JP2001514010A - インターフェロンβのような分泌タンパク質をコードする遺伝子を使用する治療のための方法および組成物 - Google Patents
インターフェロンβのような分泌タンパク質をコードする遺伝子を使用する治療のための方法および組成物Info
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Abstract
Description
の、インターフェロンタンパク質のような分泌タンパク質をコードするDNAの
送達に関する。
るタンパク質である。このうちのいくつかは、抗ウイルス、免疫調節性および抗
増殖性である。インターフェロンは、比較的低分子で、種特異的な単鎖ポリペプ
チドであり、ウイルス、ポリペプチド、マイトジェンなどのような種々のインデ
ューサーへの暴露に応答して、哺乳動物細胞によって産生される。インターフェ
ロンは、動物組織および細胞をウイルスの攻撃に対して防御し、かつ重要な宿主
防御機構である。ほとんどの場合、インターフェロンは、他の型の組織および細
胞よりも、それらが産生された種類の組織および細胞に対して、より良好な防御
を提供する。このことは、ヒト由来インターフェロンが、他の種に由来するイン
ターフェロンよりヒト疾患を処置するにおいて、より有効であり得ることを示す
。
インターフェロンアルファ[α])、線維芽細胞(インターフェロンベータ[β
])、および免疫(インターフェロンガンマ[γ])および非常に多くのそれら
の改変体として分類されている。インターフェロンに関する一般的な議論は、種
々のテキストおよび研究論文において見出され得、それらには以下:The I
nterferon System(W.E.Stewart,II,Spri
nger−Verlag、N.Y.1979);およびInterferon
Therapy(World Health Organization Te
chnical Reports Series 676,World Hea
lth Organization,Geneva 1982)(これらは、本
明細書中において参考として援用される)が含まれる。
ぜなら、これらの分子は、多重レベルで作用する抗癌活性を有するからである。
第1に、インターフェロンタンパク質は、ヒト腫瘍細胞の増殖を直接阻害し得る
。この抗増殖活性はまた、シスプラチン、5FUおよびタキソールのような認可
された種々の化学療法剤を用いて相乗的である。第2に、インターフェロンタン
パク質の免疫調節性活性は、抗腫瘍免疫応答の誘導を導き得る。この応答は、N
K細胞の活性化、マクロファージ活性の刺激、およびMHCクラスI表面発現の
誘導を包含し、これらは、抗腫瘍細胞傷害性Tリンパ球活性の誘導を導く。さら
に、いくつかの研究によって、IFN−βタンパク質は、抗脈管形成性活性を有
し得ることがさらに示されている。脈管形成、すなわち新たな血管形成は、固形
腫瘍の増殖のために重要である。証拠により、IFN−βがbFGFおよびVE
GFのような前脈管形成性因子の発現を阻害することによって脈管形成が阻害さ
れ得るということが示される。最後に、インターフェロンタンパク質は、組織再
構成において重要であるコラゲナーゼおよびエラスターゼのような酵素の発現を
もたらすことによって腫瘍侵襲性を阻害し得る。
ようである。例えば、I型インターフェロンタンパク質(αおよびβ)は、ヒト
B型肝炎ウイルス(「HBV」)およびC型肝炎ウイルス(「HCV」)の複製
を直接阻害するが、これらのウイルスに感染した細胞を攻撃する免疫応答も刺激
し得る。
ンパク質は、ウイルス性肝炎および固形腫瘍に対して限られた臨床成功しか有し
ていなかった。IFN−αは、HBVおよびHCVの両方の処置のために認可さ
れている;しかし、両方の場合における応答割合は、約20%に過ぎない。イン
ターフェロンタンパク質が、リンパ腫、白血病、黒色腫および腎臓細胞癌のよう
ないくつかの癌の処置のために認可されている一方で、インターフェロンが、固
体腫瘍の処置において単独または従来の化学療法剤と組み合わせて使用される臨
床治験の大部分は、不成功であった。
要な因子である。静脈内、筋肉内または皮下注射のいずれかによるインターフェ
ロンタンパク質の全身投与は、最も頻繁には、毛様細胞性白血病、後天性免疫不
全症候群(AIDS)および関連するカポジ肉腫のような障害の処置においてい
くらかの成功を伴って使用されてきた。しかし、それらの精製された形態のタン
パク質が特に変性しやすいことが公知である。特に、インターフェロンβについ
ては、溶液におけるインターフェロン変性の主要な機構は、凝集および脱アミド
である。溶液および他の産物におけるインターフェロン安定性の欠失は、現在ま
でその有用性が限定されていた。さらに、非経口インターフェロンタンパク質投
与(筋肉内、皮下または静脈内)後に、インターフェロンタンパク質のクリアラ
ンスの速度は、非常に迅速である。従って、今や、非経口タンパク質投与は、そ
の活性部位(固形腫瘍、または肝炎の場合には肝臓)で十分なインターフェロン
の局在化を可能にしないかもしれない。患者において非経口に与えられ得るイン
ターフェロンの量は、高インターフェロン用量で観察された副作用によって制限
される。より有効な治療が、明らかに必要である。
質の送達に付随する問題を排除することに関する。本発明は、インターフェロン
治療の方法に関し、ここでタンパク質自体よりむしろ分泌タンパク質をコードす
る遺伝子が送達される。
れた細胞の使用およびインターフェロンのような分泌タンパク質を送達するため
のその使用に基づいて遺伝子治療の方法を提供することである。本発明は、細胞
発現系を形成するための方法、これによって生成されたこの発現系、および発現
系を含む薬学的組成物を提供することによって、これらおよび他の目的を満たす
。この細胞発現系は、1つ以上の分泌タンパク質をコードする遺伝子を発現し、
そしてインサイチュでの哺乳動物レシピエントに遺伝子産物を送達するためのビ
ヒクルとして有用である。好ましい実施態様において、哺乳動物レシピエントは
、ヒトである。
ピエントの細胞での、症状を処置するためのインターフェロンタンパク質の発現
に関して記載される。この発現系は、哺乳動物レシピエントと同じ種の細胞およ
びインターフェロンタンパク質の発現のためにそこに含まれる発現ベクターを含
む。好ましくは、哺乳動物レシピエントはヒトであり、この発現ベクターは、ウ
イルスベクターを含む。
胞および分泌タンパク質を発現させるためにそこに含まれる発現ベクターを含む
。この発現ベクターは、複数の細胞の一部分にのみ含まれる。好ましくは、細胞
数の少なくとも0.3%がそのベクターを含む。好ましい分泌タンパク質はイン
ターフェロンであり、そして最も好ましいインターフェロンは、α、β、γ、お
よびコンセンサスインターフェロンであり、βインターフェロンが最も好ましい
。
なくとも一部分は、発現の際にインターフェロンをコードする単離されたポリヌ
クレオチドを有するアデノウイルスベクターを含む。この細胞発現系において、
アデノウイルスベクターは、(a)そのE1遺伝子における欠失および/または
変異を有するアデノウイルスベクター;(b)そのE2a遺伝子における欠失お
よび/または変異を有するアデノウイルスベクターであって、ヒトインターフェ
ロンβを発現する、アデノウイルスベクター;(c)そのE1およびE4遺伝子
の両方における欠失および/または変異を有するアデノウイルスベクター、なら
びに(d)その遺伝子の全ての欠失を有するアデノウイルスベクターであって、
ヒトインターフェロンβを発現する、アデノウイルスウイルスベクターからなる
群より選択される。
成物もまた、本発明内に含まれる。この組成物は、キャリアおよび哺乳動物レシ
ピエントと同じ種の遺伝的に改変された複数の細胞を含み、そしてこの細胞の少
なくとも一部分は、有効量の分泌タンパク質を発現するための発現ベクターを含
む。好ましい分泌タンパク質は、インターフェロンである。この組成物は、イン
ビボおよびエキソビボの両方の送達のための組成物を含む。
調製物を作製するための方法は、別の実施態様である。この方法は、以下:(a
)哺乳動物レシピエントと同じ種の複数の細胞を形成する工程、(b)複数の細
胞のうち少なくとも1つの細胞に分泌されたタンパク質を発現するための発現ベ
クターを導入して、少なくとも1つの遺伝的に改変された細胞を形成する工程、
および(c)薬学的に受容可能なキャリア中に少なくとも1つの遺伝的に改変さ
れた細胞を配置して、哺乳動物レシピエントのある部位に投与するために適切で
ある薬学的調製物を得る工程を包含する。
の工程:(a)少なくとも1つの細胞に分泌タンパク質を発現するための発現ベ
クターを導入して、少なくとも1つの遺伝的に改変された細胞を形成する工程、
および(b)哺乳動物レシピエントのある部位にこの遺伝的に改変された細胞を
接触させる工程、によって哺乳動物レシピエントの少なくとも1つの細胞を遺伝
的に改変する工程を包含する。この方法は、発現ベクターを導入する工程の前に
、哺乳動物レシピエントから少なくとも1つの細胞を取り出す工程をさらに包含
し得る。なお別の実施態様において、ベクターを導入する工程は、ベクターを複
数の細胞の一部分にのみ導入する工程を包含する。
細胞を取り出す工程;過剰の細胞がアデノウイルスを含まないように、この複数
の細胞のうち少なくとも1つに組換えアデノウイルスを投与する工程を包含する
。このアデノウイルスは、E1遺伝子における欠失を有し、そして分泌タンパク
質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。この複数の細胞は、被験体
に再導入される。
βタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベ
クターを、最初に被験体から細胞を取り出すことなく、被験体の細胞に直接投与
する工程を包含する。インビボおよびエキソビボでの方法は、局所的、眼内、非
経口、鼻腔内、気管内、気管支内、筋肉内、皮下、静脈内、筋肉内、および腹腔
内投与を可能にする。
身レベルで非常に高い局所的インターフェロン濃度を可能にする。これは、より
少ない副作用でより大きな有用性を生じる。また、インターフェロンタンパク質
治療において観察された状況(そこでは、タンパク質注射後に生じる(毒性を導
き得る)タンパク質濃度の非常に高いインターフェロン「バースト」またはピー
クの後に、インターフェロン濃度が、低すぎて有効でない可能性のある、非常に
低いレベルが続く)とは異なり、遺伝子治療によって送達されたインターフェロ
ンは、かなり一定のレベルで存在する。
注射が必要であるが、インターフェロン遺伝子を発現するベクターの、単回の投
与か、または数回の頻繁でない投与は、タンパク質の長期の安定した生成を提供
し得る。遺伝子治療は、異なる標的器官または腫瘍に対して、制御された様式に
おいて、インターフェロンの送達を可能にし得る。同一の細胞がインターフェロ
ンを発現し、分泌し、そして取り込む、自己分泌系が、確立され得る。従って、
非常に局所的な用量が、達成され得る。これらの高用量は、毒性の問題に起因し
て、非経口タンパク質投与によっては、達成され得ない。
全ての細胞、または肝炎感染肝臓における全ての細胞が、インターフェロン遺伝
子によって形質導入される必要があるわけではない。その遺伝子を取り込まない
細胞は、近隣の細胞(その遺伝子を有し、インターフェロンタンパク質を分泌す
る)によって影響を受ける(いわゆる「バイスタンダー効果」)。これは重要な
発見であり、そして処置レジメにおいて劇的な効果を有する可能性がある。なぜ
なら、腫瘍塊中の、または器官内の全ての細胞が、発現ベクターを含有する必要
があるわけではないからである。
たらすことが、示されている。この可能性のある中和抗体応答が、明確な局所領
域へのインターフェロン遺伝子の導入の後に減少し得るということがあるかもし
れない。局所的発現の他にも、発現されたインターフェロンは、内因性のヒト細
胞によって生成される。従って、このインターフェロンは、その構造およびグリ
コシル化において、より天然であり、そして、おそらく、細菌、酵母、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞で生成され、次に精製されて非経口的に注射されるイン
ターフェロンタンパク質よりも、より免疫原性が少ない。
い実施態様の詳細な説明、および添付の図面を参照して、より明らかである。
療方法の開発に基づく:(1)患者から容易に除去され得る、(2)遺伝性物質
の形質導入によって、インビトロで改変され得る、(3)レシピエントに都合よ
く移植され得る、(4)非血栓溶解性である、そして(5)大多数のレシピエン
トに移植され得る。開示されるインビボ遺伝子治療方法は、以下の特徴を有する
細胞を使用する:(1)レシピエントに存在し、そして(2)単離された遺伝物
質をインサイチュで発現するように改変され得る。遺伝子の改変された細胞は、
発現される遺伝物質の量を制御するための調節エレメントを含有する。
、細胞の位置する組織の正常な機能を妨げることなく、有利(例えば、治療的)
な効果を有するために必要な時間、その発現される物質を生成し続ける。
最も好ましくは、分泌タンパク質は、インターフェロンである。実際、インター
フェロンは、最も好ましい治療的因子であるが、任意の分泌タンパク質を用いる
遺伝子治療に適用可能である一般的な原理が、発見されている。本発明者らは、
インターフェロンのような分泌タンパク質がそれが発現されている細胞から放出
されるという事実に起因して、腫瘍塊または例えば、肝炎に感染した肝臓におけ
る細胞の全てが「分泌タンパク質」遺伝子によって形質導入される必要がないこ
とを、見いだした。遺伝子を取り込まない細胞は、その遺伝子を有し、そしてそ
のタンパク質を分泌する近隣の細胞の影響を受ける(すなわち、「バイスタンダ
ー効果」)。遺伝子治療は、インターフェロンを発現するようコードする単離さ
れたポリヌクレオチドを用いて記載されているが、(以下に規定するような)任
意の分泌タンパク質が、本発明の方法および組成物において可能性を有する。
援用される。
矯正される手順。
培養する手順。機能的遺伝子のようなポリヌクレオチドは、インビトロで細胞に
導入され、改変された細胞を培養物中で増殖し、そして次に被検体に再移植され
る。
、移入されたポリヌクレオチド(例えば、インターフェロンを発現するためにコ
ードする遺伝子)を、インサイチュでレシピエント生物の細胞(すなわち、レシ
ピエント内)に導入する。インビボ遺伝子治療は、いくつかの動物モデルにおい
て試験されており、近年の刊行物は、器官および組織中への、インサイチュでの
直接的遺伝子移入の実行可能性が報告している。
の遺伝子欠損に起因する疾患状態)、後天的病理(すなわち、先天的欠損に起因
しない病理学的状態)、ガンの状態ならびに予防プロセス(すなわち、疾患また
は所望されない医学的状態の予防)を含む。
よび分子生物学の状態によって明らかとなる、疾患または症候群をいう。
リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、または両方の組み合わせで
ある。4つのDNA塩基は、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)
、およびチミン(T)である。4つのRNA塩基は、A、G、C、およびウラシ
ル(U)である。
列に適用される場合、RNAまたはDNAポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレ
オチドの一部、cDNAまたは合成ポリヌクレオチドを意味し、これらは、その
起源または操作によって、(i)天然に会合するポリヌクレオチドの全てとは会
合しない(例えば、宿主細胞中に、発現ベクターの一部として存在する)か;あ
るいは(ii)天然に連結するものとは異なる、核酸または他の化学部分と連結
するか;あるいは(iii)天然には存在しない。「単離された」とは、さらに
ポリヌクレオチド配列:(i)例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によっ
て、インビトロで増幅されるか;(ii)化学的に合成されるか;(iii)ク
ローニングによって組み換え的に生成されるか;または(iv)切断およびゲル
分離によって精製される、ことをさらに意味する。
センスRNAに転写され得る天然に生じない核酸、ならびに、天然に生じる細胞
