KR100699285B1 - 인터페론-베타와 같은 분비 단백질을 암호화하는 유전자를이용한 치료 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동일계 인간 인터페론과 같은 분비 단백질을 암호화하는 DNA로 포유류 수용체 세포를 변형시키는 방법 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 분비 단백질 발현계를 생체내 또는 생체외에서 형성하는 단계, 발현계를 포유류 수용체내로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 발현계 및 방법은 동일계 인터페론의 국부 및 전신 전달에 유용하다.
Description
본 발명은 유전자 치료법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 인간 및 동물에서 인터페론 단백질과 같은 분비 단백질을 암호화하는 DNA 전달에 관한 것이다.
인터페론("IFN" 또는 "INFs"로도 칭함)은 각종 생물학적 활성을 가지는 단백질로서, 일부 활성으로는 항바이러스성, 면역조절성 및 증식억제성이 있다. 인터페론은 바이러스, 폴리펩티드, 분열유발인자 등과 같은 각종 유발자(inducer)에의 노출에 반응하는 포유류 세포가 생성하는 상대적으로 작고, 종특이적인 1본쇄 폴리펩티드이다. 인터페론은 바이러스 공격에 대해 동물 조직 및 세포를 보호하는 중요한 숙주 방어 메카니즘이다. 대부분의 경우, 인터페론은 다른 유형의 조직 및 세포보다 인터페론이 생성된 유형의 조직 및 세포에 대해서 더 우수한 보호 효과를 나타내는데, 이는 인간 유래의 인터페론이 기타 종에서 유래한 인터페론보다 인간의 질병을 치료하는데 더욱 효과적이라는 것을 제시한다.
인간 인터페론에는, 일반적으로는 백혈구(인터페론-알파[α]), 섬유아세포( 인터페론-베타[β]) 및 면역(인터페론-감마[γ])으로 분류되는 몇가지 구별되는 유형과 다수의 이의 변형체가 있다. 인터페론의 일반적인 논의는 본원에서 참고로 인용한 각종 서적과 모노그래프[예, The Interferon System(W.E. Stewart, II, Springer-Verlag, N.Y. 1979); 및 Interferon Therapy(World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneva 1982)]에 개시되어 있다.
인터페론은 이들 분자가 여러 레벨에서 작용하는 항암 활성이 있기 때문에 각종 인간 암의 치료에 효능이 있다. 첫째, 인터페론 단백질은 인간 종양 세포의 증식을 직접 억제할 수 있다. 증식 억제 활성은 시스 플라틴, 5FU 및 탁솔과 같은 각종 허가된 화학치료제를 같이 사용하면 상승된다. 둘째, 인터페론 단백질의 면역조절 활성은 종양 억제 면역 반응의 유도를 유발할 수 있다. 이러한 반응은 NK 세포의 활성화, 대식세포 활성화의 자극 및 항종양 세포독성 T 림프구 활성의 유도를 유발하는 MHC 클래스 I 표면 발현의 유도를 포함한다. 또한, 일부 연구로부터 IFN-β 단백질이 혈관형성 억제 활성을 가질 수 있음을 추가로 알아내었다. 혈관형성성, 즉 새로운 혈관을 형성하는 것은 고형 종양의 증식에 중요하다. IFN-β가 bFGF 및 VEGF와 같은 프로-혈관형성 인자의 발현을 억제함으로서 혈관 형성을 억제할 수 있다는 증거가 제시되었다. 마지막으로, 인터페론 단백질은 조직 재모델링에 중요한 콜라게나제 및 엘라스타제와 같은 효소의 발현에 영향을 줌으로써 종양 침입성을 억제할 수 있다.
인터페론은 2가지 상이한 메카니즘을 기초로 항바이러스 활성을 가지는 것으 로 보인다. 예를 들어, I형 인터페론 단백질(α 및 β)은 인간 B형 간염 바이러스("HBV") 및 C형 간염 바이러스("HCV")의 복제를 직접 억제할 수 있지만, 이들 바이러스에 감염된 세포를 공격하는 면역 반응을 자극할 수도 있다.
특히 유효 치료적 가치에도 불구하고, 인터페론 단백질은 바이러스성 간염 및 고형 종양에 대한 임상적인 성공에만 제한되어 왔다. IFN-α는 HBV 및 HCV의 치료 용도로 허가되었다. 그러나, 두 경우에 반응율은 단지 약 20%이다. 인터페론 단백질은 림프종, 백혈병, 흑색종 및 신장 세포 암종과 같은 일부 암 치료용으로 허가되었지만, 인터페론을 단독으로 또는 고형 종양 치료 분야에서 통상적인 화학치료제와 함께 사용되는 대부분의 임상 실험은 성공하지 못하였다.
인터페론의 투여 방법은 중요한 치료제의 임상 용도에서 중요한 인자이다. 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의한 인터페론 단백질의 전신 투여는 가장 빈번하게 사용되며 모발 세포 백혈병, 후천성 면역 결핍증(AIDS) 및 관련 카포시 육종과 같은 질병을 치료하는데 어느 정도 성공하였다. 그러나, 정제된 형태의 단백질은 분해에 특히 민감하다는 것이 알려져 있다. 특히, 인터페론 베타의 경우, 용액내 인터페론의 분해의 주요 메카니즘은 응집 및 탈아미드화이다. 따라서, 용액 및 기타 생성물내 인터페론의 안정성 부족으로 그 사용이 제한되어 왔다. 또한, 비경구 인터페론 단백질 투여 후(근육내, 피하 또는 정맥내) 인터페론 단백질의 제거율은 매우 빠르다. 그러므로, 비경구 단백질 투여는 활성 부위(고형 종양, 또는 간염의 경우에 간)에 충분한 양의 인터페론을 공급할 수 없다. 환자내 비경구적으로 제공될 수 있는 인터페론의 양은 고용량의 인터페론에서 관찰되는 부작용 때문에 제 한된다. 더욱 효과적인 치료법이 필요한 것은 분명하다.
발명의 개요
본 출원은 치료제로서의 인터페론 단백질과 같은 분비 단백질을 전달하는 것과 관련된 문제를 해결하기 위한 것이다. 본 발명은 단백질 그 자체보다는 분비 단백질을 암호화하는 유전자를 전달하는 인터페론 치료법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 유전자적으로 조작된 세포의 사용을 기초로 하는 유전자 치료법을 제공하고, 포유류 수용체에게 인터페론과 같은 분비 단백질을 전달하기 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명은 세포 발현계를 형성하는 방법, 이에 의해 형성된 발현계 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하여 이들 및 기타 목적을 달성한다. 세포 발현계는 1종 이상의 분비 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하고, 동일계 포유류 수용체에 유전자 생성물을 전달하는 용도의 매개체로서 유용하다. 바람직한 양태에서, 포유류 수용체는 인간이다.
본 발명의 일양태에서, 세포 발현계는 증상을 치료하는 용도의 인터페론 단백질을 생체내 포유류 수용체의 세포에서 발현한다. 발현계는 포유류 수용체와 동일한 종의 세포 및 그 내부에 포함된 인터페론 단백질을 발현하는 발현 벡터를 포함한다. 바람직하게는 포유류 수용체는 인간이며, 발현 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 발현계는 포유류 수용체와 동일한 종의 다수의 세포 및 그 내부에 함유된 분비된 단백질을 발현하는 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 다수의 세포의 일부내에만 함유시킨다. 세포 수의 0.3% 이상이 벡터를 함유하는 것이 바람직하다. 바람직한 분비 단백질은 인터페론이고 가장 바람직한 인터페론은 알파, 베타, 감마 및 공통 인터페론이며, 베타 인터페론이 가장 바람직하다.
기타 양태에서, 세포 발현계는 다수의 암세포를 포함하고, 암세포의 적어도 일부는 발현시 인터페론을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 가지는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 이 세포 발현계에서, 아데노바이러스 벡터는 (a) E1 유전자내 결실 및/또는 돌연변이를 보유한 아데노바이러스 벡터, (b) E2a 유전자내 결실 및/또는 돌연변이를 보유한 아데노바이러스 벡터[이 벡터는 인간의 인터페론-베타를 발현함], (c) E1 및 E4 유전자내 결실 및/또는 돌연변이를 보유한 아데노바이러스 벡터, 및 (d) 모든 유전자가 결실된 아데노바이러스 벡터[이 벡터는 인간의 인터페론 벡터를 발현함]로 구성된 군에서 선택된다.
포유류 수용체 부위로 분비 단백질을 전달하는 용도의 약학 조성물도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 조성물은 담체 및 포유류 수용체와 동일한 종의 유전자 변형된 다수 세포를 포함하고, 최소한 세포의 일부는 분비 단백질의 유효량을 발현하는 발현 벡터를 포함한다. 바람직한 분비 단백질은 인터페론이다. 본 발명의 조성물로는 생체내 전달용 및 생체외 전달용 조성물이 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 포유류 수용체에 투여하기 위한 생체외 유전자 치료용 약학 제제를 제조하는 방법이다. 이 방법은 (a) 포유류 수용체와 동일한 종의 다수 세포를 형성하는 단계, (b) 다수의 세포 중 하나 이상의 세포내로 분비 단백 질을 발현하는 발현 벡터를 도입하여 1종 이상의 유전자 변형된 세포를 형성하는 단계 및 (c) 1종 이상의 유전자 변형된 세포를 약학적 허용 담체내에 두어 포유류 수용체의 부위에 투여하기 적절한 약학 제제를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 유전자 치료법으로서, (a) 하나 이상의 세포내로 분비 단백질 발현용 발현 벡터를 도입하여 하나 이상의 유전자 변형된 세포를 형성하는 단계, 및 (b) 포유류 수용체의 부위와 유전자 변형된 세포를 접촉시키는 단계를 통하여 포유류 수용체의 하나 이상의 세포를 유전자적으로 변형시키는 것을 포함한다. 이 방법은 발현 벡터를 도입시키는 단계 이전에 포유류 수용체로부터 하나 이상의 세포를 떼어내는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 벡터의 도입 단계는 다수의 세포의 일부에만 벡터를 도입하는 단계를 포함한다.
생체외 유전자 치료법도 본 발명에 포함되며, 검체로부터 다수의 세포를 떼어내는 단계; 아데노바이러스를 함유하지 않는 과량의 세포가 존재하도록 재조합 아데노바이러스를 다수의 세포 중 하나 이상의 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 아데노바이러스는 E1 유전자내 결실을 보유하며 분비 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다수의 세포는 검체내로 다시 재도입된다.
생체내 유전자 치료법은 먼저 검체로부터 세포를 떼어내지 않고 인간 인터페론-베타(β) 단백질을 암호화하는 분리 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 직접 검체의 세포내로 도입하는 단계를 포함한다. 생체내 및 생체외 방법은 국소, 안내, 비경구, 비강내, 기관내, 기관지내, 근육내, 피하, 정맥내, 근육내 및 복강내 투여한다.
본 발명에는 몇가지 장점이 있다. 인터페론 유전자 치료법은 낮은 전신 농도에서 매우 높은 국부적 인터페론 농도를 얻을 수 있다. 이 때문에 효과는 크고 부작용은 작다. 또한, 매우 높은 레벨의 인터페론이 단백질 주입 후에 발생하는 단백질 농도(독성을 유발하는 농도)에서 "폭발(burst)" 또는 최대였다가 인터페론 농도가 너무 낮아서 효과를 낼 수 없는 너무 낮은 레벨이 되는 인터페론 단백질 치료에서 관찰되는 상황과는 달리, 유전자 치료에 의해 전달되는 인터페론은 꽤 일정한 농도로 존재한다.
환자 편의는 매우 중요한 요소이다. 인터페론 단백질은 자주 주사해야 하지만, 인터페론 유전자를 발현하는 벡터의 단일 투여 또는 덜 빈번한 투여로 장기간 안정하게 단백질을 생성할 수 있다. 유전자 치료는 특징적인 표적 기관 또는 종양에 제어된 방식으로 인터페론을 전달할 수 있다. 동일한 세포가 인터페론을 발현, 분비 및 흡수하는 오토크린 시스템을 설정할 수 있다. 따라서, 매우 높은 국소 용량을 얻을 수 있다. 이들 고용량은 독성 문제 때문에 비경구 단백질 투여로는 얻을 수 없다.
인터페론 단백질은 세포 밖으로 분비되기 때문에, 종양내 또는 간염에 감염된 간의 모든 세포를 인터페론 유전자로 형질도입시킬 필요는 없다. 유전자를 흡수하지 않은 세포는, 이 유전자를 보유하여 인터페론 단백질을 분비하는 인접 세포에 의해 영향을 받는다(소위 말하는 "구경꾼 효과"). 이는 중요한 발견으로서 치료법에서 극적인 효과를 줄 것으로 예상되는데, 그 이유는 종양 물질 또는 기관내 모든 세포가 발현 벡터를 함유할 필요가 없기 때문이다.
마지막으로, 비경구 인터페론 투여는 항인터페론 항체의 생성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이는 중화 항체 반응이 특정 국부 영역으로의 인터페론 유전자 도입후에 감소될 수 있기 때문이다. 국부 발현 외에도, 발현된 인터페론은 내인성 인간 세포가 생성할 수 있고, 따라서 구조 및 글리코실화 측면에서 더 자연적이며, 박테리아, 효모 또는 중국산 햄스터 난소 세포에서 생성된 후 정제하여 비경구적으로 주사된 인터페론 단백질보다 면역원성이 더 적다.
본 발명의 이들 및 기타 양태 뿐 아니라 각종 장점 및 유용성은 바람직한 양태 및 첨부 도면을 참조하면 더욱 명확해질 것이다.
도 1. (A) 감염되지 않은 MDA-MB-468(-○-), 또는 0.01%(-△-), 0.03%(-□-), 0.1%(-∇-) 또는 0.3%(-
-)의 H5.110hIFNβ 세포로 감염된 세포를 누드 마우스의 측부로 피하 주사하고, 평균 종양 크기를 종양 세포 이식 후 시간에 대하여 플롯하였다. (B) 109일의 관찰 기간 동안 마우스의 생존율을 나타내는 Kaplan-Meir 플롯. 감염되지 않은 세포(-○-); 0.01%(-△-), 0.03%(-□-), 0.1%(-∇-) 또는 0.3%(-
-)에서 H5.100hIFNβ 감염된 세포.
도 2. (A) (1) KM12L4A 세포; (2) Huh7 세포; 및 (3) ME180 세포에서의 생체외 인터페론 베타 유전자 치료. 평균 종양 크기를 종양 세포 이식후 경과 시간에 대해 플롯하였다. 감염되지 않은 세포(-■-)나, 1%(-●-) 또는 10%(-▲-)로 H5.110hIFNβ 감염된 세포를 마우스에 이식하였다. 일부 마우스가 희생된 이들 군에서, 종양 크기는 희생된 동물에 대하여 수행된 최종값의 평균으로 나타내었다. 플롯에서 불연속점은 군내의 모든 동물이 죽었거나 희생되었음을 반영한다. (B) 70일의 관찰 기관 동안 마우스 생존율. 패널 1, 2, 및 3은 KM12L4A 세포, Huh7 세포, 및 ME180 세포 각각을 이식한 마우스가 형성한 자료를 나타낸다. 기호는 감염되지 않은 세포(-■-)나, 1%(-●-) 또는 10%(-▲-)로 H5.110hIFNβ 감염된 세포로 이식된 마우스를 나타낸다.
도 3은 형성된 MDA-MB-468 종양의 직접적인 생체내 치료. 종양에 각각 3 ×109 pfu(-
-), 1 ×109 pfu(-▨-), 3 ×108 pfu(-○-), 1 ×108 pfu(-△-), 및 3 ×107 pfu(-▽-)의 H5.110hIFNβ, 또는 PBS(-
-), 또는 각각 3 ×109 pfu(-◇-), 1 ×109 pfu(-▲-), 3 ×108 pfu(-X-) 및 1 ×108 pfu(-▷-)의 H5.110lacZ를 주사하였다. 종양 크기는 치료 주사한 후 14일 동안 측정하였다.
