SK143299A3 - BETA-AMYLOID PEPTIDE-BINDING PROTEINS AND POLYNUCLEOTIDESì (54) ENCODING THE SAME - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nových polynukleotidov a proteínov, ktoré sú týmito polynukleotidmi kódované, a tiež liečebného, diagnostického a výskumného využitia týchto polynukleotidov a proteínov. Vynález sa osobitne týka polynukleotidov a proteínov kódovaných takými polynukleotidmi, ktoré sa viažu na β-amyloidový peptid, jednu z primárnych zložiek amyloidových depozit sprevádzajúcich Alzheimerovu chorobu.

Doterajší stav techniky

Alzheimerova choroba (AD) je progresívna demencia pokročilejšieho veku, pre ktorú je charakteristický rad štrukturálnych abnormalít mozgu. Neuróny v početných oblastiach centrálneho nervového systému (CNS) sa stávajú nefunkčné a odumierajú, čo má za následok zmeny na synaptických vstupoch. Bunkové telá a proximálne dendrity týchto zraniteľných neurónov obsahujú neurofibrilárnu sieť zloženú zo spojených špirálovitých filamentov, ktorých hlavnou zložkou je fosforylovaný proteín viažuci mikrotubuly, a to najmä tau. Jedným z charakteristických rysov choroby je akumulácia depozitov obsahujúcich amyloid v mozgu, ktoré sa nazývajú senilné (alebo neuritické) pláty. Hlavnou zložkou amyloidových plátov je β-amyloidový peptid (dalej nazývaný skrátene BAP, v literatúre tiež uvádzaný ako Αβ, βΑΡ apod.), ktorý tvorí počas AD denzné agregáty.

BAP je peptid s 39-43 aminokyselinami vznikajúci proteolytickým štiepením z proteínového prekurzoru amyloidu (dalej nazývaný ako APP) a zložený z časti transmembránovej domény a luminálnej/extracelulárnej domény APP. Predpokladá sa, že peptid BAP obsahujúci 42 aminokyselín (BAP42) je pre človeka potenciálne viac toxická agregovaná forma. APP sa vyskytuje ako izoforma obsahujúca niekoľko BAP. Hlavné formy sa skladajú z 695, 751 a 770 aminokyselín, pričom dva posledne uvedené APP obsahujú doménu, ktorá má štrukturálne a funkčné homológie s inhibítormi Kunitzovej serínovej proteázy. U normálnych jedincov sa BAP neakumuluje a je rýchlo odstraňovaný z cirkulujúcich tekutín. Ale peptid môže tvoriť pláty na povrchu dystrofických dendritov a axónov, mikroglií a reaktívnych astrocytov. Predpokladá sa, že agregácia a depozícia (ukladanie) BAP v neuritických plátoch je jeden z javov, ktoré spúšťajú AD. Štúdium javov vedúcich k expresii a významu BAP a jeho individuálnej úlohe u AD je hlavné ohnisko neurologického výskumu. Objav proteínov, ktoré viažu BAP, je osobitne kľúčový pre pokrok v porozumení patogenézy choroby a pre možné zavádzanie nových liečebných cieľov. Až do predložení tohto vynálezu neboli identifikované proteíny a ich fragmenty, ktoré sa viažu k ľudskému BAP, a ktoré sa podieľajú na biologických účinkoch BAP pri AD.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje nové izolované polynukleotidy, ktoré kódujú génové produkty, ktoré selektívne viažu aminokyselinové sekvencie ľudského peptidu β-amyloidu (BAP).

V jednom uskutočnení poskytuje predkladaný vynález prípravok obsahujúci izolovaný polynukleotid vybraný zo skupiny obsahujúcej :

a) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia s identifikačným číslom 1 (id. č. 1),

b) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617,

c) polynukleotid kódujúci proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) kódovaný cDNA inzertom klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617,

d) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zo sekvencie id. č. 1 od nukleotidu 202 po nukleotid 807,

e) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) klonu pEK196 uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98399,

f) polynukleotid kódujúci proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) kódovaný cDNA inzertom klonu pEK196 uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98399,

g) polynukleotid kódujúci proteín obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu tu uvedenú ako sekvencia id. č. 2,

h) polynukleotid kódujúci proteín obsahujúci fragment aminokyselinovej sekvencie zo sekvencie id. č. 2, ktorý má väzbovú aktivitu pre ludský β-amyloidový peptid, fragment zahŕňajúci aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269 zo sekvencie id. č. 2,

i) polynukleotid, ktorý je alelickým variantom polynukleotidu z bodov a) až f) uvedených hore,

j) polynukleotid, ktorý kóduje druhový homológ proteínu z bodov g) až i) uvedených hore, a

k) polynukleotid, ktorý je schopný hybridizovať za stringentných podmienok s každým z polynukleotidov vymedzených v bodoch a) až h).

Tieto polynukleotidy výhodne zahŕňajú nukleotidovú sekvenciu uvedenú tu ako sekvencia s identifikačným číslom 1, nukleotidovú sekvenciu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617, alebo polynukleotidu kódujúceho proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) kódovaného cDNA inzertom klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617. Ďalšie rozpracovanie poskytuje gén zodpovedajúci cDNA sekvencii id. č. 1.

V ďalších uskutočneniach poskytuje predkladaný vynález prípravok obsahujúci proteín, pričom uvedený proteín obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z:

a) aminokyselinovej sekvencie uvedenej tu ako sekvencia id. č. 2,

b) aminokyselinovej sekvencie zo sekvencie id. č. 2 od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269,

c) aminokyselinovej sekvencie kódovanej cDNA inzertom klonu BPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617, a

d) fragmentov aminokyselinovej sekvencie id. č. 2 obsahujúcej aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 185 po aminokyselinu 217 zo sekvencie id. č. 2.

Výhodne tieto proteíny obsahujú aminokyselinovú sekvenciu s identifikačným číslom 2 alebo aminokyselinovú sekvenciu zo sekvencie id. č. 2 od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269. Fúzne proteíny sú tiež nárokované v predkladanom vynáleze.

V určitých výhodných uskutočneniach je polynukleotid operatívne spojený s expresnou kontrolnou sekvenciou. Vynález tiež poskytuje hostitelskú bunku, vrátane bakteriálnych, kvasinkových, hmyzích a cicavčích buniek, transformovaných týmito polynukleotidovými prípravkami.

Vynález tiež poskytuje spôsoby produkcie BBP, ktoré zahŕňajú;

a) pestovanie kultúry hostiteíských buniek podía patentového nároku 3 vo vhodnom kultivačnom médie, a

b) purifikáciu proteínu z kultivačného média.

Predkladaný vynález poskytuje tiež prípravky obsahujúce protilátku, ktorá špecificky reaguje s týmito BBP.

Sú poskytnuté spôsoby a diagnostické postupy na detekciu chorobného stavu charakterizovaného odchylnou expresiou ľudského BAP, a tiež spôsoby identifikácie zlúčenín, ktoré regulujú aktivitu BBP.

Ďalšie rozpracovanie vynálezu zahŕňa transgénne zvieratá obsahujúce polynukleotid kódujúci BBP operatívne spojený s expresnou kontrolnou sekvenciou.

Prehľad obrázkov

Nasledujúce obrázky zobrazujú len určité rozpracovania vynálezu. Sú iba ilustratívne a nijak neobmedzujú tu opisovaný vynález.

Obrázok 1: Schéma kvasinkového dvojhybridného testu. Hostiteľský kmeň Y2H exprimujúci doménu viažucu DNA Gal4 fúzovanú k BAP₄₂ (BAPBD, plazmid obsahujúci značku TRPÍ) a nefúzovaný BAP₄₂ (BAP, plazmid obsahujúci značku URA3) bol transformovaný s cDNA knižnicou mozgu ľudského fétu v Y2H (plazmid obsahujúci značku LEU2) exprimujúci fúzne proteíny aktivačnej domény Gal4 (neznám^⁰), ako je opísané. Kmene obsahovali tri epizomálne plazmidy, označené krúžkami, exprimujúce uvedený proteín. Pozitívne interakcie proteín-proteín rekonštituovali aktivitu Gal4 v protismere od aktivačnej sekvencie (GALUAS), a tým indukovali transkripciu reportérového génu HIS3.

Obrázok 2: Dôkaz asociácie BBP1/BAP. Kmene Y2H sa testovali na histidínovú prototrofiu tvorením desatinného sériového riedenia a kvapkaním 5 μΐ na syntetický agar, v ktorom chýbal tryptofán, leucín, histidín a ktorý obsahoval 25 mM 3-amino-triazol, ako je opísané. Všetky kmene obsahovali expresný plazmid pEK162 s fúznym proteínom BAP, ako vyznačené popisom BAP. Prvé stĺpce (vektor) obsahujú nezávisle odvodené kmene nesúce pEK162 a vektor pACT2 exprimujúci irelevantný fúzny proteín. Tie slúžia ako miera pozadia na porovnanie s kmeňmi exprimujúcimi cieíové proteíny. Stĺpce označené BBPIDtm vyjadrujú skrátený BBP1 z pEK198, ako je opísané v texte. Interakcia medzi fúznymi proteínmi BAP a BBPIDtm rekonštituuje aktivitu Gal4, čo má za následok indukciu reportérového génu HIS3 (pozri obrázok

1), pozorovanú ako zvýšený prototrofický rast v porovnaní s kontrolnými kmeňmi.

Obrázok 3: Biologické testy demonštrujúce interakciu BBP1 s proteínmi G. Predikovaná intracelulárna doména BBP1 bola exprimovaná ako doména viažuca DNA Gal4 s časťami potkaních Gas, Gao alebo Gai2 exprimovanými ako fúzne proteíny aktivačnej domény Gal4. Reakcia Y2H dvoch nezávisle odvodených klonov každého kmeňa sa porovnávali s reakciami buniek postrádajúcich zložku proteín G (vektor). Protokol je rovnaký ako v legende k obrázku 2.

Obrázok 4: Lokalizácia interakcií medzi BBP1 a BAP. BBPlAtm bol rozdelený na dva prekrývajúce sa segmenty, ako je opísané v texte. Tieto proteíny, BBP1AC a BBP1ÔN, sa testovali na interakcie s BAP. Testovacia metóda a kmene označené vektor alebo BBPlAtm sú ako v legende k obrázku 2. Kmene značené BBPlác alebo ΒΒΡ1ΔΝ exprimujú označený segment BBP1 ako fúzny proteín.

Obrázok 5: Expresia mRNA BBP1 v ľudských tkanivách (A) a oblastiach mozgu (B). Nylonové membrány s 2 pg prenesenej poly-A RNA izolovanej z uvedených tkanív, rozdelené podía veľkosti, boli získané od firmy CLONTECH. Membrány sa hybridizovali s rádioaktívne značenou cDNA BBP1 sondou, ako je opísané. Vo všetkých dráhach bol pozorovaný prevládajúci pás zodpovedajúci veľkosti 1,25 kb (určené podľa štandardu molekulovej hmotnosti, neukázané). Pásy s vyššou molekulovou hmotnosťou pravdeΊ podobne zodpovedajú heteronukleárnej RNA, gén BBP1 obsahuje niekoľko intrónov. Z blotov sa odstránila sonda a hybridizovali sa opäť s β-aktínom ako kontrolou neporušenosti a množstva

RNA, všetky dráhy vykázali rovnocenný signál (údaje nie sú uvedené).

Obrázok 6: Expresia BBP1 a APP v bunkách hippokampu. Snímky autorádiogramov hybridizácie in situ ukazujúce typ expresie BBP1 (A) a APP (B) v ľudskom hippokampe a entor iná Inom kortexe. Rezy použité na vytvorenie týchto snímkov boli odobrané z posmrtných vzoriek získaných od dvoch rôznych pacientov. Skratky: DG = gyrus dentatum, CA1 = oblasť hippokampu, EC = entorinálny kortex.

Obrázok 7: Porovnanie interakcií BBP1 s ľudským BAP alebo BAP hlodavcov. BAP hlodavcov bol skonštruovaný a exprimovaný ako fúzny proteín, ako je opísané v texte. Kmene označené ľudský BAP sú totožné s kmeňmi ukázanými na obrázku 2. Kmene označené BAP hlodavcov exprimujú BAP hlodavcov ako fúziu domény viažucej DNA Gal4. Vektor označuje kontrolné kmene obsahujúce iba vektor oproti fúznym proteínom BAP, BBP1 označuje kmene exprimujúce fúzny proteín BBPlátm.

Detailný opis vynálezu

Predkladaný vynález sa týka izolácie a klonovania ľudského proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP1). BBP1 bol v kvasinkovom dvojhybridnom teste charakterizovaný ako fúzny proteín, ktorý sa viaže k fragmentu s 42 aminokyselinami z BAP (BAP₄₂). Expresia BBP1 bola preukázaná v ľudských tkanivách a v špecifických oblastiach mozgu (pozri obrázok 5). Je dôležité, že bolo preukázané, že BBP1 selektívne viaže ľudský BAP v kvasinkovom dvojhybridnom systému na rozdiel od BAP hlodavcov. Tieto nálezy podporujú predpoklad, že BBP1 podľa predkladaného vynálezu môže byt použitý v diagnóze a liečení

Alzheimerovej choroby, a tiež na hodnotenie a testovanie liečiv na reguláciu hromadenia plátov obsahujúcich amyloid v mozgu.

