HU224422B1 - Eljárások és készítmények szekretált fehérjéket, például béta-interferont kódoló géneket alkalmazó terápiára - Google Patents
Eljárások és készítmények szekretált fehérjéket, például béta-interferont kódoló géneket alkalmazó terápiára Download PDFInfo
- Publication number
- HU224422B1 HU224422B1 HU0002913A HUP0002913A HU224422B1 HU 224422 B1 HU224422 B1 HU 224422B1 HU 0002913 A HU0002913 A HU 0002913A HU P0002913 A HUP0002913 A HU P0002913A HU 224422 B1 HU224422 B1 HU 224422B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- interferon
- gene
- vector
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 179
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims description 52
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims description 23
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 title claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 11
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 156
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 75
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 71
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 29
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 8
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 claims description 8
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 claims description 7
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 7
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 7
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 2
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 claims 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 claims 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 claims 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 208
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 176
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 104
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 84
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 69
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 40
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 27
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract description 14
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 abstract description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 abstract description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 333
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 77
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 66
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 66
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 66
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 59
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 42
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 37
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 24
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 24
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 22
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 20
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 16
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 12
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 12
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 12
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 8
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 8
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 8
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 8
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 8
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 7
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 5
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 4
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 4
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 4
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 3
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- 101000904962 Arabidopsis thaliana Histone H2B.6 Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 101150075174 E1B gene Proteins 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010048832 Colon adenoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FBUKMFOXMZRGRB-UHFFFAOYSA-N Coronaric acid Natural products CCCCCC=CCC1OC1CCCCCCCC(O)=O FBUKMFOXMZRGRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- -1 DNA) into a cell Chemical class 0.000 description 1
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101150002621 EPO gene Proteins 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000531123 GB virus C Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 101900065606 Human cytomegalovirus Immediate early protein IE1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101150103227 IFN gene Proteins 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 101710170970 Leukotoxin Proteins 0.000 description 1
- 206010050017 Lung cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 206010028116 Mucosal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 201000010927 Mucositis Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 231100000439 acute liver injury Toxicity 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 1
- 230000003443 anti-oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000012 chronic liver injury Toxicity 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229940000986 dextran 110 Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N glycerol 1-phosphate Chemical compound OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002989 hepatic vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013415 human tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000018309 neoplasm of pericardium Diseases 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 235000021075 protein intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 1
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 229960001814 trypan blue Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007442 viral DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 244000000009 viral human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
A találmány tárgya sejtexpressziós rendszer szekretált fehérje(előnyösen interferon) in vivo expresszálására emlősrecipiens(előnyösen ember) sejtjében például tumor kezelésére. Az expressziósrendszer rekombináns adenovírusvektort tartalmaz, melyet hordozókéntalkalmaznak géntermék in situ biztosítására. Az expressziós rendszertalkalmazó ex vivo génterápiás eljárásban emlősrecipiensből származósejtet genetikailag módosítanak szekretált fehérjét, előnyöseninterferont kódoló DNS-sel, majd beadják az emlősrecipiensnek akezelésre szoruló helyre; valamint in vivo génterápiás eljárásban azexpressziós vektort közvetlenül a kezelendő alany sejtjébe juttatják.A találmány tárgya expressziós rendszert tartalmazógyógyszerkészítmény is. A vizsgálatok szerint IFN-?-gén ex vivo célbajuttatása tumorba a sejtek nagyon kis százalékába (legalább 0,3%)elegendő volt a tumorképződés blokkolására, és egyetlen dózisból állóközvetlen intratumorális IFN-?-gén-bevitel kialakult tumorokvisszafejlődéséhez vezetett.
Description
A találmány tárgya a génterápia területére vonatkozik. A találmány tárgya pontosabban szekretált fehérjéket, például interferonfehérjéket kódoló DNS célba juttatása emberekben és állatokban.
Az interferonok (a továbbiakban „IFN” vagy „IFN-ek” is) különböző biológiai aktivitásokkal rendelkező fehérjék, amelyek közül néhány antivirális, immunmoduláló és antiproliferatív. Viszonylag kisméretű, fajspecifikus, egyláncú polipeptidek, amelyeket emlőssejtek termelnek különféle indukálószerekre, például vírusokra, polipeptidekre, mitogénekre és hasonlókra adott válaszként. Az interferonok megvédik az állati szöveteket és sejteket vírustámadás ellen, és fontosak a gazdaszervezet védekezőmechanizmusában. A legtöbb esetben az interferonok jobb védettséget biztosítanak olyan típusú szöveteknek és sejteknek, amelyekből előállítottuk azokat, mint más típusú szöveteknek és sejteknek, ami azt mutatja, hogy emberi eredetű interferon hatékonyabb lehet emberi betegségek kezelésére, mint más fajból származó interferonok.
A humán interferonok számos típusát különböztetjük meg, általában leukocita- (interferon-alfa [a]), fibroblaszt- (interferon-béta [β]) és immuninterferonokként (interferon-gamma [γ]) osztályozzuk azokat, és ezek nagyszámú variánsa létezik. Az interferonok általános tárgyalása megtalálható különböző tankönyvekben és monográfiákban, például: „The Interferon System” (W. E. Stewart, II., Springer-Verlag, N. Y., 1979); és „Interferon Therapy” (World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneva, 1982), melyeket referenciaként tekintünk.
Az interferonoknak potenciális szerepük van nagyszámú humán rákos megbetegedés kezelésében, mivel ezek a molekulák rákellenes aktivitással rendelkeznek, amely több szinten hat. Egyrészt az interferonfehérjék képesek közvetlenül gátolni humán tumorsejtek proliferációját. Az antiproliferatív aktivitás szinergikus különféle, engedélyezett kemoterápiás ágenssel is, például ciszplatinnal, 5FU-val és taxollal. Másrészt az interferonfehérjék immunmodulátor-aktivitása antitumor-immunválasz indukálásához vezethet. Ez a válasz NK-sejtek aktiválódását, makrofág-aktivitás stimulálását és I. osztályú MHC felszíni expressziójának indukálódását foglalja magában, amely antitumorális, citotoxikus T-limfocita-aktivitás indukciójához vezet. Továbbá néhány vizsgálat azt mutatja, hogy az IFN-p-fehérje antiangiogenikus aktivitással rendelkezhet. Az angiogenezis, az új véredények képződése kritikus jelentőségű szilárd tumorok növekedéséhez. Bebizonyosodott, hogy az IFN-β gátolhatja az angiogenezist proangiogenikus faktorok, például bFGF és VEGF expressziójának gátlásával. Végül, az interferonfehérjék gátolhatják a tumor ráterjedőképességét úgy, hogy olyan enzimek expresszióját befolyásolják, mint a kollagenáz és elasztáz, amelyek fontosak a szövet újjáalakításában.
Úgy tűnik, hogy az interferonok antivirális aktivitással rendelkeznek, amely két különböző mechanizmusra épül. Például az I. típusú interferonfehérjék (a és β) közvetlenül képesek gátolni a humán hepatitis B-vírus („HBV”) és hepatitis C-vírus („HCV”) replikációját, de immunválaszt is stimulálhatnak, amely megtámadja ezen vírusok által megfertőzött sejteket.
