SK286821B6 - Bunkový systém na in vivo expresiu interferónu beta a farmaceutický prípravok obsahujúci tento systém - Google Patents

Abstract

Sú opísané spôsoby a farmaceutické prostriedky pre in situ modifikáciu buniek príjemcu, ktorým je cicavec, prostredníctvom DNA kódujúcej sekretovaný proteín, ako je napríklad interferón. Spôsob obsahuje vytvorenie expresného systému na sekretovaný proteín in vivo alebo ex vivo a podávanie expresného systému príjemcovi, ktorým je cicavec. Expresný systém a spôsoby sú užitočné na lokálne a systémového podávanie interferónov in situ.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka génovej terapie. Konkrétne sa vynález týka podávania DNA, ktorá kóduje sekretované proteíny, ako sú napr. interferónové proteíny, človeku alebo zvieraťu.

Doterajší stav techniky

Interferóny (tiež označované „IFN“) sú proteíny s radom biologických aktivít, z ktorých niektoré sú antivírusové, imunomodulačné a antiproliferatívne. Sú to relatívne malé, druhovo špecifické jednoreťazcové polypeptidy, tvorené v bunkách cicavcov, ktoré tak odpovedajú na expozíciu rôznymi induktormi, ako sú napr. vírusy, polypeptidy, mitogény a pod. Interferóny chránia cicavčie tkanivá a bunky proti napadnutiu vírusmi a sú dôležitou súčasťou hostiteľského obranného mechanizmu. Vo väčšine prípadov poskytujú interferóny lepšiu ochranu tým tkanivám a bunkám, v ktorých sa vytvorili, ako ostatným tkanivám a bunkám, čo ukazuje, že interferóny pochádzajúce z človeka budú účinnejšie pri liečení ochorení u človeka ako interferóny z iných biologických druhov.

Existuje niekoľko odlišných typov ľudských interferónov, ktoré sa všeobecne rozdeľujú na leukocytové (interferón-alfa [a]), fibroblastové (interferón-beta [β]) a imunitné (interferón-gama [γ]) a celý rad ich variantov. Všeobecnú diskusiu o interferónoch možno nájsť v mnohých odborných publikáciách, napr. „The Interferon Systém“ (W. E. Stewart, II., Springer Verlag, N. Y., 1979) a „Interľeron Therapy“ (World Health Organization Technical Reports Šerieš 676, WHO, Geneva, 1982).

Interferóny sú potenciálne využiteľné na liečenie mnohých druhov rakoviny, pretože majú protirakovinovú aktivitu, ktorá pôsobí na mnohých úrovniach. Po prvé, interferónové proteíny môžu priamo inhibovať proliferáciu ľudských nádorových buniek. Antiproliferatívna aktivita pôsobí synergicky s mnohými už používanými chemoterapeutickými činidlami, ako je cis-platina, 5FU a taxol. Po druhé, imunomodulačná aktivita interferónových proteínov môže indukovať protinádorovú imunitnú odpoveď. Súčasťou tejto odpovede je aktivácia NK buniek, stimulácia aktivity makrofágov a indukcia expresie MHC triedy I na povrchu, čo spôsobuje indukciu protinádorovej aktivity cytotoxických T lymfocytov. Okrem toho, niektoré štúdie ukazujú, že IFN-β má antiangiogénnu aktivitu. Angiogenéza, t. j. vytváranie nových krvných ciev, je kritická pre rast pevných nádorov. Dôkazy ukazujú, že IFN-β môže inhibovať angiogenézu tým, že inhibuje expresiu proangiogénnych faktorov, ako sú bFGF a VEGF. A nakoniec, interferónové proteíny môžu mierniť aj invazívnosť nádorov tým, že ovplyvňujú expresiu enzýmov ako kolagenáza a elastáza, ktoré sú dôležité pri pretváraní tkanív.

Interferóny majú tiež antivírusovú aktivitu, ktorá je založená na dvoch odlišných mechanizmoch. Napr. interferónové proteíny typ I (a a p) priamo inhibujú replikáciu ľudského vírusu hepatitídy B (HBV) a C (HCV), a tiež stimulujú imunitnú odpoveď namierenú proti bunkám infikovaným týmito vírusmi.

Aj napriek ich potenciálnemu terapeutickému využitiu mali interferónové proteíny iba obmedzenú klinickú úspešnosť proti vírusovej hepatitíde a tuhým nádorom. IFN-α bol schválený na liečenie tak HBV, ako aj HCV, ale odpovedavosť je v obidvoch prípadoch asi približne 20 %. Zatiaľ čo interferónové proteíny boli schválené na liečenie niektorých typov rakoviny, ako sú lymfómy, leukémie, melanómy a karcinóm obličkových buniek, väčšina klinických skúšok, keď sa interferóny použili buď samotné, alebo v kombinácii s konvenčnými chcmoterapeutikami pri liečení tuhých nádorov, nebola úspešná.

Spôsob podávania interferónu je dôležitým faktorom pri klinickom použití tohto dôležitého terapeutického činidla.

Systémové podávanie interferónu, či už intravenóznou, intra-muskulárnou alebo subkutánnou injekciou, bolo najčastejšie používaným a do istej miery úspešným spôsobom pri liečení leukémie vlasatých buniek, syndrómu získanej imunodeficiencie (AIDS) a s tým súvisiaceho Kaposiho sarkómu. Ale je známe, že proteíny v ich purifikovanej forme sú osobitne náchylné na degradáciu. Konkrétne pri interferóne-beta je primárnym mechanizmom degradácie interferónu v roztoku agregácia a deaminácia. Nedostatočná stabilita interferónu v roztoku či v iných produktoch veľmi obmedzuje možnosti využitia. Okrem toho po parenterálnom podaní interferónového proteínu (t. j. intramuskuláme, subkutánne alebo intravenózne) sa prejavuje veľmi rýchla clearance interferónu. Preto parenterálne podanie proteínu nezaistí lokalizáciu dostatočného množstva interferónu v aktívnom mieste (tuhý nádor alebo pečeň v prípade hepatitídy). Množstvo interferónu, ktoré sa môže podať parenterálne, je obmedzené vedľajšími účinkami, ktoré sa pozorujú pri vyšších dávkach interferónu. Je teda evidentne potrebná účinnejšia terapia.

Podstata vynálezu

Predkladaná prihláška smeruje k riešeniu toho, ako eliminovať problémy spojené s aplikáciou sekretovaných proteínov, ako je napr. interferón, ako liečiva. Predkladaný vynález sa preto týka spôsobu interferónovej terapie, keď sa namiesto samotného proteínu aplikuje do organizmu gén kódujúci sekretovaný proteín.

Jeden predmet predkladaného vynálezu sa teda týka spôsobu génovej terapie, ktorý je založený na použití geneticky upravených buniek a ich využití na prenos sekretovaného proteínu do príjemcu, ktorým je cicavec. Predkladaný vynález poskytuje spôsob prípravy bunkového expresného systému, takto vytvorený expresný systém a farmaceutický prípravok obsahujúci takýto expresný systém. Bunkový expresný systém exprimuje gén, ktorý kóduje jeden alebo niekoľko sekretovaných proteínov, a je užitočný ako nosič na prenos génového produktu do cicavčieho príjemcu in situ. Vo výhodnom uskutočnení je príjemcom, ktorý je cicavec, človek.

Iné uskutočnenie predkladaného vynálezu opisuje bunkový expresný systém na expresiu interferónového proteínu in vivo v bunke cicavčieho príjemcu na liečenie ochorenia. Expresný systém obsahuje bunky toho istého biologického druhu, ako je cicavčí príjemca a expresný vektor nachádzajúci sa v nich na expresiu interferónového proteínu. Výhodne je cicavčím príjemcom človek a expresný vektor obsahuje vírusový vektor.

V inom uskutočnení vynálezu expresný systém obsahuje množstvo buniek toho istého biologického druhu ako cicavčí príjemca a expresný vektor nachádzajúci sa v týchto bunkách na expresiu sekretovaného proteínu. Pritom expresný vektor sa nachádza iba v časti z mnohých buniek. Výhodne aspoň 0,3 % z celkového počtu buniek obsahuje vektor. Výhodný sekretovaný proteín je interferón beta, gama a konvenčný interferón, najvýhodnejšie interferón beta.

V inom uskutočnení bunkový expresný systém obsahuje množstvo rakovinových buniek a aspoň časť týchto buniek obsahuje adenovírusový vektor obsahujúci izolovaný polynukleotid kódujúci expresiu interferónu. V tomto bunkovom expresnom systéme sú adenovírusové vektory vybraté zo skupiny obsahujúcej: a) adenovírusový vektor s deléciou a/alebo mutáciou v géne El, b) adenovírusový vektor s deléciou a/alebo mutáciou v géne E2, pričom vektor exprimuje ľudský interferón beta, c) adenovírusový vektor s deléciou a/alebo mutáciou tak v géne El ako aj v E4 a d) adenovírusový vektor s deletovanými všetkými génmi, pričom vektor exprimuje ľudský interferón beta.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež farmaceutický prípravok na podanie sekretovaného proteínu na určené miesto v príjemcovi, ktorýmje cicavec. Prípravok obsahuje nosič a množstvo geneticky modifikovaných buniek toho istého biologického druhu, ako je cicavčí príjemca, pričom aspoň časť buniek obsahuje expresný vektor na expresiu účinného množstva sekretovaného proteínu. Výhodný sekretovaný proteín je interferón. Prípravok zahrnuje prípravok tak na podávanie in vivo, ako aj na prenos in vitro.

Ďalším predmetom predkladaného vynálezu je spôsob prípravy farmaceutického prípravku ex vivo na podanie cicavčiemu príjemcovi pri génovej terapii. Tento spôsob obsahuje kroky, keď sa: a) pripraví množstvo buniek toho istého biologického druhu, ako je cicavčí príjemca, b) aspoň do jednej bunky z tohto množstva buniek sa vnesie expresný vektor na expresiu sekretovaného proteínu, aby sa vytvorila aspoň jedna geneticky modifikovaná bunka a c) aspoň jedna geneticky modifikovaná bunka sa umiestni do farmaceutický prijateľného nosiča, aby sa tak získal farmaceutický prípravok, ktorý je vhodný na podávanie do miesta v cicavčom príjemcovi.

Ďalším uskutočnením predkladaného vynálezu je spôsob génovej terapie, ktorý obsahuje genetickú modifikáciu aspoň jednej bunky cicavčieho príjemcu prostredníctvom nasledovných krokov: a) aspoň do jednej bunky sa vnesie expresný vektor na expresiu sekretovaného proteínu, aby sa vytvorila aspoň jedna geneticky modifikovaná bunka a b) geneticky modifikovanej bunke sa umožní, aby sa dostala do kontaktu s miestom v cicavčom príjemcovi. Spôsob môže ďalej prípadne obsahovať krok, keď sa z cicavčieho príjemcu odstráni aspoň jedna bunka predtým, ako sa vnesie expresný vektor. V ďalšom uskutočnení krok vnesenia vektora obsahuje vnesenie vektora iba do časti z množstva buniek.

Ďalším uskutočnením predkladaného vynálezu je spôsob génovej terapie ex vivo, ktorý obsahuje kroky, keď sa zo subjektu vyberie množstvo buniek, podá sa rekombinantný adenovírus do aspoň jednej bunky z tohto množstva buniek tak, že existuje nadbytok buniek neobsahujúcich adenovírus. Adenovírus má deléciu v géne El a obsahuje izolovaný polynukleotid kódujúci sekretovaný proteín. Toto množstvo buniek sa potom vnesie späť do subjektu.

Kroky v spôsobe génovej terapie in vivo obsahujú podanie adenovirusového vektora, ktorý obsahuje izolovaný polynukleotid kódujúci proteín ľudského interferónu-beta (β), priamo do buniek subjektu, pričom sa bunky predtým nevyberali zo subjektu. Spôsoby in vivo a ex vivo umožňujú topické, intraokulárne, parenterálne, intranazálne, intratracheálne, intrabronchiálne, intramuskulárne, subkutánne, intravenózne a intraperitoneálne podanie.

Predkladaný vynález poskytuje rad výhod. Interferónová génová terapia umožňuje aplikovať veľmi vysokú lokálnu koncentráciu interferónu s veľmi nízkymi systémovými hladinami. To spôsobuje dosiahnutie vysokej účinnosti pri minimálnych vedľajších účinkoch. Interferóny podávané génovou terapiou budú tiež prítomné v značne vyrovnanej konštantnej hladine, na rozdiel od situácie pri liečení interferónovým proteínom, keď sa pozorujú značné „výrony“ interferónu alebo vrcholy v koncentrácii proteínov (ktoré môžu spôsobovať až toxicitu) nasledujúce po injekcii proteínu, po ktorých nasledujú veľmi nízke hladiny, keď je koncentrácia interferónu pravdepodobne príliš nízka na to, aby bola účinná.

Pohodlie pacienta je tiež dôležitým faktorom. Zatiaľ čo pri proteínovej terapii sú nutné časté injekcie interferónu, jediné podanie alebo niekoľko nie príliš častých podaní vektora exprimujúceho interferónový gén poskytne dlhodobo stálu produkciu požadovaného proteínu. Génová terapia umožňuje podanie interferónu riadeným spôsobom do určitého cieľového orgánu alebo do nádoru. Môže sa vytvoriť taký autokrinný systém, keď tie isté bunky exprimujú, sekretujú a prijímajú interferón. Môžu sa tiež dosiahnuť veľmi vysoké dávky interferónu. Takto vysoké dávky sa nemôžu dosiahnuť parenterálnym podávaním proteínu z dôvodov toxicity.

Keďže interferónové proteíny sú sekretované z buniek, každá bunka nádoru alebo hepatitídou infikovanej pečene sa nemusí transdukovať génom interferónu. Tie bunky, do ktorých sa nedostane gén, budú pod vplyvom susedných buniek (tzv. „bystander effect“), ktoré obsahujú gén a sekretujú interferónový proteín. To je veľmi významné zistenie a bude mať veľmi vážne dôsledky na liečebný režim, pretože nie je nutné, aby každá bunka z celkového masy nádoru alebo orgánu obsahovala expresný vektor.

Ukázalo sa, že parenterálne podávanie interferónu spôsobuje tvorbu anti-interferónových protilátok. Je možné, že táto odpoveď potenciálne neutralizačných protilátok bude zmenšená po vnesení génu pre interferón do určitej lokálnej oblasti. Okrem toho, že sa bude interferón exprimovať lokálne, bude sa tvoriť endogénnymi ľudskými bunkami, preto budú jeho štruktúra i glykozylácia bližšie prirodzenému stavu, a preto tiež menej imunogénny ako interferón produkovaný v baktériách, kvasinkách alebo bunkách vaječníkov čínskeho škrečka, purifikovaný a podávaný parenterálne injekciou.

Tieto a ďalšie výhody predkladaného vynálezu budú zreteľnejšie na základe detailného opisu výhodných uskutočnení vynálezu a priložených obrázkov.

Opis výhodných uskutočnení vynálezu

Predkladaný vynález je založený čiastočne na vývoji metódy génovej terapie ex vivo, ktorá využíva bunky, ktoré 1. sa môžu ľahko získať od pacienta, 2. môžu sa modifikovať in vitro vnesením genetického materiálu, 3. môžu sa pohodlne implantovať príjemcovi, 4. nie sú trombogénne a 5. môžu sa implantovať príjemcovi vo veľkom množstve. Génová terapia in vivo podľa predkladaného vynálezu využíva bunky, ktoré 1. sú prítomné v príjemcovi a 2. môžu sa in situ modifikovať, aby exprimovali izolovaný genetický materiál. Geneticky modifikované bunky obsahujú regulačné prvky na riadenie množstva genetického materiálu, ktoré sa exprimuje.

Geneticky modifikované bunky prežívajú a produkujú exprimovaný materiál in situ čas nutný na to, aby exprimovaný materiál prejavil prospešný (t. j. liečebný) účinok bez nežiaduceho narušenia normálnej funkcie tkaniva, kde sú bunky lokalizované.

Výhodne je exprimovaným materiálom sekretovaný proteín (ďalej podrobnejšie definovaný). Najvýhodnejšie je sekretovaným proteínom interferón. Skutočne, aj keď interferóny sú najvýhodnejším terapeutickým činidlom, našiel sa všeobecný terapeutický princíp aplikovateľný na génovú terapiu s akýmkoľvek sekretovaným proteínom. Zistilo sa, vďaka tomu, že sekretované proteíny, ako sú napr. interferóny, sú uvoľňované z buniek, v ktorých sa exprimujú, nemusí byť každá bunka z celkovej masy nádoru, alebo napr. hepatitídou infikovanej pečene, transdukovaná génom pre sekretovaný proteín. Tie bunky, do ktorých sa nedostane gén, budú pod vplyvom susedných buniek (tzv. „bystander effect“), ktoré obsahujú gén a sekretujú interferónový proteín. Aj keď je opísaná génová terapia s izolovaným polynukleotidom, ktorý kóduje expresiu interferónov, akýkoľvek sekretovaný proteín (ako je definovaný ďalej) sa môže potenciálne využiť v metóde alebo prípravku podľa vynálezu. Všetky citované publikácie v tomto texte sú do prihlášky zahrnuté formou odkazov.