Sekvencie kódujúce BBP1

Východiskový kloň ľudského BBP1 (označený ako kloň 14) bol získaný použitím kvasinkového dvojhybridného (Y2H) genetického filtru vyvinutého na identifikáciu proteínov, ktoré interagujú s ľudským BAP₄₂, potenciálne toxickejšou formou BAP. BAP₄₂ bol exprimovaný fúzovaný s DNA viažucou doménou kvasinkového génu Gal4 a bol tiež exprimovaný ako voľný peptid (obrázok 1). Tento kmeň bol transformovaný s Y2H knižnicou cDNA z mozgu ľudského fétu. Jeden kloň, označený č. 14, z približne 10⁶ nezávislých transformantov, poskytoval konzistentnú aktiváciu reportérového génu a obsahoval otvorený čítací rámec súvisiaci s rámcom domény GAL4. cDNA inzert obsahoval 984 párov báz, zakončených úsekom poly-A. Táto sekvencia kódovala 201 aminokyselín (aminokyselina 68 až aminokyselina 269 zo sekvencie id. č. 2) s dvoma oblasťami, ktorých dĺžka a hydrofóbnost postačuje na prekročenie bunkovej membrány. Sú tu tiež potenciálne glykozylačné miesta spojené s asparagínom. Kloň 14 bol označený ako kloň pEK196 a uložený ako ATCC 98399.

Plazmid získaný z knižnice bol z klonu 14 izolovaný a použitý na rekonštrukciu kmeňov testu Y2H. Vyšetrenie týchto kmeňov ukázalo, že fúzny proteín BAP špecificky interaguje s proteínom klonu 14, hoci reakcia bola slabá. Pretože silne hydrofóbne proteínové domény, ako sú transmembránové oblasti, inhibujú reakcie Y2H (Ozenberger, nepublikované údaje), bol inzert klonu 14 skrátený (BBP1 tm, pozri tabuľku 2 ďalej na ďalší opis), aby sa odstránila oblasť najsilnejšej hydrofóbie a opäť sa testovali interakcie s BAP. S BBP1 tm bola pozorovaná oveľa silnejšia reakcia Y2H, čo podporuje predstavu, že odstránené sekvencie kódujú potenciálnu transmembránovú (tm) kotvu. Kloň 14 identifikuje nový proteín viažuci BAP vo forme fúzneho proteínu.

Ukázalo sa, že sekvencie cDNA BBP1 obsiahnuté v klone 14 postrádajú 5' koniec kódujúcej oblasti proteínu, pretože nie je prítomný žiadny potenciálny iniciačný metionínový kodón. Početné pokusy s obvyklou metódou 5’ RAČE (rýchla amplifikácia cDNA koncov), ktorá používa štandardnú reverznú transkriptázu, mali za následok len pridanie 27 nukleotidov. Preto bol na izoláciu 5' konca použitý postup genómového klonovania, ako je opísané v príklade 2 ďalej·

Pretože sekvencia kódujúca 5' koniec pochádzala z genómovej knižnice, existovala možnosť, že táto oblasť obsahuje intróny. Táto možnosť bola vyšetrovaná dvoma metódami, ako je opísané v príklade 2 ďalej. Výsledné údaje potvrdili sekvencie v protismere (ako genómové, tak z cDNA) a neprítomnosť intrónov v tejto oblasti. Plazmid BBPl-fl obsahujúci inzert cDNA kódujúci kompletnú kódujúcu oblasť proteínu BBP1 bol uložený v Americkej zbierke mikroorganizmov (American Type Culture Collection, ATCC) pod prístupovým číslom 98617. Kompletná kódujúca oblasť a odvodená proteínová sekvencia sú ukázané v sekvenciách id. č. 1 a 2. Netranslatované nukleotidové sekvencie 3' sú obsiahnuté v pôvodnom klone 14 (pEK196).

Podľa predkladaného vynálezu môžu byt použité nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú BBP1, fragmenty, fúzne proteíny alebo ich funkčné ekvivalenty, na produkciu rekombinantných molekúl DNA, ktoré riadia expresu BBP1 alebo funkčne aktívneho peptidu v príslušných hostiteľských bunkách. Alebo môžu byt na hybridizácie nukleových kyselín, na Southern a northern analýzy apod., použité nukleotidové sekvencie, ktoré hybridizujú s časťami sekvencie BBP1.

Vynález tiež zahŕňa polynukleotidy so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám polynukleotidov tu opísaných. Predkladaný vynález tiež zahŕňa polynukleotidy schopné hybridizovat v menej stringentných podmienkach, výhodne v stringentných podmienkach a najvýhodnejšie vo vysoko stringentných podmienkach, s polynukleotidmi tu opísanými. Príklady stringentných podmienok sú ukázané v tabuľke ďalej, vysoko stringentné podmienky sú tie, ktoré sú stringentné aspoň ako napríklad podmienky A- až F, stringentné podmienky sú tie, ktoré sú stringentné aspoň ako napríklad podmienky G až L, a slabo stringentné podmienky sú tie, ktoré sú stringentné aspoň ako napríklad podmienky M až R.

Stringentné podmienky

Stringentné podmienky	Polynukleotidový hybrid	Dĺžka hybridu (bp)'	Hybridizačná teplota a tlmivý roztok“	Teplota na odmývanie a tlmivý roztok“
A	DNA: DNA	50	65 °C; lxSSC alebo 42 °C; lxSSC, 50% formamid	65°C; 0,3xSSC
B	DNA:DNA	<50	TB*; lxSSC	TB*; lxSSC
C	DNA:RNA	50	67°C; lxSSC alebo 45°C; lxSSC, 50% formamid	67°C; 0,3xSSC
D	DNA:RNA	<50	TD*; lxSSC	TD*; lxSSC
E	RNA:RNA	50	65°C; lxSSC alebo 42°C; lxSSC, 50% formamid	70°C; 0,3xSSC
F	RNA:RNA	<50	TF*; lxSSC	TF*J lxSSC
G	DNAiDNA	50	65°C;4xSSC alebo 42°C; 4xSSC, 50% formamid	65°C; lxSSC
H	DNAiDNA	<50	TH*;4xSSC	Th*;4xSSC
I	DNAiRNA	50	67°C;4xSSC alebo 45°C; 4xSSC, 50% formamid	67°C; lxSSC
J	DNAiRNA	<50	Tj*;4xSSC	Tj*;4xSSC
K	RNAiRNA	50	70°C;4xSSC alebo 50°C; 4xSSC, 50% formamid	67°C; lxSSC
L	RNAiRNA	<50	Tl*;2xSSC	Tl*;2xSSC
M	DNAiDNA	50	50°C;4xSSC alebo 40°C; 6xSSC, 50% formamid	50°C; 2xSSC

N	DNA:DNA	<50	Tn*;6xSSC	Tn*;6xSSC
O	DNA:RNA	50	55°C;4xSSC alebo 42°C; 6xSSC, 50% formamid	55’C; 2xSSC
P	DNA:RNA	<50	TP*;6xSSC	Tp*;6xSSC
Q	RNA:RNA	50	60°C;4xSSC alebo 45°C; 6xSSC, 50% formamid	60°C; 2xSSC
R	RNA:RNA	<50	Tr*;6xSSC	Tr*;6xSSC

Dĺžka hybridu je dĺžka, ktorá je očakávaná pre hybridizovanú oblastí i) hybridižujúcich polynukleotidov. Keď sa hybridizuje polynukleotid s cieíovým polynukleotidom neznámej sekvencie, predpokladá sa, že dĺžka hybridu je rovnaká ako dĺžka hybridižujúceho polynukleotidu. Keď sa hybridižujú polynukleotidy známej sekvencie, dĺžka hybridu môže byt určená porovnaním sekvencií polynukleotidov a určením oblasti alebo oblastí optimálnou komplementaritou sekvencií.

: SSPE (lxSSPE je 0,15 M NaCl, 10 mM NaH^PO., a 1,25 mM EDTA, pH 7,4) môže byt nahradené SSC (lxSSC je 0,15 M NaCl a 15 mM citrát sodný) v hybridizačných a premývacích tlmivých roztokoch, premytia sa uskutočňujú 15 minút po dokončení hybridizácie. *

Tg - T_R: hybridizačná teplota pre hybridy, pri ktorých sa čaká, že budú kratšie ako 50 párov báz, by mala byt o 5-10°C menšia ako teplota topenia T_ hybridu, kde T_m je určená podía nasledujúcich rovníc. Pre hybridy kratšie ako 18 párov báz - T_(’C) = 2(počet báz A+T) + 4(počet báz G+C). Pre hybridy s dĺžkou medzi 18 a 49 pármi báz - T_m(°C) = 81,5 + 16,6(log₁₀ [Na⁺]) + 0,4l(%G+C) - (600/N), kde N je počet báz v hybride, a [Na^] je koncentrácia sodných iónov v hybridizačnom tlmivom roztoku ([Na⁺] pre lxSSC = 0,165 M).

Ďalšie príklady stringentných podmienok na hybridizáciu polynukleotidov sú poskytnuté v: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, kapitoly 9 a 11, a Ausubel, F.M. et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., oddiely 2.10 a 6.3-6.4, zahrnuté v odkazoch.

Každý taký hybridizujúci polynukleotid je výhodne dlhý tak, že je aspoň z 25 % (výhodnejšie aspoň z 50 % a najvýhodnejšie aspoň zo 75 %) dlhý ako polynukleotid predkladaného vynálezu, s ktorým hybridizuje, a má z aspoň 60 % totožnú sekvenciu (výhodnejšie z aspoň 75 %, najvýhodnejšie z aspoň 90 % alebo 95 %) s polynukleotidom predkladaného vynálezu, s ktorým hybridizuje, pričom identita sekvencií je určená porovnaním sekvencií hybridižujúcich polynukleotidov, keď sú porovnané tak, aby sa maximalizovalo prekrývanie a totožnosť a súčasne minimalizovali rozdiely v sekvencií.

Expresia BBP1

Izolovaný polynukleotid podľa vynálezu môže byť operatívne spojený s expresnou kontrolnou sekvenciou, ako sú expresné vektory pMT2 alebo pED odhalené v práci Kaufman et al. (Nucleic Acids Res., 19, 4485-4490, 1991), aby produkovali rekombinantne proteín. V odbore je známe veľa vhodných expresných kontrolných sekvencií. Všeobecné metódy expresie rekombinantných proteínov sú tiež známe a sú doložené príkladmi v práci Kaufman, R. (Methods in Enzymology, 185, 537-566, 1990). Ako je tu definované, operatívne spojený znamená, že izolovaný polynukleotid vynálezu a expresné kontrolné sekvencie sú lokalizované vo vektore alebo v bunke tak, že proteín je exprimovaný hostiteľskou bunkou, ktorá bola transformovaná (transfekovaná) ligovanou sekvenciou polynukleotid/expresná kontrolná sekvencia.

Expresný systém pre BBP1

Na expresiu proteínu môže ako vhodná hostiteľská bunka slúžiť veľké množstvo typov buniek. Cicavčie hostiteľské bunky zahŕňajú napríklad opičie bunky COS, bunky ovárií čínskeho chrčka (CHO), bunky 293 ľudských obličiek, ľudské epidermálne bunky Ά431, ľudské bunky Colo205, bunky 3T3, bunky CV-1, ďalšie transformované bunkové línie primátov, normálne diploidné bunky, bunkové kmene pochádzajúce z in vitro kultúr primárnych tkanív, primárne explantáty, bunky HeLa, myšie L bunky, bunky BHK, HL-60, U937, HaK alebo Jurkat.

Alebo je možné produkovať proteín v nižších eukaryotoch, ako sú kvasinky, alebo v prokaryotoch, ako sú baktérie. Možné vhodné kmene kvasiniek zahŕňajú Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, kmene Kluyveromyces, Candida alebo akýkoľvek kmeň kvasiniek schopný exprimovat heterologné proteíny. Možné vhodné kmene baktérií zahŕňajú Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, alebo akýkoľvek kmeň baktérií schopný exprimovat heterologné proteíny. Rečí je proteín tvorený v kvasinkách alebo baktériách, môže byt na získanie funkčného proteínu nezbytné takto produkovaný proteín modifikovať, napríklad fosforyláciou alebo glykozyláciou príslušných miest. Také kovalentné väzby sa môžu vykonať pri použití známych chemických alebo enzýmových metód.

Proteín môže byt takisto tvorený operatívnym spojením izolovaného polynukleotidu vynálezu s vhodnými kontrolnými sekvenciami v jednom alebo viacerých hmyzích expresných vektoroch a použitím hmyzieho expresného systému. Materiály a metódy pre expresné systémy bakulovírus/hmyzia bunka sú komerčne dostupné ako súprava, napr. od firmy Invitrogen, San Diego, Kalifornia, U.S.A. (kit MaxBac7) a tieto metódy sú v odbore dobre známe, ako je opísané v práci Summers a Smith (Texas Agricultural Experiment Station Bulletin č. 1555, 1987), zahrnutej v odkazoch. Podľa terminológie ako sa tu používa, hmyzia bunka schopná exprimovat polynukleotid predkladaného vynálezu je transformovaná.

