CZ361299A3

CZ361299A3 - Proteiny vázající β-amyloidový peptid a polynukleotidy, které je kódují

Info

Publication number: CZ361299A3
Application number: CZ19993612A
Authority: CZ
Inventors: Bradley Alton Ozenberger; Eileen Marie Kajkowski; Jack Steven Jacobsen; Jonathan Adam Bard; Stephen Glenn Walker
Original assignee: American Home Products Corporation
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2000-05-17

Abstract

Nové polynukleotidy a proteiny, kteréjsou těmito polynukleotidy kódovány, se váží na β-amyloidový peptid, jednu z primárních složek amyloidových depozit, doprovázejícíchAlzheimerovu nemoc. Způsoby diagnostiky a léčení využívající tyto polynukleotidy a proteiny.

Description

Proteiny vázající β-amyloidový peptid a polynukleotidy, které je kódují

Tato přihláška se dovolává benefitu prozatímní přihlášky U.S. 60/064 583, podané 16. dubna 1997, jejíž obsah je formou odkazu zahrnut v předkládané přihlášce.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových polynukleotidů a proteinů, které jsou těmito polynukleotidy kódovány, a také léčebného, diagnostického a výzkumného využití těchto polynukleotidů a proteinů. Vynález se zejména týká polynukleotidů a proteinů kódovaných takovými polynukleotidy, které se vážou na β-amyloidový peptid, jednu z primárních složek amyloidových depozit doprovázejících Alzheimerovu nemoc.

Dosavadní stav techniky

Alzheimerova nemoc (AD) je progresivní demence pokročilejšího věku, pro kterou je charakteristická řada strukturálních abnormalit mozku. Neurony v četných oblastech centrálního nervového systému (CNS) se stávají nefunkčními a umírají, což má za následek změny na synaptických vstupech. Buněčná těla a proximální dendrity těchto zranitelných neuronů obsahují neurofibrilámí síť složenou ze spojených spirálovitých filament, jejichž hlavní složkou je fosforylovaný protein vázající mikrotubuly, a to zejména tau. Jedním z charakteristických rysů nemoci je akumulace depozit obsahujících amyloid v mozku, které se nazývají senilní (nebo neuritické) pláty. Hlavní složkou amyloidových plátů je β-amyloidový peptid (dále nazýván zkráceně „BAP“, v literatuře také uváděn jako Αβ, βΑΡ apod.), který tvoří v průběhu AD denzní agregáty.

• ·

BAP je peptid o 39-43 aminokyselinách vznikající proteolytickým štěpením z proteinového prekurzoru amyloidu (dále nazýván „APP“) a složený z části transmembránové domény a luminální/extracelulámí domény APP. Má se za to, že peptid BAP obsahující 42 aminokyselin (BAP42) je pro člověka potenciálně více toxická agregovaná forma. APP se vyskytuje jako izoforma obsahující několik BAP. Hlavní formy se skládají z 695, 751 a 770 aminokyselin, přičemž dva posledně uvedené APP obsahují doménu, která sdílí strukturální a funkční homologie s inhibitoiy Kunitzovy serinové proteázy. U normálních jednotlivců se BAP neakumuluje a je iychle odstraňován z cirkulujících tekutin. Ale peptid může tvořit pláty na povrchu dystrofických dendritů a axonů, mikroglií a reaktivních astrocytů. Předpokládá se, že agregace a depozice (ukládání) BAP v neuritických plátech je jeden zjevů, které spouští AD. Studium jevů vedoucích k expresi a významu BAP a jeho individuální úloze u AD je hlavní ohnisko neurologického výzkumu. Objev proteinů, které vážou BAP, je obzvláště klíčový pro pokrok v porozumění patogeneze nemoci a pro možné zavádění nových léčebných cílů.

Až do předložení tohoto vynálezu nebyly identifikovány proteiny a jejich fragmenty, které se vážou k lidskému BAP, a které se podílejí na biologických účincích BAP při AD.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje nové izolované polynukleotidy, které kódují genové produkty, které selektivně vážou aminokyselinové sekvence lidského peptidu β-amyloidu (BAP).

V jednom provedení poskytuje předkládaný vynález přípravek obsahující izolovaný polynukleotid vybraný ze skupiny obsahující:

a) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence identifikačního čísla 1 (i. ě. 1), • · ·

b) póly nukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP) klonu BBPl-fl uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98617,

c) polynukleotid kódující protein vázající β-amyloidový peptid (BBP) kódovaný cDNA inzertem klonu BBPl-fl uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98617,

d) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci ze sekvence i. č. 1 od nukleotidu 202 po nukleotid 807,

e) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP) klonu pEK196 uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98399,

f) polynukleotid kódující protein vázající β-amyloidový peptid (BBP) kódovaný cDNA inzertem klonu pEK196 uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98399,

g) polynukleotid kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci zde uvedenou jako sekvence i. č. 2,

h) polynukleotid kódující protein obsahující fragment aminokyselinové sekvence ze sekvence i. č. 2, který má vazebnou aktivitu pro lidský β-amyloidový peptid, fragment zahrnující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269 ze sekvence i. č. 2,

i) polynukleotid, který je alelickou variantou polynukleotidu z bodů

a) až f) uvedených výše,

j) polynukleotid, který kóduje druhový homolog proteinu z bodů g) až i) uvedených výše, a

k) polynukleotid, který je schopný hybridizovat za stringentních podmínek s každým z polynukleotidů vymezených v bodech a) až h).

Tyto polynukleotidy výhodně zahrnují nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence identifikačního čísla 1, nukleotidovou sekvenci proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP) klonu BBPl-fl uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98617, nebo polynukleotidu kódujícího protein vázající β-amyloidový peptid (BBP) kódovaného cDNA inzertem klonu BBPl-fl uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98617. Další provedení poskytuje gen odpovídající cDNA sekvenci i. č. 1.

V dalších provedeních poskytuje předkládaný vynález přípravek obsahující protein, přičemž uvedený protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z :

a) aminokyselinové sekvence uvedené zde jako sekvence i. č. 2,

b) aminokyselinové sekvence ze sekvence i. č. 2 od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269,

c) aminokyselinové sekvence kódované cDNA inzertem klonu BBPl-fl uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98617, a

d) fragmentů aminokyselinové sekvence i. č. 2 obsahující aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 185 po aminokyselinu 217 ze sekvence i. č. 2.

Výhodně tyto proteiny obsahují aminokyselinovou sekvenci identifikačního čísla 2 nebo aminokyselinovou sekvenci ze sekvence i. č. 2 od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269. Fúzní proteiny jsou také nárokovány v předkládaném vynálezu.

V určitých výhodných provedeních je polynukleotid operativně spojen s expresní kontrolní sekvencí. Vynález také poskytuje hostitelskou buňku, včetně bakteriálních, kvasinkových, hmyzích a savčích buněk, transformovaných těmito polynukleotidovými přípravky.

Vynález také poskytuje způsoby produkce BBP, které zahrnují;

a) pěstování kultury hostitelských buněk podle patentového nároku 3 ve vhodném kultivačním médiu, a

b) puriíikaci proteinu z kultivačního média.

Předkládaný vynález poskytuje také přípravky obsahující protilátku, která specificky reaguje s těmito BBP.

• ·

Jsou poskytnuty způsoby a diagnostické postupy pro detekci chorobného stavu charakterizovaného odchylnou expresí lidského BAP, a také způsoby identifikace sloučenin, které regulují aktivitu BBP.

Další provedení vynálezu zahrnuje transgenní zvířata obsahující póly nukleotid kódující BBP operativně spojený s expresní kontrolní sekvencí.

Přehled obrázků

Následující obrázky zobrazují pouze určitá provedení vynálezu. Jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují zde popisovaný vynález.

Obrázek 1: Schéma kvasinkového dvouhybridního testu. Hostitelský kmen Y2H exprimující doménu vázající DNA Gal4 fúzovanou k BAP42 (BAP^BD, plazmid obsahující značku TRPÍ) a nefúzovaný BAP42 (BAP, plazmid obsahující značku URA3) byl transformován s cDNA knihovnou mozku lidského fétu v Y2H (plazmid obsahující značku LEU2) exprimující fúzní proteiny aktivační domény Gal4 (neznámý^AD), jak popsáno. Kmeny tudíž obsahovaly tři epizomální plazmidy, označené kroužky, exprimující uvedený protein. Pozitivní interakce protein-protein rekonstituovaly aktivitu Gal4 v protisměru od aktivační sekvence (GALUAS), a tím indukovaly transkripci reportérového genu HIS3.

Obrázek 2: Průkaz asociace BBP 1/BAP. Kmeny Y2H se testovaly na histidinovou prototrofii tvořením desetinného sériového ředění a kapáním 5 μΐ na syntetický agar, ve kterém chyběl tryptofan, leucín, hístidín a který obsahoval 25 mM 3-amino-triazol, jak je popsáno. Všechny kmeny obsahovaly expresní plazmid pEK162 s fúzním proteinem BAP, jak vyznačeno popiskou BAP. První sloupce (vektor) obsahují nezávisle odvozené kmeny nesoucí pEK162 a vektor pACT2 exprimující irelevantní fúzní protein. Ty slouží jako míra pozadí pro srovnání s kmeny exprimujícími cílové proteiny. Sloupce označené BBPIDtm vyjadřují zkrácený BBP1 z pEK198, jak je popsáno v textu. Interakce mezi fúzními proteiny BAP a BBPlDtm rekonstituuje aktivitu Gal4, což má za následek indukci reportérového genu HIS3 (viz obrázek 1), pozorovanou jako zvýšený prototrofický růst ve srovnání s kontrolními kmeny.

Obrázek 3: Biologické testy demonstrující interakce BBP1 s proteiny Ga. Predikovaná intracelulámí doména BBP1 byla exprimována jako doména vázající DNA Gal4 s částmi potkaních Gas, Gao nebo Gai2 exprimovanými jako fúzní proteiny aktivační domény Gal4. Reakce Y2H dvou nezávisle odvozených klonů každého kmene se srovnávaly s reakcemi buněk postrádajících složku protein G (vektor). Protokol je stejný jako v legendě k obrázku 2.

Obrázek 4; Lokalizace interakcí mezi BBP1 a BAP. BBPlAtm byl rozdělen na dva překrývající se segmenty, jak je popsáno v textu. Tyto proteiny, BBPIAC a ΒΒΡ1ΔΝ, se testovaly na interakce s BAP. Testovací metoda a kmeny označené vektor nebo BBPlAtm jsou jako v legendě k obrázku 2. Kmeny značené BBPIAC nebo ΒΒΡ1ΔΝ exprimují označený segment BBP1 jako fúzní protein.

Obrázek 5: Exprese rnRNA BBP1 v lidských tkáních (A) a oblastech mozku (B). Nylonové membrány s 2 gg přenesené póly-A RNA izolované z uvedených tkání, rozdělené podle velikosti, byly získány od firmy CLONTECH. Membrány se hybridizovaly s radioaktivně značenou cDNA BBP1 sondou, jak popsáno. Ve všech drahách byl pozorován převládající pás odpovídající velikosti 1,25 kb (určeno dle standardu molekulové hmotnosti, neukázáno). Pásy o vyšší molekulové hmotností pravděpodobně odpovídají heteronukleámí RNA, gen BBP1 obsahuje několik intronů. Z blotů se odstranila sonda a hybridizovaly se znovu s β-aktinem jako kontrolou neporušenosti a množství RNA, všechny dráhy vykázaly rovnocenný signál (data neuvedena).

• · · • ·

Obrázek 6: Exprese BBP1 a APP v buňkách hipokampu. Snímky autoradiogramů hybridizace in šitu ukazující typ exprese BBPl (A) a APP (B) v lidském hippokampu a entorinálním kortexu. Řezy použité pro vytvoření těchto snímků byly odebrány z posmrtných vzorků získaných od dvou různých pacientů. Zkratky: DG = gyrus dentatum, CA1 = oblast hippokampu, EC = entorinální kortex.

Obrázek 7: Srovnání interakcí BBP1 s lidským BAP nebo BAP hlodavců. BAP hlodavců byl zkonstruován a exprimován jako fuzní protein, jak popsáno v textu. Kmeny označené lidský BAP jsou totožné s kmeny ukázanými na obrázku 2. Kmeny označené BAP hlodavců exprimuji BAP hlodavců jako fúzi domény vázající DNA Gal4. Vektor označuje kontrolní kmeny obsahující pouze vektor oproti fúzním proteinům BAP, BBP1 označuje kmeny exprimující fúzní protein BBPlAtm.

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká izolace a klonování lidského proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP1). BBP1 byl v kvasinkovém dvouhybridním testu charakterizován jako fúzní protein, který se váže k fragmentu o 42 aminokyselinách z BAP (BAP42). Exprese BBP1 byla prokázána v lidských tkáních a ve specifických oblastech mozku (viz obrázek 5). Je důležité, že bylo prokázáno, že BBPl selektivně váže lidský BAP v kvasinkovém dvouhybridním systému na rozdíl od BAP hlodavců. Tyto nálezy podporují předpoklad, že BBP1 podle předkládaného vynálezu může být použit v diagnóze a léčení Alzheimerovy nemoci, a také pro hodnocení a testování léčiv pro regulaci hromadění plátů obsahujících amyloid v mozku.

