KR20010006393A

KR20010006393A - β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

Info

Publication number: KR20010006393A
Application number: KR1019997009480A
Authority: KR
Inventors: 오젠버거브래들리앨튼; 카즈코브스키에일린마리; 제이콥슨잭스티븐; 바드조너선애덤; 워커스티븐글렌
Original assignee: 이곤 이 버그; 아메리칸 홈 푸로닥츠 코포레이션
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2001-01-26
Also published as: EE9900482A; GEP20043386B; JP2008104465A; HUP0003116A2; IL132236A0; CN1690203A; UA72875C2; SK143299A3; NZ500216A; IL132236A; BR9808562A; CN1268973A; CN1196785C; CA2286484A1; NO995062L; JP2008253275A; EA199900941A1; ID24914A; WO1998046636A3; NO995062D0

Abstract

인간 β-아밀로이드 펩타이드와 결합하는 신규 단백질, 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이러한 단백질의 제조방법이 제공됨. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 사용하는 진단, 치료, 및 스크리닝법도 제공됨.

Description

β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드{β-AMYLOID PEPTIDE-BINDING PROTEINS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME}

알츠하이머병(AD)은 일련의 뇌의 구조이상을 특징으로 하는 노인의 진행성 치매병이다. 중추신경계(CNS)의 다수 영역내 뉴런은 기능장애되고 사멸하여, 시냅스 입력에 변성을 가져오게 된다. 이러한 취약한 뉴런의 세포체와 근위 수상 돌기는 주성분이 포스포릴화된 마이크로튜불상-결합 단백질, 즉 tau인 쌍을 이룬 나선형 필라멘트로 구성된 뉴로피브릴 탱글을 함유한다. 질환의 특징 중 하나는 노년기(또는 신경염성) 플라크로 불리는, 뇌내 아밀로이드 함유 침착물의 축적현상이다. 아밀로이드 플라크의 주성분은 AD 진행 중에 조밀한 응집체를 형성하는 b-아밀로이드 펩타이드(이하, "BAP"로 통칭, 관련문헌에서는 Aβ, βAP 등으로도 언급)이다.

BAP는 아밀로이드 전구체 단백질(이하, ""APP"로 통칭)의 단백질 분해 절단에 의해 유도되고 APP의 막횡단 도메인 및 관강/세포외 도메인 부분으로 이루어진 39-43개 아미노산 펩타이드이다. 42개 아미노산을 포함하는 BAP 펩타이드(BAP42)는 잠재적으로 인간에 있어 더욱 유독한 응집형태인 것으로 생각된다. APP는 수 종의 BAP-함유 동위형으로 발생한다. 주된 형태는 695, 751, 및 770개 아미노산으로 이루어지며, 뒤의 두 APP는 Kunitz 세린 프로테아제 억제제와 구조적 및 기능적 상동성을 공유하는 도메인을 함유한다. 정상인의 경우, BAP는 축적되지 않으며 순환체액으로부터 신속히 제거된다. 그러나, 펩타이드는 영양장애 수상돌기와 축색돌기, 소교세포, 및 반응성 성상세포의 표면에 플라크를 형성할 수 있다. 신경염성 플라크내 BAP의 응집 및 침착은 AD의 초기사건 중 하나로 추론된다. BAP의 발현과 영향을 이끄는 사건과 AD에서의 이들 개개의 역할 조사는 신경과학 연구의 주된 초점이다. 특히, BAP와 결합하는 단백질의 발견은 질환의 병인론 이해의 진전 및 신규 치료 표적의 잠재적 도입에 중요하다.

본 발명에 이르러서야 비로서, 인간 BAP와 결합하고 AD에서 BAP의 생물학적 효과에 연루될 수 있는 단백질 및 이의 단편이 동정되었다.

발명의 요약

본 발명은 인간 β-아밀로이드 펩타이드(BAP) 아미노산 서열과 선택적으로 결합하는 유전자 산물을 암호화하는 신규의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

일 양태로서, 본 발명은

(a)서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(b)기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(c)기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(d)서열번호 1의 202 내지 807번 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(e)기탁번호 ATCC 98399로 기탁되어 있는 클론 pEK196의 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(f)기탁번호 ATCC 98399로 기탁되어 있는 클론 pEK196의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(g)서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(h)인간 β-아밀로이드 펩타이드 결합 활성을 보유하고, 서열번호 2의 68 내지 269번 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 2의 아미노산 서열 단편을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(j)상기 (a) 내지 (f)의 폴리뉴클레오타이드의 대립유전자 변이체인 폴리뉴클레오타이드;

(k)상기 (g) 내지 (j)의 단백질의 종 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및

(l)엄격한 조건하에서 (a) 내지 (h)에 명시된 폴리뉴클레오타이드 중 하나에 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열; 기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)의 뉴클레오타이드 서열; 또는 기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 양태는 서열번호 1의 cDNA 서열에 상응하는 유전자를 제공한다.

다른 양태로서, 본 발명은

(a)서열번호 2의 아미노산 서열;

(b)서열번호 2의 68 내지 269번 아미노산의 아미노산 서열;

(c)기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 아미노산 서열; 및

(d)서열번호 2의 185 내지 217번 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 2의 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게는 이러한 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 68 내지 269번 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 융합 단백질도 본 발명에서 청구된다.

특정의 바람직한 양태로서, 폴리뉴클레오타이드는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 본 발명은 또한, 이러한 폴리뉴클레오타이드 조성물로 형질전환된, 세균, 효모, 곤충, 및 포유동물 세포를 포함한 숙주세포도 제공한다.

(a)제 3 항의 숙주세포 배양균을 적당한 배양배지에서 생장시킨 다음; (b)배양배지로부터 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 BBP 생산방법도 제공된다.

이러한 BBP와 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 조성물도 본 발명에 의해 제공된다.

인간 BAP의 이상발현을 특징으로 하는 질환상태를 검출하는 방법 및 진단과정과, BBP의 활성을 조절하는 화합물의 동정방법도 제공된다.

본 발명의 다른 양태는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 BBP를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 트랜스제닉 동물을 포함한다.

본 출원은 1997년 4월 16일로 출원된 미국 가출원 60/064,583의 혜택을 청구하며, 이의 내용은 본원에 참조로 인용된다.

본 발명은 신규 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질과, 이러한 폴리뉴클레오타이드 및 단백질에 대한 치료, 진단 및 연구 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 알츠하이머병과 연관된 아밀로이드 침착물의 주성분 중 하나인 b-아밀로이드 펩타이드에 결합하는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이다.

하기 도면은 본 발명의 특정 양태를 설명한다. 이들은 본원에 기재된 본 발명을 제한하지 않으며 설명에 불과하다.

도 1: 효모 2-하이브리드 스크린 디자인

BAP₄₂에 융합된 Gal4 DNA-결합 도메인(BAP^BD; TRP1 마커를 함유하는 플라스미드) 및 비융합 BAP₄₂(BAP; URA3 마커를 함유하는 플라스미드)를 발현하는 Y2H 숙주 균주를 기술한 바와 같이 Gal4 활성화 도메인 융합 단백질(미지^AD)을 발현하는 Y2H 인간 태아 뇌 cDNA 라이브러리(LEU2 마커를 함유하는 플라스미드)로 형질전환시킨다. 따라서, 균주는 표시된 단백질을 발현하는 3개의 에피솜 플라스미드(원으로 표시)를 함유한다. 양성 단백질-단백질 상호작용은 상류 활성화 서열에서의 Gal4 활성(GALUAS)을 재구성하여 리포터 유전자 HIS3의 전사가 유도된다.

도 2: BBP1/BAP 결합의 증명

Y2H 균주를 10배 연속 희석액을 제조한 다음 트립토판, 루이신, 히스티딘이 결핍되고 기술한 3-아미노-트리아졸을 25 mM 함유하는 합성 아가 배지상에 5 ㎕를 스포팅함으로써 히스티딘 독립영양성에 대해 분석한다. 모든 균주는 표지물 BAP로 표시한 바와 같이 BAP 융합 단백질 발현 플라스미드 pEK162를 함유한다. 제 1 칼럼(벡터)은 pEK162를 운반하는 독립적으로 유도된 균주 및 무관한 융합 단백질을 발현하는 벡터 pACT2를 함유한다. 이들은 표적 단백질 발현 균주와의 비교를 위한 배경수단 역할을 한다. 텍스트에 기술한 바와 같이 BBP1Dtm으로 표시한 칼럼은 pEK198로부터의 끝이 절단된 BBP1을 발현한다. BAP와 BBP1Dtm 융합 단백질 간의 상호작용은 Gal4 활성을 재구성하여, HIS3 리포터 유전자의 유도를 초래하며(도 1 참조), 대조군 균주에 비하여 증진된 독립영양 생장으로 관찰된다.

도 3: Gα 단백질과의 BBP1 상호작용을 입증하는 생물분석

BBP1의 예상된 내세포 도메인이 Gal4 활성화 영역 융합 단백질로서 발현된 래트 Gas, Gao, 또는 Gai2 부분이 있는 Gal4 DNA-결합 도메인으로서 발현된다. 각 균주의 독립적으로 유도된 두 클론의 Y2H 반응을 G 단백질 성분(벡터)이 결여된 세포의 반응과 비교한다. 프로토콜은 도 2에 대한 설명에 기술한 바와 같다.

도 4: BBP1과 BAP 간의 상호작용 위치선정

BBP1Δtm을 텍스트에 기술된 바와 같이 두 중첩 단편으로 세분한다. 이들 단백질 BBP1ΔC 또는 BBP1ΔN을 BAP와의 상호작용에 대해 분석한다. 분석법 및 균주 표지한 벡터 또는 BBP1Δtm은 도 2에 대한 설명에 기술한 바와 같다. 균주 표지한 BBP1ΔC 또는 BBP1ΔN은 융합 단백질로서 표시된 BBP1 단편을 발현한다.

도 5: 인간 조직(A) 및 뇌 영역(B)에서 BBP1 mRNA의 발현

지정 조직으로부터 분리한 2 ㎍ 크기의 분획화한 폴리-A RNA로 블로팅한 나일론 막을 CLONTECH로부터 입수한다. 이들을 기술한 바와 같이 방사능표지한 BBP1 cDNA 프로브와 하이브리드화시킨다. 1.25 kb(분자량 마커로부터 측정, 비도시)에 상응하는 우점 밴드가 모든 레인에서 관찰된다. 고분자량 밴드도 마찬가지로 이핵 RNA에 상응한다; BBP1 유전자는 수 개의 인트론을 함유한다. 블롯을 스트리핑하여 로딩 및 RNA 온전성 대조군으로서 β-액틴으로 재시험한다; 모든 레인은 동등한 시그널을 나타내었다(데이터 나타내지 않음).

도 6: 해마 세포에서 BBP1 및 APP의 발현

인간 해마 및 내비강 피질에서 BBP1(A) 및 APP(B) 발현 패턴을 보여주는 현장 하이브리드화 오토래디오그램의 이미지. 이러한 이미지 발생에 사용되는 절편을 두 명의 상이한 환자로부터 수득한 사후 시편으로부터 채취한다. 약어:DG = 치상회(dentate gyrus); CA1 = 해마 부분체; EC = 내비강 피질.

