CZ299095B6 - Bunecný systém pro lécení rakoviny obsahující bunku savce a virový vektor s genem kódujícím proteininterferon-beta, farmaceutický prípravek obsahující takový bunecný systém a zpusob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Rešení poskytuje bunecný expresní systém pro sekretovaný protein in vivo nebo ex vivo, konkrétne pro interferon. Vynález dále poskytuje farmaceuticképrípravky pro in situ modifikaci bunek príjemce, kterým je savec, prostrednictvím DNA kódující sekretovaný protein. Prípravky podle vynálezu jsou užitecné pro lokální a systémové podávání interferonuk lécení rakoviny.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká genové terapie. Konkrétně se vynález týká podávání DNA, která kóduje sekretované proteiny jako jsou např. interferonové proteiny, ělověku nebo zvířeti, a to prostřednictvím buněčného systému podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Interferony (také označované „IFN“) jsou proteiny mající řadu biologických aktivit, z nichž některé jsou antivirové, imunomodulační a antiproliferativní. Jsou to relativně malé, druhově specifické jednořetězcové polypeptidy, tvořené v buňkách savců, které tak odpovídají na expozici různých induktorů, jako jsou např. viry, polypeptidy, mitogeny apod. Interferony chrání savčí tkáně a buňky proti napadení viry ajsou důležitou součástí hostitelského obranného mechanismu.

Ve většině případů poskytují interferony lepší ochranu těm tkáním a buňkám, ve kterých byly vytvořeny, než ostatním tkáním a buňkám, což ukazuje, že interferony pocházející z člověka budou účinnější při léčení nemocí u člověka než interferony z jiných biologických druhů.

Existuje několik odlišných typů lidských interferonů, které se obecně rozdělují na leukocytové (interferon-alfa [a]), fibroblastové (interferon-beta [β]) a imunitní (interferon-gama [γ]), a celá řada jejich variant. Obecnou diskusi o interferonech lze najít v mnoha odborných publikacích, např. „The Interferon Systém“ (W. E. Stewart, II., Springel Verlag, N.Y., 1979) a „Interferon Therapy“ (World Health Organization Technical Report Series 676, WHO, Geneva, 1982).

Interferony jsou potenciálně využitelné k léčení mnoha druhů rakovin, neboť projevují protirakovinovou aktivitu, která působí na mnoha úrovních. Za prvé, interferonové proteiny mohou přímo inhibovat proliferaci lidských nádorových buněk. Antiproliferační aktivita působí synergicky s mnoha již uznávanými chemoterapeutickými činidly jako je cis-platina, 5FU a taxol. Za druhé, imunomodulační aktivita interferonových proteinů může indukovat protinádorovou imu35 nitní odpověď. Součástí této odpovědí je aktivace NK buněk, stimulace aktivity makrofágů a indukce exprese MHC třídy I na povrchu, což vede k indukci protinádorové aktivity cytotoxických T lymfocytů. Kromě toho některé studie ukazují, že IFN-β má antiangiogenní aktivitu. Angiogeneze, tj,. vytváření nových krevních cév, je kritická pro růst solidních nádorů. Důkazy ukazují, že IFN-β může inhibovat angiogenezi tím, že inhibuje expresi pro-angiogenních faktorů jako jsou bFGF a VEGF. A nakonec interferonové proteiny mohou mírnit i invezivnost nádorů tím, že ovlivňují expresi enzymů jako je kolagenáza a elastáza, kteréjsou důležité při přetváření tkání.

Interferony projevují také antivirovou aktivitu, která je založena na dvou odlišných mechanis45 mech. Např. interferonové proteiny typu I (a a β) přímo inhibují replikaci lidského viru hepatitidy B (HBV) a C (HCV), a také stimulují imunitní odpověď namířenou proti buňkám, infikovaným těmito viry.

I přes jejich potenciální terapeutické využití měly interferonové proteiny pouze omezenou klinic50 kou úspěšnost proti virové hepatitidě a solidním nádorům. IFN-α byl schválen pro léčení jako HBV tak I HCV, ale odpovídavost je v obou případech tak přibližně 20 %. Zatímco interferonové proteiny byly schváleny pro léčení některých typů rakoviny jako jsou lymfomy, leukemie, melanomy a karcinom ledvinných buněk, většina klinických zkoušek, kdy byly interferony použity buďto samotné nebo v kombinaci s konvenčními chemoterapeuticky při léčení solidních národů, byla neúspěšná.

-1 CZ 299095 B6

Způsob podávání interferonu je důležitým faktorem při klinickém použití tohoto důležitého terapeutického agens. Systémové podávání interferonu, ať již intravenózní, intramuskulámí nebo subkutánní injekcí, bylo nejčastěji užívaným a do jisté míry úspěšným způsobem při léčení leukemie vlasatých buněk, syndromu získané imunodeficience (AIDS) a souvisejícího Kaposiho sarkomu. Avšak je známo, že proteiny v jejich purifikované formě jsou zvláště náchylné k degradaci. Konkrétně u interferonu-beta primárním mechanismem degradace interferonu v roztoku je agregace a deamidace. Nedostatečná stabilita interferonu v roztoku či v jiných produktech velmi omezuje možnosti využití. Kromě toho po parenterálním podání interferonového proteinu io (tj. intramuskulámě, subkutánně nebo intravenózně) se projevuje velmi rychlá clearance interferonu. Proto parenterální podání proteinu nezajistí lokalizaci dostatečného množství interferonu v aktivním místě (solidní nádor nebo játra v případě hepatitidy). Množství interferonu, které může být podáno parenterálně, je omezené vedlejšími účinky, které jsou pozorovány při vyšších dávkách interferonu. Je tedy zjevně potřeba účinnější terapie.

Podstata vynálezu

Předkládaná přihláška směřuje k řešení toho, jak eliminovat problémy spojené s aplikací sekre20 tovaných proteinů jako je např. interferon, jakožto léčiva. Předkládaný vynález se proto týká způsobu interferonové terapie, kdy se místo proteinu samotného aplikuje do organismu gen kódující sekretovaný protein.

Tudíž jeden předmět předkládaného vynálezu se týká způsobu genové terapie, který je založený na použití geneticky upravených buněk a jejich využití k přenosu sekretovaného proteinu do příjemce, kterým je savec. Předkládaný vynález se týká též přípravy buněčného expresního systému, takto vytvořeného expresního systému a farmaceutického přípravku, obsahujícího takový expresní systém. Buněčný expresní systém exprimuje gen, který kóduje jeden nebo několik sekretovaných proteinů a je užitečný jako vehikulum pro přenos genového produktu do savčího příjemce in šitu. Ve výhodné provedení je příjemcem, který je savec, člověk.

Jiné provedení předkládaného vynálezu se týká buněčného expresního systému pro expresi v buňce savčího příjemce in vivo interferonového proteinu pro léčení nemoci. Expresní systém obsahuje buňky téhož biologického druhu jako je savčí příjemce a expresní vektor v nich obsa35 žený pro expresi interferonového proteinu. Výhodně je savčím příjemcem člověk a expresní vektor obsahuje virový vektor.

V jiném provedení vynálezu expresní sytém obsahuje množství buněk téhož biologického druhu jako je savčí příjemce a expresní vektor obsažený v těchto buňkách pro expresi sekretovaného proteinu. Přitom expresní vektor je obsažen pouze v části z mnoha buněk. Výhodně alespoň 0,3 % z celkového počtu buněk obsahuje vektor. Výhodný sekretovaný protein je interferon beta, gama a konvenční interferon, nej výhodnější je interferon beta.

V jiném provedení buněčný expresní systém obsahuje množství rakovinných buněk a alespoň část těchto buněk obsahuje adenovirový vektor obsahující izolovaný polypeptid kódující expresi interferonu. V tomto buněčném expresním systému jsou adenovirové vektory vybrány ze skupiny obsahující: a) adenovirový vektor mající deleci a/nebo mutaci v genu El, b) adenovirový vektor majíc deleci a/nebo mutaci v genu E2, přičemž vektor exprimuje lidský interferon beta, c) adenovirový vektor mající deleci a/nebo mutaci jak v genu El tak i v genu E2 a d) adenovirový vektor mající deletované všechny geny, přičemž vektor exprimuje lidský interferon beta.

Předkládaný vynález se dále týká zejména farmaceutického přípravku pro podávání sekretovaného proteinu do určeného místa v příjemci, kterým je savec. Přípravek obsahuje nosič a množství geneticky modifikovaných buněk téhož biologického druhu jako je savčí příjemce, přičemž ales55 poň část buněk obsahuje expresní vektor pro expresi účinného množství sekretovaného proteinu.

-2CZ 299095 B6

Výhodný sekretovaný protein je interferon. Příjemce zahrnuje přípravek jak pro podávání in vivo tak i pro přenos in vitro.

Předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy farmaceutického přípravu ex vivo pro podání savčímu příjemci při genové terapii. Tento způsob obsahuje kroky, kde se: a) připraví množství buněk téhož biologického druhu jako je savčí příjemce, b) alespoň do jedné buňky z tohoto množství buněk se vnese expresní vektor pro expresi sekretovaného proteinu, aby se vytvořila alespoň jedna geneticky modifikovaná buňka a c) alespoň jedna geneticky modifikovaná buňka se umístí do farmaceuticky přijatelného nosiče, aby se tak získal farmaceutický přípravek, který je vhodný pro podávání do místa v savčím příjemci.

Dále se předkládaný vynález týká také způsobu genové terapie, který obsahuje genetickou modifikaci alespoň jedné buňky savčího příjemce prostřednictvím následujících kroků: a) alespoň do jedné buňky se vnese expresní vektor pro expresi sekretovaného proteinu, aby se vytvořila alespoň jedna geneticky modifikovaná buňka a b) umožní se geneticky modifikované buňce, aby se dostala do kontaktu s místem v savčím příjemci. Způsob může případně dále obsahovat krok, aby se ze savčího příjemce odstraní alespoň jedna buňka před tím, než se vnese expresní vektor. V dalším provedení krok vnesení vektoru obsahuje vnesení vektoru pouze do části v množství buněk.

Dále se předkládaný vynález týká způsobu genové terapie ex vivo, který obsahuje kroky, kdy se ze subjektu vyjme množství buněk, podá se rekombinantní adenovirus do alespoň jedné buňky z tohoto množství buněk, takže existuje přebytek buněk neobsahujících adenoviru. Adenovirus má deleci v genu El a obsahuje izolovaný polypeptid kódující sekretovaný protein. Toto množ25 štvi buněk je pak vneseno zpět do subjektu.

Kroky ve způsobu genové terapie in vivo obsahují podání adenovirového vektoru, který obsahuje izolovaný polynukleotid kódující protein lidského interferonu-beta (β), přímo do buněk subjektu, aniž by předtím byly buňky vyjmuty ze subjektu. Způsob in vivo a ex vivo umožňují topické, intraokulámí parenterální, intranazální, intratracheální, intrabronchiální, intramuskulámí, subkutánní, intravenózní, intramuskulámí a intraperitoneální podání.

Předkládaný vynález poskytuje řadu výhod. Interferonová genová terapie umožňuje aplikovat velmi vysokou lokální koncentraci interferonu s velmi nízkými systémovými hladinami. To vede k dosažení velké účinnosti při minimálních vedlejších účincích. Také interferony podávané genovou terapií budou přítomny ve značně vyrovnané, konstantní hladině, na rozdíl od situace při léčení interferonovým proteinem, kdy se pozorují značné „výrony“ interferonu nebo vrcholy v koncentraci proteinů (které mohou vést až k toxicitě) následující po injekci proteinu, po nichž následují velmi nízké hladiny, kde je koncentrace interferonu pravděpodobně příliš nízká na to, aby byla účinná.

Pohodlí pacienta je také důležitým faktorem. Zatímco při proteinové terapii jsou nutné časté injekce interferonu, jediné podání nebo několik nepříliš častých podání vektoru exprimujícího interferonový gen poskytne dlouhodobou stálou produkci požadovaného proteinu. Genová terapie dovoluje podání interferonů řízeným způsobem do určitého cílového orgánu nebo do nádoru. Může být vytvořen takový autokrinní systém, kdy tytéž buňky exprimují, sekretují i přijímají interferon. Lze tak dosáhnout velmi vysokých dávek interferonu. Takto vysokých dávek není možné dosáhnout parenterálním podáváním proteinu z důvodů toxicity.

Jelikož interferonové proteiny jsou sekretovány z buněk, každá buňka nádoru nebo hepatitidou infikovaných jater nemusí být transdukována genem interferonu. Ty buňky, do kterých se nedostane gen, budou pod vlivem sousedních buněk (tzv. „bystander effect“), které obsahují gen a sekretují interferonový protein. To je velmi významné zjištění a bude mít velmi vážné důsledky pro léčebný režim, neboť není třeba, aby každá buňka z celkové masy nádoru nebo orgánu obsahovala expresní vektor.

-3 CZ 299095 B6

Bylo ukázáno, že parenterální podávání interferonů vede k tvorbě anti-interferonových protilátek. Je možné, že tato odpověď potenciálně neutralizačních protilátek bude zmenšena po vnesení genu pro interferon do určité lokální oblasti. Kromě toho, že bude interferon exprimován lokálně, bude tvořen endogenními lidskými buňkami, proto budou jeho struktura a glykosylace bližší přirozenému stavu, a proto také méně imunogenní než interferon produkovaný v bakteriích, kvasinkách nebo buňkách ovarií čínského křečka, purifikovaný a podávaný parenterálně injekcí.

Tyto a další výhody předkládaného vynálezu budou zřetelnější na základě detailního popisu výhodných provedení vynálezu a doprovázejících obrázků.

Popis obrázků

Obr. 1. (A) Neinfikované buňky MDA-MB-468 (°) nebo buňky infikované H5.100/z/W/? v 0,01 % (Δ), 0,03 % (□), 0,1 % (V) nebo 0,3 % (O) byly injikovány subkutánně po boku „nahých“ myší a pak byla průměrná velikost nádoru vynesena v závislosti na čase po implantaci nádorových buněk.

(B) Kaplan-Meirův graf ukazující procento přežívajících myší po dobu pozorování 109 dnů.

Neinfikované buňky (°), buňky infikované H5.1 ΟΜΕΝβ v 0,01 % (Δ), 0,03 (□), 0,1 % (V) a 0,3 % (O).

Obr. 2. (A) Ex vivo genová terapie s interferonem beta v (1) buňkách KM12L4A, (2) buňkách

Huh7 a (3) buňkách ME180. Průměrná velikosti nádoru byla vynesena jako funkce času po implantaci nádorových buněk. Myším byly implantovány neinfikované buňky () nebo buňky infikované H5.1 lOů/F/V/J v 1 % (·) nebo 10 % (*). V těchto skupinách, kde byly některé myši utraceny, je velikost nádoru uvedena jako průměrná hodnota s poslední uvedenou hodnotou pro utracená zvířata. Přerušení grafu odráží úhyn nebo utracení všech zvířat ve skupině.

(B) Procenta přežívání myší po dobu pozorování 70 dnů. Panely 1, 2 a 3 ukazují data získaná na myších s implantovanými buňkami KM12L4A, Huh7 a ME180, v uvedeném pořadí. Symboly představují myši, kterým byly implantovány neinfikovány neinfikované buňky () nebo buňky infikované H5.1 ΥΜΕΝβχ 1 % (·) nebo 10 % (*·).

Obr. 3. Přímé ošetření in vivo zavedených nádorů MDA-MB-468. Nádory byly injikovány H5.1 lOů/EV/? v množství 3 χ 10⁹ pfu (O), 1 χ 10⁹ pfu (□), 3 χ 10⁸ pfu (°), 1 χ 10⁸ pfu (Δ) a 3 χ 10⁷ pfu (V), nebo PBS (□) anebo H5.100/acZ v množství 3 χ 10⁹ pfu (O), 1 χ 10⁹ pfu (A), 3 χ 10⁸ pfu (χ), 1 χ 10⁸ pfu ([>). Velikost nádorů byla měřena po dobu 14 dnů po injekčním ošetření.