Sekvence kódující BBP1

Výchozí klon lidského BBP1 (označený jako klon 14) byl získán použitím kvasinkového dvouhybridního (Y2H) genetického filtru vyvinutého pro identifikaci proteinů, které interagují s lidským BAP42, potenciálně toxičtější formou BAP. BAP42 byl exprimován fúzovaný s DNA vázající doménou kvasinkového genu Gal4 a byl také exprimován jako volný peptid (obrázek 1). Tento kmen byl transformován s Y2H knihovnou cDNA z mozku lidského fétu. Jeden klon, označený c. 14, z přibližně 10^snezávislých transformant, poskytoval konzistentní aktivaci reportérového genu a obsahoval otevřený čtecí rámec související s rámcem domény GAL4. cDNA inzert obsahoval 984 párů baží, zakončených úsekem poly-A. Tato sekvence kódovala 201 aminokyselin (aminokyselina 68 až aminokyselina 269 ze sekvence id. č. 2) se dvěma oblastmi, jejichž délka a hydrofobnost postačuje pro překročení buněčné membrány. Jsou zde také potenciální glykosylační místa spojená s asparaginem. Klon 14 byl označen jako klon pEK196 a uložen jako ATCC 98399.

Plazmid získaný z knihovny byl z klonu 14 izolován a použit k rekonstrukci kmenů testu Y2H. Vyšetření těchto kmenů ukázalo, že fúzní protein BAP specificky* interaguje s proteinem klonu 14, ačkoliv reakce byla slabá. Protože silně hydrofobní proteinové domény, jako jsou transmembránové oblasti, inhibují reakce Y2H (Ozenberger, nepublikovaná data), byl inzert klonu 14 zkrácen (BBPlAtm, viz tabulku 2 níže pro další popis), aby se odstranila oblast nej silnější hydrofobie a znovu se testovaly interakce s BAP. S BBPlAtm byla pozorována mnohem silnější reakce Y2H, což podporuje představu, že odstraněné sekvence kódují potenciální transmembránovou („tm“) kotvu. Klon 14 identifikuje nový protein vázající BAP ve formě fůzního proteinu.

Ukázalo se, že sekvence cDNA BBP1 obsažené v klonu 14 postrádají 5' konec kódující oblasti proteinu, protože není přítomen žádný potenciální iniciační methioninový kodon. Četné pokusy s obvyklou metodou 5' RACE (rychlá amplifikace cDNA konců), která používá standardní reverzní transkriptázu, měly za následek pouze přidání 27 nukleotidů. Proto byl pro izolaci 5’ konce použit postup genomového klonování, jak popsáno v příkladu 2 níže.

Protože sekvence kódující 5' konec pocházela z genomové knihovny, existovala možnost, že tato oblast obsahuje introny. Tato možnost byla • · • · • ·

vyšetřována dvěma metodami, jak je popsáno v příkladu 2 níže. Výsledná data potvrdila sekvence v protisměru (jak genomové, tak z cDNA) a nepřítomnost intronů v této oblasti. Plazmid BBPl-fl obsahující inzert cDNA kódující kompletní kódující oblast proteinu BBP1 byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, ATCC) pod přístupovým číslem 98617. Kompletní kódující oblast a odvozená proteinová sekvence jsou ukázány v sekvencích i. č. 1 a 2. Netranslatované nukleotidové sekvence 3’ jsou obsaženy v původním klonu 14 (pEK196).

Podle předkládaného vynálezu mohou být použity nukleotidové sekvence, které kódují BBP1, fragmenty, fúzní proteiny nebo jejich funkční ekvivalenty, pro produkci rekombinantních molekul DNA, které řídí expresi BBP1 nebo funkčně aktivního peptidu v příslušných hostitelských buňkách. Nebo mohou být pro hybridizace nukleových kyselin, pro Southemovy a northemové analýzy apod., použity nukleotidové sekvence, které hybridizují s částmi sekvence BBP1.

Vynález také zahrnuje polynukleotidy se sekvencemi komplementárními k sekvencím póly nukleotidů zde popsaných.

Předkládaný vynález také zahrnuje polynukleotidy schopné hybridizovat v méně stringentních podmínkách, výhodně ve stringentních podmínkách a nejvýhodněji ve vysoce stringentních podmínkách, s polynukleotidy zde popsanými. Příklady stringentních podmínek jsou ukázány v tabulce níže, vysoce stringentní podmínky jsou ty, které jsou stringentní alespoň jako například podmínky A- až F, stringentní podmínky jsou ty, které jsou stringentní alespoň jako například podmínky G až L, a slabě stringentní podmínky jsou ty, které jsou stringentní alespoň jako například podmínky M až R.

• · · · • ·

Stringentní podmínky

Stringentní podmínky	Polynukleo- tidový hybrid	Délka hybridu (bpf	Hybridizační teplota a pufr^H	Teplota pro odmývání a pufr^H
A	DNA:DNA	50	65 °C; lxSSC nebo 42 °C; lxSSC, 50% formamid	65°C; 0,3xSSC
B	DNA:DNA	<50	T_B*; lxSSC	T_B*; lxSSC
C	DNA:RNA	50	67°C; lxSSC nebo 45°C; lxSSC, 50% formamid	67°C; 0,3xSSC
D	DNA:RNA	<50	T_D*; lxSSC	T_D*; lxSSC
E	RNA:RNA	50	65°C; lxSSC nebo 42°C; lxSSC, 50% formamid	70°C; 0,3xSSC
F	RNA:RNA	<50	Tf*; lxSSC	T_F*; lxSSC
G	DNA-.DNA	50	65°C;4xSSC nebo 42°C; 4xSSC, 50% formamid	65°C; lxSSC
H	DNA: DNA	<50	T_h*;4xSSC	T_h*;4xSSC
I	DNA: RNA	50	67°C;4xSSC nebo 45°C; 4xSSC, 50% formamid	67°C; lxSSC
J	DNA:RNA	<50	Tj*;4xSSC	Tj*;4xSSC
K	RNA:RNA	50	70°C;4xSSC nebo 50°C; 4xSSC, 50% formamid	67°C; lxSSC
L	RNA:RNA	<50	T_l*;2xSSC	T_l*;2xSSC
M	DNA.-DNA	50	50°C;4xSSC nebo 40°C; 6xSSC, 50% formamid	50°C; 2xSSC

• ·

N	DNA:DNA	<50	T_n*;6xSSC	Tn*;6xSSC
O	DNA;RNA	50	55°C;4xSSC nebo 42°C; 6xSSC, 50% formamid	55°C; 2xSSC
P	DNA:RNA	<50	Tp*;6xSSC	Tp*;6xSSC
Q	RNA:RNA	50	60°C;4xSSC nebo 45°C; 6xSSC, 50% formamid	60°C; 2xSSC
R	RNA:RNA	<50	T_r*;6xSSC	Tr*;6xSSC

ť Délka hybridu je délka, která je očekávána pro hybridizovanou oblast(i) hybridizuj ících polynukleotidů. Když se hybridizuje polynukleotid s cílovým polynukleotidem neznámé sekvence, předpokládá se, že délka hybridu je stejná jako délka hybridizuj ícího póly nukleotidu. Když se hybridizují póly nukleotidy známé sekvence, délka hybridu může být určena porovnáním sekvencí polynukleotidů a určením oblasti nebo oblastí s optimální komplementaritou sekvencí.

^H: SSPE (lxSSPE je 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄, a 1,25 mM EDTA, pH 7,4) může být nahrazeno SSC (lxSSC je 0,15 M NaCl a 15 mM citrát sodný) v hybridizačních a promývacích pufrech, promytí se provádějí 15 minut po dokončení hybridizace.

*Tb - Tr: hybridizační teplota pro hybridy, u nichž se čeká, že budou kratší než 50 párů baží, by měla být o 5-10 °C menší než teplota tání T_m hybridu, kde T_m je určena podle následujících rovnicí. Pro hybridy kratší než 18 párů baží - T_m(°C) = 2(počet baží A+T) + 4(počet baží G+C). Pro hybridy délkou mezi 18 a 49 páry baží - T_m(°C) = 81,5 + 16,6(logio[Na⁺]) + 0,41(%G+C) - (600/N), kde N je počet baží v hybridu, a [Na⁺]je koncentrace sodných iontů v hybridizačním pufru ([Na⁺] pro lxSSC = 0,165 M).

Další příklady stringentních podmínek pro hybridizaci polynukleotidů jsou poskytnuty v: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, kapitoly 9 a 11, a Ausubel, F.M. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, lne., oddíly 2.10 a 6.3-6.4, zahrnuto v odkazech.

Každý takový hybridizující polynukleotid je výhodně dlouhý tak, že je alespoň z 25 % (výhodněji alespoň z 50 % a nejvýhodněji alespoň ze 75 %) t · dlouhý jako polynukleotid předkládaného vynálezu, se kterým hybrídizuje, a má z alespoň 60 % totožnou sekvenci (výhodněji z alespoň 75 %, nejvýhodněji z alespoň 90 % nebo 95 %) s polynukleotidem předkládaného vynálezu, se kterým hybrídizuje, přičemž identita sekvencí je určena srovnáním sekvencí hybridizujících póly nukleotidů, když jsou srovnány tak, aby se maximalizovalo překrývání a totožnost a současně minimalizovaly rozdíly v sekvenci.

Exprese BBP1

Izolovaný polynukleotid podle vynálezu může být operativně spojen s expresní kontrolní sekvencí, jako jsou expresní vektory pMT2 nebo pED odhalené v práci Kaufman et al. (Nucleic Acids Res., 19, 4485-4490, 1991), aby produkovaly rekombinantně protein. V oboru je známo mnoho vhodných expresních kontrolních sekvencí. Obecné metody exprese rekombinantních proteinů jsou také známy a jsou doloženy příklady v práci Kaufman, R. (Methods in Enzymology, 185, 537-566, 1990). Jak je zde definováno, „operativně spojen“ znamená, že izolovaný polynukleotid vynálezu a expresní kontrolní sekvence jsou lokalizovány ve vektoru nebo v buňce tak, že protein je exprimován hostitelskou buňkou, která byla transformována (transfekována) ligovanou sekvencí polynukleotid/expresní kontrolní sekvence.

Expresní systém pro BBP1

Pro expresi proteinu může jako vhodná hostitelská buňka sloužit velké množství typů buněk. Savčí hostitelské buňky zahrnují například opičí buňky COS, buňky ovarií čínského křečka (CHO), buňky 293 lidských ledvin, lidské epidermální buňky A431, lidské buňky Colo205, buňky 3T3, buňky CV-1, další transformované buněčné linie primátů, normální diploidní buňky, buněčné kmeny pocházející z in vitro kultur primárních tkání, primární explantáty, buňky HeLa, myší L buňky, buňky BHK, HL-60, U937, HaK nebo Jurkat.

Nebo je možné produkovat protein v nižších eukaryotech, jako jsou kvasinky, nebo v prokaiyotech, jako jsou bakterie. Možné vhodné kmeny kvasinek zahrnují Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, kmeny Kluyveromyces, Candida nebo jakýkoliv kmen kvasinek schopný exprimovat heterologní proteiny. Možné vhodné kmeny bakterií zahrnují Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, nebo jakýkoliv kmen bakterií schopný exprimovat heterologní proteiny. Jestliže je protein tvořen ve kvasinkách nebo bakteriích, může být pro získání funkčního proteinu nezbytné takto produkovaný protein modifikovat, například fosforylací nebo glykosylací příslušných míst. Takové kovalentní vazby se mohou provést s použitím známých chemických nebo enzymových metod.

Protein může být také tvořen operativním spojením izolovaného polynukleotidů vynálezu s vhodnými kontrolními sekvencemi v jednom nebo více hmyzích expresních vektorech a použitím hmyzího expresního systému. Materiály a metody pro expresní systémy bakulovirus/hmyzí buňka jsou komerčně dostupné jako souprava, např. od firmy Invitrogen, San Diego, Kalifornie, U.S.A. (kit MaxBac7) a tyto metody jsou v oboru dobře známy, jak je popsáno v práci Summers a Smith (Texas Agricultural Experiment Station Bulletin č. 1555, 1987), zahrnuto v odkazech. Dle terminologie jak se zde používá, hmyzí buňka schopná exprimovat polynukleotid předkládaného vynálezu je „transformována“.

Protein podle vynálezu může být připraven pěstováním transformovaných hostitelských buněk v kultivačních podmínkách vhodných pro expresi rekombinantního proteinu. Výsledný exprimovaný protein je pak z takové kultury purifikován (tj. z tkáňového média nebo buněčných extraktů) s použitím známých purifikačních postupů, jako je gelová filtrace a iontoměničová chromatografie. Purifikace proteinu může také zahrnovat použití afinitní kolony obsahující agens, která se vážou na protein, jedno nebo více použití kolony s takovými afmitními pryskyřicemi, jako jsou konkavalin A-agaróza, heparin-toyopearl7 nebo Cibacrom blue 3GA Sepharose7, jeden nebo více kroků zahrnujících chromatografii

« • · s hydrofobní interakcí s použitím takových pryskyřic, jako jsou fenyléter, butyléter nebo propyléter, nebo imunoafínitní chromatografie.