Proteín podľa vynálezu môže byt pripravený pestovaním transformovaných hostiteľských buniek v kultivačných podmienkach vhodných na expresiu rekombinantného proteínu. Výsledný exprimovaný proteín je potom z takej kultúry purifikovaný (tzn. z tkanivového média alebo bunkových extraktov) pri použití známych purifikačných postupov, ako je gélová filtrácia a iónomeničová chromatografia. Purifikácia proteínu môže tiež zahŕňať použitie afinitnej kolóny obsahujúcej agens, ktorá sa viažu na proteín, jedno alebo viac použití kolóny s takými afinitnými živicami, ako sú konkavalin A-agaróza, heparin-toyopearl7 alebo Cibacrom blue 3GA Sepharose7, jeden alebo viac krokov zahŕňajúcich chromatografiu s hydrofóbnou interakciou pri použití takých živíc, ako sú fenyléter, butyléter alebo propyléter, alebo imunoafinitná chromatografie.

Proteín podľa vynálezu môže byt eventuálne tiež exprimovaný vo forme uľahčujúcej purifikáciu. Napríklad môže byt exprimovaný ako fúzny proteín, ako proteín viažuci maltózu (MBP), glutatión-S-transferázu (GST) alebo tioredoxín (TRX). Súpravy na expresiu a purifikáciu takých fúznych proteínov sú komerčne dostupné od firiem New England BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ) a InVitrogen. Na proteín môže byt tiež pripojený epitop a proteín potom môže byt purifikovaný pri použití špecifickej protilátky namierenej proti tomuto epitopu. Jeden taký epitop (Flag) je komerčne dostupný od firmy Kodak (New Haven, CT).

Konečne na dalšiu purifikáciu proteínu môže byt použitý jeden alebo viac zákrokov vysoko účinnou kvapalinovou chromatograf iou s reverznou fázou (RP-HPLC) používajúcich hydrofóbne RP-HPLC médiá, napr. silikagél, ktorý má naviazané metylové alebo iné alifatické skupiny. Niektoré alebo všetky predchádzajúce purifikačné zákroky v rôznych kombináciách môžu byt tiež použité na získanie v podstate homogénneho izolovaného rekombinantného proteínu. Takto purifikovaný proteín je v podstate bez iných cicavčích proteínov a podľa predkladaného vynálezu je definovaný ako izolovaný proteín.

Proteín podľa vynálezu môže byt tiež exprimovaný ako produkt transgénnych zvierat, napr. ako zložka mlieka transgénnych kráv, kôz, ošípaných alebo oviec, ktoré sa vyznačujú tým, že ich somatické alebo zárodočné bunky obsahujú nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín.

Proteín môže byt tiež tvorený známou konvenčnou chemickou syntézou. Spôsoby konštrukcie proteínov predkladaného vynálezu syntetickou cestou sú odborníkom známe. Synteticky konštruované proteínové sekvencie tým, že majú spoločnú primárnu, sekundárnu alebo terciárnu štruktúru a/alebo konformačné vlastnosti s proteínmi, si môžu podržat spoločné biologické schopnosti, vrátane proteínovej aktivity. Môžu byt teda použité ako biologicky aktívne alebo imunologické náhražky prirodzených purifikovaných proteínov na screening terapeutických zlúčenín a v imunologických postupoch na tvorbu protilátok.

Proteíny podľa vynálezu tiež zahŕňajú proteíny, pre ktoré sú charakteristické aminokyselinové sekvencie podobné sekvenciám purifikovaných proteínov, ale ku ktorým sa vyskytujú modifikácie prirodzené alebo vytvorené zámerne. Odborníkom môžu byt vytvorené pri použití známych techník napríklad modifikácie peptidových sekvencií alebo sekvencií DNA. Požadované modi fikácie proteínových sekvencií môžu zahŕňat alterácie, substitúcie, náhrady, inzercie alebo delécie vybraného aminokyselinového zvyšku v kódujúcej sekvencií. Napríklad, aby sa zmenila konformácia molekuly, môže byt jeden alebo viac cysteínových zvyškov odstránených alebo nahradených inou aminokyselinou. Techniky takých alterácií substitúcií, náhrad, inzercií alebo delécií sú odborníkovi dobre známe (pozri napr. patent US 4 518 584). Výhodne tieto alterácie, substitúcie, náhrady, inzercie alebo delécie ponechávajú žiadúcu aktivitu proteínu.

Ďalšie fragmenty a deriváty sekvencií proteínov, od ktorých by sa očakávalo zachovanie úplnej alebo čiastočnej aktivity proteínu a ktoré by teda mohli byť použiteľné na screening alebo iné imunologické metódy, môžu byť tiež ľahko vytvorené odborníkom na základe predkladaného vynálezu. Preto sa usudzuje, že tieto modifikácie sú takisto obsiahnuté v predkladanom vynáleze.

Kvasinkové dvojhybridné testy

Y2H testy preukázali, že asociácia BAP s fúznym proteínom BBP1 je špecifická. Asociácia BBP1 s BAP svedči o tom, že aktivita BBP1 môže mat definovanú úlohu v patogenéze Alzheimerovej choroby.

Sekvencie BBP1 boli porovnané so sekvenciami z Genbank pri použití základného vyhľadávacieho programu na miestne porovnanie (BLAST, Altschul et al., 1990). Proteín BBP1 a translácie dostupných krátkych exprimovaných markérových sekvencií (expressed sequence tags) boli porovnané, prezerané na výskyt konzervatívnych segmentov a vyhodnotené pomocou algoritmu na vyhľadávanie proteínových motívov MoST (Tatusov et al., 1994). Tieto analýzy odhalili možný evolučný vzťah k rodine receptorov spojených s proteínom G (GPCR). Tieto analýzy presnejšie ukázali, že BBP1 obsahuje dve potenciálne transmembránové (tm) domény rovnocenné tm doménam 3 a 4 receptorov spojených s proteínom G. Intervenujúca hydrofilná slučka obsahuje dobre charakterizovaný motív troch aminokyselín, aspartát (D) alebo glutamát nasledovaný arginínom (R) a aromatickým zvyškom (Y alebo F) (všeobecne nazývaný ako sekvencia DRY), tento motív je zachovaný pri takmer všetkých členoch tejto rodiny receptorov a bolo ukázané, že slúži ako molekulový spúšťač aktivácie proteínu G (Acharya a Karnik, 1996).

Údaje z testov Y2H (pozri obrázky 2-4) ukazujú, že BBP1 predstavuje nový proteín potenciálne obsahujúci funkčný modul spoločný s členmi velkej rodiny receptorov spojených s proteínom G. Presnejšie sa ukazuje, že BBP1 zachováva kritickú sekvenciu DRF (aminokyseliny 199 až aminokyseliny 201 zo sekvencie id. č. 2), medzi dvoma predikovanými tm doménami, a môže mať potenciál pre spojenie so signálnou drahou riadenou proteínom G.

Bolo tiež ukázané, že APP funkčne asociuje s Gao (Nishimoto et al., 1993, Yamatsuji et al., 1996) a BBP1 obsahuje štrukturálny motív, o ktorom je známe, že je aktivačnou sekvenciou proteínu Ga pri príbuzných receptoroch spojených s proteínom G. Navyše, hypotéza založená na predikovanej pozícii a orientácii tm domény BBP1 svedčí o tom, že oblast proteínu, ktorá interaguje s BAP je topograficky obmedzená do rovnakej lokalizácie ako BAP pri APP.

Kmene na test Y2H boli konštruované na vyhodnotenie asociácie intracelulárnej oblasti BBP1 s proteínmi Ga. Predikované intracelulárne sekvencie BBP1 boli exprimované ako fúzny proteín a testované na interakcie s C-koncovými oblasťami troch proteínov Ga. Proteínové segmenty použité v týchto pokusoch sú uvedené v zozname v tabulke 2, d'alej. Intracelulárna slučka BBP1 interagovala s všetkými tromi proteínmi Ga (obrázok 3), čo podporovalo predpoklad, že BBP1 môže pôsobiť ako modulátor aktivity proteínu G. Tieto rôzne testy Y2H napovedajú spletitý model zloženého proteínového komplexu tvoreného minimálne úplnými membránovými proteínmi BBP1 a APP pripojenými k heterotrimerickému proteínu G.

Tabuľka 2

Plazmidy použité v kvasinkových dvoj hybridných testoch

Expresný plazmid	Proteín	Segment
	BAP
pEK162	(ľudský)	1-42
pEK240	(myší)	1-42
	BBP1
pEK196	(kloň 14)	68-269
pEK198	(Atm)	68-202
pEK219	(AC)	68-175
pEK216	(AN)	123-202
pOZ339	(intracelulámy)	185-217
	Ga
pOZ345	(Gas)	235-394
pOZ346	(Gao)	161-302
pOZ348	(Gai2)	213-355

Ďalšia analýza BBP1 bola získaná pri použití testov Y2H. Dve prekrývajúce sa časti sekvencie BBP1 obsiahnutej v klone BBP1 tm boli amplifikované a klonované do Y2H vektoru pACT2 (expresné plazmidy pEK216 a pEK219, tabuľka 2 a zodpovedajúce proteíny ΒΒΡ1ΔΝ a BBPlAC, (obrázok 4)). Konštrukt AC postrádal obidve tm domény, konštrukt ΔΝ kódoval prvú tm doménu a predchádzajúcich 52 aminokyselín. Tieto fúzne proteíny boli testované s fúznym proteínom BAP a reakcie sa porovnávali s reakciami kmeňov exprimujúcich väčší proteín BBPlAtm. Proteín BBP1ÁC vyvolal slabú reakciu Y2H (porovnaj BBPlAC s vektorom, obrázok 4), ale proteín ΒΒΡ1ΔΝ obsahujúci prvú tm doménu a susedné amino-proximálne sekvencie produkoval reakciu len o málo slabšiu ako bola reakcia pozorovaná pri BBP1 tm (obrázok 4). Tieto výsledky svedčia o tom, že hlavný determinant pre asociáciu s BAP je obsiahnutý v oblasti BBP1, o ktorej sa predpokladá, že je topograficky podobná BAP v divokom typu proteínu APP.

Systém Y2H bol použitý na dôkaz selektívnosti a špecific kosti BBP1 viažuceho sa na ludský BAP, v porovnaní s BAP hlodavcov. V sekvencii BAP hlodavcov sú tri aminokyselinové substitúcie (G55R, F10Y a R13H) v porovnaní s ludskou sekvenciou V teste Y2H opísanom v príklade 6 peptid hlodavcov vykazuje zníženú neurotoxickost a neprítomnosť väzby na homogenáty ľud ského mozgu (Maggio et al., 1992). Bolo preto žiadúce vyhodno tiť asociáciu BAP hlodavcov s BBP1 v systému Y2H. Sekvencia ľudského BAP v pEK162 bola zmenená, aby kódovala peptid hlodavcov prostredníctvom oligonukleotidom riadenej mutagenézy s pomocou PCR. Výsledný plazmid, pEK240, je totožný s expresným plazmidom ľudského BAP fúzneho proteínu používaného všade v tejto publikácii okrem troch kodónov tvoriacich aminokyselinové substitúcie v sekvencii peptidu hlodavcov. Interakcie medzi fúznym proteínom BBP1 a ľudským fúznym proteínom BAP a fúznym proteínom BAP hlodavcov boli porovnané v biologickom teste Y2H. Kmene exprimujúce BBP1 a BAP hlodavcov nereagovali rastom (obrázok 7). Tento nález podporuje predpoklad, že BBP1 môže slúžiť ako špecifický mediátor neurotoxického účinku BAP a poskytuje mechanizmus vysvetľujúci zníženú neurotoxickost BAP hlodavcov. Je dôležité, že tieto údaje tiež slúžia na ilustráciu vysokého stupňa špecifickosti interakcie BBP1/BAP v testoch Y2H, pretože substitúcia troch aminokyselín bola postačujúca na úplné zrušenie asociácie (obrázok 7).

Izolované polypeptidy BBP1

Proteíny a proteínové fragmenty predkladaného vynálezu zahŕňajú proteíny s aminokyselinovou sekvenciou dlhou tak, že je aspoň z 25 % (výhodnejšie aspoň z 50 % a najvýhodnejšie aspoň zo 75 %) dlhá ako opísaný proteín, a má aspoň z 60 % totožnú sekvenciu (výhodnejšie aspoň z 75 %, najvýhodnejšie aspoň z 90 % alebo 95 %) s opisovaným proteínom, pričom identita sekvencií je určená porovnaním aminokyselinových sekvencií proteínov, kečf sú porovnané tak, aby sa maximalizovalo prekrývanie a totožnosť a súčasne minimalizovali rozdiely v sekvencii. V predkladanom vynáleze sú tiež obsiahnuté proteíny a proteínové fragmenty, ktoré obsahujú segment skladajúci sa výhodne z 8 alebo viac (výhodnejšie z 20 alebo viac, najvýhodnejšie z 30 alebo viac) susedných aminokyselín, ktoré majú aspoň zo 75 % identickú sekvenciu (výhodnejšie aspoň z 85 %, najvýhodnejšie aspoň z 95 %) s ktorýmkoľvek takým segmentom každého z opisovaných proteínov.