I. Definície „Génová terapia“ je postup, ktorým sa fenotyp spojený s chorobou „opraví“ tým, že sa vnesie genetická informácia do organizmu trpiaceho chorobou.

„Génová terapia ex vivo“ je postup, pri ktorom sa zo subjektu vyberú bunky a kultivujú sa in vitro. Polynukleotid ako napr. funkčný gén sa vnesie do buniek in vitro, modifikované bunky sa namnožia v kultúre a potom sa implantujú späť do subjektu.

„Génová terapia in vivo“ je postup, pri ktorom sa cieľové bunky nevyberajú zo subjektu, ale prenášaný polynukleotid (napr. gén kódujúci expresiu interferónu) je vnesený do buniek príjemcovho organizmu in situ, t. j. vnútri príjemcu. Génová terapia in vivo sa skúmala na niekoľkých zvieracích modeloch a súčasné odborné publikácie opisujú možnosť priameho prenosu in situ do orgánov a tkanív.

Termín „stavy vhodné na génovú terapiu“ zahrnuje patologické stavy ako sú genetické choroby (t. j. choroby, ktoré sú dôsledkom jedného alebo viacerých defektov génov), získané choroby (t. j. patologické stavy, ktoré nie sú dôsledkom vrodenej chyby), rôzne typy rakovinových ochorení, a tiež príslušné profylaktické procesy (t. j. prevencii ochorení alebo nežiaducich stavov).

„Získaná choroba“ označuje chorobu alebo syndróm, ktoré sa prejavujú nenormálnym fyziologickým, biochemickým, bunkovým, štruktúrnym alebo molekulárnobiologickým stavom.

„Polynukleotid“ je polymér monomémych jednotiek nukleovej kyseliny, keď monoméme jednotky sú buď ribonukleové kyseliny (RNA), alebo deoxyribonukleové kyseliny (DNA), alebo ich kombinácie. Štyri bázy prítomné v DNA sú adenín (A), guanín (G), cytozín (C) a tymín (T). Štyri bázy DNA sú A, G, C a uracil (U).

Termín „izolovaný“ znamená, pokiaľ sa týka polynukleotidových sekvencií génov, ktoré kódujú interferón, RNA alebo DNA polynukleotid, časť genómového polynukleotidu, cDNA alebo syntetický polynukleotid, ktorý v dôsledku svojho pôvodu alebo zaobchádzania s ním: (I) nie je spojený so všetkými polynukleotidmi, s ktorými je spojený v prírode (napr. je prítomný v hostiteľskej bunke ako časť expresného vektora), (II) je spojený s nukleovou kyselinou alebo inou chemickou skupinou, ktoré sa odlišujú od tých, s ktorými je spojený v prírode, alebo (III) nevyskytuje sa v prírode. Ako „izolovaná“ sa ďalej označuje polynukleotidová sekvencia (I) amplifikovaná in vitro napr. metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), (II) syntetizovaná chemicky, III) purifikovaná, napr. štiepením a gélovou separáciou.

Takže k „izolovaným“ interferónovým polynukleotidom patria napr. nukleové kyseliny nevyskytujúce sa prirodzene, ktoré sa môžu ľahko transkribovať do „anti-sense“ RNA, a tiež gén kódujúci interferónový proteín, ktorý sa v prirodzene sa vyskytujúcich bunkách neexprimuje alebo sa exprimuje v biologicky nevýznamnom množstve. Na ilustráciu, syntetický alebo prirodzený gén kódujúci ľudský interferón-beta 1A by sa považoval za izolovaný vzhľadom na mozgové bunky človeka, pretože tieto bunky prirodzene neexprimujú interferón beta 1A. Ešte ďalším príkladom izolovaného polynukleotidu je použitie iba časti interferónového génu na vytvorenie rekombinantného génu, ako je napr. kombinácia indukovateľného promótora so sekvenciou kódujúcou endogénny interferón prostredníctvom homologickej rekombinácie.

„Gén“ je sekvencia DNA (t. j. lineárne usporiadanie nukleotidov spojených navzájom 3'-5'pentózofosfodiesterovou väzbou), ktorá kóduje prostredníctvom mRNA aminokyselinovú sekvenciu špecifického proteínu.

„Transkripcia“ je proces, ktorým vzniká z génu mRNA.

„Translácia“ je proces, ktorým vzniká z mRNA proteín.

„Expresia“ je proces, v ktorom zo sekvencie DNA alebo génu vzniká proteín, zahrnujúci tak transkripciu ako aj transláciu.

Termín „inhibujúci rast“ sa tu používa na označenie inhibície rastu cieľových buniek (napr. nádoru) a inhibicia transformovaného fenotypu (merané napr. zmenami v morfológii).

„Aminokyselina“ je monoméma jednotka peptidu, polypeptidu alebo proteínu. Existuje dvadsať L-izomérov aminokyselín. Patria sem tiež analógy aminokyselín a D-izoméry aminokyselín tvoriace proteíny a ich analógy.

„Proteín“ je polymér zložený v podstate z ktorýchkoľvek z dvadsiatich proteínových aminokyselín, bez ohľadu na jeho veľkosť. Aj keď termín „polypeptid“ sa často používa na označenie relatívne veľkých polypeptidov a termín „peptid“ sa často používa na označenie relatívne malých polypeptidov, použitie týchto termínov v odbore sa často prekrýva a je odlišné. V tomto texte sa používa termín „proteín“ na označenie peptidov, proteínov aj polypeptidov, pokiaľ nie je uvedené inak.

„Sekretovaný proteín“ je proteín, ktorý je transportovaný zvnútra bunky do okolia bunky, k sekretovaným proteínom patri veľký počet rastových faktorov a imunomodulačných proteínov, ako sú napr. rôzne interferóny (α,β,γ), interleukíny, ako IL-1, -2, -4, -8 a 12 a rastové faktory, ako GM-CSF a G-CSF.

„Genetická fúzia“ označuje kolineáme kovalentné spojenie dvoch alebo viacerých proteínov prostredníctvom ich jednotlivých peptidových kostier, a to tým, že sa exprimuje polynukleotidová molekula kódujúca tieto proteíny.

„Mutácia“ (a tiež „mutant“) označuje akúkoľvek zmenu v kvalite alebo štruktúre genetického materiálu organizmu, konkrétne akákoľvek zmena (t. j. delécia, substitúcia, adícia alebo alterácia) v géne interferónu divého typu alebo akúkoľvek zmenu v interferónovom proteíne divého typu.

„Divý typ“ je prirodzene sa vyskytujúca polynukleotidová alebo aminokyselinová sekvencia interferónového génu alebo proteínu, tak ako sa vyskytuje in vivo.

„Štandardné hybridizačné podmienky“ sú podmienky určené koncentráciou soli a teplotou v podstate zhodné s podmienkami 0,5 x SSC až 5 x SSC a 65 °C tak pre hybridizáciu, ako aj pre premývanie. Termín „štandardné hybridizačné podmienky“ tu používaný je preto operačná definícia zahrnujúca rad hybridizácií. Podmienky s vysokou stringenciou (prísnosťou) môžu napr. zahrnovať hybridizáciu v pufri na skríning plakov (0,2 % polyvinylpyrolidón), 0,2 % Ficoll 400, 0,2 % hovädzí sérový albumín, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5), IM NaCl, 0,1 % hydrogénfosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10 % dextránsulfátom a 100 pg/ml denaturovanej sonikovanej DNA zo spermií lososa pri 65 °C počas 12 až 20 hodín a premývaní v 75 mM NaCl/7,5 mM citrónan sodný (0,5 x SSC)/1 % SDS pri 65 °C. Podmienky s nízkou stringenciou môžu napr. zahrnovať hybridizáciu v pufri pre skríning plakov s 10 % dextránsulfátom a 110 pg/ml denaturovanej sonikovanej DNA zo spermií lososa pri 55 °C počas 12 až 20 hodín z premývaní v 300 mM NaCl/30 mM citrónan sodný (2 x x SSCJ/1 % SDS pri 55 °C.

„Expresná kontrolná sekvencia“ je sekvencia nukleotidov, ktorá riadi a reguluje expresiu génov, keď je s génmi operatívne spojená.

„Operatívne spojená“ znamená, že polynukleotidová sekvencia je „operatívne spojená“ s expresnou kontrolnou sekvenciou, keď expresná kontrolná sekvencia riadi a reguluje transkripciu a transláciu tejto polynukleotidovej sekvencie. Termín „operatívne spojená“ znamená, že pred polynukleotidovou sekvenciou, ktorá sa má exprimovať, je vhodný štartovací signál (napr. ATG), a že sekvencia je v správnom čítacom rámci, ktorý umožňuje expresiu polynukleotidovej sekvencie a teda produkciu požadovaného interferónu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvenciou.

„Expresný vektor“ je polynukleotid, väčšinou DNA plazmid (ale tiež to môže byť vírus), ktorý umožňuje expresiu aspoň jedného génu, keď je vektor vnesený do hostiteľskej bunky. Vektor môže ale nemusí byť schopný replikácie v hostiteľskej bunke.

„Nádor“ označuje akúkoľvek nežiaducu proliferáciu buniek. Nádorový rast zahrnuje tak malígne ako aj nemalígne nádory, pevné alebo kvapalné nádory, karcinómy, myelómy. sarkómy, leukémie, lymfómy a ďalšie neoplázie a rakovinové a tumorogénne stavy.

„Geneticky modifikovaná bunka“ (tiež nazývaná „bunkový expresný systém“) obsahuje bunku a expresný vektor na expresiu interferónového proteínu. Na ex vivo účely sú geneticky modifikované bunky vhodné na podávanie cicavčiemu hostiteľovi, kde buď nahradí, alebo existujú súčasne s endogénnymi bunkami príjemcu. Na účely in vivo sa modifikované bunky vytvárajú priamo v príjemcovi.

Predkladaný vynález poskytuje tiež rôzne spôsoby na prípravu a použitie už opísaných geneticky modifikovaných buniek. Konkrétne vynález poskytuje spôsob genetickej modifikácie buniek cicavčieho príjemcu ex vivo a podávanie geneticky modifikovaných buniek cicavčiemu príjemcovi. Vo výhodnom uskutočnení génovej terapie ex vivo sú bunkami autológne bunky, t. j. bunky odobraté z cicavčieho príjemcu. Termín „odobraté“ znamená bunku alebo množstvo buniek, ktoré boli odobraté či vybraté z miesta ich prirodzeného výskytu v tele. Spôsoby odoberania buniek pacientovi, a tiež spôsoby udržiavania izolovaných buniek v kultúrach, sú odborníkovi známe (Stylianou, E. a kol., Kidney Intl. 37: 1563-1570, 1992, Hjelle, J.H. a kol., Peritoneal Dialysis Intl. 9: 341-347, 1989, Heldin, P., Biochem. J. 283: 165-170, 1992, DiPaolo, N. a kol., Int. J. Art. Org. 12: 485-501, DiPaolo, N. a kol., Clinical Nephrol. 34: 1791848, 1990, DiPaolo, N. a kol., Nephron 57: 323-331, 1991. Všetky skôr aj ďalej citované patenty, patentové prihlášky a odborné publikácie sú tu zahrnuté formou odkazov.

II. Izolovanie interferónových polynukleotidov „Interferón“ (skrátene označovaný IFN) je malý, druhovo špecifický, jednoreťazcový polypeptid, tvorený v bunkách cicavcov ako reakcia na expozíciu rôznym induktorom, ako sú vírusy, polypeptidy, mitogény a pod. Výhodne interferóny sú v rekombinantnej forme, pričom metódy prípravy proteínov technikami rekombinantnej DNA sú známe, vrátane prípravy rôznych interferónov, a nijako neobmedzujú predkladaný vynález, pozri napr. patenty U.S. č. 4 399 216, 5 149 636 a 5 179 017 (Axel a kol.) a 4 470 461 (Kaufman). Boli pripravené rekombinantne formy interferónu alfa, beta, gamma a konvenčného interferónu. Tieto formy sa môžu exprimovať z buniek, ktoré obsahujú polynukleotidové sekvencie kódujúce varianty, ako sú mutanty bez cysteínov (napr. pre interferón beta) a mutanty bez metionínu. Ďalšie modifikácie sa môžu uskutočniť prostredníctvom posttranslačného opracovania v hostiteľskej bunke. Presná chemická štruktúra konkrétneho interferónu je teda závislá od niekoľkých faktorov a nijako neobmedzuje predmet predkladaného vynálezu. Všetky takéto proteíny nachádzajúce sa v prípravkoch podľa vynálezu si udržia svoju biologickú aktivitu, pokiaľ sa dostanú do vhodného prostredia.

Výhodné polynukleotidy, ktoré sa môžu použiť podľa predkladaného vynálezu, sa odvodili zo sekvencií interferónu divého typu rôznych stavovcov, výhodne cicavcov, a získali sa metódami, ktoré sú odborníkovi známe. Pozri napr. patent U.S. 5 641 656 (udelený 24.6.1997), DNA kódujúca vtáčí interferónový preproteín typ I a zrelý vtáčí interferón typ I, patent U.S. 5 605 688 (25. februára 1997 - rekombinantné psie a konské interferóny typ I), patent U.S. 5 554 513 (10. september 1996 -DNA sekvencia kódujúca ľudský interferón beta2A), patent U.S. 5 541 513 (10. júl 1996 - DNA sekvencia kódujúca ľudský fibroblastový polypeptid interferónu beta2A), patent U.S. 5 231 176 (27. júl 1993 - DNA molekula kódujúca ľudský leukocytový interferón), patent U.S. 5 071 761 (10. december 1991 - DNA sekvencie kódujúca subsekvencie ľudských lymfoblastoidných interferónov LyIFN-alfa-2 a LyIFN-alfa-3), patent U.S. 4 737 931 (19. apríl 1988 - DNA sekvencia obsahujúca gén ľudského interferónu beta), patent U.S. 4 456 748 (26. jún 1984 - DNA sekvencie kódujúce subsekvencie rôznych prirodzene sa vyskytujúcich leukocytových interferónov).

Mutantní členovia rodiny interferónových génov sa tiež môžu použiť podľa vynálezu. Mutácie v polynukleotidovej sekvencií interferónu divého typu sa pripravujú v odbore známymi metódami cielenej mutagenézy. Termín „mutant“ tiež zahrnuje genetické fúzie, takže za „mutantné“ sekvencie sa môžu považovať aj nasledujúce sekvencie interferónov:

Patent U.S. 5 273 889 (28. Decembra 1993 - DNA konštrukt obsahujúci gén interferónu gamma spojený so sekvenciou kódujúcou imunogénny leukotoxin), patent U.S. 4 959 314 (25. september 1990 - gén s DNA sekvenciou, ktorá kóduje syntetický muteín biologicky aktívneho natívneho proteínu), patent U.S. 4 929 554 (29. máj 1990 - DNA kódujúca des-Cys-Tyr-Cys rekombinantný ľudský imunitný interferón), patent U.S. 4 914 033 (3. apríl 1990 - DNA molekula kódujúca modifikovaný interferón-beta obsahujúci interferón beta) a patent U.S. 4 569 908 (11. február 1986 - DNA molekula so sekvenciou, ktorá kóduje viactriedny hybrid interferónového polypeptidu).

Okrem toho, izolované polynukleotidy opísané v uvedených patentoch sa môžu zmeniť tak, aby poskytli funkčne ekvivalentné polypeptidy. Polynukleotid je „íúnkčne ekvivalentný“ v porovnaní s polynukleotidom s už uvedenými sekvenciami, pokiaľ spĺňa aspoň jednu z nasledovných podmienok:

a) „funkčne ekvivalentný“ je polynukleotid, ktorý hybridizuje s ktoroukoľvek predchádzajúcou sekvenciou pri štandardných podmienkach a/alebo je degenerovaný vzhľadom na ktorékoľvek predchádzajúce sekvencie, najvýhodnejšie kódujúce mutantný interferón s terapeutickou aktivitou interferónu divého typu,

b) „funkčne ekvivalentný“ je polynukleotid, ktorý kóduje expresiu aminokyselinovej sekvencie kódovanej polynukleotidom s ktoroukoľvek z predchádzajúcich interferónových sekvencií.

Môže sa teda zhrnúť, že termín „interferón“ zahrnuje, ale nie obmedzený iba na ne, všetky činidlá uvedené v predchádzajúcom texte a ich funkčné ekvivalenty. Termín „funkčné ekvivalenty“ sa týka interferónového proteínu alebo polynukleotidu kódujúceho interferónový proteín, ktoré majú rovnaký alebo lepší prospešný účinok na cicavčieho príjemcu ako pôvodný interferón, ku ktorému sa funkčný ekvivalent vzťahuje. Odborníkovi je zrejmé, že funkčne ekvivalentný proteín sa môže pripraviť rekombinantnou technikou, t. j. expresiou „funkčne ekvivalentnej“ DNA. Teda predmetom predkladaného vynálezu sú tiež interferóny kódované prirodzene sa vyskytujúcou DNA, a tiež kódované DNA, ktorá sa prirodzene nevyskytuje, ale kóduje rovnaký proteín, ako je kódovaný prirodzene sa vyskytujúcou DNA.