도 7: 인간 또는 설치류 BAP와의 BBP1 상호작용 비교

텍스트에 기술한 바와 같이 설치류 BAP를 공학처리하고 융합 단백질로서 발현시킨다. 균주 표지된 인간 BAP는 도 2에 도시된 것들과 동일하다. 균주 표지된 설치류 BAP는 Gal4 DNA-결합 도메인 융합으로서 설치류 BAP를 발현한다. 벡터는 BAP 융합 단백질에 대비되는 벡터만을 함유하는 대조군 균주를 표시하고; BBP1은 BBP1Δtm 융합 단백질을 발현하는 균주를 표시한다.

본 발명은 인간 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질(BBP1)의 분리 및 클로닝에 관한 것이다. BBP1은 BAP의 42 아미노산 단편(BAP42)에 결합하듯이 효모 2 하이브리드 분석에서 융합 단백질로서 특징규명된다. BBP1의 발현은 인간 조직 및 특정 뇌 영역에서 나타났다(도 5). 중요하게는, BBP1은 설치류 BAP에 비하여, 효모 2 하이브리드 시스템에서 인간 BAP에 선택적으로 결합하는 것으로 입증되었다. 이러한 발견은 본 발명의 BBP1이 알츠하이머병의 진단 및 치료에 및 뇌내 아밀로이드-함유 플라크의 축적 조절 약제의 평가 및 스크리닝에 사용될 수 있다는 전제를 지지한다.

BBP1 암호화 서열

BAP의 잠재적으로 더욱 유독한 형태인 인간 BAP₄₂와 상호작용하는 단백질의 동정을 위해 개발된 효모 2-하이브리드(Y2H) 유전자 스크린을 사용함으로써 초기 인간 BBP1 클론(클론 14로 명명)이 수득된다. BAP₄₂는 효모 Gal4 DNA-결합 도메인에 융합된 채로 발현되며 또한 유리 펩타이드로서 발현된다(도 1). 이러한 균주는 인간 태아 뇌 cDNA Y2H 라이브러리로 형질전환된다. 대략 10⁶독립 형질전환체로부터의 넘버 14로 표시한 단일 클론은 일관된 리포터 유전자 활성화를 일으키고 GAL4 도메인의 것과 연속상태인 실질적인 판독 프레임을 함유한다. cDNA 삽입체는 폴리-A 다발로 종결되는, 984 염기쌍을 포함한다. 이러한 서열은 세포막을 횡단하기에 충분한 길이와 소수성의 두 영역을 갖는 201개 아미노산(서열번호 2의 68 내지 269번 아미노산)을 암호화한다. 또한, 잠재적인 아스파라긴-결합된 글리코실화 부위가 존재한다. 클론 14는 클론 pEK196으로 명명되고 ATCC 98399로 기탁되어 있다.

라이브러리-유도된 플라스미드는 클론 14로부터 분리되고 Y2H 분석 균주의 재구성에 사용된다. 이러한 균주를 검사한 결과 반응은 약했지만, BAP 융합 단백질이 클론 14 단백질과 특이적으로 상호작용하였음을 입증한다. 막횡단 영역과 같은 소수성이 강한 단백질 도메인은 Y2H 반응을 억제하기 때문에(Ozenberger, 비공개 데이터), 클론 14 삽입체는 끝이 절단되어(BBP1Δtm; 추가 설명을 위해 하기의 표 2 참조) 가장 강력한 소수성 영역이 제거되며 BAP와의 상호작용에 대해 재시험된다. 한층 더 강건한 Y2H 반응이 BBP1Δtm으로 관찰되며, 이는 결실된 서열이 잠재적인 막횡단("tm") 앵커를 암호화한다는 개념을 지지한다. 클론 14는 융합 단백질 형태의 신규 BAP 결합 단백질을 동정한다.

클론 14에 함유되어 있는 BBP1 cDNA 서열은 어떠한 잠재적인 개시 메티오닌 코돈도 존재하지 않음에 따라 단백질 암호화 영역의 5′말단이 결여된 된 것으로 확인되었다. 표준 역전사효소를 이용한 통상적인 5′RACE(cDNA 말단의 고속 증폭)에서의 여러 시도는 27개 뉴클레오타이드를 첨가시켰을 뿐이다. 따라서, 하기 실시예 2에 기술된 게놈 클로닝 접근법이 5′말단의 분리에 사용되었다.

5′암호화 서열 말단이 게놈 라이브러리에서 유도되었으므로, 이러한 영역이 인트론을 함유하였을 가능성이 존재한다. 이러한 가능성이 하기 실시예 2에 기술된 두 방법에 의해 조사되었다. 결과적인 데이터는 상류 서열(게놈 및 cDNA원으로부터의 서열 둘다) 및 이 영역내 인트론의 결여를 확인시켜 주었다. 완전한 길이의 BBP1 단백질 암호화 영역을 암호화하는 cDNA 삽입체를 함유하는 플라스미드 BBP1-fl은 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁번호 98617로 기탁되어 있다. 전 암호화 영역 및 추론된 단백질 서열이 서열번호 1 및 2에 예시되어 있다. 3' 비해독 뉴클레오타이드 서열이 최초의 클론 14 (pEK 196)에 함유되어 있다.

본 발명에 따라서, BBP1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 이의 단편, 융합 단백질 또는 이의 기능성 등가물이 적당한 숙주세포에서 BBP1 또는 기능적 활성 펩타이드의 발현을 지시하는 재조합 DNA 분자의 생성에 사용될 수 있다. 또한, BBP1 서열 부분과 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열이 핵산 하이브리드화 분석, 서던 및 노던 블롯 분석 등에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명은 또한 감압된 엄격 조건, 좀더 바람직하게는 엄격 조건, 가장 바람직하게는 고엄격 조건하에서 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 엄격 조건의 예는 하기의 표에 예시되어 있다: 고엄격 조건은 예를 들면, 적어도 조건 A-F와 같이 엄격한 조건이고; 엄격 조건은 예를 들면, 적어도 조건 G-L과 같이 엄격한 조건이며; 감압된 엄격 조건은 예를 들면, 적어도 조건 M-R과 같이 엄격한 조건이다.

엄격 조건

엄격조건t	폴리뉴클레오타이드하이브리드	하이브리드길이 (bp)^I	하이브리드화 온도및 완충제 H	세척 온도및완충제 H
A	DNA:DNA	$ 50	65EC; 1xSSC 또는42EC; 1xSSC, 50 %포름아미드	65EC;0.3xSSC
B	DNA:DNA	＜ 50	T_B ^*; 1xSSC	T_B ^*; 1xSSC
C	DNA:RNA	$ 50	67EC; 1xSSC 또는45EC; 1xSSC, 50 %포름아미드	67EC;0.3xSSC
D	DNA:RNA	＜ 50	T_D ^*; 1xSSC	T_D ^*; 1xSSC
E	RNA:RNA	$ 50	70EC; 1xSSC 또는50EC; 1xSSC, 50 %포름아미드	70EC;0.3xSSC
F	RNA:RNA	＜ 50	T_F ^*; 1xSSC	T_F ^*; 1xSSC
G	DNA:DNA	$ 50	65EC; 4xSSC 또는42EC; 4xSSC, 50 %포름아미드	65EC;1xSSC
H	DNA:DNA	＜ 50	T_H ^*; 4xSSC	T_H ^*; 4xSSC
I	DNA:RNA	$ 50	67EC; 4xSSC 또는45EC; 4xSSC, 50 %포름아미드	67EC;1xSSC
J	DNA:RNA	＜ 50	T_J ^*; 4xSSC	T_J ^*; 4xSSC
K	RNA:RNA	$ 50	70EC; 4xSSC 또는50EC; 4xSSC, 50 %포름아미드	67EC;1xSSC
L	RNA:RNA	＜ 50	T_L ^*; 2xSSC	T_L ^*; 2xSSC
M	DNA:DNA	$ 50	50EC; 4xSSC 또는40EC; 6xSSC, 50 %포름아미드	50EC; 2xSSC
N	DNA:DNA	＜ 50	T_N ^*; 6xSSC	T_N ^*; 6xSSC
O	DNA:RNA	$ 50	55EC; 4xSSC 또는42EC; 6xSSC, 50 %포름아미드	55EC; 2xSSC
P	DNA:RNA	＜ 50	T_P ^*; 6xSSC	T_P ^*; 6xSSC
Q	RNA:RNA	$ 50	60EC; 4xSSC 또는45EC; 6xSSC, 50 %포름아미드	60EC; 2xSSC
R	RNA:RNA	＜ 50	T_R ^*; 4xSSC	T_R ^*; 4xSSC

^I: 하이브리드 길이는 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화하는 하이브리드화영역으로 예상된다. 미지 서열의 폴리뉴클레오타이드를 표적화하기 위해서 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화하는 경우, 하이브리드 길이는 하이브리드화 폴리뉴클레오타이드의 길이로 추정된다. 공지된 서열의 폴리뉴클레오타이드를 하이브리드화하는경우, 하이브리드 길이는 폴리뉴클레오타이드 서열을정렬시키고 최적 서열 상보성의영역(들)을 동정함으로써측정될 수 있다.^H: SSPE(1xSSPE는 0.15 M NaCl, 10 ml NaH₂PO₄및 1.25 mM EDTA, pH 7.4)가 하이브리드화및 세척 완충제에서 SSC(1xSSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 나트륨 시트레이트) 대신에 대체할 수 있고; 세척은 하이브리드화가 완료된 후 15 분 동안 수행된다.^*T_B-T_R: 길이가 50 염기쌍 이하로 예상되는 하이브리드를 위한 하이브리드화 온도는 하이브리드의 용융 온도 (T_m)보다 5-10EC 이하이어야 하고 T_m은 하기의 등식에 따라서 결정된다.길이가 18 염기쌍 이하인 하이브리드에 있어서, T_m(EC) = 2(A + T 염기의 수) + 4 (G + C염기의 수)이다. 길이가 18 내지 49 염기쌍인 하이브리드에 있어서, T_m(EC) =81.5 + 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41 (%G + C) - (600/N)이고, 여기에서 N은 하이브리드내염기의 수이고, [Na⁺]는 하이브리드화 완충제 중의 나트륨 이온의 농도이다( 1xSSC = 0.165 M에 대한 [Na⁺] = 0.165 M).

폴리뉴클레오타이드 하이브리드화를 위한 엄격 조건의 추가의 예가 문헌[참조: 본원에 참조로 인용된 Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley ＆ Sons, Inc. sections 2.10 and 6.3-6.4]에 기재되어 있다.

바람직하게는, 각각의 이러한 하이브리드화 폴리뉴클레오타이드는 이것이 하이브리드화하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 길이의 적어도 25%(좀더 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%)인 길이를 지니고, 이것이 하이브리드화하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 60% 동일성(좀더 바람직하게는 적어도 75% 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 90% 또는 95% 동일성)을 지니며, 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩과 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 하이브리드화 폴리뉴클레오타이드의 서열을 비교함으로써 측정된다.

BBP1의 발현

본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 단백질을 재조합 생산하기 위해서 문헌[참조: Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)]에 기재된 pMT2 또는 pED 발현 벡터와 같은 발현 조절 서열에 작동적으로 결합될 수 있다. 다수의 적합한 발현 조절 서열이 당분야에 공지되어 있다. 재조합 단백질의 일반적인 발현방법이 또한 공지되어 있고 문헌[참조: R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)]에 예시되어 있다. 본원에 정의된 바와 같이 "작동적으로 결합된"이란 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드와 발현 조절 서열이 단백질이 연결된 폴리뉴클레오타이드/발현 조절 서열로 형질전환(형질감염)된 숙주세포에 의해 발현되는 방식으로 벡터 또는 세포 내에 위치함을 의미한다.