Predkladaný vynález tiež poskytuje druhové homológy opisovaných polynukleotidov a proteínov. Ako sa tu používa, druhový homológ je proteín alebo polynukleotid pôvodom z odlišného druhu ako je pôvod daného proteínu alebo polynukleotidu, ale s významnou podobnosťou sekvencií s daným proteínom alebo polynukleotidom. Polynukleotidové druhové homológy majú výhodne z aspoň 60 % totožnú sekvenciu (výhodnejšie aspoň zo 75 %, najvýhodnejšie aspoň z 90 %) s daným polynukleotidom, a proteínové druhové homológy majú výhodne aspoň z 30 % totožnú sekvenciu (výhodnejšie aspoň z 45 %, najvýhodnejšie aspoň z 60 %) s daným proteínom, pričom identita sekvencií je určená porovnaním nukleotidových sekvencií polynukleotidov alebo aminokyselinových sekvencií proteínov, kedf sú porovnané tak, aby sa maximalizovalo prekrývanie a totožnosť a súčasne minimalizovali rozdiely v sekvencii. Druhové homológy môžu byt izolované a rozpoznávané vytvorením vhodných sond alebo prajmerov zo sekvencií tu poskytnutých a testovaním vhodného zdroja nukleových kyselín požadovaných druhov, výhodne sú druhové homológy izolované z druhov cicavcov. Výhodnejšie sú druhové homológy izolované z určitých druhov cicavcov, ako sú napríklad Pan troglodytes, Gorilia gorilia, Pongo pygmaeus, Hylobates concolor, Macaca mulatta, Papio papio, Papio hamadryas, Cerco22 pithecus aethiops, Cebus capucinus, Aotus trivirgatus, Sanguinus oedipus, Microcebus murinus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Cricetulus griseus, Felis catus, Mustela vison, Canis familiaris, Oryctolagus cuniculus, Bos taurus, Ovis aries, Sus scrofa, a Eguus caballus, pre ktoré boli vytvorené genetické mapy umožňujúce identifikáciu syntenného vzťahu medzi genómovou organizáciou génov pri jednom druhu a genómovou organizáciou príbuzných génov pri inom druhu (O'Brien a Seuanez, Ann. Rev. Genet., 22, 323-351, 1988, O'Brien et al., Náture Genetics, 3, 103-112, 1993, Johansson et al., Genomics, 25, 682-690, 1995, Lyons et al., Náture Genetics, 15, 47-56,

1997, O'Brien et al., Trends in Genetics, 13(10), 393-399, Carver a Stubbs, Genome Research, 7, 1123-1137, 1997).

Vynález tiež obsahuje alelické varianty opisovaných polynukleotidov alebo proteínov, tzn. prirodzene sa vyskytujúce alternatívne formy izolovaných polynukleotidov, ktoré tiež kódujú proteíny, ktoré sú totožné alebo majú významne podobné sekvencie s proteínmi kódovanými opisovanými polynukleotidmi. Alelické varianty majú výhodne z aspoň 60 % totožnú sekvenciu (výhodnejšie z aspoň 75 %, najvýhodnejšie z aspoň 90 %) s daným polynukleotidom, pričom identita sekvencií je určená porovnaním nukleotidových sekvencií polynukleotidiov, keď sú porovnané tak, aby sa maximalizovalo prekrývanie a totožnosť a súčasne minimalizovali rozdiely v sekvencií. Alelické varianty môžu byť izolované a rozpoznávané vytvorením vhodných sond alebo prajmerov zo sekvencií tu poskytnutých a testovaním vhodného zdroja nukleových kyselín jedincov príslušných druhov.

Vynález tiež zahŕňa polynukleotidy so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám polynukleotidov tu opisovaných.

Aplikácia

Proteíny BBP1 predkladaného vynálezu môžu byť na základe tohto vynálezu použité v celom rade aplikácií, ktoré sú pre odborníka bežné. Presnejšie BBP môžu byť použité ako imunogény na vytvorenie protilátok, ktoré sú špecifické pre klonované polypeptidy. Na tvorbu protilátok proti proteínom BBP1 môžu byť použité rôzne postupy v odbore známe. Také protilátky zahŕňajú, ale nie sú na nich obmedzené, monoklonálne, polyklonálne, chimerické, jednoreťazcové protilátky, fragmenty Fab a Fab expresnú knižnicu. Na produkciu protilátok sa rôznym hostiteľským zvieratám vrátane (ale bez obmedzenia) králikov, myší a potkanov, podávajú injekcie BBP. V jednom rozpracovaní je polypeptid alebo fragment polypeptidu so schopnosťou špecifickej imunoaktivity konjugovaný s imunogénnym nosičom. Na zvýšenie imunologickej reakcie hostiteľského zvieraťa môžu byť tiež v spojení s polypeptidom podávané adjuvansy. Príklady adjuvansov, ktoré môžu byt použité, zahŕňajú (ale nie sú na nich obmedzené) kompletné a nekompletné Freundovo adjuvans, minerálne gély ako je hydroxid hlinitý, povrchovo aktívne látky ako je lyzolecitín, polyoly Pluronic, polyanióny, peptidy, olejové emulzie, hemocyanin z prílipky a dinitrofenol.

Monoklonálne protilátky k proteínom BBP1 predkladaného vynálezu môžu byt pripravené pri použití každého postupu, ktorý zaistí produkciu protilátok nepretržitou bunkovou líniou v tkanivovej kultúre. Tieto postupy sú odborníkom dobre známe a zahŕňajú (ale nie sú na nich obmedzené) technológiu hybridómu pôvodne opísanú Kohlerom a Milsteinom (Náture, 256, 4202497, 1975), metódu hybridómu ľudských B buniek opísanú Kosborom et al. (Immunology Today, 4, 72, 1983) a metódu EBVhybridómu opísanú Colom et al. (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96).

Protilátky imunoreaktívne na polypeptidy predkladaného vynálezu môžu byť potom použité na testovanie výskytu a subcelulárnej distribúcie podobných polypeptidov v biologických vzorkách. Okrem toho monoklonálne protilátky špecifické pre proteíny BBP1 predkladaného vynálezu môžu byť použité ako liečivá.

Proteíny BBP1 môžu tiež slúžiť ako antigény použiteľné v testoch s pevnou fázou meriacich prítomnosť protilátok, ktoré imunologický reagujú s nárokovanými peptidmi. Kompetitívne testy s pevnou fázou môžu byt použité na meranie imunologických množstiev antigénu majúceho vzťah ku klonu 14 v biologických vzorkách. Toto určovanie nie je použiteľné iba na uľahčenie kompletnej charakterizácie bunkovej funkcie alebo funkcií polypeptidov predkladaného vynálezu, ale môže byt tiež použité na identifikáciu pacientov s abnormálnym množstvom týchto proteínov.

Proteíny BBP1 predkladaného vynálezu môžu byť tiež použité ako záchytové reagencie v afinitnej chromatografii na detekciu BAP a BAP agregátov ako markéry pre AD.

Okrem toho sú BBP1 užitočné ako reagencie v teste na identifikáciu kandidátových molekúl, ktoré uskutočňujú interakciu BAP a klonovaného proteínu. Zlúčeniny, ktoré špecificky blokujú túto asociáciu by mohli byt použiteľné v liečení alebo prevencii AD.

BBP1 sú tiež použiteľné v bezbunkových in vitro väzbových testoch, kde sa určuje alterácia väzby proteínov združených s β-amyloidovým peptidom k BAP alebo BAP agregátom určitou zlúčeninou. Bezbunkové testy sú mimoriadne užitočné pri screeningu pomerne veľkého počtu zlúčenín, pretože tieto testy sú efektívne vzhľadom na vynaložené náklady a pri uskutočňovaní sú ľahšie ako testy používajúce živé bunky. Po opise po25 lypeptidov podľa predkladaného vynálezu je vývoj týchto testov pre odborníka rutinný. V týchto testoch je označený buď BBP1 alebo BAP. Tieto značky zahŕňajú (ale nie sú na nich obmedzené) rádioaktívne značenia, protilátky a fluorescenčné alebo

I ultrafialové značky. Väzba BBP1 na BAP alebo BAP agregáty sa najskôr určuje v neprítomnosti testovanej zlúčeniny. Potom sa do testu pridajú testované zlúčeniny, aby sa určilo, či táto zlúčenina zmení sledovanú interakciu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález je ďalej opísaný formou nasledujúcich príkladov. Príklady slúžia iba na ilustráciu vynálezu a demonštrujú výhodné uskutočnenia vynálezu. Tieto výhodné uskutočnenia, hoci ilustrujú určité špecifické aspekty vynálezu, nepredstavujú žiadne obmedzenia vynálezu ani nevymedzujú rozsah vynálezu.

Kvasinkový dvojhybridný systém (ďalej Y2H)

Y2H expresné plazmidy boli konštruované vo vektoroch pAS2 a pACT2 (opísané WadeHarper et al., 1993) a pCUP (opísané Ozenberger a Young, 1995). Kvasinkový kmeň CY770 (Ozenberger a Young, 1995) slúžil ako hostiteľ pre všetky testy Y2H.

Genetický filter

Metóda polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) bola použitá na amplifikáciu a modifikáciu sekvencií kódujúcich BAP. Oligonukleotidy č. 1 (5'- CC ATG GAT GCA GAA TTC CGA C) a č. 3 (5'-AAGCTTGTCGAC TTA CGC TATGAC AAC ACC GC) boli použité na amplifikáciu BAP pri použití pCLL621, modifikovaného ľudského klonu APP (Jacobsen et al., 1994) ako templátu. Amplifikovaná DNA sa skladala z kodónov 389 až 430 (ktoré kódujú BAP₄₂) ^z prekurzorového proteínu APP s nasledujúcimi modifikáciami.

Prajmer pre sense vlákno pridával 5' Ncol reštrikčné miesto do rovnakého translačného čítacieho rámca ako je miesto Ncol v pAS2. Prajmer pre antisense vlákno pridával stop kodón a miesta HindlII a Sali pre klonovanie. Produkt z tejto amplifikácie bol ligovaný do TA klonovacieho systému (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) a potom odstránený štiepením s Ncol a Sali. Tento fragment bol klonovaný do pAS2 štiepeného Ncol a Sali. Výsledný plazmid pEK162 bol overený sekvenovaním DNA cez spojenie GAL4/BAP. Proteín (BAP^BD, obrázok 1) exprimovaný z pEKI62 obsahoval fúzny proteín obsahujúci doménu viažucu DNA z kvasinkového transkripčného aktivačného proteínu Gal4 (postrádajúci funkčné aktivačné sekvencie) s pridaním 42 aminokyselín z BAP ku karboxy koncu. Bol vyvinutý expresný plazmid, ktorý sprostredkováva expresiu nemodifikovaného BAP₄₂· Oligonukleotid Č. 2 (5 ’-AAGCTTAAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA C) bol spárovaný s oligonukleotidom č. 3 v PCR, ako je opísané hore. Produkt tejto amplifikácie obsahoval 5' miesto HindlII a translačné iniciačné signály optimalizované na expresiu v Saccharomyces cerevisiae.

DNA fragment bol opäť klonovaný do systému TA. Potom bol izolovaný ako fragment HindlII a klonovaný do pCUP štiepeného s HindlII. Orientácia génu BAP vo výslednom plazmide pEK149 (BAP, obrázok 1) bola overená sekvenovaním DNA. Expresia BAP plazmidov pEK149 (ktorý používa ako selekčnú značku URA3) a pEK162 (ktorý používa ako selekčnú značku TRPÍ) boli transformované do kvasinkového hostiteľa CY770 (Ozenberger a Young, 1995). Kmeň obsahujúci obidva plazmidy bol nazvaný CY2091. Od Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) bola zakúpená plazmidová knižnica skladajúca sa z cDNA fragmentov izolovaných z ľudského fetálneho mozgu klonovaných do kvasinkového dvojhybridného expresného vektoru pACT2 (ktorý používa ako selekčnú značku LEU2). Proteín pochádzajúci z knižnice je na obrázku 1 označený ako neznámy. Táto knižnica bola použitá na transformáciu CY2091. Vzorky boli rozptýlené na syntetickom kompletnom (SC) kvasinkovom rastovom médie bez uracilu, tryptofánu a leucínu, aby sa vybrali bunky obsahujúce všetky tri plazmidy. V médie tiež nebol histidín a obsahovalo 3-aminotriazol, inhibítor produktu kvasinkového génu HIS3 v koncentrácii 25 mM. 3-amino-triazol bol použitý na redukciu aktivity konštitutívnej expresie nízkej úrovne reportérového génu HIS3. Doštičky sa inkubovali v 30°C 12 dní. Bolo izolovaných 24 kolónií, ktoré prejavovali zvýšenú histidínovú prototrofii. Transformačné kontroly ukázali, že filtrom prešlo 10⁶ jednotlivých klonov. Na rýchle určenie obsahu pozitívnych klonov bol použitý prístup pomocou PCR. Z každého pozitívneho kmeňa bola štandardnými metódami izolovaná celková DNA. Tento materiál bol použitý ako templát na PCR pri použití oligonukleotidov č. 4 (5'-TTTAATACCA CTACAATGGA T) a č. 5 (5'-TTTTCAGTAT CTACGATTCA T), ktoré ohraničujú klonovaciu oblasť vektoru knižnici pACT2. DNA fragmenty boli ligované do systému TA a prešetrované sekvenovaním DNA. Plazmid knižnici obsiahnutý v klone č. 14 (ako je opísané hore) bol izolovaný po prenose do E. coli. Určila sa nukleotidová sekvencia ľudských cDNA sekvencií, čo overilo sekvenciu východiskového produktu PCR.