Vďaka degenerácii nukleotidových kódujúcich sekvencií sa môžu použiť iné polynukleotidy na kódovanie interferónov. K nim patria celé alebo časti uvedených sekvencií, ktoré sa zmenili substitúciou rôznych kodónov, ktoré kódujú rovnaký aminokyselinový zvyšok v sekvencií, ide teda o umlčanú zámenu. Takéto zmenené sekvencie sa považujú za ekvivalenty týchto sekvencií. Napr. Phe (F) je kódovaný dvoma kodónmi, TTC alebo TTT, Tyr (Y) je kódovaný TAC alebo TAT a His (H) je kódovaný CAC alebo CAT. Na druhej strane Trp (W) je kódovaný jediným kodónom TGG. Teda je jasné, že pre danú sekvenciu DNA kódujúcu konkrétny interferón existuje mnoho degenerovaných sekvencií, ktoré ho kódujú. Tieto degenerované sekvencie sú tiež zahrnuté vo vynáleze.

„Konvenčný“ („consensus“) interferón tiež patrí pod uvedenú definíciu. Termín „konvenčný interferón“ sa tu používa na označenie polypeptidu, ktorý sa prirodzene nevyskytuje, ale ktorý prevažne obsahuje aminokyselinové zvyšky spoločné všetkým prirodzene sa vyskytujúcim ľudským sekvenciám subtypov interferónov, pričom obsahuje v jednej alebo viac takýchto pozícií, kde nie je žiadna aminokyselina spoločná všetkým subtypom, aminokyselinu, ktorá sa nevyskytuje v tejto pozícii prevažne a v žiadnom prípade neobsahuje aminokyselinu, ktorá sa v tejto pozícii nevyskytuje aspoň pri jednom prirodzene sa vyskytujúcom subtype. Konvenčné interferónové sekvencie zahrnujú konvenčné sekvencie všetkých uvedených interferónov za predpokladu, že majú sekvencie subtypov. Príklady konvenčných interferónových sekvencií sú uvedené v patentoch U.S. 4 695 623 a 4 897 471 (Amgen). DNA sekvencie kódujúce konvenčné interferónové polypeptidy sú výhodne produktmi expresie pripravených sekvencií DNA, transformovaných alebo transfekovaných do hostiteľa, ako sa opisuje v tejto prihláške. To znamená, že výhodné konvenčné interferóny sú produkované rekombinantným spôsobom. Takéto materiály sa potom môžu purifikovať štandardnými postupmi odborníkovi známymi.

Už opísané interferóny a stavy vhodné pre génovú terapiu sú ilustratívne a nijako neobmedzujú predmet predkladaného vynálezu. Výber vhodného interferónu na liečenie známej choroby je v rámci rutinnej činnosti odborníka bez neprimeraného experimentovania.

III. Spôsoby vnášania polynukleotidových sekvencií pre sekretované proteíny do buniek

Termín „transformovať“ alebo „transformácia“ sa týka akýchkoľvek genetických modifikácií buniek a zahrnuje tak „transfekciu“ ako aj „transdukciu“.

„Transfekcia buniek“ označuje získanie nového genetického materiálu bunkami tým, že sa do buniek vnesie dodatočná DNA. Takže transfekcia sa týka vloženia nukleovej kyseliny (napr. DNA) do bunky pomocou fyzikálnej alebo chemickej metódy. Odborníkom je známych niekoľko techník transfekcie, ku ktorým patria napr.: koprecipitácia DNA s fosfátom draselným (pozri Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer And Expression Protocols, ed. E. J. Murray, Humana Press, 1991), metóda s DEAE-dextránom (pozri už uvedenú citáciu), elektroporácia (pozri skôr), transfekcia sprostredkovaná katiónovými lipozómami (pozri skôr) a ostreľovanie mikročasticami wolfrámu (Johnston, S. A., Náture - 346: 776-777, 1990) a koprecipitácia DNA s fosfátom strontnatým (Brash, D. E. a kol., Molec. Celí. Biol. 7: 3031-2034, 1987). Každá z týchto metódje v odbore dobre známa.

Na rozdiel od toho, „transdukcia buniek“ sa týka procesu prenosu nukleových kyselín do bunky pomocou RNA alebo DNA vírusov. Jedna alebo niekoľko izolovaných polynukleotidových sekvencii, ktoré kódujú jeden alebo niekoľko interferónových proteínov, sa nachádza vo víruse a môže sa vložiť do chromozómu transdukovanej bunky. Alternatívne sa bunka transdukuje vírusom, ale pritom nebude mať izolovaný polynukleotid inkorporovaný v svojich chromozómoch, ale bude schopná extrachromozomálne exprimovať interferón vnútri bunky.

Podľa jedného uskutočnenia vynálezu sú bunky transformované (t. j. geneticky modifikované) ex vivo. Bunky sú izolované z cicavca (výhodne človeka) a transformované (t. j. transdukované alebo transfekované in vitro) vektorom obsahujúcim izolovaný polynukleotid, ako je napr. rekombinantný gén operatívne spojený s jednou alebo niekoľkými expresnými kontrolnými sekvenciami pre expresiu rekombinantného sekretovaného proteínu (napr. interferónu). Bunky sa potom podajú cicavčiemu príjemcovi na to, aby tvorili proteín in situ. Výhodne je cicavčím príjemcom človek a modifikované bunky sú autológne bunky, t. j. bunky izolované z cicavčieho príjemcu. Izolácia a kultivácia buniek in vitro už boli opísané v odbornej literatúre.

Podľa iného uskutočnenia vynálezu sa bunky transformujú alebo inak geneticky modifikujú in vivo. Bunky z cicavčieho príjemcu (výhodne človeka) sa transformujú (t. j. transdukujú alebo transfekujú) in vivo vektorom, ktorý obsahuje izolovaný polynukleotid, ako je rekombinantný gén operatívne spojený s jednou alebo niekoľkými expresnými kontrolnými sekvenciami, na expresiu rekombinantného sekretovaného proteínu (napr. rekombinantného interferónu) a proteín sa potom podáva in situ.

Izolovaný polynukleotid kódujúci sekretovaný proteín (napr. cDNA kódujúcu jeden alebo niekoľko terapeutických interferónových proteínov) sa vnesie do bunky ex vivo alebo in vivo spôsobom na prenos génov, ako je napr. transfekcia alebo transdukcia, čím vznikne geneticky modifikovaná bunka. Rôzne expresné vektory (t. j. nosiče na uľahčenie prenosu izolovaného polynukleotidu do cieľovej bunky) sú odborníkovi známe.

Vnesený genetický materiál typicky obsahuje izolovaný polynukleotid, ako je napr. interferónový gén (zvyčajne vo forme cDNA obsahujúcej exóny kódujúce interferón) spoločne s promótorom na kontrolu transkripcie nového génu. Promótor má typicky špecifickú nukleotidovú sekvenciu nutnú na iniciáciu transkripcie. Prípadne môže genetický materiál obsahovať intrónové sekvencie, ktoré sa odstránia zo zrelého transkriptu zostrihom RNA. Na 3'-konci génu, ktorý sa má exprimovať, by mal byť prítomný polyadenylačný signál. Vnesený genetický materiál tiež môže obsahovať vhodnú signálnu sekvenciu na sekréciu produktu terapeutického génu (napr. interferónu) z bunky do medzibunkového prostredia.

Izolovaný genetický materiál pripadne ďalej obsahuje ďalšie sekvencie (t. j. zosilňovače, „enhancery“) potrebné na získanie požadovaného stupňa transkripčnej aktivity. „Enhancer“ alebo „zosilňovač“ je jednoducho netranslatovaná sekvencia DNA, ktorá funguje v spojitosti s kódujúcou sekvenciou (t. j. v cis) tak, že mení základnú transkripčnú hladinu určovanú promótorom.

Izolovaný genetický materiál je výhodne vnesený do bunkového genómu bezprostredne „v smere“ („downstream“) od promótora, takže promótor a kódujúca sekvencia sú operatívne spojené, čo umožňuje transkripciu kódujúcej sekvencie. Výhodné vírusové expresné vektory obsahujú exogénny promótorový element na kontrolu transkripcie vloženého mterferónového génu. K takýmto exogénnym promótorom patria tak konštitutívne ako aj indukovateľné promótory.

Prirodzene sa vyskytujúce konštitutívne promótory riadia expresiu proteínov, ktoré regulujú esenciálne bunkové funkcie. Výsledkom je, že gén kontrolovaný konštitutívnym promótorom je exprimovaný za akýchkoľvek okolnosti bunkového rastu. K príkladom konštitutívnych promótorov patria promótory nasledovných génov, ktoré kódujú základné „udržiavacie“ funkcie metabolizmu: hypoxantinfosforibozyltransferáza (HPRT), dihydrofolátreduktáza (DHFR) (Scharfmann a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630, 1991), adenozindeamináza, fosfoglycerátkináza, pyruvátkináza, fosfoglycerolmutáza a ďalej promótor β-aktínu (Lai a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010, 1989) a ďalšie konštitutívne promótory odborníkom známe.

Okrem toho mnoho vírusových promótorov funguje v eukaryotických bunkách konštitutívnym spôsobom. K takýmto promótorom patria: skoré a neskoré promótory SV40 (pozri Bemoist a Chambon, Náture 290: 304, 1981), promótory z dlhých terminálnych opakovaných sekvencii (LTR) vírusu Moloneyovej leukémie (MLV) a ďalších retrovírusov (pozri Weiss a kol., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1985), timidínkinázový promótor cytomegalovírusu IE1 (pozri Karasuymama a kol., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), promótor vírusu Rousovho sarkómu, RSV (pozri Yamamoto a kol., Celí 22: 787, 1980), neskorý promótor adenovírusu (Yamada a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3567, 1985) a ďalšie. Teda ktorýkoľvek z už uvedených konštitutívnych promótorov sa môže použiť na kontrolu transkripcie génového inzertu v predkladanom vynáleze (pozri tiež časť B).

Pokiaľ sa má uskutočniť prenos interťerónového génu do špecifického tkaniva, môže byť žiaduce priamo zamerať expresiu tohto génu. Napr. existujú promótory opísané v odbornej literatúre, ktoré umožňujú expresiu iba v niektorých tkanivách. K príkladom takýchto promótorov patria promótory vírusu hepatitídy B špecifickej pre pečeň (Sandig a kol., Gene Therapy 3: 1002-1009, 1996) a albumínového génu ((Pinkert a kol., Genes and Development 1: 268-276, 1987, Guo a kol., Gcnc Therapy 3: 802-810, 1996) ako príklad ďalšieho

SK 286821 Β6 promótora špecifického pre pečeň. Okrem toho existuje rad promótorov, ktoré sú opísané v odbornej literatúre, a ktoré umožňujú expresiu iba v špecifických nádoroch. K príkladom takýchto promótorov patria promótor PSA (karcinóm prostaty), promótor karcinoembryonálneho antigénu (karcinóm hrubého čreva a pľúc), promótor β-kazeínu (karcinóm prsníka), promótor tyrozinázy (melanóm), promótor c-sis (osteosarkóm) a promótor α-fetcproteínu (hepatóm).

Gény, ktoré sú pod kontrolou indukovateľného promótora, sa exprimujú, alebo sa vo väčšej miere exprimujú, iba v prítomnosti indukujúceho činidla (napr. transkripcie pod kontrolou metalo-tioneinového promótora sa výrazne zvyšuje v prítomnosti niektorých kovových iónov. Pozri tiež promótor indukovateľný glukokortikoidmi vyskytujúci sa v dlhej koncovej repetícii (LTR) vírusu nádoru prsnej žľazy myši (MMTV) (Klessig a kol., Mol. Celí Biol. 4: 1354, 1984). K indukovateľným promótorom patria responzívne (odpovedajúce) elementy (RE), ktoré stimulujú transkripciu, keď sa naviaže ich indukujúci faktor. Napr. existujú RE pre sérové faktory, steroidné hormóny, kyselinu retinovú a cyklický AMP. Promótory obsahujúce konkrétny RE sa môžu vybrať preto, aby sa získala indukovateľná odpoveď a v niektorých prípadoch samotný RE sa môže pripojiť k inému promótoru, čím sa získa indukovateľnosť rekombinantného génu.

Takže výberom vhodného promótora (konštitutívneho alebo indukovateľného, silného alebo slabého) je možné riadiť tak existenciu, ako aj hladinu expresie interferónu v geneticky modifikovaných bunkách. Keď je gén kódujúci interferón pod kontrolou indukovateľného promótora, podávanie interferónu in situ spusti tým, že sa geneticky modifikované bunky vystavia podmienkam, ktoré umožnia expresiu interferónu, napr. tým, že sa injikujú špecifické induktory pre indukovateľné promótory, ktoré kontrolujú transkripciu činidla. Napr. expresia in situ v geneticky modifikovaných bunkách interferónového proteínu kódovaného interferónovým génom pod kontrolou metalotioneinového promótora sa zvyšuje kontaktom geneticky modifikovaných buniek s roztokom obsahujúcim vhodné (t. j. indukujúce) kovové ióny in situ.

Nedávno sa vyvinul komplikovaný systém, ktorý umožňuje presnú reguláciu génovej expresie exogénne podávanými malými molekulami. K príkladom patrí systém FK5O5/Rapamycin (Rivera a kol., Náture Medicíne 2(9): 1028-1032, 1996), tetracyklínový systém (Gossen a kol., Science 268: 1766-1768, 1995), ecdysonový systém (No a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-3351, 1996) a progesteroriový systém (Wang a kol., Náture Biotechnology 15: 239-243, 1997).

Množstvo interferónu, ktoré sa dodáva in situ, jc teda regulované kontrolou niekoľkých faktorov, ako sú: 1. povaha promótora použitého na kontrolu transkripcie vloženého génu (t. j. či ide o promótor indukovateľný alebo konštitutívny, silný alebo slabý alebo tkanivovo špecifický), 2. počet kópii exogénneho génu, ktoré sú vložené do bunky, 3. počet transdukovaných/transfekovaných buniek, ktoré sú podané (napr. implantované) pacientovi, 4. veľkosť implantátu (napr. štep alebo zapuzdrený expresný systém) pri spôsobe ex vivo, 5. počet implantátov pri spôsobe ex vivo, 6. počet transdukovaných/transťekovaných buniek pri podaní in vivo, 7. čas, ktorý sú transdukované/transfekované bunky ponechané na mieste tak pri spôsobe ex vivo ako aj in vivo a 8. rýchlosť s akou je v geneticky modifikovaných bunkách tvorený interferón.

Selekcia a optimalizácia týchto faktorov na podanie terapeuticky účinnej dávky určitého interferónu patria k schopnostiam priemerného odborníka, a pokiaľ sa zoberú do úvahy už uvedené faktory a klinický stav pacienta, môže sa uskutočniť bez neprimeraného experimentovania.

Pretože protein exprimovaný pri spôsobe génovej terapie podľa predkladaného vynálezu je sekretovaný protein, okolité bunky, ktoré neobsahujú vektor pre génovú terapiu, sú tiež ovplyvnené (pozri príklady). Preto sa pri metóde podľa predkladaného vynálezu typicky nevyžaduje použitie selekčného génu. Ale okrem aspoň jedného promótora a aspoň jedného izolovaného polynukleotidu kódujúceho interferón, môže expresný vektor prípadne obsahovať selekčný gén, napr. gén rezistencie k neomycínu, na uľahčenie selekcie buniek, ktoré sa transfekovali alebo transdukovali expresným vektorom. Alternatívne sa bunky transfekujú dvoma alebo viac expresnými vektormi, pričom aspoň jeden vektor obsahuje gén(-y) kódujúci interferón(-y) a iný vektor obsahuje selekčný gén. Výber vhodného promótora, zosilňovača, selekčného génu a/alebo signálna sekvencia (opísané ešte ďalej) je v rámci schopností priemerného odborníka, pričom nie je potrebné neprimerané experimentovanie.

IV. Spôsoby prípravy špecifických vektorov na génovú terapiu

Môže sa použiť akákoľvek metóda v odbore známa na vloženie polynukleotidovej sekvencie do vektora. Pozri napr. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Ausubel a kol., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc., 1992. Bežné vektory obsahujú vhodné transkripčné/translačné kontrolné signály operatívne spojené s polynukleotidovou sekvenciou pre konkrétny interferón. Promótory/enhancery sa tiež môžu použiť na kontrolu expresie interferónov (pozri časť III).

K expresným vektorom kompatibilným s cicavčími hostiteľskými bunkami na použitie v génovej terapii nádorov patria napr. plazmidy, vtáčie, myšacie a ľudské retrovírusové vektory, adenovírusové vektory, vektory z herpetických vírusov, parvovírusy a nereplikativne vírusy kiahní. Replikačné parvovírusy sa môže pripraviť pomocou zbalovacích („packaging“) bunkových línií, ktoré produkujú iba replikačné defektné vírusy.

Pozri Current Protocols in Molecular Biology, kapitoly 9.10 až 9.14, Ausubel a kol. (eds.), Greene Publishing Associates, 1989.