Popis výhodných provedení vynálezu

Předkládaný vynález je založen, zčásti, na vývoji metody genové terapie ex vivo, která užívá buňky, které 1) mohou být snadno získány od pacienta, 2) mohou být modifikovány in vitro vnesením genetického materiálu, 3) mohou být pohodlně implantovány příjemci, 4) nejsou trombogenní a 5) mohou se implantovat příjemci ve velkém počtu. Genová terapie in vivo podle předkládaného vynálezu užívá buňky, které 1) jsou přítomny v příjemci a 2) mohou být in šitu modifikovány, aby exprimovaly izolovaný genetický materiál. Geneticky modifikované buňky obsahují regulační prvky pro řízení množství genetického materiálu, které je exprimováno.

-4CZ 299095 B6

Geneticky modifikované buňky přežívají a produkují exprimovaný materiál in šitu po dobu nutnou ktomu, aby exprimovaný materiál projevil prospěšný (tj. léčebný) účinek, aniž by došlo k nežádoucímu narušení normální funkce tkáně, kde jsou buňky lokalizovány.

Výhodně je exprimovaným materiálem sekretovaný protein (dále podrobněji definovaný). Nejvýhodněji je sekretovaným proteinem interferon. Skutečně, i když interferony jsou nej výhodnějším terapeutickým agens, byl nalezen obecný terapeutický princip aplikovatelný na genovou terapii s jakýmkoliv sekretovaným proteinem. Bylo zjištěno, že díky tomu, že sekretované proteiny, jako jsou např. interferony, jsou uvolňovány z buněk, ve kterých jsou exprimovány, nemusí být každá buňky z celkové masy nádoru nebo např. hepatitidou infikovaných jater transdukovány genem pro sekretovaný protein. Ty buňky, do kterých se nedostane gen, budou pod vlivem sousedních buněk (tzv. „bystander effect“), které obsahují gen a sekretují interferonový protein. Ačkoliv je popsána genová terapie s izolovaným polynukleotidem, který kóduje expresi interferonů, jakýkoliv sekretovaný protein (jak je definován dále) může být potenciálně využit v metodě nebo přípravku podle vynálezu. Všechny citované publikace v tomto textu jsou do přihlášky zahrnuty formou odkazů.

I. Definice „Genová terapie“ je postup, kterým se fenotyp spojený s nemocí „opraví“ tím, že se vnese genetická informace do organismu trpícího nemocí.

„Genová terapie ex vivo“ je postup, při kterém se ze subjektu vyjmou buňky a kultivují se in vitro. Polynukleotid jako např. funkční gen se vnese do buněk in vitro, modifikované buňky se namnoží v kultuře a pak se implantují zpět subjektu.

„Genová terapie in vivo“ je postup, při kterém se cílové buňky nevyjímají ze subjektu, ale přenášený polynukleotid (např. gen kódující expresi interferonů) je vnesen do buněk příjemcova organismu in šitu, tj. uvnitř příjemce. Genová terapie in vivo byla zkoumána na několika zvířecích modelech a současné odborné publikace popisují možnost přímého přenosu in šitu do orgánů a tkání.

Termín „stavy vhodné pro genovou terapii“ zahrnuje patologické stavy jak jsou genetické nemoci (tj. nemoci, které jsou důsledkem jednoho nebo více defektů genů), získané nemoci (tj. patologic35 ké stavy, které nejsou důsledkem vrozené vady), různé typy rakovinných onemocnění, a také příslušné profylaktické procesy (tj. prevenci nemoci nebo nežádoucích stavů).

„Získaná nemoc“ označuje nemoc nebo syndrom, které se projevují nenormálním fyziologickým, biochemickým, buněčným, strukturním nebo molekulárně biologickým stavem.

„Polynukleotid“ je polymer monomem ich jednotek nukleové kyseliny, kdy monomemí jednotky jsou buďto ribonukleové kyseliny (RNA) nebo deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo jejich kombinace. Čtyři báze přítomné v DNA jsou adenin (A), guanin (G), cytosin (C) a thymin (T). Čtyři báze RNA jsou A, G, C a uráčil (U).

Termín „izolovaný“ znamená, pokud se týká polynukleotidových sekvencí genů, které kódují interferon, RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s nimi: I) není spojen se všemi polynukleotidy se kterými je spojen v přírodě (např. je přítomen v hostitelské buňce jako část expresního vektoru), II) je spojen s nukleovou kyselinou nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako „izolovaná“ se dále označuje polynukleotidová sekvence I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), II) syntetizovaná chemicky, III) rekombinantně připravená klonováním nebo IV) purifikovaná, např. štěpením a gelovou separací.

-5CZ 299095 B6

Takže k „izolovaným“ interferonovým polynukleotidům patří např. nukleové kyseliny nevyskytující se v přírodě, které se mohou snadno transkribovat do „anti-sense“ RNA, a také gen kódující interferonový protein, který není exprimován neboje exprimován v biologicky nevýznamném množství v přirozeně se vyskytujících buňkách. Pro ilustraci, syntetický nebo přírodní gen kódu5 jící lidský interferon-beta la by se považoval za izolovaný vzhledem k mozkovým buňkám člověka, neboť tyto buňky přirozeně neexprimují interferon-beta la. Ještě dalším příkladem izolovaného polynukleotidu je použití pouhé části interferonového genu k vytvoření rekombinantního genu, jako je např. kombinace indukovatelného promotoru se sekvencí kódující endogenní interferon prostřednictvím homologní rekombinace.

„Gen“ je sekvence DNA (tj. lineární uspořádání nukleotidů spojených navzájem 3-5' pentózofosfodiesterovou vazbou), která kóduje prostřednictvím mRNA aminokyselinovou sekvenci specifického proteinu.

„Transkripce“ je proces kterým vzniká z genu mRNA.

„Translace“ je proces kterým vzniká z mRNA protein.

„Exprese“ je proces, ve kterém ze sekvence DNA nebo genu vzniká protein, zahrnující jak trans20 kripci tak translaci.

Termín „inhibující růst“ se zde užívá k označení inhibice růst cílových buněk (např. nádoru) a inhibice transformovaného fenotypu (měřené např. změnami v morfologii).

„Aminokyselina“ je monomerní jednotka peptidu, polypeptidu nebo proteinu. Existuje dvacet L-izomerů aminokyselin, patří sem také analogy aminokyselin a D-izomery aminokyselin tvořící proteiny ajejich analogy.

„Protein“ je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin, bez ohledu na jeho velikost. I když termín „polypeptid“ se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů a termín „peptid“ se často užívá k označení relativně malých polypeptidů, použití těchto termínů v oboru se často překrývá a je odlišné. V tomto textu se užívá termín „protein“ k označení peptidů, proteinů i polypeptidů, pokud není uvedeno jinak.

„Sekretovaný protein“ je protein, který je transportován z vnitřku buňky do okolí buňky, k sekretovaným proteinům patří velký počet růstových faktorů a imunomodulačních proteinů jako jsou např. různé interferony (α, β, γ), interleukiny jako IL-1, -2, -4, -8 a 12 a růstové faktory jako GM-CSF a G-CSF.

„Genetická fúze“ označuje kolineámí kovalentní spojení dvou nebo více proteinů prostřednictvím jejich jednotlivých peptidových koster, a to tím, že se exprimuje polynukleotidová molekula kódující tyto proteiny.

„Mutace“ (a také „mutanta“) označuje jakoukoliv změnu v kvalitě nebo struktuře genetického materiálu organismu, konkrétně jakákoliv změna (tj. delece, substituce, adice nebo alterace) v genu interferonu divokého typu nebo jakoukoliv změnu v interferonovém proteinu divokého typu.

„Divoký typ“ je přirozeně se vyskytující polynukleotidová nebo aminokyselinová sekvence interferonového genu nebo proteinu, tak jak se vyskytuje in vivo.

„Standardní hybridizační podmínky“ jsou podmínky určené koncentrací soli a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0,5xSSC až 5xSSC a 65 °C jak pro vlastní hybridizaci tak promývání. Termín „standardní hybridizační podmínky“ zde užívaný je proto operační definice zahrnující řadu hybridizaci. Podmínky s vysokou stringencí (přesností) mohou např. zahrnovat hybridizaci

-6CZ 299095 B6 v pufru pro screening plaků (0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400, 0,2% bovinní sérový albumin, 50mM Tris-HCl, pH 7,5), 1M NaCl, 0,1% hydrogenfosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10% dextrasulfátem a 100 pg/l denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný (0,5xSSC)/l% SDS při 65 °C.

Podmínky s nízkou stringencí mohou např. zahrnovat hybridizaci v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20hodin a promývání v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2xSSC)/l% SDS při 55 °C.

„Expresní kontrolní sekvence“ je sekvence nukleotidů, která řídí a reguluje expresi genů, když je io s geny operativně spojena.

„Operativně spojena“ znamená, že polynukleotidová sekvence je „operativně spojena“ s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín „operativně spojena“ znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný startovací signál (např. ATG), a že sekvence je ve správném čtecím rámci, který dovoluje expresi polynukleotidové sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž produkci požadovaného interferonu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.

„Expresní vektor“ je polynukleotid, většinu DNA plazmid (ale také to může být virus), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.

„Nádor“ označuje jakoukoliv nežádoucí proliferaci buněk. Nádorový růst zahrnuje jak maligní tak i nemaligní nádory, solidní nebo fluidní nádory, karcinomy, myelomy, sarkomy, leukemie, lymfomy a další neoplazie a rakovinné a tumorigenní stavy.

„Geneticky modifikovaná buňka (také nazývaná „buněčný expresní systém“) obsahuje buňku a expresní vektor pro expresi interferonového proteinu. Pro účely ex vivo jsou geneticky modi30 fikované buňky vhodné pro podávání savčímu hostiteli, kde buďto nahradí nebo existují současně s endogenními buňkami příjemce. Pro účely in vivo se modifikované buňky vytvářejí přímo v příjemci.

Předkládaný vynález poskytuje také různé způsoby pro přípravu a užití výše popsaných geneticky modifikovaných buněk. Konkrétně vynález poskytuje způsob genetické modifikace buněk savčího příjemce ex vivo a podávání geneticky modifikovaných buněk savčímu příjemci. Ve výhodném provedení genové terapie ex vivo jsou buňkami autologní buňky, tj. buňky odebrané ze savčího příjemce. Termín „odebrané“ znamená buňku nebo množství buněk, které byly odebrány či vyjmuty z místa jejich přirozeného výskytu v těle. Způsoby odebírání buněk pacientovi, a také způsoby udržování izolovaných buněk v kulturách, jsou odborníkovi známy (Stylianou, E. et al., Kidney Intl. 37: 1563-1570, 1992, Hjelle, J.H. et al., Peritoneal Dialysis Intl. 9: 341-347, 1989, Heldin, P., Biochem. J. 283: 165-170, 1992, DiPaolo, N. et al., Int. J. Art. Org. 12. 485-501, 1989, DiPaolo, N. et al., Clinical Nephrol. 34: 179-1848, 1990, DiPaolo, N. et al., Nephron 57: 323-331, 1991. Všechny dříve i dále citované patenty, patentové přihlášky a odborné publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu.

II. Izolované interferonové polynukleotidy „Interferon“ (zkráceně označovaný IFN) je malý, druhově specifický, jednořetězcový polypeptid, tvořený v buňkách savců jako reakce na expozici různým induktorům jako jsou viry, polypeptidy, mitogeny apod. Výhodně interferony jsou v rekombinantní formě, přitom metody přípravy proteinů technikami rekombinantní DNA jsou známy, včetně přípravy různých interferon, a nijak neomezují předkládaný vynález, viz např. patenty US 4 399 216, US 5 149 636 a US 5 179 017 (Axek et al.) a US 4 470 461 (Kaufman). Rekombinantní formy interferonu alfa, beta, gama a konvenčního interferonu byly připraveny. Tyto formy lze exprimovat z buněk, které obsahují

-7CZ 299095 B6 polynukleotidové sekvence kódující varianty jako jsou cysteiny zbavené mutanty (např. pro interferon-beta) a methioninu zbavené mutanty. Další modifikace se mohou uskutečnit prostřednictvím potranslačního opracování v hostitelské buňce. Přesná chemická struktura konkrétního interferonu je tedy závislá na několika faktorech a nijak nemezuje předmět předkládaného vyná5 lezu. Všechny takové proteiny obsažené v přípravcích podle vynálezu si udrží svou biologickou aktivitu, pokud se dostanou do vhodného prostředí.

Výhodné polynukleotidy, které lze užít podle předkládaného vynálezu, byly odvozeny ze sekvencí interferonu divokého typu různých obratlovců, výhodně savců, a byly získány metodami, které jsou odborníkovi známé. Viz např. patent US 5 641 656 (udělený 24.6. 1997, DNA kódující ptačí interferonový proprotein typu I a zralý ptačí interferon typu I), patent US 5 605 688 (25: února 1997 - rekombinantní psí a koňské interferony typu I), patent US 5 554 513 (10. září 1996 DNA 5 541 513 (10. července 1996 - DNA sekvence kódující lidský fibrinoblastový polypeptid interferonu beta2A), patent US 5 231 176 (27. července 1993, DNA molekula kódující lidský fibroblastový polypeptid interferonu beta2A), patent US 5 231 176 (27. července 1993, DNA molekula kódující lidský leukocytámí interferon), patent US 5 071 761 (10. 12. 1991, DNA sekvence kódující subsekvence lidských lymfolastoidních interferonů LyIFN-alfa-2 a LylFNalfa-3), patent US 4 970 161 (13. listopadu 1990, DNA sekvence kódující lidský interferon gama), patent US 4 738 931 (19. dubna 1988, DNA sekvence obsahující gen lidského interferonu beta), patent US 4 456 748 (26. červen 1984, DNA sekvence kódující subsekvence různých přirozeně se vyskytujících leukocytových interferonů).

Mutantní členy rodiny interferonových genů se také mohou užít podle vynálezu. Mutace v polynukleotidové sekvenci interferonu divokého typu se připravují v oboru známými metodami cílené metageneze. Termín „mutanta“ také zahrnuje genetické fúze, takže i dále uvedené sekvence interferonů lze považovat za „mutantní“ sekvence:

Patent US 5 273 889 (28. prosince 1993, DNA konstrukt obsahující gen interferonu gama spojený se sekvencí kódující imunogenní leukotoxin), patent US 4 959 314 (25. září 1990, Gen mající DNA sekvenci, která kóduje syntetický mutein biologicky aktivního nativního proteinu), patent US 4 929 554 (29. května 1990, DNA kódující des-Cys-Tyr-Cys rekombinantní lidský imunitní interferon), patent US 4 914 033 (3. dubna 1990, DNA molekula kódující modifikovaný interferon-beta obsahující interferon beta) a patent US 4 569 908 (11. února 1986, DNA molekula mající sekvenci, která kóduje vícetřídní hybrid interferonového polypeptidu).

Kromě toho izolované polynukleotidy popsané ve výše uvedených patentech mohou být změněn tak, aby poskytly funkčně ekvivalentní polypeptidy. Polynukleotid je „funkčně ekvivalentní“ ve srovnání s polynukleotidem s výše uvedenými sekvencemi pokud splňuje alespoň jednu z následujících podmínek:

a) „funkčně ekvivalentní“ je polynukleotid, který hybridizuje s kteroukoliv předcházející sekvencí za standardních hybridizačních podmínek a/nebo je degenerovaný vzhledem ke kterékoliv předchozí sekvenci, nejvýhodněji kóduje mutantní interferon mající terapeutickou aktivitou interferonu divokého typu,

b) „funkčně ekvivalentní“ je polynukleotid, který kóduje expresi aminokyselinové sekvence kódované polynukleotidem s kteroukoliv z předchozích interferonových sekvencí.