바람직한 양태들의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로는 (1) 환자로부터 쉽게 떼어낼 수 있고, (2) 유전 물질을 도입하여 시험관내에서 변형시킬 수 있으며, (3) 수용체내에 편리하게 이식할 수 있고, (4) 혈전형성하지 않고(non-thrombogenic), (5) 다수의 수용체에게 이식할 수 있는 세포를 사용한 생체외 유전자 치료법 개발을 기초로 한 것이다. 개시된 생체내 유전자 치료법은 (1) 수용체내에 존재하고, (2) 분리된 유전 물질을 발현하도록 동일계 변형시킬 수 있는 세포를 사용한다. 유전자 변형된 세포는 발현된 유전 물질량을 제어하는 조절 성분을 포함한다.
유전자 변형된 세포는 생존하여, 발현된 물질이 이로운(즉, 치료적) 효과를 나타내는데 필요한 시간 동안 동일계 발현 물질을 계속 생성하는데, 이때 세포가 배치된 조직의 정상 기능은 저해하지 않는다.
발현된 물질은 분비 단백질인 것이 바람직하다(후술). 분비 단백질은 인터페론인 것이 가장 바람직하다. 실제로, 인터페론이 가장 바람직한 치료제이지만, 임의의 분비 단백질을 이용하여 유전자 치료법에 적용할 수 있는 일반 원칙을 밝혀냈다. 본 발명자들은 분비 단백질이 발현되는 세포로부터 인터페론과 같은 분비 단백질이 방출된다는 사실에 기인하여, 종양 물질 또는 예컨대 간염에 감염된 간내 모든 세포를 "분비 단백질" 유전자로 형질도입시킬 필요는 없다는 것을 발견하였다. 유전자를 흡수하지 않는 세포는 이 유전자를 보유하여 단백질을 분비하는 인접 세포에 의해 영향을 받는다(즉, "구경꾼 효과"). 유전자 치료는 발현시 인터페론을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 이용한다고 개시되어 있지만, 임의의 분비된 단백질(후술)은 본 발명의 방법 및 조성물내에서 유효하다.
본 문서에서 언급한 모든 인용문은 참고로 인용한 것이다.
1. 정의
"유전자 치료"- 영향을 받은 유기체내로 유전 정보를 도입하여 질병 표현형을 보정하는 절차.
"생체외 유전자 치료"- 검체로부터 세포를 떼어내어 시험관내에서 배양하는 절차. 작용성 유전자와 같은 폴리뉴클레오티드를 시험관내에서 세포에 도입하고, 변형된 세포를 배양 증식시킨 다음, 검체내로 재이식한다.
"생체내 유전자 치료"- 검체로부터 표적 세포를 떼어내지 않는 절차. 오히려 전달된 폴리뉴클레오티드(예, 발현시 인터페론을 암호화하는 유전자)를 동일계에서 수용체 유기체의 세포내, 즉 수용체내로 도입한다. 생체내 유전자 치료는 일부 동물 모델에서 검사되었으며, 최근의 공개 문헌에는 기관 및 조직 내로 직접 유전자를 전달할 수 있다고 보고되어 있다.
"유전자 치료를 받을 수 있는 증상"- 유전자 질병과 같은 증상(즉, 하나 이상의 유전자 결함에 의한 질병 증상), 후천성 병리학(즉, 선천적인 결함이 아닌 병리학적 증상), 암 및 예방법(즉, 질병 또는 바람직하지 않은 의학 증상의 예방)을 포함한다.
"후천성 병리학"- 비정상적 생리학, 생화학, 세포, 구조 또는 분자 생물학 상태로 나타나는 질병 또는 증상을 의미한다.
"폴리뉴클레오티드"- 핵산 단량체 단위체의 중합체. 여기서 단량체 단위체는 리보핵산(RAN), 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이의 조합이다. 4개의 DNA 염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 및 티민(T)이다. 4개의 RNA 염기로는 A, G, C 및 우라실(U)이 있다.
"분리된"- 인터페론을 암호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에 적용하는 경우, 기원 또는 조작에 의해서 (i) 자연적으로 회합되어 있는(예, 발현 벡터의 일부로서 숙주 세포내에 존재함) 모든 폴리뉴클레오티드가 회합되어 있지 없거나; 또는 (ii) 자연적으로 결합되어 있지 않은 화학 부분 또는 핵산에 결합되거나; (iii) 자연적으로 발생하지 않는 RNA 또는 DNA 폴리펩티드, 게놈 폴리뉴클레오티드 의 일부, cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한 "분리된"이란, (i) 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 시험관내 증폭; (ii) 화학적으로 합성; (iii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성; 또는 (iv) 절단 및 겔 분리에 의해 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
따라서, "분리된" 인터페론 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 안티센스 RNA내로 전사될 수 있는 비자연발생적 핵산 뿐 아니라, 자연 발생적 세포내에서 생물학적으로 유의적이지 않은 레벨로 발현되거나 또는 발현되지 않는 인터페론 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 예컨대, 인간 인터페론 베타 1a를 암호화하는 합성 또는 천연 유전자는, 인간 뇌세포가 인터페론 베타 1a를 자연적으로 발현하지 않기 때문에 인간 뇌 세포에 대하여 "분리된" 것으로 간주한다. "분리된 폴리뉴클레오티드"의 또 다른 예로서, 인터페론 유전자의 일부만을 도입하여, 예컨대 상동성 재조합을 통해 내인성 인터페론을 암호화하는 서열과 유도성 프로모터를 조합하여 재조합 유전자를 형성한다.
"유전자"- mRNA를 통해서 특정 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열(즉, 3'-5' 펜토스 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 연결된 뉴클레오티드의 선형 배열).
"전사"- 유전자로부터 mRNA를 형성하는 과정.
"해독"- mRNA로부터 단백질을 생성하는 과정.
"발현"- 전사 및 해독을 조합하여 단백질을 생성하기 위한 DNA 서열 또는 유전자에 의해 진행되는 과정.
"성장 억제"- 표적 세포(즉, 종양)의 억제 및 형질전환된 표현형의 억제(예컨대 형태 변화로 측정됨)를 의미한다.
"아미노산"- 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 단량체 단위체. 아미노산의 20개의 L 이성체가 있다. 이 용어는 아미노산의 유사체 및 단백질 아미노산의 D이성체와 그의 유사체도 포함한다.
"단백질"- 크기에 관계없이 20개의 단백질 아미노산 중 임의의 단백질을 주 성분으로 하는 임의의 중합체. "폴리펩티드"는 상대적으로 큰 폴리펩티드를 의미하는데 주로 사용되며, "펩티드"는 작은 폴리펩티드를 의미하는데 사용되는데, 본 분야에서 이들 용어의 사용은 중복되며 다양하다. "단백질"은 특별한 언급이 없으면 펩티드, 단백질 및 폴리펩티드를 의미한다.
"분비된 단백질"- 세포의 내부로부터 세포의 외부로 이송되는 단백질. 분비 단백질로는 다수의 증식 인자 및 면역조절 단백질, 예컨대 각종 인터페론(α, β, γ), 인터루킨, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-4, IL-8 및 IL-12와, 증식 인자, 예컨대 GM-CSF, G-CSF가 있다.
"유전자 융합"- 2 이상의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자 발현을 통해서 각각의 펩티드 골격을 통한 2 이상의 단백질의 동일선상에서의 공유 결합을 의미한다.
"돌연변이"- 유기체의 유전 물질의 질 또는 구조의 임의의 변화, 특히 야생형 인터페론 유전자의 임의의 변화(즉, 결실, 치환, 첨가 또는 변경) 또는 야생형 인터페론 단백질의 임의의 변화.
"야생형"- 각각 생체내에서 존재하는 인터페론 유전자 또는 인터페론 단백질의 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열.
"표준 하이브리드화 조건"- 하이브리드화 및 세척을 위한 0.5 X SSC 내지 약 5 X SSC 및 65℃와 실질적으로 동일한 염 및 온도 조건. 따라서, 본원에서 사용된 "표준 하이브리드화 조건"은 조작 한계이며, 일정 하이브리드화 범위를 포함한다. 더 높은 엄중 조건은, 예컨대 플라크 검색 완충액(0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 피콜 400; 0.2% 소 혈청 알부민, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5); 1 M NaCl; 0.1% 피로인산나트륨; 1% SDS); 10% 덱스트란 설페이트 및 100 ㎍/㎖ 변성되고, 초음파 처리된 연어 정액 DNA와 65℃에서 12∼20 시간 동안 하이브리드화시키는 단계, 65℃에서 75 mM NaCl/7.5 mM 구연산나트륨(0.5 ×SSC)/1% SDS로 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 낮은 엄중 조건은, 예컨대 플라크 검색 완충액, 10% 덱스트란 설페이트 및 110 ㎍/㎖ 변성되고 초음파처리된 연어 정액 DNA와 55℃에서 12∼20 시간 동안 하이브리드화시키는 단계, 및 55℃에서 300 mM NaCl/30 mM 구연산나트륨(2.0 ×SSC)/1% SDS로 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
"발현 제어 서열"- 유전자에 작동가능하게 결합된 경우 유전자의 발현을 제어 및 조절하는 뉴클레오티드 서열.
"작동가능하게 결합된"- 발현 제어 서열이 폴리뉴클레오티드 서열(DNA, RNA)의 전사 및 해독을 제어 및 조절하는 경우 그 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 것이다. "작동가능하게 결합된"은 발현하고자 하는 폴리뉴클레오티드 서열 앞에 적절한 출발 시그널(예, ATG)을 가지고, 보정된 리딩 프레임을 유지하여 발현 제어 서열의 제어하에 폴리뉴클레오티드를 발현하고 분리된 폴리뉴클레오티드 서열이 암호화하는 소정의 인터페론을 생성하는 것을 포함한다.
"발현 벡터"- 발현 벡터가 숙주 세포내로 도입되면 하나 이상의 유전자가 발현되는 폴리뉴클레오티드, 가장 통상적으로는 DNA 플라스미드(그러나, 바이러스도 포함). 벡터는 세포내에서 복제가능할 수도, 가능하지 않을 수도 있다.
"종양"- 임의의 바람직하지 않은 세포 증식. 이러한 증식으로는 악성 및 비악성, 고형 또는 유체 종양, 암종, 골수종, 육중, 백혈병, 림프종과 기타 암, 신생물 또는 종양형성성 질병이 있다.
"유전자 변형된 세포"(또는 "세포 발현계"라고도 함)- 인터페론 단백질을 발현하는 용도의 발현 벡터 및 세포를 포함한다. 생체외 용도의 경우, 유전자 변형된 세포는 포유류 수용체에 투여하기 적절한데, 이 세포는 수용체의 내인성 세포 대신, 또는 이 세포와 공존한다. 생체내 용도의 경우, 세포를 수용체내에 생성한다.
본 발명은 전술한 유전자 변형된 세포의 각종 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 생체외 포유류 수용체의 세포(들)를 유전자적으로 변형시키고, 포유류 수용체에 유전자 변형된 세포를 투여하는 방법을 제공한다. 생체외 유전자 치료의 바람직한 양태에서, 세포는 자가 세포, 즉 포유류 수용체로부터 떼어낸 세포이다. 본원에서 "떼어낸"이란 생체내 자연발생적 위치로부터 떼어낸 세포 또는 다수의 세포를 의미한다. 환자로부터 세포를 떼어내는 방법 뿐 아니라, 배양액내에서 분리된 세포를 유지하는 방법도 당업자에게 공지되어 있다(Stylianou, E., et al., Kidney Intl. 37:1563-1570(1992); Hjelle, J.H., et al., Peritoneal Dialysis Intl. 9:341-347(1989); Heldin, P. Biochem. J. 283: 165-170(1992); Di Paolo, N., et al., Int. J. Art. Org. 12:485-501(1989); Di Paolo, N., et al., Clinical Nephrol. 34:179-1848(1990); Di Paolo, N., et al., Nephron 57:323-331 (1991)). 상기 및 하기의 본원의 상세한 설명에서 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 문헌은 참고로 인용한 것이다.
II. 분리된 인터페론 폴리뉴클레오티드
"인터페론"("IFN"으로도 칭함)은 바이러스, 폴리펩티드, 분열유발인자 등과 같은 각종 유발자에의 노출에 반응하여 포유류 세포가 생성하는 작고, 종특이적인 1본쇄 폴리펩티드이다. 가장 바람직한 인터페론은 재조합 형태이며, 각종 인터페론을 비롯한 단백질을 생성하는 재조합 DNA 방법은 공지되어 있으나, 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하려는 것은 아니다. 예컨대 미국 특허 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017(Axel et al.) 및 4,470,461(Kaufman) 참조. 인터페론 알파, 베타, 감마 및 공통 인터페론의 재조합 형태를 생성하였다. 인터페론형은 시스테인 고갈된 돌연변이(예, 인터페론 베타) 및 메티오닌 고갈된 돌연변이와 같은 변형체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포로부터 발현할 수 있다. 숙주 세포의 전사후 프로세싱 시스템을 통해 기타 변형이 가능하다. 따라서, 특정 인터페론의 정확한 화학 구조는 일부 인자에 좌우되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 개시된 제제에 포함된 이러한 모든 인터페론 단백질은 적절한 환경 조건하에 있으면 생활성을 보유한다.
본 발명의 방법에 사용할 수 있는 바람직한 폴리뉴클레오티드는 각종 척추동물, 바람직하게는 포유류의 야생형 인터페론 유전자 서열로부터 유도되며, 당업자들에게 공지된 방법으로 얻는다. 예컨대 미국 특허 5,641,656(1997년 6월 24일 발행; 조류 I형 인터페론 프로프로테인 및 성숙 조류 I형 인터페론을 암호화하는 DNA); 미국 특허 5,605,688(1997년 2월 25일-재조합 개 및 말 I형 인터페론); 미국 특허 5,554,513(1996년 9월 10일- 인간 인터페론 베타 2A를 암호화하는 DNA 서열), 미국 특허 5,541,312(1996년 7월 30일- 인간 섬유아세포 베타-2 인터페론 폴리펩티드를 암호화하는 DNA); 미국 특허 5,231,176(1993년 7월 27일, 인간 백혈구 인터페론을 암호화하는 DNA 분자); 미국 특허 5,071,761(1991년 12월 10일- 인간 림프구아세포 인터페론 LyIFN-알파-2 및 LyIFN-알파-3의 세부 서열을 암호화하는 DNA 서열), 미국 특허 4,970,161(1990년 11월 13일, 인간 인터페론 감마를 암호화하는 DNA 서열), 미국 특허 4,738,931(1988년 4월 19일, 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하는 DNA 서열), 미국 특허 4,695,543(1987년 9월 22일- 인간 알파 인터페론 Gx-1 유전자) 및 미국 특허 4,456,748(1984년 6월 26일, 상이한 자연발생적 백혈구 인터페론의 세부 서열을 암호화하는 DNA) 참조.
유전자의 인터페론 계열의 돌연변이 구성원을 본 발명에 사용할 수 있다. 당업자들에게 공지된 종래의 지향성 돌연변이유발법을 사용하여 야생형 인터페론 폴리뉴클레오티드 서열내 돌연변이를 형성한다. "돌연변이"는 본원에서 참고로 인용한 하기의 인터페론 서열이 "돌연변이" 서열로 간주되도록 유전자 융합체도 포함한다:
미국 특허 5,273,889(1993년 12월 28일, 면역원성 류코톡신을 암호화하는 서 열에 결합된 감마-인터페론 유전자를 포함하는 DNA 작제물); 미국 특허 4,959,314(1990년 9월 25일, 생물학적으로 활성인 천연 단백질의 합성 뮤테인을 암호화하는 DNA 서열을 가진 유전자); 미국 특허 4,929,554(1990년 5월 29일, des-CYS-TYR-CYS 재조합 인간 면역 인터페론을 암호화하는 DNA); 미국 특허 4,914,033(1990년 4월 3일, 베타 인터페론을 포함하는 변형된 베타 인터페론을 암호화하는 DNA 분자); 및 미국 특허 4,569,098(1986년 2월 11일, 멀티클래스 하이브리드 인터페론 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 DNA).
또한, 이들 특허에 개시된 분리된 폴리뉴클레오티드는 변형되어 작용적으로 등가인 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드가 다음과 같은 조건 중 하나 이상을 만족한다면 상기 서열과 비교하여 "작용적 등가물"이다.
(a) "작용성 등가물"은 표준 하이브리드화 조건하에 전술한 임의의 서열에 하이브리드화하고/또는 전술한 임의의 서열에 대해 축퇴성인 폴리뉴클레오티드이다. 야생형 인터페론의 치료 활성을 가지는 돌연변이 인터페론을 암호화하는 것이 더욱 바람직하다.