Špecifické vírusové vektory na použitie ako prenosové systémy génu sú teraz už dobre známe a používané. Podrobné informácie sa môžu nájsť napr. v publikáciách Madzak a kol., J. Gen. Virol. 73: 1533-1536, 1992 (papovavírus SV40), Bemer a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992 (adenovírus), Moss a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992 (vaccinia vírus), Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-123, 1992 (adeno-asociované vírusy), Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 67-93, 1992 (vírus Herpes simplex, HSV a vírus Epsteina-Barrovej, EBV), Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992 (retrovírus), Brandyopadhyay a kol., Mol. Celí. Biol. 4: 749-754, 1984 (retrovírus), Miller a kol., Náture 357: 455-460, 1992 (retrovírus), Anderson a kol., Science 256: 808-813, 1992 (retrovírus).

Výhodné vektory sú DNA vektory, ku ktorým patria adenovírusy (výhodne vektor, ktorého základ sú Ad-2 alebo Ad-5), herpetické vírusy (výhodne vektory založené na víruse Herpes simplex) a parvovírusy (výhodne defektné alebo neautonómne parvovírusové vektory, výhodnejšie vektory založené na adenoasociovaných vírusoch, najvýhodnejšie založené na AAV-2), pozri Ali a kol., Gene Therapy 1: 367-384, 1994, patent U.S. 4 797 368 a 5 339 346 a tiež nasledujúce diskusie.

Výber konkrétneho vektorového systému na prenos, napr. interferónovej sekvencie, závisí od radu rôznych faktorov. Jedným dôležitým faktorom je povaha populácie cieľových buniek. Aj keď retrovírusy sa intenzívne skúmali a tiež sa použili v mnohých experimentoch génovej terapie, všeobecne sú nevhodné na infekciu buniek, ktoré sa nedelia, ale môžu byť užitočné na terapiu nádorov, pretože integrujú a exprimujú svoje gény iba v replikujúcich sa bunkách. Sú užitočné pri spôsoboch terapie ex vivo a z tohto hľadiska sú atraktívne vzhľadom na ich stálu integráciu do genómu cieľovej bunky.

Adenovírusy sú eukaryotické DNA vírusy, ktoré sa môžu modifikovať tak, aby účinne prenášali reportérový alebo terapeutický transgcn do buniek rôznych typov. Všeobecné adenovírusy typ 2 a 5 (Ad2 a Ad5), ktoré spôsobujú respiračné ochorenie u človeka, sa v súčasnosti skúmajú s cieľom využiť ich na génovú terapiu Duchenneovej muskulárnej dystrofie (DMD) a cystickej fibrózy (CF) . Tak Ad2, ako aj Ad5 patria do podtriedy adenovírusov, ktoré nijako nesúvisia s ľudskými malignitami. Adenovírusové vektory sú schopné mimoriadne účinného prenosu transgénu do takmer všetkých typov buniek bez ohľadu na ich mitotický stav. Vysoké titre (10¹¹ jednotiek tvoriacich plaky/ml) rekombinantného vírusu sa môžu ľahko pripraviť v bunkách 293 (čo je línia ľudských embryonálnych obličkových buniek transformovaných adenovirusom, ATCC CRL1573) a uložiť v zmrazenom stave bez badateľných strát. Účinnosť tohto systému prenosu terapeutických transgénov in vivo, ktoré doplňujú genetickú nerovnováhu, sa už dokázala na zvieracích modeloch rôznych ochorení, pozri napr. Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36: 261-268, 1986., K. Tanzawa a kol., FEBS Letters 118: 81-84, 1980, J. L. Golasten a kol., New England J. Med. 309: 11983: 288-296, 183, S. Ishibashi a kol., J. Clin. Invest. 92: 883-8893, 1993, a S. Ishibashi a kol,, J. Clin. Invest. 93: 1889-1893, 1994. A skutočne, rekombinantný replikačne defektný adenovírus kódujúci cDNA pre transmembránový regulátor cystickej fibrózy (CTFR) bol schválený na použitie v niekoľkých skúškach u pacientov s CF (pozri napr. J. Wilson, Náture 365: 691-692, Oct. 21, 1993). Ďalšia skutočnosť, ktorá podporuje bezpečnosť rekombinantných adenovírusov na génovú terapiu, je značne rozsiahla skúsenosť s očkovaním ľudských populácií živými adenovírusovými vakcínami.

Ľudské adenovírusy obsahujú genóm tvorený lineárnou dvojvláknovou DNA s veľkosťou 36 kb, ktorý je rozdelený do 100 mapových jednotiek (m.u.), každá veľká 360 bp DNA obsahuje úseky s krátkymi invertovanými koncovými repeticiami (ITR) na každom konci genómu, ktoré sú nevyhnutné pre replikáciu DNA. Génové produkty sú organizované do skorých (E1 a E4) a neskorých (L1 až L5) úsekov, v závislosti od expresie pred alebo po iniciácii syntézy vírusovej DNA, pozri Horwitz, Virology, 2^nd. Ed., B. N. Fields, ed., Raven Press Ltd., New York, 1990.

Adenovírusový genóm podlieha v priebehu životného cyklu vírusu veľmi regulovanému programu, pozri Y. Yang a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411, 1994. Virióny sú intemalizované bunkami, vstupujú do endozómu a odtiaľ vírus vstupuje do cytoplazmy a začína strácať svoj proteínový obal. Virión DNA potom migruje do jadra, kde zostáva ako extrachromozómová lineárna štruktúra, pričom sa neintegruje do genómu. Bezprostredne skoré gény Ela, Elb sa exprimujú v jadre. Tieto produkty skorých génov regulujú transkripciu adenovírusu a sú nevyhnutné pre replikáciu vírusu a expresiu rôznych génov hostiteľa, ktoré pripravia bunku na produkciu vírusu, a sú centrom kaskádovej aktivácie neskorých skorých génov (napr. E2, E3 a E4) nasledovaných neskorými génmi (L1 a L5).

Prvá generácia rekombinantných replikačne defektných adenovírusov, ktoré sa vyvinuli na génovú terapiu, obsahovali delécie celého úseku Ela a časti úseku Elb. Tento replikačne defektný vírus sa pestoval v bunkách 293, ktoré obsahujú funkčný úsek El adenovírusu, ktorý poskytuje E1 proteín in trans, čím umožňuje replikáciu adenovírusu s deletovaným El. Výsledný vírus je schopný infikovať mnoho bunkových typov a môže exprimovať vložený gén (za predpokladu, že nesie promótor), ale nemôže sa replikovať v bunkách, ktoré neobsahujú úsek DNA El. Rekombinantné adenovírusy majú výhodu, že majú široké hostiteľské spek trum, môžu infikovať pokojové alebo už výsledné diferencované bunky, ako sú napr. neuróny a sú úplne neonkogénne. Adenovírusy sa neintegrujú do genómu hostiteľa. Keďže existujú extrachromozómovo, riziko inzerčnej mutagenézy je veľmi znížené. Rekombinantné adenovírusy tvoria veľmi vysoké titre, vírusové častice sú stredne stále, hladiny expresie sú vysoké a môže sa infikovať široké spektrum buniek.

Adeno-asociované vírusy (AAV) sa tiež použili ako vektory v somatickej génovej terapii. AAV je malý vírus tvorený jedno-vláknovou (ss) DNA s jednoduchou organizáciou genómu veľkého 4,7 kb, čo ho robi ideálnym materiálom pre génové inžinierstvo. Dva otvorené čítacie rámce kódujú sériu polypeptidov rep a cap. Polypeptid rep (rep78, rep68, rep62 a rep40) sa zúčastňuje replikácie, uvoľnenia a integrácie genómu AAV. Proteíny cap (VPI, VP2 a VP3) vytvárajú vírusovú kapsidu. Otvorené čítacie rámce pre rep a cap sú tak na 5'-konci ako aj na 3'-konci ohraničené invertovanou koncovou repetíciou (ITR) veľkou 145 bp, pričom prvých 125 báz je schopných tvoriť duplexovú štruktúru tvaru Y alebo T. Pre vývoj AAV vektorov je dôležité, že celé domény rep a cap sa môžu vybrať a nahradiť terapeutickým alebo reportérovým transgénom, pozri

B. J. Carter, Handbook of retroviruses, ed. P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168, 1990. Ukázalo sa, že ITR predstavujú minimálnu sekvenciu nutnú na replikáciu, uvoľnenie, zabalenie a integráciu genómu AAV.

Životný cyklus AAV je dvojfázový, zložený tak z latentnej, ako aj lyrickej fázy. Počas latentnej infekcie virióny AAV vstupujú do bunky ako enkapsidované (opuzdrené) ssDNA a krátko potom sa dostávajú až do jadra, kde sa AAV DNA trvalo integruje do hostiteľského chromozómu, pričom na to netreba delenie hostiteľskej bunky. Pokiaľ nie je prítomný pomocný („helper“) vírus, integrovaný genóm AAV zostáva latentný, ale schopný aktivácie a uvoľnenia. Lytická fáza je vyvolaná druhotnou infekciou herpetickým vírusom alebo adenovírusom, ktoré kódujú pomocnú („helper“) funkciu, ktorú AAV potrebuje na svoje „vystrihnutie“ z hostiteľského chromatínu (B. J. Carter, pozri skôr). Pôvodná jednovláknová (ss) DNA sa replikuje na dvojvláknovú replikačnú formu (RF) DNA spôsobom závislým od rep. Uvoľnené genómy AAV sú enkapsidované do dopredu vytvorenej vírusovej kapsidy (proteínového obalu s ikozahedrálnou symetriou s priemerom približne 20 nm) a po lýze buniek sa uvoľňujú ako infekčné virióny, v ktorých je enkapsidovaný genóm v podobe buď +ssDNA, alebo -ssDNA.

AAV majú významný potenciál pre génovú terapiu. Vírusové častice sú veľmi stabilné a rekombinantne AAV (rAAV) majú vlastnosti podobné liečivám v tom, že rAAV sa môžu purifikovať peletovanim alebo ultracentrifugáciou v gradiente CsCl. Sú teplotné stabilné, môžu sa lyofilizovať v podobe prášku a potom sa rehydratovať opäť na plnú aktivitu. Ich DNA sa trvalo integruje do hostiteľského chromozómu, takže expresia je dlhodobá. Majú široký hostiteľský rozsah a nie je známe, že by AAV spôsobovali nejaké ochorenie, takže rekombinantné vektory sú netoxické.

Ukázalo sa, že vysoká expresia génu z AAV v myši pretrváva aspoň 1,5 roka, pozri Xiao a Samulski, 1996, Joumal of Virology 70, 8089-8108. Keďže nie sú známe žiadne dôkazy o toxicite vírusu alebo vyvolaní imunitnej odpovede hostiteľa, tieto obmedzenia génovej terapie boli teda prekonané.

Kaplitt, Leone, Samulski, Xiao, Pfaff, O'Malley a During (1994, Náture Genetics 8, 148-153) opísali dlhodobú (až 4 mesiace) expresiu tyrozinhydroxylázy v mozgu potkana po priamej intrakraniálnej injekcii AAV vektora. To je základ pre potenciálnu terapiu Parkinsonovej choroby u ľudí. Expresia bola vysoko účinná a vektor bezpečný a stály.

Fisher a kol. (Náture Medicíne, 1997, 3, 306-312) opísal stálu génovú expresiu pri myši po injekcii AAV do svalu. Opäť bol vírus úplne bezpečný. Nedetegovala sa žiadna bunková alebo humorálna imunitná odpoveď ani proti vírusu, ani proti cudzorodým génovým produktom.

Kessler a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 14082-14087) ukázali vysokú hladinu expresie erytropoetinového (Epo) génu po intramuskulámej injekcii AAV pri myši. Dokázalo sa, že proteín Epo bol prítomný v krvnom obehu a zaznamenal sa zvýšený počet červených krviniek, čo ukazuje na terapeutický potenciál. V inej práci tá istá skupina použila AAV exprimujúci gén HSV-tk na liečenie rakoviny a opísala sa vysoká hladina génovej expresie v pevných nádoroch.

Nedávno sa ukázalo, že rekombinantný baculovírus primárne odvodený z baculovírusu Autographa califomica (vírus mnohopočetnej jadrovej polyhedrózy, AcMNPV) je schopný transdukovať cicavčie bunky in vitro (Hofmann, C, Sandig, V., Jennings, G., Rudolph, M., Schlag, P., Strauss, M., 1995, „Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovírus vectors“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10099-10103, Boyce„ F. M., Buchner,N.L.R., 1996, „Baculovírus-mediated gene transfer into mammalian cells“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2348-2352).

Rekombinantné bakulovírusy majú veľké potenciálne výhody pre génovú terapiu. Patria k nim veľmi veľká DNA inzerčná kapacita, neprítomnosť imunitnej odpovede pred podaním vírusu u človeka, ďalej to, že u cicavcov nedochádza k ich replikách, vírusy nie sú toxické pre cicavcov, u cicavcov nedochádza k expresii vírusových génov, keďže transkripčné promótory bakulo-virusov sú špecifické pre hmyz, a potenciálne neexistuje odpoveď cytotoxických lymfocytov namierená proti proteínom týchto vírusov.

IV. Testy účinnosti/identifikácie interferónov

Interferónové polynukleotidy sa podávajú do bunky prostredníctvom expresného vektora. Všeobecne sa účinnosť určitého vektora pre génovú terapiu v konkrétnych bunkových podmienkach a pri určitom metabolizme testuje na (I) zmeny v bunkovej morfológii, (II) inliibíciu bunkovej proliferácie a (III) antivírusové aktivity.

Výber a optimalizácia konkrétneho expresného vektora na expresiu špecifického produktu interferónového génu v izolovanej bunke sa uskutoční tak, že sa získa mterferónový gén, výhodne s jedným alebo niekoľkými kontrolnými úsekmi (napr. promótorom), pripraví sa vektorový konštrukt obsahujúci vektor, do ktorého je vložený interferónový gén, vektorovým konštruktom sa transfekuje alebo transdukuje bunková kultúra in vitro a potom sa určí, či produkt interferónového génu je prítomný v kultivovaných bunkách.

Účinok transfekcie polynukleotidmi, ktoré kódujú interferóny, sa môže testovať in vitro pomocou celého radu dostupných bunkových línií ľudských nádorov. K takýmto bunkovým líniám patria napr. línie ľudských buniek karcinómu močového mechúra 5637 (ATCC HTB9), ľudská bunková línia karcinómu prsníka MDA-MB.468 (HTB132), ľudská bunková línia karcinómu prostaty DU145 (ATCC HTB81), ľudská bunková línia osteosarkómu SA0S2 (ATCC HTB85), línia fibrosarkómovej metastázujúcej pľúcnej rakoviny Hs913T (ATCC HTB152), línia karcinómu krčka maternice HeLa (ATCC ECL2). Každá z týchto bunkových línií sa môže transfekovať vhodnými polynukleotidmi kódujúcimi interferóny a vplyv transfekcie na bunkový rast a bunkovú morfológiu sa môže testovať spôsobmi, ktoré sú v odbore známe, ako je napr. test vylučovania trypánovej modrej, ktorý meria životaschopnosť buniek alebo počítanie buniek na zistenie množenia v závislosti od času a inkorporácie tymidínu značeného tríciom na zmeranie replikácie DNA.

Vplyv sekretovaného proteínu na okolité bunky, ktoré neobsahujú vírusový vektor s polynukleotidom kódujúcim interferón, sa môže ľahko testovať metódami opísanými v príklade 3.

Ak je už raz interferónová sekvencia vložená do cieľovej bunky, môže sa identifikovať konvenčnými metódami, napr. hybridizáciou nukleových kyselín so sondou obsahujúcou sekvencie, ktoré sú homologické/komplementárne s vloženou mutovanou interferónovou sekvenciou. Transkripcia interferónu sa môže merať pomocou polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkriptázou. Alternatívne sa môže merať interferónový proteín v médiu po kultivácii buniek pomocou štandardných antivírusových testov alebo pomocou testu ELISA. Pri inom spôsobe je možné identifikovať sekvenciu podľa prítomnosti/absencie funkcie markerového génu (ako je napr. aktivita tymidínkinázy, rezistencia k antibiotikám a pod.) vnesenej do cieľovej bunky expresným vektorom. Napr. pokiaľ je vložený do vektora polynukleotid kódujúci interferón-beta la, pričom vektor obsahuje dominantný selekčný markerový gén, ako je gén pre neomycinfosfotransferázu pod samostatnou kontrolou skorého promótora SV40, sekvencia sa môže identifikovať podľa prítomnosti funkcie markerového génu (t. j. rezistencie k Geniticínu). Odborníkovi sú známe aj ďalšie vhodné metódy na detekciu vhodných vektorov.

V. Užitočnosť vynálezu

A. Interferóny a infekčné choroby

Interferóny sa používajú na liečenie bakteriálnych, vírusových a plesňových infekcií. Vírus chrípky a vírus vezikulámej stomatitídy (VSV) sú osobitne citlivé na inhibíciu interferónmi a často sa používajú v testoch na meranie interferónovéj aktivity a tiež vo výskume mechanizmu antivírusovej aktivity interferónov. K ďalším vírusom, ktoré sú ľudskými patogénmi a sú citlivé k interferónom, patri vírus hepatitídy B (HBV), vírus hepatitídy C (HCV), vírus hepatitídy D, ľudský papilomavírus, vírus herpes simplex, vírus herpes zoster, cytomegalovírus (CMV), rhinovírus a vírus encefalomyokardiotídy.