Potenciális terápiás értékük ellenére konkrétan az interferonfehérjékkel csak korlátozott klinikai sikereket értek el vírusos hepatitis és szilárd tumorok ellen. Az IFN-a-t jóváhagyták HBV és HCV kezelésére; azonban a válaszadási arány mindkét esetben csak körülbelül 20%-os volt. Míg az interferonfehérjéket jóváhagyták néhány rák, például limfómák, leukémiák, melanoma és vesesejt-karcinóma kezelésére, a klinikai kísérletek többsége, amelyekben az interferonokat egymagukban vagy szokásos kemoterápiás ágensekkel kombinációban, szilárd tumorok kezelésére alkalmazták, sikertelen volt.
Az interferon beadási módja fontos faktor ezen jelentős terápiás ágens klinikai alkalmazásában. Az interferonfehérje szisztémás beadása a leggyakrabban intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekció formájában alkalmazva bizonyos sikerekkel járt olyan rendellenességek, mint például hajas sejtes leukémia, szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) és ezzel társult Kaposi-szarkóma kezelésében. Azonban ismeretes, hogy fehérjék tisztított formájukban különösen érzékenyek degradálódásra. Az interferon-béta esetén az interferondegradálódás elsődleges mechanizmusát!) oldatban főleg az aggregáció és deamináció. Az interferon stabilitásának hiánya oldatokban és más termékekben idáig korlátozta hasznosságát. Továbbá, az interferonfehérje parenterális (intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás) beadását követően az interferonfehérje kiürülési sebessége nagyon gyors. Ennélfogva parenterális fehérjebeadás nem tesz lehetővé elegendő mennyiségű interferonlokalizációt az aktív helyen (szilárd tumornál vagy hepatitis esetén a májban). A parenterálisan páciensekbe beadható interferon mennyiségét a mellékhatások korlátozzák, melyeket nagy interferondózisoknál figyeltek meg. Nyilvánvaló, hogy hatékonyabb terápiára van szükség.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki szekretált fehérjék, például interferonfehérje terápiás hatású szerként való célba juttatásával kapcsolatos problémák megszüntetését. A találmány tárgya interferonterápiát alkalmazó eljárás, amelyben az adott fehérje helyett szekretált fehérjét kódoló gént juttatunk célba.
Ennek megfelelően, a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztünk ki géntechnológiailag módosított sejtek alkalmazására alapuló génterápiás eljárás kidolgozását, amelyben ezeket szekretált fehérje, például interferon emlősrecipiensbe való célba juttatására alkalmazzuk. A találmány szerinti megoldásban ezeket és más célokat úgy érünk el, hogy kidolgozunk eljárásokat sejtexpressziós rendszer létrehozására, ezek alkalmazásával előállítunk expressziós rendszert és ezeket tartalmazó gyógyászati készítményeket. A sejtexpressziós rendszer egy vagy több, szekretált fehérjét kódoló gént képes expresszálni, és hordozóként alkalmazható a géntermék in situ célba juttatására
HU 224 422 Β1 emlősrecipiensbe. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint az emlősrecipiens ember.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a sejtexpressziós rendszer egy emlősrecipiens sejtjében interferonfehérje in vivő expresszálására szolgál, egy állapot kezelésére. Az expressziós rendszer az emlősrecipienssel megegyező fajból származó sejtet és a sejtben lévő, interferonfehérje expresszálására szolgáló expressziós vektort tartalmaz. Előnyösen az emlősrecipiens ember, és az expressziós vektor vírusvektort tartalmaz.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az expressziós rendszer az emlősrecipienssel megegyező fajból származó, több sejtet és a sejtekben lévő, szekretált fehérje expresszálására szolgáló expressziós vektort tartalmaz. Az expressziós vektort a több sejtnek csak egy része tartalmazza. Előnyösen a sejtek legalább 0,3%-a tartalmazza a vektort. A szekretált fehérje előnyösen interferon, és a legelőnyösebb interferon az alfa-, béta-, gamma- és konszenzusinterferon, ezek közül a legelőnyösebb a béta-interferon.
A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint a sejtexpressziós rendszer több ráksejtet tartalmaz, és a ráksejtek legalább egy része olyan izolált polinukleotiddal rendelkező adenovírusvektort tartalmaz, amely expresszióra interferont kódol. Ebben a sejtexpressziós rendszerben az adenovírusvektor lehet például: (a) E1-génjében delécióval és/vagy mutációval rendelkező adenovírusvektor; (b) E2a-génjében delécióval és/vagy mutációval rendelkező adenovírusvektor, amely vektor humán béta-interferont képes expresszálni; (c) E1- és E4-génjében egyaránt delécióval és/vagy mutációval rendelkező adenovírusvektor; és (d) valamennyi génjében delécióval rendelkező adenovírusvektor; amely vektor humán béta-interferont képes expresszálni.
A találmány tárgyát képezi szekretált fehérje emlősrecipiensben lévő helyre való célba juttatására szolgáló gyógyszerkészítmény is. A készítmény tartalmaz hordozót és az emlősrecipienssel megegyező fajból származó, genetikailag módosított, több sejtet, és a sejtek legalább egy része a szekretált fehérje hatásos mennyiségének expressziójára szolgáló, expressziós vektort tartalmaz. A szekretált fehérje előnyösen interferon. A készítmény lehet in vivő és ex vivő célba juttatásra egyaránt alkalmas készítmény.
A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint az eljárás ex vivő génterápiában alkalmazott, emlősrecipiensbe beadható gyógyszerpreparátum előállítására szolgál. Az eljárás az alábbi lépésekből áll: (a) előállítunk az emlősrecipienssel megegyező fajból származó, több sejtet, (b) szekretált fehérje expressziójára szolgáló expressziós vektort beviszünk a sok sejt közül legalább egybe, legalább egy, genetikailag módosított sejt előállítása céljából, és (c) legalább egy, genetikailag módosított sejtet gyógyászatilag elfogadható hordozóba helyezünk, így olyan gyógyszerpreparátumhoz jutunk, amely alkalmas emlősrecipiensben lévő helyre való beadásra.
A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya génterápiás eljárás, amelyben genetikailag módosítunk emlősrecipiensből származó, legalább egy sejtet az alábbi lépésekben: (a) szekretált fehérje expressziójára szolgáló expressziós vektort beviszünk legalább egy sejtbe, legalább egy, genetikailag módosított sejt előállítása céljából, és (b) lehetővé tesszük, hogy a genetikailag módosított sejt érintkezzen az emlősrecipiensben lévő hellyel. Az eljárásban továbbá az emlősrecipiensből eltávolíthatunk legalább egy sejtet az expressziós vektor bevitelére szolgáló lépés előtt. A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint a vektor bevitelére szolgáló lépésben a vektort a sok sejtnek csak egy részébe visszük be.