(b) "작용성 등가물"은 전술한 인터페론 서열의 임의의 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 아미노산 서열에 대한 발현을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.
요약하면, "인터페론"은 전술한 제제 뿐 아니라 이의 작용성 등가물도 포함하나, 이게 국한되는 것은 아니다. 따라서, 본원에서 사용한 "작용성 등가물"은 작용성 등가물이라고 간주되는 인터페론과 포유류 수용체에 대해 동일하거나 또는 개선된 유익한 효과를 주는 인터페론 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 인터페론 단백질을 의미한다. 당업자에게는 자명한 바와 같이, 작용성 등가 단백질은 재조합 기법, 예컨대 "작용성 등가 DNA"를 발현하여 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 자연 발생적 DNA, 뿐 아니라 자연 발생적 DNA가 암호화하는 단백질과 동일한 단백질을 암호화하는 비자연 발생적 DNA에 의해 암호화되는 인터페론을 포함한다. 뉴클레오티드 암호화 서열의 축퇴성으로 인해서, 기타 폴리뉴클레오티드를 사용하여 인터페론을 암호화할 수 있다. 이들은 서열내 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈의 치환으로 변경되어 침묵 변형을 형성하는 상기 서열 전체 또는 일부를 포함한다. 이러한 변경된 서열은 이들 서열의 등가물로 본다. 예를 들어, Phe(F)는 2개의 코돈, 즉 TTC 또는 TTT가 암호화하고, Tyr(Y)는 TAC 또는 TAT가 암호화하며, His(H)는 CAC 또는 CAT가 암호화한다. 한편, Trp(W)는 단일 코돈, TTG가 암호화한다. 따라서, 특정 인터페론을 암호화하는 제공된 DNA 서열의 경우, 이를 암호화하는 다수의 DNA 축퇴성 서열이 있다는 것을 인지해야 한다. 이들 축퇴성 DNA 서열은 본 발명의 범위내에 있다.
공통 인터페론도 이 정의내에 포함된다. 본원에서 사용된 "공통 인터페론"은 비자연 발생적인 폴리펩티드로서, 이 폴리펩티드는 모든 자연 발생적 인간 인터페론 아형 서열에 공통인 아미노산 잔기를 주로 포함하며, 모든 아형에 공통인 아미노산이 없는 하나 이상의 위치에서 그 위치에 주로 발생하고 하나 이상의 자연 발생적 아형내 그 위치에 존재하지 않는 임의의 아미노산 잔기를 포함하는 일이 없는 아미노산을 포함한다. 공통 인터페론 서열은 상기 인터페론의 임의의 공통 서열을 포함하지만, 단 아형 서열을 보유한다. 예시적인 공통 인터페론은 미국 특허 4,695,623 및 4,897,471(Amgen)에 개시되어 있다. 공통 인터페론을 암호화하는 DNA 서열을 이들 특허에 개시된 방법 및 기타 표준 방법으로 합성할 수 있다. 공통 인터페론 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같이 제작된 DNA 서열을 숙주내로 형질전환 또는 형질감염시킨 발현 생성물이 바람직하다. 즉, 공통 인터페론은 재조합으로 생성하는 것이 좋다. 이러한 물질은 당업계에 공지된 절차로 정제할 수 있다.
유전자 대체 치료에 적용할 수 있는 상기 인터페론 및 증상은 단지 예시용이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 공지된 증상을 치료하는 용도의 적절한 인터페론의 선택은 과도한 실험 없이 당업자가 인식할 수 있을 것이다.
III. 세포내로 분비된 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하기 위한 방법.
"형질전환" 또는 "형질전환시키다"는 세포의 임의의 유전자 변형을 의미하며, "형질감염" 및 "형질도입"을 포함한다.
본원에서 사용한 "세포의 형질감염"은 첨가된 DNA의 도입으로 새로운 유전 물질을 세포가 획득하는 것을 의미한다. 따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 세포내로 핵산(예, DAN)을 삽입하는 것을 의미한다. 일부 형질감염 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 인산칼슘 DNA-동시침전법(Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Ed, E.J. Murray, Humana Press (1991)), DEAE-덱스트란(상기 문헌 참조), 전기사출법(상기 문헌 참조), 양이온 리포좀-매개된 형질감염(상기 문헌 참조), 및 텅스텐 입자 촉진된 미소입자 충격법(Johnston, S.A., Nature 346; 776-777 (1990)); 및 인산스트롬튬 DNA 동시침전법(Brash D.E. et al., Molec.Cell.Biol. 7:2031-2034(1987))이 있다. 이들 방법은 각각 당업계에서 대표적인 방법들이다.
대조적으로 "세포의 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 사용하여 세포내로 핵산을 전달하는 방법을 말한다. 바이러스내에 함유된 1종 이상의 인터페론 단백질을 암호화하는 1종 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 형질도입된 세포의 염색체내로 도입할 수 있다. 대안적으로, 세포를 바이러스로 형질도입하나, 세포는 염색체내에 도입된 분리된 폴리뉴클레오티드를 보유하지 않지만 세포내 염색체외로 인터페론을 발현할 수 있다.
일양태에서, 세포를 생체외 형질감염시킨다(즉, 유전자적으로 변형). 세포는 포유류(바람직하게는 인간)로부터 분리되어 재조합 분비 단백질(예, 인터페론)을 발현하기 위한 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 재조합 유전자와 같은 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터로 형질전환(즉, 시험관내 형질도입 또는 형질감염)된다. 그 다음 동일계 단백질 전달을 위해 포유류 수용체에 세포를 투여한다. 포유류 수용체는 인간이고 변형하고자 하는 세포는 자가 세포(즉, 세포가 포유류 수용체로부터 분리됨)인 것이 바람직하다. 시험관내 세포 분리 및 배양법이 보고되어 있다.
또 다른 양태에서, 세포를 형질전환하거나, 또는 생체내에서 유전자적으로 변형시킨다. 포유류 수용체(바람직하게는 인간)로부터의 세포를, 분비 단백질(즉, 재조합 인터페론)을 발현하는 1종 이상의 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 재조합 유전자와 같은 분리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터로 생체내 형질전 환(즉, 형질도입 또는 형질감염)시키고 단백질을 동일계 전달한다.
분비 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(예, 1종 이상의 치료 인터페론 단백질을 암호화하는 cDNA)를 형질감염 또는 형질도입과 같은 유전자 전달 방법으로 생체외 또는 생체내 세포로 도입하여 유전자 변형된 세포를 얻는다. 각종 발현 벡터(즉, 분리된 폴리뉴클레오티드를 표적 세포로 용이하게 전달하기 위한 매개체)는 당업계에 공지되어 있다.
전형적으로, 도입된 유전 물질은 새로운 유전자 전사를 제어하는 프로모터와 함께 인터페론 유전자와 같은 분리된 폴리뉴클레오티드(일반적으로 인터페론을 암호화하는 엑손을 포함하는 cDNA의 형태로 존재)를 포함한다. 이 프로모터는 특징적으로 전사 개시에 필요한 특이적 뉴클레오티드 서열을 가진다. 임의로, 유전 물질은 RNA 스플라이싱에 의한 성숙 전사체로부터 분리된 인트론 서열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 발현하고자 하는 유전자의 3' 말단에 존재해야 한다. 도입된 유전 물질은 세포로부터 세포외 환경으로 치료 유전자 생성물(즉, 인터페론)을 분비하는 적절한 분비 "시그널" 서열을 포함할 수도 있다.
임의로, 분리된 유전 물질은 소정의 유전자 전사 활성을 얻는데 필요한 추가의 서열(즉, 인헨서)을 더 포함한다. 이를 위해서, "인헨서"는 단순히 프로모터가 요구하는 기본 전사 레벨을 변화시키는 암호화 서열과 인접하여 작용하는(시스) 임의의 비해독된 DNA 서열이다.
바람직하게, 분리된 유전 물질을 프로모터의 바로 하방에 있는 세포 게놈내로 도입하여 프로모터 및 암호화 서열을 작동가능하게 결합시켜 암호화 서열을 전사시킨다. 바람직한 바이러스 발현 벡터는 외인성 프로모터 성분을 포함하여 삽입된 인터페론 유전자의 전사를 제어한다. 이러한 외인성 프로모터는 구조 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한다.
자연 발생적 구조 프로모터는 필수 세포 작용을 조절하는 단백질 발현을 제어한다. 결과적으로, 구조 프로모터의 제어하의 유전자는 세포 증식의 모든 조건하에서 발현된다. 구조 프로모터의 예로는 일정 구조 또는 "하우스키핑" 작용을 암호화하는 다음 유전자에 대한 프로모터가 있다: 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(Scharfmann et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:4626-4630(1991)), 아데노신 디아미나제, 포스포글리세롤 키나아제(PGK), 피루베이트 키나아제, 포스포글리세롤 뮤타제, β-액틴 프로모터(Lai et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:10006-10010(1989), 및 기타 당업계에 공지된 구조 프로모터.
또한, 다수의 바이러스 프로모터는 진핵 세포에서 구조적으로 작용한다. 이들의 예로는, SV40의 초기 및 후기 프로모터(참조, Bernoist and Chambon, Nature, 290:304(1981)), 몰로니 백혈병 바이러스 및 기타 레트로바이러스의 장말단 반복부(LTR)(참조, Weiss et al., RNA 종양 바이러스, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)의 티미딘 키나아제 프로모터(참조, Wagner et al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 78:1441(1981)), 시토메갈로바이러스 즉초기(IE1) 프로모터(참조, Karasuyama et al., J.Exp.Med., 169: 13(1989)), 라우스 육종 바이러스(RSV)의 프로모터(Yamamoto et al., Cell, 22:787(1980)), 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Yamada et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 82:3567(1985)) 등이 있다. 따라서, 상기 임의의 구조 프로모터를 사용하여 유전자 삽입체의 전사를 제어할 수 있다(섹션 B 참조).
인터페론 유전자를 특정 조직에 전달하려면, 이 유전자 발현을 표적화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 특정 조직내에서만 발현되는 여러 프로모터가 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, B형 간염 바이러스(Sandig et al., Gene Therapy 3:1002-1009 (1996)) 및 알부민 유전자(Pinkert et al., Genes and Development, 1:268-276(1987))의 간 특이적 프로모터가 있다. 기타 간 특이적 프로모터에 대해서는 문헌[Guo et al., Gene Therapy, 3:802-810 (1996)] 참조. 또한, 특정 종양에서만 발현되는 다수의 프로모터도 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, PSA 프로모터(전립선 암), 암배형성(carcinoembryonic) 항원 프로모터(결장암 및 폐암), β-카제인 프로모터(유방암), 티로시나제 프로모터(흑색종), 칼시뉴린 Aα프로모터(신경교종, 신경아세포종), c-sis 프로모터(골육종) 및 α-페토단백질 프로모터(간암)가 있다.
유도성 프로모터의 제어하에 있는 유전자는 유발제의 존재하에서만 또는 다소 광범위하게 발현된다(예, 메탈로티오네인 프로모터의 제어하의 전사는 특정 금속 이온의 존재하에서 상당히 증가됨). 마우스 유방 종양 바이러스 장말단 반복부(MMTV LTR)내 존재하는 글루코코르티코이드 유도성 프로모터 참조(Klessig et al., Mol.Cell.Biol., 4:1354(1984)). 유도성 프로모터는 이의 유도 인자가 결합된 경우 전사체를 자극하는 반응성 성분(RE)을 포함한다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레틴산 및 고리형 AMP에 대한 RE가 있다. 특정 RE를 포함하는 프로모터를 선택하여 유도성 반응을 얻을 수 있고, 일부 경우 RE 자체는 상이한 프로모터에 부착되어 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다.
따라서, 적절한 프로모터(구조 프로모터 대 유도성 프로모터; 강한 프로모터 대 약한 프로모터)를 선택함으로써, 유전자 변형된 세포내 인터페론의 존재 및 발현량을 제어할 수 있다. 인터페론을 암호화하는 유전자가 유도성 프로모터의 제어하에 있으면, 동일계 인터페론 전달은 인터페론의 전사를 허용하는 조건에 동일계 유전자 변형된 세포를 노출시켜(예, 제제의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특정 유발자를 주사하여) 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어하에 인터페론 유전자가 암호화하는 인터페론 단백질의 유전자 변형된 세포에 의한 동일계 발현은, 동일계에서 적절한(예, 유도성) 금속 이온을 함유하는 용액과 유전자 변형된 세포를 접촉시키면 증가된다.
최근, 외래 투여된 소분자에 의한 유전자 발현을 정확히 제어하는 매우 정교한 시스템이 개발되었다. 이들은, FK506/라파마이신 시스템(Rivera et al., Nature Medicine 2(9); 1028-1032, 1996), 테트라사이클린 시스템(Gossen et al., Science 268:1766-1768, 1995), 에크디손 시스템(No et al., Proc.Nat.Acad.Sci., USA 93:3346-3351, 1996) 및 프로게스테론 시스템(Wang et al., Nature Biotechnology 15: 239-243, 1997)을 포함한다.
따라서, 동일계 전달되는 인터페론의 양은, (1) 삽입된 유전자의 전사를 유도하는데 사용되는 프로모터의 특성(즉, 프로모터가 구조 프로모터인지 또는 유도성 프로모터인지, 강한 프로모터인지 또는 약한 프로모터인지 또는 조직 특이적인지 여부); (2) 세포내로 삽입되는 외인성 유전자의 카피수; (3) 환자에게 투여되는(예, 이식) 형질도입/형질감염된 세포의 수; (4) 생체외 방법에서 이식물의 크기(예, 이식편 또는 캡슐화된 발현계); (5) 생체외 방법에서 이식물의 수; (6) 생체내 투여에 의해 형질도입/형질감염된 세포의 수; (7) 형질도입/형질감염된 세포 또는 이식물이 생체외 및 생체내 방법에서 적절한 곳에 남게 되는 시간 길이; 및 (8) 유전자 변형된 세포에 의한 인터페론의 생성율과 같은 인자를 제어하여 조절한다.
특정 인터페론의 치료학적 유효량의 전달을 위한 이들 인자의 선별 및 최적화는, 전술한 인자 및 환자의 임상적 프로필을 고려하여 과도한 실험없이 당업자가 인식할 수 있을 것으로 생각된다.
유전자 치료법에 의해 발현되는 단백질이 분비 단백질이기 때문에, 유전자 치료 벡터를 함유하지 않는 주변 세포는 영향을 받는다(실시예 참고). 결과적으로, 본 발명의 방법은 통상 선별가능한 유전자의 사용을 필요로 하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 발현 벡터는 인터페론을 암호화하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 프로모터 이외에, 발현 벡터로 형질감염 또는 형질도입된 세포의 선별을 용이하게 하는 선별 유전자, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 임의로 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포를 2 이상의 발현 벡터로 형질감염시키고, 이 때 하나 이상의 벡터는 인터페론(들)을 암호화하는 유전자(들)를 포함하고, 다른 벡터는 선별 유전자를 포함한다. 적절한 프로모터, 인헨서, 선별 유전자 및/또는 시그널 서열(후술)은 과도한 실험없이 당업자가 선택할 수 있을 것으로 생각된다.
IV 특정 유전자 치료 벡터를 제조하는 방법
폴리뉴클레오티드 서열을 벡터내로 삽입하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)] 및 Ausubel 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, J.Wiley & Sons, NY (1992)] 참조. 종래의 벡터는 특정 인터페론에 대한 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 적절한 전사/해독 제어 시그널을 포함한다. 프로모터/인헨서를 사용하여 인터페론 발현을 제어할 수 있다(섹션 III 참조).
종양 세포의 유전자 치료에 사용하기 위한 포유류 숙주 세포에 적합한 발현 벡터로는, 예컨대 플라스미드; 조류, 설치류 및 인간 레트로바이러스 벡터; 아데노바이러스 벡터; 헤르페스 바이러스 벡터; 파르보바이러스; 및 비복제성 폭스 바이러스가 있다. 특히 복제 결함 재조합 바이러스는 복제 결함 바이러스만을 생성하는 패키징 세포주에서 형성된다. Current Protocols in Molecualr Biology: 섹션 9.10-9.14 참조(Ausubel et al., eds.), Greene Publishing Associcates, 1989.