K veľmi atraktívnym terapeutickým cieľom medzi vírusovými ochoreniami patrí hepatitída. Vírusová hepatitída, ochorenie pečene - spôsobované niekoľkými vírusmi, je hlavným problémom svetového zdravotníctva. Izolovalo sa a klonovalo päť odlišných vírusov ľudskej hepatitídy. Sú to vírusy hepatitídy A, B, C, D a E. Zdá sa, že niektoré prípady akútnej a chronickej hepatitídy sú spôsobené inými vírusmi hepatitídy, ako sú doteraz opísané, ako jc napr. novo objavený vírus hepatitídy G. Vírusy s najpočetnejším výskytom sú vírusy hepatitídy A, B a C. Okrem toho, že spôsobujú akútne a chronické poškodenie pečene a zápaly, infekcia HBV a HCV môžu viesť k hepatocelulámemu karcinómu. Ukázalo sa, že interferóny prejavujú istú mieru účinnosti in vivo proti HBV a HCV a tiež proti vírusu hepatitídy D a A v bunkovej kultúre.

Vírusová hepatitída by sa mohla liečiť podávaním génu pre interferón. Výhodným cieľom na prenos takéhoto génu sú hepatocyty v pečeni. Aj keď je možná ex vivo terapia (napr. vybratie buniek pečene, vloženie polynukleotidov exprimujúcich interferón a spätná transplantácia pacientovi), prenos génu in vivo je však osobitne výhodný. Uskutoční sa chirurgický zákrok, aby sa gén injikoval do vrátnice (V. portae) alebo sa gén podá infúziou pomocou katétra v tepne pečene (A. hepatica) . V ideálnom prípade sa použije menej invazívny postup ako napr. intravenózna injekcia.

Interferónový gén je vložený pod kontrolu promótora transkripcie vo vhodnom expresnom vektore. Promótor transkripcie môže byť bunkového alebo vírusového pôvodu (napr. CMV, SV40, RSV atď.). Pokiaľ je potrebná expresia špecifická pre pečeň, je výhodný bunkový promótor špecifický pre hepatocyty, ako je napr.

albumínový enhancer/promótor, promótor al-antitrypsinu alebo enhancer/promótor HBV. V odbornej literatúre je opísaný rad promótorov špecifických pre tkanivo pečene (pozri skôr).

Tiež sa môže navrhnúť vektor, v ktorom je interferónový gén, ktorý sa exprimuje iba v bunkách pečene infikovaných vírusom hepatitídy. Napr. expresia interferónu sa môže indukovať transkripčným faktorom HBx z HBV, ktorý je prítomný iba v hepatocytoch infikovaných s HBV. Okrem toho sa môže použiť nosičový systém. To môže byť nevírusový systém, ako sú napr. katiónové lipozómy alebo konjugáty proteín : DNA (konjugáty DNA a asialoglykoproteíny sa môžu prenášať prednostne do pečene prostredníctvom väzby na receptory pre asialoglykoproteíny na hepatocytoch).

Ale súčasné najúčinnejšie systémy na prenos génov sú založené na vírusoch. Rekombinantné retrovírusy sa použili na prenos génov do ľudských hepatocytov ex vivo. Zvieracie modely ukazujú, že rekombinantné adenovírusy sa môžu účinne lokalizovať in vivo v pečeni po intravenóznom podaní. Približne 98 % adenovírusov je po intravenóznom podaní lokalizovaných v pečeni.

Zdá sa, že tiež rekombinantné adeno-asociované vírusy (rAAV) môžu infikovať pečeň po in vivo podaní. Môžu sa použiť aj iné typy vírusov, ako napr. alfa vírusy, lentivírusy alebo ďalšie cicavčie vírusy. Nedávno sa ukázalo, že aj iný ako cicavčí vírus, konkrétne baculovirus špecifický pre hmyz, je schopný preniesť gény a exprimovať ich účinne v hepatocytoch (Hofmann a kol., 1995, Boyce a Buecher, pozri skôr).

Ako príklad uveďme, že rekombinantné adenovírusy sa môžu použiť tiež na prenos interferónu in vivo. Niekoľko výskumných skupín skonštruovalo replikačne defektné adenovírusy. Prvá generácia týchto vírusov je defektná vďaka delécii v úseku El. Tento defekt je komplementovaný v bunkovej línii 293, ktorá exprimuje adenovírusový úsek El. Je však výhodné použitie adenovírusu, ktorý bol „poškodený“ vo väčšom rozsahu, teda deléciami v génoch El, E2a a/alebo E4. Všetky deletované funkcie sa môžu exprimovať v zbalovacej bunkovej línii. Interferónový gén sa vloží do polohy „v smere“ („downstream“) od ktoréhokoľvek z veľkého množstva možných promótorov, napr. bezprostredne skorý promótor CMV, promótor z LTR RSV, promótor bunkového aktínu, enhancer/promótor albumínu alebo iný promótor špecifický pre pečeň. Táto génová kazeta sa potom vloží do rekombinantného adenovírusu namiesto jedného z deletovaných génov, ako napr. El, čím sa vytvorí adenovírusový prenosový vektor.

Rekombinantné adenovírusy obsahujúce interferónový gén sa pripravia priamou ligáciou alebo homologickou rekombináciou, po ktorej nasleduje transfekcia do zbalovacej línie štandardným spôsobom. Rekombinantný vírusový kmeň obsahujúci interferónový gén sa potom purifikuje metódou plakov niekoľkokrát po sebe a potom sa namnoží vo veľkom rozsahu v zbalovacích bunkách. Vírus sa môže purifikovať ultracentrifugáciou z pásu gradientu CsCl, kolónovou chromatografiou alebo iným spôsobom a potom titrovať na enkapsidačných bunkách. Metódy prípravy adenovirusov defektných v génoch El a E2a (Engelhardt a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6196-6200, 1994) a adenovirusov defektných v génoch El a E4 (Gao a kol., J. Virology 70: 8934-8943, 1996) sa dostatočne podrobne opísali. Metódy prípravy adenovirusov defektných v El sa môžu nájsť v publikácii Graham, F. L., L. Prevec, „Methods for Construction od Adenovírus vectors“, Mol. Biotech. 3: 207-220, 1995.

V pokusoch sa testujú rôzne dávky vírusu. Veľkosť dávky je od 10⁷ jednotiek tvoriacich plaky (pfu) do 10¹² pfu. Pokiaľ je to nutné, vírus sa podáva opakovane (napr. raz za jeden až šesť mesiacov). Humorálna imunitná odpoveď v dôsledku opakovaného podania vírusu môže obmedziť účinnosť opakovaného podania. V takom prípade sa môže podať spoločne s vírusom imunosupresívne činidlo ako cyklosporín alebo protilátka namierená proti ligandu CD40 .

Účinok interferónovej génovej terapie proti vírusovej hepatitíde sa môže testovať na zvieracích modeloch (pozri časť C). Napr. v prípade vírusu hepatitídy B je dostupné množstvo modelov, ku ktorým patrí svišť, kačica, piskor, potkan a myš. K myšacím modelom HBV patria myši, ktoré sú transgénne na HBV a trvalo replikujú IIBV DNA v svojej pečeni, čo spôsobuje trvalú produkciu HBV do krvného obehu. Pre HCV je dostupný šimpanzí model. Adenovírusy obsahujúce interferónový gén sa môžu podávať priamo do pečene alebo sa môžu podávať intravenózne injekciou.

Účinnosť sa môže stanoviť monitorovaním replikácie vírusovej DNA, vírusových častíc v obehu, pečeňových enzýmov (ALT) prípadne patológie pečene a zápalov.

B. Rakovina

Ukázalo sa, že interferónové proteíny majú pri mnohých okolnostiach antionkogénnu aktivitu. Pozri prehľadné články Wadler a Schwarz, Cancer Research 50: 3473-3486, 1990, Martin-Odegard, DN&P 4: 116117, 1991, Spiegel, Seminars in Oncology 15(5): 41-45, 1988. Liečenie interferónom-alfa a inteferónom-beta malo istú účinnosť proti niekoľkým typom rakoviny. Génová terapia sa môže uskutočňovať samostatne alebo v spojení s konvenčným chirurgickým postupom, ožarovaním alebo chemoterapiou. Nasledujúci prehľad typov rakovinových ochorení vhodných na génovú terapiu nie je úplný a je zrejmé, že interferónová génová terapia by mohla byť účinná v rade ďalších ochorení, ktoré nie sú v tomto zozname.

Malígne gliómy predstavujú 60 až 80 % primárnych nádorov mozgu u dospelých. Ľudské gliómové bunky sa môžu implantovať do mozgu imunodeficientnej myši (tzv. „nahé myši“), aby sa vytvoril model gliómu.

Ukázalo sa, že liečenie interferónom-beta zlepšilo prežívanie pri týchto myšiach. Problémom v niektorých pokusoch s liečením gliómu proteínom interferón-beta bola vysoká toxicita interferónu-beta po parenterálnom (intravenóznom alebo intramuskulámom) podaní. Lokalizované podanie génu interferónu-beta do mozgu, pravdepodobne priamo v okamihu chirurgického zákroku, spôsobí dlhodobú produkciu interferónu-beta v mozgu, pričom sa neprejavia vedľajšie účinky pozorované pri systémovom podaní proteínu.

Melanóm je výborným cieľom pre interferónovú génovú terapiu. Prognóza je v prípade metastázujúceho malígneho melanómu veľmi zlá. Incidencia choroby sa dramaticky zvyšuje a konvenčná chemoterapia je neúčinná. Melanóm je nádor imunogénneho typu, keď pacientova odpoveď závisí od hostiteľovej imunitnej reakcie. Za týchto okolností môžu byť účinné tak antiproliferatívne, ako aj imunomodulačné aktivity interferónu-beta. Ukázalo sa, že proteín interferón-beta má priame antiproliferatívne účinky na kultivované bunky malígneho melanómu.

Hemangióm je proliferácia endotelu kapilár do zhluku mastocytov, fibroblastov a makrofágov a spôsobuje poškodenie tkaniva. Aj keď sú samotné spravidla neškodné, hemangiómy môžu ukázať, že interferón-alfa indukuje skorú regresiu hemangiómov rezistentných k steroidom u detí (Marlin-Odegard, pozri skôr).

Ukázalo sa, že interferónové proteíny sú účinné pri liečení leukémie, lymfómov a myelómov. Účinnosť ukázaná pri týchto ochoreniach je v rozpore so všeobecným zistením, že účinnosť in vivo je omnoho menej zvyčajná, aj keď účinnosť interferónových proteínov pri liečení rakoviny in vitro je dobre charakterizovaná. Ale interferón-alfa je účinný v klinických pokusoch proti leukémii vlasatých buniek, chronickej myeloidnej leukémii, kožným lymfómom T buniek, Hodgkinovmu lymfómu a mnohonásobnému lymfómu. Interferónbeta inhibuje rast kultivovaných buniek renálneho bunkového karcinómu. IFN-α sa už schválil na použitie na liečenie renálneho bunkového karcinómu.

Kolorektálny karcinóm ja hlavnou príčinou úmrtí spôsobených rakovinou v USA. Existujú silné antiproliferatívne účinky proteínov IFN-ct , IFN-β a IFN-y na kultivované bunky ľudského karcinómu hrubého čreva. Karcinóm hrubého čreva tvorí časté metastázy v pečeni s veľmi zlými následkami. Adenovírusy alebo iné prenosové systémy špecifické pre pečeň sa môžu použiť na prenos interferónového génu do pečene na liečenie týchto metastáz. Hepatocelulámy karcinóm je tiež atraktívnym cieľom vzhľadom na vysokú účinnosť prenosu do pečene pri použití adenovírusu. Pozorovalo sa, že proteín IFN-|3 významne inhiboval proliferáciu ľudských hepatómových buniek v kultúre.

Interferónové proteíny prejavili v niektorých klinických skúškach účinnosť tiež na liečenie neoperovateľného nemalobunkového pľúcneho karcinómu, ale v iných skúškach zostali bez účinku. Zistilo sa, že dve ľudské línie pľúcnej rakoviny sú citlivé na inhibíciu rastu interferónom-beta (interferón-beta bol účinnejší ako alfa). V jednej klinickej skúške sa pozorovala významná toxicita súvisiaca s interferónom po intravenóznom podaní interferónu. Lokálne podanie génu pre interferón-beta do pľúc (pravdepodobne prenosom pomocou rekombinantného adenovírusového vektora v aerosóle) bude účinné, pričom sa neprejavia vedľajšie účinky pozorované po systémovom podaní proteínu. Pozorovala sa in vitro inhibícia proliferácie buniek malobunkového pľúcneho karcinómu účinkom interferónu-beta.

Interferón-alfa inhibuje rast xenoštepov karcinómu prsníka pri „nahých“ myšiach. Interferón-alfa môže byť účinný proti rakovine prsníka nielen pre svoj antiproliferatívny účinok, ale tiež vďaka indukcii estrogénových receptorov a progesterónových receptorov tamoxifenu. Tu sú uvedené dáta z pokusov, keď sa použila génová terapia s IFN- β na myšacom modeli ľudského karcinómu prsníka (pozri príklady 3 a 4).

Rakovina vaječníkov je tiež možným cieľovým ochorením. Interferón-beta sa zdá menej účinný ako interferón-alfa v inhibícii proliferácie kultivovaných buniek rakoviny vaječníkov. Terapia sa v tomto prípade môže uskutočňovať vložením vektora pre génovú terapiu do peritonea, keďže tento typ nádorov má tendenciu vyplňovať peritoneálnu dutinu.

Môže sa zhrnúť, že interferónové proteíny preukázali antionkogénne vlastnosti v rade podmienok, aj keď klinické výsledky s použitím interferónového proteínu nie sú jednoznačne pozitívne. Proteíny IFN-α a IFN-β sa testovali v spojení s konvenčnými chemoterapeutikami a prejavili synergický účinok s týmito liekmi v mnohých indikáciách vrátane buniek rakoviny krčku maternice, hrtanu, leukémie, karcinómu obličiek, adeno-karcinómu hrubého čreva a myelómu. Tiež sa predpokladá, že interferóny majú antiangiogénnu aktivitu. Existuje inverzná korelácia medzi lokálnou hladinou IFN-β a angiogénnou schopnosťou. Niektoré dáta ukazujú, že trvalá hladina proteínu IFN- β je nevyhnutná pre inhibíciu angiogenézu. V takomto prípade by interferónová génová terapia bola výhodnejšia ako proteínová terapia, pri ktorej hladiny interferónového proteínu veľmi rýchlo klesajú na príliš nízku alebo nedetegovateľnú hladinu.

C. Zvieracie modely

Odborníkom je známe, že existuje mnoho zvieracích modelov, ktoré sú dostupné na testovanie génovej terapie ex vivo a in vivo. Najpoužívanejším modelom, patriacim k hlodavcom, je model xenoštepov ľudských nádorov pri „nahých“ (nu/nu) myšiach. Ľudské rakovinové bunky sa namnožia v kultúre a transfekujú sa alebo sa infikujú génom, ktorý kóduje interferón a je operatívne spojený s vhodnou expresnou kontrolnou sekvenciou. Tieto bunky sa potom injikujú do „nahých“ myši. Typicky sa nádorové bunky injikujú subkutánne do chrbta myši, čo spôsobí vytvorenie hmoty pevného nádoru (pozri príklad 1). Alternatívne sa nádorové bunky injikujú ortopicky do orgánu, v ktorom by sa prirodzene vyskytovali (bunky pľúcnej rakoviny by sa injikovali do pľúc, rakoviny hrubého čreva do hrubého čreva atď.). Rast nádorov sa dá sledovať meraním priemeru nádorovej hmoty v závislosti od času (pozri príklad 2).

Okada a kol. (1996, Gene Therapy 3, 957-964) vytvorili experimentálne gliómy pri myši priamou intrakraniálnou stereotaktickou injekciou ľudských gliómových buniek do mozgu. Po vytvorení sa detegovateľných nádorov sa priamo do rovnakého miesta injikoval AAV vektor exprimujúci gén tymidínkinázy (HSV tk) z vírusu herpes simplex. Enzým HSV tk premieňa netoxický analóg gancyklovir (GCV) na toxický metabolit. Po génovej terapii sa intraperitoneálne podal GCV. Myši, ktoré dostali AAV-tk a GCV, ale nedostali kontrolný AAV alebo AAV-tk bez GCV, prejavili výrazné zmenšenie veľkosti nádoru. Táto terapia bol bezpečná a účinná.

Rekombinantná adenovirusy (AdV) sa tiež použili na liečenie pevných nádorov na zvieracích modeloch a v preklinických skúškach na ľuďoch. Mnohé z týchto štúdií používali podobné modely, ako je ľudský xenoštep/“nahá“ myš. Niektoré príklady týchto modelových experimentov sú uvedené ďalej.

Clayman a kol. (1995, Cancer Research 55, 1-6) pripravili model ľudského kožného karcinómu dlaždicového epitelu v oblasti hlavy a krku na nahých myšiach. Zistili, že adenovírus exprimujúci divý typ p53 zabránil tvorbe týchto nádorov.

Hirschowitz a kol. (1995, Human Gene Therapy) vniesli bunky ľudského karcinómu hrubého čreva do nahých myší. Po vytvorení nádorov injikovali priamo do nádoru adenovírus exprimujúci gén cytozíndeaminázy (CD) z E. coli a potom podali systémovo 5-fluorcytozin (5FC) (CD a 5FC je kombinácia enzým/prekurzor lieku podobná kombinácii tk a GCV).Pozorovali 4 až 5 x menšiu veľkosť nádorov.