Protein podle vynálezu může být eventuelně také exprimován ve formě usnadňující puriíikaci. Například může být exprimován jako fúzní protein, jako protein vázající maltózu (MBP), glutathion-S-transferázu (GST) nebo thioredoxin (TRX). Soupravy pro expresi a puriíikaci takových fúzních proteinů jsou komerčně dostupné od firem New England BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) a InVitrogen. Na protein může být také připojen epitop a protein pak může být purifikován s použitím specifické protilátky namířené proti tomuto epitopu. Jeden takový epitop („Flag“) je komerčně dostupný od firmy Kodak (New Haven, CT).

Konečně pro další puriíikaci proteinu může být použit jeden nebo více zákroků vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází (RP-HPLC) používajících hydrofobní RP-HPLC média, např. silikagel, který má navázané metylové nebo jiné alifatické skupiny. Některé nebo všechny předchozí purifikační zákroky v různých kombinacích mohou být také použity pro získání v podstatě homogenního izolovaného rekombinantního proteinu. Takto purifikovaný protein je v podstatě bez jiných savčích proteinů a podle předkládaného vynálezu je definován jako „izolovaný protein“.

Protein podle vynálezu může být také exprimován jako produkt transgenních zvířat, např. jako složka mléka transgenních krav, koz, prasat nebo ovcí, které se vyznačují tím, že jejich somatické nebo zárodečné buňky obsahují nukleotidovou sekvenci kódující protein.

Protein může být také tvořen známou konvenční chemickou syntézou. Způsoby konstrukce proteinů předkládaného vynálezu syntetickou cestou jsou odborníkům známy. Synteticky konstruované proteinové sekvence tím, že sdílejí primární, sekundární nebo terciární strukturu a/nebo konformační vlastnosti s proteiny, si mohou podržet společné biologické schopnosti, včetně proteinové aktivity. Mohou být tedy použity jako biologicky aktivní nebo imunologické náhražky přirozených r— purifikovaných proteinů pro screening terapeutických sloučenin a v imunologických postupech pro tvorbu protilátek.

Proteiny podle vynálezu také zahrnují proteiny, pro které jsou charakteristické aminokyselinové sekvence podobné sekvencím purifikovaných proteinů, ale ke kteiým se vyskytují modifikace přirozené nebo vytvořené záměrně. Odborníkem mohou být vytvořeny s použitím známých technik například modifikace peptidových sekvencí nebo sekvencí DNA. Požadované modifikace proteinových sekvencí mohou zahrnovat alterace, substituce, náhrady, inzerce nebo delece vybraného aminokyselinového zbytku v kódující sekvenci. Například, aby se změnila konformace molekuly, může být jeden nebo více cysteinových zbytků odstraněno nebo nahrazeno jinou aminokyselinou. Techniky takových alteraci substitucí, náhrad, -inzercí nebo cteiecí jsou odborníkovi dobře známy (viz např. patent US 4 518 584). Výhodně tyto alterace, substituce,

Další fragmenty a deriváty sekvencí proteinů, od kterých by se očekávalo-zachování úptnémebo částečné aktivity -proteinu a které by-tedy mohly být použitelné pro screening nebo jiné imunologické metody, mohou být také snadno vytvořeny odborníkem na základě předkládaného vynálezu. -Proto se má za to, že tyto modifikace jsou také-obsaženy v předkládaném vynálezu.

Kvasinkové dvouhybridní testy

Y2H testy prokázaly, že asociace BAP s fúzním proteinem BBP1 je specifická. Asociace BBP1 s BAP svědčí yrro to,-že nktivita DBPl může mít definovanou úlohu v patogeneze Alzheimerovy nemoci.

Sekvence BBPl byly «rovnány se sekvencemi z Genbank s použitím základního vyhledávacího programu pro místní porovnání (BLAST, Altschul et al., 1990). Protein BBPl a translace dostupných Krátkých exprimovaných markerových sekvencí (expressed sequence tags) byly -porovnány, -prohledány na výskyt konzervativních segmentů a vyhodnoceny pomocí algoritmu na vyhledávání proteinových motivů * · · ♦

MoST (Tátusov et al., 1994). Tyto analýzy odhalily možný evoluční vztah k rodině receptorů spojených s proteinem G (GPCR). Tyto analýzy přesněji ukázaly, že BBP1 obsahuje dvě potenciální transmembránové (tm) domény rovnocenné tm doménám 3 a 4 receptorů spojených s proteinem G. Intervenující hydrofilní smyčka obsahuje dobře charakterizovaný motiv tří aminokyselin, aspartát (D) nebo glutamát následovaný argininem (R) a aromatickým zbytkem (Y nebo F) (obecně nazývaný jako sekvence DRY), tento motiv je zachován u téměř všech členů této rodiny receptorů a bylo ukázáno, že slouží jako molekulový spouštěč aktivace proteinu G (Acharya a Kamik, 1996).

Data z testů Y2H (viz obrázky 2-4) ukazují, že BBP1 představuje nový protein potenciálně obsahující funkční modul sdílený soleny velké rodiny receptorů spojených s proteinem G. Přesněji se ukazuje, že BBP1 zachovává kritickou sekvenci DRF (aminokyseliny 199 až aminokyseliny 201 ze sekvence id. č. 2), mezi dvěma predikovanými tm doménami, a může mít potenciál pro spojení se signální drahou Tíženou proteinem G.

Bylo také ukázáno, že APP funkčně asociuje s Goto (Nishimoto et al., 1993, Yamatsuji et al., 1996) a BBP1 obsahuje strukturální motiv, o kterém je známo, že je aktivační sekvencí proteinu Ga u příbuzných receptorů spojených s proteinem G. Navíc, hypotéza založená na predikované pozici a orientaci tm domény BBP1 svědčí pro to, že oblast proteinu, která interaguje s BAP je topograficky omezena do stejné lokalizace jako BAP u APP.

Kmeny pro test Y2H byly konstruovány pro vyhodnocení asociace intracelulámí oblasti BBP1 s proteiny Ga. Predikované intracelulámí sekvence BBP1 byly exprimovány jako fúzní protein a testovány na interakce s C-koncovými oblastmi tří proteinů Ga. Proteinové segmenty použité v těchto pokusech jsou uvedeny v seznamu v tabulce 2, níže. Intracelulámí smyčka BBP1 interagovala se všemi třemi proteiny Ga (obrázek 3), což podporovalo předpoklad, že BBP1 může působit jako modulátor -aktivity proteinu G. Tvto různé testy Y2H napovídají -spletitý • ·

model složeného proteinového komplexu tvořeného minimálně úplnými membránovými proteiny BBP1 a APP připojenými k heterotrimerickému proteinu G.

Tabulka 2

Plazmidy použité v kvasinkových dvouhybridních testech

Expresní plazmid	Protein	Segment
	SAP
pEK162	/lidský)	1-42
pEK240	(myší)	1-42
	SBP1
pEK196	(klon 14)	£8-269
pEK198	(Atm)	68-202
pEK219	(AC)	68-175
pEK2T6	(AN)	123-202
pQZ339	ýintracelulární)	185-217
	Gcc
pOZ345	(Gas)	235-394
pGZ346	jGao)	161-302
pQZ348	/Gai2)	.213-355

Další analýza BBP1 byla získána s použitím testů Y2H. Dvě překrývající se části sekvence BBP1 obsažené v klonu BBPlAtm byly amplifikovány a klonovány do Y2H vektoru pACT2 /expresní plazmidy pEK216 a pEK219, tabulka 2 a odpovídající proteiny ΒΒΡ1ΔΝ a BBP1AC, (obrázek 4)). -Konstrukt AG postrádal Obě tm domény, konstrukt AN kódoval první tm doménu a předcházejících 52 aminokyselin. Tyto fúzní proteiny byly -testovány s fúzním proteinem SAP -a -reakce -se srovnávaly s reakcemi kmenů exprimujících větší protein BBPlAtm. Protein BBP1AC -vyvolal slabou reakci Y2H /srovnej SBP1AC s vektorem, -obrázek-4), -ale • « protein ΒΒΡ1ΔΝ obsahující první tm doménu a sousední aminoproximální sekvence produkoval reakci jen o málo slabší než byla reakce pozorovaná u BBPlAtm (obrázek 4). Tyto výsledky svědčí pro to, že hlavní determinanta pro asociaci s BAP je obsažena v oblasti BBP1, o které se předpokládá, že je topograficky podobná BAP v divokém typu proteinu APP.

Systém Y2H byl použit pro průkaz selektivnosti a specifičnosti BBP1 vázajícího se na lidský BAP, ve srovnání s BAP hlodavců. V sekvenci BAP hlodavců jsou tři aminokyselinové substituce (G55R, F10Y a R13H) ve srovnání s lidskou sekvencí. V testu Υ2Ή popsaném v příkladu 6 peptid hlodavců vykazuje sníženou neurotoxicitu a nepřítomnost vazby na homogenáty lidského mozku (Maggio et s.1., 1992). Bylo proto žádoucí vyhodnotit asociaci BAP hlodavců s BBP1 v systému Y2H. Sekvence lidského BAP v pEK162 byla změněna, aby kódovala peptid hlodavců prostřednictvím oligonukleotidem řízené mutageneze s pomocí PCR. Výsledný plazmid, pEK240, je totožný s expresním plazmídem lidského BAP fúzního proteinu používaného všude v této publikaci kromě tří kodonů tvořících aminokyselinové substituce v sekvenci peptidu hlodavců. Interakce mezi fúzním proteinem BBP1 a lidským fúzním proteinem BAP a fúzním proteinem BAP hlodavců byly porovnány v biologickém testu Y2H. Kmeny -exprimující BBP1 a BAP hlodavců nereagovaly růstem (obrázek 7). Tento nález podporuje předpoklad, že BBP1 může sloužit jako specifický mediátor neurotoxického účinku BAP a poskytuje mechanismus vysvětlující sníženou neurotoxicitu BAP hlodavců. Je důležité, že tato data také slouží pro ilustraci vysokého stupně specifičnosti interakce BBP1/BAP v testech Y2H, protože substituce tří aminokyselin byla postačující pro úplné zrušení asociace (obrázek 7).

Izolované polypeptidy BBP1

Proteiny a proteinové fragmenty předkládaného vynálezu zahrnují proteiny s aminokyselinovou sekvencí dlouhou -tak, že je alespoň z 25 % (výhodněji alespoň z 50 % a nejvýhodněji alespoň ze 75 %) dlouhá jako «

popsaný protein, a má alespoň z 60 % totožnou sekvenci (výhodněji alespoň z 75 %, nejvýhodněji alespoň z 90 % nebo 95 %) s popisovaným proteinem, přičemž identita sekvencí je určena srovnáním aminokyselinových sekvencí proteinů, když jsou srovnány tak, aby se maximalizovalo překrývání a totožnost a současně minimalizovaly rozdíly v sekvenci. V předkládaném vynálezu jsou také obsaženy proteiny a proteinové fragmenty, které obsahují segment skládající se výhodně z 8 nebo více (výhodněji z 20 nebo více, nejvýhodněji z 30 nebo více) sousedních aminokyselin, které sdílejí alespoň ze 75 % identickou sekvenci (výhodněji alespoň z 85 %, nevýhodněji alespoň z 95 %) s kterýmkoliv takovým segmentem každého z popisovaných proteinů.

Předkládaný vynález také poskytuje druhové homology popisovaných póly nukleotidů a proteinů. Jak se zde používá, druhový homolog je protein nebo polynukleotid původem z odlišného druhu než je původ daného proteinu nebo polynukleotidu, ale s významnou podobností sekvencí s daným proteinem nebo polynukleotidem. Polynukleotidové druhové homology mají výhodně z alespoň 60 % totožnou sekvenci (výhodněji alespoň ze 75 %, nejvýhodněji alespoň z 90 %) s daným polynukleotidem, a proteinové druhové homology mají výhodně alespoň z 30 % totožnou sekvenci (výhodněji alespoň z 45 %, nejvýhodněji alespoň z 60 %) s daným proteinem, přičemž identita sekvencí je určena srovnáním nukleotidových sekvencí polynukleotidů nebo aminokyselinových sekvencí proteinů, když jsou srovnány tak, aby se maximalizovalo překrývání a totožnost a současně minimalizovaly rozdíly v sekvenci. Druhové homology mohou být izolovány a rozpoznávány vytvořením vhodných sond nebo primerů ze sekvencí zde poskytnutých a testováním vhodného zdroje nukleových kyselin požadovaných druhů. Výhodně jsou druhové homology izolované z druhů savců. Výhodněji jsou druhové homology izolované z určitých druhů savců, jako jsou například Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus, Hylobates concolor, Macaca mulatta, Papío papio, Papio hamadryas, Cercopithecus aethiops, Cebus capucinus, Aotus trivirgatus, Sanguinus oedipus, Microcebus murinus, Mus musculus, Rattus norvegicus,

Crícetulus griseus, Felis catus, Mustela vison, Canis familiaris, Oryctolagus cuniculus, Bos taurus, Ovís aries, Sus scrofa, a Equus caballus, pro které byly vytvořeny genetické mapy umožňující identifikaci syntenního vztahu mezi genomovou organizací genů u jednoho druhu a genomovou organizací příbuzných genů u druhu jiného (O’Brien a Seuanez, Ann. Rev. Genet., 22, 323-351, 1988, O'Brien et al., Nátuře Genetics, 3, 103-112, 1993, Johansson et al., Genomics, 25, 682-690, 1995, Lyons et al., Nátuře Genetics, 15, 47-56, 1997, O’Brien et al., Trends in Geneticccs, 13(10), 393-399, Carver a Stubbs, Genome Research, 7, 1123-1137, 1997).