BBP1을 위한 발현 시스템

다수 유형의 세포가 단백질 발현을 위한 적합한 숙주세포로서 작용할 수 있다. 포유동물 숙주세포에는 예를 들면, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (OHO) 세포, 인간 신장 293 세포, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo 205 세포, 3T3 세포, CV-1 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 1차 조직의 시험관내 배양물로부터 유도된 세포 균주, 1차 외식체, HeLa 세포, 마우스 L 세포, BHK, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포가 포함된다.

또한, 효모와 같은 하등 진핵세포 또는 세균과 같은 원핵세포에서 단백질을 생산하는 것이 가능할 수 있다. 잠재적으로 적합한 효모 균주에는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 균주, 칸디다(Candida) 또는 이종 단백질을 발현시킬 수 있는 임의 효모 균주가 포함된다. 잠재적으로 적합한 세균 균주에는 에세리히아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 이종 단백질을 발현시킬 수 있는 임의 세균 균주가 포함된다. 단백질이 효모 또는 세균에서 제조되는 경우, 예를 들면, 포스포릴화 또는 글리코실화에 의해서 생성된 단백질을 기능성 단백질을 수득하기 위해서 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 공유 부착은 공지된 화학적 또는 효소학적 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

단백질은 또한 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 곤충 발현 벡터 중의 적합한 조절 서열에 작동적으로 결합시키고 곤충 발현 시스템을 사용함으로써 생성될 수 있다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료 및 방법이 예를 들면, 미국 캘리포니아 샌디아고 소재의 Invitrogen으로부터 키트 형태로 시판되고 있으며(MaxBac 7 키트), 이러한 방법은 본원에 참조로 인용되는 문헌[참조: Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)]에 기재된 바와 같이 당분야에 익히 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있는 곤충세포는 "형질전환"된다.

본 발명의 단백질은 재조합 단백질을 발현시키기에 적합한 배양조건 하에서 형질전환된 숙주세포를 배양시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성되는 발현 단백질이 공지된 정제방법, 예를 들면, 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 이러한 배양물로부터(즉, 배양배지 또는 세포 추출물로부터) 정제될 수 있다. 단백질의 정제는 또한 단백질에 결합할 제제를 함유하는 친화성 칼럼; 콘카나발린 A-아가로스, 헤파린-토요펄 7 또는 시바크롬 블루 3GA 세파로스 7과 같은 친화성 수지 위에서의 하나 이상의 칼럼 단계; 페닐 에테르, 부틸 에테르 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 단계; 또는 면역 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질은 또한 정제를 촉진할 형태로 발현될 수 있다. 예를 들어, 이것은 융합 단백질, 예를 들면, 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 또는 티오레독신(TRX)으로서 발현될 수 있다. 이러한 융합 단백질의 발현 및 정제를 위한 키트는 New England BioLab(미국 매사추세츠 비버리), Pharmacia(미국 뉴저지 피스캣어웨이) 및 Invitrogen으로부터 각각 시판된다. 단백질은 또한 에피토프로 표지를 달고 이어서 이러한 에피토프에 대한 특이적 항체를 사용함으로써 정제될 수 있다. 하나의 이러한 에피토프("플래그")가 Kodak (미국 커네티컷 뉴 헤이븐)으로부터 시판된다.

마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들면, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 그룹을 갖는 실리카 겔을 사용하는 하나 이상의 역상 고 성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계가 단백질의 추가 정제에 사용될 수 있다. 전술된 정제 단계의 일부 또는 전부를 다양한 조합으로 사용하여 또한 실질적으로 균질한 분리 재조합 단백질을 제공할 수 있다. 이렇게 하여 정제된 단백질은 기타 포유동물 단백질을 실질적으로 함유하지 않고 본 발명에 따라 "분리된 단백질"로서 정의된다.

본 발명의 단백질은 또한 트랜스제닉 동물의 산물로서, 예를 들면, 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 체세포 또는 생식세포를 특징으로 하는 트랜스제닉 소, 염소, 돼지 또는 양의 우유 성분으로서 발현될 수 있다.

단백질은 또한 공지된 통상의 화학합성에 의해서 생성될 수 있다. 합성수단에 의한 본 발명의 단백질의 작제방법이 당분야 기술자들에게 익히 공지되어 있다. 합성 작제된 단백질 서열은 1차, 2차 또는 3차 구조 및/또는 형태적 특성을 단백질과 공유함으로써, 단백질 활성을 포함하여 이와 공통적인 생물학적 성질을 지닐 수 있다. 따라서, 이들은 치료 화합물의 스크리닝 및 항체 개발을 위한 면역학적 공정에서 천연의 정제된 단백질에 대한 생물학적 활성 또는 면역학적 대용물로서 사용될 수 있다.

본원에서 제공된 단백질은 또한 변형이 자연적으로 제공되거나 정교하게 공학처리된 정제된 단백질의 아미노산 서열과 유사한 서열을 특징으로 하는 단백질을 포함한다. 예를 들면, 펩타이드 또는 DNA 서열에 있어서의 변형은 공지 기술을 사용하여 당분야 기술자에 의해 제조될 수 있다. 단백질 서열에 있어 해당 변형에는 암호화 서열 중의 선택된 아미노산 잔기의 변경, 치환, 복위, 삽입 또는 결실이 포함될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 시스테인 잔기는 분자의 형태를 변경시키기 위해서 결실되거나 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 이러한 변경, 치환, 복위, 삽입 또는 결실에 대한 기술은 당분야 기술자들에게 익히 공지되어 있다(예를 들면, USP 제4,518,584호 참조). 바람직하게는, 이러한 변경, 치환, 복위, 삽입 또는 결실은 단백질의 원하는 활성을 보유한다.

따라서, 단백질 활성을 완전히 또는 부분적으로 보유하는 것으로 예상되는 단백질 서열의 기타 단편 및 유도체는 스크리닝에 유용할 수 있거나 본원의 명세서에 기재된 기타 면역학적 방법이 또한 당분야 기술자들에 의해서 수월하게 수행될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명에 의해서 포함되는 것으로 간주된다.

효모 2 하이브리드 분석

Y2H 분석은 BAP와 BBP1 융합 단백질의 결합이 특이적임을 나타낸다. BBP1과 BAP의 결합은 BBP1 활성이 알츠하이머병의 병인론에서 규정된 역할을 할 수 있음을 제안한다.

BBP1 서열을 기본 국소 정렬 조사 도구(BLAST; Altschul et al., 1990)를 사용하여 Genbank와 비교한다. BBP1 단백질 및 이용가능한 발현된 서열 태그의 해독물을 정렬하고 보존된 단편을 조사하고, MoST(Tatusov et al., 1994) 단백질 모티프 조사 알고리듬에 의해 평가한다. 이들 분석은 G 단백질 커플링 수용체(GPCR) 훼밀리에 대한 잠재적인 진화 관계를 보여준다. 구체적으로, 이들 분석은 BBP1이 G 단백질-커플링 수용체의 막횡단(tm) 도메인 3 및 4와 동등한 2개의 잠재적인 막횡단 도메인을 함유함을 나타낸다. 개재하는 친수성 루프는 잘 특징규명된 3개의 아미노산 모티프, 아스파테이트(D) 또는 글루타메이트에 이어서 아르기닌(R)과 방향족 잔기(Y 또는 F) (보통 DRY 서열이라 함)를 함유하고, 즉 이러한 수용체 훼밀리의 거의 모든 멤버에서 보존되며 G 단백질 활성화를 위한 분자 방아쇠로서 작용하는 것으로 나타났다(Acharya and Karnik, 1996).

Y2H 분석으로부터의 데이터(도 2 내지 4)는 BBP1이 G 단백질-커플링 수용체 수퍼훼밀리의 멤버와 공유된 기능성 모듈을 잠재적으로 함유하는 신규 단백질을 나타낸다. 구체적으로, BBP1이 두 예견된 tm 도메인 사이의 중요한 DRF 서열(서열번호 1의 199 내지 201번 아미노산)이고 G 단백질 조절 시그널링 경로에 커플링하는 잠재력을 지닐 수 있는 것으로 보인다.

APP는 Gαo와 기능적으로 결합하는 것으로 보이고(Nishimoto et al., 1993; Yamatsuji et al., 1996) BBP1은 관련된 G-단백질-커플링 수용체 중의 Gα 단백질 활성화 서열인 것으로 알려진 구조적 모티프를 함유한다. 또한, BBP1 tm 도메인의 예견된 위치 및 배향에 기초한 가설은 BAP와 상호작용하는 단백질의 영역이 APP 중의 BAP와 동일한 위치로 지형적으로 구속됨을 암시한다.

Y2H 분석 균주는 BBP1 세포내 영역과 Gα 단백질의 결합을 평가하기 위해서 공학처리된다. BBP1의 예견된 세포내 서열이 융합 단백질로서 발현되고 3개의 Gα 단백질의 C 말단 영역과의 상호작용에 대해 분석된다. 이러한 실험에 사용된 단백질 단편이 표 2에 수록되어 있다. BBP1 세포내 루프는 모든 3개의 Gα 단백질과 상호작용하고(도 3), 이는 BBP1가 G 단백질 활성의 조정자로서 기능할 수 있다는 전제를 지지한다. 이러한 다양한 Y2H 분석은 헤테로삼량체 G 단백질에 커플링된 필수 막 단백질 BBP1 및 APP로 최소한으로 이루어진 다중 단백질 복합체의 흥미로운 모델을 제안한다.

효모 2-하이브리드 분석에 사용되는 플라스미드

발현 플라스미드	단백질	단편
	BAP
pEK162	(인간)	1 - 42
pEK240	(마우스)	1 - 42
	BBP1
pEK196	(클론 14)	68 - 269
pEK198	(Δtm)	68 - 202
pEK219	(ΔC)	68 - 175
pEK216	(ΔN)	123 - 202
pEK339	(내세포성)	185 - 217
	Gα
pEK345	(Gαs)	235 - 394
pEK346	(Gαo)	261 - 302
pEK348	(Gαi2)	213 - 355

BBP1의 추가 분석이 Y2H 분석을 사용하여 수행된다. BPP1Δtm 클론에 함유된 BBP1의 2개의 중첩 서열이 증폭되고 Y2H 벡터 pACT2 중으로 클로닝된다(표 2의 발현 플라스미드 pEK216 및 pEK219 및 상응하는 단백질 BBP1ΔN 및 BBP1ΔC(도 4)). ΔC 작제물은 두 tm 도메인 모두 결여되고; ΔN 작제물은 제 1 tm 도메인+선행하는 52개의 아미노산을 암호화한다. 이러한 융합 단백질을 BAP 융합 단백질로 분석하고 반응을 더 큰 BBP1Δtm 단백질을 발현하는 균주와 비교한다. BBP1ΔC 단백질은 약한 Y2H 반응을 유도하지만(BBP1ΔC를 벡터와 비교, 도 4), 제 1 tm 도메인 및 인접한 아미노-근위 서열을 함유하는 BBP1ΔN 단백질은 BBP1Δtm으로 관찰된 것보다 단지 약간 더 약한 반응을 생성한다. 이러한 결과는 BAP와의 결합을 위한 주요 결정자가 야생형 APP 단백질 중의 BAP와 지형적으로 유사한 것으로 예견되는 BBP1 영역 내에 함유됨을 암시한다.