Zhang a kol. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4513-4518) vytvorili nádor prsníka pri nahých myšiach. Tieto nádory sa injikovali priamo adenovírusom, ktorý exprimoval interferón-alfa. Pozorovali regresiu nádorov pri 100 % zvierat.

Ko a kol. (1996, Human Gene Therapy 7: 1683-1691) pripravili ľudské nádory prostaty pri nahých myšiach a zistili, že priama intratumorová injekcia adenovírusu exprimujúceho p53 divého typu inhiboval rast nádorov. Všetky liečené myši zostali bez nádorov ešte aspoň počas 12 týždňov po ukončení liečenia.

Bishoff a kol. (1996, Science 274, 373-376) vytvorili ľudský karcinóm krčku maternice a glioblastómové nádory pri nahých myšiach. Liečili tieto myši adenovírusom, ktorý mal deléciu v géne E1B. V neprítomnosti E1B adenovírus selektívne usmrcoval nádorové bunky deficitné na p53. Pokiaľ sa injikoval priamo do nádoru, tento adenovírus spôsobil regresiu nádoru pri 60 % zvierat.

Ohwada a kol. (1996, Human Gene Therapy 7, 1567-1576) injikovali bunky ľudského karcinómu hrubého čreva do pečene nahých myší, aby napodobnili pečeňové metastázy črevného karcinómu. Potom do pečene v blízkosti nádoru injikovali adenovírus exprimujúci CD. Systémové podanie 5FC potlačilo rast nádorov pri týchto zvieratách.

Modely rakoviny sa môžu vytvoriť tiež pri imunokompetentných myšiach a potkanoch. Nádory môžu byť založené z nádorových buniek syngénnych zvierat. V týchto prípadoch môžu endogénne nádory vznikať podaním karcinogénu zvieraťu alebo môžu vznikať spontánne v dôsledku genetického základu určitých myší (napr, deficitných v p53). Nasleduje niekoľko príkladov.

Elsahami a kol. (1996, Human Gene Therapy 7, 141-148) liečili endogénny mezotelióm pri imunokompetentných potkanoch pomocou adenovírusu exprimujúceho gén tk. Vírus sa injikoval do oblasti pleury a GCV sa podal systémovo. Ukázalo sa výrazné zníženie hmotnosti nádorov a zvýšenie času prežívania.

Eastham a kol. (1996, Human Gene Therapy 7: 515-523) implantovali bunky nádoru prostaty syngénnej myši subkutánne z imunokompetentnej myši, potom injikovali adenovírus-tk priamo do nádoru a podávali GCV systémovo. Autori opísali zmenšenie veľkosti nádorov a predĺženie života.

Bramson a kol. (1996, Human Gene Therapy 7: 1995-2002) injikovali adenovírus exprimujúci cytokín IL-2 priamo z endogénneho nádoru prsníka myši. Zistili, že pri 75 % myší sa prejavila regresia nádoru a 33 % myší zostalo bez nádoru aj po dlhom čase.

Riley a kol. (1996, Náture Medicíne 2: 1336-1341) injikovali adenovírus exprimujúci gén retinoblastómu do melanotrofných nádorov štítnej žľazy, ktoré vznikli spontánne pri Rb+/-myši. Pri liečených zvieratách zistili zníženie proliferácie nádorových buniek, spomalenie rastu nádoru a predĺženie dĺžky života.

Retrovírusové vektory boli prvými vektormi, ktoré sa použili v klinických testoch génovej terapie u ľudí. Publikáciou relevantnou k predkladanej patentovej prihláške je práca Roth a kol. (1996, Náture Medicíne 2: 985-991). Autori vytvorili rekombinantný retrovírus, ktorý exprimoval gén p53 divého typu. Tento vírus sa podal deviatim pacientom trpiacim nemalobunkovým karcinómom pľúc pomocou priamej intratumorovej injekcie použitím ihly vloženej do bronchoskopu. Z týchto deviatich pacientov sa u troch prejavila regresia nádoru a u troch ďalších pacientov došlo k stabilizácii nádorového rastu.

D. Ďalšie uskutočnenie vynálezu

Geneticky modifikované bunky sa podávajú napr. intraperitoneálnou injekciou alebo implantovaním buniek alebo štepu alebo tiež puzdra/tobolky obsahujúcej bunky do bunkovo kompatibilného miesta v tele príjemcu. Termín „bunkovo kompatibilné miesto“ znamená štruktúru, dutinu alebo telovú tekutinu príjemcu, do ktorej sa implantujú geneticky modifikované bunky, bunkový štep alebo zapuzdrený bunkový expresný systém bez vyvolania nepriaznivých fyziologických následkov. K príkladom bunkovo kompatibilných miest patria napr. peritoneálna, pleurálna alebo perikardiálna dutina, a tiež pevný nádor, z ktorého pochádzajú bunky alebo orgán, z ktorého sa odstránil nádor.

Geneticky modifikované bunky sa implantujú do bunkovo kompatibilného miesta, samotné alebo v kombinácii s inými geneticky modifikovanými bunkami. Takže predkladaný vynález zahrnuje aj spôsob modifikácie systému príjemcu použitím zmesi geneticky modifikovaných buniek, keď prvá modifikovaná bunka exprimuje prvý interferón a druhá modifikovaná bunka exprimuje druhý interferón alebo iný sekretovaný proteín. Ďalšie typy geneticky modifikovaných buniek (napr. hepatocyty, bunky hladkého svalstva, fibroblasty, gliové bunky, endotelové bunky, keratinocyty) sa môžu pridať, spoločne s geneticky zmenenými bunkami, aby sa dosiahla expresia komplexného súboru vnesených génov. Navyše do každej geneticky modifikovanej bunky sa môže vniesť viac ako jeden rekombinantný gén, a to pomocou toho istého vektora alebo rôznych vektorov, čo umožňuje expresiu niekoľkých interferónov v jedinej bunke.

Predkladaný vynález sa týka tiež bunkových štepov. Štep obsahuje množstvo už opísaných génovo modifikovaných buniek naviazaných na nosič, ktorý je vhodný na implantáciu do príjemcu, ktorým je cicavec. Nosič môže byť buď z prírodného, alebo syntetického materiálu. V inom uskutočnení vynálezu štep obsahuje kúsok peritonea. V takomto prípade je nosičom prirodzene sa vyskytujúci matrix, ktorý udržuje spolu množstvo geneticky modifikovaných buniek. Alternatívne obsahuje štep množstvo už uvedených geneticky modifikovaných buniek naviazaných na náhradu uvedeného prírodného matrixu, napr. Gelfoam (Upjohn, Kalamazoo, Mích.), Dacron alebo Cortex®.

Iný aspekt predkladaného vynálezu poskytuje opuzdrený bunkový expresný systém. Opuzdrený systém obsahuje tobolky vhodné na implantáciu do cicavčieho príjemcu a množstvo už opísaných geneticky modifikovaných mezotelových buniek nachádzajúcich sa vnútri. Formulácia takýchto toboliek je odborníkovi známa. Na rozdiel od buniek, ktoré sú priamo implantované cicavčiemu príjemcovi (napr. implantovaným tak, že geneticky modifikované bunky sú v priamom fyzickom kontakte s bunkovo kompatibilným miestom), opuzdrené bunky ostávajú po implantácii izolované (t. j. nie sú v priamom kontakte s miestom). Opuzdrený systém nie je obmedzený len na tobolky obsahujúce geneticky modifikované bunky, ktoré neboli imortalizované, ale môže obsahovať aj geneticky modifikované imortalizované bunky.

VI. Formulácia

Vo výhodnom uskutočnení prípravok geneticky modifikovaných buniek obsahuje množstvo buniek dostatočné na to, aby sa preniesla terapeuticky účinná dávka interferónu do príjemcu in situ. Stanovenie terapeuticky účinnej dávky pre špecifický interferón a známy stav je v kompetencii bežného odborníka bez toho, aby bolo nutné neprimerané experimentovanie. Takže pri stanovení účinnej dávky by odborník zvážil stav pacienta, závažnosť ochorenia, a tiež výsledky klinických testov konkrétneho interferónu, ktorý sa podáva.

Pokiaľ už gén alebo geneticky modifikované bunky nie sú prítomné vo farmaceutický prijateľnom nosiči, sú do takéhoto nosiča umiestnené pred podaním príjemcovi. Medzi farmaceutický prijateľné nosiče patrí napr. izotomcký soľný roztok alebo iné pufre v závislosti od vhodnosti pre daného pacienta a zvolenej terapie.

Termín „farmaceutický prijateľný nosič“ znamená jednu alebo niekoľko prísad, prírodných či syntetických, s ktorými sa izolovaný polynukleotid spája, aby sa uľahčilo jeho podávanie. Medzi vhodné nosiče patrí sterilný soľný roztok, aj keď aj iné vodné či nevodné izotonické sterilné roztoky a sterilné suspenzie, ktoré sú farmaceutický prijateľné, sú odborníkovi známe. Z tohto hľadiska termín „nosič“ zahrnuje tiež akýkoľvek plazmidový a vírusový expresný vektor. Termín „účinné množstvo“ sa týka množstva, ktoré je schopné zlepšiť stav alebo spomaliť postup choroby, degeneratívneho stavu alebo poškodenia. Účinné množstvo sa dá stanoviť na individuálnej báze a vychádza čiastočne zo zváženia symptómov, ktoré sa liečia, a výsledkov, ktoré sa majú dosiahnuť. Účinné množstvo sa môže stanoviť bežným odborníkom pri zvážení takýchto faktorov bez toho, aby bolo potrebné viac ako rutinné testy.

Vo výhodnom spôsobe podľa vynálezu sa účinné množstvo interferónovej polynukleotidovej sekvencie nachádzajúcej sa v sprievodnom vektore (napr. nosiči) podá priamo do cieľovej bunky alebo nádorového tkaniva pomocou priamej injekcie s ihlou alebo pomocou katétra alebo inou podávacou trubičkou vloženou do rakovinového tkaniva, nádoru alebo krvnej cievy zásobujúcej nádor. Dávkovanie je primáme závislé od faktorov, ako je choroba, ktorá sa má liečiť, vybratý interferón, vek, hmotnosť a zdravotný stav subjektu, a je teda rozdielne pre rôzne subjekty. Keď sa používa vírusový vektor pre génovú terapiu, predpokladá sa, že účinné množstvo pre človeka je od 0,1 do 10 ml fyziologického roztoku obsahujúceho 1 x 10' až 1 x 10¹² jednotiek tvoriacich plak (pfu)/ml vírusových expresných vektorov obsahujúcich interferón.

Ako sa už diskutovalo, interferónový gén sa môže podávať priamou injekciou do pevného nádoru. Alternatívne sa podanie do nádoru môže uskutočniť prostredníctvom infúzie do krvnej cievy, ktorá zásobuje nádor. Tiež sa môže vektor podať parenterálne. Polynukleotidy kódujúce interferón sa môžu podávať topicky, intraokuláme, parenterálne, intranazálne, intratracheálne, intrabronchiálne, intramuskuláme, subkutánne alebo akýmkoľvek ďalším spôsobom. Medzi parenterálne podanie patria podanie intravenózne, intramuskulárne, intraperitoneálne a subkutánne. Zložitejším postupom je parenterálne podávanie vírusu alebo chemického konjugátu, ktorý sa lokalizuje do určitého typu nádoru vďaka prirodzenému tropizmu alebo vďaka prítomnosti povrchovej molekuly, ktorá sa viaže na receptor vyskytujúci sa iba na určitých typoch nádorov.

Ako sa už opísalo, predkladaný vynález poskytuje spôsoby prípravy bunkového expresného systému na expresiu génového produktu (napr. interferónu) v príjemcovi, ktorým je cicavec, tento expresný systém takto pripravený a farmaceutické prípravky obsahujúce takýto systém. Cieľom nasledujúcich príkladov je demonštrovať uskutočniteľnosť bunkovej génovej terapie na zvieracom modelovom systéme.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 (A) Neinfikované bunky MDA-MB-468 (°) alebo bunky infikované R5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ v 0,01 % (Δ), 0,03 % (□), 0,1 % (V) alebo 0,3 % (O) sa injikovali subkutánne do boku „nahých“ myší a potom sa priemerná veľkosť vyniesla v závislosti od času po implantácii nádorových buniek.

(B) Kaplan-Meirov graf ukazujúci percento prežívajúcich myší počas pozorovania 109 dní. Neinfikované bunky (»), bunky infikované H5 1 ΙΟΙιΙΡΝβ v 0,01 % (Δ), 0,03 % (□), 0,1 % (V) alebo 0,3 % (O).

Obrázok 2 (A) Ex vivo génová terapia s interferónom beta v (1) bunkách KM12L4A, (2) bunkách Huh7 a (3) bunkách ME180. Priemerná veľkosť nádoru sa vyniesla ako funkcia času po implantácii nádorových buniek. Myšiam sa implantovali neinfikované bunky () alebo bunky infikované H5.110hIFN3 v 1 %(·), 10 % (^Á). V tých skupinách, kde sa niektoré myši utratili, je veľkosť nádoru uvedená ako priemerná hodnota s poslednou uvedenou hodnotou pre utratené zvieratá. Prerušenie grafu odráža úhyn alebo utratenie všetkých zvierat v skupine.

(B) Percentá prežívajúcich myší počas pozorovania 70 dní. Panely 1, 2 a 3 ukazujú dáta získané na myšiach s implantovanými bunkami KM12L4A, Huh7 a ME180, v uvedenom poradí. Symboly predstavujú myši () alebo bunky infikované H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ v 1 %(·), 10 % (*).

Obrázok 3

Priame ošetrenie in vivo zavedených nádorov MDA-MB-468. Nádory sa injikovali H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ v množstve 3 x 10⁹ pfu (O), 1 x 10⁹ pfu (□), 3 x 10^s pfu (°), 1 x 10⁸ pfu (Δ) a 3 x 10⁷ (V) alebo PBS ( □) alebo H5.1 lOlacZ v množstve 3 x 10⁹ pfu (0), 1 x 10⁹ pfu (*), 3 x 10⁸ pfu (x), 1 x 10⁸ pfú (). Veľkosť nádorov sa merala počas 14 dní po injekčnom opracovaní.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príklady zvieracích modelov

Testovanie in vivo polynukleotidov schopných exprimovať interferón sa zvyčajne uskutočňuje na zvieracích modeloch. Nádory pri nahých myšiach sa tvoria injekciou ľudských nádorových buniek do myši. Nahé myši (kmeň nu/nu) sú imunodeficientné myši a neodvrhujú cudzorodé nádorové bunky. Nádory sa vytvoria za 1 až 2 týždne po injekcii nádorových buniek, aj keď presný okamih závisí od množstva injikovaných buniek a tumorigenicity injikovanej bunkovej línie. Polynukleotidy exprimujúce interferón sa vnesú do nádorových buniek konvenčným postupom transfekcie v bunkovej kultúre pred injekciou do myši. Alternatívne sa vhodný polynukleotid vnesie do nádoru transfekciou alebo vírusovou transdukciou in vivo po vytvorení nádorov pri myši.

Až na jeden príklad sú používané bunky buď línia karcinómu močového mechúra HTB9 (Huang a kol., pozri skôr), alebo línia retinoblastómových buniek WERI-Rb27 (Takahashi a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5257-5261, 1991). Na prenos izolovaného polynukleotidu kódujúceho interferón do kultúry sa nádorové bunky transfekujú (konvenčným spôsobom ako je kalciumfosfátová precipitácia, elektroporácia alebo transfekcia s lipofectaminom) alebo priamo infikujú (retrovírusom, adenovírusom, baculovírusom alebo adeno-asociovaným vírusom). V prípade účinnej vírusovej infekcie, keď 100 % buniek úspešne inkorporovalo príslušný polynukleotid, nie je potrebná žiadna selekcia. Okrem toho sa zistilo (pozri príklad 3), že je potrebné, aby iba malé percento buniek exprimovalo interferónový gén, takže selekcia pomocou liekov sa zvyčajne nevyžaduje.

Ak sa uskutočňuje selekcia v prípade transfekcie, ktorá nie je tak účinná, ako tu opisovaná vírusová infekcia, bunky sa transfekujú expresným vektorom, ktorý kóduje, tak gén rezistencie k lieku (ako je gén neo kódujúci rezistenciu k G418), ako aj polynukleotid, ako napr. interferónový gén. Kontrolná transfekcia sa uskutoční s vektorom, ktorý kóduje samotnú rezistenciu k lieku.

Po 2 až 3 týždňoch selekcie na médiu obsahujúcom liek sa bunkové kolónie spoja a subkutánne injikujú do boku samíc myší nu/nu (tzv. nahých myší) v počte 10⁶ buniek v objeme 100 μΐ. Vírusom infikované bunky sa injikujú priamo bez potreby uskutočňovať selekčný krok. Myši sa ďalej udržujú aspoň 2 mesiace a monitoruje sa veľkosť nádoru pomocou kalipera na týždennom základe.