Vynález také obsahuje alelické varianty popisovaných polynukleotidů nebo proteinů, tj. přirozeně se vyskytující alternativní formy izolovaných polynukleotidů, které také kódují proteiny, které jsou totožné nebo mají významně podobné sekvence s proteiny kódovanými popisovanými polynukleotidy. Alelické varianty mají výhodně z alespoň 60 % totožnou sekvenci (výhodněji z alespoň 75 %, nejvýhodněji z alespoň 90 %) s daným póly nukleotidem, přičemž identita sekvencí je určena srovnáním nukleotidových sekvencí polynukleotidů, když jsou srovnány tak, aby se maximalizovalo překrývání a totožnost a současně minimalizovaly rozdíly v sekvenci. Alelické varianty mohou být izolovány a rozpoznávány vytvořením vhodných sond nebo primerů ze sekvencí zde poskytnutých a testováním vhodného zdroje nukleových kyselin jedinců příslušných druhů.

Vynález také zahrnuje polynukleotidy se sekvencemi komplementárními k sekvencím polynukleotidů zde popisovaných.

Aplikace

Proteiny BBP1 předkládaného vynálezu mohou být na základě tohoto vynálezu použity v celé řadě aplikací, které jsou pro odborníka běžné. Přesněji BBP mohou být použity jako imunogeny pro vytvoření protilátek, které jsou specifické pro klonované polypeptidy. Pro tvorbu protilátek proti proteinům BBP1 mohou být použity různé postupy v oboru známé. Takové protilátky zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, monoklonální, polyklonální, ♦ · chimérické, jednořetězcové protilátky, fragmenty Fab a Fab expresní knihovnu. Pro produkci protilátek se různým hostitelským zvířatům včetně (ale bez omezení) králíků, myší a potkanů, podávají injekce BBP. V jednom provedení je polypeptid nebo fragment polypeptidů se schopností specifické imunoaktivity konjugován s imunogenním nosičem. Pro zvýšení imunologické reakce hostitelského zvířete mohou být také ve spojení s polypeptidem podávána adjuvans. Příklady adjuvans, která mohou být použita, zahrnují (ale nejsou na ně omezeny) kompletní a nekompletní Freundovo adjuvans, minerální gely jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky jako je lysolecitin, polyoly Pluronic, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyanin z přílipky a dinitrofenol.

Monoklonální protilátky k proteinům BBP1 předkládaného vynálezu mohou být připraveny s použitím každého postupu, který zajistí produkci protilátek nepřetržitou buněčnou linií v tkáňové kultuře. Tyto postupy jsou odborníkům dobře známy a zahrnují (ale nejsou na ně omezeny) technologii hybridomu původně popsanou Kohlerem a Milsteinem (Nátuře, 256, 4202-497, 1975), metodu hybridomu lidských B buněk popsanou Kosborem et al. (Immunology Today, 4, 72, 1983) a metodu EBVhybridomu popsanou Colem et al. (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., s. 77-96).

Protilátky imunoreaktivní na polypeptidy předkládaného vynálezu mohou být pak použity pro testování výskytu a subcelulámí distribuce podobných polypeptidů v biologických vzorcích. Kromě toho monoklonální protilátky specifické pro proteiny BBP1 předkládaného vynálezu mohou být použity jako léčiva.

Proteiny BBP1 mohou také sloužit jako antigeny použitelné v testech s pevnou fází měřících přítomnost protilátek, které imunologicky reagují s nárokovanými peptidy. Kompetitivní testy s pevnou fází mohou být použity pro měření imunologických množství antigenu majícího vztah ke klonu 14 v biologických vzorcích. Toto určování není použitelné pouze pro usnadnění kompletní charakterizace buněčné funkce nebo funkcí • ·

- V>

polypeptidů předkládaného vynálezu, ale může být také použito pro identifikaci pacientů s abnormálním množstvím těchto proteinů.

Proteiny BBP1 předkládaného vynálezu mohou být také použity jako záchytové reagencie v afinitní chromatografií pro detekci BAP a BAP agregátů jako markéry pro AD.

Kromě toho BBP1 jsou užitečné jako reagencie v testu pro identifikaci kandidátových molekul, které uskutečňují interakci BAP a klonovaného proteinu. Sloučeniny, které specificky blokují tuto asociaci by mohly být použitelné v léčení nebo prevenci AD.

BBP1 jsou také použitelné v bezbuněéných in vitro vazebných testech, kde se určuje alterace vazby proteinů sdružených s β-amyloidovým peptidem k BAP nebo BAP agregátům určitou sloučeninou. Bezbuněčné testy jsou mimořádně užitečné při screeningu poměrně velkého počtu sloučenin, protože tyto testy jsou efektivní vzhledem k vynaloženým nákladům a při provádění jsou snadnější než testy používající živé buňky. Po popise polypeptidů podle předkládaného vynálezu je vývoj těchto testů pro odborníka rutinní. V těchto testech je označen buď BBP1 nebo BAP. Tyto značky zahrnují (ale nejsou na ně omezeny) radioaktivní značení, protilátky a fluorescenční nebo ultrafialové značky. Vazba BBP1 na BAP nebo BAP agregáty se nejdříve určuje v nepřítomnosti testované sloučeniny. Pak se do testu přidají testované sloučeniny, aby se určilo, zda tato sloučenina změní sledovanou interakci.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález je dále popsán formou následujících příkladů. Příklady slouží pouze k ilustraci vynálezu a demonstrují výhodná provedení vynálezu. Tato výhodná provedení, ačkoliv ilustrují určité specifické aspekty vynálezu, nepředstavují žádné omezení vynálezu ani nevymezují rozsah vynálezu.

9· ♦ · · ·· ·* • · · · · · · · » ·» · ··· · · «. * • · · · · · · · ·»* • · » · « ···· ·· ··» ··»· ··

Kvasinkový dvouhybridní systém (dále „Y2H“)

Y2H expresní plazmidy byly konstruovány ve vektorech pAS2 a pACT2 (popsáno WadeHarper et al., 1993) a pCUP (popsáno Ozenberger a Young, 1995). Kvasinkový kmen CY770 (Ozenberger a Young, 1995) sloužil jako hostitel pro všechny testy Y2H.

Genetický filtr

Metoda polymerázové řetězové reakce (PCR) byla použita pro amplifikaci a modifikaci sekvencí kódujících BAP. Oligonukleotidy č. 1 (5'CC ATG GAT GCA GAA TTC CGA C) a č. 3 (5 -AAGCTTGTCGAC TTA CGC TATGAC AAC ACC GC) byly použity pro amplifikaci BAP s použitím pCLL621, modifikovaného lidského klonu APP (Jacobsen et al., 1994) jako templátu. Amplifikovaná DNA se skládala zkodonů 389 až 430 (které kódují BAP42) z prekurzorového proteinu APP s následujícími modifikacemi. Primer pro sense vlákno přidával 5' Ncol restrikční místo do stejného translačního čtecího rámce jako je místo Ncol v pAS2. Primer pro antisense vlákno přidával stopovací kodon a místa HindlII a Sáli pro klonování. Produkt z této amplifikace byl ligován do TA klonovacího systému (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) a pak odstraněn štěpením s Ncol a Sáli. Tento fragment byl klonován do pAS2 štěpeného Ncol a Sáli. Výsledný plazmid pEK162 byl ověřen sekvencováním DNA přes spojení GAL4/BAP. Protein (BAP^BD, obrázek 1) exprimovaný zpEK162 obsahoval fúzní protein obsahující doménu vázající DNA z kvasinkového transkripčního aktivačního proteinu Gal4 (postrádající funkční aktivační sekvence) s přidáním 42 aminokyselin z BAP ke karboxy konci. Byl vyvinut expresní plazmid, který zprostředkovává expresi nemodifikovaného BAP42. Oligonukleotid č. 2 (5'-AAGCTTAAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA C) byl spárován s oligonukleotidem č. 3 v PCR, jak je popsáno výše. Produkt této amplifikace obsahoval 5' místo HindlII a translační iniciační signály optimalizované pro expresi v Saccharomyces cerevisiae.

DNA fragment byl opět klonován do systému TA. Pak byl izolován jako fragment HindlII a klonován do pCUP štěpeného s HindlII. Orientace

4 9

9 94

9 9 · • · · • 999 4 • · 9494 49

49

9 9

9 • · » f949 4449 genu BAP ve výsledném plazmidů pEK149 (BAP, obrázek 1) byla ověřena sekvencováním DNA. Exprese BAP plazmidů pEK149 (který používá jako selekční značku URA3) a pEK162 (který používá jako selekční značku TRPÍ) byly transformovány do kvasinkového hostitele CY770 (Ozenberger aYoung, 1995). Kmen obsahující oba plazmidy byl pojmenován CY2091. Od Clontech Laboratories, lne. (Palo Alto, CA) byla zakoupena plazmidová knihovna skládající se z cDNA fragmentů izolovaných z lidského fetálního mozku klonovaných do kvasinkového dvouhybridního expresního vektoru pACT2 (kteiý používá jako selekční značku LEU2). Protein pocházející z knihovny je na obrázku 1 označen jako neznámý. Tato knihovna byla použita pro transformaci CY2091. Vzorky byly rozptýleny na syntetickém kompletním (SC) kvasinkovém růstovém médiu bez uracilu, tryptofanu a leucinu, aby se vybraly buňky obsahující všechny tři plazmidy. V médiu také nebyl histidin a obsahovalo 3-amino-triazol, inhibitor produktu kvasinkového genu HIS3 v koncentraci 25 mM. 3-amino-triazol byl použit pro redukci aktivity konstitutivní exprese nízké úrovně reportérového genu HIS3. Destičky se inkubovaly ve 30 °C 12 dnů. Bylo izolováno dvacet čtyři kolonií, které projevovaly zvýšenou histidinovou prototroíii. Transformační kontroly ukázaly, že filtrem prošlo 10⁶ jednotlivých klonů. Pro rychlé určení obsahu pozitivních klonů byl použit přístup pomocí PCR. Z každého pozitivního kmene byla standardními metodami izolována celková DNA. Tento materiál byl použit jako templát pro PCR s použitím oligonukleotidů č. 4 (5'-TTTAATACCA CTACAATGGA T) a č. 5 (5'-TTTTCAGTAT CTACGATTCA T), které ohraničují klonovací oblast vektoru knihovny pACT2. DNA fragmenty byly ligovány do systému TA a prošetřovány sekvencováním DNA. Plazmid knihovny obsažený ve klonu č. 14 (jak je popsáno výše) byl izolován po přenosu do E. coli. Určila se nukleotidová sekvence lidských cDNA sekvencí, což ověřilo sekvenci výchozího produktu PCR.

Biologické testy

Kmeny byly pěstovány přes noc ve 2 ml média SC, ve kterém chyběl leucin a tryptofan, do hustoty přibližně 7xl0⁷ buněk na ml. Buňky se spočítaly a sterilní vodou se naředila série desítkového ředění od 10⁴ po 10⁸ buněk na ml. Tyto vzorky se nakapaly po 5 μΐ na médium SC, ve kterém chyběl tryptofan, leucin a histidin a které obsahovalo 25 mM 3-amino-triazol. Destičky se inkubovaly 2 až 3 dny ve 30 °C. Pozitivní interakce protein/protein se rozpoznávaly podle zvýšeného prototrofického růstu ve srovnání s kontrolními kmeny exprimujícími fúzní protein domény vázající DNA Gal4 a fúzní protein irelevantní transkripční aktivační domény (nebo jednoduše obsahující vektor pACT bez vložených sekvencí). Tyto kontrolní kmeny byly označeny na obrázcích popsaných výše popiskou „vektor“. Tato testovací metoda byla vysoce reprodukovatelná a zajistila detekci i malé indukce růstu zprostředkované specifickou interakcí mezi cílovými proteiny. Původní klon BBP1, označený pEK196 a uložený jako ATCC 98399 (nazývaný zde klon 14), byl použit jako PCR templát pro zkrácení proteinového produktu pro expresi BBPlAtm. Sense primer č. 6 (5’- TTTAATACCA CTACAATGGA T) nasedl na sekvence GAL4 vpACT2. Antisense primer č. 7 (CTCGAG TTA AAA TCG ATC TGC TCC CAA CC) vložil 3’ stop-kodon a místo Xhol bezprostředně 3' k sekvencím kódujícím motiv DRF z BBP1. Produkt PCR byl ligován do klonovacího vektoru TA a pak štěpen s EcoRI + Xhol a klonován do pACT2. Hybridní produkt exprimovaný tímto plazmidem (pEK198) byl označen BBPlAtm. Podobně byl primer č. 7 párován s primerem č. 8 (5'-GAATT CCA AAA ΑΤΑ AAT GAC GCT ACG) pro konstrukci ΒΒΡ1ΔΝ expresního plazmidu pEK216. Produkt PCR byl opět ligován do systému TA a výsledný plazmid štěpený EcoRI + Xhol s fragmentem BBP1 (kodony 123-202) byl konečně ligován do pACT2 štěpeného stejnými enzymy. BBP1AC byl vytvořen použitím oligonukleotidu specifického pro pACT2 č. 6 s antisense oligonukleotidem č. 9 (5'- CTCGAG TCA AGA TAT GGG CTT GAA AAA AC). Po klonování TA, izolaci fragmentu EcoRI-Xhol a klonování do pACT2, • ·

