ り、その中で生産されたタンパク質を修飾することが必要である可能性がある。 既知の化学的または酵素的方法を用いてそのような共有結合連結を成し遂げるこ とができる。 また、１つまたはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に本発明の 単離されたポリヌクレオチドを機能的に連結し、そして昆虫発現系を用いること によりタンパク質を生産してもよい。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料 及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ ｏｒｎｉａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．からキットの形態（ＭａｘＢａｃ７キット）で市販さ れており、そのような方法は引用することにより本明細書に組み込まれるＳｕｍ ｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７） 中に記述されたように当該技術分野において周知である。本明細書に用いられる 場合、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる昆虫細胞は「形質転換 」されている。 組み換えタンパク質を発現させるために適当な培養条件下で形質転換された宿 主細胞を培養することにより本発明のタンパク質を製造することができる。次に 、ゲル濾過及びイオン交換クロマトグラフィーのような既知の精製方法を用いて そのような培養物から（すなわち、培養培地または細胞抽出物から）得られた発 現タンパク質を精製することができ る。また、タンパク質の精製はタンパク質に結合する薬剤を含有するアフィニテ ィーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール７またはシ バクロムブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ）３ＧＡセファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ）７のようなアフィニティー樹脂での１つもしくはそれ以上のカラム 工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルのような樹 脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つもしくはそれ以上の工 程；または免疫アフィニティークロマトグラフィーを含んでもよい。 あるいはまた、精製を容易にする形態で本発明のタンパク質を発現させてもよ い。例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トラン スフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のもののような融合タ ンパク質としてそれを発現させることができる。そのような融合タンパク質の発 現及び精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａ ｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ Ｊ）及びＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。また、タンパク質にエピト ープをつけ、続いて、そのようなエピトープに対する特異的抗体を用いることに より精製することもできる。一つのそのようなエピトープ（「フラッグ（Ｆｌａ ｇ）」）はＫｏｄａｋ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）から市販されている。 最後に、タンパク質をさらに精製するために疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質、例え ば、メチルまたは他の脂肪族側基を有するシリカゲルを用いる１つまたはそれ以 上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いることがで きる。また、実質的に均質な単離された組み 換えタンパク質を与えるために前記の精製工程のいくつかまたは全てを様々な組 み合わせで用いることもできる。従って、タンパク質は他の哺乳類タンパク質を 実質的に含まず、本発明により「単離されたタンパク質」と定義される。 また、本発明のタンパク質をトランスジェニック動物の生成物として、例えば 、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞を 特徴とするトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの成分と して発現させることもできる。 また、タンパク質を既知の通常の化学合成により製造してもよい。合成手段に より本発明のタンパク質を構築するための方法は当業者に知られている。合成的 に構築されたタンパク質配列は、タンパク質と共有する一次、二次もしくは三次 構造及び／または配座特性のために、タンパク質活性を初めとする生物学的特性 をそれらと同様に保有することができる。従って、治療用化合物のスクリーニン グ及び抗体の開発のための免疫学的工程において天然の精製されたタンパク質の 生物学的に活性のあるまたは免疫学的代用品としてそれらを用いることができる 。 また、本明細書に与えられるタンパク質は、精製されたタンパク質のものに類 似したアミノ酸配列を特徴とするタンパク質も含むが、それらに改変が自然に与 えられるかまたは故意に作製される。例えば、既知の技術を用いて当業者はペプ チドまたはＤＮＡ配列における改変を実施することができる。タンパク質配列中 の目的の改変はコーディング配列中の選択したアミノ酸残基の変更、置換、交換 、挿入または欠失を含むことができる。例えば、分子の配座を変えるために１個 またはそれ以上のシステイン残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸と交換する ことがで きる。そのような変更、置換、交換、挿入または欠失のための技術は当業者に周 知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照）。好ましくは、そ のような変更、置換、交換、挿入または欠失はタンパク質の適切な活性を保持す る。 本明細書の開示が与えられれば、当業者は、タンパク質活性を全部または一部 保持すると予想され、従って、スクリーニングまたは他の免疫学的方法論に有用 な可能性があるタンパク質の配列の他のフラグメント及び誘導体を容易に作製す ることもできる。そのような改変は本発明により包含されると考えられる。酵母２ハイブリッドアッセイ Ｙ２Ｈアッセイにより、ＢＢＰ１融合タンパク質とＢＡＰの結合が特異的であ ることが示された。ＢＡＰごＢＢＰ１の結合は、ＢＢＰ１活性がアルツハイマー 病の病因において特定の役割を有する可能性があることを示唆する。 基本的な局所整列検索手段（ＢＬＡＳＴ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０）を 用いてＢＢＰ１配列をジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）に比較した。ＢＢＰ１タ ンパク質及び利用できる発現配列標識の翻訳を整列させ、保存されたセグメント を検索し、ＭｏＳＴ（Ｔａｔｕｓｏｖ等、１９９４）タンパク質モチーフ検索ア ルゴリズムにより評価した。これらの分析により、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ ＰＣＲ）ファミリーに対する可能性のある進化的関係が示された。具体的には、 これらの分析から、ＢＢＰ１がＧタンパク質共役受容体のｔｍドメイン３及び４ に同等な２つの可能性のある膜貫通（ｔｍ）ドメインを含むことが示された。介 在する親水性ループは十分に特性化された３個のアミノ酸モチーフ、アス パルテート（Ｄ）またはグルタメート及びそれに続くアルギニン（Ｒ）及び芳香 族残基（ＹまたはＦ）（一般にＤＲＹ配列と呼ばれる）を含み、それはこの受容 体ファミリーのほとんど全てのメンバーにおいて保存され、そしてＧタンパク質 活性化のための分子引き金として働くことが示されている（Ａｃｈａｒｙａ及び Ｋａｒｎｉｋ、１９９６）。 Ｙ２Ｈアッセイからのデータ（図２−４を参照）は、ＢＢＰ１がＧタンパク質 共役受容体スーパーファミリーのメンバーと共有する機能モジュールをおそらく 含有する新規なタンパク質であることを示す。具体的には、ＢＢＰ１は２つの予 測されるｔｍドメイン間に重要なＤＲＦ配列（配列番号：２のアミノ酸１９９な いしアミノ酸２０１）を保持し、そしてＧタンパク質調節シグナリング経路に共 役する可能性を有すると思われる。 ＡＰＰはＧ_αOと機能的に結合することが示されており（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ 等、１９９３；Ｙａｍａｔｓｕｊｉ等、１９９６）、そしてＢＢＰ１は関係のあ るＧタンパク質共役受容体中のＧ_αタンパク質活性化配列であることが知られて いる構造モチーフを含有する。さらに、ＢＢＰ１ ｔｍドメインの予測される位 置及び方向に基づいた仮説から、ＢＡＰと相互作用するタンパク質の領域がＡＰ Ｐ中のＢＡＰと同じ位置に構造関係的に拘束されることが示唆される。 Ｇ_αタンパク質とＢＢＰ１細胞内領域の結合を評価するためにＹ２Ｈアッセイ 株を作製した。ＢＢＰ１の予測される細胞内配列を融合タンパク質として発現さ せ、３つのＧ_αタンパク質のＣ末端領域との相互作用に関してアッセイした。こ れらの実験に用いたタンパク質セグメントを以下の表２に挙げる。ＢＢＰ１細胞 内ループは３つ全てのＧ_αタンパク 質と相互作用し（図３）、ＢＢＰ１がＧタンパク質活性のモジュレーターとして 機能する可能性があるという前提を裏付けた。これらの様々なＹ２Ｈアッセイに より、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に共役した最低限で内在性膜タンパク質ＢＢＰ １及びＡＰＰからなる複数のタンパク質複合体の魅力的なモデルが示唆される。 表２．酵母２−ハイブリッドアッセイに用いたプラスミド ＢＢＰ１のさらなる分析をＹ２Ｈアッセイを用いて得た。ＢＢＰ１Δｔｍクロ ーン中に含まれるＢＢＰ１配列の２つの重複する部分を増幅し、Ｙ２Ｈベクター ｐＡＣＴ２中にクローン化した（発現プラスミドｐＥＫ２１６及びｐＥＫ２１９ 、表２並びに対応するタンパク質ＢＢＰ１ΔＮ及びＢＢＰ１ΔＣ（図４））。