A találmány tárgyát képezi ex vivő génterápiás eljárás, amely az alábbi lépésekből áll: eltávolítunk több sejtet a kezelendő alanyból; beadunk rekombináns adenovírust a sok sejt közül legalább egybe, így a sejtek többsége olyan lesz, amely nem tartalmaz adenovírust. Az adenovírus rendelkezhet delécióval E1-génjében, és szekretált fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmaz. A több sejtet visszavisszük a kezelendő alanyba.
In vivő génterápiás eljárásban humán béta(p)-interferonfehérjét kódoló, izolált polinukleotidot tartalmazó adenovírusvektort közvetlenül beadunk a kezelendő alany sejtjébe anélkül, hogy előtte eltávolítottuk volna a sejtet a kezelendő alanyból. Az in vivő és ex vivő eljárások lehetővé tesznek topikális, intraokuláris, parenterális, intranazális, intratracheális, intrabronchiális, intramuszkuláris, szubkután, intravénás és intraperitoneális beadást.
A találmány szerinti megoldás számos előnnyel jár. Az interferon-génterápia nagyon magas interferonkoncentrációkat tesz lehetővé alacsony szisztémás szintekkel. Ez nagyobb hatékonyságot eredményezhet kisebb mellékhatásokkal. Génterápiával célba juttatott interferonok viszonylag állandó szinten is jelen lehetnek, eltérően az interferonfehérje-terápiától, amelyben nagyon magas „lökések” vagy csúcsok figyelhetők meg a fehérjekoncentrációban (amely toxicitáshoz is vezethet) a fehérje injektálása után, melyeket nagyon alacsony szintek követnek, amelyben az interferonkoncentráció valószínűleg túl alacsony ahhoz, hogy hatékony legyen.
A páciens kényelme szintén kritikus faktor. Míg interferonfehérjéből gyakori injekciók szükségesek, interferongént expresszálni képes vektorból egyetlen beadás vagy néhány ritka beadás a fehérje hosszan tartó, stabil termelését képes biztosítani. A génterápia lehetővé teszi interferonok célba juttatását ellenőrzött módon egy jól elkülöníthető szervbe vagy tumorba. Egy autokrin rendszert lehet kialakítani, amelyben ugyanaz a sejt expresszálja, szekretálja és veszi fel az interferont. Tehát nagyon magas lokális dózist lehet elérni. Ezeket a magas dózisokat nem lehet elérni a fehérje parenterális beadásával, toxicitási problémák miatt.
Mivel az interferonfehérjék a sejteken kívülre szekretálódnak, nem szükséges, hogy a tumorban lévő
HU 224 422 Β1 vagy a hepatitis által fertőzött minden sejt transzdukálva legyen az interferongénnel. Azok a sejtek, amelyek nem vették fel a gént, a szomszédos sejt hatása alá kerülnek (úgynevezett ,,bystander”-hatás), amelyek rendelkeznek a génnel, és szekretálják az interferonfehérjét. Ez egy jelentős felfedezés, és valószínűleg drámai hatással van a kezelési rendekre, mivel nem szükséges, hogy a tumortömegben vagy szervben lévő minden sejt tartalmazza az expressziós vektort.
Végül megemlítve kimutatták, hogy az interferon parenterális beadása antiinterferon antitestek termelődéséhez vezet. Lehet, hogy ezen potenciális semlegesítő antitestválasz mértéke csökkenthető az interferongén jól elkülönült, lokális régióba való bevitelével. A lokális expresszió mellett az expresszált interferont endogén, humán sejtek termelik, és ennélfogva struktúrájában és glikoziláltságában természetesebb, és valószínűleg kevésbé immunogén, mint a baktériumokban, élesztőben vagy kínai hörcsög petefészkéből származó sejtekben termeltetett interferonfehérje, melyet azután tisztítanak és parenterálisan injektálnak.
Ezek és a találmány szerinti megoldás más vonatkozásai, valamint különböző előnyei és hasznai nyilvánvalóbbak lesznek a találmány előnyös megvalósítási módjának részletes leírása és a csatolt ábrák alapján.
Az ábrák rövid magyarázata:
1. ábra. (A) Nem fertőzött MDA-MB-468-sejteket (—o—) vagy 0,01% (-Δ-), 0,03% (-El·), 0,1% (-V-) vagy 0,3% (-©-)
H5.110h/F/Vp-val fertőzött sejteket injektáltunk szubkután meztelen egerek horpaszába, és a tumor átlagos méretét ábrázoltuk a tumorsejt-implantáció után eltelt idő függvényében. (B) Kaplan-Meier-féle ábrázolás, amely az egerek százalékos túlélését mutatja 109 napos megfigyelési időtartam során. Nem fertőzött sejtek (-o-) vagy 0,01% (-Δ-), 0,03% (-Cl·), 0,1% (-V-) vagy 0,3% (-©-) H5.110ö/FA/p-val fertőzött sejtek.
2. ábra. (A) Ex vivő béta-interferon-génterápia (1)
KM12L4A-sejtekben; (2) Huh7-sejtekben és (3) ME180-sejtekben. Az átlagos tumorméretet ábrázoltuk a tumorsejt-implantáció után eltelt idő függvényében. Az egerekbe nem fertőzött sejteket (——), vagy 1 % (-·-) vagy 10% (-a.-) H5.110b/FNp-val fertőzött sejteket implantáltunk. Azokban a csoportokban, amelyekben néhány egeret elpusztítottunk, ezt követően a tumorméret átlagát úgy számítottuk, hogy az elpusztított állatokra a továbbiakban az utolsó mért értékeket vettük figyelembe. A görbe megszakadása a csoportban lévő valamennyi állat pusztulására vagy elpusztítására utal. (B) Az egerek százalékos túlélése a 70 napos megfigyelési időtartam során. Az 1., 2. és 3. panel adatai azokból az egerekből származnak, amelyekbe KM12L4A-sejteket, Huh7-sejteket és ME180-sejteket implantáltunk, sorrendben. A szimbólumok nem fertőzött sejtekkel (——), vagy 1 % (-·-) vagy 10% (-a-) H5.110h/FA/3-val fertőzött sejtekkel implantált egerekre utalnak.
3. ábra. Kialakult MDA-MB-468-tumorok közvetlen in vivő kezelése. A tumorokat 3*109 pfu (-©-), 1*109 pfu (-□-), 3*10® pfu (—o—), 1*10® pfu (—Δ—), 3*107 pfu (—V—) H5.110ö/F/Vp-val injektáltuk, sorrendben, vagy PBS-sel (-B-), vagy 3*1CP pfu (-<>-), 1x109 pfu (-A-), 3*10® pfu (-x-), 1*10® pfu (->-) H5.110/acZ-vel, sorrendben. A tumorméreteket az injekciós kezelések utáni 14 napos időtartamban mértük.