유전자 전달계 용도의 특정 바이러스 벡터는 공지되어 있다. 예를 들어, Madzak et al., J.Gen.Virol., 73:1533-36(1992)(파보바바이러스 SV40), Berkner et al., Curr.Top.Micorbiol. Immunol., 158:39-61(1992)(아데노바이러스), Moss et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158:25-38(1992)(백시니아 바이러스), Muzyczka, Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158:97-123(1992)(아데노 관련 바이러스), Margulskee, Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158:67-93(1992)(헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 및 엡스타인 바르 바이러스(HBV)), Miller, Curr.Top.Microbiol.Immunol., 158:1-24(1992)(레트로바이러스); Brandyopadhyay et al., Mol.Cell.Biol., 4:749-754(1984)(레트로바이러스), Miller et al., Nature. 357:455-450(1992)(레트로바이러스), Anderson, Science, 256:808-813(1992)(레트로바이러스) 참조.
바람직한 벡터는 아데노바이러스(바람직하게는 Ad-2 또는 Ad-5 계열 벡터), 헤르페스 바이러스(바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스계 벡터) 및 파르보바이러스(바람직하게는 "결함성" 또는 비자발적인 파르보바이러스계 벡터, 더욱 구체적으로 아데노 관련 바이러스계 벡터, 가장 바람직하게는 AAV-2계 벡터)를 포함하는 DNA 바이러스이다. Ali et al., Gene Therapy 1:367-384, 1994; 미국 특허 4,797,368 및 5,399,346과 하기 참조.
예를 들어 인터페론 서열을 전달하는 용도의 특정 벡터계의 선택은 각종 인자에 좌우된다. 하나의 중요한 인자는 표적 세포군의 특성이다. 레트로바이러스 벡터는 광범위하게 연구되어 각종 유전자 치료 용도로 사용되지만, 레트로바이러스 벡터는 복제 세포에서 유전자를 통합하여 발현하기 때문에 분열되지 않는 감염 세포에는 일반적으로 부적합하지만 암 치료에는 유용할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 생체외 방법에 유용하며 표적 세포 게놈내로 안정하게 통합되기 때문에 이러한 측면에서 흥미롭다.
아데노바이러스는 각종 세포 유형으로 치료 또는 리포터 이식유전자를 효과적으로 전달하기 위해서 변형시킬 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 인간에게서 호흡 질병을 유발하는 일반적인 아데노바이러스 2형 및 5형(각각 Ad2 및 Ad5)은, 현재 뒤시엔느(Duchenne) 근육이영양증(DMD) 및 낭포성 섬유증(CF)의 유전자 치료를 위해 개발 중에 있다. Ad2 및 Ad5는 인간 악성 종양과 관련이 없는 아데노바이러스 서브클래스에 속한다. 아데노바이러스 벡터는 유사분열 상태와 무관하게 결과적으로 모든 세포형으로 이식유전자를 매우 높은 레벨로 전달할 수 있다. 고 역가의 재조합 바이러스(1011 플라크 형성 단위/㎖)는 293 세포(아데노바이러스 형질전환된, 상보성 인간 배아 신장 세포주:ATCC CRL1573)에서 쉽게 형성될 수 있고, 감지할 수 있을 정도의 손실없이 상당 기간동안 저온에서 저장할 수 있다. 유전자 불균형을 보완하는 생체내 치료 돌연변이를 전달하는 이 시스템의 효과는 각종 질병의 동물 모델에서 입증되었다. Y.Watanabe, Atherosclerosis, 36:261-268(1986), K.Tanzawa et al., FEBS Letters, 118(1):81-84(1980), J.L.Golasten et al., New Engl.J.Med., 309(11983), 288-296(1983); S.Ishibashi et al., J.Clin.Invest., 92:883-893(1993), 및 S.Ishibashi et al., J.Clin.Invest., 93:1889-1893(1994) 참조. 실제로, 낭포성 섬유증 경막 조절인자(CFTR)에 대한 cDNA를 암호화하는 재조합 복제 결함 아데노바이러스는 일부 인간 CF 임상 시험에서의 사용이 허가되었다. 예를 들어, J.Wilson, Nature, 365: 691-692(1993년 10월 21일) 참조. 유전자 치료용 재조합 아데노바이러스의 안정성에 대한 추가의 증거는 인간 개체군에서의 생아데노바이러스 백신의 광범위한 경험이다.
인간 아데노바이러스는 선형의 약 36 kb의 2본쇄 DNA 게놈으로 구성되며, 이는 100 지도 단위(m.u.)로 분할되고, 각각은 그 길이가 360 bp이다. DNA는 바이러스 DNA 복제에 필요한 게놈의 각 말단에 역전된 짧은 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 이 유전자 생성물은 바이러스 DNA 합성의 개시 전 또는 후에 발현을 기초로 초기(E1 내지 E4) 및 후기(L1 내지 L5) 영역으로 편성된다. Horwitz, Virology, 2d edit., ed.B.N. Fields, Raven Press Ltd., New York(1990) 참조.
아데노바이러스 게놈은 정상의 바이러스 생활환 과정에서 고도로 조절된 프로그램을 진행한다. Y. Yang et al., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91:4407-4411(1994) 참조. 비리온은 세포에 의해 내면화되어, 엔도좀에 유입되고, 거기로부터 바이러스가 세포질에 유입하여 단백질 코트를 잃기 시작한다. 비리온 DNA는 핵내로 이동하여 염색체내로 통합되기 보다는 염색체외 선형 구조를 보유한다. 즉초기 유전자 E1a 및 E1b는 핵에서 발현된다. 이들 초기 유전자 생성물은 아데노바이러스 전사를 조절하고 각종 숙주 세포의 바이러스 복제 및 발현에 필요하며(세포가 바이러스를 생성하게 함), 지연된 초기 유전자(예, E2, E3 및 E4)와 후속하는 후기 유전자(예, L1-L5)의 다단계 활성화에 중심이 된다.
유전자 치료에 대해 개발된 제1 세대 재조합 복제 결함 아데노바이러스는 E1a 전체 및 E1b 일부 영역의 결실을 포함한다. 복제 결함 바이러스는 트랜스 E1 단백질에 제공되는 작용성 아데노바이러스 E1 영역을 포함하는 293 세포내에서 증식되어, E1 결실된 아데노바이러스를 복제한다. 생성 바이러스는 다수의 세포 유형을 감염시킬 수 있고 도입된 유전자(단, 프로모터를 보유하는 경우)를 발현할 수 있지만, E1 영역 DNA를 보유하지 않는 세포내에서는 복제할 수 없다. 재조합 아데노바이러스는 숙주 범위가 광범위하다는 장점이 있고, 뉴런과 같은 정지(quiescent) 또는 말단 분화된 세포를 감염시킬 수 있으며, 필수적으로 비종양원성이다. 아데노바이러스는 숙주 게놈내로 통합하지 않는 것으로 보인다. 이들은 염색체외에 존재하기 때문에, 삽입 돌연변이 유발 위험성이 상당히 감소된다. 재조합 아데노바이러스는 매우 높은 역가를 형성하며, 바이러스 입자는 중간 정도로 안정하고, 발현량은 많으며, 광범위한 세포를 감염시킬 수 있다.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 체세포 유전자 치료에 대한 벡터로서 사용되어 왔다. AAV는 유전자 조작에 대한 이상적인 기질로 만드는 단순한 게놈 구성(4.7 kb)을 가진 작은 1본쇄 DNA (ss) 바이러스이다. 2개의 오픈 리딩 프레임은 일련의 rep 및 cap 폴리펩티드를 암호화한다. rep 폴리펩티드(rep78, rep68, rep62 및 rep40)는 AAV 게놈의 복제, 구제 및 통합에 관련되어 있다. cap 단백질(VP1, VP2 및 VP3)은 비리온 캡시드를 형성한다. 5' 및 3' 말단에서의 인접 rep 및 cap 오픈 리딩 프레임은 145 bp 역전된 말단 반복부(ITR)로서, 이중 처음 125 bp는 Y형 이중 구조 또는 T형 이중 구조를 형성할 수 있다. AAV 벡터의 개발에 중요한 것은 전체 rep 및 cap 도메인을 절제하여 치료 또는 리포터 이식유전자로 대체할 수 있다는 것이다. B.J.Carter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P.Tijsser, CRC Press, pp155-168(1990) 참조. ITR은 AAV 게놈의 복제, 구제, 패키징 및 통합에 필요한 최소한의 서열을 나타낸다는 것이 확인되었다.
AAV 생활환은 2기, 즉 잠재 에피소드 및 세포 용해 에피소드로 구성된다. 잠재 감염 과정에서, AAV 비리온은 캡시드화된 ssDNA로서 세포로 유입되고, 그 직후에 핵으로 전달되어 숙주 세포 분열에 대한 요구없이 숙주 염색체내로 AAV DNA가 안정하게 통합된다. 헬퍼 바이러스의 부재하에, 통합된 AAV 게놈 바이러스는 잠재되어 있지만 활성화되어 구제될 수 있다. 생활환의 세포 용해기는, AAV 프로바이러스 보유 세포가 숙주 크로마틴으로부터 제거되는 것을 보조하기 위해서 AAV에 의해 필요한 헬퍼 기능을 암호화하는 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스에 의한 2차 감염으로 공격받는 경우 개시된다(B.J. Carter, 상기 문헌 참조). 감염성 부모 1본쇄 (ss)DNA를 rep 의존 방식으로 이중 복제 형태(RF) DNA로 확장한다. 구제된 AAV 게놈을 미리 형성된 단백질 캡시드(직경이 약 20 nm인 대칭 20면체)로 패키징하고, 세포 용해 후에 + 또는 - ssDNA 게놈을 패키징한 감염성 비리온으로서 방출한다.
AAV는 유전자 치료에 상당히 효과적이다. 바이러스 입자는 매우 안정하고, 재조합 AAV(rAAV)는 rAAV가 펠렛 형성 또는 CsCl 구배 밴드 형성에 의해서 정제할 수 있다는 점에서 "약물 유사" 특징을 갖는다. 이들은 열 안정성이 있으며, 분말로 동결건조한 후 재수화시켜 완전한 활성을 갖게 할 수 있다. DNA는 숙주 염색체내로 안정하게 통합되어 장기간 발현한다. 숙주 범위는 넓으며, AAV는 공지된 질병을 유발하지 않으므로 재조합 벡터는 비독성이다.
마우스에서 AAV로부터의 다량의 유전자 발현은 1.5 년 이상 동안 지속되는 것으로 보인다. Xiao, Li 및 Samulski(1996) Journal of Virology 70, 8089-8108 참조. 바이러스 독성 또는 세포 숙주 면역 반응의 증거가 없기 때문에 바이러스 유전자 치료의 한계를 극복하였다.
문헌[Kaplitt, Leone, Samulski, Xiao, Pfaff, O'Malley 및 During(1994) Nature Genetics 8, 148-153]은 AAV 벡터를 사용하여 직접적인 두개내 주사 후에 래트 뇌에서 티로신 히드록실라제가 장기간(최대 4개월) 발현됨을 개시하고 있다. 이는 인간에서 파킨슨 질병에 대한 유효 치료법이다. 발현은 고도로 효과적이며 바이러스는 안전 및 안정하다.
Fisher 등의 문헌[Nature Medicine(1997) 3, 306-312)]에는 AAV를 근육내로 주사한 후에 마우스에서 안정하게 유전자가 발현됨이 보고되어 있다. 또한, 바이러스는 안전하였다. 외래 유전자 생성물 또는 바이러스에 대한 세포 및 체액 면역 반응은 검출되지 않았다.
Kessler 등[Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1996) 93, 14082-14087]은 마우스에서 AAV를 근육내 주사한 후에 다량의 에리트로포이에틴(Epo) 유전자를 발현함을 확인하였다. Epo 단백질은 혈중에 존재하는 것으로 확인되었으며 적혈구 세포수 증가가 보고되었는데, 이는 치료 효과가 있음을 나타내는 것이다. 이 그룹에 의한 또 다른 연구에서는 암 치료로서 HSV tk 유전자를 발현하는 AAV를 사용하였다. 고형 종양에서의 다량의 유전자 발현이 개시되어 있다.
최근, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 다핵 다각체병 바이러스(AcMNPV)에서 주로 유래한 재조합 바큘로바이러스는 시험관내에서 포유류 세포를 형질도입시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다(Hofmann, C., Sandig, V., Jennings, G., Rudolph, M., Schlag, P., and Strauss, M. (1995), "Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors", Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92, 10099-10103; Boyce, F.M. and Bucher, N.L.R. (1996) "Baculovirus-mediated gene transfer into mamalian cells", Proc.Natl.Acad.USA 93, 2348-2352 참조).
재조합 바큘로바이러스는 유전자 치료를 위한 일부 유효 장점을 지닌다. 이들 장점은 매우 거대한 DNA 삽입체 용량, 인간에서 선재하는 면역 반응의 결핍, 포유류에서의 복제 결함, 포유류에서의 독성 결핍, 바큘로바이러스 전사 프로모터의 곤충 특이성으로 인한 포유류 세포에서의 바이러스 유전자 발현 결핍, 및 가능하게는 이들 바이러스 단백질에 대해 유도된 세포독성 T 림프구 반응의 결핍을 포함한다.
IV. 인터페론의 효능/확인 시험
인터페론 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터를 통해 세포에 투여한다. 일반적으로 (i) 세포 형태의 변경, (ii) 세포 증식 억제, 및 (iii) 항바이러스 활성에 대해 분석하여 특정 세포 조건 및 기작에 대한 제공된 유전자 치료 벡터의 효과를 시험한다.
분리된 세포내 특정 인터페론 유전자 생성물을 발현하기 위한 특정 발현 벡터의 선별 및 최적화는, 인터페론 유전자, 바람직하게는 하나 이상의 적절한 제어 영역(예, 프로모터)을 얻는 단계, 인터페론 유전자를 삽입한 벡터를 포함하는 벡터 작제물을 제조하는 단계, 벡터 작제물로 시험관내 배양 세포를 형질감염 또는 형질도입하는 단계, 및 인터페론 유전자 생성물이 배양된 세포내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계로 수행한다.
인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용한 형질감염의 효과는 쉽게 이용할 수 있는 임의의 다수 인간 종양 세포주를 이용하여 시험관내에서 시험할 수 있다. 이러한 세포주로는 인간 방광암 세포주 5637(ATCC HTB9), 인간 유방암 세포주 MDA-MB-468(ATCC HTB132), 인간 전립선 육종 세포주 DU145(ATCC HTB81), 인간 골육종 세포주 SAOS2(ATCC HTB85), 폐암 세포주에 전이성인 인간 섬유육종 Hs913T(ATCC HTB152), 인간 경부암 세포주 HeLa(ATCC ECL2)가 있다. 이들 세포주 각각은 인터페론을 암호화하는 적절한 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킬 수 있으며, 세포 증식 및 세포 형태에 대한 형질감염의 영향은 당업계에 공지된 절차, 예컨대 세포 생존력을 측정하기 위한 트립판 블루 배제 분석, 시간 경과에 따른 증식을 측정하기 위한 세포 계수법 및 DNA 복제를 측정하기 위한 삼중수소-티미딘 도입법을 사용하여 시험할 수 있다.
단백질을 암호화하는 적절한 폴리뉴클레오티드와 바이러스 벡터를 함유하지 않는 주변 세포에 대한 분비 단백질의 효과는 실시예 3에 개시된 방법을 사용하여 쉽게 시험할 수 있다.
일단 표적 세포내로 도입되면, 삽입된 돌연변이 인터페론 서열에 상동성/상보성인 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 핵산 하이브리드화와 같은 종래 방법으로 인터페론 서열을 확인할 수 있다. 인터페론 전사는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응으로 측정할 수 있다. 대안적으로, 인터페론 단백질은 종래의 항바이러스 분석 또는 ELISA 분석으로 세포 조정 배지내에서 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로서, 서열(들)은 표적 세포내로 발현 벡터를 도입시켜 유발되는 "마커" 유전자 작용(예, 티미딘 키나아제 활성, 항생제 내성 등)의 존재 또는 부재로 확인할 수 있다. 예를 들어, SV40 초기 프로모터의 별도의 제어하에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자와 같은 우세한 선별 마커 유전자를 가진 벡터내로 인터페론 베타 1a를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시키는 경우, 서열은 마커 유전자 작용(제네티신 내성)의 존재로 확인할 수 있다. 기타 적절한 벡터의 검출 방법은 당업자들이 쉽게 이용할 수 있다.