Δ Ｃ構築物は両方のｔｍドメインを欠き；ΔＮ構築物は１番目のｔｍドメインとそ の前の５２アミノ酸をコードした。これらの融合タンパク質をＢＡＰ融合タンパ ク質とアッセイし、より大きいＢＢＰ１Δｔｍタンパク質を発現する株のものに 反応を比較した。ＢＢＰ１ΔＣタンパク質は弱いＹ２Ｈ反応を誘導したが（ベク ターにＢＢＰ１ΔＣを比較、図４）、１番目のｔｍドメインと隣接するアミノ近 位配列を含有するＢＢＰ１ΔＮタンパク質はＢＢＰ１Δｔｍで見 られたものよりほんのわずかに弱い反応を生じた（図４）。これらの結果は、Ｂ ＡＰとの結合のための主要な決定基が野生型ＡＰＰタンパク質中のＢＡＰに構造 関係に類似していると予測されるＢＢＰ１領域内に含まれることを示唆する。 齧歯類ＢＡＰに比較した場合にヒトＢＡＰへのＢＢＰ１結合の選択性及び特異 性を示すためにＹ２Ｈ系を利用した。ヒト配列に比較して齧歯類ＢＡＰ配列には ３個のアミノ酸置換がある（Ｇ５Ｒ、Ｆ１０Ｙ及びＲ１３Ｈ）。実施例６におい て記述したＹ２Ｈアッセイにおいて、齧歯類ペプチドは減少した神経毒性及びヒ ト脳ホモジェネートへの結合の欠如を示す（Ｍａｇｇｉｏ等、１９９２）。それ 故、Ｙ２Ｈ系においてＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰの結合を評価することは興味深か った。ＰＣＲによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によりｐＥＫ１６２中 のヒトＢＡＰの配列を齧歯類ペプチドをコードするように変えた。得られたプラ スミドｐＥＫ２４０は、齧歯類ペプチド配列のアミノ酸置換を生じる３つのコド ンを除いて、この報告を通して利用されるヒトＢＡＰ融合タンパク質発現プラス ミドと同一である。ＢＢＰ１融合タンパク質と齧歯類及びヒトＢＡＰ融合タンパ ク質の相互作用をＹ２Ｈバイオアッセイにより比較した。ＢＢＰ１と齧歯類ＢＡ Ｐを発現する株は増殖反応を生じることができなかった（図７）。この結果はＢ ＢＰ１がＢＡＰの神経毒性作用の特異的メディエーターとして働く可能性がある という前提を裏付け、そして齧歯類ＢＡＰの減少した神経毒性を説明するための 機構を与える。重要なことに、３個のアミノ酸の置換は結合を完全に妨げるため に十分であったので、これらのデータはＹ２ＨアッセイにおけるＢＢＰ１／ＢＡ Ｐ相互作用の高度の特異性を示すためにも役立つ。単離されたＢＢＰ１ポリペプチド 本発明のタンパク質及びタンパク質フラグメントは、開示されたタンパク質の 長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少 なくとも７５％）であるアミノ酸配列の長さを有し且つ開示されたタンパク質と 少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最 も好ましくは少なくとも９０％または９５％の同一性）を有するタンパク質を含 み、その場合、配列同一性は配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性 を最大にするように整列した場合にタンパク質のアミノ酸配列を比較することに より決定される。また、本発明に含まれるものは、開示されたタンパク質のいず れかのそのようないずれかのセグメントと少なくとも７５％の配列同一性（より 好ましくは少なくとも約８５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９５％の同 一性）を共有する好ましくは８個またはそれ以上（より好ましくは２０個または それ以上、最も好ましくは３０個またはそれ以上）の連続したアミノ酸を含んで なるセグメントを含むタンパク質及びタンパク質フラグメントである。 また、開示されたポリヌクレオチド及びタンパク質の種相同物も本発明により 提供される。本明細書に用いられる場合、種相同物は既定のタンパク質またはポ リヌクレオチドのものと異なる種の起源を有するが、既定のタンパク質またはポ リペプチドに著しい配列類似性を有するタンパク質またはポリヌクレオチドであ る。好ましくはポリヌクレオチド種相同物は既定のポリヌクレオチドと少なくと も６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好まし くは少なくとも９０％の同一性）を有し、タンパク質種相同物は既定のタンパク 質と少な くとも３０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも４５％の同一性；最も好 ましくは少なくとも６０％の同一性）を有し、その場合、配列同一性は配列のギ ャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にするように整列した場合にポ リヌクレオチドのヌクレオチド配列またはタンパク質のアミノ酸配列を比較する ことにより決定される。本明細書に与えられる配列から適当なプローブまたはプ ライマーを作製し、適切な種からの適当な核酸源をスクリーニングすることによ り種相同物を単離し、同定することができる。好ましくは、種相同物は哺乳類種 から単離されたものである。最も好ましくは、種相同物は、例えば、パン・トロ グロディテス（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、ゴリラ・ゴリラ（Ｇｏｒｉ ｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ ）、ポンゴ・ピグミウス（Ｐｏｎｇｏｐｙｇｍａｅｕｓ ）、ヒロバテス・コンカラー（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ ｃｏｎｃｏｌｏｒ）、マカ カ．ムラータ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、パピオ・パピオ（Ｐａｐｉｏ ｐａｐｉｏ ）、パピオ・ハマドリアス（Ｐａｐｉｏ ｈａｍａｄｒｙａｓ）、 セルコピテカス・エチオプス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ ）、セブス・カプシナス（Ｃｅｂｕｓ ｃａｐｕｃｉｎｕｓ）、アオタス・トリ ビルガタス（Ａｏｔｕｓ ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）、サングイナス・オイディ プス（Ｓａｎｇｕｉｎｕｓ ｏｅｄｉｐｕｓ）、ミクロセバス・ムリナス（Ｍｉ ｃｒｏｃｅｂｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ ）、ムス・ムスクラス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕ ｌｕｓ ）、ラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ク リセツラス・グリセウス（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、フェリス ・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）、ムステラ・ビソン（Ｍｕｓｔｅｌａ ｖｉｓｏｎ ）、カニス・ファ ミリァリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、オリクトラガス・クニクラ ス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、ボス・タウラス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ）、オビス・アリエス（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）、サス・スクロ ファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）及びエクウス・カバラス（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａ ｌｌｕｓ ）のようなある哺乳類種から単離されたものであり、それらには遺伝子 地図が作製されており、ある種の遺伝子のゲノム構成と別の種の関係のある遺伝 子のゲノム構成の間のシンテニィ関係を同定できる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ及びｓｅｕ ａｎｅｚ、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：３２３−３５１；Ｏ ’Ｂｒｉｅｎ等、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：１０３−１ １２；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等、１９９５、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２５：６８２−６ ９０；Ｌｙｏｎｓ等、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：４７ −５６；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等、１９９７、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３（１０）：３９３−３９９；Ｃａｒｖｅｒ及びＳｔｕｂｂｓ、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：１１２３−１１３７；それらの全ては引 用することにより本明細書に取り込まれる）。 また、本発明は開示されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子変 異体；すなわち、開示されたポリヌクレオチドによりコードされるものに同一で あるかまたは著しく類似した配列を有するタンパク質を同様にコードする単離さ れたポリヌクレオチドの天然に存在する代替形も包含する。好ましくは、対立遺 伝子変異体は既定のポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好 ましくは少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％の同一性 ）を有し、その場 合、配列同一性は配列のギャップを最小限にしながら重複及び同一性を最大にす るように整列した場合にポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を比較することに より決定される。