中で、発現されないかまたは生物学的に有意ではないレベルで発現されるインタ
ーフェロンタンパク質をコードする遺伝子を含む。説明のために、ヒトインター
フェロンβ1aをコードする、合成遺伝子または天然の遺伝子は、ヒト脳細胞に
関して、「単離された」と考えられる。なぜなら、後者の細胞は、天然にはイン
ターフェロンβ1aを発現しないからである。「単離されたポリヌクレオチド」
のさらに別の例は、誘導性プロモーターと相同組み換えを介する内因性インター
フェロンコード配列の組み合わせのような組み換え遺伝子を生成する、インター
フェロン遺伝子の一部のみの導入である。
する、DNA配列(すなわち、3’−5’ペントースホスホジエステル結合によ
る、相互に連結したヌクレオチドの直線的整列)。
ンパク質を生成するプロセス。
わち、腫瘍)の増殖の阻害および形質転換表現型の阻害(例えば、形態の変化に
よって測定される)の両方をいう。
0のいずれかのL−異性体アミノ酸が存在する。この用語はまた、アミノ酸のア
ナログおよびタンパク質アミノ酸のD−異性体およびそのアナログを含む。
ク質アミノ酸からなるポリマー。「ポリペプチド」は、しばしば比較的大きなポ
リペプチドに関して使用され、そして「ペプチド」は、しばしば低分子ポリペプ
チドに関して使用されるが、当該分野におけるこれらの用語の使用は、重複し、
そして変化する。本明細書において使用する場合、用語「タンパク質」とは、他
に記載しなければ、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドをいう。
分泌タンパク質の中には、多数の増殖因子および免疫モジュレータータンパク質
(例えば、種々のインターフェロン(α、β、γ)、インターロイキン(例えば
、IL−1、−2、−4、−8、および−12)、ならびに増殖因子(例えば、
GM−CSF、G−CSF))が存在する。
リヌクレオチド分子の遺伝子発現を介する、同一直線上で共有結合した2つ以上
のタンパク質をいう。
フェロン遺伝子における任意の変化(すなわち、欠失、置換、付加、または変化
)か、または野生型インターフェロンタンパク質における任意の変化。
それぞれの、インビボで存在するような、天然に生じるポリヌクレオチドまたは
アミノ酸配列。
の両方について、0.5×SSC〜約5×SSCおよび65℃と実質的に等価な
塩および温度条件。従って、本明細書において使用する場合、用語「標準的ハイ
ブリダイゼーション条件」は、操作的な定義であり、ハイブリダイゼーションの
範囲を含む。より高ストリンジェントな条件は、例えば、プラークスクリーニン
グ緩衝液(0.2% ポリビニルピロリドン、0.2% Ficoll 400
;0.2% ウシ血清アルブミン、50mM Tris−HCl(pH7.5)
;1M NaCl;0.1% ピロリン酸ナトリウム;1% SDS);10%
デキストラン硫酸、および100μg/ml変性超音波処理サケ精子DNAを
用いる65℃で12〜20時間でのハイブリダイゼーション、ならびに、75m
M NaCl/7.5mM クエン酸ナトリウム(0.5×SSC)/1% S
DSを用いる65℃での洗浄を含み得る。より低ストリンジェトな条件は、例え
ば、プラークスクリーニング緩衝液、10% デキストラン硫酸、および110
μg/ml変性超音波処理サケ精子DNAを用いる55℃で12〜20時間での
ハイブリダイゼーション、ならびに、300mM NaCl/30mM クエン
酸ナトリウム(2.0×SSC)/1% SDSを用いる55℃での洗浄を含み
得る。
制御および調節するヌクレオチドの配列。
よび翻訳を制御および調節する場合、そのポリヌクレオチド配列(DNA、RN
A)が発現制御配列と作動可能に連結されている。用語「作動可能に連結された
」とは、発現されるポリヌクレオチド配列の前の適切な開始シグナル(例えば、
ATG)を有すること、ならびに発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配
列の発現、および単離されたヌクレオチド配列によってコードされる所望のイン
ターフェロンの産生を可能にするように、正確なリーディングフレームを維持す
ることを含む。
つの遺伝子の発現を可能にする、ポリヌクレオチド(最も一般的にはDNAプラ
スミドであるが、ウイルスも含む)。このベクターは、細胞中で複製可能であっ
ても、なくてもよい。
よび非悪性、固形および液体腫瘍、ガン腫、ミエローマ、肉腫、白血病、リンパ
腫、および他のガン性、新生物性または腫瘍形成性疾患を含む。
ロンタンパク質の発現のための細胞および発現ベクターを含む。エキソビボ目的
のために、遺伝的に改変された細胞は、哺乳動物レシピエントへの投与に適し、
ここで、その細胞は、そのレシピエントの内因性の細胞を置換するか、または共
存する。インビボ目的のために、細胞はレシピエント内で作製される。
の方法を提供する。特に、本発明は、哺乳動物レシピエントの細胞をエキソビボ
で遺伝的に改変する方法、およびその遺伝的に改変された細胞をその哺乳動物レ
シピエントに投与する方法を提供する。エキソビボ遺伝子治療のための好ましい
実施態様において、細胞は自系細胞、すなわち、哺乳動物レシピエントから取り
出された細胞である。本明細書において使用する場合、用語「取り出す」とは、
インビボにおける天然に存在する位置から取り出された、細胞または複数の細胞
を意味する。患者から細胞を取り出す方法、ならびに単離された細胞を培養物中
で維持する方法は、当業者にとって公知である(Stylianou、E.、ら
、Kidney Intl.37:1563−1570(1992);Hjel le、J.H.、ら、Peritoneal Dialysis Intl.9
:341−347(1989);Heldin、P.、Biochem.J.2
83:165−170(1992);Di Paolo、N.ら、Int.J.
Art.Org.12:485−501(1989);Di Paolo、N.
ら、Clinical Nephrol.34:179−1848(1990)
;Di Paolo、N.、ら、Nephron 57:323−331(19
91))。本明細書の上記および下記の両方の、発明の詳細な説明に記載の全て
の特許、特許出願および刊行物は、本明細書において参考として援用される。
鎖ポリペプチドであって、種々のインデューサー(例えば、ウイルス、ポリペプ
チド、マイトジェンなど)への曝露に応答して哺乳動物細胞によって産生される
。最も好ましいインターフェロンは、組換え形態であり、そして種々のインター
フェロンを含むタンパク質生成のためのDNA組換え技術が、公知であり、いか
なる方法によっても本発明を限定することを意図しない。例えば、米国特許第4
,399,216号、同5,149,636号、同5,179,017号(Ax
elら)、および同4,470,461号(Kaufman)を参照のこと。イ
ンターフェロンα、β、γおよびコンセンサスインターフェロンの組換え形態が
産生されている。インターフェロンの形態は、システイン枯渇変異(例えば、イ
ンターフェロンβについて)およびメチオニン枯渇変異のような改変体をコード
するポリヌクレオチド配列を含む細胞から発現され得る。他の改変は、宿主細胞
の翻訳後プロセシング系を介して生じ得る。従って、特定のインターフェロンの
正確な化学構造は、いくつかの要素に依存し、そして本発明の範囲を限定するこ
とを意図しない。本明細書に記載の処方物において含まれるそのようなインター
フェロンタンパク質の全ては、適切な環境的条件に配置される場合、その生物活
性を保持する。
椎動物、好ましくは哺乳動物の野生型インターフェロン遺伝子配列由来であり、
そして当業者に周知の方法を使用して得られる。例えば、米国特許第5,641
,656号(1997年6月24日発行:トリI型インターフェロンプロタンパ
ク質および成熟トリI型インターフェロンをコードするDNA)、米国特許第5
,605,688号(1997年2月25日−組換えイヌおよびウマI型インタ
ーフェロン);米国特許第5,554,513号(1996年9月10日;ヒト
インターフェロンβ2AをコードするDNA配列);米国特許第5,541,3
12号(1996年7月30日−ヒト線維芽細胞β2インターフェロンポリペプ
チドをコードするDNA);米国特許第5,231,176号(1993年7月
27日、ヒト白血球インターフェロンをコードするDNA分子);米国特許第5
,071,761号(1991年12月10日、ヒトリンパ芽球腫インターフェ
ロンLyINF−α−2およびLyIFN−α−3のサブ配列をコードするDN
A配列);米国特許第4,970,161号(1990年11月13日、ヒトイ
ンターフェロンγをコードするDNA配列);米国特許第4,738,931号
(1998年4月19日、ヒトインターフェロンβ遺伝子を含むDNA);米国
特許第4,695,543号(1987年9月22日、ヒトαインターフェロン
Gx−1遺伝子)および米国特許第4,456,748号(1984年6月26
日、異なる天然に存在する白血球インターフェロンのサブ配列をコードするDN
A)を参照のこと。
用され得る。野生型インターフェロンポリヌクレオチド配列における変異は、従
来の当業者に公知の指向性変異誘発方法を使用して開発されている。用語「変異
」はまた、遺伝子融合体を含み、その結果以下のインターフェロン配列(本明細
書に参考として援用される)が全て「変異」配列として考慮されることを意味す
る。
トキシンをコードする配列と連結したγインターフェロン遺伝子を含むDNA構
築物);米国特許第4,959,314号(1990年9月25日、生物学的に
活性なネイティブタンパク質の合成ムテインをコードするDNA配列を有する遺
伝子);米国特許第4,929,554号(1990年5月29日、des−C
YS−TYR−CYS組換えヒト免疫インターフェロンをコードするDNA);
米国特許第4,914,033号(1990年4月3日、βインターフェロンを
含む改変βインターフェロンをコードするDNA分子)および米国特許第4,5
69,908号(1986年2月11日、マルチクラスハイブリッドインターフ
ェロンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するDNA)。
等価なポリヌクレオチドを提供するために変化させられ得る。ポリヌクレオチド
は、以下の条件の少なくとも1つを満たす場合、上記の配列と比較して「機能的
に等価」である: (a)「機能的等価物」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で任意の
上記の配列とハイブリダイズし、および/または、任意の上記の配列に対して縮
重しているポリヌクレオチドである。最も好ましくは、これは、野生型インター
フェロンの治療的活性を有する変異インターフェロンをコードする; (b)「機能的等価物」は、上記のインターフェロン配列の任意のポリヌクレ
オチドによってコードされるアミノ酸配列を発現のためにコードするポリヌクレ
オチドである。
の機能的等価物を含むが、これらに限定されない。従って、本明細書において使
用する場合、用語「機能的等価物」とは、インターフェロンタンパク質、または
哺乳動物レシピエントに対して、機能的等価物とみなされるインターフェロンと
同程度か、または改善された有益な効果を有するインターフェロンタンパク質を
コードするポリヌクレオチドをいう。当業者によって明らかなように、機能的に
等価なタンパク質は、組換え技術によって(例えば、「機能的に等価なDNA」
を発現することによって)、生成され得る。従って、本発明は、天然に生じるD
NA、ならびに非天然DNA(天然に生じるDNAによってコードされるのと同
一のタンパク質をコードする)によってコードされるインターフェロンを含む。
配列をコードするヌクレオチドの縮重に起因して、他のポリヌクレオチドが、イ
ンターフェロンをコードするために使用され得る。これらには、配列内の同一の
アミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換(従って、サイレント変化を生成
する)により変化される、上記の配列の全てまたは一部を含む。そのように変化
した配列は、これらの配列の等価物とみなされる。例えば、Phe(F)は、2
つのコドンによってコードされる(TTCまたはTTT)。Tyr(Y)は、T
ACまたはTATによってコードされ、そしてHis(H)は、CACまたはC
ATによってコードされる。一方、Trp(W)は、単一のコドン(TGG)に
よってコードされる。従って、特定のインターフェロンをコードする所定のDN
A配列にとって、これをコードする多くのDNA縮重配列が存在することが明ら
かである。これらの縮重DNA配列は、本発明の範囲内であると考慮される。
いて使用される場合、「コンセンサスインターフェロン」は、非天然ポリペプチ
ドであり、これは、その大部分が全ての天然ヒトインターフェロンサブタイプ配
列に共通であるアミノ酸残基を含み、そして全てのサブタイプに共通のアミノ酸
が存在しない1つ以上の位置では、その位置で主に生じるアミノ酸を含むが、少
なくとも1つの天然に生じるサブタイプにおいてその位置に存在しない任意のア
ミノ酸残基を、決して含まない。コンセンサスインターフェロン配列が、もし、
サブタイプ配列を有する場合、上記の参考文献の任意のインターフェロンのコン
センサス配列を包含する。例示的なコンセンサスインターフェロンは、米国特許
第4,695,623号および同4,897,471号(Amgen)に開示さ
れる。コンセンサスインターフェロンをコードするDNA配列は、これら特許に
記載のように合成され得るか、または他の標準的な方法によって合成され得る。
コンセンサスインターフェロンポリペプチドは、好ましくは、本明細書において
記載のように、宿主に形質転換されたか、またはトランスフェクトされた、生成
されたDNA配列の発現産物である。すなわち、コンセンサスインターフェロン
は、好ましくは、組換え的に生成される。そのような物質は、当業者に周知の手
順によって精製され得る。
単に説明のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。公知の状態
の処置のための適切なインターフェロンの選択は、過度の実験を要さない、当業
者の技術範囲内であるとみなされる。
の方法) 用語「形質転換」または「形質転換する」は、細胞の任意の遺伝的改変を言い
、そして「トランスフェクション」および「形質導入」の両方を含む。
加されたDNAの取り込みによる新規な遺伝物質の獲得をいう。従って、トラン
スフェクションとは、物理学的方法または化学的方法を使用する、細胞への核酸
(例えば、DNA)の挿入をいう。以下を含むいくつかのトランスフェクション
技術が、当業者に公知である:リン酸カルシウムDNA共沈法(Methods
in Molecular Biology、第7巻、Gene Trans
fer and Expression Protocols、E.J.Mur
ray編,Humana Press(1991));DEAE−デキストラン
(前出);エレクトロポレーション(前出);カチオン性リポソーム媒介トラン
スフェクション(前出);およびタングステン粒子加速微粒子ボンバードメント
(Johnston,S.A.、Nature 346:776〜777(19
90));およびリン酸ストロンチウムDNA共沈法(Brash D.E.ら
、Molec.Cell.Biol.7:2031〜2034(1987)。こ
れらの方法の各々は、当該分野において周知である。
使用して、細胞へ核酸を移入するプロセスをいう。ウイルス内に含まれる1つ以
上のインターフェロンタンパク質をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレ
オチド配列は、形質導入された細胞の染色体に取り込まれ得る。あるいは、細胞
は、ウイルスで形質導入されるが、細胞は、単離されたポリヌクレオチドを染色
体に取り込んでいないが、細胞内の染色体外でインターフェロンを発現し得る。
遺伝的に改変される)。細胞は、哺乳動物(好ましくは、ヒト)から単離され、
そして組換え分泌型タンパク質(たとえば、インターフェロン)を発現するため
の1つ以上の発現制御配列に作動可能に連結された組換え遺伝子のような、単離
されたポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換される(すなわち、インビト