exprimoval výsledný plazmid pEK219 BBP1 od zbytku 68 do 175. Sekvence kódující BBP1 intracelulámí smyčku byly amplifikovány s použitím oligonukleotidů č. 10 (5'-CCTTCC ATG GAA GTG GCA GTC GCA TTG TCT) a č. 11 (5’-AACACTCGAG TCA AAA CCC TAC AGT GCA AAA C). Tento produkt obsahující BBP1 kodony 185 až 217 byl štěpen Ncol + Xhol a klonován do pAS2 štěpeného Ncol + Sáli za vzniku pOZ339. Konstrukce všech expresních plazmidů pro proteiny Ga používala místo BamHI blízko středu každé potkaní cDNA sekvence (Kang et al., 1990), jako místo fúze v pACT2. Sense primery nasedly na sekvence 5' od místa BamHI, antisense primery nasedly na sekvence 3' od stop-kodonu a zahrnovaly restrikční místo Sáli. Primery byly; Gao, sense (č. 17) = 5'GTGGATCCAC TGCTTCGAGG AT, antisense (č. 18) = 5'- GTCGACGGTT GCTATACAGG ACAAGAGG, Gas, sense (č. 19) = 5'-GTGGATCCAG TGCTTCAATG AT, antisense (č. 20) = 5’-GTCGACTAAA TTTGGGCGTT CCCTTCTT, Gai2, sense (č. 21) = 5'-GTGGATCCAC TGCTTTGAGG GT, antisense (ě. 22) = 5'-GTCGACGGTC TTCTTGCCCC CATCTTCC. Produkty PCR byly klonovány do vektoru TA. Sekvence Ga byly izolovány jako fragmenty BamHI-SalI a klonovány do pACT2 štěpeného s BamHI + Sáli. Viz tabulku 2 s označeními plazmidů. Nakonec byl syntetizován oligonukleotid č. 23 pro konverzi lidského BAP na sekvenci hlodavců. Primer měl sekvenci 5'-ATATGGCCATG GAT GCA GAA TTC GGA CAT GAC TCA GGA TTT GAA GTT CGT. Triplety představují prvních 13 kodonů BAP, tři nukleotidy, které byly změněny, aby vznikla sekvence hlodavců, jsou podtrženy. Oligonukleotid č. 23 byl párován s č. 24 (5'- TGACCTACAG GAAAGAGTTA) nasedajícím na oblast vektoru Y2H, která je 3' od klonovacího místa, v PCR s použitím pEK162 jako templátů. Produkt byl štěpen Ncol + Sáli a ligován do pAS2 za vzniku pEK240. Nukleotidová sekvence segmentu kódujícího BAP hlodavců byla ověřena.

• ·

Genomové klonování

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends - rychlá amplifikace konců cDNA): lidská genomová knihovna lambda (Stratagene), odpovídající 2,0 x 10⁶ pfu, byla testována se sondou vzniklou z fragmentu EcoRI/Clal vytvořeného pomocí náhodných primerů, odpovídajícím nukleotidům 187 až 600 (obrázek 2). Sonda byla značena [³²P]-CTP při použití soupravy ^T7QuickPrimer Kit podle protokolu výrobce (Pharmacia). Filtry se hybridizovaly ve vysoce stringentních podmínkách: 40 °C v 50% formamidu, 0,12 M NaHPCů, 0,25 M NaCl, 7% SDS a 25 mg/ml sonikované DNA lososího spermatu a odmývaly se v 65 °C v 0,lxSSC obsahujícím 0,1% dodecylsulfát sodný a exponovaly se na filmu Kodak BioMax MS. Klony fágu lambda hybridizující se sondou se purifikovaly z plaků postupným vyséváním na misky a opětným testováním. Bylo purifikováno deset pozitivních klonů, které podstoupily další analýzu hybridizaci se sondou o 45 nukleotidech namířenou proti většině 5' sekvencí známých z původního cDNA klonu. Tento oligonukleotid byl reverzně komplementární k nukleotidům 157-201 (obrázek 2) a měl sekvenci 5'-CCAGGCGGCC GCCATCTTGG AGACCGACAC TTTCTCGCCA CTTCC. DNA fágu lambda byla izolována standardními technikami molekulární biologie a podrobena přímému sekvencování s použitím fluorescenčního dideoxynukleotidového cyklického sekvencování na sekvenačním analyzátoru ABI 373.

RACE

Syntéza prvního vlákna DNA se prováděla s použitím termostabilního polymerázového systému rTth (Perkin Elmer). V 1,5 ml zkumavce se smísily následující reagencie, vznikl objem 10 μΐ: 1 x pufr pro reverzní transkripci, 1 mM MnCh, 1,6 mM směs dNTP, 2,5 U rTth polymerázy, 100 ng póly A⁺ RNA lidského hippokampu (Clontěch), lOmM oligonukleotid (nukleotidy 429-452, obrázek 2, 5'-GTTATGTTGG GTGCTGGAAA ACAG). Rekce se inkubovala 15 minut v 70 °C a hned poté dala na led. Pro vznik druhého vlákna cDNA byl použit kit pro syntézu cDNA Marathon

• · · · · * (Clontěch). Celý objem 10 μΐ reakce pro vznik prvního vlákna se smísil s následujícími reagenciemi: 1 x pufr pro druhé vlákno, 0,8 mM směs dNTP, 4 x koktejl pro druhé vlákno (E. coli DNA polymeráza I, E. coli DNA ligáza, E. coli RNáza H) a H2O do objemu 80 μΐ. Zkumavka se inkubovala 1,5 hodiny v 16 °C, pak se přidala T4 DNA polymeráza (10 U) a inkubovala se dalších 45 minut v 16 °C. Aby se ukončila reakce, přidaly se do reakčních směsí 4 μΐ 20 x EDTA/glykogen (0,2 M EDTA(2mg/ml glykogen), po kterých následovala fenol/chloroform/izoamylalkoholová extrakce pro odstranění enzymů a dalších nečistot. DNA se precipitovala přidáním 0,1 x objemu 3 M acetátu sodného pH 5,2 a 2,5 x objemu EtOH standardní čistoty a umístila se do -70 °C. DNA se jedenkrát omyla 70% EtOH, usušila a resuspendovala v 10 μΐ dH2O. Polovina DNA se použila pro ligaci s adaptérem Marathon a byla použita v následujících reakcích RACE PCR podle protokolu Clontech; 5 μΐ cDNA se přidalo ke 2 μΐ (lOmM) Marathon (5'-CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT), 1 x DNA ligačního pufru a 1 μΐ (1 U) T4 DNA ligázy. Reakční směs se inkubovala přes noc v 16 °C. Směs se naředila 1:50 pro výchozí reakci RACE a v 0,2 ml zkumavce PCR se smísila s následujícími reagenciemi: 40 μΐ dH2O, 1 μΐ 10 x DNA polymerázy Klen taq (Clontech), 1 μΐ (lOmM) primerů API (5'-CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC), 1 μΐ (lOmM) primerů specifického pro BBP1 (odpovídající nukleotidům 187 až 209, obrázek 2, 5'-CCAGACGGCCA GGCGGCCGCC AT), 5 μΐ 10 x pufru pro polymerázu Klentaq, 1 μΐ lOmM směsi dNTP, 1 μΐ naředěné cDNA z výše uvedené reakce. Při použití termocyklovacího přístroje GenAmp PCR System (Perkin Elmer) se provedly cykly v následujících podmínkách: denaturační cyklus 94 °C, 1 minuta, pak 5 cyklů 30 v 94 °C, 3' v 72 °C, 5 cyklů 30 v 94 °C, 3' v 70 °C, následované 25 cykly 30 v 94 °C, 3' v 68 °C, s konečným prodloužením 7' v 72 °C. Potom následovala vložená („nested“) RACE PCR reakce: 40 μΐ dH2O, 1 μΐ (1 U) 10 x DNA polymeráza AmplitaqGold (Perkin Elmer), 1 μΐ (lOmM) primerů AP2 (5'-ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC), 1 μΐ (lOmM) primerů specifického pro BBP1 • · · · (odpovídající nukleotidům 172-194, obrázek 2, 5'-GCCGCCATCT

TGGAGACCGA CAC), 5 μΐ 10 x pufru pro polymerázu Amplitaq, 1 μΐ 10 mM směsi dNTP, 1 μΐ produktu z primární RACE. Cyklovací podmínky pro PCR byly: počáteční denaturační cyklus 9’ v 94 °C, 25 cyklů 30” v 94 °C, 30” v 68 °C, 2' v 72 °C, následováno konečným prodloužením 7' v 72 °C. Produkt PCR byl puštěn na 1% agarózový gel v pufru 1 χ TBE. Výsledný produkt o velikosti 350 párů baží byl purifikován z gelu a přímo klonován při použití soupravy TA Cloning Kit (Invitrogen). Ligační směsi byly transformovány do buněk OneShot (Invitrogen) a vysety na miskách s LB-agarem s ampicilinem (100 μg/ml) obsahujícím X-gal. Minipreparací se izolovala DNA a zkontrolovala se pomocí přímého sekvencování s použitím fluorescenčního dideoxynukleotidového cyklického sekvencování na sekvenačním analyzátoru ABI 373.

Northemové analýzy

Northemové bio ty (membrány) se vzorky mRNA z různých lidských tkání a různých tkání mozku byly získány od firmy Clontech (Palo Alto, CA). Sekvence BBP1 táhnoucí se od původního fúzního spojení po oblast poly-A byly izolovány s pomocí fragmentu EcoRI z klonu TA pocházejícího z pEK196. DNA β-aktinu byla poskytnuta výrobcem. Radioaktivně značené sondy byly vytvořeny z těchto DNA s použitím metody náhodných primerů začleňující ³²P-dCTP (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Hybridizace se prováděly podle instrukcí výrobce (Clontech) v roztoku Express Hyb v 68 °C. Bloty se odmývaly ve 2 x SSC (1 X SSC je 0,15 M chlorid sodný, 0,015 M citrát sodný), 0,05% SDS při teplotě místnosti, pak následovala dvě promytí v 0,1 x SSC, 0,1% SDS v 50 °C. Hybridizační signály se zviditelnily expozicí proti filmu Kodak BioMax.

Hybridizace in šitu

DNA templáty pro syntézu ribosond (RNA sond)) se připravovaly pomocí PCR s použitím plazmidového klonu obsahujícího kompletní cDNA » · · · · «

lidského BBP. Byla použita jedna ribosonda namířená proti 3' UTR z cDNA. Pro ujištění, že sonda ze všech uložených sekvencí rozeznává pouze daný cíl, byly sekvence sondy zkontrolovány proti databázi GenBank. Pro vznik ribosond pro BBP1 byl navržen pár oligonukleotidových primerů tak, aby amplifikoval oblast o velikosti 275 párů baží od 3' UTR z cDNA BBP1, a navíc přidával promotorové sekvence pro polymerázu T7 (sense) a T3 (antisense). Tyto primery obsahovaly následující sekvence: 5'-TAATACGACT CACTATAGGG TTAGAAGAAA CAGATTTGAG (dopřední primer), 5'-ATTAACCCTC ACTAAAGGGA CAAGTGGCAA CTTGCCTTTG (reverzní primer). Produkty PCR byly purifikovány na 1,5% agarózových gelech z agarózy s nízkým bodem tání, a pásy obsahující produkty byly vyříznuty, extrahovány fenolem a fenolchloroformem, a precipitovány etanolem. Pelety byly usušeny a resuspendovány v 1 x TE pufru (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Templát ribosondy APP se skládal z fragmentu Ddel-Xhol z kódující oblasti proteinu, jak popsáno Jacobsenem et al. (1991). 50 ng DNA templátu bylo použito pro transkripční reakce používající (³⁵S)-CTP (New England Nuclear, Boston, MA) a soupravu Riboprobe Gemini™ System (Promega, Madison, WI).