A találmány szerinti megoldás részben ex vivő génterápiás eljárás kifejlesztésére alapul, amelyben olyan sejteket alkalmazunk, amelyek (1) könnyen eltávolíthatók a páciensből, (2) in vitro módosíthatók genetikai anyag bevitelével; (3) kényelmesen beültethetők a recipensbe; (4) nem trombogének; és (5) nagy számban beültethetők a recipiensbe. A találmány szerinti in vivő génterápiás eljárásban olyan sejteket alkalmazunk, amelyek (1) jelen vannak a recipiensben, és (2) in situ módosíthatók izolált genetikai anyag expresszálása céljából. A genetikailag módosított sejt szabályozóelemeket tartalmaz az expresszálandó genetikai anyagmennyiség szabályozására.
A genetikailag módosított sejtek túlélnek, és tovább termelik in situ az expresszált anyagot addig, amíg szükség van a jótékony (azaz terápiás) hatással rendelkező expresszált anyagra anélkül, hogy megzavarná a szövet normálfunkcióját, amelyben a sejt elhelyezkedik.
Az expresszált anyag előnyösen szekretált fehérje (a lentebb definiáltak szerint). A szekretált fehérje legelőnyösebben interferon. Bár az interferonok valóban a legelőnyösebb terápiás ágensek, egy általános elvet találtunk szekretált fehérjéket alkalmazó génterápiára. Azt találtuk, hogy mivel a szekretált fehérjék, például interferonok kiszabadulnak a sejtekből, amelyekben expresszálódtak, nem szükséges, hogy a tumortömegben vagy például hepatitisszel fertőzött májban lévő minden sejt transzdukálva legyen a „szekretált fehérjét” kódoló génnel. Azok a sejtek, amelyek nem vették fel a gént, a szomszédos sejtek hatása alá kerülnek, amelyek tartalmazzák a gént és szekretálják a fehérjét (azaz úgynevezett ,,bystander”-hatás). Bár génterápiát interferonokat expresszióra kódoló, izolált polinukleotidokra írunk le, potenciálisan bármelyik szekretált fehérjére (a lentebb definiáltak szerint) alkalmazhatók a találmány szerinti eljárások és készítmények.
A leírásban található valamennyi hivatkozás a kitanítás részét képezi.
/. Definíciók „Génterápia” olyan eljárás, amelyben egy beteg fenotípust kijavítunk genetikai információ bevitelével a betegség által megtámadott szervezetbe.
Az „ex vivő génterápia egy olyan eljárás, amelyben sejteket eltávolítunk egy alanyból, és azokat in vitro tenyésztjük. Polinukleotidot, például funkcionális gént beviszünk a sejtekbe in vitro, a módosított sejteket tenyé4
HU 224 422 Β1 szetben expandáljuk, és azután visszaültetjük az alanyba.
Az „in vivő génterápia” egy olyan eljárás, amelyben a célsejteket nem távolítjuk el az alanyból. Ehelyett a transzferálandó polinukleotidot (például interferont expresszióra kódoló gént) in situ bevisszük a recipiensszervezet sejtjeibe, amelyek a recipiensben vannak. Az in vivő génterápiát számos állatmodellen vizsgálták, és a közelmúltban megjelent közleményekben leírták szervekbe és szövetekbe irányuló, in situ közvetlen géntranszfer megvalósíthatóságát.
„Génterápiával megközelíthető állapot” kifejezésen olyan körülményeket értünk, mint például genetikai megbetegedések (azaz olyan beteg állapot, amely egy vagy több gén defektusának tulajdonítható), szerzett patológiák (azaz olyan patológiai állapot, amely nem tulajdonítható veleszületett hatásnak), rákos megbetegedések és profilaktikus folyamatok (azaz egy betegség vagy egy nem kívánt orvosi állapot megelőzése).
„Szerzett patológia” olyan betegségre vagy szindrómára utal, amely abnormális fiziológiai, biokémiai, celluláris, strukturális vagy molekuláris biológiai állapotként nyilvánul meg.
A „polinukleotid” nukleinsavmonomer-egységekből álló polimer, amelyben a monomeregységek lehetnek ribonukleinsavak (RNS), dezoxiribonukleinsavak (DNS) vagy mindkettő kombinációi. A négy DNS-bázis: adenin (A), guanin (G), citozin (C) és timin (T). A négy RNS-bázis: A, G, C és uracil (U).
Az „izolált” kifejezés, ha interferont kódoló gének polinukleotidszekvenciájára alkalmazzuk, olyan RNSvagy DNS-polinukleotidot, genomiális polinukleotidszakaszt, cDNS-t vagy szintetikus polinukleotidot jelent, amely eredete vagy manipuláció következtében: (i) nem asszociált egyik polinukleotiddal sem, amelyekkel természetes körülmények között asszociált (például egy gazdasejtben, egy expressziós vektor részeként van jelen); vagy (ii) olyan nukleinsavhoz vagy más kémiai csoporthoz van kapcsolva, amely különbözik attól, amelyhez természetes körülmények között kapcsolódik; vagy (iii) természetes körülmények között nem fordul elő. Az „izolált” kifejezés továbbá olyan polinukleotidszekvenciát jelent, amely: (i) in vitro lett amplifikálva, például polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazásával; (ii) kémiailag lett szintetizálva; (iii) rekombinánsan lett termeltetve klónozással; vagy (iv) tisztítva van, például hasítással és gélen való elválasztással.
Tehát egy „izolált” interferonpolinukleotid lehet például természetes körülmények között elő nem forduló nukleinsav, amelyet át lehet írni antiszensz RNS-sé, valamint olyan interferonfehérjét kódoló gén, amely nem expresszálódik, vagy biológiailag nem szignifikáns mennyiségben expresszálódik természetes körülmények között előforduló sejtben. Szemléltetés céljából megemlítjük, hogy humán béta-interferon-1a-t kódoló, szintetikus vagy természetes gén „izoláltnak” tekinthető humán agysejtek vonatkozásában, mivel ez utóbbi sejtek természetes körülmények között nem expresszálnak béta-interferon-1 a-t. „Izolált polinukleotid” másik példája az az eset, amelyben interferongénnek csak egy részét visszük be rekombináns gént előállítva, például endogén interferont kódoló szekvenciát kombinálunk indukálható promoterrel, homológ rekombináción keresztül.
A „gén” egy olyan DNS-szekvencia (azaz nukleotidok lineáris elrendeződése, egymáshoz 3-5' pentóz-foszfodiészter-kötésekkel kapcsolódva), amely mRNS-én keresztül specifikus fehérje aminosavszekvenciáját kódolja.
A „transzkripció” mRNS génből való keletkezésének folyamata.
A „transzláció” egy fehérje mRNS-ből való keletkezésének folyamata.
Az „expresszié” DNS-szekvencián vagy génen végbemenő folyamat fehérje termelődése céljából, transzkripció és transzláció kombinációjával.
A „növekedés gátlása” kifejezés jelentése a leírásban mind a célsejt (azaz tumor) növekedésének gátlása, mind a transzformált fenotípus (azaz például morfológiában bekövetkezett változásként mérve) gátlása.