Lze tedy shrnout, že termín „interferon“ zahrnuje, avšak není omezen pouze na ně, všechna agens 50 uvedená v předchozím textu a jejich funkční ekvivalenty. Termín „funkční ekvivalenty“ se týká interferonového proteinu nebo polynukleotidu kódujícího interferonový protein, které mají stejný nebo lepší prospěšný účinek na savčího příjemce jako původní interferon, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je zřejmé, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantní technikou, tj. expresí „funkčně ekvivalentní“ DNA. Tudíž předmětem předklá55 daného vynálezu jsou také interferony kódované přirozeně se vyskytující DNA, a také kódované

-8CZ 299095 B6

DNA, které se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. Díky generaci nukleotidových kódujících sekvencí se mohou užít jiné polynukleotidy pro kódování interferonů. K nim patří celé nebo části výše uvedených sekvencí,které byly změněny substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o umlčenou záměnu. Takové změněné sekvence se považují za ekvivalenty těchto sekvencí. Tak např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo TTT, Tyr (Y) je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován CAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou sekvenci DNA kódující konkrétní interferon existuje mnoho degenerovaných sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence jsou také zahrnuty ve vynálezu.

„Konvenční“ („consensus“) interferon také spadá pod uvedenou definici. Termín „konvenční interferon“ se zde užívá k označení polypeptidu, který se přirozeně nevyskytuje, ale který převážně obsahuje aminokyselinové zbytky společně všem přirozeně se vyskytujícím lidským sekven15 cím subtypů interferonů, přičemž obsahuje v jedné nebo více takových pozic, kde není možná aminokyselina společná všem subtypům, aminokyselinu, která se vyskytuje v této pozici převážně a v žádném případě neobsahuje aminokyselinu, která se v této pozici nevyskytuje alespoň u jednoho přirozeně se vyskytujícího subtypu. Konvenční interferonové sekvence zahrnují konvenční sekvence všech výše uváděných interferonů za předpokladu, že mají sekvence subtypů. Příklady konvenčních interferonových sekvencí jsou uvedeny v patentech US 4 695 623 a US 4 897 471 (Amgen). DNA sekvence kódující konvenční interferony mohou být syntetizovány způsobem popsaným v těchto patentech nebo jiným standardním způsobem. Konvenční interferonové polypeptidy jsou výhodně produkty exprese připravených sekvencí DNA, transformovaných nebo transfekovaných do hostitele, jak se popisuje v této přihlášce. To znamená, že výhodné konvenční interferony jsou produkovány rekombinantním způsobem. Takové materiály pak mohou být purifikovány standardními postupy odborníkovi známými.

Výše popsané interferony a stavy vhodné pro genovou terapii jsou ilustrativní a nijak neomezují předmět předkládaného vynálezu. Výběr vhodného interferonů pro léčení známé nemoci je v rámci rutinní činnosti odborníka bez nepřiměřeného exprimentován.

III. Způsob vnášení polynukleotidových sekvencí pro sekreto váné proteiny do buněk

Termín „transformovat“ nebo „trasformace se týká jakýchkoliv genetických modifikací buněk a zahrnuje jak „transfekci“ tak „transdukci“.

„Transfekce buněk“ označuje získání nového genetického materiálu buňkami tím, že se do buněk vnese dodatečná DNA. Takže transfekce se týká vložení nukleové kyseliny (např. DNA do buňky pomocí fyzikální nebo chemické metody. Odborníkům je známo několik technik transfekce, k nimž např. patří: koprecipitace DNA s kalciufosfátem (viz Methods in Molecular Biology, Vol. 7., Gene Transfer And Expression Protocols, ed. E.J. Murray, Humana Press, 1991), metoda s DEAE-dextranem (viz výše uvedená citace), elektroporace (viz výše), transfekce zprostředkována kationtovými lipozomy (viz výše) a ostřelování mikročásticemi wolframu H(Johnston, S.A., Nátuře 346: 776-777, 1990) a koprecipitace DNA se stronciumfosfátem (Brash d.E. et al.,

Molec. Cell. Biol. 7: 3031-2034, 1987). Každá z těchto metod je v oboru dobře známa.

Naproti tomu „transdukce buněk“ se týká procesu přenosu nukleových kyselin do buňky pomocí RNA nebo DNA virů. Jedna nebo několik izolovaných polynukleotidových sekvencí, které kódují jeden nebo několik interferonových proteinů, je obsažena ve viru a může být vloženo do chro50 mozomu transdukované buňky. Alternativně buňka je transdukována virem, ale přitom nebude schopna exprimovat interferon uvnitř buňky extrachromozomálně.

Podle jednoho provedení vynálezu jsou buňky transformovány (tj. geneticky modifikovány) ex vivo. Buňky jsou izolovány ze savce (výhodně člověka) a transformovány (tj. transdukovány nebo transfekovány in vitro) vektorem obsahujícím izolovaný polynukleotid jako jsou např.

-9CZ 299095 B6 rekombinantní gen operativně spojený s jednou nebo několika expresními kontrolními sekvencemi pro expresi rekombinantního sekretovaného proteinu (např. interferonů). Buňky se pak podají savčímu příjemci pro to, aby tvořily protein in šitu. Výhodně je savčím příjemcem člověka a modifikované buňky jsou autologní buňky, tj. buňky izolované ze savčího příjemce. Izolace a kultivace buněk in vitro již byly v odborné literatuře popsány.

Podle jiného provedení vynálezu jsou buňky transformovány nebo jinak geneticky modifikovány in vivo. Buňky ze savčího příjemce (výhodně člověka) jsou transformovány (tj. transdukovány nebo transfekovány) in vivo vektorem, který obsahuje izolovaný polynukleotid jako je rekom10 binantní gen operativně spojený s jednou nebo několika expresními kontrolními sekvencemi pro expresi rekombinantního sekretovaného proteinu (např. rekombinantního interferonů) a protein je pak podáván in šitu.

Izolovaný polynukleotid kódující sekretovaný protein (např. cDNA kódující jeden nebo několik terapeutických interferonových proteinů) je vnesen do buňky ex vivo nebo in vivo způsobem pro přenos genů, jako např. transfekce nebo transdukce, čímž vznikne geneticky modifikovaná buňka. Různé expresní vektory (tj. nosiče pro usnadnění přenosu izolovaného polynukleotidu do cílové buňky) jsou odborníkovi známy.

Typicky vnesený genetický materiál obsahuje izolovaný polynukleotid jako je např. interferonový gen (obvykle ve formě cDNA obsahující exony kódující interferon) společně s promotorem pro kontrolu transkripce nového genu. Promotor má typicky specifickou nukleotidovou sekvenci nutnou pro iniciaci transkripce. Případně může genetický materiál obsahovat interonové sekvence, které se odstraní ze zralého transkriptu sestřihem RNA. Na 3'-konci genu, který má být expri25 mován, by měl být přítomen polyadenylační signál. Vnesený genetický materiál také může obsahovat vhodnou signální sekvenci pro sekreci produkci terapeutického genu (např. interferonů) z buňky do mezibuněčného prostředí.

Izolovaný genetický materiál případně dále obsahuje další sekvence (tj. zesilovače, „enhancery“) potřebné k získání požadovaného stupně transkripční aktivity. Pro účel této diskuse „enhancer“ neboli „zesilovač“ je jednoduše netranslatovaná sekvence DNA, která funguje v souvislém spojení škodující sekvencí (tj. v cis), tak, že mění základní transkripční hladinu určovanou promotorem.

Výhodně je izolovaný genetický materiál vnesen do buněčného genomu bezprostředně „po směru“ („downstream“) od promotoru, takže promotor a kódující sekvence jsou operativně spojeny, což dovoluje transkripci kódující sekvence. Výhodně virové expresní vektory obsahují exogenní promotorový element pro kontrolu transkripce vloženého interferonového genu. K takovým exogenním promotorům patří jak konstitutivní tak i indukovatelné promotory.

Přirozeně se vyskytující konstitutivní promotory řídí expresi proteinů, které regulují esenciální buněčné funkce. Výsledkem je, že gen kontrolovaný konstitutivním promotorem je exprimován za jakýchkoliv okolností buněčného růstu. K příkladům konstitutivních promotorů patří promotory následujících genů, které kódují základní „udržovací“ funkce metabolismu: hypoxantin45 fosforibosyltransferáza (HPRT), dihydrofolátreduktáza (DHFR) (Scharfmann et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 88 4626-4630, 1991), adenosindeamináza, fosfoglycerátkináza (PGK), pyruvátkináza, fosfoglycerolmutáza a dále promotor β-aktinu (Lai et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010, 1989) a další konstitutivní promotory odborníkům známé.

Kromě toho mnoho virových promotorů funguje v eukaiyotických buňkách konstitučním způsobem. K takovým promotorům patří: časné a pozdní promotory SV40 (viz Bemoist a Chambon, Nátuře 290: 304, 1981), promotory z dlouhých termálních opakovaných sekvencí (LTR) viru Moloneyho leukemie (MLV) a dalších retrovirů (viz Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1985), thimidinkinázový promotor z viru

Herpes simplex (HSV) (viz Wagner etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441, 1981),

- 10CZ 299095 B6 bezprostředně časný promotor cytomegaloviru IE1 (viz karasuymama et al., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), promotor viru Rousova sarkomu, RSV (viz Yamamoto et al., cell 22: 787, 1980), pozdní promotor adenovirů (Yamada et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 3567, 1985 a další. Tudíž kterýkoliv z výše uvedených konstitutivních promotorů může být užit ke kontrole trans5 kripce genového inzertu v předkládaném vynálezu (viz také část B).

Pokud se má uskutečnit přenos interferonového genu do specifické tkáně, může být žádoucí přímo zaměřit expresi tohoto genu. Např. existují promotory, popsané v odborné literatuře, které umožňují expresi pouze v některých tkáních. K příkladům takových promotorů patří promotory io viru hepatitidy B specifické pro játra (Sandig et al., Gene Therapy 3: 1002-1009, 1996) a albuminového genu (Pinkert etal., Genes and Development 1: 268-276, 1987, Guo et al., Gene Therapy

3: 802-810, 1996) jako příklad dalšího promotoru specifického pro játra. Kromě toho existuje celá řada promotorů, které jsou popsány v odborné literatuře, a které umožňují expresi pouze ve specifických nádorech. K příkladům takových promotorů patří promotor PSA (karcinom prosta15 ty), promotor karcinoembryonálního antigenu (karcinom tlustého střeva a plic), promotor βkaseinu (karcinom prsu), promotor tyrosinázy (melanom), promotor kalcineurinu Aa (gliom, neutroblastom), promotor c-sis (osteosarkom) a promotor α-fetoproteionu (hepatom).

Geny, které jsou pod kontrolou indukovatelného promotoru jsou exprimovány, a nebo jsou ve větší míře exprimovány, pouze v přítomnosti indukujícího činidla (např. transkripce pod kontrolou metalothioneninového promotoru se výrazně zvyšuje v přítomnosti některých kovových iontů. Viz také promotor indukovatelný glukokortikoidy vyskytující se v dlouhé koncové repetici (LTR) viru tumoru prsní žlázy myší (MMTV) (Klessig et al., Mol. Cell Biol. 4: 1354, 1984. K indukovatelným promotorům patří responzivní (odpovídající) elementy (RE), které stimulují transkripci, když se naváže jejich indukující faktor. Např. existují RE pro sérové faktory, steroidní hormony, kyselinu retinovou a cyklické AMP. Promotory obsahující konkrétní RE lze vybrat proto, aby se získala indukovatelná odpověď a v některých případech samotný RE může být připojen k jinému promotoru, čímž se získá indukovatelnost rekombinantního genu.

Takže výběrem vhodného promotoru (konstitutivního nebo indukovatelného, silného nebo slabého) je možné řídit jak existenci tak i hladinu exprese interferonu v geneticky modifikovaných buňkách. Když je gen kódující interferon pod kontrolou indukovatelného promotoru, podávání interferonu in šitu spustí tím, že se geneticky modifikované buňky vystaví podmínkám, které dovolují expresi interferonu, např. tím, že se injikuji specifické induktory pro indukovatelné pro35 motory, které kontrolují transkripci agens. Tak např. exprese in šitu v geneticky modifikovaných buňkách interferonového proteinu kódovaného interferonovým genem po kontrolou metalothieneninového promotoru se zvyšuje kontaktem geneticky modifikovaných buněk s roztokem obsahujícím vhodné (tj. indukující) kovové ionty in šitu.

Nedávno byl vyvinut velmi komplikovaný systém, který umožňuje přesnou regulaci genové exprese exogenní podávanými malými molekulami. K příkladům patří systém FK505/Rapamycin (Rivera et al., Nátuře Medicine 2(9): 1028-1032, 1996), tetracylinový systém (Gossen et al., Science 268: 1766-1768, 1995), ekdysonový systém (No et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 3346-3351, 1996) a progesteronový systém (Wang et al., Nátuře Biotechnology 15: 239-243,

1 997).

Tudíž množství interferonu které se dodává in šitu, je regulováno kontrolou několika faktorů jako jsou : 1) povaha promotoru použitého ke kontrole transkripce vloženého genu (tj. zda jde o promotor indukovatelný nebo konstitutivní, silný nebo slabý nebo tkáňový specifický), 2) počet kopií exogenního genu, které jsou vloženy do buňky, 3) počet transfukovaných/transfekovaných buněk, které jsou podány (např. implantovány) pacientovi, 4) velikost implantátu (např. štěp nebo zapouzdřený expresní systém) při způsobu ex vivo, 5) počet implantátů při způsobu ex vivo, 6) počet transdukovaných/transfekovaných buněk při podání in vivo, 7) doba, po kterou jsou transdukované/transfekované buňky ponechány na místě jak při způsobu ex vivo tak i in vivo a 8) rychlost, s jakou je v geneticky modifikovaných buňkách tvořen interferon.

-11 CZ 299095 B6

Selekce a optimalizace těchto faktorů pro podání terapeuticky účinné dávky určitého interferonů patří ke schopnostem průměrného odborníka a pokud se vezmou v úvahu výše uvedené faktory a klinický stav pacienta, lze je provést bez nepřiměřeného experimentování.

Protože protein exprimovaný při způsobu genové terapie podle předkládaného vynálezu je sekretovaný protein, okolní buňky, které neobsahují vektor pro genovou terapii, jsou také ovlivněny (viz příklady). V důsledku toho se při metodě podle předkládaného vynálezu typicky nevyžaduje užití selekčního genu. Avšak kromě alespoň jednoho promotoru a alespoň jednoho izolovaného polynukleotidu kódujícího interferon, může expresní vektor případně obsahovat selekční gen, např. gen rezistence kneomycinu, pro usnadní selekce buněk, které byly transfekovány nebo transdukovány expresním vektorem. Alternativně se buňky transfekují dvěma nebo více expresními vektory, přičemž alespoň jeden vektor obsahuje selekční gen. Selekce vhodného promotoru, zesilovače, selekčního genu a/nebo signální sekvence (popsané ještě dále) je v rámci schopností průměrného odborníka, aniž by bylo třeba nepřiměřené experimentování.

IV. Způsoby přípravy specifických vektorů pro genovou terapii

Může být použita jakákoliv metoda v oboru známá pro vložení polynukleotidové sekvence do vektoru. Viz Např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Joh, Willey & Sons, lne., 1992. Běžné vektory obsahují vhodné transkripční/translační kontrolní signály operativně spojené s polynukleotidovou sekvencí pro konkrétní interferon Promotor/enhancery se také mohou užít ke kontrole exprese interferonů (viz část

III).