ロで形質導入またはトランスフェクトされる)。次いで、細胞は、インサイチュ
でタンパク質の送達のための哺乳動物レシピエントに投与される。好ましくは、
哺乳動物レシピエントはヒトであり、そして改変される細胞は、自律的細胞であ
る(すなわち、細胞は哺乳動物レシピエントから単離される)。インビトロでの
細胞の単離および培養は、報告されている。
ボで遺伝的に改変される。哺乳動物レシピエント(好ましくは、ヒト)由来の細
胞は、分泌型タンパク質(すなわち、組換えインターフェロン)を発現するため
の1つ以上の発現制御配列に作動可能に連結された組換え遺伝子のような単離さ
れたポリヌクレオチドを含むベクターで、インビボにて形質転換(すなわち、形
質導入またはトランスフェクト)され、そしてそのタンパク質はインサイチュで
送達される。
上の治療用インターフェロンタンパク質をコードするcDNA)は、遺伝的に改
変された細胞を提供するために、遺伝子移入方法(例えば、トランスフェクショ
ンまたは形質導入)によって、エクスビボまたはインビボで細胞に導入される。
種々の発現ベクター(すなわち、標的細胞への単離されたポリヌクレオチドへの
送達を促進するためのビヒクル)が当業者に公知である。
ロモーターとともに、インターフェロン遺伝子のような単離されたポリヌクレオ
チド(通常は、インターフェロンをコードするエキソンを含む、cDNAの形態
)を含む。プロモーターは、転写を開始するために必要な特定のヌクレオチド配
列を特徴的に有する。必要に応じて、遺伝物質は、RNAスプライシングによっ
て成熟転写物から除去されるイントロン配列を含み得る。ポリアデニル化シグナ
ルは、発現されるべき遺伝子の3’末端に存在するべきである。導入される遺伝
物質はまた、治療用遺伝子産物(すなわち、インターフェロン)を細胞から細胞
外環境へ分泌するために適切な分泌「シグナル」配列を含み得る。
めに必要とされるさらなる配列(すなわち、エンハンサー)を含む。この議論の
目的のために、エンハンサーは、簡単には、コード配列と連続して(シスで)作
用してプロモーターによって指示される基本的な転写レベルを変化させる、任意
の非翻訳DNA配列である。
列の転写を可能にするように、単離された遺伝物質は、プロモーターのすぐ下流
の細胞ゲノムに導入される。好ましいウイルス性発現ベクターは、挿入されるイ
ンターフェロン遺伝子の転写を制御するための外因性プロモーターエレメントを
含む。そのような外因性プロモーターは、構成性プロモーターおよび誘導性プロ
モーターの両方を含む。
の発現を制御する。結果として、構成性プロモーターの制御下の遺伝子は、すべ
ての細胞増殖条件下で発現される。例示的な構成性プロモーターは、特定の構成
性機能または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子についてのプ
ロモーターを含む:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPR
T)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)(Scharfmannら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626〜4630 (1991))、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ(PG
K)、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、β−アクチンプロモ
ーター(Laiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 6:10006−10010(1989))、および当業者に公知の他の構成性
プロモーター。
能する。これらは、とりわけ以下を含む:SV40の初期プロモーターおよび後
期レセプター(BernoistおよびChambon,Nature,290
:304(1981)を参照のこと);モロニー白血病ウイルスおよび他のレト
ロウイルスの長い末端反復(LTR)(Weissら、RNA Tumor V
iruses,Cold Spring Harbor Laboratory
, Cold Spring Harbor、NY(1985)を参照のこと)
;単純ヘルペスウイルス(HSV)のチミジンキナーゼプロモーター(Wagn
erら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、78:1441 (1981)を参照のこと);サイトメガロウイルス前初期(IE1)プロモー
ター(Karasuyamaら、J.Exp.Med.,169:13(198
9)を参照のこと);ラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター(Yama
motoら、Cell、22:787(1980));アデノウイルス主要後期
プロモーター(Yamadaら、Proc. Nat. Acad. Sci.U SA、82:3567(1985))。従って、上記の構成性プロモーターのい
ずれかは、遺伝子挿入物の転写を制御するために使用され得る(B節もまた参照
のこと)。
の発現を標的化することが望ましくあり得る。例えば、特定の組織においてのみ
発現される、文献に記載された多くのプロモーターが存在する。例としては、B
型肝炎ウイルスの肝臓特異的プロモーター(Sandigら、Gene The
rapy 3:1002〜1009(1996)、およびアルブミン遺伝子(P
inkertら、Genes and Development、1:268〜
276(1987)が挙げられる;他の肝臓特異的プロモーターについては、G
uoら、Gene Thearapy、3:802〜810(1996)もまた
参照のこと。さらに、特定の腫瘍においてのみ発現される、文献において記載さ
れる多くのプロモーターが存在する。例としては、以下が挙げられる:PSAプ
ロモーター(前立腺ガン)、ガン胎児性抗原プロモーター(結腸ガンおよび肺ガ
ン)、β−カゼインプロモーター(乳ガン)、チロシナーゼプロモーター(黒色
腫)、カルシニューリンAαプロモーター(神経膠腫、神経芽腫)、c−シスプ
ロモーター(骨肉腫)、およびα−フェトプロテインプロモーター(肝ガン)。
は誘導剤の存在下でより大きな程度で発現される(例えば、メタロチオネインプ
ロモーターの制御下での転写は、特定の金属イオンの存在下で非常に増大する)
。マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復(MMTV LTR)内に存在するグ
ルココルチコイド誘導性プロモーターもまた参照のこと(Klessigら、M
ol.Cell.Biol.4:1354(1984))。誘導性プロモーター
は、それらの誘導因子が結合する場合に転写を刺激する応答性エレメント(RE
)を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチン酸、およびサイクリ
ックAMPについてのREが存在する。特定のREを含むプロモーターは、誘導
性応答を得るために選択され得、そしていくつかの場合において、RE自体は、
異なるプロモーターに結合され、それによって組換え遺伝子に誘導性を付与し得
る。
によって、遺伝的に改変された細胞におけるインターフェロンの発現の存在およ
びレベルの両方を制御することが可能である。インターフェロンをコードする遺
伝子が、誘導性プロモーターの制御下にある場合、インサイチュでのインターフ
ェロンの送達は、遺伝的に改変された細胞を、インターフェロンの転写を可能に
する条件下でインサイチュで曝露することによって、例えば、因子の転写を制御
する誘導性プロモーターの特定の誘導因子の注入によって誘発される。例えば、
メタロチオネインプロモーターの制御下のインターフェロン遺伝子によってコー
ドされたインターフェロンタンパク質の遺伝的に改変された細胞によるインサイ
チュ発現は、適切な(すなわち、誘導性)金属イオンを含む溶液と、遺伝的に改
変された細胞をインサイチュで接触させることによって増強される。
する、非常に洗練された系が開発されている。これらとしては、FK506/R
apamycin系(Riveraら、Nature Medicine 2(
9):1028〜1032、1996);テトラサイクリン系(Gossenら
、Science 268:1766〜1768、1995)、エクジソン系(
Noら、Proc. Nat. Acad. Sci.USA 93:3346〜 3351、1996)、およびプロゲステロン系(Wangら、Nature
Biotechnology 15:239〜243、1997)が挙げられる
。
子を制御することによって調節される:(1)挿入された遺伝子の転写を指向す
るために使用されるプロモーターの性質(すなわち、プロモーターが、構成性か
誘導性か、強いか弱いか、または組織特異的であるか);(2)細胞に挿入され
る外因性遺伝子のコピー数;(3)患者に投与(例えば、移植)される、形質導
入/トランスフェクトされた細胞の数;(4)エクスビボ方法における移植物(
例えば、移植片、またはカプセル化発現系)のサイズ;(5)エクスビボ方法に
おける移植物の数;(6)インビボ投与によって形質導入/トランスフェクトさ
れる細胞の数;(7)形質導入/トランスフェクトされた細胞または移植物が、
エクスビボおよびインビボ方法の両方の適切な場所に置かれた時間の長さ;なら
びに(8)遺伝的に改変された細胞による、インターフェロンの産生速度。
の選択および最適化は、先に開示された因子および患者の臨床的プロフィールを
考慮すると、過度な実験なしに当業者の範囲内にあると考えられる。
質であるので、遺伝子治療ベクターを含まない周辺の細胞はなお影響を及ぼされ
る(実施例を参照のこと)。結果として、本方法は、代表的には選択可能遺伝子
の使用を必要としない。にもかかわらず、少なくとも1つのプロモーター、およ
びインターフェロンをコードする少なくとも1つの単離されたポリヌクレオチド
に加えて、発現ベクターは、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入さ
れている細胞の選択を容易にするために、必要に応じて選択遺伝子(例えば、ネ
オマイシン耐性遺伝子)を含み得る。あるいは、細胞は、2つ以上の発現ベクタ
ー(少なくとも1つのベクターは、インターフェロンをコードする遺伝子を含み
、他のベクターは選択遺伝子を含む)でトランスフェクトされる。適切なプロモ
ーター、エンハンサー、選択遺伝子、および/またはシグナル配列の選択(下記
)は、過度な実験なしに当業者の範囲内にあると考えられる。
任意の方法が使用され得る。例えば、Sambrookら、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,Cold Sp
ring Harbor Laboratory,Cold Spring H
arbor,NY(1989)、およびAusubelら、Current P
rotocols in Molecular Biology,J.Wile
y & Sons,NY(1992)を参照のこと。従来のベクターは、特定の
インターフェロンについてのポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された適切
な転写/翻訳制御シグナルからなる。プロモーター/エンハンサーはまた、イン
ターフェロンの発現を制御するために使用され得る(第III節を参照のこと)
。
現ベクターには、例えば以下が挙げられる:プラスミド;ニワトリ、マウス、お
よびヒトレトロウイルスベクター;アデノウイルスベクター:ヘルペスウイルス
ベクター:パルボウイルス;および非複製性ポックスウイルス。特に、複製欠損
性組換えウイルスは、複製欠損性ウイルスのみを産生するパッケージング細胞株
において産生され得る。Current Protocols in Mole
cular Biology:第9.10節〜第9.14節(Ausubelら
編)、Greene Publishing Associcates,198
9を参照のこと。
に確立されている。例えば以下を参照のこと:Madzakら、J.Gen.V
irol.、73:1533〜36(1992)(パポバウイルスSV40);
Berknerら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.
、158:39〜61(1992)(アデノウイルス);Mossら、Curr
.Top.Microbiol.Immunol.,158:25〜38(19
92)(ワクシニアウイルス);Muzyczka、Curr.Top.Mic
robiol.Immunol.,158:97〜123(1992)(アデノ
随伴ウイルス);Margulskee、Curr.Top.Microbio
l.Immunol.、158:67〜93(1992)(単純ヘルペスウイル
ス(HSV)およびエプスタインバーウイルス(HBV));Miller,C
urr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1〜24(
1992)(レトロウイルス);Brandyopadhyayら、Mol.C
ell.Biol.4:749〜754(1984)(レトロウイルス);Mi
llerら、Nature,357:455〜450(1992)(レトロウイ
ルス);Anderson,Science,256:808〜813(199
2)(レトロウイルス)。
ましくは、Ad−2またはAd−5に基づくベクター)、ヘルペスウイルス(好
ましくは、単純ヘルペスウイルスに基づくベクター)、およびパルボウイルス(
好ましくは「欠損性」または非自律的パルボウイルスに基づくベクター、より好
ましくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはAAV−2に基
づくベクター)。例えば、Aliら、Gene Therapy 1:367〜
384、1994;米国特許第4,797,368号および同第5,399,3
46号、ならびに以下の議論を参照のこと。
種々の因子に依存する。1つの重要な因子は、標的細胞集団の性質である。レト
ロウイルスベクターは、広範に研究され、そして多くの遺伝子治療適用において
使用されているが、レトロウイルスベクターは、一般には、分裂していない細胞
に感染するのに不適切であるが、ガン治療において有用であり得る。なぜなら、
レトロウイルスベクターは、複製している細胞においてのみそれらの遺伝子を組
込み、そして発現させるからである。レトロウイルスベクターは、標的細胞ゲノ
ムへの適切な組込みに起因して、エクスビボでのアプローチに有用であり、そし
てこれに関して魅力的である。
伝子を効率的に送達するように改変され得る、真核生物DNAウイルスである。
一般的なアデノウイルス2型および5型(それぞれ、Ad2およびAd5)は、
ヒトにおいて呼吸性疾患を生じ、そして現在、デュシェーヌ筋ジストロフィー(
DMD)、および嚢胞性線維症(CF)の遺伝子治療について開発されている。
Ad2およびAd5の両方は、ヒト悪性疾患と関連しないアデノウイルスのサブ
クラスに属する。アデノウイルスベクターは、有糸分裂状態にかかわらず、実質
的にすべての細胞型への非常に高レベルな導入遺伝子送達を提供し得る。高力価
(1011プラーク形成単位/ml)の組換えウイルスは、293細胞(アデノウ
イルスによって形質転換された相補ヒト胎児腎臓細胞株:ATCC CRL15
73)において容易に生成され得、そして感知されるほどの損失なしに長期間、
凍結保存され得る。遺伝的不均衡を補完する治療用導入遺伝子をインビボで送達
する際のこの系の効率は、種々の障害の動物モデルにおいて実証されている。Y
.Watanabe、Atherosclerosis,36:261〜268
(1986);K.Tanzawaら、FEBS Letters,118(1
):81〜84(1980);J.L.Golastenら、New Engl
.J.Med.、309(11983):288〜296(1983);S.I
shibashiら、J.Clin.Invest.、92:883〜893(
1993);およびS.Ishibashiら、J.Clin.Invest.