Histochemický postup hybridizace in šitu s použitím posmrtných řezů lidského hippokampu se prováděl tak, jak bylo popsáno dříve (Rhodes, 1996). Řezy o tloušťce 10 pm se řezaly na kryostatu HackerBrights a připevňovaly táním na vychlazená (-20 °C) podložní sklíčka potažená reagencií Vectabond (Vector Labs, Burlingame, CA). Všechny roztoky byly připraveny z dLLO ošetřené 0,1% (objem/objem) dietylpyrokarbonátem a autoklávovány. Řezy se fixovaly ponořením do 4% paraformaldehydu v PBS (pH 7,4) a pak se ponořovaly postupně do 2 x SSC, dLUO a 0,1 M trietanolaminu obsahujícího 0,25% (objem/objem) acetanhydrid, omyly v 0,2 x SSC, dehydrovaly v 50%, 70% a 90% etanolu a rychle usušily. Jeden ml prehybridizačního roztoku obsahujícího 0,9M NaCl, 1 mM EDTA, 5x Denhardtův roztok, 0,25 mg/ml jednovláknové DNA ze spermatu lososů (GIBCO/BRL, Gaithersberg, MD), • ·

50% deionizovaný formamid (EM Sciences, Gibbstown, NJ) v lOmM Tris (pH 7,6), se nanášel pipetou na každé sklíčko a sklíčka se inkubovala 3 hodiny v 50 °C ve zvlhčované krabici. Řezy se pak dehydrovaly ponořením do 50%, 70% a 90% etanolu a usušily na vzduchu. Značené ribosondy se přidaly v konečné koncentraci 50 000 cpm/μΐ do hybridizačního roztoku obsahujícího 0,9 M NaCl, 1 mM EDTA, lx Denhardtův roztok, 0,1 mg/ml kvasinkové tRNA, 0,1 mg/ml jednovláknové DNA lososího spermatu, dextransulfát (10%), 0,08% BSA, 10 mM DTT (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 50% deionizovaný formamid v 10 mM Tris (pH 7,6). Sondy se pak denaturovaly v 95 °C (1 minutu), umístily na ledu (5 minut) a nanášely pipetou na řezy a ponechaly hybridizovat přes noc v 55 °C ve zvlhčované komůrce. Řezy se pak promývaly lx 45 minut ve 37 °C ve 2x SSC obsahujícím 10 mM DTT, pak následovalo lx 30 minut ve 37 °C v lx SSC obsahujícím 50% formamid a lx 30 minut ve 37 °C ve 2x SSC. Jednovláknová a nespecificky hybridizovaná ribosonda byla štěpena ponořením do lOmM Tris pH 8,0 obsahujícího RNázu A bovinního pankreatu (Boehringer Mannheim, 40 mg/ml), 0,5 M NaCl a 1 mM EDTA. Řezy se promývaly 1 hodinu ve 2x SSC v 60 °C, pak 2 hodiny v 0,lx SSC obsahujícím 0,5% (hmotnost/objem) thiosulfát sodný v 60 °C. Řezy se pak dehydrovaly v 50%, 70% a 90% etanolu obsahujícím 0,3M acetát amonný a usušily. Sklíčka se vložila do rentgenových kazet a ponechala 14-30 dnů proti filmu Hyperfilm b-Max (Amersham). Když se získal uspokojivý snímek, sklíčka se pokiyla fotografickou emulzí („nuclear-track emulsion“) (NTB-2, Kodak) a exponovala 7-21 dnů ve 4 °C. Z emulze se vyvolaly autoradiogramy a fixovaly se podle instrukcí výrobce a řezy tkáně ležící pod emulzí se obarvily hematoxylinem. Pro stanovení nespecifického značení se z templátu poskytnutého v soupravě Riboprobe Gemini™ System Kit (Promega) vytvořila kontrolní sonda. Tento vektor se linearizoval za použití Seal a přepsal se s použitím polymerázy T3. Výsledná transkripční reakce dala vznik dvěma produktům, ribosondám o velikosti 250 a 1 525 párů baží, obsahujícím pouze vektorovou sekvenci. Směs s touto kontrolní sondou se značila jak je popsáno výše a přidala se k hybridizačnímu roztoku v konečné koncentraci 50 000 cmp/μΐ. V kontrolních řezech se nepozorovala žádná specifická hybridizace, tj. tyto řezy dávaly velmi slabý rovnoměrný hybridizační signál, který nesledoval neuroanatomické orientační body (data nejsou ukázána).

Příklad 1

Klonování a izolace proteinu vázajícího BAP (BBP1)

Byl vyvinut kvasinkový dvouhybridní (Y2H) genetický filtr pro 'vyhledávání a identifikaci proteinů, které interagují s lidským BAP42, proteolytickým fragmentem APP o 42 aminokyselinách, který je považován za potenciálně toxičtější agregovanou formu BAP. BAP42 byl exprimován fúzovaný ke kvasinkové doméně vázající DNA Gal4 a byl také exprimován jako volný peptid (obrázek 1). Tento kmen byl transformován Y2H knihovnou cDNA mozku lidského fétu. Jeden klon, označený klon 14 definovaný výše, z přibližně 10⁶ nezávislých transformant, produkoval důslednou aktivaci reportérového genu a obsahoval podstatný otevřený čtecí rámec související s rámcem domény GAL4. cDNA inzert obsahoval 984 párů baží, zakončených poly-A úsekem. Tato sekvence kódovala 201 aminokyselin (sekvence id. č. 2, aminokyselinové zbytky 68 až 269) se dvěma oblastmi délky a hydrofobie postačující pro překročení buněčné membrány.

Plazmid získaný z knihovny byl z klonu 14 izolován a použit k rekonstrukci kmenů testu Y2H. Vyšetření těchto kmenů ukázalo, že fůzní protein BAP specificky interaguje s proteinem klonu 14, ačkoliv reakce byla slabá. Protože silně hydrofobní proteinové domény, jako jsou transmembránové oblasti, inhibují reakce Y2H (Ozenberger, nepublikovaná data), byl inzert klonu 14 zkrácen (nadále BBPlAtm), aby se odstranila oblast nej silnější hydrofobie a znovu se testovaly interakce s BAP.

S BBPlAtm (obrázek 2) byla pozorována mnohem silnější reakce Y2H, což podporuje představu, že odstraněné sekvence kódují potenciální transmembránovou („tm“) kotvu. Nukleotidová sekvence klonu 14 byla srovnávána se záznamy v GenBank, ukazuje se, že takto identifikovaný protein vázající BAP (BBP1) je nový.

Příklad 2

Izolace a potvrzení 5' konce BBP1 cDNA sekvence BBP1 obsažené v klonu 14 popsaném v příkladu 1 výše postrádají 5' konec kódující oblasti proteinu, protože není přítomen žádný potenciální iniciační methioninový kodon. Četné pokusy s obvyklou metodou 5' RACE (rychlá amplifikace cDNA konců), která používá standardní reverzní tran skřip tážu, měly za následek pouze přidání 27 nukleotidů. Tyto sekvence obsahovaly ATG, ale ve stejném translačním čtecím rámci nebyl protisměrný stop-kodon pro ujištění, že toto je iniciační kodon. Pro izolaci 5' konce genu BBP1 byl zaveden postup genomového klonování.

Hybridizace lidské genomové knihovny lambda se sondou vzniklou s použitím náhodných primerů, která odpovídala 400 párům baží (bp) z 5' sekvence klonu 14, měla za následek identifikaci 10 pozitivních klonů. Další charakterizace těchto klonů s použitím oligonukleotidové sondy o 45 bazích namířené proti nejvíce protisměrné sekvenci BBP1 klonu 14 (a odpovídající 5' protisměrné sekvenci sondy o 400 párech baží) odhalila, že 6 z těchto 10 klonů obsahovalo koncové 5’ sekvence obsažené v sekvencích identifikovaných již dříve. Bylo zjištěno, že další 4 klony lambda představují jiné exony, které byly obsaženy v původních 400 párech baží sondy odvozené z cDNA a vzniklé s použitím náhodných primerů (data nejsou ukázána). Přímé cyklické sekvencování DNA fágů lambda reprezentativních klonů odpovídajících 5' konci BBP1 odhalilo 500 nukleotidů v protisměru, které se překrývají se sekvencí známou pro klon • ·

14. Tato další sekvence potenciálně kóduje 62 dalších aminokyselin v protisměru od dříve charakterizovaného MET před dosažením MET, kterému předchází stop-kodon v rámci. Ačkoliv existují dva zbytky MET po směru od nej vzdálenějšího protisměrného MET, dle standardní konvence jsme zkusmo definovali sekvenci amino konce lidského genu BBP1 tak, aby zahrnovala první 5’ MET, který následuje v rámci po stop-kodonu. Kompletní kódující oblast a odvozovaná proteinová sekvence je.ukázána v sekvencích i. č. 1 a 2. Plazmid (označený BBPl-fl) obsahující tuto aminokyselinovou sekvenci byl uložen v American Type Culture Collection pod přístupovým číslem ATCC 98617).

Protože 5' kódující sekvence pocházely z genomové knihovny, existovala možnost, že tato oblast obsahuje introny. Tato možnost byla vyšetřována dvěma metodami. Zaprvé, pro amplifikaci sekvencí z mozkové cDNA, a také z genomové DNA, byly použity dopřední primer namířený na oblast 5’ MET a reverzní primer původního klonu 14. Zobou vzorků vznikaly produkty totožné velikosti, což ukazovalo nepřítomnost intronů v této oblasti a potvrdilo vazbu protisměrné sekvence s původní sekvencí. Zadruhé byly izolovány cDNA sekvence v modifikovaných pokusech 5’ RACE (viz Materiál a metody, výše), které byly totožné se sekvencemi získanými z genomového klonu. Tyto nálezy ověřily protisměrné sekvence (jak z genomových, tak cDNA zdrojů) a chybění intronů v této oblasti.

Příklad 3

Charakterizace BBP1

Sekvence BBP1 byly porovnány s GenBank s použitím základního vyhledávacího programu pro lokální porovnávání (BLAST, Altschul et al., 1990). Shodovaly se se dvěma genomovými sekvencemi Caenorhabditis elegans a jednou genomovou sekvencí Drosophila melanogaster a velkým počtem lidských, myších a jiných savčích krátkých exprimovaných markerových sekvencí (expressed sequence tags). Ale nebyly dostupné žádné kompletní cDNA sekvence ani funkční data připisovaná genu. Protein BBP1 a tanslace dostupných krátkých exprimovaných skvencí byly porovnány, prohledány na výskyt konzervativních segmentů a vyhodnoceny pomocí algoritmu na vyhledávání proteinových motivů MoST (Tátusov et al., 1994). Tyto analýzy odhalily možný evoluční vztah k rodině receptorů spojených s G proteinem. Tyto analýzy přesněji ukázaly, že BBP1 obsahuje dvě potenciální transmembránové (tm) domény rovnocenné tm doménám 3 a 4 receptorů spojených s proteinem G. Intervenující hydrofilní smyčka obsahuje dobře charakterizovaný motiv tři aminokyselin, aspartát (D) nebo glutamát následovaný argininem (R) a aromatickým zbytkem (Y nebo F) (obecné nazývané jako sekvence DRY), tento motiv je zachován u téměř všech členů této rodiny receptorů a bylo ukázáno, že slouží jako molekulový spouštěč aktivace proteinu G (Acharya a Kamik, 1996). Tato data ukazují, že BBP1 představuje nový protein potenciálně obsahující funkční modul sdílený s členy velké rodiny receptorů spojených s proteinem G. Přesněji se ukazuje, že BBP1 zachovává kritickou sekvenci DRF mezi dvěma predikovanými tm doménami, takže může mít potenciál pro spojení se signální drahou řízenou proteinem G.

Strukturální analýza BBP1 ukázala, že obsahuje strukturální motiv, o kterém je známo, že je aktivační sekvencí proteinu Ga u příbuzných receptorů spojených s proteinem G. Testy Y2H prokazující interakci BBP1 s různými členy receptorů spojených s proteinem G, jsou ukázány na obrázku 3. Na základě strukturálních předpovědí je BBP1 zobrazen jako dvakrát přestupující membránu s oběma konci v luminálním kompartmentu. Jiné orientace nemohou být úplně vyloučeny. Potenciální proteinové interakce popsané výše byly vyšetřovány v testech Y2H. Dvě překrývající se části sekvencí BBP1 obsažených v klonu BBPlAtm byly amplifikovány a klonovány do Y2H vektoru pACT2 (expresní plazmidy pEK216 a pEK219, tabulka 2 a odpovídající proteiny ΒΒΡ1ΔΝ a BBP1AC, obrázek 4). Konstrukt AC postrádal obě tm domény, konstrukt ΔΝ kódoval • ·

první tm doménu a předcházejících 52 aminokyselin. Tyto fúzní proteiny byly testovány s fúzním proteinem BAP a reakce se srovnávaly s reakcemi kmenů exprimujících větší protein BBPlAtm. Tyto výsledky svědčí pro to, že hlavní determinanta pro asociaci s BAP je obsažena v oblasti BBP1, o které se předpokládá, že je topograficky podobná BAP v divokém typu proteinu APP.

Příklad 4

Tkáňová distribuce exprese lidského BBP1

Byla hodnocena exprese mRNA BBP1 jako počáteční krok v objasnění aktivity genu a jeho produktu. Ve všech tkáních byl pozorován hlavní transkript o velikosti 1,25 kb (obrázek 5A). V srdci byla vysoká hladina exprese. Celý mozek projevoval střední hladinu exprese. Všechny vzorky pocházející z oddělených oblastí mozku projevovaly expresi BBP1 (obrázek 5B). Je zajímavé, že limbické oblasti obsahovaly relativně větší množství mRNA BBP1. Jsou to oblasti mozku, kde nejprve nastává agregace BAP a přidružená neurotoxicita. Analýza autoradiogramů hybridizace in šitu získaných s použitím ribosondy specifické pro BBP1 ukázala, že v lidském hippokampu a entorinálním kortexu je mRNA BBP1 exprimována ve středních až velkých buňkách v rozložení odpovídajícímu expresi v neuronech a v protikladu s rozložením v gliových buňkách (obrázek 6). Kromě toho, mRNA BBP1 je exprimována vlastně ve všech hippokampálních a entorinálních neuronech, tj. neukazují se žádné podstatné nebo laminámí odchylky intenzity hybridizačního signálu. Je zajímavé, že rozložení exprese BBP1 bylo výrazně podobné rozložení pozorovanému při použiti ribosondy namířené proti mRNA prekurzorového proteinu amyloidu APP (obrázek 6). Souhrnně mRNA BBP1 byla pozorována ve všech vyšetřovaných tkáních a všech oblastech mozku. Analýza in sítu exprese mRNA BBP1 také odhalila značnou expresi v oblasti hippokampu.