K expresním vektorům kompatibilním se savčími hostitelskými buňkami pro použití v genové terapii nádorů patří např. plazmidy, ptačí, myší a lidské retrovirové vektory, adenovirové vektory, vektory z herpetických virů, parvoviry a nereplikativní viry neštovic. Replikačně defektní rekom30 binantní viry je možné připravit pomocí sbalovacích („pakážovacích“) buněčných linií, které produkují pouze replikačně defektní viry. Viz current Protocols in Molecular Biology, kapitoly 9.10 až 9.14, Asubel et al. (eds)., Grene Publishing Associates, 1989.

Specifické virové vektory pro použití jako přenosové systémy genů jsou nyní již dobře známy a zavedeny. Podrobné informace lze najít např. v publikacích Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-36, 1992 (papovavirus SV40), Bemer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992 (adenovirus) Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol 158: 25-38, 1992 (virus vakcínie), Muzyczka, Cur. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123, 1992 (adeno-asociované viry), Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immuno.. 158: 67-93, 1992 (virus Herpes simplex, HSV, a virus Epsteina-Barrové, EBV), Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992 (retvorirus), Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol, 4: 749-754, 1984 (retrovirus), Miller et al., Nátuře 357: 455^150, 1929 (retvorirus), Anderson, Scinese 256: 808-813, 1992 (retrovirus).

Výhodně vektory jsou DNA vektory ke kterým patří adenoviry (výhodně vektor jejich základem jsou Ad-2 nebo Ad-5), herpetické viry (výhodně vektory založené na viru Herpes simplex) a parvoviry (výhodně defektní nebo neautonomní parvovirové vektory, výhodněji vektory založené na adenoasociovaných virech, nejvýhodněji vektory založené na AAV-2), viz Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1949, patent US 4 797 368 a US 5 339 346 a také následující diskuse.

Výběr konkrétního vektorového systému pro přenos, např. interferonové sekvence, závisí na řadě různých faktorů. Jedním důležitým faktorem je povaha populace cílových buněk. Ačkoliv retroviry byly velmi extenzivně zkoumány a také použity v mnoha způsobem genové terapie, obecně jsou nevhodné k infekci buněk, které se nedělí, ale mohou být užitečné v terapii nádorů, protože integrují a exprimují své geny pouze v replikujících se buňkách. Jsou užitečné pří způsobech

- 12CZ 299095 B6 terapie ex vivo a z tohoto hlediska jsou aktivní vzhledem k jejich stálé integraci do genomu cílové buňky.

Adenoviry jsou eukaryotické DNA viry, které mohou být modifikovány tak, aby účinně přená5 sely reportérový nebo terapeutický transgen do buněk různých typů. Obecně adenoviry, typů 2 a 5 (Ad2 a Ad5), které způsobí respirační onemocnění u člověka, jsou v současné době zkoumány s cílem využít je při genové terapii Duchenneovy muskulámí dystrofie (DMD) a cystické fibrózy (CF). Jak Ad2 tak Ad5 patří do podtřídy adenovirů, které nijak nesouvisí s lidskými malignitami. Adenovirové vektory jsou schopné mimořádně účinného přenosu transgenu do téměř všech typů buněk bez ohledu na jejich mitotický stav. Vysoké titry (10¹¹ jednotek tvořících plak/ml) rekombinantního viru mohou být snadno připraveny v buňkách 293 (což je linie lidských embryonálních ledvinných buněk transformovaných adenovirem, ATCC CRL1573) a uchovány ve zmraženém stavu bez znatelných ztrát. Účinnost tohoto systému přenosu terapeutických transgenů in vivo, které doplňují genetickou nerovnováhu, byla již prokázána na zvířecích modelech různých nemocí, viz např. Y. Watanabe, Atherosclerosid, 36: 261-268, 1986, K. Tanzawa et al., FEBS Letters 118: 81-84, 1980, J.L. Golasten et al., New England J. Med. 309: 11983: 288-296, 1983, S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest 93: 1889-1893, 1994. A skutečně rekombinantní replikačně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fibrózy (CTFR) byl schválen pro použití v několika klinických zkouškách u pacientů s CF (viz např. J. Wilson,

Nátuře 365: 691-692, Oct. 21, 1993). Další skutečností, která podporuje bezpečnost rekombinantních adenovirů pro genovou terapii, je značně rozsáhlá zkušenost s očekáváním lidských populací živými adenovirovými vakcínami.

Lidské adenoviry obsahují genom tvořený lineární dvouřetězcovou DNA velikosti 36 kb, který je rozdělen do 100 mapových jednotek (m.u.), každá o velikosti 360 bp. DNA obsahuje úseky krátké invertované koncové repetice (ITR) na každém konci genu, které jsou nezbytné pro replikaci DNA. Genové produkty jsou organizovány do časných (El až E4) a pozdních (Ll až L5) úseků, v závislosti na expresi před nebo po iniciaci syntézy virové DNA, viz Horwitz, Virology, 2^nd et. Β. N. Fileds, ed., Raven Press Ltd. New York, 1990.

Adenovirový genom podstupuje velmi regulovaný program v průběhu virového životního cyklu, viz Y. Yang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411, 1994. Viriony jsou internalizovány buňkami, vstupují do endosomu a odtud virus vstupuje do cytoplazmy a začíná ztrácet svůj proteinový obal. Virion DNA pak migruje do jádra, kde zůstává jako extrachromozomová lineár35 ní struktura, aniž by se integroval do genomu. Bezprostředně časné geny Ela Elb se exprimují v jádře. Tyto produkty časných genů regulují transkripci adenoviru a jsou nezbytné pro replikaci viru a expresi různých genů hostitele, které připraví buňku na produkci viru a jsou centrem kaskádové aktivace pozdních časných genů (např. E2, E3 a E4) následovaných pozdními geny (Ll ažL5).

První generace rekombinantních replikačně defektních adenovirů, které byly vyvinuty pro genovou terapii, obsahovaly delece celého úseku Ela a části úseku Elb. Tento replikačně defektní virus se pěstoval v buňkách 293, které obsahují funkční úsek El adenoviru, který poskytuje El protein v trans čímž umožňuje replikaci adenoviru s deletovaným El. Výsledný virus je schopen infikovat mnoho buněčných typů a může exprimovat vložený gen (za předpokladu, že nese promotor), ale nemže se replikovat v buňkách, které neobsahují úsek DNA El. Rekombinantní adenoviry mají výhodu, že mají široké hostitelské spektrum, mohou infikovat klidové nebo již konečné diferencované buňky jako jsou např. neurony a jsou zcela zjevně neonkogenní. Adenoviry se neintegrují do genomu hostitele. Jelikož existují extrachromozomově, riziko inzerční mutageneze je značně sníženo. Rekombinantní adenoviry tvoří velmi vysoké titry, virové částice jsou středně stálé, hladiny exprese jsou vysoké a může být infikováno široké spektrum buněk.

Adeno-asociované viry (AAV) byly také užity jako vektory v somatické genové terapii. AAV je malý virus tvořený jednořetězcovou (ss) DNA s jednoduchou organizací genomu velikosti 4,7 kb,

-13CZ 299095 B6 což ho činí ideálním materiálem pro genové inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce k=odují sérii polypeptidů rep a cap. Polypeptid rep (Rep78, rep68, rep62 a rep 40) se účastní replikace, uvolnění a integrace genomu AAV. Proteiny cap (VP1, VP2 a VP3) vytvářejí virovou kapsidu. Otevřené čtecí rámci pro rep a cap jsou jak na 5'-konci tak na 3'-konci lemovány invertovanou koncovou repeticí (ITR) velikosti 145 bp, přičemž první 125 bází je schopno tvořit duplexovou strukturu tvaru Y nebo T. Pro vývoj AAV vektorů je důležité, že celé domény rep a cap mohou být vyjmuty a nahrazeny terapeutickým nebo reportérovým transgenem, viz B.J. Carter, Handbook of Paroviruses, ed. P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168, 1990. Bylo ukázáno, že ITR představují minimální sekvenci nutnou pro replikaci, uvolnění, sbalení a integraci genomu AAV.

io

Životní cyklus AAV je dvoufázový, složený jak z latentní tak lytické fáze. Během latentní infekce viriony AAV vstupují do buňky jako enkapsidovaná (opouzdřená) sDNA a krátce potom se dostávají až do jádra, kde se AAV DNA trvale integruje do hostitelova chromozomu, aniž by ktomu bylo třeba dělení hostitelské buňky. Pokud není přítomen pomocný („helper“) virus, integrovaný genom AAV zůstává latentní, ale schopný aktivace a uvolnění. Lyrická fáze životního cyklu začíná, když buňka nesoucí AAV provirus je vyprovokována druhotnou infekcí herpetickým virem nebo adenovirem které kódují pomocnou („helper“), funkci, kterou AAV potřebuje je svému „vystřižení“ z hostitelského chromatinu (B.J. Carter, viz výše). Původní infikující jednořetězcová (ss) DNA je zmnožena na dvouřetězcovou replikační formu (RF) DNA způsobem závislým na rep. Uvolněné genomy AAV jsou sbalovány do předem vytvořené virové kapsidy (proteinového obalu s ikosahedrální symetrií s průměrem přibližně 20 nm) a po buněčné lýzi se uvolňují jako infekční viriony, ve kterých je sbalen genom v podobě buďto +ssDNA nebo ssDNA.

AAV mají významný potenciál pro genovou terapii. Virové částice jsou velmi stabilní a rekombinantní AAV (rAAV) mají vlastnosti podobné léčivům v tom, že rAAV mohou být purifíkovány peletováním nebo z izolací z pásu v gradientu CsCl. Jsou teplotně stabilní a je možné je lyofilizovat v podobě prášku a pak rehydratovat opět na plnou aktivitu. Jejich DNA se trvale integruje do hostitelského chromozomu, takže exprese je dlouhodobá. Mají široký hostitelský rozsah a není známo, že by AAV způsobily nějako nemoc, takže rekombinantní vektory jsou netoxické.

Bylo ukázáno, že vysoká exprese genu z AAV v myši přetrvává alespoň 1,5 roku, viz Xioa a Samulski, 1996, Journal of Virology 70, 8089-8108. Jelikož nejsou známy žádné důkazy o virové toxicitě nebo o vyvolání imunitní odpovědi hostitele, tato omezení genové terapie byla tedy překonána.

Kaplitt, Leone, Samulski, Xlao, Pfaff, O'Malley a During (1994, Nátuře Genetics 8, 148-153) popsali dlouhodobou (až 4 měsíce) expresi tyrosinhydroxylázy v mozku potkana po přímé intra40 kraniální injekci AAV vektoru. To je základ pro potenciální terapii Parkinsonovy nemoci u lidí. Exprese byla vysoká účinná a vektor byl bezpečný a stálý.

Fiisher et al. (Nátuře Medicine, 1997, 3, 306-312) popsal stálou genovou expresi u myši po injekci AAV do svalu. Opět virus byl zcela bezpečný. Nebyla detekována žádná buněčná nebo humorální imunitní odpověď ani proti viru ani proti cizorodým genovým produktům.

Kessler et al (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 14082-14087) ukázal vysokou hladinu exprese erytropoetinového (Epo) genu po intramuskulámí injekci AAV u myši. Bylo prokázáno, že protein Epo byl přítomen v krevním oběhu a byl zaznamenán zvýšený počet červených krvi50 nek, což ukazuje terapeutický potenciál. V jiné práci tatáž skupina užila AAV exprimující gen HSV-tk pro léčení rakoviny a byla popsána vysoká hladina genové exprese v solidních nádorech.

Nedávno bylo ukázáno, že rekombinantní bakulovirus primárně odvozený z bakuloviru Autographa californica (virus mnohočetné jaderné polyhedrózy, AcMNPV) je schopen transdukovat savčí buňky in vitro (Hofmann, C„ Sandig, V., Jennings, G„ Rudolph, N„ Schlag, P., Strauss, M,

- 14CZ 299095 B6

1995, „Efficiet gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 1099-10103, Boyce, F.M., Buchner, N.L.R., 1996, „Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells“, Proč. nati. Acad. Sci. USA 93. 2348-2352).

Rekombinantní bakuloviry mají značné potenciální výhody pro genovou terapii. Patří knim velmi velká inzerční kapacita, nepřítomnost imunitní odpovědi u člověka, dále to, že u člověka nedochází k replikaci, není toxicita pro savce, u savců nedochází k expresi virových genů vzhledem ke specifičnosti bakulovirových promotorů transkripce a potenciálně neexistuje odpověď cytotoxických lymfocytů namířená proti proteinům těchto viru.

IV. Testy účinnosti/identifikace interferonů

Interferonové polynukleotidy jsou podávány do buňky prostřednictvím expresního vektoru. Obecně se účinnost určitého vektoru pro genovou terapii v konkrétních buněčných podmínkách a za určitého metabolismu testuje na I) změny v buněčné morfologii, II) inhibici buněčné proliferace a III) antivirové aktivity.

Výběr a optimalizace konkrétního expresního vektoru pro expresi specifického produktu interferonového gelu v izolované buňce se uskuteční tak, že se získá interferonový gen, výhodně s jedním nebo několika kontrolními úseky (např. promotorem), připraví se vektorový konstrukt obsahující vektor, do kterého je vložen interferonový gen, vektorovým konstruktem se transfekuje nebo transdukuje buněčná kultura in vitro a pak se určí, zda produkt interferonového genu je přítomen v kultivovaných buňkách.

Účinek transfekce polynukleotidy, které kódují interferony, lze testovat in vitro pomocí celé řady dostupných buněčných linií lidských nádorů. K takovým buněčným liniím patří např. linie lidských buněk karcinomu močového měchýře 5637 (ATCC HTB9), lidská buněčná linie karcinomu prsu MDA-MB-468 (ATCC HTB132), lidská buněčná linie karcinomu prostaty DUI45 (ATCC HTB81), lidská buněčná linie osteosarkomu SAOS2 (ATCC HTB85), linie fibrosarkomové metastázující plicní rakoviny Hs913T (ATCC HTB152), linie karcinomu děložního čípku HeLa (ATCC ECL2). Každá z těchto buněk linií může být transfekována vhodnými polynukleotidy kódujícími interferony a vliv transfekce na buněčný růst a buněčnou morfologii může být testován způsoby, které jsou v oboru známy, jako např. test vylučování tryponové modři měřící životaschopnost buněk nebo počítání buněk ke zjištění množení v průběhu času a inkorporace thymidinu značeného tritiem ke změření replikace DNA.

Vliv sekretovaného proteinu na okolní buňky, které neobsahují virový vektor s polynukleotidem kódujícím interferon, lze snadno testovat metodami popsanými v příkladu 3.

Jakmile je jednou vložena do cílové buňky, může být interferována sekvence identifikována konvenčními metodami, např. hybridizaci nukleových kyselin se sodnou obsahující sekvence, které jsou homologní/komplementámí s vloženou mutovanou interferonovou sekvencí. Transkripci interferonů je možné měřit pomocí polymerázové řetězové reakce spřažené s reverzní transkriptázou. Alternativně lze měřit interferonový protein v médiu po kultivaci buněk pomocí stan45 dardních antivirových testů nebo pomocí testu ELISA. Při jiném způsobuje možné identifikovat sekvenci podle přítomnosti/absence funkce markerového genu (jako např. aktivita thymidinkinázy, rezistence k antibiotikům apod.) vnesené do cílové buňky expresním vektorem. Tak např. pokud je vložen do vektoru polynukleotid kódující interferon-beta la, přičemž vektor obsahuje dominantní selekční markerový gen jako je gen pro neomycinfosfotransferázu pod samostatnou kontrolou časného promotoru SV40, sekvenci lze identifikovat podle přítomnosti funkce markerového genu (tj. rezistence na Geneticin). Odborníkovi jsou známy i další vhodné metody pro detekci vhodných vektorů.