,93:1889〜1893(1994)を参照のこと。実際に、嚢胞性線維症
膜貫通調節因子(CFTR)についてのcDNAをコードする組換え複製欠損性
アデノウイルスは、いくつかのヒトCF臨床試験における使用について承認され
ている。例えば、J.Wilson,Nature,365:691〜692(
1993年10月21日)を参照のこと。遺伝子治療についての組換えアデノウ
イルスの安全性のさらなる支持は、ヒト集団における、生アデノウイルスワクチ
ンの広範な経験である。
れ、これは、100マップ単位(m.u.)に分割され、その各々は、360b
p長である。DNAは、ウイルス性DNA複製について必要とされるゲノムの各
末端にて短い逆方向末端反復(ITR)を含む。遺伝子産物は、ウイルスDNA
合成の開始より前またはその後の発現に基づいて,初期領域(E1〜E4)およ
び後期領域(L1〜L5)に組織化される。例えば、Horwitz、Viro
logy、第2版、B.N.Fields,Raven Press Ltd.
、New York(1990)を参照のこと。
プログラムを経る。Y.Yangら、Proc. Natl. Acad. Sc i.U.S.A.91:4407〜4411(1994)を参照のこと。ビリオ
ンは、細胞によってインターナリゼーションを受け、エンドソームに入り、そし
てそこからウイルスは細胞質に侵入し、そのタンパク質コートを失い始める。ビ
リオンDNAは、核に移動し、ここで、その染色体外線状構造を染色体内に組み
込むのではなく、それを保持する。前初期遺伝子(E1aおよびE1b)は、核
において発現される。これらの初期遺伝子産物は、アデノウイルス性転写を調節
し、そして種々の宿主遺伝子(これは、ウイルス産生について細胞をプライムす
る)のウイルス性複製および発現について必要とされ、そしてより後期の初期遺
伝子(例えば、E2、E3、およびE4)、続いて後期遺伝子(例えば、L1〜
L5)のカスケード活性化の中心をなす。
、全E1aおよびE1b領域の一部の欠失を含む。この複製欠損性ウイルスは、
機能的アデノウイルスE1領域(これは、トランスでE1タンパク質を提供し、
それによってE1欠失アデノウイルスの複製を可能にする)を含む293細胞に
おいて増殖される。得られるウイルスは、多くの細胞型に感染し得、そして導入
遺伝子を発現し得るが(ただし、ウイルスはプロモーターを保有する)、E1領
域DNAを有さない細胞において複製し得ない。組換えアデノウイルスは、それ
らが広範な宿主域を有し、静止細胞またはニューロンのような最終的に分化した
細胞に感染し得るという利点を有し、そして本質的に非腫瘍形成性のようである
。アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれないようである。それらは染色体
外に存在するので、挿入変異誘発の危険性は、非常に低減されている。組換えア
デノウイルスは、非常に高い力価を生じ、ウイルス性粒子は中程度に安定性であ
り、発現レベルは高く、そして広範な細胞が感染され得る。
して使用されている。AAVは、それを遺伝子操作のための理想的な基質にする
単純なゲノム構成(4.7kb)を有する、小さな一本鎖(ss)DNAウイル
スである。2つのオープンリーディングフレームは、1連のrepおよびcap
ポリペプチドをコードする。Repポリペプチド(rep78、rep68、r
ep62、およびrep40)は、AAVゲノムの複製、レスキュー、および組
込みに関与する。capタンパク質(VP1、VP2、およびVP3)は、ビリ
オンキャプシドを形成する。5’末端および3’末端でrepオープンリーディ
ングフレームおよびcapオープンリーディングフレームに隣接するのは、14
5bpの逆方向末端反復(ITR)であり、そのうちの最初の125bpは、Y
型またはT型二重鎖構造を形成し得る。AAVベクターの開発のために重要なの
は、全repおよびcapドメインが切り出され、そして治療用導入遺伝子また
はレポーター導入遺伝子で置換され得ることである。B.J.Carter、H
andbook of Parvoviruses、P.Tijsser編,C
RC Press、155〜168頁(1990)を参照のこと。ITRが、A
AVゲノムの複製、レスキュー、パッケージング、および組込みのために必要と
される最小の配列を表すことが示されている。
両方から構成される。潜伏性感性の間、AAVビリオンは、キャプシド化ssD
NAとして細胞に侵入し、そしてそのすぐ後に、AAV DNAが、宿主細胞分
裂の明らかな必要性なしに宿主染色体に安定に組み込まれる核に送達される。ヘ
ルパーウイルスの非存在下で、組み込まれたAAVゲノムは、潜伏性のままであ
るが、活性化およびレスキューされ得る。AAVプロウイルスを保有する細胞が
、宿主クロマチンからの切除を補助するためにAAVによって必要とされるヘル
パー機能をコードするヘルペスウイルスまたはアデノウイルスによる二次感染で
チャレンジされる場合、生活環の溶解期が始まる(B.J.Carter,前出
)。感染親一本鎖(ss)DNAは、rep依存性様式で、二重鎖複製形態(R
F)DNAに拡大される。レスキューされたAAVゲノムは、予め形成されたタ
ンパク質キャプシド(正二十面体対称、直径約20nm)にパッケージングされ
、そして細胞溶解後に+または−のいずれかのssDNAゲノムがパッケージン
グされた感染性ビリオンとして放出される。
に安定であり、そして組換えAAV(rAAV)は、rAAVが、ペレット化ま
たはCsCl勾配バンド形成によって精製され得るという点で「薬物様」特徴を
有する。それらは、熱安定性であり、粉末になるまで凍結乾燥され、十分な活性
まで再水和され得る。それらのDNAは、宿主染色体に安定に組み込まれ、それ
ゆえ、発現は長期である。それらの宿主域は、広く、そしてAAVは公知の疾患
を全く引き起こさないので、その結果、組換えベクターは非毒性である。
続することが示された。Xiao、Li、およびSamulski(1996)
Journal of Virology 70、8089〜8108を参照の
こと。ウイルス性毒性または細胞性宿主免疫応答の証拠が存在しないので、ウイ
ルス遺伝子治療のこれらの限定は、克服された。
’Malley、およびDuring(1994) Nature Genet
ics 8、148〜153は、AAVベクターを使用する直接的な頭蓋内注射
後に、ラット脳におけるチロシンヒドロキシラーゼの長期(4ヶ月まで)発現を
記載した。これは、ヒトにおけるパーキンソン病のための潜在的な治療である。
発現は、非常に効率的であり、そしてウイルスは安全かつ安定であった。
312)は、AAVの筋肉内に注射後、マウスにおける安定な遺伝子発現は報告
した。再度、ウイルスは安全であった。細胞性免疫応答も体液性免疫応答も、ウ
イルス、または外来遺伝子産物に対して検出されなかった。
射後に、エリトロポイエチン(Epo)遺伝子の高レベル発現を示した。Epo
タンパク質は、循環において存在することが示されたが、そして治療の可能性を
示す赤血球計数における増加が報告された。このグループによる他の研究は、ガ
ンについての処置としてHSV tk遺伝子を発現するAAVを使用した。固形
腫瘍における高レベル遺伝子発現が記載されている。
性(multiple)核多角体病ウイルス(AcMNPV)に主に由来する組
換えバキュロウイルスは、インビトロにて哺乳動物細胞に形質導入し得ることが
示されている(Hofmann,C.,Sandig、V.、Jennings
,G.,Rudolph、M.、Schlag、P.、およびStrauss,
M.(1995)、「Efficient gene transfer in
to human hepatocytes by baculovirus
vectors」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 2、10099〜10103;Boyce,F.M.およびBucher,N.
L.R.(1996)「Baculovirus−mediated gene
transfer into mammalian cells」、Proc
. Natl. Acad. Sci.USA 93、2348〜2352を参照 のこと)。
を有する。これらは、非常に大きなDNA挿入能力、ヒトにおける予め存在する
免疫応答の欠如、哺乳動物における複製の欠如、哺乳動物における毒性の欠如、
バキュロウイルス転写プロモーターの昆虫特異性に起因する哺乳動物細胞におけ
るウイルス性遺伝子の発現の欠如、および潜在的には、これらのウイルス性タン
パク質に対して指向される細胞傷害性Tリンパ球応答の欠如を含む。
る。一般に、特定の細胞条件および代謝に対する所定の遺伝子治療ベクターの効
力を、以下についてアッセイすることにより試験する:(i)細胞の形態の変化
;(ii)細胞増殖の阻害;および(iii)抗ウイルス活性。
特定の発現ベクターの選択および最適化は、好ましくは、1以上の適切な制御領
域(例えば、プロモーター)を有する、このインターフェロン遺伝子を得ること
;このインターフェロン遺伝子が挿入されたベクターを含むベクター構築物を調
製すること;培養細胞にインビトロでこのベクター構築物をトランスフェクトま
たは形質導入すること;およびこのインターフェロン遺伝子産物が培養細胞中に
存在するか否かを決定することにより達成される。
効果は、多数の容易に利用可能なヒト腫瘍細胞株のうちの任意の1つを用いてイ
ンビトロで試験され得る。このような細胞株としては、ヒト膀胱ガン細胞株56
37(ATCC HTB9)、ヒト乳ガン細胞株MDA−MB−468(ATC
C HTB132);ヒト前立腺ガン細胞株DU145(ATCC HTB81
);ヒト骨肉腫細胞株SAOS2(ATCC HTB85);肺ガン細胞株に対
して転移性のヒト線維肉腫Hs913T(ATCC HTB152);ヒト子宮
頸ガン細胞株HeLa(ATCC ECL2)が挙げられる。これらの細胞株の
各々は、インターフェロンをコードする適切なポリヌクレオチドでトランスフェ
クトされ得、そして細胞増殖および細胞の形態に対するトランスフェクションの
効果は、当該分野で公知の手順(例えば、細胞生存率を測定するためのトリパン
ブルー排除アッセイ、経時的な増殖を測定するための細胞計数、およびDNA複
製を測定するためのトリチウムチミジンの取り込み)を用いて試験され得る。
ーを含まない周囲の細胞に対するこの分泌タンパク質の効果は、実施例3に記載
される方法を用いて容易に試験され得る。
ターフェロン配列に相同/相補的である配列を含むプローブを用いる核酸ハイブ
リダイゼーションのような従来の方法により同定され得る。インターフェロンの
転写は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応により測定され得る。あるいは、イン
ターフェロンタンパク質は、細胞馴化培地において、従来の抗ウイルスアッセイ
またはELISAアッセイによって測定される。別のアプローチでは、配列は、
標的細胞への発現ベクターの導入により引き起こされる「マーカー」遺伝子機能
(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など)の存在または非存在によ
り同定され得る。例えば、インターフェロンβ 1aをコードするポリヌクレオ
チドが、優性の選択マーカー遺伝子(例えば、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子)をSV40初期プロモーターの別個の制御下で有するベクターに
挿入される場合、この配列はマーカー遺伝子機能(ジェネティシン耐性)の存在
により同定され得る。適切なベクターを検出する他の方法は、当業者に容易に利
用可能である。
れている。インフルエンザおよび水疱性口内炎ウイルス(VSV)は、インター
フェロンによる阻害に特に感受性であり、そしてしばしばインターフェロン活性
の測定のためのアッセイ、およびインターフェロン抗ウイルス活性機構を探求す
る調査において用いられる。ヒト病原体であり、そしてインターフェロンに感受
性であるようである他のウイルスとしては、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型
肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘ
ルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ライノ
ウイルス、および脳心筋炎ウイルスが挙げられる。
引き起こされる肝臓疾患であるウイルス性肝炎は、世界的な主要な健康的問題で
ある。5つの別個のヒト肝炎ウイルスが単離およびクローニングされている。こ
れらは、A型、B型、C型、D型、およびE型の肝炎である。急性および慢性の
ウイルス性肝炎のいくつかの症例は、既に特徴付けられた肝炎ウイルス以外の肝
炎ウイルス(例えば、新たに発見されたG型肝炎ウイルス)と関連するようであ
る。最大の有病率を有するウイルスは、A型、B型、およびC型である。急性お
よび慢性の肝臓傷害および炎症を引き起こすことに加えて、HBVおよびHCV
感染は、肝細胞ガンを導き得る。インターフェロンは、HBVおよびHCVに対
してインビボで、ならびにD型肝炎およびA型肝炎に対して細胞培養において、
あるレベルの効力が実証されている。
遺伝子の送達の好ましい標的は、肝臓中の肝細胞である。エクスビボ治療(例え
ば、肝臓細胞を外植し、続いてインターフェロンを発現するポリヌクレオチドを
導入し、次いで患者に移植し戻すこと)は可能であるが、インビボでの遺伝子の
送達は、特に好ましい。手術を行って、肝臓の門脈にこの遺伝子を注射するか、
またはカテーテルを通してこの遺伝子を肝臓の動脈に注入する。理想的には、静
脈内注射のような、より侵襲性の低い診療が用いられる。
制御下に置かれる。転写プロモーターは、起源が細胞性またはウイルス性(CM
V、SV40、RSVなど)であり得る。肝臓特異的遺伝子発現が所望される場
合、肝細胞特異的細胞プロモーター(例えば、アルブミンエンハンサー/プロモ
ーター、α1−アンチトリプシンプロモーター、またはHBVエンハンサー/プ
ロモーター)が好ましい。文献に記載される多くの肝臓特異的プロモーターが存
在する(下記を参照のこと)。
こともまた可能である。例えば、インターフェロン遺伝子の発現は、HBV感染
肝細胞にのみ存在するHBV転写因子HBxにより誘導され得る。さらに、「キ
ャリア」系が使用され得る。これは、非ウイルス性送達系(例えば、カチオン性
リポソームまたはタンパク質:DNA結合体(DNAとアシアログリコプロテイ
ンとの結合体は、肝細胞上のアシアログリコプロテインレセプターへの結合を介
して肝臓に優先的に送達され得る))であり得る。
組換えレトロウイルスを用いて、ヒト肝細胞にエクスビボで遺伝子を送達してい
る。動物モデルは、組換えアデノウイルスが、インビボでの静脈内投与の後に肝
臓に非常に効率的に局在し得ることを示す。静脈内注射したアデノウイルスのう
ちの約98%が肝臓に局在する。
し得るようである。他の型のウイルス(例えば、アルファウイルス、レンチウイ
ルス、または他の哺乳動物ウイルス)が用いられ得る。近年、非哺乳動物ウイル
スである昆虫特異的バキュロウイルスが、肝細胞に効率的に遺伝子を送達し得、
そして発現し得ることが示された(Hofmanら,1995;Boyceおよ
びBucher,1996,前出)。
ボで送達し得る。複製欠損アデノウイルスは、複数のグループにより構築された
。このようなウイルスの最初の産生は、E1領域の欠失に起因して欠損性である
。この欠損は、アデノウイルスE1領域を発現する293細胞株において補完さ
れる。E1、E2a、および/またはE4遺伝子の欠失によって、より広範に無
能にした組換えアデノウイルスを使用することが好ましい。これらの欠損した機
能の全ては、パッケージング細胞株において発現され得る。インターフェロン遺
伝子は、任意の多数のプロモーター(例えば:CMV前初期プロモーター、RS
V LTR、細胞アクチンプロモーター、アルブミンエンハンサー/プロモータ
ー、または他の肝臓特異的プロモーター)の下流に置かれる。この遺伝子カセッ
トは、欠失した遺伝子のうちの1つ(例えば、アデノウイルス移入ベクターを作
製するためにはE1)の代わりに組換えアデノウイルスベクター中に置かれる。
準法によるパッケージング細胞へのトランスフェクション後の相同組換えを介し
て生成される。インターフェロン遺伝子を有する組換えウイルスストックは、何
回もプラーク精製され、次いでパッケージング細胞における大規模生成により拡
大される。ウイルスは、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、また
は他の方法により精製され得、次いでパッケージング細胞において力価測定され
得る。E1およびE2aが欠損したアデノウイルス(Engelhardtら,
Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:6196−6200,1
994)、ならびにE1およびE4が欠損したアデノウイルス(Gaoら,J.