V. 유용성
A. 인터페론 및 감염성 질병
인터페론은 박테리아, 진균류 및 바이러스 감염 치료에 사용되어 왔다. 인플루엔자 및 소포성 구내염 바이러스(VSV)는 인터페론에 의한 억제에 특히 민감하고, 종종 인터페론 활성을 측정하는 분석과 인터페론 항바이러스 활성의 기작을 조사하는 연구에 사용된다. 인간 병원체이고 인터페론에 감수성이 있는 것으로 보이는 기타 바이러스로는 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), D형 간염 바이러스, 인간 파필로마바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 헤르페스 대상포진 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 리노바이러스 및 뇌막심근염 바이러스가 있다.
더욱 중요한 바이러스 질병의 표적은 간염이다. 다수의 바이러스에 의해 유발되는 간 질환인 바이러스성 간염은 전세계인의 건강과 관련된 주요 질병이다. 5개의 특징적인 인간 간염 바이러스가 분리 및 클로닝되었다. 이들 바이러스는 A, B, C, D 및 E형 간염이다. 일부 급성 및 만성 바이러스 간염은 새로 발견된 G형 간염 바이러스와 같이 이미 특성 규명된 것 이외의 간염 바이러스와 관련되는 것으로 보인다. 가장 널리 유포되어 있는 바이러스는 A, B, 및 C형이다. HBV 및 HCV 감염은 급성 및 만성 간 손상 및 염증을 유발하는 것 외에도, 간세포 암종을 유발한다. 인터페론은 HBV 및 HCV에 대해 생체내 어느 정도 효능을 갖고 있을 뿐 아니라 세포 배양액내에서 D형 간염 및 A형 간염에 대해서도 효능을 갖는다는 것이 입증되었다.
바이러스 간염은 인터페론 유전자 도입으로 치료할 수 있다. 이 유전자를 전달하기 위한 바람직한 표적은 간내의 간세포이다. 생체외 치료(예, 간 세포의 외식후 인터페론을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 도입한 다음 환자내로 다시 이식함)가 가능하지만, 생체내 유전자 전달은 특히 바람직하다. 간문맥 정맥내로 유전자를 주사하는 수술을 하거나 또는 간 동맥내로 카테터를 통해 유전자를 주입한다. 이상적으로는 정맥내 주사와 같은 침입성이 적은 것을 사용한다.
인터페론 유전자는 적절한 발현 벡터내 전사 프로모터의 제어하에 위치시킨다. 전사 프로모터는 기원이 세포 또는 바이러스(CMV, SV40, RSV 등)일 수 있다. 간 특이적 유전자 발현이 바람직한 경우, 알부민 인헨서/프로모터, α1-안티프립신 프로모터 또는 HBV 인헨서/프로모터와 같은 간세포 특이적 세포 프로모터가 바람직하다. 다수의 간 특이적 프로모터가 문헌에 개시되어 있다(상기 문헌 참조).
인터페론 유전자가 간염에 감염된 세포에서만 발현되는 벡터를 고안할 수 있다. 예를 들어, 인터페론 유전자의 발현을, HBV 감염 간세포내에만 존재하는 HBV 전사 인자 HBx에 의해 유도할 수 있다. 또한, "담체" 시스템을 사용할 수 있다. 이것은 양이온 리포좀 또는 단백질:DNA 접합체(DNA와 아시알로당단백질의 접합체는 간세포상의 아시알로당단백질 수용체에 대한 결합을 통해 간에 우선적으로 전달할 수 있음)와 같은 비-바이러스 전달계일 수 있다.
그러나, 현재까지 가장 효과적인 유전자 전달계는 기원이 바이러스이다. 재조합 레트로바이러스를 사용하여 생체외 인간 간세포에 유전자를 전달할 수 있다. 동물 모델은 재조합 아데노바이러스가 생체내 정맥 투여후에 간에 효과적으로 위치할 수 있다는 것을 보여준다. 약 98%의 아데노바이러스가 정맥내 주사로 간에 위치하게 된다.
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 생체내 투여후에 간을 감염시킬 수 있는 것으로 보인다. 기타 유형의 바이러스, 예컨대 알파 바이러스, 렌티바이러스 또는 기타 포유류 바이러스를 사용할 수 있다. 최근, 비포유류 바이러스인 곤충 특이적 바큘로바이러스가 간세포에 유전자를 효과적으로 전달하여 발현시킬 수 있는 것으로 확인되었다(Hofman et al,, 1995, Boyce and Bucher, 1996, 상기 문헌 참조).
예로서, 재조합 아데노바이러스를 이용하여 생체내 인터페론 유전자를 전달할 수 있다. 복제 결함 아데노바이러스를 다수군으로 작제하였다. 이러한 바이러스의 제1 세대는 E1 영역의 결실로 인하여 결함이 있다. 이 결함은 아데노바이러스 E1 영역을 발현하는 293 세포주내에서 보충된다. E1, E2a 및/또는 E4 유전자 결실로 더욱 광범위하게 능력이 손상된 재조합 아데노바이러스를 사용하는 것이 좋다. 이들 결실된 모든 작용은 패키징 세포주에서 발현될 수 있다. 인터페론 유전자는 임의의 다수 프로모터(예, CMV 즉초기 프로모터, RSV LTR, 세포 액틴 프로모터, 알부민 인헨서/프로모터 또는 기타 간-특이적 프로모터)의 하방에 위치한다. 이 유전자 카세트를 E1과 같이 결실된 유전자 중 하나 대신에 재조합 아데노바이러스 벡터내로 위치시켜 아데노바이러스 전달 벡터를 형성한다.
인터페론 유전자를 가진 재조합 아데노바이러스는 표준 방법으로 패키징 세포내로 형질감염 후 직접적인 결찰 또는 상동 재조합을 통해 생성한다. 인터페론 유전자를 가진 재조합 바이러스 종균을 수회 플라크 정제하고 패키징 세포내에서 대규모로 생성하여 증식시켰다. 바이러스를 CsCl 밴드 형성, 컬럼 크로마토그래피 또는 기타 방법으로 정제한 다음 패키징 세포에서 역가측정하였다. E1 및 E2a에 결함이 있는 아데노바이러스를 생성하는 방법[Engelhardt et al., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 91:6196-6200, 1994]과 E1 및 E4에 결함이 있는 아데노바이러스를 생성하는 방법[Gao et al., J.Virology, 70:8934-8943, 1996]이 상세하게 설명되어 있다. E1에 결함이 있는 아데노바이러스를 생성하는 방법은 Graham, F.L. 및 L.Prevec의 문헌[Methods for Construction of Adenovirus Vectors", Mol.Biotech, 3:207-220(1995)]에 개시되어 있다.
각종 용량의 바이러스를 시험하였다. 바이러스 용량은 107 플라크 형성 단위(pfu) 내지 최대 1012 pfu인 것 같다. 필요에 따라, 바이러스를 반복 투여(예컨대 매 1∼6개월 마다 1회)할 수 있다. 반복된 바이러스 투여로부터 형성된 체액 면역 반응은 반복 투여의 효과를 제한할 수 있다. 이 경우, 면역억제제는 CD40 리간드에 대해 유도된 시클로스포린 또는 항체와 같은 바이러스와 함께 투여할 수 있다.
바이러스성 간염에 대한 인터페론 유전자 치료의 효과를 동물 모델에서 시험할 수 있다(섹션 C 참조). 예를 들어, B형 간염 바이러스의 경우, 여러 모델이 이용가능하다. 이들의 예로는 마못, 오리, 나무 두더지, 래트 및 마우스가 있다. 마우스 HBV 모델중에는 HBV에 대해 유전자이식되고 간에서 HBV DNA를 안정하게 복제하여 순환 HBV 바이러스의 정상 생성을 유도하는 마우스가 포함된다. HCV의 경우, 침팬지가 이용가능하다. 인터페론 유전자를 가진 아데노바이러스를 간에 직접 투여하거나 또는 정맥 주사할 수 있다. 효과는 바이러스 DNA 복제, 순환 바이러스 입자, 간 효소(ALT), 간 병리학 및 염증을 모니터링하여 결정할 수 있다.
B 암
인터페론 단백질은 여러 환경에서 항종양원성 활성을 소유하는 것으로 확인되었다. 검토를 위해서 문헌[Wadler and Schwartz, Cancer Research 50:3473-3486, 1990; Martin-Odegard, DN&P, 4:116-117, 1991; 및 Spiegel, Seminars in Oncology 15(5):41-45, 1988] 참조. 인터페론 알파 및 인터페론 베타를 이용한 치료는 몇몇 암에 대해 어느 정도의 효능을 나타내었다. 유전자 치료는 단독으로, 또는 통상적인 수술, 방사선 치료 또는 화학 치료와 함께 행할 수 있다. 하기의 유전자 치료가 가능한 암의 목록은 일부에 불과하며, 인터페론 유전자 치료는 이 목록에 포함되지 않은 다수의 질병 환경에서도 효과적일 수 있다.
악성 신경교종은 성인의 모든 원발 뇌 종양의 60∼80%를 차지한다. 인간 신경교종 세포를 면역 결핍 (누드) 마우스내로 대뇌내 이식하여 신경교종 모델을 제공할 수 있다. 인터페론 베타 단백질 치료는 이들 마우스에서 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다. 신경교종에서 일부 인터페론 베타 단백질 시험이 갖는 문제는 인터페론 베타의 비경구 투여(정맥내 또는 근육내)후 독성이 높다는 것이다. 인터페론 베타 유전자를 뇌에 정위 전달하면(아마도 수술시), 전신 단백질 투여 후에 나타나는 부작용 없이 뇌에서 장기간 인터페론 베타를 생성할 수 있다.
흑색종은 인터페론 유전자 치료에 대한 우수한 표적이다. 전이성 악성 흑색종에 대한 예후는 좋지 않다. 발병율은 상당히 증가하고 종래의 화학치료법은 효과가 없다. 흑색종은 면역원성 종양형으로 보인다. 그 이유는 환자 반응이 숙주 면역 반응에 좌우될 수 있기 때문이다. 인터페론 베타의 증식 억제 및 면역조절 활성은 이러한 환경에서 효과적이다. 본 발명자들은 인터페론 베타 단백질이 배양된 악성 흑색종 세포에서 증식억제 효과를 유도한다는 것을 확인하였다.
혈관종은 모세 내피세포가 증식하여 마스트 세포, 섬유아세포 및 대식세포를 축적하여 조직 손상을 유도한다. 일반적으로 무해하지만, 혈관종은 중요한 기관에 손상을 주어 죽음을 유발할 수 있다. 인터페론 알파 단백질은 유아에서 스테로이드 내성 혈관종의 조기 퇴화를 유도하는 것으로 나타났다(Martin-Odegard, 상기 문헌 참조).
인터페론 단백질은 백혈병, 림프종 및 골수종의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 질병에서 나타난 효과는, 시험관내 암 치료에서 인터페론 단백질의 효능이 특성 규명되어 있지만 생체내 효능이 휠씬 덜 공통적이라는 일반적인 발견 사실과는 대조적인 것이다. 그럼에도 불구하고, 인터페론 알파는 인간 임상 시험에서 모발 세포 백혈병, 만성 골수양 백혈병, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종 및 다발성 골수종에 대한 효능을 나타내었다. 인터페론 베타 단백질은 배양시 신장 세포 암종 세포의 증식을 억제한다. IFN-α는 신장 세포 암종의 치료에 대한 사용이 이미 허가되었다.
결장직장암은 미국에서 암 관련 사망의 주요 원인이다. 배양된 인간 결장 암 세포에 대한 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ 단백질의 유효 증식 억제 효과가 있다. 결장암은 종종 간으로 전이되어 무서운 결과를 초래한다. 아데노바이러스 또는 기타 간 친화성(liver-tropic) 전달계를 사용하여 이들 전이 치료를 위해 간으로 인터페론 유전자를 전달할 수 있다. 간세포 암종은 아데노바이러스에 의한 간 전달 효과가 매우 우수하기 때문에 눈에 띄는 표적이다. IFN-β 단백질은 배양물내 인간 간암 세포의 증식을 상당히 억제하는 것으로 관찰되었다.
인터페론 단백질은 일부 임상 시험에서 수술불가능한 비-소세포 폐암의 치료에 효과를 나타내었지만, 그 외에는 효과가 없었다. 2개의 인간 폐암 세포주는 인터페론 베타 단백질(베타는 알파보다 더욱 효과적임)에 의한 증식 억제에 민감하다는 것이 밝혀졌다. 임상 시험에서, 상당한 인터페론 관련 독성이 정맥내 인터페론 투여후에 관찰되었다. 폐로 인터페론 베타 유전자를 국소 전달하면(재조합 아데노바이러스 벡터의 분무 전달에 의함) 전신 단백질 전달 후에 관찰되는 독성 없이 효능을 나타낸다. 시험관내에서, 인터페론 베타 단백질을 사용하면 소세포 폐암 세포의 증식 억제가 관찰되었다.
인터페론 알파 단백질은 누드 마우스에서 유방암 이종이식편의 증식을 억제한다. 인터페론 베타는 증식 억제 효과 뿐 아니라, 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체의 생체내 유도로 인하여 유방 암종을 항에스트로겐 타목시펜에 대해 민감하게 하여 유방암에 대해 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명자는 인간 유방암 마 우스 모델에서 IFN-β 유전자 치료를 사용한 실험으로부터 얻은 자료를 제공하였다(실시예 3 및 실시예 4 참조).
난소암은 가능한 질병 표적이다. 인터페론 베타 단백질은 인터페론 알파보다 배양된 난소 암세포의 증식 억제에 대한 활성이 적은 것으로 나타났다. 이 경우, 이러한 유형의 종양이 복막강을 채울 우려가 있기 때문에, 유전자 치료 벡터를 복막에 설치하여 치료할 수 있다.
요약하면, 인터페론 단백질을 사용한 임상 결과가 균일하게 양성을 나타내는 것은 아니지만 다수의 환경에서 인터페론 단백질은 항종양원성 특성을 나타내었다. IFN-α 및 IFN-β 단백질은 종래의 화학치료법과 함께 시험되었으며, 대뇌암 세포, 후두암 세포, 백혈병 세포, 신장 세포 암종, 결장 선암종 및 골수종을 비롯한 여러 징후에서 약물과 함께 상승 효과를 제공한다. 또한, 인터페론은 혈관형성 억제 활성을 보유하는 것으로 생각된다. 국소 IFN-β 레벨과 혈관형성 능력 사이에 역의 상관관계가 있다. 일부 자료로부터, 혈관형성을 억제하기 위해서는 IFN-β 단백질의 레벨을 유지해야 한다는 것을 알 수 있다. 이 경우, 인터페론 유전자 치료는 고 레벨의 인터페론 단백질이 매우 급격하게 저 레벨 또는 감지할 수 없는 레벨로 감소하는 단백질 치료법보다 우수하다.
C. 동물 유전자 치료 모델
당업자들은 생체외 및 생체내 유전자 치료를 시험하는데 이용가능한 여러 동물 모델을 알 수 있을 것이다. 가장 일반적으로 사용되는 쥐의 암 모델은 누드(nu/nu) 마우스에서의 인간 종양 이종이식편 모델이다. 인간 암세포는 배양시 증식되어 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된 인터페론 암호화 유전자로 형질전환되거나 또는 감염된다. 이들 세포를 누드 마우스내로 주사한다. 통상적으로, 종양 세포는 마우스의 등으로 피하 주사되어 고형 종양 물질의 형성을 유도한다(실시예 1 참조). 대안적으로, 종양 세포가 자연적으로 나타나는 기관내로 종양 세포를 정위 주사할 수 있다(예컨대, 폐암 세포는 폐로 주사하고, 결장암 세포는 결장내로 주사함). 종양 성장 후에, 시간 경과에 따른 종양 물질의 직경을 측정하였다(실시예 2).