Y2H 시스템이 설치류 BAP에 비하여 인간 BAP에 대한 BBP1 결합의 선택성과 특이성 설명에 사용된다. 설치류 BAP 서열에는 인간 서열에 비하여 3개의 아미노산 치환(G5R, F10Y 및 R13H)이 존재한다. 실시예 6에 기재된 Y2H 분석에서, 설치류 펩타이드는 감소된 신경독성과 인간 뇌 균질물에 대한 결합의 부재를 설명한다(Maggio et al., 1992). 그러므로, Y2H 시스템에서 설치류 BAP와 BBP1의 결합을 평가하는 것이 흥미롭다. pEK 162 중의 인간 BAP의 서열을 PCR에 의한 올리고뉴클레오타이드 지향 돌연변이유발에 의해 설치류 펩타이드를 암호화하도록 변화시킨다. 생성된 플라스미드 pEK240은 설치류 펩타이드 서열에 대한 아미노산 치환을 일으키는 3개의 코돈을 제외하고 이러한 보고 전반에 걸쳐 사용된 인간 BAP 융합 단백질 발현 플라스미드와 동일하다. BBP1 융합 단백질과 설치류 및 인간 BAP 융합 단백질간의 상호작용을 Y2H 생체분석에 의해 비교한다. BBP1과 설치류 BAP를 발현하는 균주는 생장 반응을 산출하지 못한다(도 7). 이러한 발견은 BBP1이 BAP의 신경독성 효과의 특정 중개자로서 작용할 수 있다는 전제를 지지하고, 설치류 BAP의 감소된 신경독성 설명 메커니즘을 제공한다. 중요하게는, 이러한 데이터는 또한 3개의 아미노산 치환이 결합을 완전히 폐기하기에 충분하므로 Y2H 분석시 BBP1/BAP 상호작용의 고도의 특이성을 설명하는 역할을 한다 (도 7).

분리된 BBP1 폴리펩타이드

본 발명의 단백질 및 단백질 단편은 기재된 단백질 길이의 적어도 25 %(좀더 바람직하게는 적어도 50 %, 가장 바람직하게는 적어도 75 %)인 아미노산 서열 길이를 갖는 단백질을 포함하고, 그러한 기재된 단백질과 적어도 60 % 서열 동일성(좀더 바람직하게는 적어도 75 % 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 90 % 또는 95 % 동일성)을 지니며, 여기에서 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 단백질의 아미노산 서열을 비교함으로써 측정된다. 기재된 단백질의 이러한 단편과 적어도 75 % 서열 동일성(좀더 바람직하게는 적어도 85 % 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 95 % 동일성)을 공유하는 바람직하게는 8 이상(좀더 바람직하게는 20 이상, 가장 바람직하게는 30 이상)의 연속된 아미노산을 포함하는 단편을 함유하는 단백질 및 단백질 단편이 본 발명에 포함된다.

기재된 폴리뉴클레오타이드 및 단백질의 종 상동체가 또한 본 발명에 의해서 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 종 상동체는 해당 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 기원과 상이한 기원의 종을 갖지만 해당 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드와 상당한 서열 유사성을 갖는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드 종 상동체는 해당 폴리뉴클레오타이드와 적어도 60 % 서열 동일성(좀더 바람직하게는 적어도 75 % 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 90 % 동일성)을 지니고, 단백질 종 상동체는 해당 단백질과 적어도 30 % 서열 동일성(좀더 바람직하게는 적어도 45 % 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 60 % 동일성)을 지니며, 여기에서 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 단백질의 아미노산 서열을 비교함으로써 측정된다. 종 상동체는 적합한 프로브 또는 프라이머를 본원에 제공된 서열로부터 제조하고 적합한 핵산원을 원하는 종으로부터 스크리닝함으로써 분리되고 동정될 수 있다. 바람직하게는, 종 상동체는 포유동물 종, 예를 들면, 팬 트로글로다이츠(Pan troglodytes), 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla), 퐁고 피그매우스(Pongo pygmaeus), 하일로베이츠 컨컬러(Hylobates concolor), 마카카 멀라타(Macaca mulatta), 파피오 파피오(Papio papio), 파피오 하마드라이아스(Papio hamadryas), 세르코피테쿠스 애티옵스(Cercopithecus aethiops), 세부스 카푸시누스(Cebus capucinus), 아오투스 트리버가투스(Aotus trivirgatus), 산귀너스 오에디푸스(Sanguinus oedipus), 미크로세부스 무리누스(Microcebus murinus), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus), 펠리스 카투스(Felis catus), 무스텔라 비손(Mustela vison), 캐니스 훼밀리아리스(Canis familiaris), 오릭톨라구스 큐니큘루스(Oryctolagus cuniculus), 보스 타우루스(Bos taurus), 오비스 아리에스(Ovis aries), 수스 스크로파(Sus scrofa), 및 에쿠스 카발루스(Equus caballus)로부터 분리된 것들이고 유전자 지도가 생성되어 한 종의 유전자의 게놈 구성과 다른 종의 관련 유전자의 게놈 구성간의 신테닉(syntenic) 관계의 확인을 허용한다[참조문헌: O'Brien and Seuanez, 1988, Ann. Rev. Genet. 22: 323-351; O'Brien et al., 1993, Nature Genetics 3: 103-112; Johansson et al., 1995, Genomics 25: 682-690; Lyons et al., 1997, Nature Genetics 15: 47-56; O'Brien et al., 1997, Trends in Genetics 13(10): 393-399; Carver and Stubbs, 1997, Genome Research 7: 1123-1137; 모두 본원에 참조로 인용].

본 발명은 또한 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질의 대립유전자 변이체를 포함하고; 즉, 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 것들과 동일하거나 상당히 유사한 서열인 단백질을 또한 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 천연 대용물이다. 바람직하게는, 대립유전자 변이체는 해당 폴리뉴클레오타이드와 적어도 60 %의 동일성(좀더 바람직하게는 적어도 75 % 동일성; 가장 바람직하게는 적어도 90 % 동일성)을 지니고 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 비교함으로써 측정된다. 대립유전자 변이체는 적당한 프로브 또는 프라이머를 본원에서 제공된 서열로부터 제조하고 적합한 핵산원을 적당한 종의 개체로부터 스크리닝함으로써 분리되고 동정될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 서열과 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

적용

본 발명의 BBP1 단백질이 본 명세서를 토대로 당분야 기술자에게 일상적인 다양한 적용에 사용될 수 있다. 구체적으로 BBP는 클로닝된 폴리펩타이드에 특이적인 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 당분야에 공지된 다양한 절차가 BBP1 단백질에 대한 항체의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 항체에는 폴리클론, 모노클론, 키메릭, 일본쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되고 이에 제한되지 않는다. 항체의 생성을 위해서, 토끼, 마우스 및 래트가 포함되지만 이에 제한되지 않는 다양한 숙주동물이 BBP로 주사된다. 일 양태에서, 폴리펩타이드 또는 특이적 면역활성을 띨 수 있는 폴리펩타이드의 단편이 면역원성 캐리어와 접합된다. 보조제가 또한 숙주세포 동물의 면역반응을 증가시키기 위해서 폴리펩타이드와 병행하여 투여될 수 있다. 사용될 수 있는 보조제의 예에는 완전 및 불완전 Freund's, 미네럴 겔, 예를 들면, 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 예를 들면, 라이조레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 BBP1 단백질에 대한 모노클로날 항체가 배양물 중의 연속 세포주에 의한 항체의 생성을 제공하는 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 기술은 당분야 기술자들에게 익히 공지되어 있고 이에는 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature 1975, 256, 4202-497]에 최초 기재된 하이브리도마 기술, 문헌[참조: Kosbor et al., Immunology Today 1983, 4, 72]에 기재된 인간 B-세포 하이브리도마 기술 및 문헌[참조: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96]에 기재된 EBV-하이브리도마 기술이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

이어서 본 발명의 폴리펩타이드에 면역반응성인 항체는 생물학적 샘플내 유사 폴리펩타이드의 존재 및 아세포 분포 스크리닝에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 BBP1 단백질에 특이적인 모노클로날 항체는 치료제로서 사용될 수 있다.

BBP1 단백질은 또한 청구된 펩타이드와 면역반응하는 항체의 존재를 측정하는 고체상 분석에 유용한 항원으로서 작용할 수 있다. 고체상 경쟁 분석은 생물학적 샘플 중의 클론 14-관련 항원의 면역학적 양 측정에 사용될 수 있다. 이러한 측정은 본 발명의 폴리펩타이드 세포 기능(들)의 완전한 특징규명 촉진에 유용할 뿐만 아니라 이들 단백질을 비정상적인 양으로 갖는 환자의 확인에 사용될 수 있다.

본 발명의 BBP1 단백질은 또한 AD에 대한 마커로서 BAP 및 BAP 응집체의 검출을 위한 친화성 크로마토그래피의 포획 시약으로서 사용될 수 있다.

또한, 이들 BBP1은 BAP와 클로닝된 단백질의 상호작용을 수행하는 후보 분자를 동정하기 위한 분석에서 시약으로서 유용하다. 이러한 결합을 특이적으로 차단하는 화합물은 AD의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.

BBP1은 또한 무세포 시험관내 결합 분석에 유용하고 여기에서 이들 베타 아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 BAP 또는 BAP 응집체와의 결합시 화합물에 의한 변경이 측정된다. 무세포 분석은 이러한 분석이 비용 효과적이고 생세포를 사용하는 분석보다 수행하기 수월하므로 적정수 화합물의 스크리닝에 매우 유용하다. 본 발명의 폴리펩타이드의 기재시, 이들 분석의 개발은 숙련된 기술자들에게 일상적이다. 이러한 분석에서, BBP1 또는 BAP는 표지된다. 이러한 표지물에는 방사표지물, 항체 및 형광 또는 자외선 태그가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. BBP1의 BAP 또는 BAP 응집체와의 결합은 먼저 시험 화합물의 부재하에 측정된다. 이어서 시험될 화합물이 이러한 화합물이 상호작용을 변경시키는지를 측정하기 위해서 분석에 첨가된다.

본 발명은 또한 하기의 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 실시예는 특정 양태를 참조로 하여 단지 본 발명을 설명하기 위해서 제공된다. 본 발명의 특정 일면을 설명하는 이러한 예시는 제한을 나타내지 않고 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

효모 2-하이브리드 시스템 (이하 "Y2H"): Y2H 발현 플라스미드를 벡터 pAS2와 pACT2(WadeHarper et al., 1993에 기재) 및 pCUP(Ozenberger and Young, 1995에 기재)에서 작제한다. 효모 균주 CY770(Ozenberger and Young, 1995)은 모든 Y2H 분석에 대한 숙주로서 작용한다.