Biologické testy

Kmene boli pestované cez noc v 2 ml média SC, v ktorom chýbal leucín a tryptofán, do hustoty približne 7xl0⁷ buniek na ml. Bunky sa zrátali a sterilnou vodou sa nariedila séria desiatkového riedenia od 10⁴ po 10⁸ buniek na ml. Tieto vzorky sa nakvapkali po 5 μΐ na médium SC, v ktorom chýbal tryptofán, leucín a histidín a ktoré obsahovalo 25 mM 3-amino-triazol. Doštičky sa inkubovali 2 až 3 dni v 30’C. Pozitívne interakcie proteín/proteín sa rozpoznávali podľa zvýšeného prototrofického rastu v porovnaní s kontrolnými kmeňmi exprimujúcimi fúzny proteín domény viažucej DNA Gal4 a fúzny proteín irelevantnej transkripčnej aktivačnej domény (alebo jednoducho obsahujúci vektor pACT bez vložených sekvencií). Tieto kontrolné kmene boli označené na obrázkoch opísaných hore označením vektor”. Táto testovacia metóda bola vysoko reprodukovateľná a zaistila detekciu aj malej indukcie rastu sprostredkovanej špecifickou interakciou medzi cieľovými proteínmi. Pôvodný kloň BBP1, označený pEK196 a uložený ako ATCC 98399 (nazývaný tu ako kloň 14), bol použitý ako PCR templát na skrátenie proteínového produktu na expresiu BBPlňtm. Sense prajmer č. 6 (5¹— TTTAATACCA CTACAATGGA T) nasadol na sekvencie GAL4 v pACT2. Antisense prajmer Č. 7 (CTCGAG TTA AAA TCG ATC TGC TCC CAA CC) vložil 3' stop-kodón a miesto Xhol bezprostredne 3' k sekvenciám kódujúcim motív DRF z BBP1. Produkt PCR bol ligovaný do klonovacieho vektoru TA a potom štiepený s EcoRl + Xhol a klonovaný do pACT2. Hybridný produkt exprimovaný týmto plazmidom (pEK198) bol označený BBPlÄtm. Podobne bol prajmer č. 7 párovaný s prajmerom č. 8 (5'-GAATT CCA AAA ATA AAT GAC GCT ACG) na konštrukciu BBPIÔn expresného plazmidu pEK216. Produkt PCR bol opát ligovaný do systému TA a výsledný plazmid štiepený EcoRl +

Xhol s fragmentom BBP1 (kodóny 123-202) bol konečne ligovaný do pACT2 štiepeného rovnakými enzýmami. BBPIÄC bol vytvorený použitím oligonukleotidu špecifického pre pACT2 č. 6 s antisense oligonukleotidom č. 9 (5'- CTCGAG TCA AGA TAT GGG CTT GAA AAA AC). Po klonovaní TA, izolácii fragmentu EcoRI-Xhol a klonovaní do pACT2, exprimoval výsledný plazmid pEK219 BBP1 od zvyšku 68 do 175. Sekvencie kódujúce BBP1 intracelulárnu slučku boli amplifikované pri použití oligonukleotidov č. 10 (5’—CCTTCC ATG GAA GTG GCA GTC GCA TTG TCT) a č. 11 (5'AACACTCGAG TCA AAA CCC TAC AGT GCA AAA C) . Tento produkt obsahujúci BBP1 kodóny 185 až 217 bol štiepený Ncol + Xhol a klonovaný do pAS2 štiepeného Ncol + Sali za vzniku pOZ339. Konštrukcia všetkých expresných plazmidov pre proteíny Ga používala miesto BamHI blízko stredu každej potkanej cDNA sekvencie (Kang et al., 1990), ako miesto fúzie v pACT2. Sense prajmery nasadli na sekvencie 5' od miesta BamHI, antisense prajmery nasadli na sekvencie 3' od stop-kodónu a zahŕňali reštrikčné miesto Sali. Prajmery boli: Gao, sense (č. 17) = 5'

-GTGGATCCAC TGCTTCGAGG AT, antisense (Č. 18) = 5’- GTCGACGGTT GCTATACAGG ACAAGAGG, Gas, sense (Č. 19) = 5'-GTGGATCCAG TGCTTCAATG AT, antisense (Č. 20) = 5'-GTCGACTAAA TTTGGGCGTT CCCTTCTT, Gai2, sense (č. 21) = 5'-GTGGATCCAC TGCTTTGAGG GT, antisense (č. 22) =

5'-GTCGACGGTC TTCTTGCCCC CATCTTCC. Produkty PCR boli klonované do vektoru TA. Sekvencie G boli izolované ako fragmenty BamHISall a klonované do pACT2 štiepeného s BamHI + Sali. Pozri tabuľku 2 s označením plazmidov. Nakoniec bol syntetizovaný oligonukleotid č. 23 na konverziu ľudského BAP na sekvenciu hlodavcov. Prajmer mal sekvenciu 5'-ATATGGCCATG GAT GCA GAA TTC GGA CAT GAC TCA GGA TTT GAA GTT CGT. Triplety predstavujú prvých 13 kodónov BAP, tri nukleotidy, ktoré boli zmenené, aby vznikla sekvencia hlodavcov, sú podtrhnuté. Oligonukleotid č. 23 bol párovaný s č. 24 (5'- TGACCTACAG GAAAGAGTTA) nasadajúcim na oblast vektoru Y2H, ktorá je 3' od klonovacieho miesta, v PCR pri použití pEK162 ako templátu. Produkt bol štiepený Ncol +

Sali a ligovaný do pAS2 za vzniku pEK240. Nukleotidová sekvencia segmentu kódujúceho BAP hlodavcov bola overená.

Genómové klonovanie

RAČE (Rapid Amplification of cDNA Ends - rýchla amplifikácia koncov cDNA): ľudská genómová knižnica lambda (Stratagene), zodpovedajúca 2,0 x 10⁶ pfu, bola testované so sondou vzniknutou z fragmentu EcoRI/Clal vytvoreného pomocou náhodných prajmerov, zodpovedajúcich nukleotidom 187 až 600 (obrázok 2). Sonda bola značená [³²P]-CTP pri použití súpravy T^QuickPrimer Kit podľa protokolu výrobca (Pharmacia). Filtre sa hybridizovali vo vysoko stringentných podmienkach: 40’C v 50% formamide, 0,12 M NaHPO₄, 0,25 M NaCI, 7% SDS a 25 mg/ml sonikovanej DNA lososej spermy a odmývali sa v 65’C v 0,lxSSC obsahujúcom 0,1% dodecylsulfát sodný a exponovali sa na filme Kodak BioMax MS. Klony fágu lambda hybridizujúce so sondou sa purifikovali z povlakov postupným vysievaním na misky a opätným testovaním. Bolo purifikovaných desať pozitívnych klonov, ktoré podstúpili dalšiu analýzu hybridizáciou so sondou s 45 nukleotidmi namierenou proti väčšine 5' sekvencií známych z pôvodného cDNA klonu. Tento oligonukleotid bol reverzne komplementárny k nukleotidom 157-201 (obrázok 2) a mal sekvenciu 5'-CCAGGCGGCC GCCATCTTGG AGACCGACAC TTTCTCGCCA CTTCC. DNA fágu lambda bola izolovaná štandardnými technikami molekulárnej biológie a podrobená priamemu sekvenovaniu pri použití fluorescenčného dideoxynukleotidového cyklického sekvenovania na sekvenačnom analyzátore ABI 373.

RAČE

Syntéza prvého vlákna DNA sa vykonávala pri použití termostabilného polymérázového systému rTth (Perkin Elmer). V 1,5 ml skúmavke sa zmiešali nasledujúce reagencie, vznikol objem 10 μΐ: 1 x tlmivý roztok na reverznú transkripciu, 1 mM MnCl₂, 1,6 mM zmes dNTP, 2,5 U rTth polymerázy, 100 ng poly A⁺ RNA ľudského hippokampu (Clontech), lOmM oligonukleotid (nukleotidy 429-452, obrázok 2, 5'-GTTATGTTGG GTGCTGGAAA ACAG). Reakcia sa inkubovala 15 minút v 70’C a ihned potom dala na ľad. Na vznik druhého vlákna cDNA bol použitý kit na syntézu cDNA Marathon (Clontech). Celý objem 10 μΐ reakcie na vznik prvého vlákna sa zmiešal s nasledujúcimi reagenciami: 1 x tlmivý roztok pre druhé vlákno, 0,8 mM zmes dNTP, 4 x koktail pre druhé vlákno (E. coli DNA polymeráza I, E. coli DNA ligáza, E. coli RNáza H) a Η₂θ čo objemu 80 μΐ. Skúmavka sa inkubovala 1,5 hodiny v 16’C, potom sa pridala T4 DNA polymeráza (10 U) a inkubovala sa ďalších 45 minút v 16C. Aby sa ukončila reakcia, pridali sa do reakčných zmesí 4 μΐ 20 x EDTA/glykogén (0,2 M EDTA (2 mg/ml glykogén), po ktorých nasledovala fenol/chloroform/izoamylalkoholová extrakcia na odstránenie enzýmov a ďalších nečistôt. DNA sa precipitovala pridaním 0,1 x objemu 3 M acetátu sodného pH 5,2 a 2,5 x objemu EtOH so štandardnou čistotou a umiestnila sa do -70’C. DNA sa raz omyla 70% EtOH, usušila a resuspendovala v 10 μΐ dH₂O. Polovina DNA sa použila na ligáciu s adaptérom Marathon a bola použitá v nasledujúcich reakciách RAČE PCR podľa protokolu Clontech: 5 μΐ cDNA sa pridalo k 2 μΐ (10mM) Marathon (5'-CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT), 1 x DNA ligačného tlmivého roztoku a 1 μΐ (1 U) T4 DNA ligázy. Reakčná zmes sa inkubovala cez noc v 16°C. Zmes sa nariedila 1:50 na východiskovú reakciu RAČE a v 0,2 ml skúmavke PCR sa zmiešala s nasledujúcimi reagenciami: 40 μΐ dH₂O, μΐ 10 x DNA polymerázy Klentaq (Clontech), 1 μΐ (lOmM) prajmeru AP1 (5'-CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC), 1 μΐ (lOmM) prajmeru špecifického pre BBP1 (zodpovedajúci nukleotidom 187 až 209, obrázok 2, 5'-CCAGACGGCCA GGCGGCCGCC AT), 5 μΐ 10 x tlmivého roztoku pre polymerázu Klentaq, 1 μΐ lOmM zmesi dNTP, 1 μΐ nariedenej cDNA z hore uvedenej reakcie. Pri použití termocyklovacieho prístroja GenAmp PCR System (Perkin Elmer) sa uskutočnili cykly v nasledujúcich podmienkach: denaturačný cyklus 94 ’C, 1 minúta, potom 5 cyklov 30'' v 94’C, 3' v 72’C, 5 cyklov 30'' v 94’C, 3' v 70’C, nasledované 25 cyklami 30'' v 94 ’C, 3' v 68’C, s konečným predĺžením 7' v 72’C. Potom nasledovala vložená (nested) RAČE PCR reakcia: 40 μΐ dH₂O, 1 μΐ (1 U) 10 x DNA polymeráza AmplitaqGold (Perkin Elmer), 1 μΐ (lOmM) prajmeru AP2 (5'-ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC), 1 μΐ (10mM) prajmeru špecifického pre BBP1 (zodpovedajúci nukleotidom 172-194, obrázok 2, 5'-GCCGCCATCT TGGAGACCGA CAC), 5 μΐ 10 x tlmivého roztoku pre polymerázu Amplitaq, 1 μΐ 10 mM zmesi dNTP, 1 μΐ produktu z primárnej RAČE. Cyklovacie podmienky pre PCR boli: počiatočný denaturačný cyklus 9' v 94’C, 25 cyklov 30'' v 94’C, 30'' v 68’C, 2' v 72’C, nasledované konečným predĺžením 7' v 72’C. Produkt PCR bol pustený na 1% agarózový gél v tlmivom roztoku 1 x TBE. Výsledný produkt s veľkosťou 350 párov báz bol purifikovaný z gélu a priamo klonovaný pri použití súpravy TA Cloning Kit (Invitrogen). Ligačné zmesi boli transformované do buniek OneShot (Invitrogen) a vysiate na miskách s LB-agarom s ampicilínom (100 μg/ml) obsahujúcim X-gal. Minipreparáciou sa izolovala DNA a skontrolovala sa pomocou priameho sekvenovania pri použití fluorescenčného dide32 oxynukleotidového cyklického sekvenovania na sekvenačnom analyzátore ABI 373.