Okada 등[문헌 (1996) Gene Therapy 3,957-964 참조]은 뇌내로 인간 신경교종 세포를 직접 두개내 정위 주사하여 마우스에서 실험적 신경교종을 형성하였다. 검출가능한 종양이 형성된 후에, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자(HSV tk)를 발현하는 AAV 벡터를 동일한 부위내로 직접 주사하였다. HSV tk 효소는 비독성 뉴클레오시드 유사체인 강시클로비르(GCV)를 독성 대사물질로 전환시킨다. 유전자 치료 후에, GCV를 복강내 투여하였다. AAV-tk와 GCV를 투여받은 마우스는 종양 크기가 상당히 감소하였지만, GCV가 없는 대조군 AAV 또는 AAV-tk는 그렇지 않았다. 이 치료는 안전하고 효과적인 것으로 보인다.
재조합 아데노바이러스(AdV)는 동물 모델 및 초기 인간 임상 시험에서 고형 종양 치료에 사용되어 왔다. 다수의 연구에서는 유사한 누드 마우스/인간 이종이식편 모델을 사용하였다. 이들 모델링 실험의 일부 예는 하기에 개시되어 있다. Clayman 등[문헌: (1995) Cancer Research 55, 1-6]은 누드 마우스에서 두부와 목의 인간 편평세포 암종의 모델을 설정하였다. 이들은 야생형 p53을 발현하는 아데노바이러스가 종양의 형성을 억제함을 확인하였다.
Hirschowitz 등[문헌:(1995) Human Gene Therapy 6,1055-1063]은 누드 마우스내로 인간 결장암 세포를 도입하였다. 종양이 생긴 후에, 이.콜리 시토신 디아미나제 유전자(CD)를 발현하는 아데노바이러스와 함께 직접 종양을 주사한 다음 5-플루오로시토신(5FC)을 전신 투여하였다(CD + 5FC는 tk + GCV와 유사한 효소/프로드럭 조합이다). 4 내지 5배의 종양 크기 감소가 관찰되었다.
Zhang 등[문헌: (1996) Proc.Natl.Acad.Sci USA 93, 4513-4518]은 누드 마우스에서 인간 유방 종양을 형성하였다. 이들 종양은 인터페론 알파를 발현하는 아데노바이러스와 함께 직접 주사하였다. 100% 동물에서 종양 퇴화를 관찰하였다.
Ko 등[문헌: (1996) Human Gene Therapy 7, 1683-1691]은 누드 마우스에서 인간 전립선 종양을 형성하고, 야생형 p53을 발현하는 아데노바이러스를 종양내 직접 주사하면 종양 성장을 억제함을 발견하였다. 모든 처리된 마우스는 치료 중단 후 12주 이상 동안 종양이 없는 상태를 유지하였다.
Bischoff 등[문헌: (1996) Science 274, 373-376]은 누드 마우스에서 인간 경부암 및 신경교아세포종 종양을 형성하였다. 이들 마우스를 E1B 유전자가 결실된 아데노바이러스로 처리하였다. E1B의 부재하에, 아데노바이러스는 p53 결핍성 종양 세포를 선별적으로 사멸시킨다. 종양내로 직접 주사하면, 아데노바이러스는 60% 동물에서 종양 퇴화를 유발하였다.
Ohwada 등[문헌: (1996) Human Gene Therapy 7, 1567-1576]은 인간 결장 암종 세포를 누드 마우스의 간내로 주사하여 결장암의 간 전이를 모방하였다. CD를 발현하는 아데노바이러스를 종양 부근의 간에 주사하였다. 전신 5FC 치료는 이들 동물에서 종양 성장을 억제하였다.
또한, 암 모델을 면역적격성 마우스 및 래트에서 설정할 수 있다. 이들 종양은 마우스내로 주입된 동계 쥐 종양 세포로부터 만들었다. 대안적으로, 종양은 내인성 세포로부터 유도할 수 있다. 이 경우, 내인성 종양은 발암원으로 동물을 처리하여 얻거나, 또는 마우스의 유전 배경(예컨대 p53 결핍)에 기인하여 자발적으로 형성될 수 있다. 일부 예는 하기와 같다.
Elshami 등[문헌: (1996) Human Gene Therapy 7, 141-148]은 tk 유전자를 발현하는 아데노바이러스로 면역적격성 래트에서 내인성 중피종을 치료하였다. 바이러스를 흉막 공간에 주사한 다음 GCV를 전신 투여하였다. 종양 중량의 급격한 감소 및 생존 시간 증가를 나타내었다.
Eastham 등[문헌: (1996) Human Gene Therapy 7, 515-523]은 면역적격성 마우스내로 동계 마우스 전립선 종양 세포주를 피하로 이식하였다. 이들은 종양내로 아데노바이러스-tk를 직접 주사하고, GCV로 전신 치료하였다. 이들은 종양 크기 감소 및 생명 연장을 보고하였다.
Bramson 등[문헌: (1996) Human Gene Therapy 7, 1995-2002]은 내인성 마우스 유방 종양내로 시토킨 IL-12를 발현하는 아데노바이러스를 직접 주사하였다. 이들은 마우스의 75%가 종양 퇴화를 나타내고 33%가 상당한 기간이 지난 후에도 종양이 없는 상태를 유지함을 발견하였다.
Riley 등[문헌: (1996) Nature Medicine 2, 1336-1341]은 자발적으로 Rb+/- 마우스에서 발생하는 뇌하수체 멜라닌 친화성 종양내로 직접 망막아세포종 유전자를 발현하는 아데노바이러스를 주사하였다. 이들은 처리된 동물에서 종양 세포 증식의 감소, 종양 성장의 감소 및 수명 연장을 확인하였다.
레트로바이러스 벡터는 인간의 유전자 치료 임상 시험에서 처음 사용된 벡터이다. 본 특허 출원과 관련된 한 보고는 Roth 등의 문헌[(1996) Nature Medicine 2, 985-991]에 개시되어 있다. 이들은 야생형 p53 유전자를 발현하는 재조합 레트로바이러스를 형성하였다. 이 바이러스는, 기관지경내 삽입된 바늘을 사용하여 종양내 직접 주사하여 비소세포 폐암이 있는 9명의 인간 환자에게 도입하였다. 9명의 환자 중에서, 3명은 종양 퇴화를 나타내었지만 3명의 다른 환자는 종양 성장의 안정화를 나타내었다.
D. 기타 양태
유전자 변형된 세포는, 예컨대 수용체의 세포-적합성 부위내 세포를 함유하는 캡슐 또는 이식편 또는 세포를 이식하거나 복강내 주사하여 투여한다. 본원에서 "세포 적합성(compatible) 부위"는 유전자 변형된 세포(들), 세포 이식편 또는 캡슐화된 세포 발현계가 생리학적 부작용을 촉발하지 않고 이식될 수 있는 수용체의 구조, 강 또는 유체를 의미한다. 대표적인 세포 적합성 부위로는 복막강, 흉막 및 심막강 뿐 아니라 종양을 떼낸 기관 또는 세포가 유래된 고형 종양이 있다.
유전자 변형된 세포는 단독으로 또는 기타 유전자 변형된 세포와 함께 세포 적합성 부위에 이식된다. 따라서, 본 발명은 제1 변형 세포가 제1 인터페론을 발현하고 제2 변형 세포는 제2 인터페론 또는 기타 분비 단백질을 발현하도록 유전자 변형 세포의 혼합물을 사용하여 수용체의 시스템을 변형시키는 방법을 제공한다. 기타 유전자 변형된 세포형(예, 간세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 신경교 세포, 내피 세포 또는 각질 세포)을 유전자 변경된 세포와 함께 첨가하여 도입된 유전자 복합 세트를 발현할 수 있다. 또한, 하나 이상의 재조합 유전자를 동일하거나 또는 상이한 벡터상의 각 유전자 변형된 세포내로 도입하여 단일 세포가 다수 인터페론을 발현하게 할 수 있다.
본 발명은 세포 이식편을 추가로 포함한다. 이식편은 포유류 수용체내로 이식하기 적절한 지지체에 부착된 다수의 전술한 유전자 변형된 세포를 포함한다. 지지체는 천연 또는 합성 물질로 형성될 수 있다. 또 다른 양태에서, 이식편은 복막 패치를 포함할 수 있다. 이 양태에 따르면, 지지체는 다수의 유전자 변형된 세포를 함께 보유하는 자연 발생적 매트릭스이다. 대안적으로, 이식편은 자연 발생적 매트릭스의 대체물(예, 겔발포체(Upjohn, Kalamazoo, Mich.), Dacron, Cortex(등록상표))에 부착된 전술한 다수 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 캡슐화된 세포 발현계가 제공된다. 캡슐화된 시스템은 포유류 수용체내로 이식하기에 적절한 캡슐 및 그 내부에 함유된 전술한 다수의 유전자 변형 중피 세포를 포함한다. 캡슐은 합성 또는 자연 발생적 물질로 형성할 수 있다. 이러한 캡슐 제제는 당업자들에게 공지되어 있다. 포유류 수용체내로 직접 이식되는(즉, 유전자 변형된 세포가 세포 적합성 부위와 직접 물리적으로 접촉하는 방식으로 이식되는) 세포와는 대조적으로 캡슐화된 세포는 이식후 분리되어 있다(즉, 세포 적합성 부위와 직접 물리적 접촉하지 않음). 따라서, 캡슐화된 시스템은 유전자 변형된 비무한증식 세포를 포함하는 캡슐에 한정되는 것이 아니라 유전자 변형된 무한증식 세포를 포함할 수 있다.
VI. 제제
바람직한 양태에서, 유전자 변형된 세포 제제는 인터페론의 치료학적 유효량을 동일계 수용체에게 전달하기에 충분한 세포양을 포함한다. 공지된 증상에 대한 특정 인터페론의 치료학적 유효량은 당업자들이 과도한 실험 없이 결정할 수 있다. 따라서, 유효량을 결정하는데 있어서, 당업자들은 환자의 증상, 증상의 경중 뿐 아니라 특정 인터페론을 투여한 임상 연구 결과를 고려해야 한다.
유전자 또는 유전자 변형 세포가 약학적 허용 담체내에 이미 존재하지 않는 경우, 수용체에게 투여하기 전에 이러한 담체내에 넣는다. 이러한 약학적 허용 담체로는, 예컨대 환자 및 치료에 적절한 등장 염수 및 기타 완충액을 포함한다.
"약학적 허용 담체"는 천연 또는 합성의 하나 이상의 성분을 의미하며, 인터페론을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 조합하여 적용하기 용이하게 한다. 적절한 담체는 멸균 염수를 포함하지만, 약학적으로 허용가능한 것으로 알려진 기타 수성 및 비수성 등장 멸균 용액과 멸균 현탁액도 당업자에게 공지되어 있다. "담체"란 임의의 플라스미드 및 바이러스 발현 벡터를 포함한다. "유효량"은 질병, 퇴행성 또는 손상 증상의 진행을 완화 또는 지연시킬 수 있는 양이다. 유효량은 개별적으로 결정되지만, 부분적으로는 치료하고자 하는 증상 및 얻고자 하는 결과를 고려한다. 당업자라면 이러한 인자를 이용하고 일상적인 실험으로 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
바람직한 방법에서, 부수적인 벡터(즉, "담체")내에 함유된 인터페론 폴리뉴클레오티드 서열의 유효량을, 바늘로 직접 주사하거나 또는 암이나 종양내에 배치된 카테터 또는 기타 전달관이나 종양으로 공급되는 혈관을 통해 표적 세포 또는 종양 조직에 직접 투여할 수 있다. 용량은 치료할 증상, 선택된 인터페론, 검체의 연령, 체중, 및 건강 상태와 같은 인자에 주로 좌우되므로, 검체에 따라 매우 다양할 수 있다. 바이러스 유전자 치료 벡터가 사용되는 경우, 인간 검체에 대한 유효량은 바이러스 발현 벡터를 포함하여 약 1×107 내지 약 1×1012 플라크 형성 단위(pfu)/㎖ 인터페론을 함유하는 염수 용액 약 0.1∼약 10 ㎖ 인 것으로 생각된다.
전술한 바와 같이, IFN 유전자를 고형 종양내로 직접 투여할 수 있다. 대안적으로, 종양내로의 전달은 종양에 제공되는 혈관내로 주입하여 수행할 수 있다. 벡터의 비경구 투여도 가능하다. 인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 국소, 안내, 비경구, 비강내, 기관내, 기관지내, 근육내, 피하 또는 기타 임의의 방법으로 투여할 수 있다. 비경구 투여로는 정맥내, 근육내, 복강내 및 피하 투여가 있다. 더욱 정교한 방법으로서, 특정 종양 유형에서만 발견되는 수용체에 결합하는 표면 분자의 존재 또는 자연 향성에 기인한 특정 유형 종양에 정위시킨 바이러스 또는 화학적 접합체를 비경구 투여할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 포유류 수용체내 유전자 생성물(예, 인터페론)을 발현하는 세포 발현계를 생성하는 방법, 이에 의해 생성된 발현계 및 이를 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 하기 실시예는 동물 모델계에서 세포 유전자 치료 가능성을 입증한다.
실시예 1: 예시적 동물 모델
동물 모델에서 인터페론을 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 생체내 시험을 통상적으로 수행한다. 마우스내로 인간 종양 세포주를 주사하여 누드 마우스에서 종양을 형성한다. 누드 마우스(종 nu/nu)는 면역결핍성이어서 외래 종양 세포를 거부하지 않는다. 종양 세포를 주입한 지 1∼2후에 종양을 형성하지만, 정확한 기간은 주사된 세포수 및 세포주의 종양형성성에 좌우된다. 마우스내로 주사하기 전에 배양물내에서 종래의 형질감염 절차를 수행하여 인터페론을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 종양 세포내로 도입한다. 대안적으로, 종양이 마우스내에서 형성된 후에 생체내 형질감염 또는 바이러스 형질도입으로 적절한 폴리뉴클레오티드를 종양내로 도입할 수 있다.
한 예로서, 사용된 세포는 방광암 세포주 HTB9(Huang et al, 상기 문헌 참조) 또는 망막아세포종 세포주 WERI-Rb27이다(Takahashi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:5257-5261, 1991). 배양시 인터페론을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드의 전달을 위해서, 종양 세포를 (인산칼슘 침전법, 전기사출법 또는 리포펙트아민 형질감염법과 같은 통상의 절차를 사용하여) 형질감염시키거나 또는 (레트로바이러스, 아데노바이러스, 바큘로바이러스 또는 아데노 관련 바이러스를 사용하여) 직접 감염시킨다. 100%의 세포에 성공적으로 적절한 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 효과적인 바이러스 감염의 경우, 세포를 선별할 필요가 없다. 또한, 단지 작은 비율의 세포만이 인터페론 유전자를 발현하면 되고, 따라서 일반적으로 약물 선별이 필요하지 않다는 것을 발견하였다(실시예 3).
본원에 개시된 바이러스 감염처럼 효과적이지 않은 형질감염의 경우 선별이 수행되면, 약물 내성 유전자(예, G418 내성을 암호화하는 neo 유전자) 및 인터페론 유전자와 같은 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 발현 벡터로 세포를 형질감염시킨다. 대조 형질감염은 약물 내성 유전자만을 암호화하는 벡터이다.
약물 함유 배지에서 약 2∼3주의 선별 후에, 세포 콜로니를 모으고 약 100 ㎕의 부피내 약 106 세포수로 nu/nu (누드) 암컷 마우스 측부로 주사한다. 바이러스 감염된 세포는 선별 단계 없이 직접 주사한다. 마우스를 추가로 2개월 이상 동안 유지하고 종양 크기는 캘리퍼로 매주 단위로 모니터링한다.
또한, 형질감염되지 않은 종양 세포 또는 감염되지 않은 종양 세포를 마우스 측부로 피하 주사한다. 종양 형성후에 인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 함유 바이러스 또는 DNA를 종양내 직접 주사한다. 여러 바이러스가 이 절차에 적절하지만, 재조합 아데노바이러스가 가장 효과적이고 재조합 레트로바이러스는 종양 세포 게놈내로 안정하게 통합되는 장점이 있다. 양이온 리포좀과 DNA를 혼합하고 혼합물을 주사하여 DNA를 세포내로 도입할 수 있다. 인터페론 유전자를 함유하지 않는 DNA 또는 바이러스를 다른 마우스의 종양내로 주사하여 대조군으로서 사용한다. 종양 진행 또는 감소는 캘리퍼로 모니터링한다.