Az „aminosav” peptid, polipeptid vagy fehérje monomeregysége. Húsz L-izomer aminosav van. A kifejezésen értünk aminosavanalógokat is, és a fehérjeaminosavak D-izomerjeit és ezek analógjait.
A fehérje bármilyen olyan polimer, amely lényegében a 20 fehérjeaminosav bármelyikét tartalmazza, tekintet nélkül a méretére. Bár a „polipeptid kifejezést gyakran alkalmazzuk viszonylag nagy polipeptidekre, és a „peptid” kifejezést gyakran alkalmazzuk kis polipeptidekre, ezen kifejezések használata a szakirodalomban átfed és változó. A „fehérje” kifejezést a leírásban peptidek, fehérjék és polipeptidek megjelölésére használjuk, hacsak másképpen nem jelöljük.
A „szekretált fehérje” olyan fehérje, amely egy sejt belsejéből a sejten kívülre szállítódik; szekretált fehérjék közé tartozik nagyszámú növekedési faktor és immunmodulátor fehérje, például különböző interferonok (α, β, γ), interleukinok, például IL—1, -2, -4, -8 és-12, valamint növekedési faktorok, például GM-CSF, G-CSF.
A „genetikai fúzió” egy vagy több fehérje kolineáris, kovalens kapcsolását jelenti egyedi peptidvázaikon keresztül, ezen fehérjéket kódoló, polinukleotidmolekulák genetikai expressziója útján.
A „mutáns” bármilyen változás egy szervezet genetikai anyagának minőségében és szerkezetében, különösen bármilyen változás (azaz deléció, szubsztitúció, addíció vagy más változtatás) vad típusú interferongénben, vagy bármilyen változás vad típusú interferonfehérjében.
A „vad típus” egy interferongén vagy interferonfehérje természetesen előforduló polinukleotid- vagy aminosavszekvenciáját jelenti, ahogyan az in vivő létezik.
A „standard hibridizációs körülmények” olyan sótartalmú és hőmérsékleti körülmények, amelyek lényegében ekvivalensek 0,5*SSC és 5*SSC közötti sótartalommal és 65 °C hőmérséklettel, hibridizációban és mosásban egyaránt. A leírásban alkalmazott „standard hibridizációs körülmények” kifejezés egy műveleti meghatározás, és egy hibridizációs tartományt ölel fel. Na5
HU 224 422 Β1 gyobb mértékben sztringens körülmények lehetnek például plakkszűrő pufferrel [0,2% poli(vinil-pirrolidon); 0,2% Ficoll 400; 0,2% marhaszérum-albumin; 50 mM Tris-HCI, pH 7,5; 1 M NaCI; 0,1% nátrium-pirofoszfát; 1% SDS]; 10% dextrán-szulfáttal és 100 pg/ml denaturált, ultrahanggal kezelt, lazacspermából származó DNS-sel, 65 °C-on, 12-20 óra hosszáig végzett hibridizációban, és 75 mM NaCI/7,5 mM nátrium-citrát (0,5*SSC)/1% SDS jelenlétében, 65 °C-on végzett mosás közben. Kisebb mértékben sztringens körülmények lehetnek például plakkszűrő pufferrel, 10% dextrán-szulfáttal és 110 pg/ml denaturált, ultrahanggal kezelt, lazacspermából származó DNS-sel, 55 °C-on, 12-20 óra hosszáig végzett hibridizációban, és 300 mM NaCI/30 mM nátrium-citrát (2,0*SSC)/1% SDS jelenlétében, 55 °C-on végzett mosás közben.
Az „expressziós szabályozószekvencia” olyan nukleotidszekvencia, amely gének expresszióját vezérli és szabályozza, ha működőképesen van kapcsolva az adott génekhez.
Egy polinukleotidszekvencia (DNS, RNS) „működőképesen kapcsolt egy expressziós szabályozószekvenciához, ha az expressziós szabályozószekvencia a polinukleotidszekvencia transzkripcióját és transzlációját vezérli és szabályozza. A „működőképesen kapcsolt” kifejezés az expresszálandó polinukleotidszekvencia előtt megfelelő startszignál (például ATG) meglétét és a helyes leolvasási fázis megtartását jelenti, amely lehetővé teszi a polinukleotidszekvencia expresszióját az expressziós szabályozószekvencia vezérlete alatt és az izolált polinukleotidszekvencia által kódolt, kívánt interferon termelődését.
Az „expressziós vektor” olyan polinukleotid, leggyakrabban DNS-plazmid (de amely lehet vírus is), amely lehetővé teszi legalább egy gén expresszióját, ha az expressziós vektort gazdasejtbe visszük. A vektor képes lehet vagy nem lehet képes replikálódni a sejtben.
A „tumor”-sejtek bármilyen nemkívánatos proliferációja. Ilyen növekedés lehet malignus és nem malignus, szilárd vagy folyékony tumorok, karcinómák, myelomák, szarkómák, leukémiák, limfómák és más rákos, neopláziás vagy tumorgén betegségek.
A „genetikailag módosított sejt” („sejtexpressziós rendszerinek is hívjuk) tartalmaz egy sejtet és az interferonfehérje expressziójára szolgáló expressziós vektort. Ex vivő célokra a genetikailag módosított sejtek alkalmasak emlősrecipiensnek való beadásra, ahol helyettesítik vagy együtt léteznek a recipiens endogén sejtjeivel. In vivő célokra a sejteket a recipiensen belül hozzuk létre.
A találmány tárgyát képezik különféle eljárások a fentebb leírt, genetikailag módosított sejtek előállítására és alkalmazására is. A találmány tárgyát különösen olyan eljárás képezi, amely emlősrecipiens genetikailag módosított sejtjének (sejtjeinek) ex vivő előállítására és a genetikailag módosított sejtek emlősrecipiensnek való beadására szolgál. A találmány előnyös, ex vivő génterápiára szolgáló megvalósítási módja szerint a sejtek autológ sejtek, azaz olyan sejtek, amelyeket eltávolítottunk az emlősrecipiensből. Az „eltávolítás kifejezés a leírásban olyan sejtre vagy több sejtre utal, amelyeket eltávolítottunk természetes előfordulási, in vivő helyükről. Szakember által jól ismertek eljárások sejtek eltávolítására egy páciensből, valamint eljárások izolált sejtek fenntartására tenyészetben [Stylianou, E. et al., Kidney Inti. 37, 1563-1570 (1992); Hjelle, J. H. et al., Peritoneal Dialysis Int. 9, 341-347 (1989); Heldin, P„ Biochem. J. 283, 165-170 (1992); Di Paolo, N. et al., Int. J. Art. Org. 12, 485-501 (1989); Di Paolo, N. et al., Nephron 57, 323-331 (1991)]. A találmány részletes leírásában említett valamennyi szabadalmi leírást, szabadalmi bejelentést és közleményt, fentebb és lentebb egyaránt, a kitanítás részének tekintünk.