유전자 스크린: 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)법이 BAP를 암호화하는 서열의 증폭 및 변형에 사용된다. 올리고뉴클레오타이드 넘버 1(5'-CC ATG GAT GCA GAA TTC CGA C) 및 넘버 3(5'-AAGCTTGTCGAC TTA CGC TATGAC AAC ACC GC)이 주형으로서 pCLL621, 변형된 인간 APP 클론(Jacobsen et al., 1994)을 사용하여 BAP 증폭에 사용된다. 증폭된 DNA는 하기 변형을 갖는 APP 전구체 단백질의 코돈 389 내지 430(BAP₄₂를 암호화함)으로 이루어진다. 센스 본쇄 프라이머는 pAS2의 Ncol 부위와 동일한 해독 판독 프레임에 5' Ncol 제한부위를 첨가한다. 안티센스 본쇄 프라이머는 클로닝을 위해 정지 코돈 및 HindIII 및 SaII 부위를 첨가한다. 이러한 증폭으로부터의 산물을 TA 클로닝 시스템(미국 캘리포니아 칼스배드 소재의 Invitrogen Corp.) 중으로 연결시키고 이어서 Ncol 및 SaII 분해에 의해 제거시킨다. 이 단편을 Ncol과 SaII로 절단된 pAS2 중으로 클로닝한다. 생성된 플라스미드 pEK162를 GAL4/BAP 연접부를 통해 DNA 서열분석에 의해 확인한다. pEK162로부터 발현된 단백질(BAP^BD; 도 1)은 BAP의 42 아미노산의 카복시 말단으로의 첨가와 함께 효모 전사 활성화 단백질 Gal4의 DNA-결합 도메인(기능성 활성화 서열 결여)을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 비변형 BAP₄₂의 발현을 매개하는 발현 플라스미드가 생성된다. 올리고 넘버 2(5' - AAGCTTAAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA C)는 전술한 PCR에서 올리고 넘버 3와 쌍을 이룬다. 이러한 증폭 산물은 사카로마이세스 세레비지애에서 발현을 위해 최적화된 5' HindIII 부위와 해독 개시 시그널을 함유한다. 재차, DNA 단편을 TA 시스템 중으로 클로닝한다. 이는 HindIII 단편에 의해 분리되어 HindIII로 절단된 pCUP 중으로 클로닝된다. 생성된 플라스미드 pEK149(BAP; 도1)에서 BAP 유전자의 배향을 DNA 서열분석에 의해 확인한다. BAP 발현 플라스미드 pEK149(URA3를 선별 마커로 이용함) 및 pEK162(TRP1을 선별 마커로 이용함)를 효모 숙주 CY770(Ozenberger and Young, 1995) 중으로 형질전환한다. 두 플라스미드를 함유하는 균주를 CY2091로 명명한다. 효모 2-하이브리드 발현 벡터 pACT2(선별 마커로 LEU2이 사용됨) 중으로 클로닝된 인간 태아의 뇌로부터 분리된 cDNA 단편으로 이루어진 플라스미드 라이브러리를 Clontech Laboratories, Inc(미국 캘리포니아 팔로 알토)로부터 구입한다. 라이브러리-유도 단백질을 도 1에서는 미지^AD로 묘사하고 있다. 이 라이브러리를 사용하여 CY2091을 형질전환한다. 샘플을 우라실, 트립토판, 및 루이신이 결여된 합성 완전(SC) 효모 생장 배지상에 스프레딩시켜 모든 세 종류의 플라스미드를 함유하는 세포를 선별한다. 배지는 또한 히스티딘이 결여되어 있고 효모 HIS3 유전자의 산물 억제제인 3-아미노-트리아졸을 25 mM의 농도로 함유한다. 3-아미노-트리아졸은 저수준의 HIS3 유전자의 구성적 발현으로부터 활성을 감소시키는데 이용된다. 플레이트를 30℃에서 12일간 배양한다. 증가된 히스티딘 독립영양성을 나타내는 24개의 콜로니를 분리한다. 형질전환 대조군은 10⁶개의 개개 클론이 스크린 분석됨을 나타낸다. PCR 접근법을 이용하여 양성 클론의 함량을 빠르게 측정한다. 총 DNA를 표준법에 의해 각 양성 균주로부터 분리해낸다. 이 물질은 라이브러리 벡터 pACT2의 클로닝 영역의 측면에 있는 올리고 넘버 4(5'-TTTAATACCA CTACAATGGA T)와 넘버 5(5'-TTTTCAGTAT CTACGATTCA T)를 이용하는 PCR의 경우에 주형으로 이용된다. DNA 단편을 TA 시스템으로 연결하고 DNA 서열분석으로 조사한다. 클론 넘버 14(상술됨)에 함유된 라이브러리 플라스미드를 셔틀에 의해 이.콜라이 중으로 분리한다. 인간 cDNA 서열의 뉴클레오타이드 서열을 측정하여, 초기 PCR 산물의 서열을 확인한다.

생물분석: 균주를 밤새 루이신과 트립토판이 결여된 2㎖의 SC 배지에서 대략 7 x 10⁷세포/㎖의 밀도로 배양한다. 세포수를 계산한 다음 10배로 연속 희석하여 멸균수에 10⁴내지 10⁸세포/㎖가 되게한다. 이들 샘플을 루이신, 트립토판 및 히스티딘이 결여되고 25 mM의 3-아미노-트리아졸을 함유하는 SC 배지상에 5 ㎕ 분취량으로 스포팅한다. 플레이트를 30℃에서 2 내지 3일간 배양한다. Gal4 DNA-결합 도메인 융합 단백질과 비관련 전사 활성 도메인 융합 단백질(또는 삽입된 서열없이 단순히 pACT 벡터를 함유)을 발현시키는 대조군 균주에 비해 증가된 독립영양성 생장에 의해 양성 단백질/단백질 상호작용을 확인한다. 이들 대조군 균주를 앞서 기술된 도면에서 표지 '벡터'로 나타낸다. 이 분석법은 고도로 재현가능하고 표적 단백질간의 특정 상호작용에 의해 매개된 포착이 어려운 생장 유도를 검출해 낸다. 최초 BBP1 클론(pEK196으로 명명되고 ATCC 98399로 기탁됨; 본원에서 클론 14로 언급됨)을 PCR 주형으로 사용하여 BBP1Δtm을 발현시키도록 단백질 산물을 자른다. 센스 프라이머 넘버 6(5'-TTTAATACCA CTACAATGGA T)를 pACT2에서 GAL4 서열에 어닐링한다. 안티센스 프라이머 넘버 7(5'-CTCGAG TTA AAA TCG ATC TGC TCC CAA CC)은 3'-종결 코돈과 Xhol 부위를 BBP1의 DRF 모티프를 암호화하는 서열 바로 3'에 통합시킨다. PCR 산물을 TA 클로닝 벡터 중으로 연결하고 추후 EcoRI+Xhol로 분해하여 pACT2 중으로 클로닝한다. 이 플라스미드(pEK198)에서 발현된 하이브리드 산물을 BBP1Δtm으로 명명한다. 이와 유사하게, 프라이머 넘버 7은 프라이머 넘버 8(5'-GAATT CCA AAA ATA AAT GAC GCT ACG)과 쌍을 이루어 BBP1ΔN 발현 플라스미드 pEK216을 만든다. 또한, PCR 산물을 TA 시스템 중으로 연결하고 BBP1 단편(코돈 123-202)을 지닌 EcoR1-XhoI으로 분해된 생성 플라스미드를 최종적으로 동일 효소로 분해된 pACT2 중으로 연결한다. 안티센스 올리고 넘버 9(5'-CTCGAG TCA AGA TAT GGG CTT GAA AAA AC)을 지닌 pACT2-특정 올리고 넘버 6를 이용하여 BBP1ΔC를 제조한다. TA 클로닝, EcoRI+XhoI 단편의 분리 및 pACT2 중으로의 클로닝 후, 생성된 플라스미드 pEK219는 잔기 68에서 175까지의 BBP1을 발현시킨다. BBP1 세포내 루프를 암호화하는 서열을 올리고뉴클레오타이드 넘버 10(5'-CCTTCC ATG GAA GTG GCA GTC GCA TTG TCT)과 넘버 11(5'-AACACTCGAG TCA AAA CCC TAC AGT GCA AAA C)를 이용하여 증폭시킨다. BBP1 코돈 185에서 217을 함유하는 이러한 산물을 NcoI+XhoI으로 분해하고 NcoI+SaII으로 분해된 pAS2 중으로 클로닝하여 pOZ339를 생성한다. 모든 Gα 단백질 발현 플라스미드의 작제는 각 래트 cDNA 서열(Kang et al., 1990)의 중앙 가까이의 BamHI 부위를 pACT2중의 융합 부위로 이용한다. 센스 프라이머는 BamHI 부위의 5' 서열에 어닐링되고; 안티센스 프라이머는 종결 코돈 3' 서열에 어닐링되며 Sall 제한 부위를 포함한다. 프라이머는 Gαo, 센스(넘버 17) = 5'-GTGGATCCAC TGCTTCGAGG AT, 안티센스 (넘버 18) = 5'-GTCGACGGTT GCTATACAGG ACAAGAGG; Gas, 센스(넘버 19) = 5'-GTGGATCCAG TGCTTCAATG AT, 안티센스(넘버 20) = 5'-GTCGACTAAA TTTGGGCGTT CCCTTCTT; Gai2, 센스(넘버 21) = 5'-GTGGATCCAC TGCTTTGAGG GT, 안티센스(넘버 22) = 5'-GTCGACGGTC TTCTTGCCCC CATCTTCC이다. PCR 산물을 TA 벡터 중으로 클로닝한다. Gα 서열을 BamHI-SaII 단편으로서 분리하고 BamHI+SaII으로 분해된 pACT2 중으로 클로닝한다. 플라스미드 명칭에 대해 표 2를 참조하라. 최종적으로, 인간 BAP를 설치류 서열로 전환시기 위해 올리고뉴클레오타이드 넘버 23을 합성한다. 이 프라이머는 서열 5'-ATATGGCCATG GAT GCA GAA TTC GGA CAT GAC TCA GGA TTT GAA GTT CGT를 가진다. 트리플렛은 BAP의 첫 번째 13 코돈을 나타내고; 설치류 서열을 생성하기 위해 변화하는 세 개의 뉴클레오타이드는 밑줄 그어져 있다. 올리고 넘버 23은 주형으로 pEK162를 이용하는 PCR에서 클로닝 부위의 3'에 존재하는 Y2H 벡터 영역에 어닐링된 넘버 24(5'-TGACCTACAG GAAAGAGTTA)와 쌍을 이룬다. 산물을 NcoI+SaII으로 분해하고 pAS2 중으로 연결시켜 pEK240을 생성한다. 설치류 BAP를 암호화하는 부분의 뉴클레오타이드 서열을 확인한다.

게놈 클로닝; RACE(cDNA 말단의 고속 증폭):^a2.0 x 10⁶pfu에 상응하는 인간 게놈 람다 라이브러리(Stratagene)를 뉴클레오타이드 187-600에 상응하는 랜덤-프라이밍된 EcoRI/ClaI 단편 프로브를 이용하여 선별한다(도 2). 프로브를 제조자(Pharmacia)의 프로토콜에 따라^T7QuickPrimer Kit를 이용하여 [³²P]-CTP로 표지한다. 필터를 고 엄격조건: 50% 포름알데히드 중 40℃, 0.12 M NaHPO₄, 0.25 M NaCl, 7% SDS 및 25 ㎎/㎖의 초음파처리된 연어 정충 DNA하에 하이브리드화하고 0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 함유하는 0.1배의 SSC 중 65℃에서 세척한 다음 Kodak BioMax MS 필름에 노출시킨다. 프로브와 하이브리드화하는 람다 파아지 클론은 연속 플레이팅 및 재선별에 의해 정제된 플라크이다. 10개의 양성 클론을 정제하고 최초 cDNA 클론으로 알려진 최고의 5' 서열로 향하는 45 nt 올리고뉴클레오타이드 프로브에 하이브리드화시켜 추가 분석한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드에 대해 역 상보적이다. 157-201(도 2)은 서열 5'-CCAGGCGGCC GCCATCTTGG AGACCGACAC TTTCTCGCCA CTTCC를 가진다. 람다 파아지 DNA를 표준 분자 생물학 기술로 분리하고 ABI 373 서열분석기상에서 서열분석하는 형광 디데옥시 사이클을 이용하여 직접 서열분석한다.