-15CZ 299095 B6

V. Užitečnost vynálezu

A. Interferony a infekční nemoci

Interferony se užívají k léčení bakteriálních, virových a houbových infekcí. Virus chřipky a virus vesikulámí stomatitidy (VSV) jsou zvláště citlivé na inhibici interferony a často se užívají v testech ke změření interferonové aktivity a také ve výzkumu mechanismu antivirové aktivity interferonů. K dalším virům které jsou lidskými patogeny a jsou citlivé k interferonům, patří virus hepatitidy B (HBV), virus hepatitidy C (HCV), virus hepatitidy D, lidský papilomavirus, virus herpes simplex, virus herpes zoster, cytomegalovirus (CMV), rhinovirus a virus encefalomyokarditidy.

K velmi aktivním terapeutickým cílům mezi virovými onemocněními patří hepatitida. Virová hepatitida, onemocnění jater způsobované několika viry, je hlavním problémem světového zdravotnictví. Bylo izolováno a klonováno pět odlišných virů lidské hepatitidy. Jsou to viry hepatitidy A, B, C, D a E. Zdá se, že některé případy akutní a chronické hepatitidy jsou způsobeny jinými viry hepatitidy, než jsou dosud popsané, jako je např. nově objevený virus hepatitidy G. Viry s nejhojnějším výskytem jsou viry hepatitidy A, B a C. Kromě toho, že způsobují akutní a chronické poškození jater a záněty, infekce HBV a HCV mohou vést k hepatocelulámímu karcinomu. Bylo ukázáno, že interferony projevují jistou míru účinnosti in vivo proti HBV a HCV a také proti viru hepatitidy D a A v buněčné kultuře.

Virová hepatitida by mohla být léčena podáváním genu pro interferon. Výhodným cílem pro přenos takového genu jsou hepatocyty vjátrech. Ačkoliv ex vivo terapie (např. vyjmutí jatemích buněk, vložení polynukleotidů exprimujících interferon a zpětná transplantace pacientovi) je možná, přenos genu in vivo je však zvláště výhodný. Provede se chirurgický zákrok, aby se gen injikoval do vrátnice (K portae) nebo se gen podá infuzi pomocí katétru v jatemí tepně (A. hepatica). V ideálním případě se užije méně invazivní postup jako např. intravenózní injekce.

Interferonový gen je vložen pod kontrolu promotoru transkripce ve vhodném expresním vektoru. Promotor transkripce může být buněčného nebo virového (např. CMV, SV40, RSV atd.). původu. Pokud je žádoucí exprese specifická pro játra, je výhodný buněčný promotor specifický pro hepatocyty jako je např. albuminový enhancer/promotor, promotor αΐ-antitrypsinu nebo enhancer/promotor HBV. V odborné literatuře je popsaná řada promotorů specifických pro jatemí tkáň (viz výše).

Je také možné navrhnout vektor, ve kterém je interferonový gen, který se exprimuje pouze v jatemích buňkách infikovaných virem hepatitidy. Tak např. exprese interferonu může být indukována transkripčním faktorem HBx z HBV, který je přítomen pouze v hepatocytech infikovaných HBV. Kromě toho se může užít nosičový systém. To může být nevirový systém jako jsou např. kationtové lipozomy nebo konjugáty protein:DNA (konjugáty DNA s asialoglykoproteiny se mohou přenášet přednostně do jater prostřednictvím vazby na receptory pro asialoglykoproteiny na hepatocytech).

Avšak současné nejúčinnější systémy pro přenos genů jsou založeny na virech. Rekombinantní retroviry byly užity k přenosu genů do lidských hepatocytů ex vivo. Zvířecí modely ukazují, že rekombinantní adenoviry se mohou účinně lokalizovat in vivo vjátrech po intravenózním podání. Přibližně 98 % adenoviruje pro intravenózním podání lokalizováno vjátrech.

Zdá se, že také rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) mohou infikovat játra po in vivo podání. Mohou se užít i jiné typy virů jako např. alfa viry, lentiviry nebo další savčí viry. Nedávno bylo ukázáno, že i jiný než savčí virus, a sice bakulovirus specifický pro hmyz, je schopen převést geny a exprimovat je účinně v hepatoytech (Hofmann et al., 1995, Boyce a Bucher, viz výše).

-16CZ 299095 B6

Jako příklad uveďme, že rekombinantní adenoviry se mohou užít také k přenosu interferonu in vivo. Několik výzkumných skupin zkonstruovalo replikačně-defektní adenoviry. První generace těchto virů je defektní díky deleci v úseku El. Tento defekt je komplementován v buněčné linii 293, která exprimuje adenovirový úsek El. Je však výhodné užít adenovirus, který byl „poškozen“ ve větším rozsahu, tedy delecemi v genech El, E2a a/nebo E4. Všechny deletované funkce se mohou exprimovat ve sbalovací buněčné linii. Interferonový gen se vloží do polohy „po směru“ („downstream“) od kteréhokoliv z velkého počtu možných promotorů (např. bezprostředně časný promotor CMV, promotor z LTR RSV, promotor buněčného aktinu, ío enhance/promotoru albuminu nebo jiný promotor specifický pro játra). Tato genová kazeta se pak vloží do rekombinantního adenoviru místo jednoho z deletovaných genů, jako např. El, čímž se vytvoří adenovirový přenosový vektor.

Rekombinantní adenoviry obsahující interferonový gen se připraví přímou ligaci nebo homologní rekombinaci, po které následuje transfekce do sbalovací buněčné linie standardním způsobem. Rekombinantní virový kmen obsahující interferonový gen se pak purifikuje metodou plaků několikrát za sebou a pak se namnoží ve velkém měřítku ve sbalovacích buňkách. Virus je možné purifikovat zpási CsCl gradientu, sloupcovou chromatografií nebo jiným způsobem a pak titrovat na sbalovacích buňkách. Metody přípravy adenovirů defektních v genech El a E2a (Engelhardt et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 91: 6196-6200, 1994) a adenovirů defektních v genech El a E4 (Gao et al., J. Virology 70: 8934-8943, 1996) byly dostatečně podrobně popsány. Metody přípravy adenovirů defektních v El lze najít v publikaci Graham, F.L, L. Prevec, „Methods for Construction of Adenovirus vectors“, Mol. Biotech. 3:207-220, 1995.

V pokusech se pak testují různé dávky virů. Velikost dávky je od 10⁷ jednotek tvořících plaky (pfu) do 10¹² pufru. Pokud je to třeba, virus se podává opakovaně (např. jedenkrát za jeden až šest měsíců). Humorální imunitní odpověď v důsledku opakovaného podání viru může omezit účinnost opakovaného podání. V takovém případě je možné podat společně s virem imunosupresivní agens jako např. cyklosporin nebo protilátku namířenou proti ligand CD40.

Účinek interferonové genové terapie proti virové hepatitidě je možné testovat na zvířecích modelech (viz část C). Např. v případě viru hepatitidy B je dostupné množství modelů, k nimž patří svišť, kachna, rejsek, potkan a myš. K myším modelům HBV patří myši, které jsou transgenní na HBV a trvala replikují HBV DNA ve svých játrech, což vede k trvalé produkci HBV do krevního oběhu. Pro HCV je dostupný šimpanzí model. Adenoviry obsahující interferonový gen mohou být podávány přímo do jater nebo mohou být podávány intravenózní injekcí. Účinnost je možné stanovit monitorováním replikace virové DNA, virových částic v oběhu, jatemích enzymů (ALT), případně patologie jater a zánětů.

B. Rakovina

Bylo ukázáno, že interferonové proteiny mají za mnohých okolností antionkogenní aktivitu. Přehledné články viz Walder a Schwarz, Cancer Research 50: 3473-3486, 1990, Martin-Odegand, DN&P 4:116-117, 1991, Spiegel, Seminars in Oncology 15(5):41-45, 1988.

Léčení interferonem-alfa a interferonem-beta jevilo jistou účinnost proti několika typům akoviny. genová terapie se může provádět samostatně nebo ve spojení s konvenčním chirurgickým postupem, ozařováním nebo chemoterapií. Následující přehled typů rakovinných onemocněný vhodných pro genovou terapii není úplný a je zřejmé, že interferonová genová terapie by mohla být účinná v řadě dalších nemocí, které nejsou v tomto seznamu.

Maligní gliomy představují 60 až 80 % primárních nádorů mozku u dospělých. Lidské gliomové buňky je možné implantovat do mozku imunodeficitní myši (tzv. „nahé“ myši), aby se vytvořil model gliomu. Bylo ukázáno, že léčení interferonem-beta zlepšilo přežívání u těchto myší. Problémem v některých pokusech s léčením gliomu proteinem interferon-beta byla vysoká toxi55 čita po parenterálním podání (intravenózním nebo intramuskulámím) interferonu-beta. Loka- 17CZ 299095 B6 lizované podání genu interferonu-beta do mozku, pravděpodobně přímo v okamžiku chirurgického zákroku, povede k dlouhodobé produkci interferonu-beta v mozku, aniž by se projevily vedlejší účinky pozorované při systémovém podání proteinu.

Melanom je výborným cílem pro interferonovou genovou terapii. Prognóza je v případě metastázujícího maligního melanomu velmi špatná. Incidence nemoci se dramaticky zvyšuje a konvenční chemoterapie je neúčinná. Melanom je nádor imunogenního typu, kdy pacientova odpověď závisí na hostitelově imunitní reakci. Za těchto okolností mohou být účinné jak anti-proliferativní tak i imunomodulační aktivity interferonu-beta. Bylo ukázáno, že protein interferon-beta má přímé antiproliferativní účinky na kultivované buňky maligního melanomu.

Hemangiom je proliferace endotelia kapilár do shluku mastocytů, fibroblastů a makrofágů a vede k poškození tkáně. Ačkoliv jsou samy zpravidla neškodné, hemangiomy mohou poškodit životně důležité orgány s fatálními důsledky. Bylo ukázáno, že interferon-alfa indukuje časnou regresi hemangiomů rezistentních ke steroidům u dětí (Martin-Odegard, viz výše).

Bylo také ukázáno, že interferonové proteiny jsou účinné při léčení leukémií, lymfomů amyelomů. Účinnost ukázaná u těchto nemocí je v rozporu s obecným zjištěním, že účinnost in vivo je mnohem méně obvyklá, i když účinnost interferonových proteinů při léčení rakoviny in vitro je dobře charakterizovaná. Avšak interferon-alfa je účinný v klinických pokusech proti leukémii vlasatých buněk, chronické myeloidnf leukemiii, kutánním lymfomům T buněk, Hodgkinově lymfomu a mnohočetnému lymfomu. Interferon-beta inhibuje růst kultivovaných buněk renálního buněčného karcinomu. IFN-α byl již schválen pro použití k léčení renálního buněčného karcinomu.

Kolorektální karcinom je hlavní příčinou úmrtí způsobených rakovinou v USA. Existují silné antiproliferativní účinky proteinů IFN-a, IFN-β a IFN-γ na kultivované buňky lidského karcinomu tlustého střeva. Karcinom tlustého střeva tvoří časté metastázy v játrech s velmi špatnými následky. Adenoviry nebo jiné přenosové systémy specifické pro játra se mohou užít k přenosu interferonového genu do jater pro léčení těchto metastáz. Hepatocelulámí karcinom je také atraktivním cílem vzhledem k vysoké účinnosti přenos do jater při užití adenoviru. Bylo pozorováno, že protein IFN-β významně inhiboval proliferaci lidských hepatomových buněk v kultuře.

Interferonové proteiny projevily v některých klinických zkouškách účinnost také v léčení neoparovatelného nemalobuněčného plicního karcinomu, ale v jiných zkouškách zůstaly bez účinku. Bylo zjištěno, že dvě lidské linie plicní rakoviny jsou citlivé k inhibici růstu interferonem-beta (interferon-beta byl účinnější než alfa). V jedné klinické zkoušce byla pozorována významná toxicita související s interferonem po intravenózním podání interferonů. Lokální podání genu pro interferon-beta do plic (pravděpodobně přenosem pomocí rekombinantního adeno40 virového vektoru v aerosolu) bude účinné aniž by se projevily vedlejší účinky pozorované po systémovém podání proteinu. Byla pozorována in vitro inhibice proliferace buněk malobuněčného plicního karcinomu účinkem interferonu-beta.

Interferon-alfa inhibuje růst xenoštěpů karcinomu prsu u „nahých“ myší. Interferon-alfa může být účinný proti rakovině prsu nejen pro svůj antiproliferativní účinek, ale také díky indukci estrogenových receptorů a progestenových receptorů in vivo, což činí karcinomy prsu citlivé k antiestrogenu tamoxifenu. Zde jsou uvedeny data z pokusů, kdy byla užita genová terapie IFNβ na myším modelu lidského karcinomu prsu (viz příklady 3 a 4).

Rakovina vaječníků je také možnou cílovou nemocí. Interferon-beta se zdá být méně účinný než interferon-alfa v inhibici proliferace kultivovaných buněk rakoviny vaječníků. Terapie se v tomto případě může provádět vložením vektoru pro genovou terapii do paritonea, jelikož tento typ nádorů má tendenci vyplňovat peritoneální dutinu.

-18CZ 299095 B6

Lze shrnout, že interferonové proteiny prokázaly antionkogenní vlastnosti v řadě podmínek, i když klinické výsledky s užitím interferonového proteinu nejsou jednoznačně pozitivní. Proteiny IFN-α a IFN-β byly testovány ve spojení s konvenčními chemoterapeuticky a projevily synergický účinek s těmito léky v mnoha indikacích včetně buněk rakoviny děložního čípku, hrtanu, leukémií, karcinomů ledvin, adenokarcinomů tlustého střeva a myelomu.Věří se také, že interferony mají antiangiogenní aktivitu. Existuje inverzní korelace mezi lokální hladinou IFN-β a angiogenní schopností. Některá data ukazují, že trvalá hladina proteinu IFN-β je nezbytná pro inhibici angiogeneze. V takovém případě by interferonová genová terapie byla výhodnější než proteinová terapie, při které hladiny interferonového proteinu velmi rychle padají na příliš nízkou nebo nedetekovatelnou hladinu.

C. Zvířecí modely

Odborníkům je známo, že existuje mnoho zvířecích modelů, které jsou dostupné k testování ex vivo a in vivo genové terapie. Nejužívanějším modelem, patřícím k hlodavcům je model xenoštěpů lidských nádorů u „nahých“ (nu/nu) myší. Lidské rakovinné buňky se namnoží v kultuře a transfekují se nebo se infikují genem, který kóduje interferon, aje operativně spojen svhodnou expresní kontrolní sekvencí. Tyto buňky se pak injikují do „nahých“ myší. Typicky se nádorové buňky injikují subkutánně do hřbetu myši, což vede k vytvoření hmoty solidního nádoru (viz příklad 1). Alternativně se nádorové buňky injikují ortotopicky do orgánu, ve kterém by se přirozeně vyskytovaly (buňky plicní rakoviny by se injikovaly do plic, rakoviny tlustého střeva do tlustého střeva atd.). Růst nádorů je možné sledovat měřením průměru nádorové hmoty v závislosti na čase (viz příklad 2).

Okada et al.(1996, gene Therapy 3, 957-964) vytvořily experimentální gliomy u myší přímou intrakraniální stereotaktickou injekcí lidských gliomových buněk do mozku. Poté, co se vytvořily detekovatelná nádory, byl přímo do stejného místa injikován AAV vektor exprimující gen thymidinkinázy (HSV tk) z viru herpes simplex. Enzym HSV tk přeměňuje netoxický nukleosidový analog gancyklovir (GCV) na toxický metabolit. Po genové terapii byl intraperitoneálně podán GCV. Myší, které dostaly AAV-tk a GCV, ale nikoliv kontrolní AAV nebo AAV-TK bez GCV, projevily dramatické zmenšení velikosti nádoru. Tato terapie byla bezpečná a účinná.