II. Izolált interferonpolinukleotidok
Az „interferon” („IFN”-nek is hívják) kisméretű, fajspecifikus, egyláncú polipeptid, amelyet emlőssejtek termelnek különféle indukálószerekre, például vírusokra, polipeptidekre, mitogénekre és hasonlókra adott válaszként. Az interferonok legelőnyösebben rekombináns formában vannak, és ismeretesek fehérjék, beleértve különböző interferonok termelésére szolgáló rekombináns DNS-módszerek, amelyekkel semmilyen módon nem kívánjuk korlátozni a találmány szerinti megoldást. Lásd például USP 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al.) és 4,470,461 (Kaufman) számú szabadalmi iratokat. Előállították az alfa-, béta-, gamma-interferon és a konszenzusinterferon rekombináns formáit. Interferonok expresszálhatók olyan polinukleotidszekvenciákat tartalmazó sejtekből, amelyek variánsokat kódolnak, például ciszteinre kimerített mutánsokat (például béta-interferonra) és metioninra kimerített mutánsokat. Más módosításokat a gazdasejt poszttranszlációs processzálási rendszere útján lehet végezni. Egy adott interferon pontos kémiai szerkezete ezért számos faktortól függ, ezekre nem kívánjuk korlátozni a találmány igényelt oltalmi körét. Valamennyi, leírt formula szerinti interferonfehérje megőrzi biológiai aktivitását, ha megfelelő környezetbe helyezzük azokat.
A találmány szerinti eljárásokban előnyösen alkalmazható polinukleotidon különböző gerincesek vad típusú interferon-génszekvenciáiból származnak, előnyösen emlősökből, és szakember által jól ismert módszerek alkalmazásával állítjuk elő azokat. Lásd például; USP 5,641,656 (megadva 1997. jún. 24., madárból származó, I. típusú interferonprofehérjét kódoló DNS, és érett, madárból származó, I. típusú interferon); 5,605,688 (1997. febr. 25., kutyából és lóból származó, rekombináns, I. típusú interferonok); 5,554,513 (1996. szept. 10., humán béta-interferon-2A-t kódoló DNS-szekvencia); 5,541,312 (1996. júl. 30., humán fibroblasztból származó, béta-2-interferon-polipeptidet kódoló DNS-szekvencia); 5,231,176 (1993. júl. 27., humán leukocita interferont kódoló DNS-molekula); 5,071,761 (1991. dec. 10., humán limfoblasztoid LylFN-alfa-2 és LylFN-alfa-3 interferonok alszekvenciáit kódoló DNS-szekvencia); 4,970,161 (1990. nov. 13., humán gamma-interferont kódoló DNS-szekvencia); 4,738,931 (1988. ápr. 19., humán béta-interferongént tartalmazó DNS); 4,695,543 (1987. szept. 22., hu6
HU 224 422 Β1 mán alfa-interferon Gx-1-gén); és 4,456,748 (1984. jún. 26., különböző, természetesen előforduló leukocitainterferonok alszekvenciáit kódoló DNS) számú szabadalmi iratok.
Az interferon-géncsalád mutáns tagjait is alkalmazhatjuk a találmány szerinti megoldásban. Vad típusú polinukleotidszekvenciában lévő mutációkat szakember által ismert, irányított mutagenezis szokásos módszereivel hozunk létre. A „mutáns” kifejezés jelentése felöleli a genetikai fúzióval létrejött szekvenciákat, így az alábbi közlemények szerinti interferonszekvenciákat, melyeket a kitanítás részének tekintünk, „mutáns” szekvenciáknak tekinthetünk:
USP 5,273,889 (1993. dec. 28., gamma-interferongént immunogén leukotoxint kódoló szekvenciához kapcsolva tartalmazó DNS-konstrukció); 4,959,314 (1990. szept. 25., biológiailag aktív, natív fehérje szintetikus muteinjét kódoló DNS-szekvenciával rendelkező gén); 4,929,554 (1990. máj. 29., des-CYS-TYR-CYS, rekombináns, humán immuninterferont kódoló DNS); 4,914,033 (1990. ápr. 3., béta-interferont tartalmazó, módosított béta-interferont kódoló DNS-molekula); és 4,569,908 (1986. febr. 11., több osztályhoz tartozó, hibrid interferonpolipeptidet kódoló nukleotidszekvenciával rendelkező DNS) számú szabadalmi iratok.
Továbbá ezekben a szabadalmi leírásokban ismertetett, izolált polinukleotidokat meg lehet változtatni funkcionálisan ekvivalens polinukleotidok előállítása céljából. Egy polinukleotid akkor „funkcionálisan ekvivalens” a fentebb leírt szekvenciákhoz hasonlítva, ha az alábbi feltételek közül legalább egyet kielégít:
(a) a „funkcionálisan ekvivalens olyan polinukleotid, amely képes hibridizálódni standard hibridizációs körülmények között a fentebb leírt szekvenciák valamelyikével, és/vagy a fentebb leírt bármelyik szekvencia degenerált változata. Legelőnyösebben olyan mutáns interferont kódol, amely a vad típusú interferon terápiás aktivitásával rendelkezik;
(b) a „funkcionálisan ekvivalens” olyan polinukleotid, amely expresszióra olyan aminosavszekvenciát kódol, mint amelyet a fentebb leírt interferonszekvenciák polinukleotidjainak valamelyike kódol.
Összegezve, az „interferon” kifejezésen értjük például a fentebb felsorolt ágenseket, valamint azok funkcionális ekvivalenseit. A „funkcionális ekvivalens” kifejezés tehát olyan interferonfehérjére vagy interferonfehérjét kódoló polinukleotidra utal, amely ugyanolyan vagy javított jótékony hatást képes kifejteni az emlősrecipiensre, mint az interferon, amelynek vélhetően funkcionális ekvivalense. Szakember számára nyilvánvaló, hogy funkcionálisan ekvivalens fehérjét elő lehet állítani rekombináns technikákkal, például „funkcionálisan ekvivalens DNS” expresszálásával. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik olyan interferonok, amelyeket természetesen előforduló DNS-ek kódolnak, valamint nem természetesen előforduló DNS-ek kódolnak, amelyek ugyanazt a fehérjét kódolják, mint a természetesen előforduló DNS. A kódoló nukleotidszekvenciák degeneráltsága következtében más polinukloetidokat is lehet alkalmazni interferonok kódolására. Ezek lehetnek például a fentebb leírt, olyan teljes vagy részleges szekvenciák, amelyek különböző kodonok szubsztitúciójával meg vannak változtatva, és ugyanazokat az aminosavakat kódolják a szekvenciában, így „csendes” változásokat hoznak létre. Ilyen megváltoztatott szekvenciákat ezen szekvenciák ekvivalenseinek tekintjük. Például a Phe-t (F) két kodon kódolja, TTC vagy TTT, a Tyr-t (Y) TAC vagy TAT és a His-t (H) CAC vagy CAT. Másrészt, a Trp-t (W) egyetlen kodon kódolja, TGG. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy egy konkrét interferont kódoló, adott DNS-szekvenciára sok degenerált DNS-szekvencia létezik, amely ugyanazt kódolja. Ezeket a degenerált DNS-szekvenciákat is az igényelt oltalmi körbe tartozónak tekintjük.