RACE: rTth 열-안정성 폴리머라제 시스템(Perkin Elmer)을 이용하여 제 1 본쇄 DNA 합성을 수행한다. 1.5 mL 튜브에 하기 시약을 합쳐 10 마이크로리터 용적을 만든다: 1배의 역 전사 완충액, 1 mM MnCl₂, 1.6 mM dNTP 믹스, 2.5 U rTth 폴리머라제, 100 ng 인간 해마 폴리 A⁺RNA(Clontech), 10 mM 올리고뉴클레오타이드 (nt 429-452, 도 2; 5'-GTTATGTTGG GTGCTGGAAA ACAG). 반응물을 70℃에서 15분간 배양하고 즉시 얼음 위에 둔다. 제 2 본쇄 cDNA 생성을 위해서는 Marathon cDNA 합성 키트(Clontech)를 사용한다. 제 1 가닥 반응에서 나온 전체 10 ㎕를 하기 시약과 합쳐 80 ㎕의 용적에 이르게 한다: 1배의 제 2 본쇄 완충액, 0.8 mM dNTP 믹스, 4배의 제 2 가닥 칵테일(이.콜라이 DNA 폴리머라제 I, 이.콜라이 DNA 리가제, 이.콜라이 RNaseH), 및 dH₂O. 튜브를 16℃에서 1.5 시간 동안 배양한 후 T4 DNA 폴리머라제(10U)를 첨가하고 16℃에서 추가 45분간 배양한다. 반응을 종료하기 위해, 20배의 EDTA/글리코겐(0.2 M EDTA/2 mg/㎖ 글리코겐) 4 ㎕를 반응 믹스에 첨가한 다음 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출에 의해 효소 및 기타 불순물을 제거한다. 0.1배의 용적 3 M Na 아세테이트 pH 5.2 및 2.5배의 용적 시약 등급 EtOH를 첨가하여 DNA를 침전시키고 -70℃에 둔다. DNA를 70% EtOH로 1회 세척하고, 건조시킨 다음 10 ㎕ dH₂O에 재현탁한다. 추후 RACE PCR 반응에 이어 하기와 같은 Clontech 프로토콜이 사용될 수 있는 Marathon 아답터 연결을 위해 DNA의 반 정도가 이용된다: 5 ㎕ cDNA를 2 ㎕(10 mM)의 Marathon(5'-CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT), 1배의 DNA 연결 완충액 및 1 ㎕의 (1U) T4 DNA 리가제에 첨가한다. 반응 믹스를 16℃에서 밤새 배양한다. 믹스를 초기 RACE 반응을 위해 1:50으로 희석하고 0.2 mL PCR 튜브에서 하기: 40 ㎕ dH₂O, 1 ㎕ 10배의 Klentaq DNA 폴리머라제(Clontech), 1 ㎕ (10 mM)AP1 프라이머(5'-CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC), 1㎕(10mM) BBP1-특이성 프라이머(nts.187-209에 상응, 도 2; 5'-CCAGACGGCCA GGGCGGCCGCC AT), 5 ㎕ 10배의 Klentaq 폴리머라제 완충액, 1 ㎕ 10 mM dNTP 믹스, 상기 반응에서 희석된 cDNA 1 ㎕와 합친다. Perking Elmer GeneAmp PCR 시스템 2400 열순환기를 이용하여 하기 사이클링 조건을 수행한다: 94℃에서 1분간 변성 사이클에 이어 94℃에서 30초의 5 사이클, 72℃에서 3분, 94℃에서 30초의 5 사이클, 70℃에서 3분에 이어 94℃에서 30초간 25사이클, 68℃에서 3분, 72℃에서 마지막 연장 7분. 이후 하기와 같은 네스팅 RACE PCR 반응을 행한다: 40 ㎕ dH₂O, 1 ㎕(1U) 10배의 AmplitaqGold DNA 폴리머라제(Perkin Elmer), 1 ㎕(10 mM) AP2 프라이머(5'-ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC), 1 ㎕(10 mM) BBP-1-특이성 프라이머(nts.172-194에 상응, 도 2; 5'-GCCGCCATCT TGGAGACCGA CAC), 5 ㎕ 10배의 Amplitaq 폴리머라제 완충액, 1 ㎕ 10 mM dNTP 믹스, 1 ㎕ 1차 RACE 산물. PCR 사이클링 조건은 94℃에서 9분의 초기 변성 사이클, 94℃에서 30초의 25 사이클, 68℃에서 30초, 72℃에서 2분에 이은, 72℃에서 연장 7분이다. PCR 산물을 1배의 TBE 완충액에서 1% 아가로스 겔상에 흘린다. 생성된 350 염기쌍 산물을 겔 정제하고 TA Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 직접 클로닝한다. 연결 믹스를 OneShot Cell(Invitrogen) 중으로 형질전환하고 X-gal을 함유하는 LB-앰피실린(100 ㎍/㎖) 아가 플레이트상에 플레이팅한다. mini-prep DNA를 얻어 ABI 373 서열분석기상에 형광 디데옥시 사이클 서열분석에 의해 조사한다.

노던 분석. Clontech(미국 캘리포니아 팔로 알토)로부터 인간 다중 조직 및 다중 뇌 조직 mRNA 노던 블롯을 얻는다. 최초 융합점에서 폴리-A 영역까지 뻗어있는 BBP1 서열을 pEK 196에서 유도된 TA 클론으로부터 EcoRI 단편에 의해 분리한다. 제조자는 β-액틴 DNA를 제공한다.³²P-dCTP(미국 뉴저지 피스캣어웨이의 Pharmacia Biotech)를 혼입하는 랜덤 프라이밍법을 이용하여 이들 DNA로부터 방사능표지된 프로브를 만든다. 68℃의 Express Hyb Solution에서 제조자(Clontech)의 지시에 따라 하이브리드화를 수행한다. 블롯을 2배의 SSC(1배의 SSC는 0.15M 나트륨 클로라이드, 0.015M 나트륨 시트레이트), 실온의 0.05% SDS에서 세척한 다음, 0.1배의 SSC, 50℃의 0.1% SDS에서 2회 세척한다. Kodak BioMax 필름에 노출시켜 하이브리드화 시그널을 관찰한다.

현장 하이브리드화. 완전한 길이의 인간 BBP cDNA를 함유하는 플라스미드 클론을 이용하여 PCR에 의해 리보프로브 합성을 위한 DNA 주형을 제조한다. cDNA의 3' UTR로 표적화된 단일 리보프로브를 사용한다. GenBank 데이터베이스와 대조해가며 프로브 서열을 체크하여 이들이 모든 기탁된 서열 중 적절한 표적만을 인식하도록 해준다. BBP1에 대한 리보프로브를 만들기 위해, 한쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 고안하여 BBP1 cDNA의 3' UTR의 275 염기쌍을 증폭시키고, 또한 T7(센스) 및 T3(안티센스) 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 첨가시킨다. 이들 프라이머는 하기 서열을 함유한다: 5'-TAATACGACT CACTATAGGG TTAGAAGAAA CAGATTTGAG(순방향); 5'-ATTAACCCTC ACTAAAGGGA CAAGTGGCAA CTTGCCTTTG(역방향). PCR 산물을 1.5%의 저융점 아가로스 겔상에서 겔 정제하고, 이 산물을 함유하는 밴드를 잘라내어, 페놀 및 페놀-클로로포름으로 추출한 다음, 에탄올로 침전시킨다. 펠릿을 건조시켜 1배의 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4)에서 재현탁시킨다. APP 리보프로브 주형은 Jacobsen 등(1991)이 기술한 바와같이, 단백질 암호화 영역의 Ddel-XhoI 단편으로 이루어진다. (³⁵S)-CTP(미국 매사추세츠 보스턴의 New England Nuclear) 및 Riboprobe Gemini^TM시스템(미국 위스콘신 매디슨의 Promega)을 이용하여 50 ng의 DNA 주형을 전사 반응에 이용한다.

현장 하이브리드화에서 앞서 기재한 바와같이 사후의 인간 해마 절편을 이용하는 조직화학을 수행한다(Rhodes, 1996). 절편을 Hacker-Brights 저온조에서 10 ㎛로 절단하고 Vectabond 시약(미국 캘리포니아 벌린게임의 Vector Labs)으로 코팅된 냉각된(-20℃) 슬라이드상에 해동-고정한다. 모든 용액을 0.1% (용적/용적) 디에틸피로카보네이트로 처리된 dH₂O에서 제조한 다음 오토클레이빙한다. 절편을 PBS(pH 7.4)의 4% 파라포름알데히드에 침지시켜 고정시킨 다음 pH 8.0의 2배의 SSC, dH₂O, 및 0.1M 트리에탄올아민에 순차적으로 침지한다. 이 절편을 0.25%(용적/용적)의 아세트산 무수물을 함유하는 0.1 M의 트리에탄올아민에 침지시켜 아세틸화하고, 0.2배의 SSC에서 세척하며, 50, 70 및 90%의 에탄올에서 탈수시킨 다음, 빠르게 건조시킨다. 0.9 M NaCl, 1 mM EDTA, 5배의 Denhard, 0.25 mg/㎖의 일본쇄 청어 정충 DNA(미국 메릴랜드 게이터스버그의 GIBCO/BRL), 10 mM Tris(pH 7.6)중의 50% 탈이온화된 포름아미드(미국 뉴저지 깁스타운의 EM Sciences)를 함유하는 예비하이브리드화 용액 1 ㎖를 각 슬라이드상에 피펫팅하고, 슬라이드를 50℃에서 가습 박스에서 3시간 동안 배양한다. 이 절편을 50, 70 및 90% 에탄올에 침지시켜 탈수시킨 다음 공기 건조한다. 표지된 리보프로브를 최종 농도 50,000 cpm/㎕로 0.9 M NaCl, 1 mM EDTA, 1배의 Denhardt, 0.1 mg/㎖의 효모 tRNA, 0.1 mg/㎖의 일본쇄 연어 정충 DNA, 덱스트란 설페이트(10%), 0.08% BSA, 10 mM DTT(미국 인디애나 인디애나폴리스의 Boehringer Mannheim), 및 10 mM Tris (pH 7.6)중의 50% 탈이온화된 포름알데히드를 함유하는 하이브리드화 용액에 첨가한다. 프로브를 95℃(1분간)에서 변성시키고, 얼음(5분)에 둔 다음, 절편상에 피펫팅하여 55℃의 가습 챔버에서 밤새 하이브리드화한다. 이 절편을 추후 10 mM DTT를 함유하는 2배의 SSC, 37℃에서 1회 45분간 세척한 다음, 50% 포름알데히드를 함유하는 1배의 SSC, 37℃에서 1회 30분간, 및 2배의 SSC, 37℃에서 1회 30분간 세척한다. 일본쇄 및 비-특이적으로 하이브리드화된 리보프로브를 소 췌장 RNAse A(Boehringer Mannheim; 40 mg/㎖)를 함유하는 10 mM Tris pH 8.0, 0.5 M NaCl, 및 1 mM EDTA에 침지시켜 분해한다. 절편을 60℃에서 1시간 동안 2배의 SSC에서 세척한 다음 60℃에서 2시간 동안 0.5% (중량/용적) 나트륨 티오설페이트를 함유하는 0.1배의 SSC로 세척한다. 절편을 0.3 M 암모늄 설페이트를 함유하는 50, 70, 90% 에탄올에서 탈수시킨 다음 건조한다. 슬라이드를 X-선 카세트 중으로 로딩하고 14-30일간 Hyperfilm b-Max(Amersham)과 마주보게 한다. 일단 만족스럽게 노출되면, 슬라이드를 핵-트랙 에멀션(NTB-2; Kodak)으로 코팅하고 4℃에서 7-21일간 노출한다. 에멀션 오토래디오그램을 전개하고 제조자의 지시에 따라 고정시킨 다음, 밑에 놓인 조직 절편을 헤마톡실린으로 염색한다. 비특이성 표지를 평가하기 위해, Riboprobe Gemini^TMSystem 키트(Promega)에 제공된 주형으로부터 대조군 프로브를 제조한다. 이 벡터를 Scal을 이용하여 선형화하고 T3 폴리머라제를 이용하여 전사한다. 생성된 전사 반응은 두 산물, 단지 벡터 서열을 함유하는 250 염기 및 1,525 염기 리보프로브를 제조한다. 이 대조군 프로브 혼합물을 상술한 바와같이 표지하고 50,000 cpm/㎕의 최종 농도가 되게끔 하이브리드화 용액에 첨가한다. 대조군 절편에서는 특정 하이브리드화가 관찰되지 않는데, 즉, 이들 절편은 신경해부학적 랜드마크(데이터 나타내지 않음)를 따르지 않는 매우 약한 균일한 하이브리드화 시그널을 제공한다.