本明細書に与えられた配列から適当なプローブまたはプライマ ーを作製し、適切な種の個体からの適当な核酸源をスクリーニングすることによ り対立遺伝子変異体を単離し、同定することができる。 また、本発明は本明細書に開示されたポリヌクレオチドのものに相補的な配列 を有するポリヌクレオチドも含む。 用途 本開示に基づいて当業者に慣例の様々な用途に本発明のＢＢＰ１タンパク質を 用いることができる。具体的には、クローン化されたポリペプチドに対して特異 的な抗体を作製するための免疫原としてＢＢＰを用いることができる。ＢＢＰ１ タンパク質に対する抗体の製造のために当該技術分野で知られている様々な方法 を用いることができる。そのような抗体はポリクローナル、モノクローナル、キ メラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリーを含むがそれらに 限定されない。抗体の製造のために、ウサギ、マウス及びラットを初めとするが それらに限定されない様々な宿主動物にＢＢＰを注入する。一つの態様として、 特異的免疫活性能力があるポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを免 疫原性担体に結合させる。また、宿主動物の免疫学的応答を上げるためにアジュ バントをポリペプチドと共に投与してもよい。用いることができるアジュバント の例は完全及び不完全フロイント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、 リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、 ペプチド、油乳濁液、スカシ ガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン及びジニトロフェノールを 含むがそれらに限定されない。 培養における連続細胞系による抗体の生産を規定するあらゆる技術を用いて本 発明のＢＢＰ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を調製することができる 。そのような技術は当業者に周知であり、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（ Ｎａｔｕｒｅ １９７５、２５６、４２０２−４９７）により最初に記述された ハイブリドーマ技術、Ｋｏｓｂｏｒ等（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １ ９８３、４、７２）により記述されたヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術並びにＣｏ ｌｅ等（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ７７−９６）によ り記述されたＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含むがそれらに限定されない。 次に、生物学的サンプルにおける類似したポリペプチドの存在及び細胞以下分 布に関してスクリーニングするために本発明のポリペプチドに免疫反応する抗体 を用いることができる。さらに、本発明のＢＢＰ１タンパク質に特異的なモノク ローナル抗体を治療法として用いることができる。 また、請求したペプチドと免疫反応する抗体の存在を測定する固相アッセイに 有用な抗原としてもＢＢＰ１タンパク質を用いることができる。生物学的サンプ ルにおけるクローン１４に関連した抗原の免疫学的量を測定するために固相競合 アッセイを用いることができる。この測定は本発明のポリペプチドの細胞機能ま たは複数の機能の完全な特性化を容易にすることに有用なだけでなく、これらの タンパク質の異常な量を有す る患者を同定するためにも用いることができる。 また、ＡＤのマーカーとしてのＢＡＰ及びＢＡＰ集合体の検出のためのアフィ ニティークロマトグラフィーにおける捕捉試薬としても本発明のＢＢＰ１タンパ ク質を用いることができる。 さらに、これらのＢＢＰ１はＢＡＰとクローン化されたタンパク質の相互作用 に影響を与える候補分子を同定するためのアッセイにおける試薬として有用であ る。この結合を特異的に妨げる化合物はＡＤの処置または予防に有用である可能 性がある。 また、これらのＢＢＰ１は、ＢＡＰまたはＢＡＰ集合体へのこれらのβ−アミ ロイドペプチド結合タンパク質の結合の化合物による改変を測定する非細胞イン ビトロ結合アッセイにも有用である。非細胞アッセイは生細胞を用いるアッセイ より費用効果的であり、実施するのが容易であるのでこれらのアッセイはかなり 多数の化合物をスクリーニングすることに非常に有用である。本発明のポリペプ チドの開示により、これらのアッセイの開発は当業者にとって慣例的である。そ のようなアッセイでは、ＢＢＰ１またはＢＡＰのいずれかが標識される。そのよ うな標識は放射性標識、抗体及び蛍光または紫外線標識を含むがそれらに限定さ れない。まず、ＢＡＰまたはＢＡＰ集合体へのＢＢＰ１の結合をあらゆる試験化 合物なしで測定する。次に、試験される化合物をアッセイに添加してそのような 化合物がこの相互作用を改変するかどうかを測定する。 実施例 本発明は以下の実施例によりさらに説明される。それらの実施例は特定の態様 に関して本発明を具体的に示すためにのみ与えられる。これらの例示は、本発明 のある特定の態様を具体的に示すが、限定を表さず、 または本発明の範囲を制限しない。 酵母２−ハイブリッド系（以下、「Ｙ２Ｈ」）：Ｙ２Ｈ発現プラスミドを（Ｗ ａｄｅＨａｒｐｅｒ等、１９９３中に記述された）ベクターｐＡＳ２及びｐＡＣ Ｔ２並びに（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＹｏｕｎｇ、１９９５中に記述された） ｐＣＵＰにおいて構築した。酵母株ＣＹ７７０（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＹｏ ｕｎｇ、１９９５）を全ての２Ｈアッセイの宿主として用いた。 遺伝子スクリーニング：ＢＡＰをコードする配列を増幅及び改変するためにポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いた。鋳型として、改変されたヒトＡＰＰ クローンのｐＣＬＬ６２１（Ｊａｃｏｂｓｅｎ等、１９９４）を用いてＢＡＰを 増幅するためにオリゴヌクレオチド＃１（５’−ＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ Ｇ ＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ Ｃ）及び＃３（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣ ＴＴＡ ＣＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＧＣ）を用いた。増幅されたＤＮＡは以 下の改変を含むＡＰＰ前駆体タンパク質の（ＢＡＰ₄₂をコードする）コドン３８ ９ないし４３０からなる。センス鎖プライマーはｐＡＳ２中のＮｃｏＩ部位と同 じ翻訳読み枠で５’ＮｃｏＩ制限部位を付加した。アンチセンス鎖プライマーは 終止コドン並びにクローニングのためのＨｉｎｄIII及びＳａｌＩ部位を付加し た。この増幅からの産物をＴＡクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒ ｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に連結し、続いて、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩでの 消化により取り出した。このフラグメントをＮｃｏＩとＳａｌＩで切断したｐＡ Ｓ２中にクローン化した。得られたプラスミド、ｐＥＫ１６２をＧＡＬ４／ＢＡ Ｐ連結点を通ってＤＮＡシークエンシングにより確かめた。ｐＥＫ１６２から発 現されるタン パク質（ＢＡＰ^BD；図１）はカルボキシ末端にＢＡＰの４２アミノ酸を付加した （機能活性化配列を欠いている）酵母転写活性化タンパク質Ｇａｌ４のＤＮＡ結 合ドメインを含有する融合タンパク質を含んでなった。未改変のＢＡＰ₄₂の発現 をもたらす発現プラスミドを開発した。上記のようなＰＣＲにおいてオリゴ＃２ （５’−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＧＡ Ｃ ）をオリゴ＃３と対にした。この増幅の産物は５’ＨｉｎｄIII部位及びサッカ ロミセス・セレビシエにおける発現のために最適化された翻訳開始シグナルを含 む。 再び、ＤＮＡフラグメントをＴＡ系にクローン化した。次に、それをＨｉｎｄII I フラグメント上で単離し、ＨｉｎｄIIIで切断したｐＣＵＰ中にクローン化した 。得られたプラスミド、ｐＥＫ１４９（ＢＡＰ；図１）中のＢＡＰ遺伝子の方向 をＤＮＡシークエンシングにより確かめた。ＢＡＰ発現プラスミドｐＥＫ１４９ （選択マーカーとしてＵＲＡ３を用いた）及びｐＥＫ１６２（選択マーカーとし てＴＲＰ１を用いた）を酵母宿主ＣＹ７７０（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ及びＹｏｕ ｎｇ、１９９５）中に形質転換した。両方のプラスミドを含有する株をＣＹ２０ ９１と称した。酵母２−ハイブリッド発現ベクターｐＡＣＴ２（選択マーカーと してＬＥＵ２を用いた）中にクローン化されたヒト胎児脳から単離されたｃＤＮ ＡフラグメントからなるプラスミドライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ライ ブラリー由来のタンパク質を図１において未知^ADとして示す。このライブラリー を用いてＣＹ２０９１を形質転換した。３つ全てのプラスミドを含有する細胞を 選択するためにウラシル、トリプトファン及びロイシンを欠いている合成完全（ ＳＣ）酵母増殖培地上 にサンプルを広げた。また、培地はヒスチジンも欠き、そして酵母ＨＩＳ３遺伝 子の産物のインヒビターの３−アミノートリアゾールを２５ｍＭの濃度で含有し た。ＨＩＳ３レポーター遺伝子の低レベルの構成的発現からの活性を減らすため に３−アミノ−トリアゾールを利用した。プレートを３０℃で１２日間インキュ ベートした。増加したヒスチジン原栄養を示す２４個のコロニーを単離した。形 質転換コントロールにより、スクリーニングが１０⁶の別個のクローンをアッセ イしたことが示された。