Konszenzusinterferont is értünk ezen a definíción. A leírásban a „konszenzusinterferon” kifejezésen nem természetes körülmények között előforduló polipeptidet értünk, amely túlnyomórészt olyan aminosavakat tartalmaz, amelyek valamennyi természetesen előforduló humán interferon-altípus szekvenciájában általánosan elterjedtek, és egy vagy több helyzetében (ahol nincs az összes altípusban általánosan előforduló aminosav) olyan aminosavat tartalmaz, amely az esetek többségében ebben a helyzetben fordul elő, és soha nem tartalmaz olyan aminosavat, amely nem fordul elő ebben a helyzetben legalább egy, természetesen előforduló altípusban. Konszenzusinterferon-szekvenciákhoz tartoznak a fenti hivatkozásokban szereplő bármelyik interferon megfelelő konszenzusszekvenciája, feltéve, ha rendelkezik altípus-szekvenciákkal. Konszenzusinterferonokat közölnek például az USP 4,695,623 és 4,897,471 számú (Amgen) szabadalmi iratokban. Konszenzusinterferont kódoló DNS-szekvenciákat ezen szabadalmi leírások alapján vagy más standard eljárások szerint lehet szintetizálni. Konszenzusinterferon-polipeptidek előnyösen mesterségesen előállított, olyan DNS-szekvenciák expressziós termékei, amelyek a leírás szerint gazdaszervezetekbe vannak transzformálva vagy transzfektálva. Tehát konszenzusinterferont előnyösen rekombinánsan termeltetünk. Ilyen anyagokat szakember által jól ismert eljárásokkal lehet tisztítani.
A fentebb tárgyalt interferonok és génhelyettesítést alkalmazó terápiával megközelíthető állapotok csupán szemléltetés célját szolgálják, amellyel nem kívánjuk a találmány által igényelt oltalmi kört korlátozni. Ismert állapotok kezelésére szolgáló alkalmas interferon kiválasztását szakember által vélhetően ismert ténynek vesszük, amely felesleges kísérletezést nem igényel.
III. Eljárások szekretált fehérjét kódoló polinukleotidszekvenciák bevitelére sejtekbe A „transzformáció” vagy „transzformálás” kifejezés sejtek bármilyen genetikai módosítását jelenti, amelyen „transzfekciót és „transzdukciót” egyaránt értünk.
A leírásban a „sejtek transzfekciója” kifejezés sejt általi új genetikai anyag megszerzését jelenti, hozzáadott DNS beépítésével. Tehát a transzfekció nukleinsav (például DNS) inszertálását jelenti egy sejtbe, fizi7
HU 224 422 Β1 kai vagy kémiai módszerek alkalmazásával. Szakember számára számos transzfekciós technika ismeretes, például kalcium-foszfátot alkalmazó DNS-koprecipitáció [„Methods in Molecular Biology” 7, „Gene Transfer and Expression Protocols”, szerk. E. J. Murray, Humana Press (1991)]; DEAE-dextrán [mint fent]; elektroporáció [mint fent]; kationos liposzómamediált transzfekció [mint fent]; és volfrámrészecskével elősegített, mikrorészecskebombázás [Johnston, S. A., Natúré 346, 776-777 (1990)]; és stroncium-foszfátot alkalmazó DNS-koprecipitáció [Brash, D. E. et al., Molec. Cell. Bioi. 7, 2031-2034 (1987)]. Az egyes módszerek a szakirodalomban jól dokumentáltak.
Viszont a „sejtek transzdukciója” kifejezésen olyan eljárást értünk, amelyben nukleinsavat DNS- vagy RNS-vírus alkalmazásával viszünk be egy sejtbe. A vírusban lévő, egy vagy több interferonfehérjét kódoló, egy vagy több izolált polinukleotidszekvenciát beépíthetünk a transzdukált sejtbe. Más módszer szerint egy sejtet transzdukálunk egy vírussal, de az izolált polinukleotidszekvencia nem épül be a sejt kromoszómájába, hanem extrakromoszomálisan képes interferon expresszálódni a sejtben.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a sejteket ex vivő transzformáljuk (azaz genetikailag módosítjuk). A sejteket emlősből (előnyösen emberből) izoláljuk, és izolált polinukleotidot tartalmazó vektorral transzformáljuk (azaz transzdukáljuk vagy transzfektáljuk in vitro), például egy vagy több expressziós szabályozószekvenciával működőképesen kapcsolt, rekombináns génnel, rekombináns, szekretált fehérje (például interferon) expressziójára. A sejteket azután beadjuk az emlősrecipiensnek a fehérje in situ célba juttatása céljából. Az emlősrecipiens előnyösen ember, és a módosítandó sejtek autológ sejtek, azaz a sejteket az emlősrecipiensből izoláltuk. Sejtek izolálását és in vitro tenyésztését leírták a szakirodalomban.
A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint a sejteket transzformáljuk, vagy más módon genetikailag in vivő módosítjuk. Az emlősrecipiensből (előnyösen emberből) származó sejteket izolált polinukleotidot tartalmazó vektorral in vivő transzformáljuk, például egy vagy több expressziós szabályozószekvenciával működőképesen kapcsolt, rekombináns génnel, rekombináns, szekretált fehérje (például rekombináns interferon) expressziójára.
A szekretált fehérjét kódoló izolált polinukleotidokat (például egy vagy több, terápiás hatású interferonfehérjét kódoló cDNS-t) beviszünk a sejtbe ex vivő vagy in vivő genetikai transzfer módszerekkel, például transzfekcióval vagy transzdukcióval, genetikailag módosított sejt előállítása céljából. Különböző expressziós vektorok (azaz izolált polinukleotid célsejtbe való bevitelét elősegítő hordozók) ismertek szakember számára.
A bevitt genetikai anyag tipikusan izolált polinukleotid, például interferongén (rendszerint interferont kódoló exonokat tartalmazó cDNS formájában) egy promoterrel együtt, amely az új gén transzkripcióját szabályozza. A promoter jellemzően transzkripció iniciálásához szükséges, specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz. Adott esetben a genetikai anyag tartalmazhat intronszekvenciákat, amelyeket az RNS-splicing eltávolít az érett transzkriptumból. Az expresszálandó gén 3’-végénél jelen lehet poliadenilálási szignál. A bevitt genetikai anyag tartalmazhat megfelelő szekréciós „szignál'-szekvenciát a terápiás hatású génterméknek (azaz interferonnak) a sejtből az extracelluláris térbe való szekretálása céljából.
Adott esetben az izolált genetikai anyag tartalmazhat továbbá hozzáadott szekvenciákat (azaz enhanszereket), amelyek a kívánt géntranszkripcicós aktivitás eléréséhez szükségesek. Ebből a célból az „enhanszer” egyszerűen bármilyen nem transzlálódó DNS-szekvencia, amely összefüggően együtt működik a kódolószekvenciával (cisz-ben) a promoter által diktált transzkripciós alapszint megváltoztatása céljából.