실시예 1: BAP-결합 단백질(BBP 1)의 클로닝 및 분리

효모 2-하이브리드(Y2H) 유전자 스크린을 행하여 잠재적으로는 BAP의 좀더 유독성인 응집 형태로 간주되는 인간 BAP₄₂, 42 아미노산 단백질 가수분해 단편과 상호작용하는 단백질을 동정한다. 효모 Gal4 DNA-결합 도메인과 융합된 BAP₄₂를 발현시키고 이를 또한 유리 펩타이드 형태로 발현시킨다(도 1). 이 균주를 인간 태아의 뇌 cDNA Y2H 라이브러리를 이용하여 형질전환한다. 앞서 정의된 클론 14로 명명된 단일 클론은 대략 10⁶의 독립 형질전환체로부터 일관된 리포터 유전자 활성을 생성하고 GAL4 도메인의 것과 연속적인 실질적인 개방 판독 프레임을 함유한다. cDNA 삽입체는 폴리-A 다발로 종결되는 984 염기쌍으로 이루어진다. 이 서열은 세포막을 통과하기에 충분한 길이 및 소수성의 두 영역을 지닌 201 아미노산(서열번호: 2; 아미노산 잔기 68에서 269)을 암호화한다.

라이브러리-유도 플라스미드를 클론 14에서 분리하고 Y2H 분석 균주를 재작제하는데 사용한다. 이들 균주를 조사해 보면 비록 반응이 약하지만, BAP 융합 단백질이 특이적으로 클론 14 단백질과 상호작용함을 알 수 있다. 막횡단 영역과 같이 강한 소수성의 단백질 도메인이 Y2H반응(Ozenberger, 비공개 데이터)을 억제하기 때문에, 클론 14 삽입물은 가장 강한 소수성 영역을 제거하기 위해 절단되고(이하 BBP1Δtm) BAP와의 상호작용을 위해 재시험된다. BBP1Δtm(도 2)를 이용하여 보다 강한 Y2H 반응이 관찰되는데, 이는 결실된 서열이 잠재적 막횡단 ("tm") 앵커를 암호화함을 지지한다. 클론 14의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank와 대조해가며 조사되고; 이렇게 동정된 BAP 결합 단백질(BBP1)은 신규한 것으로 여겨진다.

실시예 2: BBP1의 5'말단의 분리 및 확인

실시예 1에 기재된 클론 14에 함유된 BBP1 cDNA 서열은 잠재적인 개시 메티오닌 코돈이 존재하지 않을 때 단백질 암호 영역의 5' 말단이 결여되어있다. 표준 역-전사효소를 이용하는 통상의 5' RACE(cDNA 말단의 고속 증폭)에서 다수의 시도는 단지 27 뉴클레오타이드를 첨가시킨다. 이들 서열은 ATG를 포함하지만, 이것이 개시 코돈이라고 확신하도록 하는 동일한 해독 판독 프레임에는 상류 종결 코돈이 없다. 게놈 클로닝 접근법을 개시하여 BBP1 유전자의 5' 말단을 분리한다.

클론 14의 5' 서열의 400 염기쌍(bps)에 상응하는 램덤-프라이밍된 프로브를 이용한 인간 게놈 람다 라이브러리의 하이브리드화에 의해 10개의 양성 클론이 동정되었다. 클론 14의 최상류 BBP1 서열에 대한 45-염기 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하고 400 염기쌍 프로브의 5' 상류 서열에 상응하는 이들 클론의 추가적인 특징규명은 10 클론 중 6이 앞서 동정된 것내에 함유된 말단 5' 서열을 포함함을 드러낸다. 기타 4 람다 클론은 최초 400 염기쌍으로 랜덤-프라이밍된 cDNA-유도 프로브(데이터는 나타내지 않았음)내에 함유된 기타 엑손을 나타내는 것으로 확인된다. BBP1의 5'말단에 상응하는 대표적인 클론으로부터 람다 파아지 DNA의 직접적인 사이클 서열분석은 클론 14로 알려진 서열의 상류에 있고 이와 중첩되는^a500 뉴클레오타이드를 나타낸다. 이 부수적인 서열은 프레임내 종결 코돈에 선행하는 MET에 이르기 전에 앞서 특징규명된 MET의 상류 62 추가 아미노산을 잠재적으로 암호화한다. 가장 먼 상류 MET로부터 하류에 두 MET 잔기가 존재하지만, 표준 약정에 의해 본 출원인은 프레임내 종결 코돈을 따르는 최초 5' MET를 포함하도록 인간 BBP1 유전자의 아미노 말단 서열을 시험적으로 규정하고 있다. 전체 암호화 영역 및 추정된 단백질 서열은 서열번호:1과 2로 도시된다. 이러한 아미노산 서열을 함유하는 플라스미드(BBP-1-fl로 명명)는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 기탁번호 98617로 기탁되어있다.

5' 암호화 서열은 게놈 라이브러리로부터 유도되기 때문에, 이 영역이 인트론을 함유하고 있을 가능성이 존재한다. 이러한 가능성은 두 가지 방법에 의해 조사된다. 첫째, 5' MET 영역에 대한 순방향 프라이머 및 최초 클론 14내의 역방향 프라이머를 이용하여 뇌 cDNA 및 게놈 DNA 서열을 증폭시킨다. 두 샘플로부터 동일한 크기의 산물이 생성되는데, 이는 이 영역내의 인트론의 부재를 나타내고 최초 서열과 상류 서열의 연결을 확인한다. 둘째, cDNA 서열은 게놈성 클론에서 얻어진 것과 일치하는 변형된 5' RACE 실험(상기 재료 및 방법 참조)에서 분리된다. 이들 발견은 상류 서열(게놈 및 cDNA원 모두) 및 이 영역에서의 인트론 결핍을 확인시킨다.

실시예 3: BBP1의 특징화

BBP1 서열을 기본 국소 정렬 조사 도구(BLAST; Altschul et al., 1990)를 이용하여 Genbank와 비교한다. 두 개의 캐노랩디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 및 하나의 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster) 게놈 서열 및 다수의 인간, 마우스 및 기타 포유류 발현 서열 태그가 동정된다. 그러나, 완전한 cDNA 서열은 유용하지도 않고 유전자의 것으로 간주되는 기능성 데이터도 아니다. BBP1 단백질 및 유용한 발현 서열 태그의 해독물을 정렬시켜, 보존된 단편을 조사한 다음, MoST(Tatusov et al., 1994) 단백질 모티프 조사 알고리듬에 의해 평가한다. 이들 분석은 G 단백질-커플링 수용체 훼밀리와의 잠재적 진화 관계를 나타낸다. 상세히 말하면, 이들 분석은 BBP1이 G 단백질-커플링 수용체의 막횡단(tm) 도메인 3과 4에 상응하는 두 개의 잠재적 막횡단 도메인을 함유함을 나타낸다. 삽입된 친수성 루프는 잘 특징규명된 3개의 아미노산 모티프, 아스파테이트(D) 또는 글루타메이트에 이어 아르기닌(R) 및 방향족 잔기(Y 또는 F)(보통은 DRY 서열로 언급됨)를 함유하며, 이는 이 수용체 훼밀리의 거의 모든 멤버에서 보존되고 G 단백질 활성(Acharya and Karnik, 1996)에 대한 분자 방아쇠로 작용함을 보여준다. 이들 데이터는 BBP1이 G 단백질-커플링 수용체 수퍼훼밀리의 멤버와 공유된 작용 모듈을 잠재적으로 함유하는 신규 단백질을 나타냄을 지적하고 있다. 상세히 말하자면, BBP1은 두 개의 예측된 tm 도메인간에 중요한 DRF 서열을 보유하고 있어, G 단백질 조절 시그널링 경로에 커플링하도록 하는 잠재력을 가질 수 있다.

BBP1의 구조 분석은 이것이 관련 G 단백질-커플링 수용체에서 Gα 단백질 활성화 서열로 알려진 구조 모티프를 함유함을 나타낸다. G 단백질 커플링 수용체의 각종 멤버와 BBP1 간의 상호작용을 입증하는 Y2H 분석은 도 3에 설명되어있다. 구조 예측을 근거로, BBP1은 관강 구획에 있는 두 말단으로 막을 2회 통과하는 것으로 묘사되고있다. 기타 배향이 완전히 배제되는 것은 아니다. 상술된 잠재적 단백질 상호작용을 Y2H 분석에서 조사한다. BBP1Δtm 클론에 함유된 BBP1 서열의 두 중첩 부위를 증폭시키고 이를 Y2H 벡터 pACT2(발현 플라스미드 pEK216 및 pEK219, 표 2 및 상응하는 단백질 BBP1ΔN 및 BBP1ΔC, 도4) 중으로 클로닝한다. ΔC 작제물은 두 개의 tm 도메인이 결여되어 있으며; ΔN 작제물은 제 1 tm 도메인과 선행하는 52 아미노산을 암호화한다. 이들 융합 단백질을 BAP 융합 단백질을 이용하여 분석하고 반응을 보다 큰 BBP1Δtm 단백질을 발현시키는 균주의 것과 비교한다. 이들 결과는 BAP와의 결합을 위한 주 결정자가 야생형 APP 단백질내의 BAP와 지형적으로 유사할 것으로 예상되는 BBP1 영역내에 함유됨을 암시한다.

실시예 4: 인간 BBP1 발현의 조직 분포

BBP1 mRNA 발현을 유전자 및 이의 산물의 활성을 설명하는 초기 단계에서와 같이 평가한다. 1.25 kb의 주요 전사체가 모든 조직에서 관찰된다(도 5A). 심장에서 발현 수준이 높다. 전뇌는 중간 수준의 발현을 나타낸다. 개개의 뇌 영역에서 유도된 샘플 모두 BBP1 발현을 나타낸다(도 5B). 흥미롭게도, 대뇌변연계 영역은 비교적 보다 많은 양의 BBP1 mRNA를 함유한다. 이들은 BAP 응집 및 관련 뇌독성이 초기에 일어나는 뇌 영역이다. BBP1-특이성 리보프로브를 이용하여 얻어진 현장 하이브리드화 오토래디오그램의 분석은 인간 해마 및 내비강 피질에서, BBP1 mRNA가 신경교세포와는 대조되게 뉴런에서의 발현과 일치하는 패턴으로 중간 내지 대형 세포에서 발현됨을 나타낸다(도 6). 또한, BBP1 mRNA는 실제로 모든 해마 및 내비강 뉴런에서 발현되는데, 즉, 하이브리드화 시그널의 강도면에서 실질적인 또는 라미나르 차이가 나타나지 않는다. 흥미롭게도, BBP1 발현 패턴은 놀랍게도 아밀로이드 전구체 단백질 APP의 mRNA에 대한 리보프로브를 이용하여 관찰된 패턴과 유사하다(도 6). 요약하면, BBP1 mRNA는 조사된 모든 조직 및 모든 뇌 영역에서 관찰된다. BBP1 mRNA 발현의 현장 분석도 또한 해마 영역에서 광범위한 발현을 나타낸다.