Příklad 5

Distribuce exprese BBP1 v buněčných liniích

Exprese BBP1 byla také vyšetřována v četných buněčných liniích a byla vytažena data z dbEST, databáze krátkých exprimovaných sekvencí Národního centra pro biotechnologické informace, NCBI. Metody polymerázové řetězové reakce s reverzní polymerázou (RT-PCR) byly použity pro kvalitativní stanovení exprese mRNA BBP1 v buněčných liniích všeobecně používaných pro expresi rekombinantních proteinů, a také v celé řadě karcinomových buněčných linií. BBP1 byl pozorován v křeččích buňkách CHO a lidských buňkách HEK293. Signály byly pozorovány v embryonální kmenové buněčné linii Ntera-2 a neuroblastomových liniích IMR32 a SK-N-SH. Exprese BBP1 byla pozorována v karcinomových buněčných liniích, které pocházely z následujících tkání: tlusté střevo (Cx-1, Colo205, MIP101, SW948, CaCo, SW620, LS174T), ovarií (A2780S, A2780DDP), prsu (MCF-7, SKBr-3, T47-D, B7474), plic (Lx-1, A5439), melanomu (Lox, Skmel30), leukémie (HL60, CEM), prostaty (LNCAP, Dul 45, PC-3). Testování pomocí northemových blotů s mRNA z následujících karcinomových buněčných linií prokázalo expresi BBP1 ve všech vzorcích: promyelocytámí leukémie (HL-60), karcinom (HeLa S3), chronická myeloidní leukémie (K-562), lymfoblastová leukémie (MOLT-4), Burkittův lymfom (Ráji), kolorektální adenokarcinom (SW480), plicní karcinom (A549) a melanom (G361).

Přiklad 6

Selektivní interakce BBP1 s lidským BAP versus BAP hlodavců

Ve srovnání s lidskou sekvencí jsou v sekvenci BAP hlodavců tri aminokyselinové substituce (G5R, F10Y a R13H). Peptid hlodavců • · vykazoval sníženou neurotoxicitu a nevázal se na homogenáty lidského mozku (Maggio et al., 1992). Bylo proto zajímavé vyhodnotit asociaci BAP hlodavců s BBPl v systému Y2H. Sekvence lidského BAP v pEK162 se změnila tak, aby kódovala peptid hlodavců prostřednictvím oligonukleotidem řízené mutageneze pomocí PCR popsané výše. Výsledný plazmid pEK240 byl totožný s expresním plazmidem lidského fúzního proteinu BAP používaným všude v předkládaném vynálezu kromě tří kodonů, ve kterých byly aminokyselinové substituce pro vytvoření sekvence peptidu hlodavců. Interakce mezi fúzním proteinem BBPl a fúzními proteiny BAP hlodavců a lidským BAP byly porovnány pomocí biologického testu Y2H. Kmeny exprimující BBPl a BAP hlodavců nevytvořily růstovou reakci (obrázek 7). Tento nález podporuje předpoklad, že BBPl může sloužit jako specifický mediátor neurotoxických účinků BAP a poskytuje mechanismus pro vysvětlení snížené toxicity BAP hlodavců. Je důležité, že tato data také slouží pro ilustraci vysokého stupně specifičnosti interakce BBP1/BAP v testech Y2H, protože substituce tří aminokyselin byla postačující pro kompletní zrušení asociace (obrázek 7).

Odborníkovi je jasné, že vynález se může v praxi provádět i jinak, než jak je konkrétně popsáno v předchozím popisu a příkladech. Početné modifikace a variace předkládaného vynálezu jsou možné na základě výše uvedeného výkladu, a proto spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

• ·

Citovaná literatura

Acharya, S., and Karnik, S. (1996). Modulation of GDP release from transducin by the conserved Glu134-Arg135 sequence in rhodopsin. J Biol Chem 271, 25406-25411.

Altschul, S., Gish, W., Miller, W., Myers, E., and Lipman, D. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410.

Chartier-Harlin, M., Crawford, F., Houlden, H., Warren, A., Hughes, D., Fidani, L., Goate, A., Rossor, M., Roques, P., Hardy, J., and Mullan, M. (1991). Early-onset AIzheimer's disease caused by mutations at codon 717 of the β-amyloid precursor protein gene. Nátuře 353, 844-846. DuYan, S., Chen, X., Fu, J., Chen, M., Zhu, H., Roher, A., Siattery, T., Zhao, L., Nagashima, M., Morser, J., Migheii, A., Nawroth, P., Stern, D., and Schmidt, A. (1996). RAGE and amyloid-β peptide neurotoxicity in Aizheimer's disease. Nátuře 382, 685-691.

El Khoury, J., Hickman, S., Thomas, C., Cao, L., Silverstein, S., and Loike, J. (1996). Scavenger receptor-mediated adhesion of microglia to βamyloid fibrils. Nátuře 382, 716-719.

Goate, A., Chartier-Harlin, M., Mullan, M., Brown, J., Crawford, F.,

Fidani, L., Giuffra, L., Haynes, A., Irving, N., James, L., Mant, R.,

Newton, P., Rooke, K., Roques, P., Talbot, C., Pericak-Vance, M., Roses, A., Williamson, R., Rossor, M., Owen, M., and Hardy, J. (1991). Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with famiiial Alzheimefs disease. Nátuře 349, 704-706.

Hendriks, L., van Duijn, C., Cras, P., Cruts, M., van Hul, W., van Harskamp, F., Martin, J.-J., Hofman, A., and van Broeckhoven, C.

(1992). Presenile dementia and cerebrai haemorrhage iinked to a mutation at codon 692 of the β-amyloid precursor protein gene. Nat Genet 1, 218221.

Jacobsen, J., Spruyt, M., Brown, A., Sahasrabudhe, S., Blume, A., Vitek, M., Muenkel, H., and Sonnenberg-Reines, J. (1994). The release of

Alzheimer's disease β amyloid peptide is reduced by phorbol treatment. J Biol Chem 269, 8376-8382.

Jacobsen, J, Muenkel, H, Blume, A, and Vitek, M (1991). A novel species-specific RNA related to alternatively spliced amyloid precursor protein mRNAs. Neurobiol of Aging 12, 575-583.

Kang, V.-S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J., and Tipper, D. (1990).

Effects of expression of mammalian Ga and hybrid mammalian-yeast Ga proteins on the yeast pheromone response signál transduction pathway. Mol Cell Biol 10, 2582-2590.

LaFerla, F., Tinkle, B., Bieberich, C., Haudenschild, C., and Jay, G.

(1995). The Alzheimer's Αβ peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice. Nátuře Genetics 9, 21-30. Lassmann, H., Bancher, C., Breitschopf, H., Wegiel, J., Bobinski, M., Jellinger, K., and Wisniewski, H. (1995). Cell death in Alzheimer's disease evaluated by DNA fragmentation in šitu. Acta Neuropathol 89, 35-41. Levý, E., Carman, M., Fernandez-Madrid, I., Power, M., Lieberburg, I., vanDuinen, S., Bots, G., Luyendijk, W., and Frangione, B. (1990). Mutation of the Alzheimer's disease amyloid gene in hereditary cerebral hemorrhage, Dutch type. Science 248, 1124-1126.

Loo, D., Copani, A., Pike, C., Whittemore, E., Walencewicz, A., and Cotman, C. (1993). Apoptosis is induced by β-amyloid in cultured centrál nervous systém neurons. Proč Nati Acad Sci USA 90, 7951-7955. Maggio, J., Stimson, E., Ghilardi, J., Allen, C., Dahl, C., Whitcomb, D., Vigna, S., Vinters, H., Labenski, M., and Mantyh, P. (1992). Reversible in vitro growth of Alzheimer disease b-amyloid plaques by deposition of labeled amyloid peptide. Proč Nati Acad Sci USA 89, 5462-5466.

Mulian, M., Crawford, F., Axelman, K., Houlden, H., Lilius, L., Winblad, W., and Lannfelt, L. (1992). A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the N-terminus of β-amyloid. Nat Genet 1, 345347.

Murrell, J., Farlow, M., Ghetti, B., and Benson, M. (1991). A mutation in the amyloid precursor protein associated with hereditary Alzheimer disease. Science 254, 97-99.

Nishimoto, I., Okamoto, T., Matsuura, Y., Takahashi, S., Okamoto, T., Murayama, Y., and Ogata, E. (1993). Alzheimer amyloid protein precursor complexes with brain GTP-binding protein Go. Nátuře 362, 75-79. Ozenberger, B., and Young, K. (1995). Functional interaction of ligands and receptors of the hematopoietic superfamily in yeast. Mol Endocrinol 9, 1321-1329.

Rhodes K., Monaghan M., Barrezueta N., Nawoschik S., Bekele-Arcuri Z., Matos M., Nakahira K., Schechter L., and Trimmer J. (1996). Voltagegated K+ channel beta subunits: expression and distribution of Kv beta 1 and Kv beta 2 in adult rat brain. J Neurosci 16, 4846-4860.

Scheuner, D., Eckman, C., Jensen, M., Song, X., Citron, M., Suzuki, N., Bird, T., Hardy, J., Hutton, M., Kukull, W., Larson, E., Levy-Lahad, E., Viitanen, M., Peskind, E., Poorkaj, P., Schellenberg, G., Tanzi, FL, Wasco, W., Lannfelt, L., Selkoe, D., and Younkin, S. (1996). AB42{43) is increased in vivo by the PS1/2 and APP mutations iinked to familial Alzheimer's disease. Nat Med 2, 864-870.

Selkoe, D. (1997). Alzheimer's Disease: Genotypes, phenotype, and treatments. Science 275, 630-631.

Smale, G., Nichols, N., Brady, D., Finch, C., and Jr, W. H. (1995). Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer's disease. Exp Neurol 133, 225-230.

Tanzi, R., Gusella, J., Watkins, P., Bruns, G., George-Hyslop, P. S., vanKeuren, M., Patterson, D., Pagan, S., Kurnit, D., and Neve, R. (1987). Amyloid β protein gene: cDNA, mRNA distribution and genetic linkage near the Alzheimer locus. Science 235, 880-884.

Tatusov, R., Altschul, S., and Koonin, E. (1994). Detection of conserved segments in proteins : Iterative scanning of sequence databases with alignment blocks. Proč Nati Acad Sci USA 91, 12091-12095.

• ·

Wade Harper, J., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., and Elledge, S. J. (1993). The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 75, 805-816.

Watt, J., Pike, C., Walencewicz-Wasserman, A., and Cotman, C. (1994). Ultrastructural analysis of β-amyloid-induced apoptosis in cultured hippocampal neurons. Brain Res 661, 147-156.

Yamatsuji, T., Matsui, T., Okamoto, T., Komatsuzaki, K., Takeda, S., Fukumoto, H., Iwatsubo, T., Suzuki, N., Asami-Odaka, A., Ireland, Si, Kinane, T., Giambarella, U., and Nishimoto, I. (1996). G protein-mediated neuronal DNA fragmentation induced by familial Alzheimer's Diseasebinding mutants of APP. Science 272, 1349-1352.

Yan, S., Fu, J., Soto, C., Chen, X., Zhu, H., Al-Mohanna, F., Collison, K., Zhu, A., Stern, E., Saido, T., Tohyama, M., Ogawa, S., Roher, A., and Stern, D. (1997). An intracellular protein that binds amyloid-β peptide and mediates neurotoxicity in Alzheimer's disease. Nátuře 389, 689-695.

• ·

• · · • ·» · · · ·

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 810 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: rnRNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..807 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