Rekombinantní adenoviry (AdV) byly také použity při léčení solidních nádorů na zvířecích modelech a v časných klinických zkouškách na lidech. Mnohé z těchto studií užívaly podobné modely jako je lidský xenoštěp/“nahá“ myš. Některé příklady těchto modelových experimentů jsou vedeny dále.

Clayman et al. (1995, Cancer Research 55, 1-6) připravily modle lidského kožního karcinomu dlaždicového epitelu v oblasti hlavy a krku na nahých myších. Zjistili, že adenovirus exprimující divoký typ p53 zabránil tvorbě těchto nádorů.

Hirschowitz et al (1995, Human Gene Therapy) vnesli buňky lidského karcinomu tlustého střeva do nahých myší. Poté, co se vytvořily nádory, injikovali přímo do nádoru adenovirus exprimující gen cytosindeaminázy (CD) z e. coli a pak podali systémově 5-fluorocytosin (5FC) (CD a 5FC je kombinace enzym/prekurzor léku podobná kombinaci tk s GCV). Pozorovali 4 až 5x menší velikost nádorů.

Zhang et al. (1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 4513-4518) vytvořili lidský nádor prsu u nahých myší. Tyto nádory byly injikovány přímo adenovirem, který exprimoval interferon50 alfa. Pozorovali regresi nádorů u 100% zvířat.

Ko et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 1683-1691) připravili lidské nádory prostaty u nahých myší a zjistili, že přímá intratumorová injekce adenovirů exprimujícího p53 divokého typu inhibovala růst nádorů. Všechny léčené myši zůstaly bez nádorů ještě alespoň po dobu 12 týdnů po ukončení léčení.

-19CZ 299095 B6

Bishoff et al. (1996, Science 274, 373-376) vytvořily lidský karcinom děložního čípku aglioblastomové nádory u nahých myší. Léčili tyto myši adenovirem, který měl deleci v genu E1B. V nepřítomnosti E1B adenovirus selektivně usmrcoval nádorové buňky deficitní vp53. Pokud byl injikován přímo do nádoru, tento adenovirů způsobil regresi nádoru u 60 % zvířat.

Ohwada et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 1567-1576) injikovali buňky lidského karcinomu tlustého střeva do jater nahých myší, aby na podobili jatemí metastázy střevního karcinomu. Pak do jater v blízkosti nádoru injikovali adenovirů exprimující CD. Systémové podání 5FC potlačilo ío růst nádorů u těchto zvířat.

Modely rakoviny je možné vytvořit také u imunokompletentních myší a potkanů. Nádory mohou být založeny z nádorových buněk syngenních zvířat. V těchto případech endogenní nádory mohou vznikat podáváním karcinogenu zvířeti nebo mohou vznikat spontánně v důsledku gene15 tického základu určitých myší (např. deficitních v P53). Následuje několik příkladů.

Elsahami et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 141-148) léčili endogenní mesothelium u imunokompetetních potkanů pomocí adenovirů exprimujícího gen tk. Virus byl injikován do oblasti pleary a GCV byl podán systémově. Bylo ukázáno dramatické snížení hmotnosti nádorů a zvýše20 ní doby přežívání.

Eastham et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 515-523) implantovali buňky nádoru prostaty syngenní myši subkutánně do imunokompetentní myši. Pak injikovali adenovirus-tk přímo do nádoru a podávali GCV systémově. Autoři popsali zmenšení velikosti nádorů a prodloužení života.

Bromson et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 1995-2002) injikovali adenovirus exprimující cytokin IL—12 přímo do endogenního nádoru prsu u myší. Zjistili, že u 75 % myší se projevila regrese nádoru u 33 % myší zůstalo bez nádoru i po dlouhé době.

Riley et al. (1996, Nátuře Medicine 2, 1336-1341) injikovali adenovirus exprimující gen retinoblastomu do melanotrofních nádorů štítné žlázy, které vznikly spontánně u Rb+/- myší. U léčených zvířat zjistili snížení proliferace nádorových buněk, zpomalení růstu nádorů u prodloužení délky života.

Retrovirové vektory byly prvními vektory, které byly užity v klinických testech genové terapie u lidí. Publikací relevantní k předkládané patentové přihlášce je práce Roth et al. (1996, Nátuře Medicine 2, 985-991). Autoři vytvořily rekombinantní retrovirus, který exprimoval gen p53 divokého typu. Tento virus byl podán devíti pacientům trpícím nemalobuněčným karcinomem plic pomocí přímé intratumorové injekce užitím jehly vložené do bronchoskopu. Z těchto devíti pacientů se u tří projevila regrese nádoru a u tří dalších pacientů došlo ke stabilizaci nádorového růstu.

D. Další aspekty provedení vynálezu

Geneticky modifikované buňky se podávají např. intraperitoneální injekcí nebo implantováním buněk nebo štěpu nebo také pouzdra/tobolky obsahující buňky do buněčné kompatibilního místa v těle příjemce. Termín „buněčné kompatibilní místo“ znamená strukturu, dutinu nebo tělní tekutinu příjemce, do které se aplikují geneticky modifikované buňky, buněčný štěp nebo zapouz50 dřený buněčný expresní systém, aniž by došlo k vyvolání nepříznivých fyziologických následků. K příkladům buněčně kompatibilních míst patří např. peritoneální, pleurální nebo perikardiální dutina, a také solidní nádor, ze kterého pocházejí buňky nebo orgán, ze kterého byl odstraněn nádor.

-20CZ 299095 B6

Geneticky modifikované buňky se implantují do buněčně kompatibilního místa samotné nebo v kombinaci s jinými geneticky modifikovanými buňkami. Takže předkládaný vynález zahrnuje i způsob modifikace systému příjemce užitím směsi geneticky modifikovaných buněk, kdy první modifikovaná buňky exprimuje první interferon a druhá modifikovaná buňka exprimuje první interferon a druhá modifikovaná buňka exprimuje druhý interferon nebo jiný sekretovaný protein. Další typy geneticky modifikovaných buněk (např. hepatocyty, buňky hladkého svalstva, fibroblasty, gliové buňky, endotelové buňky, keratinocyty) se mohou přidat, společně s geneticky změněnými buňkami, aby se dosáhlo exprese komplexní sady vnesených genů. Navíc do každé geneticky modifikované buňky může být vnesen víc než jeden rekombinantní gen, a sice pomocí téhož vektoru nebo různých vektorů, což umožňuje expresi několika interferonů v jediné buňce.

Předkládaný vynález se týká také buněčných štěpů. Štěp obsahuje množství výše popsaných genově modifikovaných buněk navázaných na nosič, který je vhodný pro implantaci do příjemce, kterým je savec. Nosič může být buď z přírodního nebo syntetického materiálu. V jiném prove15 dění vynálezu štěp obsahuje kousek peritonea. V takovém případě je nosičem přirozeně se vyskytující matrix, která udržuje pohromadě množství geneticky modifikovaných buněk. Alternativně obsahuje štěp množství výše uvedených geneticky modifikovaných buněk navázaných na náhražku zmíněné přírodní matrix, např. Gelfoam (Upjohn, Kalamazoo, Mich.), Dacron nebo Cortex^(R).

Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká opouzdřeného buněčného expresního systému. Opouzdřený systém obsahuje tobolky vhodné pro implantaci do savčího příjemce a množství výše popsaných geneticky modifikovaných buněk mesothelia obsažených uvnitř. Tobolka může být buď z přírodního nebo syntetickém materiálu. Formulace takových tobolek je odborníkovi známa. Proti buňkám, které jsou přímo implantovány savčímu příjemci (např. implantovaným tak, že geneticky modifikované buňky jsou v přímém fyzickém kontaktu s buněčně kompatibilním místem) opouzdřené buňky zůstávají po implantaci izolované (tj. nejsou v přímém kontaktu s místem). Opouzdřený systém není omezen jen na tobolky obsahující geneticky modifikované buňky, které nebyly imortalizovány, ale může obsahovat i geneticky modifikované imortalizované buňky.

IV. Formulace

Ve výhodném provedení přípravek geneticky modifikovaných buněk obsahuje množství buněk dostatečné k tomu, aby se přenesla terapeuticky účinná dávka interferonu do příjemce in šitu.

Stanovení terapeuticky účinné dávky pro specifický interferon a známý stav je v kompetenci běžného odborníka, aniž by bylo nutné nepřiměřené experimentování. Takže při stanovení účinné dávky by odborník zvážil stav pacienta, závažnost onemocnění, a také výsledky klinických testů konkrétního interferonu, který je podáván.

Pokud již gen nebo geneticky modifikované buňky nejsou přítomny ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jsou do takového nosiče umístěny před podáním příjemci. K farmaceuticky přijatelným nosičům patří např. Izotonický solný roztok nebo jiné pufry v závislosti na vhodnosti pro daného pacienta a zvolené terapii.

Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ znamená jednu nebo několik přísad, přírodních či syntetických, se kterými se izolovaný polynukleotid sdružuje, aby se usnadnilo jeho podávání. K vhodným nosičům patří sterilní solný roztok, ačkoliv i jiné vodné či nevodné izotonické sterilní roztoky a sterilní suspenze, které jsou farmaceuticky přijatelné, jsou odborníkovi známé. V tomto ohledu termín „nosič“ zahrnuje také jakýkoliv plazmidový a virový expresní vektor.

Termín „účinné množství“ se týká množství, které je schopné zlepšit stav nebo zpomalit postup nemoci, degenerativního stav nebo poškození. Účinné množství lze stanovit na individuální bázi a vychází zčásti ze zvážení symptomů, které se léčí, a výsledku, kterého se má dosáhnout. Účinné množství může být stanoveno běžným odborníkem při zvážení takových faktorů aniž by bylo třeba více než rutinních testů.

-21 CZ 299095 B6

Ve výhodném způsobu podle vynálezu se účinné množství interferonové polynukleotidové sekvence obsažené v doprovodném vektoru (např. nosiči) podá přímo do cílové buňky nebo nádorové tkáně pomocí přímé injekce s jehlou nebo pomocí katétru nebo jinou podávači trubičkou vloženou do rakovinné tkáně, nádoru nebo krevní cévy zásobující nádor. Dávkování je primárně závislé na faktorech jako je nemoc, která se má léčit, vybraný interferon, věk, hmotnost a zdravotní stav subjektu, a je tedy rozdílné pro různé subjekty. Když se užívá virový vektor pro genovou terapii, má se za to, že účinné množství pro člověka je od 0,1 do 10 ml fyziologického roztoku obsahujícího 1 χ 10⁷ až 1 x 10¹² jednotek tvořících plak (pfu)/ml virových expresních vektorů obsahujících interferon.

Jak bylo již diskutováno výše, interferonový gen může být podáván přímou injekcí do solidního nádoru. Alternativně se podání do nádoru může uskutečnit prostřednictvím infuze do krevní cévy, která zásobuje nádor. Je také možné parenterální podání vektoru. Polynukleotidy kódující interferon mohou být podány topicky, intraokulámě, parenterálně, intranazálně, intratracheálně, intra15 bronchiálně, intramuskulámě, subkutánně nebo jakýmkoliv dalším způsobem. K parenterálním způsobům podání patří podání intravenózní, intramuskulámí, intraperitoneální a subkutánní. Složitější přístup je parenterální podávání viru nebo chemického konjugátu, který se lokalizuje do určitého typu nádoru díky přirozenému tropismu nebo díky přítomnosti povrchové molekuly, která se váže na receptor vyskytující se pouze na určitých typech nádoru.

Jak již bylo popsáno výše, předkládaný vynález se týká i způsobů přípravy buněčného expresního systému pro expresi genového produktu (např. interferonu) v příjemci, který je savec, expresního systému takto připraveného a zejména farmaceutického přípravku obsahujícího takový systém. Cílem následujících přípravků obsahujícího takový systém. Cílem následujících příkladů je demonstrovat proveditelnost buněčné genové terapie na zvířecím modelovém systému.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příklady zvířecích modelů

Testování in vivo polynukleotidů schopných exprimovat interferon se obyčejně provádí na zvířecích modelech. Nádory u nahých myší se tvoří injekcí lidských nádorových buněk do myši. Nahé myši (kmen nu/nu) jsou imunodeficitní myši a neodvrhují cizorodé nádorové buňky. Nádory se vytvoří za 1 až 2 týdny po injekci nádorových buněk, i když přesný okamžik závisí na množství injikovaných buněk a tumorigeničnosti injikované buněčné linie. Polynukleotidy expri40 mující interferon se vnesou do nádorových buněk konvenčním postupem transfekce v buněčné kultuře před injekcí na myší. Alternativně se vhodný polynukleotid vnese do nádoru transfekcí nebo virovou transdukcí in vivo poté, co se u myší vytvořily nádory.

Až najeden příklad jsou užívané buňky buďto buňky linie karcinomu močového měchýře HTB9 (Huang et al., viz výše) nebo linie retinoblastomových buněk WERI-Rb27 (Takahaski et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5257-5261, 1991). Pro přenos izolovaného polynukleotidu kódujícího interferon do kultury se nádorové buňky transfekují (konvenčním způsobem jako je kalciumfosfátová precipitace, elektroporace nebo transfekce s lipofectaminem) nebo přímo infikují (retrovirem, adenovirem, bakulovirem nebo adeno-asociovaným virem). V případě účinné virové infekce, kdy 100 % buněk úspěšně inkorporovalo příslušný polynukleotid, není potřeba žádná selekce. Kromě toho bylo zjištěno (viz příklad 3), že je třeba, aby pouze malé procento buněk exprimovalo interferonový gen, takže selekce pomocí léků se obvykle nevyžaduje.

Jestliže se provádí selekce v případě transfekce, která není tak účinná jako virová infekce zde popisovaná, buňky se transfekují expresním vektorem, který kóduje jak gen rezistence k léku (jak

-22CZ 299095 B6 je gen neo kódující rezistenci k G418) a polynukleotid jako je např. interferonový gen. Kontrolní transfekce se provede vektorem, který kóduje samotnou rezistenci k léku.

Po 2 až 3 týdnech selekce na mediu obsahujícím lék se buněčné kolonie sloučí a subkutánně inji5 kují do boku samic myší nu/nu (tzv. nahých myší) v počtu 10⁶ buněk v objemu 100 μΐ. Virem infikované buňky se injikují přímo bez nutnosti provádět selekční krok. Myši jsou dále drženy po alespoň dva měsíce a monitoruje se velikost nádoru pomocí kaliperu na týdenní bázi.

Alternativně netransfekované nebo neinfikované nádorové buňky se subkutánně injikují do boku ío myší. Po vytvoření nádoru se přímo do nádoru injikuje DNA nebo virus obsahující polynukleotid kódující interferon. Pro tento postup jsou vhodné mnohé viry, i když nejúčinnější jsou rekombinantní adenoviry, a rekombinantní retroviry mají výhodu, že se trvale integrují do genomu nádorových buněk. DNA může být vnesena do buněk tak, že se DNA smíchá s kationtovými lipozomy a pak se injikuje tato směs. DNA nebo viru neobsahují interferonový gen se injikují do nádorů dalších myší, které slouží jako kontrola. Pomocí kaliperu se pak sleduje progrese nebo regrese nádorů.