실시예 2: 예시적 폐암 모델
추가의 실시예로서, 리포좀으로 캡슐화되고 분리된 인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용한 인간 소세포 폐암 치료는, 리포좀, 특히 작은 입자 리포좀 에어로졸을 사용하여 이러한 치료가 필요한 세포내로 인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 생체내에서 수행할 수 있다. 에어로졸을 통해 투여하면 인터페론을 암호화하는 뉴클레오티드가 비인강, 기관기관지수의 표면과 폐 영역내에 균일하게 침착된다. 리포좀 에어로졸에 대한 논의는 문헌[Knight and Gilbert, Eur.J.Clin.Micro. and Infect.Dis., 7:721-731(1988)] 참조. 이러한 방식으로 폐암을 치료하기 위해서, 안터페론 암호화 폴리뉴클레오티드를 종래의 방식으로 정제한다. 인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 임의의 다른 리포좀과 혼합하고 고 효율로 도입한다. 에어로졸 전달은 마일드하고 일반 지원자 및 환자에게 잘 용인되기 때문에, 인터페론을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 리포좀을 투여하여 임의 단계의 폐암으로 고생하는 환자를 치료할 수 있다. 리포좀은 종양 성장을 억제하기에 충분한 용량으로 분무기에 연결된 기관내관 또는 비강 흡입으로 전달된다. 분무 치료는 2주 동안 매일 실시하고, 필요한 만큼 반복한다.
정위 소세포 폐암을 사용한 생체내 연구는 무흉선 (nu/nu) 누드 마우스의 오른쪽 주류 기관지내로 주입된 종양(마우스 1마리당 약 1.5 ×106 세포)을 사용하여 수행할 수 있다. 3일 후에, 마우스에게 리포좀-캡슐화된 인터페론 유전자를 기관지내 접종하는 치료 과정(연속 3일 동안 매일)을 개시하고, 대조군은 인터페론 유전자 서열이 결핍되어 있는 것으로 한다. 종양 형성 및 크기는 처리 후 캘리퍼로 측정하고 마우스 생존율을 평가한다.
실시예 3: 인터페론 베타 1a 유전자의 생체외 유전자 치료
실시예 1에서, 본 발명자는 인간 유방암 세포주 MBA-MD-468(미국 모식균 배양소로부터 얻음)를 사용한다. 세포는 인간 인터페론 베타 1a 유전자를 발현하는 아데노바이러스로 감염시키거나 또는 감염시키지 않았다. 이 경우, 아데노바이러스는 E1 유전자 결실이 있고, E2a 유전자내 온도 감수성 돌연변이를 보유하고 있다. 특정 아데노바이러스를 생성하는 방법은 Engelhardt 등의 문헌[(1994), Gene Therapy 5: 1217-1229]에 개시되어 있다(하기 상세한 설명 참조). 간단히 요약하면, 인터페론 베타 1a 유전자를 아데노바이러스 벡터 pAdCMVlink1내로 미리 클로닝하여 유전자 전사체를 CMV IE1 프로모터로 유도함으로써, 아데노바이러스 전달 플라스미드를 형성한다. 이 유전자를 결실된 E1 유전자 대신에 벡터내로 삽입하였다. 인터페론 유전자가 있는 재조합 아데노바이러스는 293 세포내에서 전달 플라스미드 및 아데노바이러스 게놈의 재조합으로 형성한다. 바이러스를 종래의 방법으로 플라크 정제하고 플라크 분석에서 역가측정한다.
재료 및 방법
세포 배양.
인간 암종 세포 MDA-MB-468, Huh7, KM12LA4, ME180, HeLa, U87, 및 293을, 10% 소 혈청, 2 mM 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 및 비타민을 함유하는 듈베코 변형 이글 배지내 점착성 배양물로서 유지한다.
정제된 아데노바이러스의 생성.
시토메갈로바이러스 초기 프로모터에 의해 유도된 인간 IFNβ 유전자를 암호화하는 아데노바이러스 전달 벡터, pAdCMV-huIFNβ는 플라스미드 pAdCMVlink1내로 인간 IFN-β1a를 암호화하는 cDNA 삽입체를 결찰시켜 작제한다(Engelhardt et al., 1994, 상기 문헌 참조). 플라스미드 pAdCMV-huIFNβ는 온도 감수성 아데노바이러스 H5ts125로부터 정제된 게놈 DNA를 이용하여 293 세포내로 동시전달한다. 개개 플라크에서 유래한 재조합 아데노바이러스를 사용하여 39℃에서 293 세포를 감염시키고 상청액은 ELISA 분석으로 IFN-β 유전자 발현에 대해 시험하였다. IFN-βcDNA를 보유하는 아데노바이러스(H5.110hlIFNβ)를 확인하고 추가로 증폭시킨다. 유사하게, 비색 마커 β-갈락토시다제를 암호화하는 대조군 E2A 온도 감수성 아데노바이러스(H5.110lacZ)를 만든다. 바이러스 제제는 293 세포에서 생성하고 2회의 플라크 분리후에 CsCl 구배로 정제한다. 이들은 야생형 아데노바이러스의 존재에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다.
2% 소 혈청을 함유하는 배지 3 ㎖내에서 100의 다중감염도(MOI)로 H5.110hlIFNβ로 부분융합성(subconfluent) 세포를 감염시킨다. 15 시간 내지 18 시간 후에, 상청액을 수거하고 IFN-β농도를 ELISA 분석으로 정량하였다.
ELISA 분석.
96 웰 평판을 항-인체 IFNβ항체 B02(일본, 섬미트 파마슈티칼스 캄파니)로 4℃에서 밤새 피복하였다. 항체는 50 mM 중탄산나트륨/탄산염, 0.2 mM MgCl2 및 0.2 mM CaCl2(pH9.6)을 함유하는 피복 완충액에서 10 ㎍/㎖로 사용하였다. 평판을 1시간 동안 실온에서 PBS 중 1% 카세인으로 차단한 후에, 1% 카세인 및 0.05% 트윈 20내에 희석된 IFN-β 단백질 표준물(AvonexTM, 바이오겐)의 IFN-β 시료를 첨가한다. 이어서, 1시간 동안 항-IFN-β 토끼 혈청(1:2000 희석), 1 시간 동안 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 당나귀 항토끼 항체(잭슨 이뮤노 리서치, 1:5000 희석), 및 기질 용액(4.2 mM TMB 및 0.1 M 아세트산나트륨-시트르산 pH4.9)과 함께 평판을 실온에서 연속적으로 항온처리하였다. 2N H2SO4로 반응을 정지시킨 후, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
마우스 실험
4∼6 주령 암컷 Balb/c nu/nu 마우스를 타코닉 사육장(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재)에서 입수하였다. 모든 마우스를 실험전에 2주 이상 동안 무병원성 바이오겐 동물 시설에서 보호한다. 생체외 실험을 위해서, 감염 및 비감염 세포를 트립신/EDTA 용액으로 수거하고, PBS로 2회 세척하였다. 이들 세포를 전술한 비율로 마우스내로 주입하기 직전에 혼합한다. PBS 100 ㎕ 중 총 2 ×106 세포를 우측부내로 피하 이식한다. 캘리퍼를 사용하여 길이 및 폭으로 종양 크기를 측정하고 종양 직경의 평균(mm)으로 나타낸다.
생체내 직접 주사 실험을 위해서(실시예 4), 100 ㎕ PBS 중 2 ×106 종양 세포를 누드 마우스내로 먼저 피하 이식한다. 종양 크기가 5∼6 mm 직경이 되었을 때, 각종 용량의 재조합 아데노바이러스를 함유하는 PBS 100 ㎕를 단일 주사로 종양의 중심에 직접 주사한다. 캘리퍼를 사용하여 종양의 길이 및 폭을 모니터링한다. 종양 크기는 길이와 폭의 평균으로서 계산한다. 종양에서 출혈 증후가 나타나기 시작하거나 종양의 중량이 총 체중의 10%가 될때 마우스를 희생시켜 동물 사망으로 한다. 고사(apoptosis)는 온코 인코포레이티드에서 제공하는 동일계 고사 검출 키트(카탈로그 #S7110-KIT)를 사용하여 검사한다.
결과
본 발명자는 먼저 아데노바이러스 벡터의 이식유전자 발현 및 형질도입 효과를 평가하였다. 인간 유방암 세포 MDA-MB-468는 다중감염도(MOI)를 증가시키면서 H5.110lacZ로 감염시킨다. X-gal 염색 후에, 본 발명자는 다중도 100에서 유전자 형질도입 효과가 이들 세포에서 약 100%에 도달하는 것으로 추정하였다(도시되지 않음). 따라서, 유방암 세포를 세포당 100 플라크 형성 단위(pfu)의 비율로 배양물내 감염시킨다. 그 이유는 이들 암종 세포에 대한 경험으로 미루어 볼때 상기 비율이 군집내 모든 세포에서 유전자 발현을 유도하는 최저 바이러스:세포 비율이기 때문이다.
제1 실험에서, 주사 18 시간 후에, 2 ×106 세포를 각 누드 마우스의 등으로 피하 주사한다. 5마리의 마우스에게는 비감염 세포를 주사하고 5마리의 마우스에게는 아데노바이러스-IFNβ로 감염된 세포를 주사한다. 상당한 크기의 종양이 대조군 비감염 세포를 주입한 모든 마우스에서 발생하였다. IFN-β을 발현하는 아데노바이러스(H5.110hIFNβ:표 1)로 처리된 세포를 주사한 임의의 마우스에서는 종양이 발생하지 않았다.
IFN-β 단백질에 대한 종양 세포의 시험관내 노출로 인해 생체내 종양원성 손실이 유도될 가능성을 배제하기 위해서, 본 발명자는 바이러스 감염 18 시간 후에 검출된 단백질 농도에서 IFN-β 단백질로 MDA-MB-468 세포를 처리하였다. 철저히 세척한 후에, 동수의 처리 세포 또는 미처리 세포, 또는 10% 처리 세포를 포함하는 혼합물을 누드 마우스에게 주사한다. 종양 형성이 3군의 마우스에서 모두 관찰되었으며(자료는 도시되지 않음), 이는 시험관내 단백질 처리가 아니라 생체외 IFN-β 유전자 전달이 종양 형성의 억제에 중요하다는 것을 제시한다.
IFN-β 유전자를 발현하는 암세포가 비형질도입된 세포의 파괴를 유발하는지 여부를 결정하기 위해서, 하기 실험을 수행한다. 동일한 암세포를 감염시키지 않거나, IFN-β 유전자를 발현하는 아데노바이러스(H5.110hIFNβ)로 감염시키거나, 또는 동일한 유형의 아데노바이러스지만 항암 효과가 있을 것으로 기대되지 않는 β-갈락토시다제 리포터 단백질을 암호화하여 아데노바이러스 자체에 의한 임의의 효과에 대한 대조군인 lacZ 유전자를 발현하는 아데노바이러스(H5.110lacZ)로 감염시킨다. 모든 아데노바이러스 감염은 100의 pfu:세포 비율에서 수행한다. 본 발명자는 별도로 MOI 100에서 H5.110hIFNβ 또는 H5.110lacZ로 MDA-MB-468 종양 세포를 감염시켰다. 감염 18 시간 후에, 감염된 세포를 수거하고, 마우스내로 주사하기 직전에 이의 일부를 비감염 세포와 혼합하였다. Balb/c 누드 마우스에 동수의 감염 세포, 비감염 세포, 또는 감염 세포 10%와 바이러스에 노출되지 않은 세포 90%를 포함하는 혼합물을 피하 이식하였다. 종양 성장은 12일 후에 모니터링하였다. 비감염된 세포를 이식한 모든 마우스가 종양을 형성한 반면, 100%의 H5.110hIFNβ 또는 H5.110lacZ를 공급 받은 마우스에서는 종양이 관찰되지 않았다. 이러한 결과가 시사하는 바는, 바이러스에 의한 감염은 종양형성성을 제거할 수 있다는 것이다(표 1). 그러나, 10% H5.110lacZ 감염 세포를 투여받은 모든 마우스는 종양을 형성하였지만, 10% H5.110hIFNβ감염된 세포를 투여받은 모든 마우스는 종양을 형성하지 않았다. 따라서, H5.110lacZ 감염은 기존에 감염된 세포의 종양 형성을 억제하는데 충분하지만, 동시 주입된 천연 및 비감염 세포의 종양형성성을 차단하지는 못하였다. 대조적으로, 10% 세포로의 H5.110hIFNβ에 의한 형질도입은 바이러스에 의해 형질도입된 세포 뿐 아니라 형질도입되지 않는 세포의 종양형성성을 억제하는데 충분하였다. 100% 형질도입된 개체군에서 H5.110lacZ 에 의한 종양형성 억제는 일부 일반적인 독성 효과 또는 아데노바이러스의 발생의 어느 정도의 항종양 효과에 기인할 수 있으나, 형질도입된 세포는 시험관내에서 복제할 수 있다는 것에 주의해야 한다(공개되지 않은 자료).
종양형성성을 억제하는데 필요한 인터페론-함유 바이러스의 양을 정하기 위해서, H5.110hIFNβ 또는 H5.110lacZ 감염된 종양 세포를 별도로 각종 비율에서 비감염 세포와 혼합하여 각 경우에 감염되지 않은 과량의 세포가 있도록 하였다. 10%, 3%, 1%, 0.3% 세포로 구성된 상이한 시료를 아데노바이러스로 감염시키고 나머지는 감염시키지 않도록 혼합한다. 혼합 직후, 세포를 누드 마우스내로 주사한다. 결과는 표 1에 제시되어 있다. 종양 직경은 세포의 주사후 각 시점에서 2차원으로 측정한다. 표 1에서의 각 자료 점은 4마리의 마우스로부터 취한 측면 및 길이 직경 측정의 평균 +/- 표준 편차로 나타낸다. 측정은 종양 주입후 12, 19, 26 및 33일에 한다.
| 시료 | 12일 | 19일 | 26일 | 33일 |
| 100% 비감염 | 4.1 +/- 0.6 | 4.9+/- 0.8 | 5.9 +/- 0.5 | 6.3 +/- 0.6 |
| 100% AdV-IFN | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 10% AdV-IFN | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 3% AdV-IFN | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 1% AdV-IFN | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 0.3% AdV-IFN | 2.8 +/- 0.2 | 2.9 +/- 0.3 | 3.0 +/- 0.6 | 1.8 +/- 2.0 |
| 100% AdV-lacZ | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 10% AdV-lacZ | 4.8 +/- 0.4 | 5.2 +/- 0.6 | 6.2 +/- 0.5 | 6.5 +/- 0.5 |
| 3% AdV-lacZ | 4.3 +/- 0.5 | 4.6 +/- 0.6 | 5.8 +/- 0.8 | 6.5 +/- 1.0 |
| 1% AdV-lacZ | 4.3 +/- 0.4 | 4.6 +/- 0.4 | 5.0 +/- 0.5 | 6.3 +/- 0.9 |
| 0.3% AdV-lacZ | 4.4 +/- 0.5 | 4.7 +/- 0.6 | ND | ND |
1% 정도로 낮은 H5.110hIFNβ 형질도입된 세포를 투여받은 마우스에서는 종양 형성이 완전히 차단되었다(표 1). 세포를 주사한 후 첫주에, 10%, 3% 및 1% H5.110hIFNβ를 주사한 마우스에서는 매우 작은 종양이 검출되었다(이는 촉지가능하지만, 측정하기에는 충분히 크지 않음). 그러나, 이들 작은 종양은 모두 9일째에 완전히 퇴화되었다. 이는 일부 세포가 단기간 동안 생존하고 이 기간 동안 IFN-β 유전자를 발현하여 전체 종양을 사멸시킨다는 것을 제시한다. 누드 마우스에서 이 세포주를 이용하여 수행한 일부 실험에서, 1% 세포가 H5.110hIFNβ로 형질도입된 경우 종양 형성은 관찰되지 않았으며 생존율은 100%였다(자료는 도시되지 않음). 0.3% H5.110hIFNβ 형질도입된 세포를 수용한 마우스는 종양을 형성하였으나, 이들 종양의 크기는 대주군 마우스보다 상당히 작았으며, 0.3% 군내 5 마리의 마우스 중 2 마리는 33일째 종양이 완전히 퇴화되었다(표 1).