Virology,70:8934−8943,1996)を生成するための方
法は、詳細に記載されている。E1が欠損したアデノウイルスを生成するための
方法は、Graham,F.L.およびL.Prevec,「Methods
for Construction of Adenovirus Vecto
rs」,Mol.Biotech,3:207−220(1995)に見出され
得る。
して投与され得る。反復ウイルス投与から生じる体液性免疫応答は、反復投与の
有効性を制限し得る。この場合、免疫抑制剤(例えば、シクロスポリンまたはC
D40リガンドに対する抗体)がウイルスとともに投与され得る。
おいて試験され得る(第C節を参照のこと)。例えば、B型肝炎ウイルスの場合
、多くのモデルが利用可能である。これらとしては、ウッドチャック、アヒル、
ツパイ、ラット、およびマウスが挙げられる。マウスHBVモデルの中に含まれ
るのは、HBVについてトランスジェニックであり、そしてHBV DNAをそ
の肝臓において安定に複製して循環におけるHBVウイルスの定常的産生を導く
マウスである。HCVについては、チンパンジーモデルが利用可能である。イン
ターフェロン遺伝子を有するアデノウイルスは、肝臓に直接投与され得るか、ま
たは静脈内注射により与えられ得る。効力は、ウイルスDNA複製、循環中のウ
イルス粒子、肝臓酵素(ALT)、肝臓の病理および炎症をモニタリングするこ
とにより決定される。
瘍活性を有することが示されている。概説については、WadlerおよびSc
hwartz,Cancer Research 50:3473−3486,
1990;Martin−Odegard,DN&P,4:116−117,1
991;ならびにSpiegel,Seminars in Oncology
15(5):41−45,1988を参照のこと。インターフェロンαおよび
インターフェロンβでの処置は、いくつかのガンに対していくらかの効力を示し
た。遺伝子療法は、単独で、または従来の手術、照射、または化学療法とともに
行われ得る。遺伝子治療に敏感に反応するガンについての以下のリストは、単に
部分的なものであり、インターフェロン遺伝子治療は、このリストに含まれない
多くの疾患環境において有効であり得るようである。
める。ヒト神経膠腫細胞は、免疫欠損(ヌード)マウスに大脳内に移植されて、
神経膠腫モデルを提供し得る。インターフェロンβタンパク質処置は、これらの
マウスにおける生存を増加させることが示された。神経膠腫におけるいくつかの
インターフェロンβタンパク質試行についての問題は、インターフェロンβの非
経口的(静脈内または筋肉内)投与後の高い毒性であった。脳へのインターフェ
ロンβ遺伝子の、おそらく手術時の、局所送達は、脳における長期のインターフ
ェロンβ生成を、タンパク質の全身性投与後に見られる副作用を伴わずに生じ得
る。
腫についての予後は、乏しい。疾患の発生数は、劇的に増加しており、そして従
来の化学療法は効果がない。黒色腫は、患者の応答が宿主の免疫応答に依存し得
るという点で、免疫原性腫瘍型であるようである。インターフェロンβの抗増殖
活性および免疫調節活性は共に、この環境において有効であり得る。本発明者ら
は、インターフェロンβタンパク質が、培養した悪性黒色腫細胞に対して直接的
な抗増殖効果を有することを観察した。
内皮の増殖であり、そして組織損傷をもたらす。通常は無害であるが、血管腫は
、必須器官を危険にさらし、そして死を引き起こし得る。インターフェロンαタ
ンパク質は、乳児においてステロイド耐性血管腫の早期後退を誘導することが示
された(Martin−Odegard,前出)。
いて有効であることが示された。これらの疾患において示された効力は、インビ
トロでのガン処置におけるインターフェロンタンパク質の効力が充分に特徴付け
られているにもかかわらず、インビボでの効力は通常ずっと低いという一般的な
知見とは対照的である。それにもかかわらず、インターフェロンαは、毛様細胞
性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、および
多発性骨髄腫に対してヒト臨床試験において有効である。インターフェロンβタ
ンパク質は、培養中の腎臓細胞ガン細胞の増殖を阻害する。IFN−αは、既に
、腎臓細胞ガンの処置における使用が認可されている。
ンパク質、IFN−βタンパク質、およびIFN−γタンパク質による、培養ヒ
ト結腸ガン細胞に対する強力な抗増殖効果が存在する。結腸ガンは、しばしば悲
惨な結果を伴って肝臓に転移を生じる。アデノウイルスまたは他の肝臓向性送達
系を用いて、インターフェロン遺伝子をこれらの転移の処置のために肝臓に送達
し得る。肝細胞ガンは、アデノウイルスによる肝臓送達の効率が高いことに起因
して、魅力的な標的である。IFN−βタンパク質が培養中のヒト肝ガン細胞の
増殖を有意に阻害することが観察されている。
ll cell lung carcinoma)の処置における効力が、いく
つかの臨床試験において示されているが、他の臨床試験においては示されていな
い。2つのヒト肺ガン細胞株は、インターフェロンβタンパク質による増殖阻害
に感受性であることが見出される(βはαよりも有効であった)。1つの臨床試
験では、有意なインターフェロン関連毒性が、インターフェロンの静脈内投与後
に観察された。肺へのインターフェロンβ遺伝子の局所送達(おそらく、組換え
アデノウイルスベクターのエアロゾル送達による)は、タンパク質の全身性送達
後に観察される毒性を伴わずに有効であり得る。インビトロでは、インターフェ
ロンβタンパク質を用いる小細胞肺ガン細胞の増殖阻害が観察された。
増殖を阻害する。インターフェロンβは、その抗増殖効果だけでなく、そのエス
トロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプターのインビボでの誘導により
抗エストロゲンタモキシフェンに対して乳ガンを感作することに起因して、乳ガ
ンに対して有効であり得る。本発明者は、ヒト乳ガンのマウスモデルにおけるI
FN−β遺伝子治療を用いる実験(実施例3および4を参照のこと)からのデー
タを示す。
卵巣ガン細胞の増殖阻害においてインターフェロンαよりも活性でないようであ
る。この場合、治療は、腹膜への遺伝子治療ベクターの点滴注入により行われ得
る。なぜなら、この型の腫瘍は、腹膜腔に満ちる傾向があるからである。
るというわけではないが、インターフェロンタンパク質は、多数の環境において
抗腫瘍特性を実証した。IFN−αタンパク質およびIFN−βタンパク質は、
従来の化学療法とともに試験され、そして多くの適応症(子宮頸ガン細胞、喉頭
ガン細胞、白血病細胞、腎臓細胞ガン、結腸腺ガン、および骨髄腫を含む)にお
いてこれらの薬物との相乗作用を示した。インターフェロンが抗新脈管形成活性
を有するとも考えられる。局所IFN−βレベルと新脈管形成能力との間には逆
の相関が存在する。いくつかのデータは、持続レベルのIFN−βタンパク質が
新脈管形成の阻害に必要であることを示す。この場合、インターフェロン遺伝子
治療は、高レベルのインターフェロンタンパク質が極めて迅速に低いレベルまた
は検出不能なレベルに低下するタンパク質治療よりも好ましい。
である多くの動物モデルを知っている。最も通常に用いられるげっ歯類ガンモデ
ルは、ヌード(nu/nu)マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片モデルである。
ヒトのガン細胞が、培養中で増殖され、そして適切な発現制御配列に作動可能に
連結された、インターフェロンコード遺伝子でトランスフェクトまたは感染され
る。次いで、これらの細胞は、ヌードマウスに注射される。代表的には、腫瘍細
胞がマウスの背中に皮下に注射されて、固形腫瘍塊の形成を導く(実施例1を参
照のこと)。あるいは、腫瘍細胞は、腫瘍が自然に出現する器官に正常位に注射
され得る(肺ガン細胞は、肺に注射される;結腸ガン細胞は結腸に注射される、
など)。次いで、腫瘍増殖の後に、経時的な腫瘍塊の直径の測定が行われ得る(
実施例2を参照のこと)。
、脳へのヒト神経膠腫細胞の頭蓋内定位直接注射により実験的神経膠腫をマウス
において形成した。検出可能な腫瘍が形成された後、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ遺伝子(HSV tk)を発現するAAVベクターは、同じ部位に
直接注射された。HSV tk酵素は、非毒性ヌクレオシドアナログであるガン
シクロビル(GCV)を毒性の代謝産物に変換する。遺伝子治療後、GCVは、
腹腔内に投与された。AAV−tkおよびGCVを受けたマウスは腫瘍サイズの
劇的な減少を示したが、コントロールAAVを、またはGCVなしでAAV−t
kを受けたマウスは示さなかった。この治療は安全かつ有効であるようであった
。
験において固形腫瘍の処置に用いられた。これらの研究の多くは、類似のヌード
マウス/ヒト異種移植片モデルを用いた。これらのモデル構築実験のいくつかの
例を下記に列挙する。Claymanら(1995)Cancer Resea
rch 55,1−6は、ヌードマウスにおける頭部および頚部のヒト扁平上皮
ガンのモデルを提示した。彼らは、野生型p53を発現するアデノウイルスがこ
れらの腫瘍の形成を妨害することを見出した。
y 6,1055−1063は、ヒト結腸ガン細胞をヌードマウスに導入した。
腫瘍が樹立された後、彼らは、これらの腫瘍に、E.coliシトシンデアミナ
ーゼ遺伝子(CD)を発現するアデノウイルスを直接注射し、次いで5−フルオ
ロシトシン(5FC)を全身投与した(CDおよび5FCは、tkおよびGCV
に類似する酵素/プロドラッグの組み合わせである)。彼らは、腫瘍サイズの4
〜5倍の減少を観察した。
93,4513−4518は、ヌードマウスにおいてヒト乳房腫瘤を形成した。
これらの腫瘍は、インターフェロンαを発現するアデノウイルスとともに直接注
射される。彼らは、100%の動物において腫瘍の後退を観察した。
1691は、ヒト前立腺腫瘍をヌードマウスにおいて形成し、そして野生型p5
3を発現するアデノウイルスの腫瘍内直接注射が腫瘍の増殖を阻害することを見
出した。全ての処置マウスは、処置の中止の少なくとも12週間後まで腫瘍がな
いままであった。
、ヒト子宮頸ガンおよび神経膠芽細胞腫の腫瘍をヌードマウスにおいて形成した
。彼らは、これらのマウスを、E1B遺伝子が欠失したアデノウイルスで処置し
た。E1Bの非存在下では、アデノウイルスは、p53欠損腫瘍細胞を選択的に
殺傷する。腫瘍に直接注射した場合、このアデノウイルスは動物のうちの60%
において腫瘍後退を引き起こした。
567−1576は、ヒト結腸ガン細胞をヌードマウスの肝臓に注射して、結腸
ガンの肝臓転移を模倣した。次いで、彼らは、CDを発現するアデノウイルスを
腫瘍の近傍の肝臓に注射した。5FCでの全身処置は、これらの動物における腫
瘍増殖を抑制した。
れらの腫瘍は、マウスに注射される同系げっ歯類腫瘍細胞から樹立され得る。あ
るいは、腫瘍は、内因性細胞に由来し得る。これらの場合、内因性腫瘍は、発癌
物質での動物の処置に起因し得るか、あるいはマウスの遺伝的背景(例えば、p
53の欠損)に起因して自発的に形成され得る。いくつかの例が続く。
141−148は、免疫応答性ラットにおける内因性中皮腫を、tk遺伝子を発
現するアデノウイルスで処置した。このウイルスは、胸膜腔に注射され、次いで
GCVが全身投与された。彼らは、腫瘍の重量の劇的な減少および生存時間の増
加を示した。
515−523は、同系マウス前立腺腫瘍細胞株を免疫応答性マウスに皮下移植
した。彼らは、アデノウイルス−tkをこの腫瘍に直接注射し、そしてGCVで
全身処置した。著者らは、腫瘍サイズの減少および生存の長期化を報告した。
1995−2002は、サイトカインIL−12を発現するアデノウイルスを、
内因性マウス乳房腫瘤に直接注射した。彼らは、マウスのうちの75%が腫瘍の
後退を有し、そして33%が長期間の後に腫瘍がないままであったことを見出し
た。
1341は、網膜芽細胞腫遺伝子を発現するアデノウイルスを、Rb+/−マウ
スにおいて自然に生じた下垂体メラニン細胞刺激ホルモン産生細胞の腫瘍に直接
注射した。彼らは、処置動物における腫瘍細胞の増殖の減少、腫瘍増殖の減少、
および寿命の長期化を見出した。
初のベクターである。本特許出願に関連する1つの報告は、Rothら(199
6)Nature Medicine 2,985−991の報告である。彼ら
は、野生型p53遺伝子を発現する組換えレトロウイルスを生成した。このウイ
ルスは、非小細胞肺ガンを有する9人のヒト患者に、気管支鏡に挿入された針を
用いて腫瘍内直接注射により導入された。9人の患者のうち、3人は腫瘍の後退
を示したが、他の3人の患者は腫瘍増殖の安定化を示した。
ントの細胞適合性部位において、この細胞を、またはこの細胞を含む移植片もし
くはカプセルを移植することにより投与される。本明細書中で使用される場合、
「細胞適合性部位」は、この遺伝的に改変した細胞、細胞移植片、またはカプセ
ル化した細胞発現系が、有害な生理学的結果を誘発せずに移植され得るレシピエ
ントの構造、腔、または流体を言う。例えば代表的な細胞適合性部位には、腹膜
腔、胸腔、および心膜腔、ならびにこの細胞が由来するところの固形腫瘍、また
はこの腫瘍が除去されるところの器官がある。
改変した細胞と共に移植され得る。従って、本発明は、第1の改変した細胞は第
1のインターフェロンを発現し、第2の改変した細胞は第2のインターフェロン
または他の分泌タンパク質を発現するような、遺伝的に改変した細胞の混合物を
使用することにより、レシピエントの系を改変する方法を採用する。他の遺伝的
に改変した細胞型(例えば、肝細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、神経膠細胞、内
皮細胞、またはケラチノサイト)が遺伝的に変化した細胞と共に添加され、導入
した遺伝子の複雑なセットの発現を生じる。さらに、同一のまたは異なるベクタ
ー上の、1つより多い組換え遺伝子は、それぞれ遺伝的に改変された細胞に導入
され得、これにより単一の細胞による複数のインターフェロンの発現を可能にす
る。
トへの移植に適する支持体へ付着される多数の上述の遺伝的に改変した細胞を含
む。この支持体は、天然の物質または合成物質から形成され得る。別の実施態様
において、この移植片は、腹膜の斑を含む。この実施態様によると、この支持体
は、多数の遺伝的に改変した細胞を一緒に保有する天然に存在するマトリックス