Alternatívne sa netransfekované alebo neinfikované nádorové bunky subkutánne injikujú do boku myši. Po vytvorení nádoru sa priamo do nádoru injikuje DNA alebo vírus obsahujúci polynukleotid kódujúci interferón. Na tento postup sú vhodné mnohé vírusy, aj keď najúčinnejšie sú rekombinantné adenovírusy a rekombinantné retrovirusy majú výhodu, že sa trvalo integrujú do genómu nádorových buniek. DNA sa môže vniesť do buniek tak, že sa DNA zmieša s katiónovými lipozómami a potom sa injikuje táto zmes. DNA alebo vírus neobsahujúci interferónový gén sa injikujú do nádorov ďalších myši, ktoré slúžia ako kontrola. Pomocou kalipera sa potom sleduje progresia alebo regresia nádorov.

Príklad 2

Príklad modelu karcinómu pľúc

Ako ďalší príklad je možné uskutočniť liečenie ľudského malobunkového karcinómu pľúc in vivo pomocou izolovaného polynukleotidu kódujúceho interferón zapuzdreného v lipozóme tak, že sa polynukleotid kódujúci interferón vnesie do buniek vyžadujúcich tento zásah použitím lipozómov, konkrétne aerosólu malých lipozómových častíc. Pri podaní prostredníctvom aerosólu je polynukleotid kódujúci interferón deponovaný rovnomerne na povrchu nosohltanu, v tracheobronchiálnom trakte a v oblasti pľúc, pozri diskusia lipozómových aerosólov v Knight a Gilbert, Eur. J. Clin. Micro, and Inf. Dis. 7: 721-731. 1988. Na liečenie pľúcnej rakoviny takýmto spôsobom sa polynukleotid kódujúci interferón purifikuje akoukoľvek zvyčajnou metódou. Polynukleotid kódujúci interferón sa potom zmieša s lipozómami a inkorporuje sa do nich s veľkou účinnosťou. Keďže je podanie aerosólu veľmi jemné a je dobre znášané tak normálnymi dobrovoľníkmi, ako aj pacientmi, sú lipozómy obsahujúce polynukleotid kódujúci interferón podávané na liečenie pacientom trpiacim pľúcnymi rakovinami v ktoromkoľvek štádiu. Lipozómy sa podávajú nazálnou inhaláciou alebo endotracheálnou sondou pripojenou na nebulizačné zariadenie v dávkach dostatočných na inhibíciu rastu nádorov. Liečenie aerosólom sa uskutočňuje denne počas dvoch týždňov, a pokiaľ je to potrebné, opakuje sa.

Štúdie in vivo s použitím ortotopického malobunkového pľúcneho karcinómu sa môžu uskutočňovať tak, že sa nádor injikuje do pravého hlavného bronchu beztýmusových nu/nu (nahých) myší (1,5 x 106 buniek na jedno zviera). O tri dni neskôr sa začne liečenie (denne počas troch po sebe nasledujúcich dní) tým, že sa inokulujú endobronchiálne interferónovým génom zapuzdreným v lipozóme a kontroly neobsahujú sekvenciu interferónového génu. Vytváranie nádorov a ich veľkosť sa sledujú pri obidvoch skupinách meraním pomocou posuvného meradla a hodnotením prežívania myší.

Príklad 3

Génová terapia ex vivo s génom interferónu-beta la

V tomto príklade sa použila bunková línia ľudského karcinómu prsníka MBA-MD-468 (získaná z Americkej zbierky mikroorganizmov ATCC) . Bunky sa buď neinfikovali, alebo infikovali adenovírusom exprimujúcim gén ľudského interferónu-betala. V tomto prípade mal adenovírus delécie v génoch E1 a teplotné senzitívnu mutáciu v géne E2a. Metódy na prípravu tohto konkrétneho adenovírusu je možné nájsť v publikácii Engelhardt a kol., 1994, Gene Therapy 5: 1217-1229 (a ďalej sú opísané ďalšie podrobnosti). Stručne zhrnuté, gén interferónu-beta la sa už skôr klonoval do adenovírusového vektora pAdCMVlinkl tak, že translácia sa riadila promótorom CMV IE1, čím sa vytvoril adenovírusový prenosový plazmid. Gén sa vložil do tohto vektora na miesto deletovaného génu E L Rekombinantný adenovírus obsahujúci interferónový gén sa pripravil rekombináciou prenosového plazmidu a adenovírusového genómu v bunkách 293. Vírus sa potom izoloval z plaku a titroval plakovým testom konvenčným spôsobom.

Materiál a metódy Bunkové kultúry

Ľudské karcinómové bunky MDA-MB-468, Huh7, KM12LA4, ME180, HeLa, U87 a 293 sa udržiavali ako adherentné kultúry v Dulbeccom modifikovanom Eaglovom médiu obsahujúcom 10 % hovädzie sérum, 2 mM glutamin, penicilín a streptomycín, neesenciálne aminokyseliny a vitamíny.

Príprava purifikovaných adenovírusov

Adenovírusový prenosový vektor kódujúci ľudský gén IFN-β riadený skorým promótorom cytomegalovírusu, pAdCMV-huIFNfl, sa skonštruoval ligáciou inzertu cDNA kódujúcej ľudský IFN-pia do plazmidu pAdCMVlinkl (pozri Enhelhartd a kol., 1994). Plazmid pAdCMV-huIFNp sa preniesol do buniek 293 spoločne s genómovou DNA purifikovanou z teplotné senzitívneho adenovírusu H5tsl25. Rekombinantné adenovírusy pochádzajúce z jednotlivých plakov sa potom použili na infikovanie buniek 293 pri 39 °C a supernatanty sa testovali na génovú expresiu IFN-β pomocou ELISA testu. Identifikoval sa adenovírus nesúci cDNA pre IFN-β (H5-110hlIFNP) a ďalej amplifikoval. Podobne sa pripravil kontrolný adenovírus s teplotné senzitívnou mutáciou v E2A kódujúci kolorimetrický marker β-galaktozidázu (H5.1 lOlacZ).

Preparáty vírusov sa potom produkovali v bunkách 293 a purifikovali v gradiente CsCl po dvoch cykloch plakovej izolácie. Tieto preparáty sa ukázali negatívne v teste na prítomnosť adenovírusu divého typu.

Subkonfluentné bunky sa infikovali H5.1 lOhlIFNp pri násobku infekcie (MOI) 100 v 3 ml média obsahujúcom 2 % hovädzie sérum. O 15 až 18 hodín neskôr sa supematanty zozbierali a kvantitatívne sa stanovila koncentrácia IFN-β pomocou ELISA testu.

ELISA test

96-jamkové doštičky sa obalili cez noc pri 4 °C protilátkou proti ľudskému IFN-β, B02 (Summit Pharmaceuticals Co., Japonsko). Protilátka sa použila v koncentrácii 10 pg/ml v obaľovacom pufri, ktorý obsahoval 50 mM hydrogenuhličitan/uhličitan sodný, 0,2 mM MgCl₂ a 0,2 mM CaCl₂ (pH 9,6). Po blokovaní doštičiek s 1 % kazeínom v PBS 1 hodinu pri teplote miestnosti sa pridali vzorky štandardov IFN-β proteínu (AVONEX™, Biogen), nariedili v 1 % kazeíne a 0,05 % Tween-20. Doštičky sa potom postupne inkubovali pri teplote miestnosti 1 hodinu s králičím anti-IFN- β sérom (riedenie 1 : 2000), 1 hodinu s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou s osľou anti-králičou protilátkou (Jackson Immuno Research, riedenie 1 : 5000) a substrátovým roztokom (4,2 mM TMB a 0,1 M octan sodný - kyselina citrónová, pH 4,9). Po zastavení reakcie pomocou 2 N H₂SO₄ sa merala absorbancia pri 450 nm.

Pokusy na myšiach

Samice myši balb/c nu/nu staré 4 až 6 týždňov sa získali z firmy Taconic (Boston, Massachussets). Všetky myši sa udržiavali v špeciálnom zariadení bez patogénov firmy Biogen počas najmenej 2 týždňov pred pokusom. Pre experimenty in vivo sa infikované a neinfikované bunky zozbierali roztokom trypsín/EDTA a dvakrát opláchli s PBS. Tieto bunky sa zmiešali tesne pred injikovanim do myší za opísaných podmienok. Celkom sa implantovalo 2 x 10⁶ buniek v 10 μΐ PBS subkutánne do pravého boku. Veľkosť nádorov sa merala ako dĺžka a šírka pomocou posuvného meradla a uvedené hodnoty predstavujú priemernú hodnotu priemeru nádoru (v mm).

Pre experimenty s priamou injekciou in vivo (príklad 4) sa najskôr implantovalo 2 x 10⁶ buniek v 100 μΐ PBS subkutánne do nahých myší. Keď veľkosť nádoru dosiahla 5 až 6 mm, injikovalo sa 100 μΐ PBS obsahujúceho rôzne dávky rekombinantných adenovírusov priamo do stredu nádoru ako jediná injekcia. Monitorovala sa dĺžka a šírka nádoru pomocou posuvného meradla. Veľkosť nádoru sa vyrátala ako priemerná hodnota zo šírky a dĺžky. Smrť zvieraťa sa určila tým, že zvieratá sa utratili, keď nádory prejavovali známky krvácania alebo ich hmotnosť dosiahla 10 % celkovej telesnej hmotnosti. Apoptóza sa vyšetrovala pomocou súpravy in situ Apoptosis Detection Kit od firmy Oncor, Inc. (katalóg, č. S7110-KIT).

Výsledky

Najskôr sa vyhodnotila účinnosť transdukcie a expresie transgénu adenovírusových vektorov. Bunky ľudského karcinómu prsníka MDA-MB-468 sa infikovali s H5-1 lOlacZ so zvyšujúcou sa multiplicitou infekcie (MOI). Po zafarbení X-gal sa stanovilo, že pri MOI 100 účinnosť transdukcie dosiahla približne 100 % pri týchto bunkách (dáta nie sú uvedené). Teda bunky karcinómu prsníka sa infikovali v kultúre v pomere 100 jednotiek tvoriacich plak (pfu) na jednu bunku, pretože zo skúsenosti s týmito karcinómovými bunkami vyplývalo, že to bol najnižší pomer vírus: bunka, ktorý spôsobil expresiu génu v každej bunke populácie.

V prvom pokuse bola 18 hodín po infekcii podaná subkutánne injekcia 2 x 10⁶ buniek do chrbta každej nahej myši. 5 myšiam sa podali injekcie neinfikovaných buniek a 5 myšiam sa podali injekcie buniek infikovaných adenovírusom-IFNp. Pri všetkých myšiach injikovaných kontrolnými neinfikovanými bunkami vznikli nádory s významnou veľkosťou. Pri žiadnej z myší injikovaných bunkami opracovanými adenovírusom exprimujúcim IFN- β sa nádor neobjavil (H5-I Ι ΟΙιΙΡΝβ: tabuľka 1).

Aby sa vylúčila možnosť, že in vitro expozícia nádorových buniek proteínu IFN- β mohla spôsobiť stratu schopnosti vyvolávať nádory in vivo, bunky MDA-MB-468 sa opracovali proteínom IFN-β s takou koncentráciou, ktorá sa detegovala po 18 hodinách vírusovej infekcie. Po dôkladnom premytí sa nahým bunkám podávali injekcie s rovnakým množstvom opracovaných buniek, neopracovaných buniek alebo zmesi 10 % opracovaných buniek. Vo všetkých ttoch skupinách myší sa pozoroval rozvoj nádorov (dáta nie sú uvedené), čo naznačuje, že na inhibíciu tvorby nádorov je kritické podanie génu IFN-β ex vivo, a nie opracovanie proteínom in vitro.

Aby sa určilo, či rakovinové bunky exprimujúce gén IFN-β môžu spôsobovať deštrukciu netransdukovaných buniek, uskutočnil sa nasledovný pokus. Rovnaké rakovinové bunky sa buď neiníikovali, infikovali adenovírusom exprimujúcim gén IFN-β (Η5.110ΜΡΝβ), alebo sa infikovali rovnakým typom adenovírusu, ale exprimujúcim gén lacZ (H5.1101acZ), ktorý kóduje reportérový proteín β-galaktozidázu, pri ktorom sa neočakáva žiadny protirakovinový účinok, a preto je to kontrola akéhokoľvek účinku vyvolaného samotným adenovírusom. Všetky adenovírusové infekcie sa vyvolávali pri pomere pfu : bunka = 100. Nádorové bunky MDA-MB-468 sa infikovali oddelene s H5. 1 ΙΟΜΡΝβ alebo H5.1101acZ s MOI 100. 18 hodín po infekcii sa infikované bunky zozbierali a časť sa zmiešala s neinfikovanými bunkami tesne pred injekciou myšiam. Nahým myšiam Balb/c sa subkutánne implantovalo rovnaké množstvo infikovaných buniek alebo zmesi 10 % infikovaných buniek a 90 % buniek, ktoré neboli vírusu vystavené. Rast nádorov sa sledoval o 12 dní neskôr. Zatiaľ čo pri všetkých myšiach, ktorým sa implantovali neinfikované bunky, sa vyvinuli nádory, pri myšiach, ktoré dostali 100 % buniek infikovaných H5.1 ΙΟΜΡΝβ alebo H5.1101acZ, sa nepozorovali žiadne nádory, čo svedči o tom, že infekcia obidvoma vírusmi môže zrušiť schopnosť vyvolávať nádory (tabuľka 1). Ale pri všetkých myšiach, ktoré dostali 10 % buniek infikovaných H5.1101acZ, sa nádory vyvinuli, zatiaľ čo pri žiadnej z myši, ktoré dostali 10 % buniek infikovaných II5.1 ΙΟΜΡΝβ sa tak nestalo. Teda infekcia H5.1 lOlacZ, aj keď bola postačujúca na supresiu tvorby nádoru už infikovaných buniek, zlyhala v blokovaní tumorogenicity spoločne injikovaných naivných a neinfikovaných buniek. Na rozdiel od toho, transdukcia s H5.1 ΙΟΜΡΝβ v 10 % buniek bola postačujúca na supresiu tumorogenicity buniek, ktoré sa transdukovali vírusom, a tiež buniek, ktoré transdukované neboli. Inhibicia tvorby nádoru H5.1 lOlacZ pri 100 % transdukovanej populácii mohla byť spôsobená niektorými všeobecnými toxickými účinkami alebo niektorými protinádorovými účinkami tejto generácie adenovírusu, ale je nutné poznamenať, že transdukované bunky boli schopné replikovať sa in vitro (nepublikované údaje).

Aby sa stanovilo množstvo vírusu obsahujúceho interferón potrebné na supresiu tumorogenicity, nádorové bunky oddelene infikované s H5.1 ΙΟΜΡΝβ a H5.1101acZ sa zmiešali s neinfikovanými bunkami v rôznych pomeroch tak, aby bol v každom prípade prebytok neinfikovaných buniek. Zmesi sa zostavili tak, že rôzne vzorky obsahovali 10 %, 3 %, 1 % a 0,3 % buniek infikovaných adenovírusom a zvyšok sa neinfikoval. Okamžite po zmiešaní sa bunky injikovali nahým myšiam. Výsledky sú ukázané v tabuľke 1. Priemery nádorov sú merané v dvoch rozmeroch rôzny čas po injekcii buniek. Každá položka v tabuľke 1 predstavuje priemer ± štandardnú odchýlku merania priečneho a pozdĺžneho priemeru pri štyroch myšiach. Meranie sa uskutočňovalo v dňoch 12, 19, 26 a 33 po injekcii nádorových buniek.

Tabuľka 1

Priemerný rozmer nádorov (v mm)

Vzorka	Deň 12	Deň 13	Deň 2 6	Deň 33
100 % neinfikovaných	4,1 ± 0,6	4,0 ± 0,8	5,9 ± 0,5	6, 3 ± 0,6
100 % AdV-IFN	0,0	0,0	0,0	0,0
10 ΐ AdV-IFN	0,0	0,0	0,0	0,0
3 % AdV-IFN	0,0	0,0	0,0	0, 0
1 % AdV-IFN	c,o	0,0	0,0	0,0
0,3 % AdV-IFN	2,8 + 0,2	2,9 ± 0,3	3,0 ± 0,6	1,8 ± 2,0
100 % AdV-lacZ	0, 0	0,0	0,0	0, 0
1C % AcV-lacľ	4,8 ± 0,4	5,2 ± 0, 6	6,2 ± 0,5	6,5 ± 0,5
3 % AdV-lacZ	4,3 ± 0,5	4,6 + 0,6	5,8 + 0,8	6,5 + 1,0
1 % AdV-lacZ	4,3 + 0,4	4,6 ± 0,4	5,0 + 0, 5	6,3 ± 0,9
C, 3 % AdV-lacZ	4,4 ± 0,5	4,7 ± 0,6	NESTANOVENÉ	NESTANOVENÉ

Rozvoj nádorov bol úplne blokovaný pri myšiach, ktoré dostali dokonca iba 1 % buniek transdukovaných s H5.1 lOhlFN'P (tabuľka 1). V prvom týždni po injekcii buniek sa detegovali veľmi malé nádory (boli prístupné palpácii, ale neboli dostatočne veľké na meranie) pri myšiach injikovaných 10, 3 a 1 % H5.1 lOhlFNp. Ale všetky tieto malé nádory kompletne ustúpili na 9. deň. To naznačuje, že niektoré bunky krátky čas prežívali a počas tohto obdobia exprimovali gén IFN- β, čo spôsobilo smrť celého nádoru. V niekoľkých pokusoch uskutočňovaných s touto bunkovou líniou na nahých myšiach nebola tvorba nádorov nikdy pozorovaná, keď sa 1 % buniek transdukovalo Η5.110ΜΡΝβ a prežitie bolo 100 % (dáta nie sú uvedené). Pri myšiach, ktoré dostali 0,3 % buniek transdukovaných H5.1 lOhIFNP sa vyvinuli nádory, ale veľkosť týchto nádorov bola výrazne menšia ako nádorov pri kontrolných myšiach a pri 2 z 5 myší v tejto 0,3 % skupine sa na 33. deň pozorovala úplná regresia (tabuľka 1).