陽性クローンの中身を素早く決定するためにＰＣＲ法を 利用した。標準法により各陽性株から全ＤＮＡを単離した。ライブラリーベクタ ーｐＡＣＴ２のクローニング領域に隣接するオリゴ＃４（５’−ＴＴＴＡＡＴＡ ＣＣＡ ＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡ Ｔ）と＃５（５’−ＴＴＴＴＣＡＧＴＡＴ ＣＴ ＡＣＧＡＴＴＣＡ Ｔ）を用いるＰＣＲの鋳型としてこの材料を用いた。ＤＮＡ フラグメントをＴＡ系に連結し、ＤＮＡシークエンシングにより調べた。（上記 のような）クローン＃１４中に含まれるライブラリープラスミドをエシェリキア ・コリ中に往復させることにより単離した。ヒトｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配 列を決定し、最初のＰＣＲ産物の配列を確認した。 バイオアッセイ：ロイシン及びトリプトファンを欠いている２ｍｌのＳＣ培地 中で株を約７ｘ１０⁷細胞／ｍｌの密度まで一晩増殖させた。細胞を数え、滅菌 水中で１０⁴から１０⁸細胞／ｍｌまで１０倍連続希釈物を作製した。ロイシン、 トリプトファン及びヒスチジンを欠き、２５ｍＭ ３−アミノ−トリアゾールを 含有するＳＣ培地上にこれらのサンプルを５μｌアリコートで置いた。プレート を３０℃で２ないし３日間インキュベートした。Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン 融合タンパク質と 関係のない転写活性化ドメイン融合タンパク質を発現する（または単に挿入され た配列のないｐＡＣＴベクターを含有する）コントロール株に比較して増加した 原栄養増殖により陽性のタンパク質／タンパク質相互作用を同定した。これらの コントロール株を上記の図においてラベル「ベクター」として示した。このアッ セイ法は非常に再現性があり、標的タンパク質間の特異的相互作用によりもたら される増殖の微妙な誘導の検出を与えた。ＢＢＰ１Δｔｍを発現するようにタン パク質産物を短くするためのＰＣＲ鋳型として、ｐＥＫ１９６と称し、ＡＴＣＣ ９８３９９として寄託した元のＢＢＰ１クローン（本明細書においてクローン １４と呼ばれる）を用いた。センスプライマー＃６（５’−ＴＴＴＡＡＴＡＣＣ Ａ ＣＴＡＣＡＡＴＧＧＡ Ｔ）はｐＡＣＴ２中のＧＡＬ４配列にアニーリングし た。アンチセンスプライマー＃７（５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＣＡＡ ＣＣ）はＢＢＰ１のＤＲＦモチーフをコードする 配列のすぐ３’に３’終止コドン及びＸｈｏＩ部位を含んだ。ＰＣＲ産物をＴＡ クローニングベクターに連結し、続いて、ＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ｐＡ ＣＴ２中にクローン化した。このプラスミド（ｐＥＫ１９８）から発現されるハ イブリッド産物をＢＢＰ１Δｔｍで示した。同様に、ＢＢＰ１ΔＮ発現プラスミ ドｐＥＫ２１６を作製するためにプライマー＃７をプライマー＃８（５’−ＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＡＴ ＧＡＣ ＧＣＴ ＡＣＧ）と対にした。再 び、ＰＣＲ産物をＴＡ系に連結し、ＢＢＰ１フラグメント（コドン１２３−２０ ２）を含む得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化し、最後に同じ酵 素で消化したｐＡＣＴ２に連結した。ｐＡＣＴ２特異的オリゴ＃６をアンチセン スオリゴ＃９（５’−ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＧＡ ＴＡＴ ＧＧＧ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＣ）と共に用い ることによりＢＢＰ１ΔＣを作製した。ＴＡクローニング、ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ Ｉ フラグメントの単離及びｐＡＣＴ２中へのクローニング後に、得られたプラス ミド、ｐＥＫ２１９は残基６８から１７５までのＢＢＰ１を発現した。オリゴヌ クレオチド＃１０（５’−ＣＣＴＴＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＴＧ ＴＣＴ）と＃１１（５’−ＡＡＣＡＣＴＣＧＡＧ ＴＣＡ ＡＡＡ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＡＡ Ｃ）を用いてＢＢＰ１細胞内ループをコ ードする配列を増幅した。ＢＢＰ１コドン１８５ないし２１７を含有するこの産 物をＮｃｏＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ＮｃｏＩ＋ＳａｌＩで切断したｐＡＳ２中に クローン化してｐＯＺ３３９を作製した。全てのＧ_αタンパク質発現プラスミド の構築はｐＡＣＴ２における融合の部位として各ラットｃＤＮＡ配列（Ｋａｎｇ 等、１９９０）の中心近くのＢａｍＨＩ部位を利用した。センスプライマーはＢ ａｍＨＩ 部位の５’の配列にアニーリングし；アンチセンスプライマーは終止コ ドンの３’の配列にアニーリングし、ＳａｌＩ制限部位を含んだ。プライマーは ：Ｇ_αo、センス（＃１７）＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣ ＴＧＣＴＴＣＧＡＧ Ｇ ＡＴ、アンチセンス（＃１８）＝５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＴ ＧＣＴＡＴＡ Ｃ ＡＧＧ ＡＣＡＡＧＡＧＧ；Ｇ_as、センス（＃１９）＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣ ＣＡＧ ＴＧＣＴＴＣＡＡＴＧ ＡＴ、アンチセンス（＃２０）＝５’−ＧＴＣＧ ＡＣＴＡＡＡ ＴＴＴＧＧＧＣＧＴＴ ＣＣＣＴＴＣＴＴ；Ｇ_ai2、センス（＃２ １）＝５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣ ＴＧＣＴＴＴＧＡＧＧ ＧＴ、アンチセンス （＃２２）＝５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＣ ＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣ ＣＡＴＣＴＴ ＣＣであった。ＰＣＲ産物を ＴＡベクター中にクローン化した。Ｇ_α配列をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメン トとして単離し、ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩで消化したｐＡＣＴ２中にクローン化し た。プラスミド名称は表２を参照。最後に、ヒトＢＡＰの齧歯類配列への転化の ためにオリゴヌクレオチド＃２３を合成した。このプライマーは配列５’−ＡＴ ＡＴＧＧＣＣＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＡＣ ＴＣ Ａ ＧＧＡ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＧＴを有する。トリプレットはＢＡＰの最 初の１３コドンを表し；齧歯類配列を生じるように変えた３個のヌクレオチドに 下線を引く。鋳型としてｐＥＫ１６２を用いるＰＣＲにおいてクローニング部位 の３’であるＹ２Ｈベクターの領域にアニーリングする＃２４（５’−ＴＧＡＣ ＣＴＡＣＡＧ ＧＡＡＡＧＡＧＴＴＡ）とオリゴ＃２３を対にした。産物をＮｃ ｏＩ ＋ＳａｌＩで切断し、ｐＡＳ２に連結してｐＥＫ２４０を作製した。齧歯類 ＢＡＰをコードするセグメントのヌクレオチド配列を確認した。 ゲノムクローニング；ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）：ヌクレオチド１８ ７−６００（図２）に相当するランダムにプライミングされたＥｃｏＲＩ／Ｃｌ ａＩ フラグメントプローブで、^a２．０ｘ１０⁶ｐｆｕに相当するヒトゲノムラム ダライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。製造業者（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）のプロトコルに従って^T7ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅｒキットを用 いてプローブを［³²Ｐ］−ＣＴＰで標識した。高ストリンジェンシー下：５０％ ホルムアミド、０．１２Ｍ ＮａＨＰＯ₄、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、７％ＳＤＳ及 び２５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ中４０℃でフィルターをハイ ブリダイズさせ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．１ｘ ＳＳＣ中６５℃で洗浄し、Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳフィルムに露出させた 。プローブにハイブリダイズするラムダファージクローンを連続平板培養及び再 スクリーニングによりプラーク精製した。１０個の陽性クローンを精製し、元の ｃＤＮＡクローンから既知の最も５’の配列に対する４５ｎｔオリゴヌクレオチ ドプローブへのハイブリダイゼーションによるさらなる分析に供した。このオリ ゴヌクレオチドはヌクレオチド１５７−２０１（図２）の逆相補物であり、配列 ５’−ＣＣＡＧＧＣ ＧＧＣＣ ＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧ ＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣ Ｔ ＴＴＣＴＣＧＣＣＡ ＣＴＴＣＣを有する。標準的な分子生物学技術によりラム ダファージＤＮＡを単離し、ＡＢＩ３７３シーケンサーで蛍光ジデオキシサイク ルシークエンシングを用いた直接シークエンシングに供した。 ＲＡＣＥ：第一鎖ＤＮＡ合成をｒＴｔｈ熱安定性ポリメラーゼ系（Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施した。以下の試薬：ＩＸ逆転写バッファー、１ｍ Ｍ ＭｎＣｌ₂、１．６ｍＭ ｄＮＴＰミックス、２．