である。あるいはこの移植片は、天然に存在するマトリックスの置換物に付着さ
れる多数の上述の細胞を含む(例えば、Gelfoam(Upjohn,Kal
amazoo,Mich.),Dacron,Cortex(登録商標))。
カプセル化した系は、哺乳動物レシピエントへの移植に適するカプセルおよびそ
こに含まれる多数の上述の遺伝的に改変した中皮細胞を含む。このカプセルは、
合成物質または天然に存在する物質から形成され得る。このようなカプセルの処
方は当該者らに公知である。哺乳動物レシピエントに直接移植される細胞(すな
わち、遺伝的に改変した細胞がこの細胞適合性部位と直接物理的に接触している
ような様式で移植される)と対照的に、このカプセル化した細胞は移植後単離し
たままである(すなわち、この部位と直接物理的な接触をしていない)。従って
このカプセル化した系は、遺伝的に改変した非不死化細胞を含有するカプセルに
限定されないが、遺伝的に改変した不死化細胞を含み得る。
のインターフェロンをレシピエントにインサイチュで送達するに充分な量の細胞
を含む。既知の条件についての特定のインターフェロンの治療的有効用量の、決
定は、過度の実験を必要とせずに、当業者の技術の範囲内である。従って、有効
用量を決定する際に、当業者は、患者の状態、状態の重症度、ならびに投与され
る特定のインターフェロンの臨床の研究の結果を考慮する。
既に存在しない場合、それらはこのレシピエントに投与する前にこのようなキャ
リアに配置される。このような薬学的に受容可能なキャリアには、例えば等張の
生理食塩水およびこの患者および治療に適切な他の緩衝液が挙げられる。
単離されたポリヌクレオチドが結合してその適用を容易にする天然の、または合
成の1つ以上の成分を意味する。適切なキャリアには滅菌生理食塩水が挙げられ
るが、薬学的に受容可能であることが知られる他の水溶性および非水溶性の等張
滅菌溶液および滅菌懸濁液は当業者らに公知である。この点について、用語「キ
ャリア」は任意のプラスミドおよびウィルス発現ベクターを含む。「有効量」と
は、疾患の、変性の、または損傷の状態の進行を回復または遅延させ得る量を言
う。有効量は個々の根拠に基づいて決定され得、そして部分的に処置されるべき
症状の考慮および探求された結果に基づく。有効量は、このような要素を使用し
て、そしてただ慣用的な実験を使用して当業者により決定され得る。
れるインターフェロンポリヌクレオチド配列の有効量は注射針を用いた直接の注
射を介して、あるいはガンもしくは腫瘍またはこの腫瘍に送る血管中に配置した
カテーテルもしくは他の送達チューブを介して、標的細胞または腫瘍組織に直接
投与され得る。投薬量は主に、処置される条件、選択されたインターフェロン、
年齢、体重、および被検体の健康のような因子により、従って被検体間で変化し
得る。ウィルス遺伝子治療ベクターが使用される場合、ヒト被検体についての有
効量は、ウィルス発現ベクターを含む、約1×107〜約1×1012プラーク形 成ユニット(pfu)/mlインターフェロンを含む生理食塩水の約0.1〜約
10mlの範囲であると考えられる。
るいは、この腫瘍への送達は、この腫瘍に送る血管への注入により行われ得る。
このベクターの非経口的な投与はまた可能である。インターフェロンをコードす
るポリヌクレオチドは、局所的に、眼内に、非経口的に、鼻腔内に、気管内に、
気管支内に、筋肉内に、皮下に、または任意の他の手段により投与され得る。非
経口的投与には、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下が含まれる。より高性能
なアプローチは、ウィルス、あるいは天然の向性による、または特定の腫瘍型に
のみ見られるレセプターへ結合する表面分子の存在により、異なる腫瘍型に対し
局在化する化学的な結合体の非経口的投与であり得る。
ターフェロン)を発現する細胞表現系を形成する方法、これにより生産された発
現系、およびこれを含む薬学的組成物を提供する。以下の実施例は、動物モデル
系における細胞遺伝子治療の実行可能性を実証に関する。
ビボ試験を都合よく達成する。腫瘍を、ヒト腫瘍細胞株のマウスへの注射により
ヌードマウス中に形成する。このヌードマウス(nu/nu株)は免疫不全性で
、かつ外来腫瘍細胞を拒絶しない。腫瘍細胞注射後1〜2週間で腫瘍は形成する
が、この正確な時期は注入された細胞の数およびこの細胞株の腫瘍形成能による
。インターフェロンを発現するポリヌクレオチドを、このマウスへの注入前の培
養物内で、従来のトランスフェクション手順により、この腫瘍細胞中に導入する
。あるいは、この適切なポリヌクレオチドを、この腫瘍がこのマウスに形成され
た後、トランスフェクションまたはインビボウィルス形質転換により腫瘍中に導
入し得る。
uangら、前出)であるか、網膜芽細胞腫細胞株WERI−Rb27であるか
のいずれかである(共に、Takahashiら,Proc.Nat.Acad
.Sci.USA 88:5257−5261,1991)。培養物中のインタ
ーフェロンをコードする単離したポリヌクレオチドの送達について、腫瘍細胞を
トランスフェクトするか(リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ま
たはリポフェクトアミン(lipofectamine)トランスフェクション
のような従来の手順を使用する)、または直接感染させる(レトロウィルス、ア
デノウィルス、バキュロウィルス、またはアデノ随伴ウィルス)。100%の細
胞が適切なポリヌクレオチドを首尾良く取り込んだ効果的なウィルス感染の場合
、細胞の選択は必要ない。さらに、ほんの少しのパーセントの細胞がこのインタ
ーフェロン遺伝子を発現する必要があるので、薬剤選択は通常必要とされないこ
とを見い出した(実施例3)。
ンの場合に選択が行われるならば、細胞を、薬剤耐性遺伝子(例えば、G418
耐性をコードするneo遺伝子)およびこのインターフェロン遺伝子のようなポ
リヌクレオチドを共にコードする発現ベクターでトランスフェクトする。対照の
トランスフェクションはこの薬剤耐性遺伝子のみをコードするベクターである。
はプールされ、そして約100ulの容量中、約106の細胞数でnu/nu( ヌード)メスマウスの脇腹に、皮下に注射される。ウィルス感染した細胞は、選
択工程の必要なしに直接注射される。このマウスはさらに少なくとも2ヶ月間維
持され、かつ腫瘍サイズは、キャリパを使用し毎週モニターされる。
はこのマウスの脇腹に、皮下に注射される。腫瘍形成後、インターフェロンをコ
ードするポリヌクレオチドを含むDNAまたはウィルスは、この腫瘍中に直接注
射される。多くのウィルスはこの手順に適切であるが、組換えアデノウィルスは
最も効率的であり、そして組換えレトロウィルスはこの腫瘍細胞ゲノムに安定的
に組込まれる利点がある。DNAは、このDNAをカチオンのリポソームと混合
し、そしてこの混合物を注入することでこの細胞に導入され得る。このインター
フェロン遺伝子を含有しないDNAまたはウィルスは、対照として役立てるため
に他のマウスの腫瘍に注入される。腫瘍の進行または縮小を、キャリパを用いて
モニターする。
化された、単離したポリヌクレオチドを用いるヒト小細胞肺ガンの処置を、リポ
ソーム、特に小粒子リポソームエアロゾルを使用するこのような処置を必要とす
る細胞中に、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドを導入することに
よりインビボで行い得る。エアロゾルを介して投与すると、インターフェロンを
コードするポリヌクレオチドが、鼻咽頭の表面で、気管支樹で、および肺動脈弁
区中に一様に沈着する。リポソームエアロゾルの議論について、Knight
and Gilbert,Eur.J.Clin.Micro.and Inf
ect.Dis.,7:721−731(1988)を参照のこと。この方法で
肺ガンを処置するめに、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドを、任
意の他の簡便な方法により精製する。インターフェロンをコードするポリヌクレ
オチドをリポソームと混合し、そして高い有効性でそれらに取り込む。このエア
ロゾル送達は緩やかで、かつ正常なボランティアおよび患者により充分に許容さ
れるので、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドを、含有するリポソ
ームを任意の段階の肺ガンを罹患している患者を処置するために投与する。この
リポソームを、鼻吸入によりまたは噴霧器に接続した気管内チューブにより、腫
瘍の増殖を阻害するに充分な用量で送達する。エアロゾル投与処置を、必要な繰
り返しを伴い、2週間毎日投与する。
)ヌードマウスの右の主流の気管支に注入された腫瘍を使用して実施し得る(1
マウスあたり約1.5×106細胞)。3日後このマウスは、リポソームカプセ ル化したインターフェロン遺伝子およびこのインターフェロン遺伝子配列を欠く
対照を気管支内に接種される処置(連続3日間毎日)のコースを開始する。腫瘍
形成およびサイズを、両方の処置の後、キャリパを用いて測定し、そしてマウス
の生存を評価する。
) この実施例において、本発明者はヒト乳房ガン細胞株MBA−MD−468(
アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した)を使用する。細胞はヒ
トインターフェロン−β1a遺伝子を発現するアデノウィルスで感染されていな
いかまたは感染されているかのいずれかである。この場合、このアデノウィルス
はE1遺伝子を欠失しており、かつE2a遺伝子中に温度感受性変異を有する。
この特定のアデノウィルスを産生する方法は、Engelhardtら,(19
94),Gene Therapy 5:1217−1229(さらなる詳細に
ついては以下をまた参照のこと)に見い出され得る。手短には、このインターフ
ェロンβ1a遺伝子を遺伝子転写がCMV IE1プロモーターにより駆動され
るような、アデノウィルスベクターpAdCMVlink1に前もってクローン
化し、これによりアデノウィルストランスファープラスミドを作成した。この遺
伝子を欠失したE1遺伝子に代わりこのベクターに挿入した。このインターフェ
ロン遺伝子を有する組換えアデノウィルスを、このトランスファープラスミドお
よび293細胞中のアデノウィルスゲノムの組換えにより産生する。ウィルスを
プラーク精製し、そして従来の方法によりプラークアッセイにおいて滴定(ti
ter)した。
、ME180、HeLa、U87、および293を、10%ウシ血清、2mMグ
ルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン、必須でないアミノ酸、ならび
にビタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中に接着性の培養物として維
持する。
により駆動されるヒトIFNβ遺伝子をコードするアデノウィルストランスファ
ーベクター(pAdCMV−huIFNβ)を、ヒトINF−β1aをコードす
るcDNA挿入物をプラスミドpAdCMVlink1に連結することにより構
築する(Engelhardtら,1994前出を参照のこと)。プラスミドp
AdCMV−huIFNβを、温度感受性アデノウィルスH5ts125から精
製されたゲノムDNAとともに、293細胞に同時トランスフェクトする。個々
のプラーク由来の組換えアデノウィルスを使用し、293細胞を39℃で感染し
、そしてこの上清をELISAアッセイによりIFN−β遺伝子発現について試
験する。IFN−βcDNA(H5.110hIFNβ)を有するアデノウィル
スを同定し、さらに増幅した。同様に、比色マーカーβガラクトシダーゼ(H5
.110lacZ)をコードするコントロールE2A温度感受性アデノウィルス
を作成する。ウィルス調製を293細胞で産生し、かつ2回のプラーク単離後C
sCl勾配で精製する。それらが野生型アデノウィルスの存在についてネガティ
ブであることを示した。
)でH5.110hIFNβを用いて感染する。15時間から18時間後、上清
が収集され、IFNβ濃度はELISAアッセイによって定量する。
体、B02でコートする(Summit Pharmaceuticals C
o.,Japan)。この抗体を50mM炭酸水素/炭酸ナトリウム、0.2m
M MgCl2、および0.2mM CaCl2(pH9.6)を含むコーティン
グ緩衝液中、10μg/mlで使用する。このプレートをPBS中1%カゼイン
を用いて1時間室温でブロックした後、1%カゼインおよび0.05%Twee
n−20に希釈したIFNβタンパク質標準(AvonexTM,Biogen)
のIFNβサンプルを添加する。次にこのプレートを室温で、抗IFNβウサギ
血清と共に(1:2000希釈)1時間、ロバ抗ウサギ抗体を結合した西洋ワサ
ビペルオキシダ−ゼ(HRP)と共に(Jackson Immuno Res
earch,1:5000希釈)1時間、およびこの基質溶液(4.2mM T
MBおよび0.1M酢酸ナトリウム−クエン酸ナトリウムpH4.9)と共に連
続的に室温でインキュベートする。この反応を2N H2SO4により停止した後
、吸光度を450nmで測定した。
nicファーム(Boston,Massachusetts)から入手する。
全てのマウスは、各試験の前、少なくとも2週間は、病原性のないBiogen
動物施設中に維持する。エキソビボ実験について、感染したおよび感染しなかっ
た細胞を、トリプシン/EDTA溶液で収集し、PBSで2回洗浄する。これら
の細胞は、マウスに注入する直前に、下記の比率で混合する。100μlのPB
S中に全部で2×106細胞を、右の脇腹の皮下に移植した。腫瘍サイズはキャ リパを使用して長さおよび幅を測定し、そして平均腫瘍直径(mm)として表す
。
Sを単回注入で腫瘍の中心に直接注入する。腫瘍は、キャリパを使用して長さお
よび幅をモニターする。腫瘍サイズはこの長さおよび幅を平均化することで計算
する。動物の死は、このなかで腫瘍が出血の兆しを示し始めたか、または全体重
の10%に達したマウスを屠殺することと定義しする。アポトーシスは、Onc
or,Inc.(Catalog#S7110−KIT)により提供されるイン
サイチュアポトーシス検出キットを使用して調査する。
ジーン発現を評価した。ヒト乳房ガン細胞MDA−MB−468は、漸増する多
重度感染(MOI)のH5.110lacZで感染した。X−gal染色後、本