Příklad 2

Příklad modelu karcinomu plic

Jako další příklad je možné uskutečnit léčení lidského malobuněčného karcinomu plic in vivo pomocí izolovaného polynuleotidu kódujícího interferon zapouzdřeného v lipozomů tak, že se polynukleotid kódující interferon vnese do buněk vyžadujících tento zásah užitím lipozomů, konkrétně aerosolu malých lipozomových částic. Při podání prostřednictvím aerosolu je polynukleotid kódující interferon deponován rovnoměrně na povrchu nosohltanu, v racheobronchiálním traktu a v oblasti plic, viz diskuse lipozomových aerosolů v Knight a Gilbert, Eur. J. Clin. Micro, and Inf. Dis. 7: 721-731, 1988. Pro léčení plicní rakoviny takovým způsobem je polynukleotid kódující interferon purifikován jakoukoliv obvyklou metodou. Polynukleotid kódující interferon se pak smíchá s lipozomy a je do nich s velkou účinností inkorporován. Jelikož je podání aerosolu velmi jemné a je dobře snášeno jak normální dobrovolníky tak pacienty, jsou lipozomy obsahující polynukleotid kódující interferon podávány k léčení pacientům trpícím plicními rakovinami v kterémkoliv stadiu. Lipozomy se podávají nazální inhalací nebo endotracheální sondou napojenou na nebulizační zařízení v dávkách dostatečných k inhibici růstu nádorů. Léčení aerosolem se provádí denně po dobu dvou týdnů, a pokud je to třeba, opakuje se.

Studie in vivo užitím ortotopického malobuněčného plicního karcinomu se mohou provádět tak, že se nádor injikuje do pravého hlavního bronchu bezthymových nu/nu (nahých) myší (1,5 x 10⁶ buněk najedno zvíře). Tři dny později se zahájí léčení (denně po tři po sobě následující dny) tím že jsou inokulovány endobronchiálně interferonovým genem zapouzdřeným v lipozomů a kontroly postrádají sekvenci interferonového genu. Vytváření nádorů a jejich velikost se sledují u obou skupin měřených pomocí kaliperu a hodnocením přežívání myší.

Příklad 3

Genová terapie ex vivo s genem interferonu-beta la

V tomto příkladu byla užita buněčná linie lidského karcinomu prsu MBA-MD-468 (získaná z Americké sbírky mikroorganismů ATCC). Buňky byly buďto neinfikované nebo infikované adenovirem exprimujícím gen lidského interferonu - beta la. V tomto případě měl adenoviru delece v genech El a teplotě senzitivní mutaci v genu E2a. Metody pro přípravu tohoto konkrét55 ního adenoviru lze najít v publikaci Engalhardt et al., 1994, Gene Therapy 5: 1217-1229 (a níže

-23CZ 299095 B6 jsou popsány další podrobnosti). Stručně shrnuto, gen interferonu-beta la byl již dříve klonován do adenovirového vektoru pAdCMVlinkl tak, že translace byla řízena promotorem CMV IE1, čímž se vytvořil adenovirový přenosový plazmid. Gen byl vložen do tohoto vektoru na místo deletovaného genu El. Rekombinantní adenoviru obsahující interferonový gen byl připraven rekombinací přenosového plazmidů a adenovirového genomu v buňkách 293. Virus byl pak plakově purifikován a titrován v plakovém testu konvenčním způsobem.

Materiály a metody ío Buněčné kultury

Lidské karcinomové buňky MDA-MB-468, Huh7, KM12LA4, ME180, HeLa, U87 a 293 byly udržovány jako adherentní kultury v Dulbeccem modifikovaném Eagleho médiu obsahujícím 10% bovinní sérum, 2mM glutamin, penicilin a streptomycin, neesenciální aminokyseliny a vita15 miny.

Příprava purifikovaných adenovirů

Adenovirový přenosový vektor kódující lidský gen IFN-β řízený časným promotorem cyto20 megaloviru pAdCMV-huíTN^, byl zkonstruován ligací inzertu cDNA kódujícího lidský IFNβΐη do plazmidů pAdCMVlinkl (viz Englehardt et al., 1994, viz výše). Plazmid pAdCMVΙιυΙΕΝβ byl přenesen do buněk 293 společně s genomovou DNA purifikovanou z teplotně senzitivního adenoviru h5tsl25. Rekombinantní adenoviry pocházející zjednotlivých plaků pak byly užity k infikování buněk 293 při 39 °C a supematanty se testovaly na genovou expresi

IFN-β pomocí ELISA testu. Adenovirus nesoucí cDNA pro IFN-β byl identifikován (H5.1 ΙΟΙιΙΙΕΝβ) a dále amplifikován. Podobně byl připraven kontrolní adenovirus s teplotně senzitivní mutací vE2A kódující kolorimetrický markér β-galaktosidázu (h5.H0/acZ). Virové preparáty pak byly produkovány v buňkách 293 a purifikovány na gradientu CsC 1 po dvou cyklech plakové izolace. Tyto preparáty se ukázaly negativní v testu na přítomnosti adenoviru divokého typu.

Subkonfluentní buňky byly infikovány H5.1 ΙΟΙιΙΙΕΝβ při násobku infekce (MOI) 100 ve 3 ml média obsahujícího 2% hovězí sérum. 15 až 18 hodin později byly supematanty sebrány a koncentrace IFN-β byla kvantitativně stanovena pomocí ELISA testu.

ELISA test

96jamkové destičky byly potaženy přes noc ve 4 °C protilátkou proti lidskému IFN-β, B02 (Summit Pharmaceuticals Co., Japonsko). Protilátka byla užita v koncentraci 10 pg/ml v potaho40 vacím pufru, který obsahoval 50mM hydrogenuhličitan/uhličitan sodný, 0,2mM MgCl₂ a 0,2mM CaCl₂ (pH 9,6). Poté, co byly destičky blokovány 1% kaseinem v PBS po 1 hodinu při teplotě místnosti, byly přidány vzorky standardů IFN-β proteinu (AVONEX^tm, Biogen), naředěné v 1% kaseinu a 0,05% Tween-20. Destičky se pak postupně inkubovaly při teplotě místnosti 1 hodinu s králičím anit-IFN-β sérem (ředění 1:2000), 1 hodinu s křenovou peroxidázou (HRP) konjugo45 vanou s oslí anti-králičí protilátkou (Jackson Immuno Research, ředění 1:5000) a substrátovým roztokem (4,2mM TMB a 0,lM octan sodný-kyselina citrónová, pH 4,9). Po zastavení reakce pomocí 2N H₂SO₄ byla měřena absorbance při 450 nm.

Pokusy na myších

Samice myší balb/c nu/nu stáří 4 až 6 týdnů byly získány od farma Taconic (Boston, Massachussets). Všechny myší byly udržovány ve speciálním zařízení bez patogenů firmy Biogen po dobu nejméně 2 týdnů před pokusem. Pro experimenty in vivo byly infikované a neinfikované buňky sklizeny roztokem trypsin/EDTA a dvakrát opláchnuty PBS. Tyto buňky byly

-24CZ 299095 B6 smíchány těsně před injikováním do myší v poměrech popsaných dále. Celkem bylo implantováno 2 χ 10⁶ buněk ve 100 μΐ PBS subkutánně do pravého boku. Velikost nádorů byl měřena jako délka a šířka pomocí kaliperu a uvedené hodnoty představují průměrnou hodnotu průměru nádoru (v mm).

Pro experimenty s přímou injekcí in vivo (příklad 4) bylo nejdříve implantováno 2 χ 10⁶ buněk ve 100 μΐ PBS subkutánně do nahých myší. Když velikost průměru nádoru dosáhla 5 až 6 mm, injikovalo se 100 μΐ PBS obsahujících různé dávky rekombinantních adenovirů přímo do středu nádoru jako jediná injekce. Monitorovala se délka a šířka nádoru pomocí kaliperu. Velikost io nádoru se vypočetla jako průměrná hodnota z šířky a délky. Smrt zvířete byla určena tím, že zvířata byla utracena, když nádory projevovaly známky krvácení nebo jejich hmotnost dosáhla % celkové tělesné hmotnosti. Apoptóza byla vyšetřována pomocí soupravy ln šitu Apoptosin Detection Kit od Firmy Oncor, lne. (katalog, č. S7110-KIT).

Výsledky

Nejdříve byla vyhodnocena účinnost transdukce a exprese transgenu adenovirových vektorů. Buňky lidského karcinomu prsu MDA-MB-468 byly infikovány H5.1101acZ se zvyšující se multiplicitou infekce (MOI). Po obarvení X-gal bylo stanoveno, že při MOI 100 účinnost trans20 dukce dosáhla přibližně 100 % u těchto buněk (data nejsou uvedena). Tudíž buňky karcinomu prsu byly infikovány v kultuře v poměru 100 jednotek tvořících plak (pfu) na jednu buňku, neboť ze zkušenosti s těmito karcinomovými buňkami vyplývalo, že to byl nejnižší poměr virus:buňka, který vedl k expresi genu v každé buňce populace.

V prvním pokusu byla 18 hodin po infekci podána subkutánně injekce 2 χ 10⁶ buněk do hřbetu každé nahé myši. 5 myším byly podány injekce neinfikovaných buněk a 5 myším byly podány injekce buněk infikovaných adenovirem-IFNp. U všech myší injikovaných kontrolními neinfikovanými buňkami vznikly nádory významné velikosti. U žádné z myší injikovaných buňkami ošetřenými adenovirem exprimujícím IFN-β se nádor neobjevil (H5.1 XOhlFNf: tabulka 1).

Aby se vyloučila možnost, že in vitro expozice nádorových buněk proteinu IFN-β mohla vést ke ztrátě schopnosti vyvolávat nádory in vivo, byly buňky MDA-MB-468 ošetřeny proteinem IFN-β v takové koncentraci, která byla detekována po 18 hodinách virové infekce. Po důkladném promytí se nahým myším podávaly injekce se stejným množstvím ošetřených buněk, neošetřených buněk nebo směsi obsahující 10% ošetřených buněk. Ve všech třech skupinách myší byl porovnán rozvoj nádorů (dat neukázala), což naznačuje, že pro inhibici tvorby nádorů je kritické podání genu IFN-β ex vivo, ale ne ošetření proteinem in vitro.

Aby se určilo, zda rakovinné buňky exprimující gen IFN-β mohou vést k destrukci netrans40 dukovaných buněk, prováděl se následující pokus. Stejné rakovinné buňky jsou buď neinfikovány, infikovány adenovirem exprimujícím gen IFN-β (H5.1 XOhlFNffi nebojsou infikovány stejným typem adenoviru, ale exprimujícího gen lazZ (5H.H0/acZ), který kóduje reportérový protein β-galaktosidázu, u kterého se neočekává žádný protirakovinný účinek a proto je to kontrola jakéhokoliv účinku vyvolávaného samotným adenovirem. Všechny adenovirové infekce byly vyvolávány při poměru pfu: buňku = 100. Nádorové buňky MDA-MB-468 byly infikovány odděleně s H5.1 lOhIFNf nebo h5.110/acZ v MOI 100. 18 hodin po infekci byly infikované buňky sklízeny a část se smísila s neinfikovanými buňkami těsně před injekcí myším. Nahým myším Balb/c bylo subkutánně implantováno stejné množství infikovaných buněk, neinfikovaných buněk nebo směsí obsahující 10% infikovaných buněk a 90 % buněk, které nebyly vystaveny viru. Růst nádoru se sledoval 12 dnů později. Zatímco u všech myší, kterým byly implantovány neinfokované buňky, se vyvinuly nádory, u myší, které dostaly 100 % buněk infikovaných Y15 AlOhIFNf nebo H5.110/acZ nebyly pozorovány žádné nádory, což svědčí pro to, že infekce oběma viry může zrušit schopnost vyvolávat nádory (tabulka 1). Avšak u všech myší, které dostaly 10 % buněk infikovaných H5.1 IQlazZ se nádory vyvinuly, zatímco u žádné z myší,

-25CZ 299095 B6 které dostaly 10 % buněk infikovaných H5.1 lOhIFNfise tak nestalo. Tudíž infekce H5.1 lOlacZ, i když byla postačující pro supresi tvorby nádoru již infikovaných buněk, selhala v blokování tumorigeniěnosti společně injikovaných nativních a neinfikovaných buněk. Na rozdíl od toho, transdukce H5.1 IbhlFNf v 10% buněk byla postačující pro supresi tumorigeničnosti buněk, které byly transdukovány virem, a také buněk, které transdukovány nebyly. Inhibice tvorby nádoru H5.110/t/cZ u 100% transdukované populace mohla být způsobena některými obecnými toxickými účinky nebo některými protinádorovými účinky této generace adenoviru, ale je nutné poznamenat, že transdukované buňky byly schopné replikace in vitro (nepublikovaná data).

ío Aby se stanovilo množství viru obsahujícího interferon potřebné pro supresi tumorigeničnosti, byly nádorové buňky odděleně infikované s H5.1 IQhIFNfia H5.1 IQlacZsmíseny s neinfikovanými buňkami v různých poměrech tak, že byl v každém případě přebytek i neinfikovaných buněk. Směsi jsou sestavené tak, že různé vzorky obsahovaly 10 %, 3 %, 1 %, 0,3 % buněk infikovaných adenovirem a zbytek byl neinfikován. Okamžitě po smísení byly buňky injikovány nahým myším. Výsledky jsou ukázány v tabulce 1. Průměry nádorů jsou měřeny ve dvou rozměrech v různou dobu po injekci buněk. Každá položka v tabulce 1 představuje průměr ± standardní odchylku měření laterálního a longitudinálního rozměru u čtyř myší. Měření se prováděla ve dnech 12, 19, 26 a 33 po injekci nádorových buněk.

Tabulka 1

Průměrný rozměr nádorů (v mm)

Vzorek	Den 12	Den 19	Den 26	Den 33
100 % neinfikovaných	4,1 + 0,6	4,9 ± 0,8	5,9 ± 0,5	6,3 ± 0,6
100 % AdV-IFN	0,0	0,0	0,0	0, 0
10 % AdV-IFN	0,0	0,0	0, 0	0, 0
3 % AdV-IFN	0,0	0,0	0,0	0, 0
1 % AdV-IFN	0,0	0,0	o o	0, 0
0,3 % AdV-IFN	2,8 ± 0,2	2,9 ± 0,3	3,0 ± 0,6	1,8 ± 2,0
100 % AdV-lacZ	0,0	0,0	0,0	0,0
10 % AdV-lacZ	4,8 ± 0,4	5,2 + 0,6	6,2 ± 0,5	6,5 ± 0,5
3 % AdV-lacZ	4,3 + 0,5	4,6 ± 0,6	5,8 + 0,8	6,5 + 1,0
1 % AdV-lacZ	4,3 + 0,4	4,6 + 0,4	5,0 ± 0,5	6,3 + 0,9
0,3 % AdV-lacZ	4,4 ± 0,5	4,7 ± 0,6	NESTANOVENO	NESTANOVENO

Rozvoj nádorů byl úplně blokován u myší, které dostaly i tak málo jako 1 % buněk transdukovaných H5.1 \()ΜΡΝβ (tabulka 1). V prvním týdnu po injekci buněk byly detekovány velmi malé nádory (byly přístupné palpaci, ale nebyly dostatečně velké pro měření) u myší injikovaných 10, 3 a 1% H5.1 IbhlFNf. Ale všechny tyto malé nádory kompletně ustoupily v den 9. To naznačuje, že některé buňky krátkou dobu přežívaly a během tohoto období exprimovaly gen IFN-β, což vedlo ke smrti celého nádoru. V několika pokusech prováděných s touto buněčnou linií na nahých myších nebyla tvorba nádorů nikdy pozorována, když bylo 1 % buněk transdukováno H5.1 lOhIFNf a přežití bylo 100 % (data neukázána). U myší, které dostaly 0,3 % buněk transdukovaných H5.1 lOhlFNfise vyvinuly nádory, ale velikost těchto nádorů byla významně menší než nádorů u kontrolních myší a u 2 z 5 myší v této 0,3% skupině byla v den 33 pozorována kompletní regrese (tabulka 1).

-26CZ 299095 B6

Na rozdíl od toho se u myší, které dostaly 10 % až 0,3 % buněk ošetřených H5.1 \0lacZ, vyvinuly nádory podobné velikosti jako u neinfikované skupiny a v žádné z těchto kontrolních skupin nebyla pozorována regrese nádoru (tabulka 1).