대조적으로, 10% 내지 0.3% H5.110lacZ를 수용한 마우스는 비감염군의 종양과 유사한 크기의 종양을 형성하였으며, 이들 대조군 중 어떤 군에서도 종양 퇴화가 관찰되지 않았다(표 1).
분명히, 매우 작은 비율의 세포내에서의 인간 인터페론 베타(hIFN-β)의 발현은 누드 마우스에서 종양형성성을 차단하는 것으로 보인다. 본 발명자는 추가로 종양 형성에 영향을 주고(반드시 종양 형성을 차단해야 하는 것은 아님) 마우스 생존을 촉진하는데 필요한 H5.110hIFNβ감염 세포에 대한 최저 비율을 조사하였다. 0.3%, 0.1%, 0.03%, 0.01% 및 0% H5.110hIFNβ감염된 세포를 함유하는 동수의 MDA-MB-468 세포를 누드 마우스내로 이식하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 0.3% 또는 0.1% 감염된 세포를 수용한 마우스는 단지 비감염된 세포만을 수용한 마우스에 비하여 휠씬 적은 종양을 형성한다(도 1A). 0.3% 및 0.1% 형질도입으로 형성된 종양 중에서, 각각 5개 종양중 3개 및 5개 종양중 1개는 완전히 퇴화되었다. 0.3% 및 0.1% 형질도입군에서 상당한 생존 연장이 관찰되었다. 0%, 0.01% 또는 0.03% 감염된 세포의 이식은 75일내에 동물 사망을 초래하지만, 109일에 실험 결과로서 0.1% 및 0.3% 군에서 5마리 중 1마리 및 5 마리중 3마리는 각각 종양을 형성하지 않고 생존하였다(도 1B).
모든 종양 세포 중 단지 작은 부분만(약 0.3% 초과, 바람직하게는 약 1.0% 초과)을 형질감염 또는 감염시키면 효과가 나타나는 것 같다. 이는 종양내 모든 세포가 종양 억제 유전자를 얻어야 하는 야생형 종양 억제제(예, p53)의 전달과 같은 함암 유전자 치료법과 차이가 있다.
따라서, 인터페론 유전자는 시험관내 감염 후에 유효한 생체내 증식 억제 효 과를 나타낸다. 이는 아데노바이러스보다는 인터페론에 의한 것임을 대조군으로부터 알 수 있다.
기타 인간 이종이식편 종양에서의 생체외 IFN-β 유전자 치료
본 발명자는 생체외 인간 이종이식편 모델에서 기타 종양 세포 유형내 H5.110hIFNβ형질도입의 효과를 시험하였다. 인간 결장암 세포 KM12L4A, 인간 간암 세포 Huh7 또는 인간 경부암 세포 ME180에 H5.110hIFNβ를 형질도입한다. 10%, 1%, 또는 0% 형질도입된 세포를 함유하는 동수의 세포를 누드 마우스에서 종양을 형성하는 능력에 대해 시험하였다. 3종 유형의 비감염된 세포의 주사로 모든 마우스내에서 신속하게 성장하는 종양 형성을 유발한다. 대조적으로, 10% H5.110hIFNβ감염된 세포를 생체외 전달하면, 검사된 모든 동물에서 서서히 증식하는 종양의 출현을 지연시키거나 또는 종양을 형성하지 않는다(도 2A). H5.110hIFNβ에 의한 1% 형질도입이 종양 형성을 완전히 억제하는 MDA-MB-468 세포를 사용하여 얻은 결과와는 달리, 3가지 세포 유형의 1% 형질 도입은 종양 형성을 초래하였지만, 각 시점에서 비감염 대조군의 종양보다는 크기가 작았다. 10% 및 1% 형질도입된 세포를 수용한 마우스는 감염되지 않은 세포를 수용한 마우스와 비교하여 생존이 연장되었다(도 2B). 따라서, 여러 상이한 종양 세포내로의 생체외 아데노바이러스 매개된 IFN-β 유전자 전달은 종양형성성을 효과적으로 억제하고 동물 생존 시간을 연장시킨다.
실시예 4: 인터페론 베타 1a 유전자를 이용한 생체내 유전자 치료
생체외 접근법 대신에, 직접 생체내 유전자 치료를 수행할 수 있다. 생체내 유전자 치료에서, 유전자는 환자내로 직접 투여한다. 이 실시예에서, 인간 IFN-β 유전자를 가진 아데노바이러스(H5.110hIFNβ)를 고형 종양내로 직접 주사한다. 간단히 요약하면, 2 ×106 MBA-MD-468 인간 유방암 세포를 50마리의 누드 마우스 등으로 피하주사한다. 약 5∼6 mm 직경의 피하 종양이, MDA-MB-468 세포를 피하 주사한 지 24일 후에 누드 마우스에서 형성되었다. 이때, 1 ×107∼3 ×109 pfu/마우스 범위의 각종 바이러스 용량에서 H5.110hIFNβ 및 H5.110lacZ 벡터 또는 PBS를 1회 종양내 주사하여 종양을 처리하였다.
도 3에 도시된 자료로부터, 14일내에 3 ×109, 1 ×109, 또는 3 ×108 총 pfu의 H5.110hIFNβ를 이용한 1회 투여 처리가 종양 퇴화를 유발하는 것이 확인된다. 완전한 종양 퇴화는 3 ×109 pfu군에서 5 마리 중 4마리, 1 ×109 pfu군에서는 5 마리중 3 마리에서 발생하였다. 1 ×109 pfu H5.110hIFNβ를 주사한 종양에서는 약 1500 IU/㎖의 높은 IFN-β국소 농도가 검출된 반면, 혈청에서는 INF-β37 IU/㎖만이 검출되었다. 1 ×108, 3 ×107 및 1 ×107 pfu를 비롯한 낮은 H5.110hIFNβ용량은 거의 또는 전혀 영향이 없으며(도 3, 자료는 도시되지 않음), 이는 항종양 반응이 용량 의존성임을 제시하는 것이다. PBS 또는 H5.110lacZ를 동량으로 주사하면 종양 퇴화를 유발하지 않는다(도 3). 종양을 장기간 동안 모니터링하면, 3 ×109 pfu의 H5.110lacZ로 주사한 일부 개개 종양에서 완만한 성장 및 퇴화가 관찰되는데, 이는 이 용량에서 대조 바이러스가 종양 성장을 약간 억제할 수 있다는 것을 제시한다. 3 ×109, 1 ×109, 또는 3 ×108pfu의 H5.110hIFNβ로 처리하면 PBS 또는 H5.110lacZ로 처리된 마우스에 비하여 생존이 상당히 증가한다(자료는 도시되지 않음). 본 발명자들은 매3일 마다 기존의 MDA-MB-468 및 HeLa 종양내로 1 ×108 pfu H5.110hIFNβ를 5회 주사하는 수회 주사로 시험하여 2가지 유형의 종양이 성장 억제되고 퇴화된다는 것을 알았다(공개되지 않음). 본 발명자는 인간 신경교종 세포주 U87을 사용하여 생체내 유사 실험을 수행하였다. 이들 세포는 IFN-β에 대한 감수성이 매우 높아서 1 ×109 pfu H5.110hIFNβ로 처리한 4마리의 마우스중 4마리에서, 1 ×108 pfu로 처리한 4 마리의 마우스중 2 마리에서 완전한 종양 퇴화가 관찰되었다(자료는 도시되지 않음). 이들 발견은 IFN-β 유전자의 직접적 및 국부적 생체내 아데노바이러스 전달이 항종양 효과를 유의적으로 상승시킬 수 있다는 것을 입증한다.
1 ×109 pfu 바이러스를 주사한 지 4일 후에, MDA-MB-468 종양을 조직학 검사를 위해 수거하였다. 이 때 H5.110hIFNβ를 주사한 종양은 퇴화 증후를 나타내었다. 헤마톡실린-에오신 염색에 의한 MDA-MB-468 종양의 조직학 분석을 수행한다. H5.110lacZ를 주사한 종양에서보다 H5.110hIFNβ를 주사한 종양에서 더 많은 세포 고사가 발생한다. 본 발명자는 말단 표지되고 단편화된 게놈 DNA의 직접 형광 검출로 고사를 확인하였다. 매우 소량의 침윤성 단핵구 세포가 H5.110hIFNβ 또는 H5.110lacZ를 주사한 종양에서 관찰되는데, 이것이 시사하는 바는, 본 모델에서는 세포 면역 반응이 H5.110hIFNβ유도된 종양 퇴화에서 중요한 역활을 하지 않는다는 것이다.
상기 제시된 생체외 및 생체내 실험은 인터페론의 직접적인 항증식 효과만을 측정한다. 이들은 면역 결핍 마우스이기 때문에, 종양 파괴를 자극하는 인터페론이 보유하는 임의의 면역 자극 활성이 존재하지 않는다. 또한, 인터페론은 인간에서 마우스에 이르기까지 종에 걸쳐 존재하는 것이 아니기 때문에, 이들 마우스에서 인간 암세포를 억제하는데 사용된 인간 IFN-β는 마우스 혈관 내피 세포상에서 작용하지 않음으로 혈관형성성을 억제할 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 인간 환자를 인간 IFN-β를 가진 아데노바이러스로 치료한 경우 더욱 급격한 항암 활성을 나타낼 수 있다. 이는 면역 적격성 비인간 영장류에서 모델 설정할 수 있다. 대안적으로, 쥐 기원의 종양을 보유한 면역 적격성 마우스에서 쥐 IFN-β 유전자를 보유한 아데노바이러스를 사용할 수 있다. 이들 다수의 동계 마우스 종양 모델을 이용할 수 있다.
본원에 제시된 자료는 새로운 종양 형성을 차단할 뿐 아니라 기존의 종양을 퇴화시키는 현저한 IFN-β 유전자 치료 능력을 입증한다. 생체외 형질도입 실험으로부터, 유효 분비 단백질을 0.3∼1.0%의 형질도입된 세포내로 도입하면 MDA-MB-468 종양의 형성을 차단한다는 것을 확인하였다. 각종 기타 종양 세포주를 시험하였다. IFN-β 효과의 효능에 있어서 차이가 있지만, 이들은 모두 1∼10%의 IFN-β 형질도입된 세포로 차단할 수 있다. 종양 형성에 영향을 주는데 필요한 IFN-β분비 세포의 비율이 비교적 작기 때문에, 본 발명자는 아데노바이러스를 직접 종양내 주입하여 사전 형성된 종양을 자극하였다. 또한 IFN-β 유전자 전달 효과는 바이러스 1회 주사로 유효하여 종양의 부분적 퇴화 또는 일부 경우에는 완전환 퇴화를 초래하였다.
이들 연구에서, 종양의 급격한 퇴화는 주로 IFN-β의 직접적인 증식 억제 활성 또는 세포 독성 활성의 결과로 보인다. 이 결과는 본 연구에서 사용된 IFN-β 유전자가 인간 기원이고, 인간 IFN-β는 숙주 마우스 세포와 감지가능한 교차 반응을 하지 않는다는 사실에 의해 뒷받침된다. 또한, 사용된 면역 결핍성 누드 마우스는 1형 IFN 유도된 면역자극시 주요 효과기 세포인 T 림프구가 결핍되어 있다(Tough, D.F.et al., (1996), Science 272: 1947-1950 and Rogge, L.et al., (1997) J.Exp.Med., 185:825-831). 또한, IFN-β 유전자 전달 후에 급격하게 퇴화하는 종양에서, 모노클론 세포 침투의 명백한 증가는 관찰되지 않았다. 이들 발견은 IFN-β 매개된 증식 억제 활성만으로 종양 퇴화를 유발하기에 충분하다는 견해를 뒷받침하는 것이다. 본 발명의 자료는, IFN 유도된 증식 억제 활성에 대한 악성 세포의 시험관내 감수성과 생체내 치료 효과 사이에 이전에 관찰된 임상적 상관관계와 일치하는 것으로 보인다(Einhorn and Grander (1996) J.Interferon Cytokine Res. 16:275-281).
요약하면, 아데노바이러스 매개된 IFN-β 유전자 치료는 마우스 모델에서 효과적인 항종양 효과를 나타낼 수 있다는 것을 발견하였다. IFN-β 유전자를 매우 작은 비율의 세포내로 생체외 전달하는 것으로도 종양 형성을 차단하는데 충분하고, 1회 용량으로 직접 종양내 IFN-β 유전자를 전달하면 기존의 종양 퇴화를 유도한다. 이론에 구애받지 않는다면, 이러한 유효 항종양 효과는 IFN-β의 오토크린 및 파라크린 효과로부터 생긴 것일 수 있다. 항종양 효과는 유전자 전달도가 제한되고, 상당한 구경꾼 효과를 필요로 하는 유전자 치료 암 시험에서 중요한 인자이다. 따라서, 국소 IFN-β 유전자 치료는 인간의 종양 치료에 대한 유망한 방법을 제공한다.
등가물
등가물
전술한 내용은 단지 일부 바람직한 양태들의 상세한 설명이라는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 취지 또는 범위에서 벗어나지 않고 각종 변형 및 등가물이 가능하다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.
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- 인터페론-β 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는, 검체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서,상기 유전자로부터 상기 인터페론-β 단백질이 발현되고,상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인 약학 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 복제 결함성이고 E3 유전자내 결실이 있는 것인 약학 조성물.
- 제26항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 복제 결함성이고 E1 유전자내 결실이 있는 것인 약학 조성물.
- 제27항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 복제 결함성이고 E1 유전자내 결실이 있는 것인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 비강내 투여, 기관내 투여, 기관지내 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여 및 피하 투여로 구성된 군에서 선택된 경로로 투여되는 것인 약학 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 경로는 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 및 복강내 투여로 구성된 군에서 선택된 비경구 투여 경로인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 상기 검체의 종양 부위에 또는 그 부근에 직접 주사로 투여되는 것인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 암은 악성 신경교종, 흑색종, 혈관종, 백혈병, 림프종, 골수종, 결장직장암, 비-소세포 암종, 유방암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 암은 악성 신경교종인 약학 조성물.
- 인터페론-β 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 복제 결함성 바이러스 벡터를 포함하는, 검체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서,상기 유전자로부터 상기 인터페론-β 단백질이 발현되고,상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인 약학 조성물.
- 제37항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1, E2A 및 E4 영역으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아데노바이러스 게놈 영역의 하나 이상의 필수 유전자에 결함이 있는 것인 약학 조성물.
- 제37항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자내 결실이 있는 것인 약학 조성물.
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- 제40항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 E3 유전자내 결함이 있는 것인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 국소 투여, 안내 투여, 비경구 투여, 비강내 투여, 기관내 투여, 기관지내 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여 및 피하 투여로 구성된 군에서 선택된 경로로 투여되는 것인 약학 조성물.
- 제42항에 있어서, 상기 경로는 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 및 복강내 투여로 구성된 군에서 선택된 비경구 투여 경로인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 상기 검체의 종양 부위에 또는 그 부근에 직접 주사로 투여되는 것인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 암은 악성 신경교종, 흑색종, 혈관종, 백혈병, 림프종, 골수종, 결장직장암, 비-소세포 암종, 유방암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
- 제45항에 있어서, 상기 암은 악성 신경교종인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 유전자는 인간 인터페론-β 단백질을 암호화하는 것인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 유전자는 인간 인터페론-β 단백질을 암호화하는 것인 약학 조성물.
- 제24항에 있어서, 상기 검체는 인간 검체인 약학 조성물.
- 제35항에 있어서, 상기 검체는 인간 검체인 약학 조성물.
- 제24항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인터페론-β 단백질이 암 퇴화 또는 암 성장 억제를 유발하는 데 충분한 양으로 발현되는 것인 약학 조성물.
- 인터페론-β 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는, 검체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서,상기 유전자로부터 상기 인터페론-β 단백질이 발현되고,상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터이며,상기 아데노 관련 바이러스 벡터는 종양 또는 그 부근에의 직접 주사 이외의 다른 경로로 투여되는 것인 약학 조성물.
- 인터페론-β 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 복제 결함 바이러스 벡터를 포함하는, 검체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물로서,상기 유전자로부터 상기 인터페론-β 단백질이 발현되고,상기 복제 결함 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 벡터이며,상기 아데노 관련 바이러스 벡터는 종양 또는 그 부근에의 직접 주사 이외의 다른 경로로 투여되는 것인 약학 조성물.
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