ATG CAT ATT TTA

AAA GGG TCT CCC AAT GTG ATT CCA CGG GCT CAC GGG

48

Met His 1

Ile

Leu

Lys 5

Gly

Ser Pro

Asn

Val 10

Ile

Pro

Arg

Ala

His 15

Gly

CAG

AAG

AAC

ACG

CGA

AGA

GAC

GGA

ACT

GGC

CTC

TAT

CCT

ATG

CGA

GGT

96

Gin

Lys

Asn

Thr

Arg

Asp

Gly

Thr

Gly

Leu

Tyr

Pro

Met

Arg

Gly

20

25

30

CCC

TTT

AAG

AAC

CTC

GCC

CTG

TTG

CCC

TTC

TCC

CTC

CCG

CTC

CTG

GGC

144

Pro

Phe

Lys

Asn

Leu

Ala

Leu

Pro

Phe

Ser

Leu

Pro

Leu

Gly

35

40

45

GGA

GGC

GGA

AGC

GGA

AGT

GGC

GAG

AAA

GTG

TCG

GTC

TCC

AAG

ATG

GCG

192

Gly

Gly Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Glu

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Lys

Met

Ala

50

55

60

GCC

TGG

CCG

TCT

GGT

CCG

TCT

GCT

CCG

GAG

GCC

GTG

ACG

GCC

AGA

240

Ala

Trp

Pro

Ser

Gly

Pro

Ser

Ala

Pro

Glu

Ala

Val

Thr

Ala

Arg

65

70

75

80

CTC

GTT

GGT

GTC

CTG

TGG

TTC

GTC

TCA

GTC

ACT

ACA

GGA

CCC

TGG

GGG

288

Leu

Val

Gly

Val

Leu

Trp

Phe

Val

Ser

Val

Thr

Gly

Pro

Trp

Gly

85

90

95

GCT

GTT

GCC

ACC

TCC

GCC

GGG

GGC

GAG

TCG

CTT

AAG

TGC

GAG

GAC

336

Ala

Val

Ala

Thr

Ser

Ala

Gly

Glu

Ser

Leu

Lys

Cys

Glu

Asp

100

105

110

CTC

AAA

GTG

GGA

CAA

TAT

ATT

TGT

AAA

GAT

CCA

AAA

ATA

AAT

GAC

GCT

384

Leu

Lys

Val

Gly

Gin

Tyr

Ile

Cys

Lys

Asp

Pro

Lys

Ile

Asn

Asp

Ala

115 120 125

45

• 9 • • • • · ·

* 9 • · • 9 • · • 99

• < • • · •

• 99 » 9 · * • » • · · • * • 99 9 9 9 9

♦ 9 · » • t> » • « · 9 · « 9 · • « · *9

ACG

CAA

GAA

CCA

GTT

AAC

TGT

ACA

AAC

TAC

ACA

GCT

CAT

GTT

TCC

TGT

432

Thr

Gin

Glu

Pro

Val

Asn

Cys

Thr

Asn

Tyr

Thr

Ala

His

Val

Ser

Cys

130

135

140

TTT

CCA

GCA

CCC

AAC

ATA

ACT

TGT

AAG

GAT

TCC

AGT

GGC

AAT

GAA

ACA

480

Phe

Pro

Ala

Pro

Asn

Ile

Thr

Cys

Lys

Asp

Ser

Gly

Asn

Glu

Thr

145

150

155

160

CAT

TTT

ACT

GGG

AAC

GAA

GTT

GGT

TTT

TTC

AAG

CCC

ATA

TCT

TGC

CGA

528

His

Phe

Thr

Gly

Asn

Glu

Val

Gly

Phe

Lys

Pro

Ile

Ser

Cys

Arg

165

170

175

AAT

GTA

AAT

GGC

TAT

TCC

TAC

AAA

GTG

GCA

GTC

GCA

TTG

TCT

CTT

TTT

576

Asn

Val

Asn

Gly

Tyr

Ser

Tyr

Lys

Val

Ala

Val

Ala

Leu

Ser

Leu

Phe

180

185

190

CTT

GGA

TGG

TTG

GGA

GCA

GAT

CGA

TTT

TAC

CTT

GGA

TAC

CCT

GCT

TTG

624

Leu

Gly

Trp

Leu

Gly

Ala

Asp

Arg

Phe

Tyr

Leu

Gly

Tyr

Pro

Ala

Leu

195

200

205

GGT

TTG

TTA

AAG

TTT

TGC

ACT

GTA

GGG

TTT

TGT

GGA

ATT

GGG

AGC

CTA

672

Gly

Leu

Lys

Phe

Cys

Thr

Val

Gly

Phe

Cys

Gly

Ile

Gly

Ser

Leu

210

215

220

ATT

GAT

TTC

ATT

CTT

ATT

TCA

ATG

CAG

ATT

GTT

GGA

CCT

TCA

GAT

GGA

720

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Ile

Ser

Met

Gin

Ile

Val

Gly

Pro

Ser

Asp

Gly

225

230

235

240

AGT

TAC

ATT

ATA

GAT

TAC

TAT

GGA

ACC

AGA

CTT

ACA

AGA

CTG

AGT

768

Ser

Tyr

Ile

Asp

Tyr

Gly

Thr

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Ser

245

250

255

ATT

ACT ,

AAT

GAA

ACA

TTT ,

AGA

AAA

ACG

CAA

TTA

TAT

CCA

TAA

810

Ile

Thr .

Asn

Glu

Thr

Phe .

Arg

Lys

Thr

Gin

Leu

Tyr

Pro

260

265

• · • » (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 269 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

Met 1

His

Ile Leu Lys Gly Ser Pro Asn Val

Ile

Pro Arg Ala

His 15

Gly

5

10

Gin

Lys

Asn

Thr

Arg

Asp

Gly

Thr

Gly

Leu

Tyr

Pro

Met

Arg

Gly

20

25

30

Pro

Phe

Lys

Asn

Leu

Ala

Leu

Pro

Phe

Ser

Leu

Pro

Leu

Gly

35

40

45

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Glu

Lys

Val

Ser

Val

Ser

Lys

Met

Ala

50

55

60

Ala

Trp

Pro

Ser

Gly

Pro

Ser

Ala

Pro

Glu

Ala

Val

Thr

Ala

Arg

65

70

75

80

Leu

Val

Gly

Val

Leu

Trp

Phe

Val

Ser

Val

Thr

Gly

Pro

Trp

Gly

85

90

95

Ala

Val

Ala

Thr

Ser

Ala

Gly

Glu

Ser

Leu

Lys

Cys

Glu

Asp

100

105

110

Leu

Lys

Val

Gly

Gin

Tyr

Ile

Cys

Lys

Asp

Pro

Lys

Ile

Asn

Asp

Ala

115

120

125

Thr

Gin

Glu

Pro

Val

Asn

Cys

Thr

Asn

Tyr

Thr

Ala

His

Val

Ser

Cys

130

135

14 0

Phe

Pro

Ala

Pro

Asn

Ile

Thr

Cys

Lys

Asp

Ser

Gly

Asn

Glu

Thr

145

150

155

160

His

Phe

Thr

Gly

Asn

Glu

Val

Gly

Phe

Lys

Pro

Ile

Ser

Cys

Arg

165

170

175

Asn Val Asn Gly Tyr Ser Tyr Lys Val Ala Val Ala Leu Ser Leu Phe 180 185 190 ·· ·· φ · * · • · · • ··· * * » • ••φ *·

Leu Gly Trp Leu Gly Ala Asp Arg Phe Tyr Leu Gly Tyr Pro Ala Leu 195 200 205

Gly Leu Leu Lys Phe Cys Thr Val Gly Phe Cys Gly Ile Gly Ser Leu 210 215 220

Ile Asp Phe Ile Leu Ile Ser Met Gin Ile Val Gly Pro Ser Asp Gly

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Ile Ile Asp Tyr Tyr Gly Thr Arg Leu Thr Arg Leu Ser

245 250 255

Ile Thr Asn Glu Thr Phe Arg Lys Thr Gin Leu Tyr Pro

Claims

1. Izolovaný polynukleotid vybraný ze skupiny obsahující;

a) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci identifikačního čísla 1 (i. č. 1),

b) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP) klonu BBPl-fl uloženého pod přístupovým číslem ATCC 98617,

d) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci od nukleotidu 202 po nukleotid 807 ze sekvence i. č. 1,

g) polynukleotid kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci i. č. 2,

h) polynukleotid kódující protein obsahující fragment aminokyselinové sekvence i. č. 2, který má vazebnou aktivitu pro lidský β-amyloidový peptid, přičemž fragment obsahuje aminokyselinovou sekvenci od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269 ze sekvence i. č. 2,

j) polynukleotid, kteiý je alelickou variantou polynukleotidu z bodů

a) až f) uvedených výše,

k) polynukleotid, který kóduje druhový homolog proteinu z bodů g) až h) uvedených výše, a

1) polynukleotid, který je schopný hybridizovat za stringentních podmínek s každým z polynukleotidů vymezených v bodech a) až h).

2. Polynukleotid podle nároku 1, který je operativně spojen s alespoň jednou expresní kontrolní sekvencí.

3. Hostitelská buňka transformovaná polynukleotidem podle nároku 2.

4. Hostitelská buňka podle nároku 3, kde buňka je prokaryotická nebo eukaiyotická buňka.

5. Způsob produkce proteinu kódovaného polynukleotidem podle nároku 2 vyznačující se tím, že obsahuje kroky

a) pěstování tkáňové kultury hostitelské buňky podle nároku 3 ve vhodném kultivačním médiu, a

b) purifikace proteinu z kultivačního média.

6. Protein připravený způsobem podle nároku 5.

7. Protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z:

a) aminokyselinové sekvence i. č. 2,

b) aminokyselinové sekvence od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269 ze sekvence i. č. 2,

• · • · * · • · ·

8. Protein podle nároku 7, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze sekvence id. č. 2.

9. Fúzní protein, který obsahuje BBPl spojený s heterologní proteinovou nebo peptidovou sekvencí.

10. Fúzní protein podle nároku 9 kde BBPl má aminokyselinovou sekvenci i. č. 2.

11. Oligonukleotid, který kóduje antisense sekvenci komplementární k části sekvence BBPl se sekvencí i. č. 1, a který inhibuje expresi genu BBPl.

12. Způsob určování polynukleotidu kódujícího protein vázající β-amyloidový peptid (BBP) ve vzorku vyznačující se tím, že obsahuje kroky

a) hybridizace vzorku se sondou specifickou pro uvedený polynukleotid v podmínkách pro uvedenou sondu efektivních tak, aby hybridizovala specificky s uvedeným polynukleotidem, a

b) vyšetření hybridizace uvedené sondy s polynukleotidy ve vzorku, kdy uvedená sonda obsahuje sekvenci nukleové kyseliny mající oblast 20 nebo více párů baží alespoň z 90 % totožnou s polynukleotidovou sekvencí

i. č. 1.

13. Způsob určování polynukleotidu kódujícího protein vázající β-amyloidový peptid (BBP) ve vzorku vyznačující se tím, že obsahuje kroky

b) vyšetření hybridizace uvedené sondy s polynukleotidy ve vzorku, kdy uvedená sonda obsahuje sekvenci nukleové kyseliny mající oblast 20 nebo více párů baží alespoň z 90 % totožnou s polynukleotidovou sekvencí inzertu cDNA z ATCC 98617 nebo ATCC 98399.

14. Protilátka, která se specificky váže na polypeptid obsahující oblast sekvence alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí

i. č. 2.

15. Protilátka, která se specificky váže na polypeptid obsahující oblast sekvence alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP) kódovanou inzertem cDNA z ATCC 98617.

16. Způsob detekce polypeptidu obsahujícího oblast alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí i. č. 2 ve vzorku vyznačující se t í m, že obsahuje kroky

a) inkubace vzorku s reagencií, která se váže specificky k uvedenému polypeptidu v podmínkách účinných pro specifickou vazbu, a

b) vyšetření vazby reagencie k polypeptidu ve vzorku.

17. Způsob detekce polypeptidu obsahujícího oblast sekvence alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí proteinu vázajícího β-amyloidový peptid (BBP) kódovanou inzertem cDNA z ATCC 98617, vyznačující se tím, že obsahuje kroky

b) vyšetření vazby reagencie k polypeptidu ve vzorku.

18. Způsob diagnostikování nemoci charakterizované aberantní expresí lidského β-amyloidového peptidu (BAP) vyznačující se t í m, že obsahuje kroky

a) inkubace vzorku podezřelého z aberantní exprese lidského β-amyloidového peptidu s reagencií obsahující polypeptid, který obsahuje oblast alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí i. č. 2 v podmínkách účinných pro specifickou vazbu reagencie s lidským β-amyloidovým peptidem, a

b) vyšetření vazby reagencie k peptidu ve vzorku.

19. Způsob diagnostikování nemoci charakterizované aberantní expresí lidského β-amyloidového peptidu vyznačující se tím, že obsahuje

a) inkubaci vzorku podezřelého z aberantní exprese lidského β-amyloidového peptidu s reagencií obsahující polypeptid obsahující oblast alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí proteinu vázajícího β-amyloidový peptid kódovanou inzertem cDNA zATCC 98617 v podmínkách účinných pro specifickou vazbu reagencie s lidským β-amyloidovým peptidem, a

b) vyšetření vazby reagencie k peptidu ve vzorku.

20. Diagnostický způsob vyznačující se tím, že tento způsob obsahuje analýzu výskytu polynukleotidu podle nároku 1 ve vzorku pocházejícího z hostitele.

21. Způsob identifikace sloučenin, které regulují aktivitu proteinu vázajícího β-amyloidový peptid, vyznačující se tím, že obsahuje

a) inkubaci vzorku obsahujícího lidský β-amyloidový peptid v testovacím médiu obsahujícím testovanou sloučeninu a reagencií obsahující polypeptid, kteiý obsahuje oblast alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí i. č. 2 v podmínkách účinných pro specifickou vazbu reagencie s lidským β-amyloidovým peptidem, a

b) porovnání vazby reagencie k peptidu ve vzorku v přítomnosti a nepřítomnosti testované sloučeniny, a • · ·

c) vztažení odlišnosti mezi vazbou v kroku b) k testované sloučenině regulující aktivitu proteinu vázajícího β-amyloidový peptid.

22. Způsob identifikace sloučenin, které regulují aktivitu proteinu vázajícího β-amyloidový peptid, vyznačující se tím, že obsahuje

a) inkubaci vzorku obsahujícího lidský β-amyloidový peptid v testovacím médiu obsahujícím testovanou sloučeninu a reagencii obsahující polypeptid, který obsahuje oblast alespoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvencí proteinu vázajícího peptid β-amyloid kódovanou inzertem cDNA z ATCC 98317 v podmínkách účinných pro specifickou vazbu reagencie s lidským β-amyloidovým peptidem, a

b) porovnání vazby reagencie k peptidu ve vzorku v přítomnosti a nepřítomnosti testované sloučeniny, a

23. Způsob léční pacienta, který potřebuje inhibovat akumulaci β-amyloidového peptidu v mozku, vyznačující se tím, že obsahuje podávání léčebně účinné množství polypeptidů podle nároku 7 pacientovi.

24. Transgenní nebo chimérické zvíře, které obsahuje polynukleotid podle nároku 2.