Na rozdiel od toho pri myšiach, ktoré dostali 10 % až 0,3 % buniek opracovaných H5.1 lOlacZ, sa vyvinuli nádory s podobnou veľkosťou ako pri neinfikovanej skupiney a v žiadnej z týchto kontrolných skupín sa nepozorovala regresia nádoru (tabuľka 1).

Nepochybne sa ukazuje, že expresia ľudského interľerónu beta (hIFN-β) aj iba vo veľmi malom percente buniek blokuje pri nahých myšiach tumorogenézu. Ďalej sa vyšetroval najnižší pomer buniek infikovaných H5.1 ΙΟΙιΙΕΝβ nevyhnutný na ovplyvnenie, ale nie nutne blokádu, tvorby nádoru a podporujúci prežitie myší. Nahým myšiam sa implantovali rovnaké množstvá buniek MDA-MB-468 obsahujúce 0,3 %, 0,1 %, 0,03 %, 0,01 % a 0 % buniek infikovaných Η5.110ΜΡΝβ a sledoval sa rast nádorov. Myšiam, ktoré dostali 0,3 % alebo 0,1 % infikovaných buniek, sa vyvinuli omnoho menšie nádory v porovnaní s myšami, ktoré dostali iba neinfikované bunky (obrázok 1A). Z nádorov, ktoré sa tvorili pri 0,3 a 0,1 % transdukciu, úplne regredovali 3 z 5 a 1 z 5 nádorov. Významne predĺžené prežitie sa pozorovalo v 0,3 % a 0,1 % transdukčných skupín. Zatiaľ čo implantácia 0 %, 0,01 % alebo 0,03 % infikovaných buniek spôsobila smrť všetkých zvierat počas 75 dní, v skupinách 0,1 % a 0,3 % bolo nažive bez nádorov 1 z 5 a 3 z 5 zvierat na 109. deň, keď sa tento pokus ukončil (obrázok 1B).

Je pravdepodobné, že iba malá časť (väčšia ako približne 0,3 %, výhodne väčšia ako približne 1,0 %) všetkých nádorových buniek potrebuje byť transfekovaná alebo infikovaná, aby sa dosiahla účinnosť. To sa líši od takýchto prístupov protinádorovej génovej liečby, ako je podávanie nádorových supresorov divého typu (napríklad p53), v ktorých každá bunka v nádore potrebuje získať nádorový supresorový gén.

Teda gén interferónu dokazuje silný antiproliferatívny účinok in vivo po infekcii in vitro. Kontroly ukazujú, že to bolo spôsobené skôr interferónom ako adenovírusom.

Génová terapia IFN- β ex vivo ďalších ľudských nádorových xenoimplantátov

Účinok transdukcie H5.110hIFN3 sa tiež testoval na ďalších nádorových bunkových typoch v modeli ľudského xenoimplantátu ex vivo. Bunky ľudského karcinómu hrubého čreva KM12L4A, bunky ľudského karcinómu pečene Huh7 alebo bunky ľudského karcinómu čipku krčka ME180 sa transdukovali s H5.1 ΙΟΜΕΝβ .Rovnaké množstvo buniek obsahujúce 10 %, 1 % a 0 % transdukovaných buniek sa testuje na schopnosť tvoriť nádory pri nahých myšiach. Injekcie neinfikovaných buniek troch typov spôsobujú tvorbu rýchlo rastúcich nádorov pri všetkých myšiach. Na rozdiel od toho podávanie 10 % buniek infikovaných II5.1 ΙΟΙιΙΕΝβ ex vivo spôsobilo to, že sa nádor nevyvinul alebo sa pri všetkých vyšetrovaných zvieratách oneskoril výskyt pomalšie rastúcich nádorov (obrázok 2A). Na rozdiel od výsledkov získaných s bunkami MDA-MB-468, pri ktorých 1 % transdukcie úplne zabránilo tvorbe nádorov, 1 % transdukcia týchto troch bunkových typov spôsobila tvorbu nádorov, aj keď ich veľkosti boli menšie ako pri neinfikovaných kontrolách v každom časovom bode. Myši, ktoré dostali 10 % a 1 % transdukovaných buniek, prežívali dlhšie v porovnaní s tými, ktoré dostali neinfikované bunky (obrázok 2B). Teda podávanie génu IFN-β sprostredkované adenovírusom ex vivo do početných odlišných nádorových buniek spôsobilo účinnú inhibíciu tumorogenicity a spôsobilo predĺžené prežívanie zvierat.

Príklad 4

Génová terapia in vivo s génom interferónu-beta la

Namiesto spôsobu terapie ex vivo sa uskutočnila priama génová terapia in vivo. Pri génovej terapii in vivo sa gén podáva priamo pacientovi. V tomto príklade sa adenovírus obsahujúci ľudský gén IFN-β (H5.1 ΙΟΙιΙΕΝβ) priamo injikoval do pevných nádorov. Stručne zhrnuté, 2 x 10^ó buniek ľudského karcinómu prsníka MBA-MD-468 sa injikovalo subkutánne do chrbta päťdesiatich myší. Vytvorili sa subkutánne nádory s približnou veľkosťou 5 až 6 mm v priemere pri nahých myšiach do 24 dní po subkutánnej injekcii buniek MBA-MD-468. V tomto čase sa nádory opracovali buď s PBS, alebo s vektormi H5.1 ΙΟΜΕΝβ a H5.1101acZ v rôznych dávkach vírusu v rozsahu od 1 x 10⁷ do 3 x 10⁹ pfú/myš v jednej intratumorovej injekcii.

Dáta uvedené na obr. 3 ukazujú, že počas 14 dní liečenia jedinou dávkou H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ v 3 x 10⁹, 1 x 10⁹ alebo 3 x 10⁸ celkových pfti spôsobilo regresiu nádoru. K úplnej regresii nádoru došlo pri 4 z 5 myší v skupine 3 x 10⁹ pfu H5.1 lOhIFNp a pri 3 z 5 myší v skupine 1 x ΙΟ⁹ H5.1 lOhIFNp. V nádoroch injikovaných dávkou 1 x ΙΟ⁹ H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ sa detegovala vysoká lokálna koncentrácia IFN-β 1500 IU/ml, zatiaľ čo v sére sa detegovalo iba 37 IU/ml IFN-β. Nižšie dávky IFN-β, ktoré boli 1 x 10⁸, 3 x 10⁷ a 1 x 10⁷ mali iba veľmi malý alebo žiadny účinok (obr. 3 a neuvedené dáta), čo ukazuje, že protinádorová odpoveď je závislá od dávky. Injekcia PBS alebo H5.1101acZ v rovnakých dávkach nespôsobovala regresiu nádoru (obr. 3). Keď sa nádory monitorovali dlhší čas, pomalý rast a regresia sa pozorovali pri niekoľkých individuálnych nádoroch injikovaných s H5.1101ac7, s dávkou 3 x 10⁹ pfu, čo ukazuje, že aj kontrolný vírus s touto dávkou môže slabo inhibovať rast nádorov. Opracovanie H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ v dávkach 3 x 10⁹, 1 x 10⁹ alebo 3 x 10⁸ pfu významne zvyšovalo prežívanie v porovnaní s myšami opracovanými s PBS alebo H5.1101acZ (údaje nie sú uvedené). Testovali sme tiež podanie niekoľkých injekcií. Napr. 5 injekcií s dávkou 1 x 10⁸ pfu H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ podávaných raz za tri dni do založených nádorov MDA-MB-468 alebo HeLa spôsobilo pomalší rast a regresiu nádorov obidvoch typov (nepublikované). Uskutočnil sa tiež podobný experiment in vivo s líniou ľudských gliómových buniek U 87: tieto bunky boli veľmi citlivé na IFN- β, keďže sa pozorovala úplná regresia nádoru pri 4 myšiach zo 5 liečených dávkou 1 x 10⁹ pfu H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ a pri 2 zo 4 liečených dávkou 1 x 10⁸ pfu (dáta nie sú uvedené). Tieto zistenia ukazujú, že priame a lokálne podanie génu IFN-β prostredníctvom adenovírusu môže prejaviť výrazný protinádorový účinok.

Štyri dni po injekcii 1 x 10⁹ pfu vírusu sa nádory MDA-MB-468 odobrali na histologickú analýzu. V tomto čase nádory injikované s K5.110hIFNp javili známky regresie. Uskutočnila sa hematologická analýza nádorov MDA-MB-468 farbením hematoxylínomeozínom. Viac apoptotických buniek sa pozorovalo v nádoroch injikovaných s H5.1 ΙΟΙιΙΡΝβ ako v nádoroch injikovaných s H5.1101acZ. Apoptóza sa potvrdila priamou detekciou fluorescencie koncovo značenej fragmentovanej genómovej DNA. Iba veľmi málo infiltrujúcich mononukleámych buniek sa pozorovalo v nádoroch injikovaných s Η5.110ΜΡΝβ alebo H5.1 lOIacZ, čo ukazuje, že bunková imunitná odpoveď nemusí hrať hlavnú úlohu v regresii nádoru riadenej s H5.1 lOhIFNP pri tomto modele.

Obidva opísané pokusy ex vivo a in vivo merali iba priamy antiproliferatívny účinok interferónu. Pretože ide o myši s imunodeficitom, nie je prítomná žiadna imunostimulačná aktivita interferónu, ktorá by mohla stimulovať zničenie nádoru. Pretože interferóny nie sú druhovo skrížené z človeka na myš, tiež by sa načakalo, že by ľudský IFN-β používaný na inhibíciu ľudských rakovinových buniek pri týchto myšiach inhiboval angiogenézu, pretože ľudský IFN-β nepôsobí na myšie vaskulárne endotelové bunky. Teda je možné, že ak by boli adenovírusom s ľudským IFN-β liečení ľudskí pacienti, pozorovala sa dokonca výraznejšia protirakovinová aktivita. To by sa mohlo modelovať na imunokompetentných primátoch iného ako ľudského pôvodu. Ako alternatíva by sa pri imunokompetentných myšiach s nádormi myšacieho pôvodu mohol použiť adenovírus s myšacím génom IFN- β. Mnoho týchto syngénnych modelov myšacích nádorov je k dispozícii.

Tu uvedené dáta dokazujú pozoruhodnú schopnosť génovej liečby IFN-β blokovať tvorbu nádorov de novo, a tiež spôsobiť regresiu dokázaných nádorov. Transdukčné pokusy ex vivo potvrdili, že zavedenie silného sekretovaného proteínu do aj tak málo ako 0,3 % - 1 % transdukovaných buniek, blokovalo rozvoj nádorov MDA-MB-468. Testoval sa celý rad ďalších nádorových bunkových línií, a zatiaľ čo tu boli rozdiely v sile účinku IFN-β, mohli byť všetky blokované 1-10 % buniek transdukovaných s IFN-β. Relatívne malé percento buniek sekretujúcich IFN-β nevyhnutné na ovplyvnenie tvorby nádoru bolo povzbudzujúce pre ďalší pokus, keď sa dopredu vytvorili nádory stimulované priamou intratumorovou injekciou adenovírusu. Účinok podania génu IFN-β bol pri jednej injekcii vírusu opäť silný, čo spôsobilo buď čiastočnú, alebo v niektorých prípadoch aj úplnú regresiu nádorov.

V týchto štúdiách sa ukázalo, že dramatická regresia nádorov je primáme dôsledkom priamej antiproliferatívnej alebo cytotoxickej aktivity IFN-β. Tento záver bol podporený faktom, že gén IFN-β používaný v tejto štúdií je ľudského pôvodu, a ľudský IFN-β nereaguje skrížené s hostiteľskými myšacími bunkami. Tiež imunodeficitné nahé myši, ktoré sa použili, neobsahujú T lymfocyty, hlavnú efektorovú bunku v imunostimulácii indukovanej s IFN typu I (Tough, D. F. a kol., Science 272: 1947-1950, 1996, Rogge, L. a kol., J. Exp. Med. 185: 825-831, 1997). Okrem toho, pri nádoroch rýchlo regredujúcich po podaní génu IFN-β sa nepozorovalo zreteľné zvýšenie infiltrácie mononukleámych buniek. Tieto nálezy podporujú teóriu, že samotná antiproliferativna aktivita sprostredkovaná IFN-β by mohla byť postačujúca na vyvolanie nádorovej regresie. Ukazuje sa, že dáta vynálezu sú konzistentné so skôr pozorovanou klinickou koreláciou medzi senzitivitou malígnych buniek in vitro k antiproliferatívnej aktivite indukovanej IFN- β a liečebnému účinku in vivo (Einhom a Grander, J. Interferon Cytokine Res., 16, 275-281, 1996).

Je možné urobiť záver, že sa zistilo, že génová terapia s IFN-β sprostredkovaná adenovírusom môže v myšacích modeloch uplatniť použiteľný protinádorový účinok. Podávanie génu IFN-p ex vivo vo veľmi malom percente buniek bolo postačujúce, aby blokovalo tvorenie nádoru a priame intratumorové podanie génu IFN-β v jednej dávke spôsobilo regresiu dokázaných nádorov. Bez ohľadu na akúkoľvek teóriu účinku, tento výrazný protinádorový účinok môže byť dôsledkom autokrinného a parakrinného pôsobenia IFN- β. Tento protinádorový účinok by mohol byť kritický faktor v klinických skúškach génovej liečby rakoviny, v ktorých je pravdepodobné, že je limitujúce množstvo podávania génov a je nevyhnutný významný vedľajší účinok. Teda miestna génová liečba s IFN-β génom poskytuje sľubnú stratégiu pre liečbu nádorov u ľudí.

Ekvivalencia

Je potrebné chápať, že predchádzajúci text je iba detailným opisom niektorých výhodných uskutočnení predkladaného vynálezu. Odborníkovi je preto zrejmé, že sa môžu uskutočniť modifikované či ekvivalentné riešenia vynálezu, ktoré spadajú do predmetu predkladaného vynálezu.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie vírusového vektora obsahujúceho gén, ktorý kóduje proteín interferón-beta, na prípravu liečiva na liečenie rakoviny, pričom a) uvedený proteín interferón-beta je exprimovaný z tohto génu; a b) uvedený vírusový vektor je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z adenovírusového vektora, lentivírusového vektora, bakulovírusového vektora, vektora na báze vírusu Epstein-Barrovej, papovavírusového vektora, vektora na báze vírusu vakcínie a vektora na báze vírusu herpes simplex.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde týmto vírusovým vektorom je adenovírusový vektor.
3. 3. Použitie podľa nároku 2, kde adenovírusový vektor má deléciu v úseku El.
4. 4. Použitie replikačne defektného vírusového vektora obsahujúceho gén, ktorý kóduje proteín interferón-beta, na prípravu liečiva na liečenie rakoviny, pričom a) uvedený proteín interferón-beta je exprimovaný z tohto génu; a b) uvedený vírusový vektor je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z adenovírusového vektora, lentivírusového vektora, bakulovírusového vektora, vektora na báze vírusu Epstein Barrovej, papovavírusového vektora, vektora na báze vírusu vakcínie a vektora na báze vírusu herpes simplex.
5. 5. Použitie podľa nároku 4, kde týmto vírusovým vektorom je adenovírusový vektor.
6. 6. Použitie podľa nároku 5, kde adenovírusový vektor má deléciu v úseku El, E2a a/alebo E4.
7. 7. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 6, kde uvedený vírusový vektor je podávaný spôsobom vybraným zo skupiny, ktorá pozostáva z priameho injekčného podania do alebo v blízkosti nádoru, topického podania, parenterálneho podania, intraokulámeho podania, intranazálneho podania, intratracheálneho podania, intrabronchiálneho podania a subkutánneho podania.
8. 8. Použitie podľa nároku 7, kde uvedený vírusový vektor je podávaný parenterálne.
9. 9. Použitie podľa nároku 8, kde uvedené parenterálne podanie je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z intravenózneho podania, intramuskulámeho podania a intraperitoneálneho podania.
10. 10. Použitie podľa nároku 1 alebo 4, kde rakovinou je malígny glióm, melanóm, hemangióm, leukémia, lymfóm, myelóm, kolorektálny karcinóm, nemalobunkový karcinóm, karcinóm prsníka a karcinóm vaječníkov.
11. 11. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 10, kde uvedený gén kóduje ľudský proteín interferón-beta.
12. 12. Použitie podľa niektorého z nárokov 1 až 11, kde liečivo neobsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu selektovateľný markerový gén.