５Ｕ ｒＴｔｈポリメラーゼ 、１００ｎｇヒト海馬ポリＡ⁺ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１０ｍＭオリゴヌ クレオチド（ｎｔ４２９−４５２、図２；５’−ＧＴＴＡＴＧＴＴＧＧ ＧＴＧ ＣＴＧＧＡＡＡ ＡＣＡＧ）を１０μｌ容量を与えるように１．５ｍＬチューブ 中で合わせた。反応を７０℃で１５分間インキュベートし、すぐに氷上に置いた 。第二鎖ｃＤＮＡ生成のためにＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏ ｎｔｅｃｈ）を用いた。第一鎖反応からの全１０μｌを以下の試薬：１Ｘ第二鎖 バッファー、０．８ｍＭ ｄＮＴＰミックス、４Ｘ第二鎖カクテル（エシェリキ ア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、エシェリキア・コリＤＮＡリガーゼ、エシェリ キア・コリＲＮａｓｅＨ）及び８０μｌの容 量までのｄＨ₂Ｏと合わせた。チューブを１６℃で１．５時間インキュベートし 、その後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ）を添加し、１６℃でさらに４５ 分間インキュベートした。反応を停止するために、４μｌの２０Ｘ ＥＤＴＡ／ グリコーゲン（０．２Ｍ ＥＤＴＡ／２ｍｇ／ｍｌグリコーゲン）を反応混合物 に添加し、続いて、酵素及び他の不純物を除くためにフェノール／クロロホルム ／イソアミルアルコールで抽出した。０．１Ｘ容量の３Ｍ酢酸Ｎａ ｐＨ５．２ 及び２．５Ｘ容量の試薬等級ＥｔＯＨを添加し、−７０℃に置くことによりＤＮ Ａを沈殿させた。ＤＮＡを７０％ＥｔＯＨで１回洗浄し、乾燥させ、１０μｌの ｄＨ₂Ｏ中に再懸濁した。以下のにようにＣｌｏｎｔｅｃｈプロトコルに従って 次のＲＡＣＥ ＰＣＲ反応に用いるためにＤＮＡの半分をＭａｒａｔｈｏｎアダ プターライゲーションに用いた：５μｌのｃＤＮＡを２μｌ（１０ｍＭ）Ｍａｒ ａｔｈｏｎ（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣ ＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ ＧＣＴＣＧＡ ＧＣＧＧ ＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣ ＡＧＧＴ）、１Ｘ ＤＮＡライゲーションバッ ファー及び１μｌ（１Ｕ）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼに添加した。反応混合物を１６ ℃で一晩インキュべートした。混合物を最初のＲＡＣＥ反応のために１：５０希 釈し、以下のもの：４０ｐｌ ｄＨ₂Ｏ、１μｌ １０Ｘ Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１μｌ（１０ｍＭ）ＡＰ１プライマー（５ ’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＣ）、１μｌ（ １０ｍＭ）ＢＢＰ１特異的プライマー（ｎｔｓ．１８７−２０９に相当する、図 ２；５’−ＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡ ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣ ＡＴ）、５μｌ １ ０Ｘ Ｋｌｅｎｔａｑポリメラーゼバッファー、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰミッ クス、１μｌの上記の反応 からの希釈したｃＤＮＡと共に０．２ｍＬ ＰＣＲチューブ中で合わせた。Ｐｅ ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００サーモサイク ラーを用いて以下のサイクリング条件：９４℃で１分間の変性サイクル、続いて 、９４℃で３０秒、７２℃で３分を５サイクル、９４℃で３０秒、７０℃で３分 を５サイクル、続いて、９４℃で３０秒、６８℃で３分を２５サイクル、７２℃ で７分の最後の伸長を実施した。これに以下のようなネスティッド（ｎｅｓｔｅ ｄ）ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を続けた：４０μｌ ｄＨ₂Ｏ、１μｌ（１Ｕ）１０Ｘ ＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ） 、１μｌ（１０ｍＭ）ＡＰ２プライマー（５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＧ ＣＴＣＧＡＧＣ ＧＧＣ）、１μｌ（１０ｍＭ）ＢＢＰ１特異的プライマー（ｎ ｔｓ．１７２−１９４に相当する、図２；５’−ＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴ ＴＧＧ ＡＧＡＣＣＧＡ ＣＡＣ）、５μｌ １０Ｘ Ａｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼバッ ファー、１μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１μｌの一次ＲＡＣＥ産物。ＰＣ Ｒサイクリング条件は９４℃で９分の初期変性サイクル、９４℃で３０秒、６８ ℃で３０秒、７２℃で２分を２５サイクル、続いて７分間の７２℃伸長であった 。ＰＣＲ産物を１Ｘ ＴＢＥバッファー中で１％アガロースゲルで泳動した。得 られた３５０塩基対の産物をゲル精製し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ）を用いて直接クローン化した。ライゲーション混合物をＯｎｅＳｈ ｏｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ −アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で平板培養した。ミニプレ ップＤＮＡを得、ＡＢＩ ３７３シーケンサーで蛍光ジデオキシサイクルシーク エンシングにより調べた。 ノーザン分析． ヒトの複数の組織及び複数の脳組織のｍＲＮＡノーザンブロ ットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手した。元の融合 連結点からポリ−Ａ領域までに及ぶＢＢＰ１配列をｐＥＫ１９６から得られたＴ ＡクローンからＥｃｏＲＩフラグメント上で単離した。β−アクチンＤＮＡは製 造業者により供給された。³²Ｐ−ｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ ｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を取り込むためにランダムプライミング法を 用いてこれらのＤＮＡから放射性標識されたプローブを生成した。ハイブリダイ ゼーションをＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ溶液中で６８℃で製造業者（Ｃｌｏｎｔｅ ｃｈ）の説明書に従って実施した。ブロットを２ｘＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０．１ ５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）、０．０５％Ｓ ＤＳ中で室温で洗浄し、続いて、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で５０℃ で２回洗浄した。Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘフィルムへの露出によりハイブリダ イゼーションシグナルを視覚化した。 インサイチューハイブリダイゼーション． 全長ヒトＢＢＰ ｃＤＮＡを含有 するプラスミドクローンを用いてＰＣＲによりリボプローブ合成のためのＤＮＡ 鋳型を調製した。ｃＤＮＡの３’ＵＴＲを標的とする単一リボプローブを用いた 。プローブ配列をジーンバンクデータベースに対して照合してそれらが全ての寄 託配列の中で適切な標的のみを認識することを確実にした。ＢＢＰ１のリボプロ ーブを生成するために、ＢＢＰ１ ｃＤＮＡの３’ＵＴＲからの２７５塩基対領 域を増幅し、さらに、Ｔ７（センス）及びＴ３（アンチセンス）ポリメラーゼの プロモーター配列を付加するように１組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計 した。これらのプライマーは以下の配列：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡ ＣＡＧＡＴＴＴＧＡＧ（フォワー ド）：５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣ ＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ ＣＡＡＧＴＧＧＣＡ Ａ ＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧ（リバース）を含んだ。ＰＣＲ産物を１．５％低融点 アガロースゲルでゲル精製し、産物を含有するバンドを切り出し、フェノール及 びフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを乾燥さ せ、１Ｘ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ Ｈ７．４）中に再懸濁した。ＡＰＰリボプローブ鋳型はＪａｃｏｂｓｅｎ等（１ ９９１）により記述されたように、タンパク質コーディング領域からのＤｄｅＩ −ＸｈｏＩフラグメントからなった。（³⁵Ｓ）−ＣＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ ｄ Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）及びリボプローブＧｅｍｉｎｉ^TM（ 商標）システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いた転写反応の ために５０ｎｇのＤＮＡ鋳型を用いた。 死後ヒト海馬の切片を用いたインサイチューハイブリダイゼーション組織化学 を以前に記述されたように実施した（Ｒｈｏｄｅｓ、１９９６）。Ｈａｃｋｅｒ −Ｂｒｉｇｈｔｓクリオスタットで１０μｍで切片を切断し、Ｖｅｃｔａｂｏｎ ｄ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で被覆した冷 却（−２０℃）スライド上に融解固定した。