Nepochybně se ukazuje, že exprese lidského interferonu beta (hIFN-β) i jen ve velmi malém procentu buněk, blokuje u nahých myší tumorigenezi. Dále byl vyšetřován nejnižší poměr buněk infikovaných H5.1 IQhIFNf nezbytných pro ovlivnění, ale ne nutně blokádu, tvorby nádoru a podporující přežití myší. Nahým myším byla implantována stejná množství buněk MDA-MBio 468 obsahující 0,3 %, 0,1 %, 0,03 % 0,01 % a 0 % buněk infikovaných H5.1 lOhIFNf a sledoval se růst nádorů. U myší, které dostaly 0,3 % nebo 0,1 % infikovaných buněk se vyvinuly mnohem menší nádory ve srovnání s myšmi, které dostaly pouze neinfikované buňky (obrázek 1A).

Z nádorů, které se tvořily při 0,3 a 0,1% transdukci, úplně regredovaly 3 z 5 a 1 z 5 nádorů. Významně prodloužené prožití bylo pozorováno v 0,3 a 0,1% transdukčních skupinách. Zatímco implantace 0 %, 0,01 % nebo 0,03 % infikovaných buněk měla za následek smrt všech zvířat během 75 dnů, ve skupinách 0,1 % a 0,3 % bylo naživu bez nádoru 1 z 5 a 3 z 5 zvířat v den 109, kde byl tento pokus ukončen (obrázek 1B).

Je pravděpodobné, že pouze malá část (větší než přibližně 0,3 %, výhodně větší než přibližně

1,0%) všech nádorových buněk potřebuje být transfekována nebo infikována, aby se dosáhlo účinnosti. To se liší od takových přístupů protinádorové genové léčby, jako je podávání nádorových supresorů divokého typu (například p53), ve kterých každá buňka v nádoru potřebuje získat nádorový supresorový gen.

Tudíž gen interferonu prokazuje silný antiproliferační účinek in vivo pro infekci in vitro. Kontroly ukazují, že to bylo způsobeno spíše interferonem než adenovirem.

Genová terapie IFN-β ex vivo dalších lidských nádorových xenoimplantátů

Účinek transdukce H5.H0/z/FjV/? byl také testován na dalších nádorových buněčných typech v modelu lidského xenoimplantátů ex vivo. Buňky lidského karcinomu tlustého střeva KM12L4A, buňky lidského karcinomu jater Huh7 nebo buňky lidského karcinomu čípku ME180 byly transdukovány H5.1 IQhIFNfl Stejné množství buněk obsahující 10 % 1 % nebo 0 % transdukovaných buněk se testují na schopnost tvořit nádory u nahých myší. Injekce neinfikovaných buněk tří typů způsobuje tvorbu rychle rostoucích nádorů u všech myší. Na rozdíl do toho, podávání 10 % buněk infikovaných H5.1 IQhlFNf ex vivo vedlo buď k tomu, že se nádor nevyvinul nebo se u všech vyšetřovaných zvířat opozdil výskyt pomaleji rostoucích nádorů (obrázek 2A). Na rozdíl od výsledků získaných s buňkami MDA-MB-468, u kterých 1% transdukce H5.11 OhlFNP úplně zabránila tvorbě nádorů, 1% transdukce těchto tří buněčných typů měla za následek tvorbu nádorů, i když jejich velikost byly menší než u neinfikovaných kontrol v každém časovém bodě. Myši, které dostaly 10% a 1 % transdukovaných buněk, přežívaly déle ve srovnání s těmi, které dostaly neinfikované buňky (obrázek 2B). Tudíž podávání genu IFN-β zprostředkované adenovirem ex vivo do četných odlišných nádorových buněk mělo za následek účinnou inhibici tumorigeničnosti a vedlo k prodlouženému přežívání zvířat.

Příklad 4

Genová terapie in vivo s genem interferonu-beta 1 a

Místo způsobu terapie ex vivo byla provedena přímá genová terapie in vivo. Při genové terapii in vivo se gen podává přímo pacientovi. V tomto příkladu byl adenovirus obsahující lidský gen IFN-β (W5 AlOhIFNβ) přímo injikován do solidních nádorů. Stručně shrnuto, 2 χ 10⁶ buněk lidského karcinomu prsu MBA-MD-468 bylo injikováno subkutánně do hřbetu padesáti nahých

-27CZ 299095 B6 myší. Vytvořily se subkutánní nádory přibližné velikosti 5 až 6 mm v průměru u nahých myší do 24 dnů po subkutánní injekci buněk MBA-MD-468. V této době byly nádory ošetřeny buďto PBS nebo vektory H5.1 XOhlFNf a H5.110/acZ v různých dávkách viru v rozmezí od 1 x 107 do 3 x 109 pfu/myš v jedné intratumorové injekci.

Data uvedená na obr. 3 ukazují, že během 14 dnů léčení jedinou dávkou H5.1 \9hIFNp v 3 x 10⁹, 1 x 10⁹ nebo 3 x 10⁸ celkových pfu vedlo k regresi nádoru. K úplné regresi nádoru došlo u 4 z 5 myší ve skupině 3 x 10⁹ pfu H5.1 \9hIFNf3a u 3 z 5 ve skupině 1 x ΙΟ⁹ H5.1 \(}hIFN[d V nádorech injikovaných dávkou 1 x 10⁹ pfu H5.1 XOhIFNfi byla detekována vysoká lokální koncentrace IFN-β 1500 IU/ml, zatímco v séru bylo detekováno pouze 37 IU/ml IFN-β. Nižší dávky IFN-β, které byly 1 x 10⁸, 3 x 10⁷ a 1 x 10⁷ pfu měly jen malý nebo žádný účinek (obr. 3 a neuvedená data), což ukazuje, že protinádorová odpověď je závislá na dávce. Injekce PBS nebo H5.110ZacZ ve stejných dávkách nevedly k regresi nádoru (obr. 3). Když byly nádory monitorovány delší období, pomalý růst a regrese byly pozorovány u několika individuálních nádorů injikovaných H5.1 lOZacZ v dávce 3 x 10⁹ pfu, což ukazuje, že i kontrolní virus v této dávce může slabě inhibovat růst nádorů. Ošetření 115.1 lOZz/FA/Z v dávkách 3 x 10⁹, 1 x 10⁹ nebo 3 x 10⁸ významně zvyšovalo přežívání vzhledem k myším ošetřených PBS nebo H5.110ZflcZ (údaje nejsou ukázány). Testovali jsme také po dání několika injekcí. Např. 5 injekcí s dávkou 1 x 10⁸ pfu H5.1 lO/iZFA/Z podávaných jednou za tři dny do založených nádorů MDA-MB-486 nebo

HeLa vedlo k pomalejšímu růstu a regresi nádorů obou typů (nepublikováno). Byl proveden také podobný experiment in vivo s linií lidských gliomových buněk U87. Tyto buňky byly velmi citlivé k IFN-β, jelikož byla pozorována úplná regrese nádoru u 4 myší ze 4 léčených dávkou 1 x 10⁹ pfu H5.110Zz/FA/Za u 2 ze 4 léčených dávkou 1 x 10⁸ pfu (data neuvedena). Tato zjištění ukazují, že přímé a lokální podání genu IFN-β prostřednictvím adenoviru může projevit výrazný protinádorový účinek.

Čtyři dny po injekci 1 x 10⁹ pfu viru byly nádory DNA-MB-468 odebrány pro histologickou analýzu. V této době nádory injikované H5.1 \9ΜΡΝβ jevily známky regrese. Byla provedena hematologická analýza nádorů MDA-MB-468 barvením hematoxylinem-eosinem. Více apoptotických buněk bylo pozorováno v nádorech injikovaných H5.1 XQhIFNf než v nádorech injikovaných H5.1 lOZacZ. Apoptóza byla potvrzena přímou detekci fluorescence koncově značené fragmentované genomové DNA. Pouze velmi málo infiltruj ících mononukleámích buněk bylo pozorováno v nádorech injikovaných H5.110Zz/FA/? nebo HS.IIOZacZ, což ukazuje, že buněčná imunitní odpověď nemusí hrát hlavní roli v regresi nádoru řízení H5.1 lOZz/FV/Zu tohoto modelu.

Oba pokusy ex vivo a in vivo ukázané výše měřily pouze přímý antiproliferační účinek interferonu. Protože se jedná o myši s imunodeficitem, není přítomna žádní imunostimulační aktivita interferonů, která by mohla stimulovat zničení nádoru. Také, protože interferony nejsou druhově zkřížené z člověka na myš, nečekalo by se, že by lidský INF-β používaný pro inhibici lidských rakovinných buněk u těchto myší inhiboval angiogenezi, protože lidský IFN-β nepůsobí na myší vaskulámí endotelové buňky. Tudíž je možné, že kdyby byli adenovirem s lidským IFN-β léčeni lidští pacienti, byla by pozorována dokonce dramatičtější protirakovinná aktivita. To by se mohlo modelovat na imunokompatentních primátech jiného než lidského původu. Jako alternativa by se u imunokompetentních myší s nádory myšího původu mohl použít adenovirus s myším genem IFN-β. Mnoho těchto syngenních modelů myších nádorů je k dispozici.

Data zde poskytnutí dokazují pozoruhodnou schopnost genové léčby IFN-β blokovat tvorbu nádorů de novo, a také způsobit regresi prokázaných nádorů. Transdukční pokusy ex vivo potvrdily, že zavedení silného sekretovaného proteinu do i tak málo jako 0,3 % - 1 % transdukovaných buněk blokovalo rozvod nádorů MDA-MBX68. Byla testována celá řada dalších nádorových buněčných linií, a zatímco zde byly rozdíly v síle účinku IFN-β, mohly být všechny blokovány 1-10 % buněk transdukovaných IFN-β. Relativně malé procento buněk sekretujících

-28CZ 299095 B6

IFN-β nezbytné pro ovlivnění tvorby nádoru bylo povzbuzující pro další pokus, kdy byly předem vytvořené nádory stimulovány přímou intratumorovou injekcí adenovirů. Účinek podání genu IFN-β byl při jedné injekci viru opět silný, což mělo za následek buď částečnou nebo v některých případech i úplnou regresi nádorů.

V těchto studiích se ukázalo, že dramatická regrese nádorů je primárně důsledkem přímé antiproliferační nebo cytotoxické aktivity IFN-β. Tento závěr byl podporován faktem, že gen IFN-β používaný v této studii je lidského původu, a lidský IFN-β nereaguje zkříženě s hostitelskými myšími buňkami. Také imunodeficitní nahé myši, které byly použity, postrádají T lymfocyty, hlavní efektorovou buňku v imunostimulaci indukované IFN typu 1 (Tough, D.F., et al., Science, 272, 1947-1950, 1996, Rogge, L., et al., J. Exp. Med., 195, 825-831, 1997). Kromě toho u nádorů rychle regredujících po podání genu IFN-β nebylo pozorováno zřetelné zvýšení infiltrace mononukleámích buněk typu nálezy podporují teorii, že samotná antiproliferační aktivita zprostředkovaná IFN-β byl mohla být postačující pro vyvolání nádorové regrese. Ukazuje se, že data vynálezu jsou konzistentní s dříve pozorovanou klinickou korelací mezi senzitivitou maligních buněk in vitro k antiproliferační aktivitě indukované IFN a léčebnému účinku in vivo (Einhom a Grander, J. Interferon Cytokine Res. 16, 275-281, 1996).

Lze shrnout, že bylo zjištěno, že genová terapie IFN-β zprostředkovaná adenovirem může v myších modelech uplatnit použitelný protinádorový účinek. Podávání genu IFN-β ex vivo ve velmi malém procentu buněk bylo postačující, aby blokovalo tvoření nádoru a přímé intratumorové podání genu IFN-β v jedné dávce vedlo k regresi prokázaných nádorů. Bez ohledu na jakoukoliv teorii účinku, tento výrazný protinádorový účinek může být důsledkem autokrinního a parakrinního působení IFN-β. Tento protinádorový účinek by mohl být kritický faktor v klinic25 kých zkouškách genové léčby rakoviny, ve kterých je pravděpodobné, že je limitující množství podávání genů a je nezbytný významný vedlejší účinek. Tudíž místní genová léčba IFN-β genem poskytuje slibnou strategii pro léčbu nádorů u lidí.

Ekvivalence

Je třeba chápat, že předchozí test je pouze detailním popisem některých výhodných provedení předkládaného vynálezu. Odborníkovi je proto zřejmé, že lze provést modifikovaná či ekvivalentní řešení vynálezu, která spadají do předmětu předkládaného vynálezu, definovaného připojenými nároky.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Buněčný systém pro genovou terapii rakoviny, který obsahuje: buňku savce a vektor v ní vložený, kterýžto vektor obsahuje polynukleotidovou sekvenci interferonu-beta kódující proteininterferon-beta, přičemž protein interferon-beta je exprimován tím, že polynukleotidová

   45 sekvence interferonu-beta je operativně spojena s promotorem, přičemž buňka je součástí množství buněk, a kde buněčný systém poskytuje účinnou genovou terapii i když ne více než 10 %, pokud jde o počet buněk, z množství buněk obsahuje vektor.
2. 2. Buněčný systém podle nároku 1, kde savec je člověk.
3. 3. Buněčný systém podle nároku 1, kde expresní vektor obsahuje virový vektor vybraný ze skupiny obsahující adeno-asociované virové vektory a adenovirové vektory, přičemž adenovirový vektor je vybrán ze skupiny obsahující a) adenovirový vektor mající deleci v genu El, b) adenovirový vektor mající deleci v genu El a deleci nebo mutaci v genu E2a, c) adenovirový

   -29CZ 299095 B6 vektor mající deleci jak v genu El tak i v genu E2 a d) adenovirový vektor mající deleci všech genů El, E2a, E3 a E4.
4. 4. Buněčný systém podle nároku 1, kde buněčný systém poskytuje účinnou genovou terapii
5. 5 i když ne více než 3,0 %, pokud jde o počet buněk, z množství buněk obsahuje vektor.

   5. Buněčný systém podle nároku 4, kde buněčný systém poskytuje účinnou genovou terapii i když ne více než 1,0 %, pokud jde o počet buněk, z množství buněk obsahuje vektor.

   10
6. 6. Buněčný systém podle nároku 5, kde buněčný systém poskytuje účinnou genovou terapii i když ne více než 0,3 %, pokud jde o počet buněk, z množství buněk obsahuje vektor.
7. 7. Buněčný systém podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, kde buňka je rakovinná buňka.

   15
8. 8. Buněčný systém podle nároku 7, kde rakovinná buňka je buňka rakoviny jater.
9. 9. Farmaceutický přípravek, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje buněčný systém podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   20
10. 10. Způsob výroby farmaceutického přípravku pro genovou terapii, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se a) připraví množství buněk téhož biologického druhu jako je příjemce přípravku pro genovou terapii, b) alespoň do jedné buňky z tohoto množství buněk se vnese vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci interferonu-beta kódující protein interferonu-beta, přičemž protein interferon-beta je exprimován tím, že polynukleotidová sekvence inter25 feronu-beta je operativně spojena s promotorem, a c) alespoň jedna buňka se umístí do farmaceuticky přijatelného nosiče, přičemž farmaceutický přípravek poskytuje účinnou genovou terapii i když ne více než 10 %, pokud jde o počet buněk, z množství buněk obsahuje vektor.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že vektor je adenovirový vektor.
12. 12. Způsob podle nároku 11,vyznačující se tím, že adenovirový vektor je vybrán ze skupiny obsahující a) adenovirový vektor mající deleci v genu El, b) adenovirový vektor mající deleci v genu El a deleci nebo mutaci v genu E2a, c) adenovirový vektor mající deleci jak v genu El tak i v genu E4 a d) adenovirový vektor mající deleci všech genů El, E2a, E3, a E4.