실시예 5: BBP1 발현의 세포주 분포

BBP1 발현을 다수의 세포주에서도 조사하며 dbEST, 국립 생물공학 정보 센터의 발현된 서열 태그의 컬렉션으로부터 데이터를 추출해 낸다. 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)법을 이용하여 재조합 단백질 발현을 위해 보통 이용되는 세포주 및 각종 암 세포주에서 BBP1 mRNA 발현을 정량 분석한다. BBP1을 햄스터 CHO 및 인간 HEK293 세포에서 관찰한다. 시그널을 배 간세포주 Ntera-2 및 신경아세포종주 IMR32 및 SK-N-SH에서 관찰한다. BBP1 발현을 하기 조직 기원을 나타내는 암 세포주에서 관찰한다: 결장(Cx-1, Colo205, MIP101, SW948, CaCo, SW620, LS174T), 난소(A2780S, A2780DDP), 유방(MCF-7, SKBr-3, T47-D, B7474), 폐(Lx-1, A5439), 흑색종(Lox, Skmel30), 백혈병(HL60, CEM), 전립선(LNCAP, Du145, PC-3). 하기 암 세포주로부터 분리된 mRNA를 탐지하는 노던 블롯은 모든 샘플에서 BBP1 발현을 입증한다: 전골수성 백혈병(HL-60), 암종(HeLa S3), 만성 골수성 백혈병(K-562), 림프구성 백혈병(MOLT-4), Burkitt 림프종(Raji), 결장직장 선암종(SW480), 폐 암종(A549), 및 흑색종(G361).

실시예 6: BBP1과 인간 BAP 대 설치류 BAP의 선택성 상호작용

인간 서열과 비교해 설치류 BAP 서열에는 세 개의 아미노산 치환체(G5R, F10Y 및 R13H)가 존재한다. 설치류 펩타이드는 감소된 신경독성 및 인간 뇌 균질물에 대한 결합의 부재를 나타낸다(Maggio et al., 1992). 따라서, Y2H 시스템내의 BBP1과 설치류 BAP의 관련성을 평가함이 관심사항이다. pEK162내의 인간 BAP 서열을 변화시켜 상술된 PCR에 의한 올리고뉴클레오타이드 지향 돌연변이유발에 의해 설치류 펩타이드를 암호화한다. 생성되는 플라스미드 pEK240은 설치류 펩타이드 서열대신 아미노산으로 치환되는 세 개의 코돈을 제외하고 본 발명을 통해 이용된 인간 BAP 융합 단백질 발현 플라스미드와 일치한다. Y2H 생물분석에 의해 BBP1 융합 단백질과 설치류 및 인간 BAP 융합 단백질 간의 상호작용을 비교한다. BBP1 및 설치류 BAP를 발현시키는 균주는 생장 반응을 산출하지 못한다(도 7). 이러한 발견은 BBP1이 BAP의 신경독성 효과의 특이적 매개자로 작용하여, 설치류 BAP의 감소된 신경독성을 설명하는 메커니즘을 제공할 수 있다는 전제를 뒷받침한다. 중요하게도, 이들 데이터는 또한 Y2H 분석에서 BBP1/BAP 상호작용의 고도의 특이성을 설명하는 역할을 하는데 이는 세 개의 아미노산 치환이 결합을 완벽히 없애기에 충분하기 때문이다(도 7).

본 발명은 전술한 설명과 실시예에 구체적으로 기술된 바와 다르게도 실행될 수 있음이 명백하다. 상기의 교시내용에 비추어 볼때 본 발명의 다양한 변형 및 변화도 가능하며 따라서 첨부 특허청구의 범위내에 들어온다.

참조문헌

서열목록

(1)일반정보:

(i)출원인:오젠버거 브래드 에이

제이콥슨 제이 에스

카즈코브스키 에일린

(ii)발명의 명칭:β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드

(iii)서열수:2개

(iv)서신왕래 주소:

(A)수취인:아메리칸 홈 푸로닥츠

(B)거리:원 캠퍼스 드라이브

(C)도시:파시파니

(D)주:뉴저지

(E)국가:USA

(F)우편번호:07054

(v)컴퓨터 판독형태:

(A)매체형:플로피 디스크

(B)컴퓨터:IBM PC 호환기종

(C)운영체계:PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어:PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30

(vi)현 출원 데이터:

(A)출원번호:US

(B)출원일:

(C)분류:

(viii)대리인 정보:

(A)성명:월시 앤드리아 씨

(B)등록번호:34,988

(C)참조/도켓 번호:98126

(ix)통신정보:

(A)전화:973-683-2169

(B)팩스:973-683-4117

(2)서열번호 1에 대한 정보:

(i)서열특징:

(A)길이:810 염기쌍

(B)유형:핵산

(C)본쇄형:일본쇄

(D)토폴로지:선형

(ii)분자형:mRNA

(ix)특성:

(A)명칭/키:CDS

(B)위치:1..807

(xi)서열배열:서열번호 1:

(2)서열번호 2에 대한 정보:

(i)서열특징:

(A)길이:269 아미노산

(B)유형:아미노산

(D)토폴로지:선형

(ii)분자형:단백질

(xi)서열배열:서열번호 2:

Claims

(a)서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(b)기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(c)기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(d)서열번호 1의 202 내지 807번 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(e)기탁번호 ATCC 98399로 기탁되어 있는 클론 pEK196의 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;

(f)기탁번호 ATCC 98399로 기탁되어 있는 클론 pEK196의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(g)서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(h)인간 β-아밀로이드 펩타이드 결합 활성을 보유하고, 서열번호 2의 68 내지 269번 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열 단편을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;

(j)상기 (a) 내지 (f)의 폴리뉴클레오타이드의 대립유전자 변이체인 폴리뉴클레오타이드;

(k)상기 (g) 내지 (h)의 단백질의 종 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및

(l)엄격한 조건하에서 (a) 내지 (h)에 명시된 폴리뉴클레오타이드 중 하나에 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 적어도 하나의 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되는 폴리뉴클레오타이드.
제 2 항의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 숙주세포.
제 3 항에 있어서, 세포가 원핵세포 또는 진핵세포인 숙주세포.
(a)제 3 항의 숙주세포 배양균을 적당한 배양배지에서 생장시킨 다음; (b)배양배지로부터 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 제 2 항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질의 제조방법.
제 5 항의 방법에 따라 제조된 단백질.
(a)서열번호 2의 아미노산 서열;

(b)서열번호 2의 68 내지 269번 아미노산의 아미노산 서열;

(c)기탁번호 ATCC 98617로 기탁되어 있는 클론 BBP1-fl의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 아미노산 서열; 및

(d)서열번호 2의 185 내지 217번 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 2의 아미노산 서열의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
제 7 항에 있어서, 단백질이 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
이종 단백질 또는 펩타이드 서열에 결합된 BBP1을 포함하는 융합 단백질.
제 9 항에 있어서, BBP1이 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
서열번호 1의 BBP1 서열 부분에 상보성인 안티센스 서열을 암호화하고 BBP1 유전자의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오타이드.
(a)폴리뉴클레오타이드에 특이적인 프로브를 프로브가 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 하이브리드화하기에 유효한 조건하에서 샘플에 하이브리드화시킨 다음; (b)서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 동일한 20개 이상의 염기쌍으로 된 영역을 갖는 핵산서열을 포함하는 프로브의 샘플 중의 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 측정하는 단계를 포함하는, 샘플내 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 측정방법.
(a)폴리뉴클레오타이드에 특이적인 프로브를 프로브가 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 하이브리드화하기에 유효한 조건하에서 샘플에 하이브리드화시킨 다음; (b)ATCC 98617 또는 ATCC 98399의 cDNA 삽입체의 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 90% 동일한 20개 이상의 염기쌍으로 된 영역을 갖는 핵산서열을 포함하는 프로브의 샘플 중의 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 측정하는 단계를 포함하는, 샘플내 β-아밀로이드 펩타이드-결합 단백질(BBP)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 측정방법.
서열이 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
서열이 ATCC 98617의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
(a)특이적 결합에 유효한 조건하에서 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 샘플과 배양한 다음; (b)샘플내 폴리펩타이드에 대한 시약의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 샘플내 검출방법.
(a)특이적 결합에 유효한 조건하에서 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약을 샘플과 배양한 다음; (b)샘플내 폴리펩타이드에 대한 시약의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 서열이 ATCC 98617의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드의 샘플내 검출방법.
(a)인간 β-아밀로이드 펩타이드의 이상발현 지표 샘플을 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 시약과, 인간 β-아밀로이드 펩타이드에 대한 시약의 특이적 결합에 유효한 조건하에서 배양한 다음; (b)샘플내 펩타이드에 대한 시약의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 β-아밀로이드 펩타이드(BAP)의 이상발현을 특징으로 하는 질환의 진단방법.
(a)인간 β-아밀로이드 펩타이드의 이상발현 지표 샘플을 ATCC 98617의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 시약과, 인간 β-아밀로이드 펩타이드에 대한 시약의 특이적 결합에 유효한 조건하에서 배양한 다음; (b)샘플내 펩타이드에 대한 시약의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 β-아밀로이드 펩타이드의 이상발현을 특징으로 하는 질환의 진단방법.
숙주로부터 유도된 샘플내 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드 존재여부 분석단계를 포함하는 진단방법.
(a)인간 β-아밀로이드 펩타이드를 포함하는 샘플을 시험 화합물 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 시약을 함유하는 시험배지에서, 인간 β-아밀로이드 펩타이드에 대한 시약의 특이적 결합에 유효한 조건하에서 배양하고; (b)시험 화합물의 존재 및 부재하에 샘플내 펩타이드에 대한 시약의 결합을 비교한 다음; (c)단계 (b)에서의 결합 간의 차이를 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 활성을 조절하는 시험 화합물과 연관시키는 단계를 포함하는, β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 활성을 조절하는 화합물의 동정방법.
(a)인간 β-아밀로이드 펩타이드를 포함하는 샘플을 시험 화합물 및 ATCC 98617의 cDNA 삽입체에 의해 암호화된 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 시약을 함유하는 시험배지에서, 인간 β-아밀로이드 펩타이드에 대한 시약의 특이적 결합에 유효한 조건하에서 배양하고; (b)시험 화합물의 존재 및 부재하에 샘플내 펩타이드에 대한 시약의 결합을 비교한 다음; (c)단계 (b)에서의 결합 간의 차이를 β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 활성을 조절하는 시험 화합물과 연관시키는 단계를 포함하는, β-아밀로이드 펩타이드 결합 단백질의 활성을 조절하는 화합물의 동정방법.
치료 유효량의 제 7 항의 폴리펩타이드를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌내 β-아밀로이드 펩타이드 축적의 억제를 요하는 환자의 치료방법.
제 2 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 트랜스제닉 또는 키메릭 동물.