全ての溶液を０．１％（ｖ／ｖ）ジ エチルピロカーボネートで処理したｄＨ₂Ｏ中に調製し、オートクレーブした。 ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒド中に浸すことにより切片を 固定し、次に、連続して２ｘＳＳＣ、ｄＨ₂Ｏ及び０．１Ｍトリエタノールアミ ン、ｐＨ８．０中に浸した。次に、０．２５％（ｖ／ｖ）無水酢酸を含有する０ ．１Ｍトリエタノールアミン中に浸すことにより切片をアセチル化 し、０．２ｘＳＳＣ中で洗浄し、５０、７０及び９０％エタノール中で脱水し、 迅速に乾燥させる。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中に０．９Ｍ ＮａＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｘデンハルト、０．２５ｍｇ／ｍｌ一本鎖ニシン精子ＤＮ Ａ（ＧＩＢＣＯ／ＢＬＲ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）、５０％脱イオン ホルムアミド（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）を含有す る１ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液を各スライド上にピペットで移し、 スライドを給湿箱中で５０℃で３時間インキュベートした。次に、５０、７０及 び９０％エタノール中に浸すことにより切片を脱水し、風乾させた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中に０．９Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｘデンハ ルト、０．１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ一本鎖サケ精子ＤＮＡ 、デキストラン硫酸（１０％）、０．０８％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）及び５ ０％脱イオンホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液に標識したリ ボプローブを５０，０００ｃｐｍ／μｌの最終濃度で添加した。次に、プローブ を９５℃で変性させ（１分）、氷上に置き（５分）、切片上にピペットで移し、 給湿室中で５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。続いて、切片を１０ｍＭ ＤＴ Ｔを含有する２ｘＳＳＣ中で３７℃で１ｘ４５分、続いて、５０％ホルムアミド を含有する１ｘＳＳＣ中で３７℃で１ｘ３０分、そして２ｘＳＳＣ中で３７℃で １ｘ３０分洗浄した。ウシ膵臓ＲＮＡｓｅＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ；４０ｍｇ／ｍｌ）、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含有す る１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中に浸すことにより一本鎖及び非特異的にハイ ブリダイズしたリボプロ ーブを消化した。切片を２ｘＳＳＣ中で６０℃で１時間、続いて０．５％（ｗ／ ｖ）チオ硫酸ナトリウムを含有する０．１ｘＳＳＣ中で６０℃で２時間洗浄した 。次に、０．３Ｍ酢酸アンモニウムを含有する５０、７０、９０％エタノール中 で切片を脱水し、乾燥させた。スライドをＸ線カセット中に置き、Ｈｙｐｅｒｆ ｉｌｍｂ−Ｍａｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１４−３０日間対置した。いったん十 分な露出が得られると、核トラック感光乳剤（ＮＴＢ−２；Ｋｏｄａｋ）でスラ イドを覆い、４℃で７−２１日間露出させた。乳剤オートラジオグラムを現像し 、製造業者の説明書に従って固定し、下にある組織切片をヘマトキシリンで染色 した。非特異的標識化を評価するために、リボプローブＧｅｍｉｎｉ^TMシステム キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に供給される鋳型からコントロールプローブを作製 した。ＳｃａＩを用いてこのベクターを直鎖状にし、Ｔ３ポリメラーゼを用いて 転写した。得られた転写反応はベクター配列のみを含有する２つの産物、２５０ 塩基及び１，５２５塩基のリボプローブを生成する。このコントロールプローブ 混合物を上記のように標識し、５０，０００ｃｐｍ／μｌの最終濃度でハイブリ ダイゼーション溶液に添加した。コントロール切片では特異的ハイブリダイゼー ションは見られず、すなわち、これらの切片は神経解剖学的標識構造に従わない 非常に弱い均一なハイブリダイゼーションシグナルを与えた（データは示されな い）。 実施例１：ＢＡＰ結合タンパク質（ＢＢＰ１）のクローニング及び単離． おそらくＢＡＰのいっそう有毒な集合型であると考えられるＡＰＰの４２アミ ノ酸のタンパク質分解フラグメント、ヒトＢＡＰ₄₂と相互作用するタンパク質を 同定するために酵母２−ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）遺伝 子スクリーニングを開発した。ＢＡＰ₄₂を酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインに 融合して発現させ、また、遊離ペプチドとしても発現させた（図１）。この株を ヒト胎児脳ｃＤＮＡ Ｙ２Ｈライブラリーで形質転換した。約１０⁶の別個の形質 転換体から、上に特定したクローン１４と称した単一クローンが一貫したレポー ター遺伝子活性化を示し、Ｇａｌ４ドメインのものと連続した実質的なオープン リーディングフレームを含有した。ｃＤＮＡインサートはポリ−Ａ領域で終わる ９８４塩基対を含んでなった。この配列は細胞膜を横切るために十分な長さ及び 疎水性の２つの領域を有する２０１アミノ酸（配列番号：２；アミノ酸残基６８ ないし２６９）をコードした。 ライブラリー由来のプラスミドをクローン１４から単離し、Ｙ２Ｈアッセイ株 を再構築するために用いた。これらの株の試験から、反応は弱いが、ＢＡＰ融合 タンパク質がクローン１４タンパク質と特異的に相互作用することが示された。 膜貫通領域のような強い疎水性のタンパク質ドメインはＹ２Ｈ反応を妨げるので （Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ、未発表データ）、最も強い疎水性の領域を除くために クローン１４インサートを短くし（以下、ＢＢＰ１Δｔｍ）、ＢＡＰとの相互作 用に関して再試験した。ＢＢＰ１Δｔｍでかなりより強いＹ２Ｈ反応が見られ（ 図２）、削除した配列が可能性のある膜貫通（「ｔｍ」）アンカーをコードする という考えを裏付けた。クローン１４のヌクレオチド配列をジーンバンクに対し て検索し；このようにしてＢＡＰ結合タンパク質（ＢＢＰ１）は新規であるよう であると同定された。 実施例２：ＢＢＰ１の５’末端の単離及び確認． 上の実施例１に記述したクローン１４中に含まれるＢＢＰ１ ｃＤＮ Ａ配列は、可能性のある開始メチオニンコドンが存在しなかったのでタンパク質 コーディング領域の５’末端を欠いていた。標準的な逆転写酵素を利用する通常 の５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）の多数の試みは２７ヌクレオチドの 付加をもたらしただけであった。これらの配列はＡＴＧを含んだが、これが開始 コドンであるという確信を与えるための同じ翻訳読み枠の上流終止コドンを含ま なかった。ＢＢＰ１遺伝子の５’末端を単離するためにゲノムクローニング法を 開始した。 クローン１４の５’配列の４００塩基対（ｂｐｓ）に相当するランダムにプラ イミングされたプローブでのヒトゲノムラムダライブラリーのハイブリダイゼー ションは１０個の陽性クローンの同定をもたらした。クローン１４の最も上流の ＢＢＰ１配列に対する（そして、４００塩基対プローブの５’上流配列に相当す る）４５塩基オリゴヌクレオチドプローブを用いるこれらのクローンのさらなる 特性化により、１０個のうち６個のクローンが先に同定されたものの中に含まれ る末端の５’配列を含むことが示された。他の４個のラムダクローンは元の４０ ０塩基対のランダムにプライミングされたｃＤＮＡ由来のプローブ内に含まれる 他のエキソンに相当することが決定された（データは示されない）。ＢＢＰ１の ５’末端に相当する代表的なクローンからのラムダファージＤＮＡの直接サイク ルシークエンシングにより、クローン１４で既知の配列の上流でそれと重複する^a ５００ヌクレオチドが示された。おそらくこの付加配列はインーフレームの終 止コドンが前にあるＭＥＴに到達する前に先に特性化されたＭＥＴの上流に６２ 個のさらなるアミノ酸をコードする。最も遠い上流のＭＥＴから下流に２個のＭ ＥＴ残基が存在するが、標準的慣例により、インーフレームの終止コドンに続く 最初の５ ’ＭＥＴを含むようにヒトＢＢＰ１遺伝子のアミノ末端の配列を仮に特定した。 全コーディング領域及び推定されるタンパク質配列を配列番号：１及び２に示す 。このアミノ酸配列を含有する（ＢＢＰ１−ｆｌで示される）プラスミドを受託 番号９８６１７でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎに寄託した。 ５’コーディング配列はゲノムライブラリーから得られたので、この領域がイ ントロンを含む可能性が存在した。この可能性を２つの方法により調べた。第一 に、５’ＭＥＴの領域に対するフォワードプライマー及び元のクローン１４内の リバースプライマーを利用して脳ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから配列を増幅させ た。両方のサンプルから同じ大きさの産物が生成され、この領域内にイントロン がないことが示され、そして元の配列と上流配列の連結が確かめられた。第二に 、改変された５’ＲＡＣＥ実験において（上記の材料及び方法を参照）ゲノムク ローンから得られたものに同一であるｃＤＮＡ配列が単離された。これらの結果 から、（ゲノム及びｃＤＮＡ起源からの両方の）上流配列及びこの領域中にイン トロンがないことが確認された。 実施例３：ＢＢＰ１の特性化 基本的な局所整列検索手段（ＢＬＡＳＴ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０）を 用いてＢＢＰ１配列をジーンバンクに比較した。