発明者は、100のMOIで、この遺伝子形質導入の有効性はこれらの細胞中約
100%に達したことを見積もった(データ示さず)。従って、この乳房ガン細
胞は、1細胞あたり100プラーク形成ユニット(pfu)の比で培養物中に感
染される。なぜならこれらのガン細胞を用いた本発明者らの経験は、これがこの
集団における全ての細胞でこの遺伝子の発現を導く最も低いウィルス:細胞比で
あったことを示した。
匹のマウスはアデノウィルスIFNβで感染した細胞で注入する。有意なサイズ
の腫瘍は、対照の感染されていない細胞で注入した全てのマウスで生じた。腫瘍
は、IFNβ(H5.110hIFNβ:表1)を発現するアデノウィルスで処
理した細胞で感染した任意のマウスに現れなかった。
損失を導き得る可能性を除外するために、本発明者は、ウィルス感染後18時間
して検出したタンパク質濃度の、IFNβタンパク質をもちいてMDA−MB−
468細胞を処理した。徹底的な洗浄後、同数の処理した細胞または未処理細胞
、あるいは10%処理細胞を含む混合物をこのヌードマウスに注入する。腫瘍の
発達を、全て3つの群のマウスに観察する(データは示さず)。このことはエキ
ソビボIFNβ遺伝子送達は腫瘍形成の阻害に重要な意味を持つが、インビトロ
タンパク質処理はそうでないことを示す。
得るかどうかを決定するために、以下の実験を行なう。この同じガン細胞が、I
FNβ遺伝子(H5.110hlIFNβ)を発現するアデノウィルスで感染さ
れていないか、感染されているか、あるいは全く抗ガン効果を有することが予期
されないβガラクトシダーゼレポータータンパク質をコードするlacZ遺伝子
(H5.110lacZ)を発現する以外は同型のアデノウィルスで感染される
かのいずれかであり、従ってこのアデノウィルス自身による任意の効果について
の対照である。全てのアデノウィルス感染は、100のpfu:細胞比で行なう
。本発明者は、MDA−MB−468腫瘍細胞を100のMOIでH5.110
hIFNβまたはH5.110lacZを用いて別々に感染した。感染後18時
間で、この感染した細胞を収集し、そしてそれらの一部をマウスへの注入直前に
感染していない細胞で混合した。Balb/cヌードマウスに、同数の感染した
細胞、感染されていない細胞、もしくは10%の感染した細胞および90%のこ
のウィルスに曝露されなかった細胞を含有する混合物を用いて皮下に移植した。
腫瘍増殖を12日後にモニターする。感染されていない細胞で移植した全てのマ
ウスが腫瘍を発達させる一方で、どの腫瘍も100%H5.110hIFNβま
たはH5.110lacZ感染した細胞を受け入れたマウスで観察しなかったが
、これはいずれかのウィルスによる感染が腫瘍形成能を破壊し得ることを示唆す
る(表1)。しかし10%H5.110lacZ感染した細胞を受け入れた全て
のマウスが腫瘍を発達させた一方で、10%H5.110hIFNβ感染した細
胞を受容した全てのマウスは発達させなかった。従って、H5.110lacZ
感染は、この既に感染した細胞の腫瘍形成を抑制するに充分であるが、同時注入
した未処理のおよび感染していない細胞の腫瘍形成能ブロックしそこなった。対
照的に、10%の細胞におけるH5.110hIFNβによる形質導入は、この
ウィルスにより形質導入された細胞ならびに形質導入されなかった細胞の腫瘍形
成能を抑制するに充分であった。100%形質導入集団中、H5.110lac
Zによる腫瘍形成の阻害は、一般的ないくらかの毒性効果、またはこのアデノウ
ィルスの産生のいくらかの抗腫瘍効果に起因し得るが、形質導入細胞にインビト
ロで複製する能力があったことは記されるべきである(未公開データ)。
するために、このH5.110hIFNβおよびH5.110lacZ感染腫瘍
細胞を、各事例において感染していない細胞が過剰にあるような多様な比率で、
感染されていない細胞と別々に混合する。この混合は、異なる試料がこのアデノ
ウィルスで感染された10%、3%、1%、0.3%細胞、および感染されてい
ない残りからなる。混合後直ちにこの細胞はこのヌードマウスに注入される。こ
の結果を表1に示す。この腫瘍直径を細胞の注入後種々の時間で、二次元で測定
する。表1中の各データの点は、4匹のマウスからの横方向、および縦方向の直
径測定の、平均の+/−標準偏差を表す。測定は、この腫瘍細胞の注入後12、
19、26および33日で行った。
マウス中で完全にブロックされた(表1)。この細胞の注入後、最初の週で、非
常に小さい腫瘍を10、3、および1%のH5.110hIFNβを注入したマ
ウス中で検出し得た(これらは感知可能であるが、測定するに充分大きくはない
)。しかしこれらの小さい腫瘍の全ては、9日目で完全に後退した。このことは
、幾つかの細胞は短い期間生存し、かつこの期間中IFNβ遺伝子を発現したこ
とを示唆し、この全腫瘍の死へと導く。ヌードマウスにおいてこの細胞株で行っ
た幾つかの実験において、1%の細胞をH5.110hIFNβで形質導入し、
かつ100%が生存していた場合、腫瘍形成は決して観察されなかった(データ
は示さず)。0.3%H5.110hIFNβ形質導入細胞を受け入れたマウス
は腫瘍を発達させたが、これらの腫瘍のサイズは対照マウスのサイズより有意に
小さく、この0.3%群の、5匹のうちの2匹は、33日目までに完全に後退し
た(表1)。
スは未感染群と類似のサイズの腫瘍を発達させ、どの腫瘍の後退もこれらの対照
群のいずれにおいても観察されなかった(表1)。
ンβ(hIFN−β)の発現が、ヌードマウスにおいて腫瘍形成能をブロックす
るようであった。本発明者はさらに、腫瘍形成に影響を及ぼすが必然的にブロッ
クせず、かつマウスの生存を促進するのに要求されるH5.110hIFNβ感
染細胞についての最も低い比率を調査した。0.3%、0.1%、0.03%、
0.01%および0%H5.110hIFNβ感染細胞を含む同数のMDA−M
B−468細胞をヌードマウスに移植し、そして腫瘍増殖をモニターした。0.
3%または0.1%感染細胞を受け入れたマウスは、未感染細胞のみを受け入れ
たマウスと比較して、ずっと小さな腫瘍を発達させる(図1A)。0.3および
形質導入で形成された腫瘍の5つのうちの3つ、および0.1%形質導入で形成
された腫瘍の5つのうちの1つの腫瘍が、それぞれ完全に後退した。有意に延長
された生存が、0.3%および0.1%形質導入群中で観察された。0%、0.
01%、または0.03%感染した細胞の移植が75日以内に、全ての動物の死
を生じる一方で、0.1%および0.3%群のそれぞれにおいて、5匹のうちの
1匹および5匹のうちの3匹の動物が、109日目のこの実験の終了時に、腫瘍
を生じさせずに生存していた(図1B)。
.0%より大きい)が、効力を有するためにトランスフェクトまたは感染される
ことが必要であると思われる。これは、この腫瘍における全ての細胞が腫瘍抑制
遺伝子を獲得する必要がある野生型腫瘍サプレッサー(例えば、p53)の送達
のような、抗ガン遺伝子治療アプローチとは異なる。
抗増殖性効果を実証する。対照は、これがアデノウィルスよりもインターフェロ
ンに起因したことを示す。
おけるH5.110hIFNβ形質導入の効果を試験した。ヒト結腸ガン細胞K
M12L4A、ヒト肝臓ガン細胞Huh7、またはヒト子宮頚ガン細胞ME18
0をH5.110hIFNβで形質導入する。10%、1%、または0%形質導
入細胞を含有する同数の細胞を、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成するそれらの
能力について試験する。3つの型の未感染細胞の注入は、全てのマウスにおいて
速く増殖する腫瘍の形成を引き起こす。対照的に、10%H5.110hIFN
β感染細胞のエキソビボ送達は、試験した全ての動物において、腫瘍の発達がな
いように導くか、またはよりゆっくりと増殖する腫瘍の遅延状況に導く(図2A
)。H5.110hIFNβによる1%形質導入が完全に腫瘍形成を妨害するM
DA−MB−468細胞を用いて得られた結果とは異なり、これら3つの細胞型
の1%形質導入は腫瘍の形成をもたらすが、それらのサイズは各時点での未感染
対照より小さい。10%および1%形質導入細胞を受け入れたマウスは、未感染
細胞を受け入れたマウスと比較して延長された生存を示す(図2B)。従って、
多数の異なる腫瘍細胞へのエキソビボアデノウィルス媒介IFNβ遺伝子送達は
、腫瘍形成能の効率的な阻害をもたらし、かつ動物生存時間の増加を導く。
エキソビボアプローチの代わりに、直接インビボ遺伝子治療を行い得る。イン
ビボ遺伝子治療において、この遺伝子を直接的に患者に投与する。この実施例に
おいて、ヒトIFNβ遺伝子(H5.110hIFNβ)を有するアデノウィル
スを直接的に固体腫瘍に注入する。簡単には、2×106MBA−MD−468 ヒト乳房ガン細胞を、50のヌードマウスの背中に皮下注入した。約5〜6mm
の直径の皮下腫瘍は、MDA−MB−468細胞の皮下注入の24日後に、ヌー
ドマウス中に形成する。このとき、腫瘍を、単回腫瘍内注入において、1×10 7 〜3×109pfu/マウスの範囲である多様なウィルス用量で、PBS、ある
いはH5.110hIFNβおよびH5.110lacZベクターで処置した。
のみのINFβが血清中で検出される。1×108、3×107、および1×10 7 pfuを含むより低いH5.110hIFNβ用量はほとんどまたは全く効果 がなく(図3およびデータは示さず)、この抗腫瘍応答は用量依存性であること
を示す。等価な用量でのPBSまたはH5.110lacZの注入は腫瘍後退を
導かない(図3)。この腫瘍がより長い期間にわたりモニターされた場合、緩や
かな増殖および後退が、3×109pfuでH5.110lacZを注入した幾 つかの個々の腫瘍中に観察され、この対照ウィルスはその用量で腫瘍増殖の軽い
阻害を引き起こし得ることを示唆する。3×109、1×109、または3×10 8 pfuでH5.110hIFNβを用いた処置はPBSまたはH5.110l acZ処置マウスに対して、生存を有意に増加する(データは示さず)。本発明
者らはまた多回注入を試験し、確立したMDA−MB−468およびHeLa腫
瘍に3日おきに与えられた1×108pfu H5.110hIFNβの5注入 は、両腫瘍型のよりゆっくりとした増殖および後退をもたらす(未公開)。本発
明者はまた、ヒト神経膠細胞株U87を使用する類似のインビボ実験を行った。
これらの細胞は、完全な腫瘍後退が1×109pfu H5.110hIFNβ で処置された4匹のマウスのうち4匹、および1×108pfuで処置された4 匹のうちの2匹に見られるように、IFNβに対して非常に感受性であった(デ
ータは示さず)。これらの所見は、IFNβ遺伝子の直接および局所のインビボ
アデノウィルス送達が、有意な抗腫瘍効果を及ぼし得ることを実証する。
した腫瘍は後退の徴候を示す。ヘマトキシリン−エオシン染色によるMDA−M
B−468腫瘍の組織学的分析を行う。H5.110lacZ注入腫瘍において
よりも、H5.110hIFNβ注入腫瘍に、より多くのアポトーシス細胞が見
られる。本発明者は、末端標識したフラグメント化ゲノムDNAの直接蛍光検出
によりアポトーシスを確認した。非常に少数の浸潤単核細胞が、H5.110h
IFNβまたはH5.110lacZ注入腫瘍中に観察され、この細胞性免疫応
答はこのモデルにおけるH5.110hIFNβが指向する腫瘍後退において主
な役割を果たし得ないことを示す。
接の抗増殖性効果のみを測定する。これらは免疫不全性のマウスであるので、腫
瘍破壊を刺激し得るインターフェロンが有するどの免疫刺激活性も存在しない。
またインターフェロンはヒトからマウスへの種を交差しないので、これらのマウ
スにおいてヒトガン細胞を阻害するために用いられるこのヒトIFNβは、この
ヒトIFNβがマウス血管内皮細胞で作用しないので、血管形成を阻害するとは
予期されない。従って、ヒト患者がヒトIFNβを有するアデノウィルスで処置
された場合、さらにより多い劇的な抗ガン活性が見られる可能性がある。これは
、免疫適格(immune−competent)非ヒト霊長類においてモデル
化され得た。あるいは、マウス起源の腫瘍を有する免疫適格マウスにおいてマウ
スIFNβ遺伝子を有するアデノウィルスを使用し得た。これらの同系マウス腫
瘍モデルの多くが利用可能である。
に確立した腫瘍の後退を引き起こすためのIFNβ遺伝子治療の顕著な能力を実
証する。このエキソビボ形質導入実験は、強力な分泌タンパク質の0.3%〜1
.0%程度形質導入細胞への導入がMDA−MB−468腫瘍の確立をブロック
することを確認した。多様な他の腫瘍細胞株を試験し、そしてIFNβ効果の効
力に変動があるが、全てが1〜10%のIFNβ形質導入細胞でブロックされ得
た。腫瘍形成に影響するに必要な相対的に小さなパーセントのIFNβ分泌細胞
により刺激されるが、次に本発明者は、前形成された(pre−formed)
腫瘍をこのアデノウィルスの直接腫瘍内注入でチャレンジした。再びこのIFN
β遺伝子送達の効果は強力であり、ウィルスの単回注入は、部分的な、またはあ
る場合は完全な腫瘍後退をもたらした。
殖性または細胞傷害性活性の結果であるようであった。この結果は、この研究に
おいて使用されたIFNβ遺伝子がヒト起源のものであるという事実により支持
され、そしてヒトIFNβは認識し得るほどには、この宿主マウス細胞と交差反
応しない。また、使用された免疫不全ヌードマウスは、Tリンパ球、1型IFN
誘導免疫刺激中における主なエフェクター細胞を欠く(Tough,D.Fら,
(1996),Science 272:1947−1950およびRogge
、L.ら(1997)J.Exp.Med.,185:825−831)。さら
にIFNβ遺伝子送達後迅速に後退する腫瘍において、単核細胞の浸潤中の顕性
な増加は観察されなかった。これらの所見は、IFNβ媒介抗増殖性活性が腫瘍
後退を引き起こすに単独で充分であり得たという考えを支持する。本発明者らの
データは、悪性細胞のIFN誘導抗増殖性活性に対するインビトロ感受性と、イ
ンビボ治療効果との間で以前に観察された臨床的相関と一致するようである(E
inhornおよびGrander(1996)J.Interferon C
ytokine Res.16:275−281)。
効率的な抗腫瘍効果を及ぼし得ることが見出された。INFβ遺伝子の非常に小
さいパーセントの細胞へのエキソビボ送達が腫瘍形成をブロックするに充分であ
り、そして単回用量直接的腫瘍内IFNβ遺伝子送達は確立した腫瘍の後退を導
いた。いかなる作用理論により結び付けられることを切望せずに、この強力な抗