Northern analýzy

Northern bloty (membrány) s vzorkami mRNA z rôznych ludských tkanív a rôznych tkanív mozgu boli získané od firmy Clontech (Palo Alto, CA). Sekvencie BBP1 umiestnené od pôvodného fúzneho spojenia po oblasť poly-A boli izolované pri pomoci fragmentu EcoRI z klonu TA pochádzajúceho z pEK196. DNA βaktinu bola poskytnutá výrobcom. Rádioaktívne značené sondy boli vytvorené z týchto DNA pri použití metódy náhodných prajmerov začleňujúcich ³²P-dCTP (Pharmacia Biotech, Piscataway,

NJ). Hybridizácie sa vykonávali podlá inštrukcií výrobca (Clontech) v roztoku Express Hyb v 68’C. Bloty sa odmývali v 2 x SSC (1 X SSC je 0,15 M chlorid sodný, 0,015 M citrát sodný), 0,05% SDS pri teplote miestnosti, potom nasledovali dve premytia v 0,1 x SSC, 0,1% SDS v 50’C. Hybridizačné signály sa zviditeľnili expozíciou proti filmu Kodak BioMax.

Hybridizácia in situ

DNA templáty pre syntézu ribosónd (RNA sond)) sa pripravovali pomocou PCR pri použití plazmidového klonu obsahujúceho kompletnú cDNA ludského BBP. Bola použitá jedna ribosonda namierená proti 3' UTR z cDNA. Na uistenie, že sonda z všetkých uložených sekvencií rozpoznáva iba daný ciel, boli sekvencie sondy prekontrolované proti databáze GenBank. Na vznik ribosónd pre BBP1 bol navrhnutý pár oligonukleotidových prajmerov tak, aby amplifikoval oblast s velkostou 275 párov báz od 3'

UTR z cDNA BBP1, a navyše pridával promotorové sekvencie pre polymerázu T7 (sense) a T3 (antisense). Tieto prajmery obsahovali nasledujúce sekvencie: 5'-TAATACGACT CACTATAGGG TTAGAAGAAA CAGATTTGAG (dopredný primer), 5'-ATTAACCCTC ACTAAAGGGA CAAGTGGCAA CTTGCCTTTG (reverzný prajmer). Produkty PCR boli purifikované na 1,5% agarózových géloch z agarózy s nízkym bodom topenia, a pásy obsahujúce produkty boli vyrezané, extrahované fenolom a fenol-chloroformom, a precipitované etanolom. Pelety boli usušené a resuspendované v 1 x TE tlmivom roztoku (10 mM TrisHC1, 1 mM EDTA, pH 7,4). Templát ribosondy APP sa skladal z fragmentu Ddel-Xhol z kódujúcej oblasti proteínu, ako je opísané Jacobsenem et al. (1991). 50 ng DNA templátu bolo použitých na transkripčné reakcie používajúce (^⁵S)-CTP (New England Nuclear, Boston, MA) a súpravu Riboprobe Gemini™ System (Promega, Madison, WI).

Histochemický postup hybridizácie in situ pri použití posmrtných rezov ľudského hippokampu sa vykonával tak, ako bolo opísané skôr (Rhodes, 1996). Rezy s hrúbkou 10 μπι sa rezali na kryostate Hacker-Brights a pripevňovali topením na vychladené (-20°C) podložné sklíčka potiahnuté reagenciou Vectabond (Vector Labs, Burlingame, CA). Všetky roztoky boli pripravené z dH₂O ošetrené 0,1% (objem/objem) dietylpyrokarbonátom a autoklávované. Rezy sa fixovali ponorením do 4% paraformaldehydu v PBS (pH 7,4) a potom sa ponorovali postupne do 2 x SSC, dH₂O a 0,1 M trietanolamínu obsahujúceho 0,25% (objem/objem) acetanhydrid, omyli v 0,2 x SSC, dehydrovali v 50%, 70% a 90% etanole a rýchlo usušili. Jeden ml prehybridizačného roztoku obsahujúceho 0,9M NaCl, 1 mM EDTA, 5x Denhardtov roztok, 0,25 mg/ml jednovláknovej DNA zo spermy lososov (GIBCO/BRL, Gaithersberg, MD), 50% deionizovaný formamid (EM Sciences, Gibbstown, NJ) v lOmM Tris (pH 7,6), sa nanášal pipetou na každé sklíčko a sklíčka sa inkubovali 3 hodiny v 50’C v zvlhčovanej komore. Rezy sa potom dehydrovali ponorením do 50%, 70% a 90% etanolu a usušili na vzduchu. Značené ribosondy sa pridali v konečné koncentrácii 50 000 cpm/μΐ do hybridizačného roztoku obsahujúceho 0,9 M NaCl, 1 mM EDTA, lx Denhardtov roztok, 0,1 mg/ml kvasinkovej tRNA, 0,1 mg/ml jednovláknovej DNA lososej spermy, dextránsulfát (10%), 0,08% BSA, 10 mM DTT (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 50% deionizovaný formamid v 10 mM Tris (pH 7,6). Sondy sa potom denaturovali v 95’C (1 minútu), umiestnili na ľade (5 minút) a nanášali pipetou na rezy a ponechali hybridizovať cez noc v 55 ’C v zvlhčovanej komôrke. Rezy sa potom premývali lx 45 minút v 37’C v 2x SSC obsahujúcom 10 mM DTT, potom nasledovalo lx 30 minút v 37’C v lx SSC obsahujúcom 50% formamid a lx 30 minút v 37 ’C v 2x SSC. Jednovláknová a nešpecifický hybridizovaná ribosonda bola štiepená ponorením do lOmM Tris pH 8,0 obsahujúceho RNázu A bovinného pankreasu (Boehringer Mannheim, 40 mg/ml), 0,5 M NaCl a 1 mM EDTA. Rezy sa premývali 1 hodinu v 2x SSC v 60’C, potom 2 hodiny v 0,lx SSC obsahujúcom 0,5% (hmotnosť/objem) tiosulfát sodný v 60’C. Rezy sa potom dehydrovali v 50%, 70% a 90% etanole obsahujúcom 0,3M acetát amónny a usušili. Sklíčka sa vložili do rôntgenových kaziet a ponechali 14-30 dní proti filmu Hyperfilm b-Max (Amersham). Keď sa získal uspokojivý snímok, sklíčka sa pokryli fotografickou emulziou (nuclear-track emulsion) (NTB-2, Kodak) a exponovali 7-21 dní v 4’C. Z emulzie sa vyvolali autorádiogramy a fixovali sa podľa inštrukcií výrobca a rezy tkaniva ležiace pod emulziou sa ofarbili hernátoxylinom. Na stanovenie nešpecifického značenia sa z templátu poskytnutého v súprave Riboprobe Gemini™ System Kit (Promega) vytvorila kontrolná sonda. Tento vektor sa linearizoval pri použití Seal a prepísal sa pri použití polymerázy T3. Výsledná transkripčná reakcia dala vzniknúť dvom produktom, ribosondám s veľkosťou 250 a 1525 párov báz, obsahujúcim iba vektorovú sekvenciu. Zmes s touto kontrolnou sondou sa značila ako je opísané hore a pridala sa k hybridizačnému roztoku v konečnej koncentrácii 50 000 cmp/μΐ. V kontrolných rezoch sa nepozorovala žiadna špecifická hybridizácia, tzn. tieto rezy dávali veľmi slabý rovnomerný hybridizačný signál, ktorý nesledoval neuroanatomické orientačné body (údaje nie sú ukázané).

Príklad 1

Klonovanie a izolácia proteínu viažuceho BAP (BBP1)

Bol vyvinutý kvasinkový dvojhybridný (Y2H) genetický filter pre vyhľadávanie a identifikáciu proteínov, ktoré interagujú s ľudským BAP₄₂, proteolytickým fragmentom APP s 42 aminokyselinami, ktorý je považovaný za potenciálne toxickejšiu agregovanú formu BAP. BAP₄₂ bol exprimovaný fúzovaný ku kvasinkovej doméne viažucej DNA Gal4 a bol tiež exprimovaný ako voľný peptid (obrázok 1). Tento kmeň bol transformovaný Y2H knižnicou cDNA mozgu ľudského fétu. Jeden kloň, označený kloň 14 definovaný hore, z približne 10⁶ nezávislých transformantov, produkoval dôslednú aktiváciu reportérového génu a obsahoval podstatný otvorený čítací rámec súvisiaci s rámcom domény GAL4. cDNA inzert obsahoval 984 párov báz, zakončených poly-A úsekom. Táto sekvencia kódovala 201 aminokyselín (sekvencia id. č. 2, aminokyselinové zvyšky 68 až 269) s dvoma oblasťami dĺžky a hydrofóbie postačujúce na prekročenie bunkovej membrány.

Plazmid získaný z knižnice bol z klonu 14 izolovaný a použitý na rekonštrukciu kmeňov testu Y2H. Vyšetrenie týchto kmeňov ukázalo, že fúzny proteín BAP špecificky interaguje s proteínom klonu 14, hoci reakcia bola slabá. Pretože silne hydrofóbne proteínové domény, ako sú transmembránové oblasti, inhibujú reakcie Y2H (Ozenberger, nepublikované údaje), bol inzert klonu 14 skrátený (nadalej BBP1 tm), aby sa odstránila oblasť najsilnejšej hydrofóbie a opäť sa testovali interakcie s BAP. S BBP1 tm (obrázok 2) bola pozorovaná oveľa silnejšia reakcia Y2H, čo podporuje predstavu, že odstránené sekvencie kódujú potenciálnu transmembránovú (tm) kotvu. Nukleotidová sekvencia klonu 14 bola porovnávaná so záznamami v GenBank, ukazuje sa, že takto identifikovaný proteín viažuci BAP (BBP1) je nový.

Príklad 2

Izolácia a potvrdenie 5' konca BBP1 cDNA sekvencie BBP1 obsiahnuté v klone 14 opísanom v príklade 1 hore postrádajúce 5' koniec kódujúci oblasti proteínu, pretože nie je prítomný žiadny potenciálny iniciačný metionínový kodón. Početné pokusy s obvyklou metódou 5’ RAČE (rýchla amplifikácia cDNA koncov), ktorá používa štandardnú reverznú transkriptázu, mali za následok len pridanie 27 nukleotidov. Tieto sekvencie obsahovali ATG, ale v rovnakom translačnom čítacom rámci nebol protismerný stop-kodón na ubezpečenie, že toto je iniciačný kodón. Na izoláciu 5’ konca génu BBP1 bol zavedený postup genómového klonovania.

Hybridizácia ľudskej genómovej knižnice lambda so sondou vzniknutou pri použití náhodných prajmerov, ktorá zodpovedala 400 párom báz (bp) z 5' sekvencie klonu 14, mala za následok identifikáciu 10 pozitívnych klonov. Ďalšia charakterizácia týchto klonov pri použití oligonukleotidovej sondy s 45 bázami namierenej proti najviac protismernej sekvencií BBP1 klonu 14 (a zodpovedajúcej 5' protismernej sekvencií sondy s 400 pármi báz) odhalila, že 6 z týchto 10 klonov obsahovalo koncové 5' sekvencie obsiahnuté v sekvenciách identifikovaných už skôr. Bolo zistené, že ďalšie 4 klony lambda predstavujú iné exóny, ktoré boli obsiahnuté pôvodných 400 pároch báz sondy odvodenej z cDNA a vzniknuté pri použití náhodných prajmerov (údaje nie sú ukázané). Priame cyklické sekvenovanie DNA fágov lambda reprezentatívnych klonov zodpovedajúcich 5’ konci BBP1 odhalilo 500 nukleotidov v protismere, ktoré sa prekrývajú so sekvenciou známou pre kloň 14. Táto ďalšia sekvencia potenciálne kóduje 62 ďalších aminokyselín v protismere od skôr charakterizovaného MET pred dosiahnutím MET, ktorému predchádza stopkodón v rámci. Hoci existujú dva zvyšky MET po smere od naj37 vzdialenejšieho protismerného MET, podľa štandardnej konvencie sme skusmo definovali sekvenciu amino konca ľudského génu BBP1 tak, aby zahŕňala prvý 5' MET, ktorý nasleduje v rámci po stop-kodóne. Kompletná kódujúca oblasť a odvodzovaná proteínová sekvencia je ukázaná v sekvenciách id. č. 1 a 2. Plazmid (označený BBPl-fl) obsahujúci túto aminokyselinovú sekvenciu bol uložený v American Type Culture Collection pod prístupovým číslom ATCC 98617).

Pretože 5' kódujúce sekvencie pochádzali z genómovej knižnice, existovala možnosť, že táto oblasť obsahuje intróny. Táto možnosť bola vyšetrovaná dvoma metódami. Po prvé, na amplifikáciu sekvencií z mozgovej cDNA, a tiež z genómovej DNA, boli použité dopredný prajmer namierený na oblasť 5' MET a reverzný prajmer pôvodného klonu 14. Z obidvoch vzoriek vznikali produkty s totožnou veľkosťou, čo ukazovalo neprítomnosť intrónov v tejto oblasti a potvrdilo väzbu protismernej sekvencie s pôvodnou sekvenciou. Po druhé boli izolované cDNA sekvencie v modifikovaných pokusoch 5' RAČE (pozri Materiál a metódy, hore), ktoré boli totožné so sekvenciami získanými z genómového klonu. Tieto nálezy overili protismerné sekvencie (ako z genómových, tak cDNA zdrojov) a chýbanie intrónov v tejto oblasti.