２つのセノラブディティス・エ レガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）及び１つのドロソ フィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゲ ノム配列並びに多数のヒト、マウス及び他の哺乳類の発現配列標識が同定された 。しかしながら、完全なｃＤＮＡ配列も遺伝子に起因すると考えられるいかなる 機能データも入手 できなかった。ＢＢＰ１タンパク質及び利用できる発現配列標識の翻訳を整列さ せ、保存されたセグメントを検索し、ＭｏＳＴ（Ｔａｔｕｓｏｖ等、１９９４） タンパク質モチーフ検索アルゴリズムにより評価した。これらの分析により、Ｇ タンパク質共役受容体ファミリーに対する可能性のある進化関係が示された。具 体的には、これらの分析から、ＢＢＰ１がＧタンパク質共役受容体のｔｍドメイ ン３及び４に同等な２つの可能性のある膜貫通（ｔｍ）ドメインを含むことが示 された。介在する親水性ループは十分に特性化された３個のアミノ酸モチーフ、 アスパルテート（Ｄ）またはグルタメート及びそれに続くアルギニン（Ｒ）及び 芳香族残基（ＹまたはＦ）（一般にＤＲＹ配列と呼ばれる）を含有し、それはこ の受容体ファミリーのほとんど全てのメンバーにおいて保存され、そしてＧタン パク質活性化のための分子引き金として働くことが示されている（Ａｃｈａｒｙ ａ及びＫａｒｎｉｋ、１９９６）。これらのデータは、ＢＢＰ１がＧタンパク質 共役受容体スーパーファミリーのメンバーと共有する機能モジュールをおそらく 含有する新規なタンパク質であることを示す。具体的には、ＢＢＰ１は２つの予 測されるｔｍドメイン間に重要なＤＲＦ配列を保持し、それ故、Ｇタンパク質調 節シグナリング経路に共役する可能性を有するようである。 ＢＢＰ１の構造分析により、それが関係のあるＧタンパク質共役受容体中のＧ_α タンパク質活性化配列であることが知られている構造モチーフを含有すること が示された。Ｇタンパク質共役受容体の様々なメンバーとＢＢＰ１の相互作用を 示すＹ２Ｈアッセイを図３に示す。構造予測に基づいて、ＢＢＰ１は両末端を管 腔区画に有して膜を２回横切るように表される。他の配置を完全に除外すること はできない。上に記述した 可能性のあるタンパク質相互作用をＹ２Ｈアッセイにおいて調べた。ＢＢＰ１Δ ｔｍクローン中に含まれるＢＢＰ１配列の２つの重複する部分を増幅し、Ｙ２Ｈ ベクターｐＡＣＴ２中にクローン化した（発現プラスミドｐＥＫ２１６及びｐＥ Ｋ２１９、表２並びに対応するタンパク質ＢＢＰ１ΔＮ及びＢＢＰ１ΔＣ、図４ ）。ΔＣ構築物は両方のｔｍドメインを欠いており；ΔＮ構築物は１番目のｔｍ ドメインとその前の５２アミノ酸をコードする。これらの融合タンパク質をＢＡ Ｐ融合タンパク質と共にアッセイし、より大きいＢＢＰ１Δｔｍタンパク質を発 現する株のものに反応を比較した。これらの結果は、ＢＡＰとの結合のための主 要な決定基が、野生型ＡＰＰタンパク質中のＢＡＰに構造関係的に類似している と予測されるＢＢＰ１領域内に含まれることを示唆する。 実施例４：ヒトＢＢＰ１発現の組織分布． ＢＢＰ１ ｍＲＮＡの発現を遺伝子及びその産物の活性を解明することにおけ る最初の段階として評価した。全ての組織で１．２５ｋｂの主要な転写産物が見 られた（図５Ａ）。心臓において高レベルの発現があった。全脳は中間レベルの 発現を示した。別の脳領域から得られたサンプルは全てＢＢＰ１発現を示した（ 図５Ｂ）。興味深いことに、大脳辺縁領域は比較的多量のＢＢＰ１ ｍＲＮＡを 含有した。これらはＢＡＰ集合及び関連する神経毒性が最初に起こる脳の領域で ある。ＢＢＰ１特異的リボプローブを用いて得られたインサイチューハイブリダ イゼーションオートラジオグラムの分析から、ヒト海馬及び嗅内皮質において、 ＢＢＰ１ ｍＲＮＡがグリア細胞とは対照的にニューロンにおける発現と一致し たパターンで中間ないし大きい細胞で発現されることが示された（図６）。さら に、ＢＢＰ１ｍＲＮＡは実質的に全ての海馬及び嗅内 ニューロンで発現され、すなわち、ハイブリダイゼーションシグナルの強さのい かなる実質的または薄片（ｌａｍｉｎａｒ）差もないようである。興味深いこと に、ＢＢＰ１発現のパターンはアミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰのｍＲＮＡに 対するリボプローブを用いて見られたパターンに顕著に類似した（図6)。要約す ると、ＢＢＰ１ ｍＲＮＡは調べられた全ての組織及び全ての脳領域において見 られた。また、ＢＢＰ１ ｍＲＮＡ発現のインサイチュー分析も海馬領域におけ る多量の発現を示した。 実施例５：ＢＢＰ１発現の細胞系分布 ＢＢＰ１発現を多数の細胞系においても調べ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅ ｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎからの発現 配列標識の収集、ｄｂＥＳＴからデータを抽出した。組み換えタンパク質発現の ために一般に利用される細胞系及び様々な癌細胞系におけるＢＢＰ１ ｍＲＮＡ 発現を定性的に評価するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法 を利用した。ＢＢＰ１はハムスターＣＨＯ及びヒトＨＥＫ２９３細胞において見 られた。シグナルは胚幹細胞系Ｎｔｅｒａ−２並びに神経芽細胞腫系ＩＭＲ３２ 及びＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいて見られた。ＢＢＰ１発現は以下の組織起源に相当す る癌細胞系において見られた：結腸（Ｃｘ−１、Ｃｏｌｏ２０５、ＭＩＰ１０１ 、ＳＷ９４８、ＣａＣｏ、ＳＷ６２０、ＬＳ１７４Ｔ）、卵巣（Ａ２７８０Ｓ、 Ａ２７８０ＤＤＰ）、胸（ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒ−３、Ｔ４７−ＤＮＢ７４７４ ）、肺（Ｌｘ−１、Ａ５４３９）、黒色腫（Ｌｏｘ、Ｓｋｍｅｌ３０）、白血病 （ＨＬ６０、ＣＥＭ）、前立腺（ＬＮＣＡＰ、Ｄｕ１４５、ＰＣ−３）。以下の 癌細胞系から単離されたｍＲ ＮＡを検出するノーザンブロットは全てのサンプルにおいてＢＢＰ１発現を示し た：前骨髄性白血病（ＨＬ−６０）、癌腫（ＨｅＬａ Ｓ３）、慢性骨髄性白血 病（Ｋ−５６２）、リンパ芽球性白血病（ＭＯＬＴ−４）、バーキットリンパ腫 （Ｒａｊｉ）、結腸腺癌（ＳＷ４８０）、肺癌（Ａ５４９）及び黒色腫（Ｇ３６ １）。 実施例６：齧歯類ＢＡＰに対してヒトＢＡＰとＢＢＰ１の選択的相互作用 ヒト配列に比較して齧歯類ＢＡＰ配列には３個のアミノ酸置換がある（Ｇ５Ｒ 、Ｆ１０Ｙ及びＲ１３Ｈ）。齧歯類ペプチドは減少した神経毒性及びヒト脳ホモ ジェネートへの結合の欠如を示す（Ｍａｇｇｉｏ等、１９９２）。それ故、Ｙ２ Ｈ系においてＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰの結合を評価することは興味深かった。上 記のＰＣＲによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によりｐＥＫ１６２中の ヒトＢＡＰの配列を齧歯類ペプチドをコードするように変えた。得られたプラス ミドｐＥＫ２４０は、齧歯類ペプチド配列のアミノ酸置換を生じる３つのコドン を除いて、本発明を通して利用されるヒトＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミド に同一であった。ＢＢＰ１融合タンパク質と鰯歯類及びヒトＢＡＰ融合タンパク 質の相互作用をＹ２Ｈバイオアッセイにより比較した。ＢＢＰ１と齧歯類ＢＡＰ を発現する株は増殖反応を示すことができなかった（図７）。この結果はＢＢＰ １がＢＡＰの神経毒性作用の特異的メディエーターとして働く可能性があるとい う前提を裏付け、そして齧歯類ＢＡＰの減少した神経毒性を説明するための機構 を与える。重要なことに、３個のアミノ酸の置換は結合を完全に妨げるために十 分であったので（図７）、これらのデータはＹ２ＨアッセイにおけるＢＢＰ１／ ＢＡＰ相互 作用の高度の特異性を示すためにも役立つ。 前記の説明及び実施例において特に記述されたのとは別のやり方で本発明を実 施できることは明らかである。上記の教示を考慮に入れて本発明の多数の改変及 び変形が可能であり、従って、それらは付加した請求の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジヤコブセン，ジヤツク・スチーブン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07446 ラムゼイ・マルベリーロード229 (72)発明者 バード，ジヨナサン・アダム アメリカ合衆国ペンシルベニア州18901ド イルスタウン・ニユーボルトコート3708 (72)発明者 ウオーカー，スチーブン・グレン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08520 イーストウインザー・ロツクランロード39