腫瘍効果はIFNβの自己分泌およびパラ分泌効果から得られ得る。この抗腫瘍
効果は、遺伝子送達の程度が限定されるようであり、かつ有意なバイスタンダー
(bystsnder)効果が要求される遺伝子治療ガン試行における重大な因
子であり得た。従って、局所のIFNβ遺伝子治療は、ヒトにおける腫瘍の処置
について有望なストラテジーを提供する。
きである。従って、種々の改変および等価物は本発明の精神および範囲から外れ
ることなしになされ得ることが当業者に明らかである。
.01%(上向き白三角)、0.03%(白四角)、0.1%(下向き白三角)
、または0.3%(斜線丸)のH5.110hIFNβ細胞で感染させた細胞の
いずれかを、ヌードマウスの横腹に皮下注射し、平均腫瘍サイズを腫瘍細胞移植
後の時間に対してプロットした。
Kaplan−Meirプロット。感染していない細胞(白丸);0.01%(
上向き白三角)、0.03%(白四角)、0.1%(下向き白三角)、0.3%
(斜線丸)でのH5.110hIFNβ感染細胞。
)ME180細胞における、エキソビボインターフェロンβ遺伝子治療。平均腫
瘍サイズを、腫瘍細胞移植後の時間に対しプロットした。非感染細胞(黒四角)
、あるいは、1%(黒丸)、または10%(上向き黒三角)でのH5.110h
IFNβ感染細胞を移殖したマウス。数匹のマウスを屠殺したこれらの群におい
て、腫瘍サイズを平均として示し、最後の値は屠殺した動物について行ったもの
である。プロットの不連続は、群における全ての動物の死亡または屠殺を反映す
る。
、2、および3は、KM12L4A細胞、Huh7細胞、およびME180細胞
のそれぞれを用いて移植したマウスを用いて作製したデータを示す。シンボルは
、非感染細胞(黒四角)、1%(黒丸)、または10%(上向き黒三角)でのH
5.110hIFNβ感染細胞を移植したマウスを示す。
腫瘍を、それぞれ3×109pfu(斜線丸)、1×109pfu(斜線四角)、
3×108pfu(白丸)、1×108pfu(上向き白三角)、および3×10 7 pfu(下向き白三角)のH5.110hIFNβでか、またはPBS(×四 角)で、または3×109pfu(白ダイヤ)、1×109pfu(上向き黒三角
)、3×108pfu(×)、および1×108pfu(白右向き三角)のH5.
110lacZでそれぞれ注射した。腫瘍サイズを、処置注射後14日間にわた
り、測定した。
内投与、気管内投与、気管支内投与、筋肉内投与、および皮下投与からなる群よ
り選択される経路により投与される、請求項15〜16のいずれか1項に記載の ベクター。
、および皮下投与からなる群より選択される経路を含む、請求項17に記載のベ クター。
ノウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターを含み、ここで
、該アデノウイルスベクターは、それ自体、(a)そのE1遺伝子における欠失
を有するアデノウイルスベクター;(b)そのE1遺伝子における欠失およびそ
のE2a遺伝子における欠失または変異を有するアデノウイルスベクター;(c
)そのE1およびE4遺伝子の両方における欠失を有するアデノウイルスベクタ
ー、および(d)そのE1、E2、E3およびE4遺伝子の欠失を有するアデノ
ウイルスベクターからなる群より選択されるアデノウイルスベクターである、請
求項15〜20のいずれか1項に記載のベクター。
するための誘導性プロモーターを含む、請求項18に記載のベクター。
て、該組成物が複数の細胞を含み、ここで該複数の細胞が、少なくとも1つの組 換えアデノウイルスを含む細胞、および組換えアデノウイルスを含まない過剰の 細胞を含み、 ここで該アデノウイルスがそのE1遺伝子における欠失または変異
を有し、該アデノウイルスが分泌タンパク質をコードする単離されたポリヌクレ
オチドをさらに含む、組成物。
ノウイルスを含む、請求項24に記載の組成物。
ウイルスを含む、請求項24に記載の組成物。
ウイルスを含む、請求項24に記載の組成物。
デノウイルスを含む、請求項24に記載の組成物。
、該組成物が、ヒトインターフェロンβタンパク質をコードする単離されたポリ
ヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む、組成物。
投与、気管内投与、気管支内投与、筋肉内投与、および皮下投与からなる群より
選択される経路により投与される、請求項30に記載の組成物。
、および皮下投与からなる群より選択される経路を含む、請求項31に記載の組 成物。
Claims (37)
- 【請求項1】 インターフェロンβタンパク質のインビボ発現のための細胞
系であって、該系は、哺乳動物細胞;および該哺乳動物細胞に含まれるベクター
であって、インターフェロンβタンパク質をコードし、その発現を可能にするイ
ンターフェロンβポリヌクレオチド配列を有するベクター、 を包含する、細胞系。 - 【請求項2】 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の細胞系。
- 【請求項3】 前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターおよびア
デノウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターを含み、ここ
で、該アデノウイルスベクターは、それ自体、(a)そのE1遺伝子における欠
失を有するアデノウイルスベクター;(b)そのE1遺伝子における欠失および
そのE2a遺伝子における欠失または変異を有するアデノウイルスベクター;(
c)そのE1およびE4遺伝子の両方における欠失を有するアデノウイルスベク
ター、ならびに(d)そのE1、E2、E3およびE4遺伝子の欠失を有するア
デノウイルスベクターからなる群より選択されるアデノウイルスベクターである
、請求項1に記載の細胞系。 - 【請求項4】 前記細胞が、複数の細胞の一部分であって、該複数の細胞の
数の約10%以下が前記ベクターを含む、請求項1に記載の細胞系。 - 【請求項5】 前記複数の細胞の数の約3.0%以下が前記ベクターを含む
、請求項4に記載の細胞系。 - 【請求項6】 前記複数の細胞の数の約1.0%以下が前記ベクターを含む
、請求項5に記載の細胞系。 - 【請求項7】 前記複数の細胞の数の約0.3%以下が前記ベクターを含む
、請求項6に記載の細胞系。 - 【請求項8】 前記細胞が癌細胞である、請求項1〜7に記載の細胞系。
- 【請求項9】 前記癌細胞が肝臓癌細胞である、請求項8に記載の細胞系。
- 【請求項10】 請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞系および薬学的
に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項11】 遺伝子治療の薬学的調製物を作製するための方法であって
、該方法は、(a)該遺伝子治療の薬学的調製物のレシピエント同じ細胞種を含
む複数の細胞を形成する工程、(b)該複数の細胞のうち少なくとも1つにイン
ターフェロンβタンパク質をコードするインターフェロンβポリヌクレオチド配
列を有するベクターを導入して、インターフェロンβタンパク質を発現させる工
程、および(c)薬学的に受容可能なキャリア中に少なくとも1つの細胞を配置
する工程、を包含する、方法。 - 【請求項12】 前記少なくとも1つの細胞にベクターを導入する工程が、
前記複数の細胞の数の約10%以下にベクターを導入する工程を包含する、請求
項11に記載の方法。 - 【請求項13】 前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターおよびアデノ
ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターを含む、請求項1
0〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項14】 前記アデノウイルスベクターが、(a)そのE1遺伝子に
おける欠失を有するアデノウイルスベクター;(b)そのE1遺伝子における欠
失およびそのE2a遺伝子における欠失または変異を有するアデノウイルスベク
ター;(c)そのE1およびE4遺伝子の両方における欠失を有するアデノウイ
ルスベクター、ならびに(d)そのE1、E2、E3およびE4遺伝子の欠失を
有するアデノウイルスベクターからなる群より選択される、請求項13に記載の
方法。 - 【請求項15】 遺伝子治療のための方法であって、該方法が、(a)少な
くとも1つの哺乳動物細胞にインターフェロンβタンパク質をコードするインタ
ーフェロンβポリヌクレオチド配列を有するベクターを導入して、インターフェ
ロンβタンパク質を発現させる工程、および(b)該少なくとも1つの細胞を該
哺乳動物の部位に接触させる工程、を介して、該少なくとも1つの哺乳動物細胞
を遺伝的に改変する工程、を包含する、方法。 - 【請求項16】 前記ベクターを導入する工程の前に、前記哺乳動物に由来
する前記少なくとも1つの細胞を取り出す工程をさらに包含する、請求項15に
記載の方法。 - 【請求項17】 前記少なくとも1つの細胞を取り出す工程が、複数の細胞
を取り出す工程を包含し、そして前記ベクターを導入する工程が該複数の細胞の
約10%未満にベクターを導入する工程を包含する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 前記ベクターを導入する工程が、前記少なくとも1つの細
胞に該ベクターを直接注入する工程を包含する、請求項15〜17のいずれか1
項に記載の方法。 - 【請求項19】 前記投与する工程が、局所投与、眼内投与、非経口投与、
鼻腔内投与、気管内投与、気管支内投与、筋肉内投与、および皮下投与からなる
群より選択される経路による投与を包含する、請求項15〜16のいずれか1項
に記載の方法。 - 【請求項20】 前記非経口投与が、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与
、および皮下投与からなる群より選択される経路を含む、請求項19に記載の方
法。 - 【請求項21】 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項15〜20のいずれか
1項に記載の方法。 - 【請求項22】 前記細胞が肝臓細胞である、請求項21に記載の方法。
- 【請求項23】 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターおよびアデ
ノウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターを含み、ここで
、該アデノウイルスベクターは、それ自体、(a)そのE1遺伝子における欠失
を有するアデノウイルスベクター;(b)そのE1遺伝子における欠失およびそ
のE2a遺伝子における欠失または変異を有するアデノウイルスベクター;(c
)そのE1およびE4遺伝子の両方における欠失を有するアデノウイルスベクタ
ー、および(d)そのE1、E2、E3およびE4遺伝子の欠失を有するアデノ
ウイルスベクターからなる群より選択されるアデノウイルスベクターである、請
求項15〜22のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項24】 前記発現ベクターを導入する工程が、前記少なくとも1つ
の細胞に該ベクターを直接注入する工程を包含する、請求項20に記載の方法。 - 【請求項25】 前記導入する工程が、前記インターフェロンの転写を制御
するための誘導性プロモーターを含む該発現ベクターを導入する工程を包含する
、請求項20に記載の方法。 - 【請求項26】 前記発現ベクターがウイルスベクターを含む、請求項20
に記載の方法。 - 【請求項27】 前記哺乳類動物レシピエントがヒトである、請求項20に
記載の方法。 - 【請求項28】 エキソビボでの遺伝子治療の方法であって、該方法は、 被験体から複数の細胞を取り出す工程; 組換えアデノウイルスを含まない過剰の細胞が存在するように、該複数の細胞
のうち少なくとも1つの細胞に、該アデノウイルスを投与する工程であって、こ
こで該アデノウイルスがそのE1遺伝子における欠失または変異を有し、該アデ
ノウイルスが分泌タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに
包含する、工程;および 該被験体に該複数の細胞を再導入する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項29】 前記複数の細胞の数の少なくとも10%が前記組換えアデ
ノウイルスを含む、請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 前記複数の細胞の数の少なくとも3%が前記組換えアデノ
ウイルスを含む、請求項28に記載の方法。 - 【請求項31】 前記複数の細胞の数の少なくとも1%が前記組換えアデノ
ウイルスを含む、請求項28に記載の方法。 - 【請求項32】 前記複数の細胞の数の少なくとも0.3%が前記組換えア
デノウイルスを含む、請求項28に記載の方法。 - 【請求項33】 前記分泌タンパク質がインターフェロンである、請求項2
8に記載の方法。 - 【請求項34】 インビボでの遺伝子治療の方法であって、最初に被験体か
ら細胞を取り出すことなく、該被験体の細胞に直接ヒトインターフェロンβタン
パク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを投与
する工程を包含する、方法。 - 【請求項35】 前記投与する工程が、局所投与、眼内投与、非経口投与、
鼻腔内投与、気管内投与、気管支内投与、筋肉内投与、および皮下投与からなる
群より選択される経路による投与を包含する、請求項34に記載の方法。 - 【請求項36】 前記非経口投与が、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与
、および皮下投与からなる群より選択される経路を含む、請求項35に記載の方
法。 - 【請求項37】 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項34に記載の方法。
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