Príklad 3

Charakterizácia BBP1

Sekvencie BBP1 boli porovnané s GenBank pri použití základného vyhľadávacieho programu na lokálne porovnávanie (BLAST, Altschul et al., 1990). Zhodovali sa s dvoma genómovými sekvenciami Caenorhabditis elegans a jednou genómovou sekvenciou Drosophila melanogaster a veľkým počtom ľudských, myších a iných cicavčích krátkych exprimovaných markérových sekvencií (expressed seguence tags). Ale neboli dostupné žiadne kompletné cDNA sekvencie ani funkčné údaje pripisované génu. Proteín BBP1 a translácie dostupných krátkych exprimovaných sekvencií boli porovnané, prehľadané na výskyt konzervatívnych segmentov a vyhodnotené pomocou algoritmu na vyhľadávanie proteínových motívov MoST (Tatusov et al., 1994). Tieto analýzy odhalili možný evolučný vzťah k rodine receptorov spojených s G proteínom. Tieto analýzy presnejšie ukázali, že BBP1 obsahuje dve potenciálne transmembránové (tm) domény rovnocenné tm doménam 3 a 4 receptorov spojených s proteínom G. Intervenujúcu hydrofilná slučka obsahuje dobre charakterizovaný motív troch aminokyselín, aspartát (D) alebo glutamát nasledovaný arginínom (R) a aromatickým zvyškom (Y alebo F) (všeobecne nazývané ako sekvencie DRY), tento motív je zachovaný pri takmer všetkých členoch tejto rodiny receptorov a bolo ukázané, že slúži ako molekulový spúšťač aktivácie proteínu G (Acharya a Karnik, 1996). Tieto údaje ukazujú, že BBP1 predstavuje nový proteín potenciálne obsahujúci funkčný modul zdieľaný s členmi veľkej rodiny receptorov spojených s proteínom G. Presnejšie sa ukazuje, že BBP1 zachováva kritickú sekvenciu DRF medzi dvoma predikovanými tm doménami, takže môže mať potenciál pre spojenie so signálnou drahou riadenou proteínom G.

Štrukturálna analýza BBP1 ukázala, že obsahuje štrukturálny motív, o ktorom je známe, že je aktivačnou sekvenciou proteínu Ga u príbuzných receptorov spojených s proteínom G. Testy Y2H prekazujúce interakciu BBP1 s rôznymi členmi receptorov spojených s proteínom G, sú ukázané na obrázku 3. Na základe štrukturálnych predpovedí je BBP1 zobrazený ako dvakrát prestupujúci membránu s obidvoma koncami v luminálnom kompartmente. Iné orientácie nemôžu byt úplne vylúčené. Potenciálne proteínové interakcie opísané hore boli vyšetrované v testoch Y2H. Dve prekrývajúce sa časti sekvencií BBP1 obsiahnutých v klone BBPlôtm boli amplifikované a klonované do Y2H vektoru pACT2 (expresné plazmidy pEK216 a pEK219, tabuľka 2 a zodpovedajúce proteíny ΒΒΡ1ΔΝ a BBPlAC, obrázok 4). Konštrukt postrádal obidve tm domény, konštrukt ΔΝ kódoval prvú tm doménu a predchádzajúcich 52 aminokyselín. Tieto fúzne proteíny boli testované s fúznym proteínom BAP a reakcie sa porovnávali s reakciami kmeňov exprimujúcich väčší proteín BBP1 tm. Tieto výsledky svedčia o tom, že hlavný determinant pre asociáciu s BAP je obsiahnutý v oblasti BBP1, o ktorej sa predpokladá, že je topograficky podobná BAP v divokom typu proteínu APP.

Príklad 4

Tkanivová distribúcia expresie ludského BBP1

Bola hodnotená expresia mRNA BBP1 ako počiatočný krok v objasnení aktivity génu a jeho produktu. Vo všetkých tkanivách bol pozorovaný hlavný transkript s veľkosťou 1,25 kb (obrázok 5A). V srdci bola vysoká hladina expresia. Celý mozog prejavoval strednú hladinu expresie. Všetky vzorky pochádzajúce z oddelených oblastí mozgu prejavovali expresiu BBP1 (obrázok 5B). Je zaujímavé, že limbické oblasti obsahovali relatívne väčšie množstvo mRNA BBP1. Sú to oblasti mozgu, kde najskôr nastáva agregácia BAP a pridružená neurotoxickost. Analýza autorádiogramov hybridizácie in situ získaných pri použití ribosondy špecifickej pre BBP1 ukázala, že v ľudskom hippokampe a entorinálnom kortexe je mRNA BBP1 exprimovaná v stredných až veľkých bunkách v rozložení zodpovedajúcom expresii v neurónoch a v protiklade s rozložením v gliových bunkách (obrázok 6). Okrem toho, mRNA BBP1 je exprimovaná vlastne vo všetkých hippokampálnych a entorinálnych neurónoch, tzn. neukazujú sa žiadne podstatné alebo laminárne odchýlky intenzity hybridizačného signálu. Je zaujímavé, že rozloženie expresie BBP1 bolo výrazne podobné rozloženiu pozorovanému pri použití ribosondy namierenej proti mRNA prekurzorového proteínu amyloidu APP (obrázok 6). Súhrnne mRNA BBP1 bola pozorovaná vo všetkých vyšetrovaných tkanivách a všetkých oblas40 tiach mozgu. Analýza in situ expresie mRNA BBP1 tiež odhalila značnú expresiu v oblasti hippokampu.

Príklad 5

Distribúcia expresie BBP1 v bunkových líniách

Expresia BBP1 bola tiež vyšetrovaná v početných bunkových líniách a bola vytiahnuté údaje z dbEST, databázy krátkych exprimovaných sekvencií Národného centra pre biotechnologické informácie, NCBI. Metódy polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou polymerázou (RT-PCR) boli použité na kvalitatívne stanovenie expresie mRNA BBP1 v bunkových líniách všeobecne používaných na expresiu rekombinantných proteínov, a tiež v celom rade karcinómových bunkových línií. BBP1 bol pozorovaný v CHO bunkách chrčkov a ľudských bunkách HEK293. Signály boli pozorované v embryonálnej kmeňovej bunkovej línii Ntera-2 a neuroblastómových líniách IMR32 a SK-N-SH. Expresia BBP1 bola pozorovaná v karcinómových bunkových líniách, ktoré pochádzali z nasledujúcich tkanív: hrubé črevo (Cx-1, Colo205, MIP101, SW948, CaCo, SW620, LS174T), ovárií (A2780S, A2780DDP), prsníka (MCF-7, SKBr-3, T47-D, B7474), pľúc (Lx-1, A5439), melanómu (Lox, Skmel30), leukémie (HL60, CEM), prostaty (LNCAP, Dul45, PC-3). Testovanie pomocou northern blotov s mRNA z nasledujúcich karcinómových bunkových línií preukázalo expresiu BBP1 v všetkých vzorkách: promyelocytárna leukémia (HL-60), karcinóm (HeLa S3), chronická myeloidná leukémia (K-562), lymfoblastová leukémia (MOLT-4), Burkittov lymfóm (Raji), kolorektálny adenokarcinóm (SW480), pľúcny karcinópm (A549) a melanóm (G361).

Príklad 6

Selektívna interakcia BBP1 s ľudským BAP versus BAP hlodavcov

V porovnaní s ľudskou sekvenciou sú v sekvencii BAP hlodavcov tri aminokyselinové substitúcie (G5R, F10Y a R13H). Peptid hlodavcov vykazoval zníženú neurotoxickosť a neviazal sa na homogenáty ľudského mozgu (Maggio et al., 1992). Bolo preto zaujímavé vyhodnotiť asociáciu BAP hlodavcov s BBP1 v systému Y2H. Sekvencia ľudského BAP v pEK162 sa zmenila tak, aby kódovala peptid hlodavcov prostredníctvom oligonukleotidom riadenej mutagenázy pomocou PCR opísanej hore. Výsledný plazmid pEK240 bol totožný s expresným plazmidom ľudského fúzneho proteínu BAP používaným všade v predkladanom vynáleze okrem troch kodónov, v ktorých boli aminokyselinové substitúcie na vytvorenie sekvencie peptidu hlodavcov. Interakcie medzi fúznym proteínom BBP1 a fúznymi proteínmi BAP hlodavcov a ľudským BAP boli porovnané pomocou biologického testu Y2H. Kmene exprimujúce BBP1 a BAP hlodavcov nevytvorili rastovú reakciu (obrázok 7). Tento nález podporuje predpoklad, že BBP1 môže slúžiť ako špecifický mediátor neurotoxických účinkov BAP a poskytuje mechanizmus na vysvetlenie zníženej toxickosti BAP hlodavcov. Je dôležité, že tieto údaje tiež slúžia na ilustráciu vysokého stupňa špecifickosti interakcie BBP1/BAP v testoch Y2H, pretože substitúcia troch aminokyselín bola dostačujúca na kompletné zrušenie asociácie (obrázok 7).

Odborníkovi je jasné, že vynález sa môže v praxe vykonávať aj inak, ako je konkrétne opísané v predchádzajúcom opise a príkladoch. Početné modifikácie a variácie predkladaného vynálezu sú možné na základe hore uvedeného výkladu, a preto spadajú do rozsahu pripojených patentových nárokov.

Citovaná literatúra

Acharya, S., and Karnik, S. (1996). Modulation of GDP release from transducin by the conserved Glu134-Arg135 sequence in rhodopsin. J Biol Chem 271, 25406-25411.

Altschul, S., Gish, W., Miller, W., Myers, E., and Lipman, D. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410.

Chartier-Harlin, M., Crawford, F., Houlden, H., Warren, A., Hughes, D., Fidani, L., Goate, A., Rossor, M., Roques, P., Hardy, J., and Mullan, M. (1991). Early-onset Alzheimer's disease caused by mutations at codon 717 of the β-amyloid precursor protein gene. Náture 353, 844-846. DuYan, S., Chen, X„ Fu, J., Chen, M., Zhu, H., Roher, A., Slattery, T., Zhao, L., Nagashima, M., Morser, J., Migheli, A., Nawroth, P., Stern, D., and Schmidt, A. (1996). RAGE and amyloid-β peptide neurotoxicity in Alzheimer's disease. Náture 382, 685-691.

El Khoury, J., Hickman, S., Thomas, C., Cao, L., Silversteín, S., and Loike, J. (1996). Scavenger receptor-mediated adhesion of microglia to βamyloid fibrils. Náture 382, 716-719.

Goate, A., Chartier-Harlin, M., Mullan, M., Brown, J., Crawford, F.,

Fidani, L., Giuffra, L., Haynes, A., Irving, N., James, L., Mant, R.,

Newton, P., Rooke, K., Roques, P., Talbot, C., Pericak-Vance, M., Roses, A., Wiliiamson, R., Rossor, M., Owen, M., and Hardy, J. (1991). Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with família! Alzheimer's disease. Náture 349, 704-706.

Hendriks, L., van Duijn, C., Cras, P., Cruts, M., van Hul, W., van Harskamp, F., Martin, J.-J., Hofman, A., and van Broeckhoven, C.

(1992). Presenile dementia and cerebral haemorrhage linked to a mutation at codon 692 of the β-amyloid precursor proteín gene. Nat Genet 1, 218221.

Jacobsen, J., Spruyt, M., Brown, A., Sahasrabudhe, S., Blume, A., Vitek, M., Muenkel, H., and Sonnenberg-Reines, J. (1994). The release of

Alzheimer's disease β amyloid peptide is reduced by phorbol treatment. J Biol Chem 269, 8376-8382.

Jacobsen, J, Muenkel, H, Blume, A, and Vitek, M (1991). A novel species-specific RNA related to alternatively spliced amyloid precursor protein mRNAs. Neurobiol of Aging 12, 575-583.

Kang, Y.-S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J., and Tipper, D. (1990).

Effects of expression of mammalian Ga and hybrid mammalian-yeast Ga proteins on the yeast pheromone response signál transduction pathway. Mol Celí Biol 10, 2582-2590.

LaFerla, F., Tinkle, B., Bieberich, C., Haudenschild, C., and Jay, G.

(1995). The Alzheimer's Αβ peptide induces neurodegeneration and apoptotic celí death in transgenic mice. Náture Genetics 9, 21-30. Lassmann, H., Bancher, C., Breitschopf, H., Wegiel, J., Bobinski, M., Jellinger, K., and Wisniewski, H. (1995). Celí death in Alzheimer's disease evaluated by DNA fragmentation in situ. Acta Neuropathol 89, 35-41. Levy, E., Carman, M., Fernandez-Madrid, I., Power, M., Lieberburg, L, vanDuinen, S., Bots, G., Luyendijk, W., and Frangione, B. (1990). Mutation of the Alzheimer's disease amyloid gene in hereditary cerebral hemorrhage, Dutch type. Science 248, 1124-1126.