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：１のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｂ）受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆ ｌのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含 んでなるポリヌクレオチド； （ｃ）受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆ ｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパ ク質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド； （ｄ）ヌクレオチド２０２からヌクレオチド８０７までの配列番号：１の ヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｅ）受託番号ＡＴＣＣ ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６ のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含ん でなるポリヌクレオチド； （ｆ）受託番号ＡＴＣＣ ９８３９９で寄託されたクローンｐＥＫ１９６ のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク 質（ＢＢＰ）をコードするポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号：２のアミノ酸６８からアミノ酸２６９までのア ミノ酸配列を含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド結合活性を有する配列番 号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるタンパク質をコードするポリ ヌクレオチド； （ｊ）上記の（ａ）−（ｆ）のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であ るポリヌクレオチド； （ｋ）上記の（ｇ）−（ｈ）のタンパク質の種相同物をコードするポリヌ クレオチド；及び （ｌ）（ａ）−（ｈ）において特定されたポリヌクレオチドのいずれかに 厳しい条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、 よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。 ２． 該ポリヌクレオチドが少なくとも１つの発現制御配列に機能的に連結さ れている請求の範囲１のポリヌクレオチド。 ３． 請求の範囲２のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。 ４． 該細胞が原核または真核細胞である請求の範囲３の宿主細胞。 ５． 請求の範囲２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造 方法であって、（ａ）適当な培養培地中で請求の範囲３の宿主細胞の培養物を増 殖させ；そして（ｂ）培養培地からタンパク質を精製することを含んでなる方法 。 ６． 請求の範囲５の方法により製造されるタンパク質。 ７．（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列： （ｂ）アミノ酸６８からアミノ酸２６９までの配列番号：２のアミノ酸配 列； （ｃ）受託番号ＡＴＣＣ ９８６１７で寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆ ｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列； （ｄ）配列番号：２のアミノ酸１８５からアミノ酸２１７までのアミノ酸 配列を含んでなる配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント、 よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質。 ８． 該タンパク質が配列番号：２のアミノ酸配列含んでなる請求の範囲７の タンパク質。 ９． 異種起源のタンパク質またはペプチド配列に連結されたＢＢＰ１を含ん でなる融合タンパク質。 １０． ＢＢＰ１が配列番号：２のアミノ酸配列を有する請求の範囲９の融合 タンパク質。 １１． 配列番号：１のＢＢＰ１配列の一部に相補的なアンチセンス配列をコ ードし、ＢＢＰ１遺伝子の発現を妨げるオリゴヌクレオチド。 １２． サンプル中のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコ ードするポリヌクレオチドの確認方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドに特 異的なプローブを、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズ するために有効な条件下でサンプルにハイブリダイズさせ；そして（ｂ）サンプ ル中のポリヌクレオチドへの該プローブのハイブリダイゼーションを確認する工 程を含んでなり、その場合、該プローブが配列番号：１のポリヌクレオチド配列 に少なくとも９０％同一の２０またはそれ以上の塩基対の領域を有する核酸配列 を含んでなる方法。 １３． サンプル中のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコ ードするポリヌクレオチドの確認方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドに特 異的なプローブを、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズ するために有効な条件下でサンプルにハイブリダイズさせ；そして（ｂ）サンプ ル中のポリヌクレオチドへの該プローブのハイブリダイゼーションを確認する工 程を含んでなり、その場合、該プローブがＡＴＣＣ ９８６１７またはＡＴＣＣ ９８３９９のｃＤＮＡインサートのポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％同 一の２０またはそれ以上の塩基対の領域を有する核酸配列を含んでなる方法。 １４． 配列番号：２のアミノ酸配列に配列が少なくとも９０％同一の領域を 含んでなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。 １５． ＡＴＣＣ ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ− アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に配列が少なくとも90％同一 の領域を含んでなるポリペプチドに特異的に結合する抗体。 １６． 配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を含んで なるポリペプチドをサンプルにおいて検出するための方法であって、（ａ）特異 的結合のために有効な条件下で該ポリペプチドに特異的に結合する試薬をサンプ ルとインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中の該ポリペプチドへの該試薬の 結合を確認することを含んでなる方法。 １７． ＡＴＣＣ ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ− アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に配列が少なくとも９０％同 一の領域を含んでなるポリペプチドをサンプルにおいて検出するための方法であ って、（ａ）特異的結合のために有効な条件 下で該ポリペプチドに特異的に結合する試薬をサンプルとインキュベートし；そ して（ｂ）サンプル中の該ポリペプチドへの該試薬の結合を確認することを含ん でなる方法。 １８． （ａ）配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一の領域を 含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬とヒトβ−アミロイドペプチドの異常 な発現を示すサンプルを該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合 のために有効な条件下でインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中の該ペプチ ドへの該試薬の結合を確認することを含んでなる、ヒトβ−アミロイドペプチド （ＢＡＰ）の異常な発現を特徴とする疾病の診断方法。 １９． （ａ）ＡＴＣＣ ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされ るβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも９０％同 一の領域を含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬とヒトβ−アミロイドペプ チドの異常な発現を示すサンプルを該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の 特異的結合のために有効な条件下でインキュベートし；そして（ｂ）サンプル中 の該ペプチドへの該試薬の結合を確認することを含んでなる、ヒトβ−アミロイ ドペプチドの異常な発現を特徴とする疾病の診断方法。 ２０． 宿主から得られたサンプル中の請求の範囲１のポリヌクレオチドの存 在を分析することを含んでなる診断方法。 ２１． β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する化合物の同 定方法であって、（ａ）該試験化合物を含有する試験媒質中にヒトβ−アミロイ ドペプチドを含んでなるサンプルと配列番号：２のアミノ酸配列に少なくとも９ ０％同一の領域を含んでなるポリペプチドを 含んでなる試薬を該ヒトβ−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合のため に有効な条件下でインキュベートし；（ｂ）該試験化合物の有無でサンプル中の 該ペプチドへの該試薬の結合を比較し；そして（ｃ）工程（ｂ）における結合の 差をβ−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する試験化合物に結び 付けることを含んでなる方法。 ２２． β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する化合物の同 定方法であって、（ａ）該試験化合物を含有する試験媒質中にヒトβ−アミロイ ドペプチドを含んでなるサンプルとＡＴＣＣ ９８６１７のｃＤＮＡインサート によりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に少 なくとも９０％同一の領域を含んでなるポリペプチドを含んでなる試薬を該ヒト β−アミロイドペプチドへの該試薬の特異的結合のために有効な条件下でインキ ュベートし；（ｂ）該試験化合物の有無でサンプル中の該ペプチドへの該試薬の 結合を比較し；そして（ｃ）工程（ｂ）における結合の差をβ−アミロイドペプ チド結合タンパク質の活性を調節する試験化合物に結び付けることを含んでなる 方法。 ２３． 請求の範囲７のポリペプチドの治療的に有効な量を患者に投与するこ とを含んでなる、脳におけるβ−アミロイドペプチド蓄積を妨げる必要がある患 者の処置方法。 ２４． 請求の範囲２のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニックま たはキメラ動物。