Loo, D., Copani, A., Pike, C., Whittemore, E., Walencewicz, A., and Cotman, C. (1993). Apoptosis is induced by β-amyloid in cultured centrál nervous systém neurons. Proc Natl Acad Sci USA 90, 7951-7955. Maggio, J., Stimson, E., Ghilardi, J., Alien, C., Dahl, C., Whitcomb, D., Vigna, S., Vinters, H., Labenski, M., and Mantyh, P. (1992). Reversible in vitro growth of Alzheimer disease b-amyloid plaques by deposition of labeled amyloid peptide. Proc Natl Acad Sci USA 89, 5462-5466.

Mullan, M., Crawford, F., Axelman, K., Houlden, H., Lilius, L., Winblad, W., and Lannfelt, L. (1992). A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the N-terminus of β-amyloíd. Nat Genet 1, 345347.

Murrell, J., Farlow, M., Ghetti, B., and Benson, M. (1991). A mutation in the amyloid precursor protein associated with hereditary Alzheimer disease. Science 254, 97*99.

Nishimoto, I., Okamoto, T., Matsuura, Y., Takahashi, S., Okamoto, T., Murayama, Y., and Ogata, E. (1993). Alzheimer amyloid protein precursor complexes with brain GTP-binding protein Go. Náture 362, 75-79. Ozenberger, B., and Young, K. (1995). Functional interaction of ligands and receptors of the hematopoietic superfamily in yeast. Mol Endocrinol

9. 1321-1329.

Rhodes K., Monaghan M., Barrezueta N., Nawoschik S., Bekele-Arcuri Z., Matos M., Nakahira K., Schechter L., and Trimmer J. (1996). Voltagegated K+ channel beta subunits: expression and distribution of Kv beta 1 and Kv beta 2 in adult rat brain. J Neurosci 16, 4846-4860.

Scheuner, D., Eckman, C., Jensen, M., Song, X., Citrón, M., Suzuki, N., Bird, T., Hardy, J., Hutton, M., Kukull, W., Larson, E., Levy-Lahad, E., Viitanen, M., Peskind, E., Poorkaj, P., Schellenberg, G., Tanzi, R., Wasco, W., Lannfelt, L., Selkoe, D., and Younkin, S. (1996). AB42{43) is increased in vivo by the PS1/2 and APP mutations linked to familial Alzheimer's disease. Nat Med 2, 864-870.

Selkoe, D. (1997). Alzheimer's Disease: Genotypes, phenotype, and treatments. Science 275, 630-631.

Smale, G., Nichols, N., Brady, D., Finch, C., and Jr, W. H. (1995). Evidence for apoptotic celí death in Alzheimer's disease. Exp Neurol 133, 225-230.

Tanzi, R., Gusella, J., Watkins, P., Bruns, G., George-Hyslop, P. S., vanKeuren, M., Patterson, D., Pagan, S., Kurnit, D., and Neve, R. (1987). Amyloid β protein gene: cDNA, mRNA distribution and genetic linkage near the Alzheimer locus. Science 235, 880-884. . .

Tatusov, R., Altschul, S., and Koonin, E. (1994). Detection of conserved segments in proteins : Iterative scanníng of sequence databases with alignment blocks. Proc Natl Acad Sci USA'91, 12091-12095.

Wade Harper, J., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., and Eliedge, S. J. (1993). The p21 Cdk-interacting proteín Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Celí 75, 805-816.

Watt, J., Pike, C., Walencewicz-Wasserman, A., and Cotman, C. (1994). Ultrastructural analysis of β-amyloid-induced apoptosis in cultured hippocampal neurons. Brain Res 661, 147-156.

Yamatsuji, T., Matsui, T., Okamoto, T., Komatsuzaki, K., Takeda, S., Fukumoto, H., Iwatsubo, T., Suzuki, N., Asami-Odaka, A., Ireland, Si, Kinane, T., Giambarella, U., and Nishimoto, I. (1996). G protein-mediated neuronal DNA fragmentation índuced by familial Alzheimer's Diseasebinding mutants of APP. Science 272, 1349-1352.

Yan, S., Fu, J., Soto, C., Chen, X,, Zhu, H., Al-Mohanna, F., Collison, K., Zhu, A., Stern, E., Saido, T., Tohyama, M., Ogawa, S., Roher, A., and Stern, D. (1997). An intracellular protein that binds amyloid-β peptide and mediates neurotoxicity in Alzheimer's disease. Náture 389, 689-695.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polynukleotid vybraný zo skupiny obsahujúcej:

   a) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu s identifikačným číslom 1 (id. č. 1),

   b) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617,

   c) polynukleotid kódujúci proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) kódovaný cDNA inzertom klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617,

   d) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 202 po nukleotid 807 zo sekvencie id. č. 1,

   e) polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) klonu pEK196 uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98399,

   f) polynukleotid kódujúci proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) kódovaný cDNA inzertom klonu pEK196 uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98399,

   g) polynukleotid kódujúci proteín obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu id. č. 2,

   h) polynukleotid kódujúci proteín obsahujúci fragment aminokyselinovej sekvencie id. č. 2, ktorý má väzbovú aktivitu pre ludský β-amyloidový peptid, pričom fragment obsahuje aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269 z sekvencie id. č. 2,

   j) polynukleotid, ktorý je alelickým variantom polynukleotidu z bodov a) až f) uvedených hore,

   k) polynukleotid, ktorý kóduje druhový homológ proteínu z bodov g) až h) uvedených hore, a

   l) polynukleotid, ktorý je schopný hybridizovat za stringentných podmienok s každým z polynukleotidov vymedzených v bodoch a) až h).
2. 2. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý je operatívne spojený s aspoň jednou expresnou kontrolnou sekvenciou.
3. 3. Hostiteľská bunka transformovaná polynukleotidom podľa nároku 2.
4. 4. Hostiteľská bunka podľa nároku 3, kde bunka je prokaryotická alebo eukaryotická bunka.
5. 5. Spôsob produkcie proteínu kódovaného polynukleotidom podľa nároku 2,vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky

   a) pestovanie tkanivovej kultúry hostiteľskej bunky podľa nároku 3 vo vhodnom kultivačnom médie, a

   b) purifikácia proteínu z kultivačného média.
6. 6. Proteín pripravený spôsobom podľa nároku 5.
7. 7. Proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z:

   a) aminokyselinovej sekvencie id. č. 2,

   b) aminokyselinovej sekvencie od aminokyseliny 68 po aminokyselinu 269 zo sekvencie id. č. 2,

   c) aminokyselinovej sekvencie kódovanej cDNA inzertom klonu BBPl-fl uloženého pod prístupovým číslom ATCC 98617, a

   d) fragmentov aminokyselinovej sekvencie id. č. 2 obsahujúcej aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 185 po aminokyselinu 217 zo sekvencie id. č. 2.
8. 8. Proteín podľa nároku 7, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu zo sekvencie id. č. 2.
9. 9. Fúzny proteín, ktorý obsahuje BBP1 spojený s heterolognou proteínovou alebo peptidovou sekvenciou.
10. 10. Fúzny proteín podľa nároku 9 kde BBP1 má aminokyselinovú sekvenciu id. č. 2.
11. 11. Oligonukleotid, ktorý kóduje antisense sekvenciu komplementárnu k časti sekvencie BBPl so sekvenciou id. č. l, a ktorý inhibuje expresiu génu BBPl.
12. 12. Spôsob určovania polynukleotidu kódujúceho proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky

    a) hybridizácie vzorky so sondou špecifickou pre uvedený polynukleotid v podmienkach pre uvedenú sondu efektívnych tak, aby hybridizovala špecificky s uvedeným polynukleotidom, a

    b) vyšetrenia hybridizácie uvedenej sondy s polynukleotidmi vo vzorke, keď uvedená sonda obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny majúcej oblasť 20 alebo viac párov báz aspoň z 90 % totožnou s polynukleotidovou sekvenciou id. č. 1.
13. 13. Spôsob určovania polynukleotidu kódujúceho proteín viažuci β-amyloidový peptid (BBP) vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky

    a) hybridizácie vzorky so sondou špecifickou pre uvedený polynukleotid v podmienkach pre uvedenú sondu efektívnych tak, aby hybridizovala špecificky s uvedeným polynukleotidom, a

    b) vyšetrenia hybridizácie uvedenej sondy s polynukleotidmi vo vzorke, kečí uvedená sonda obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny majúcej oblasť 20 alebo viac párov báz aspoň z 90 % totožnou s polynukleotidovou sekvenciou inzertu cDNA Z ATCC 98617 alebo ATCC 98399.
14. 14. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúci oblasť sekvencie aspoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou id. č. 2.
15. 15. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid obsahujúci oblasť sekvencie aspoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) kódovanou inzertom cDNA z ATCC 98617.
16. 16. Spôsob detekcie polypeptidu obsahujúceho oblasť aspoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou id. č. 2 vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky

    a) inkubácie vzorky s reagenciou, ktorá sa viaže špecificky k uvedenému polypeptidu v podmienkach účinných na špecifickú väzbu, a

    b) vyšetrenie väzby reagencie k polypeptidu vo vzorke.
17. 17. Spôsob detekcie polypeptidu obsahujúceho oblasť sekvencie aspoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou proteínu viažuceho β-amyloidový peptid (BBP) kódovanou inzertom cDNA z ATCC 98617, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky

    a) inkubácie vzorky s reagenciou, ktorá sa viaže špecificky k uvedenému polypeptidu v podmienkach účinných pre špecifickú väzbu, a

    b) vyšetrenie väzby reagencie k polypeptidu vo vzorke.
18. 18. Spôsob diagnostikovania choroby charakterizovanej aberantnou expresiou ľudského β-amyloidového peptidu (BAP), vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky

    a) inkubácie vzorky podozrivej z aberantnej expresie ľudského β-amyloidového peptidu s reagenciou obsahujúcej polypeptid, ktorý obsahuje oblasť aspoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou id. č. 2 v podmienkach účinných pre špecifickú väzbu reagencie s ľudským β-amyloidovým peptidom, a

    b) vyšetrenie väzby reagencie k peptidu vo vzorke.
19. 19. Spôsob diagnostikovania choroby charakterizovanej aberantnou expresiou ľudského β-amyloidového peptidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje

    a) inkubáciu vzorky podozrivej z aberantnej expresie ľudského β-amyloidového peptidu s reagenciou obsahujúcou polypeptid obsahujúci oblasť aspoň z 90 % totožnou s aminokyselinovou sekvenciou proteínu viažuceho β-amyloidový peptid kódovanou inzertom cDNA z ATCC 98617 v podmienkach účinných na špecifickú väzbu reagencie s ľudským β-amyloidovým peptidom, a

    b) vyšetrenie väzby reagencie k peptidu vo vzorke.
20. 20. Diagnostický spôsob, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob obsahuje analýzu výskytu polynukleotidu podľa nároku 1 vo vzorke pochádzajúcej z hostiteľa.
21. 21. Spôsob identifikácie zlúčenín, ktoré regulujú aktivitu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje

    a) inkubáciu vzorky obsahujúcej ľudský β-amyloidový peptid v testovacom médie obsahujúcom testovanú zlúčeninu a reagenciu obsahujúci polypeptid, ktorý obsahuje oblasť aspoň z 90 % totožnú s aminokyselinovou sekvenciou id. č. 2 v podmienkach účin ných na špecifickú väzbu reagencie s ľudským β-amyloidovým peptidom, a

    b) porovnanie väzby reagencie k peptidu vo vzorke v prítomnosti a neprítomnosti testovanej zlúčeniny, a

    c) vztiahnutie odlišnosti medzi väzbou v kroku b) k testovanej zlúčenine regulujúcej aktivitu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid.
22. 22. Spôsob identifikácie zlúčenín, ktoré regulujú aktivitu proteínu viažuceho β-amyloidový peptid, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje

    a) inkubáciu vzorky obsahujúcej ľudský β-amyloidový peptid v testovacom médie obsahujúcom testovanú zlúčeninu a reagenciu obsahujúcu polypeptid, ktorý obsahuje oblasť aspoň z 90 % totožnú s aminokyselinovou sekvenciou proteínu viažuceho peptid β-amyloid kódovanou inzertom cDNA z ATCC 98317 v podmienkach účinných pre špecifickú väzbu reagencie s ľudským β-amyloidovým peptidom, a

    b) porovnanie väzby reagencie k peptidu vo vzorke v prítomnosti a neprítomnosti testovanej zlúčeniny, a

    c) vztiahnutie odlišnosti medzi väzbou v kroku b) k testovanej zlúčenine regulujúcej aktivitu proteínu viažuceho βamyloidový peptid.
23. 23. Spôsob liečby pacienta, ktorý potrebuje inhibovat akumuláciu β-amyloidového peptidu v mozgu, vyznačuj úci sa t ý m, že obsahuje podávanie liečebne účinného množstva polypeptidu podľa nároku 7 pacientovi.
24. 24. Transgénne alebo chimerické zviera, ktoré obsahuje polynukleotid podľa nároku 2.