Az izolált genetikai anyagot a sejt genomjába előnyösen úgy visszük be, hogy a promotertől közvetlenül szintézisirányban legyen, így a promoter és a kódolószekvencia működőképesen lesz kapcsolva, így lehetővé téve a kódolószekvencia transzkripcióját. Előnyös virális expressziós vektor exogén promoterelemet tartalmaz az inszertált interferongén transzkripciójának szabályozása céljából. Ilyen exogén promoterek lehetnek konstitutív és indukálható promoterek egyaránt.
Természetesen előforduló, konstitutív promoterek olyan fehérjék expresszióját szabályozzák, amelyek esszenciális sejtfunkciókat szabályoznak. Ennek eredményeként, konstitutív promoter szabályozása alatt lévő gén a sejtnövekedés bármilyen fázisában expresszálódik. Konstitutív promoterek például az alábbi gének promoterei, amelyek bizonyos konstitutív vagy „housekeeping” funkciókat kódolnak: hipoxantin-foszforibozil-transzferáz (HPRT), dihidrofolát-reduktáz (DHFR) [Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4626—4630 (1991)], adenozin-dezamináz, foszfoglicerin-kináz (PGK), piruvát-kináz, foszfoglicerin-mutáz, β-aktin-promoter [Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10 006-10 010 (1989)] és más, szakember által ismert konstitutív promoter.
Továbbá sok víruspromoter működik konstitutíven eukarióta sejtekben. Ilyenek többek között: SV40 korai és késői promoterek [lásd Bernoist és Chambon, Natúré 290, 304 (1981)]; Moloney leukémiavírusból és más retrovírusból származó hosszú, terminális ismétlődő szekvencia [lásd Weiss et al., „RNA Tumor Viruses”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1985)]; herpes simplex vírusból származó timidin-kináz-promoter [lásd Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1441 (1981)]; citomegalovírusból származó azonnali korai (IE1) promoter [lásd Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169, 13 (1989)]; Rous-szarkóma-vírus (RSV) promotere [Yamamoto et al., Cell. 22, 787 (1980)]; adenovírusból származó, fő késői promoter [Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3567 (1985)]. Ennek megfelelően a fentebbi hivatkozások szerinti, bármelyik konstitutív promoter alkalmazható géninszert transzkripciójának szabályozására [lásd még a B) részt is].
HU 224 422 Β1
Ha interferongént specifikus szövetekben juttatunk célba, kívánatos lehet a gén expresszióját a célszövetre szabályozni. Például a szakirodalomban leírnak sok olyan promotert, amely csak bizonyos szövetekben expresszálódik. Például a hepatitis B vírusának májspecifikus promotere [Sanding et al., Gene Therapy 3, 1002-1009 (1996)] és albumingén [Pinkert et al., Genes and Development 1, 268-276 (1987)]; más májspecifikus promoter leírása céljából lásd még Guo és munkatársai közleményét [Gene Therapy 3, 802-810 (1996)]. Továbbá a szakirodalomban leírnak sok olyan promotert, amelyek csak specifikus tumorokban expresszálódnak. Például PSA-promoter (prosztatakarcinómában), karcinoembriogén antigén promotere (vastagbél- és tüdőkarcinómában), β-kazein-promoter (emlőkarcinómában), tirozináz-promoter (melanomában), kalcineurin-Aa-promoter (gliomában, neuroblasztómában), c-cisz-promoter (oszteoszarkómában) és a-fetoprotein-promoter (hepatomában).
Indukálható promoterek vezérlete alatt lévő gének csak, vagy nagymértékben indukáló ágensek jelenlétében expresszálódnak (például metallotioneinpromoter szabályozása alatt az expresszió mértéke nagymértékben megnövekszik bizonyos fémionok jelenlétében). Lásd még az egéremlőtumor-vírus hosszú terminális ismétlődő szekvenciájában lévő (MMTV LTR), glükokortikoiddal indukálható promotert [Klessig et al., Mól. Cell. Bioi. 4, 1354 (1984)]. Az indukálható promoterek reszponzív elemeket (RE-ket) tartalmaznak, amelyek transzkripciót stimulálnak, ha indukálófaktoraik kötődnek. Például vannak RE-k szérumfaktorokra, szteroidhormonokra, retinolsavra és ciklikus AMP-re. Adott RE-t tartalmazó promotereket lehet választani indukálható válasz elérése céljából, és néhány esetben az RE maga lehet kapcsolva egy eltérő promoterhez, ezáltal indukálhatóságot biztosít a rekombináns gén számára.
Tehát megfelelő promoter kiválasztásával (konstitutív az indukálhatóval szemben; erős a gyengével szemben) lehetséges magát az interferonexpressziót, valamint egyidejűleg a mértékét is szabályozni a genetikailag módosított sejtben. Ha az interferont kódoló gén indukálható promoter szabályozása alatt van, akkor az interferon in situ célba juttatását úgy lehet fokozni, hogy a genetikailag módosított sejtet in situ olyan körülményeknek tesszük ki, amely lehetővé teszi az interferon transzkripcióját, például a gén transzkripcióját vezérlő, indukálható promoterek specifikus indukálószereinek injektálásával. Például metallotioneinpromoter vezérlete alatt álló interferongén által kódolt interferonfehérje genetikailag módosított sejtekkel való, in situ expressziója úgy fokozható, hogy a genetikailag módosított sejteket in situ érintkeztetjük a megfelelő (azaz indukáló) fémionokat tartalmazó oldattal.
A közelmúltban igen bonyolult rendszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik génexpresszió precíz szabályozását exogén módon beadott kis molekulákkal. Ilyenek például az FK506/rapamicin rendszer [Rivera et al., Natúré Medicine 2 (9), 1028-1032 (1996)]; a tetraciklinrendszer [Gossen et al., Science 268, 1766-1768 (1995)]; az ecdysone-rendszer [No et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351 (1996)] és a progeszteronrendszer [Wang et al., Natúré Biotechnology 15, 239-243 (1997)].
Ennek megfelelően az in situ célba juttatott interferon mennyiségét olyan faktorok befolyásolásával lehet szabályozni, mint: (1) az inszertált gén transzkripciónak vezérlésére alkalmazott promoter természete, (azaz, hogy a promoter vajon konstitutív vagy indukálható, erős vagy gyenge vagy szövetspecifikus); (2) az sejtbe inszertált, exogén gén kópiaszáma; (3) a páciensbe bevitt (például implantált) transzdukált/transzfektált sejtek száma; (4) az implantátum (például graft vagy kapszulázott expressziós rendszer) mérete az ex vivő eljárásokban; (5) az implantátumok száma az ex vivő eljárásokban; (6) az in vivő beadással transzdukált/transzfektált sejtek száma; (7) az időtartam, amit a transzdukált/transzfektált sejtek vagy implantátumok eltöltenek mind az ex vivő, mind in vivő eljárásokban; és (8) az interferon termelődési sebessége a genetikailag módosított sejtekben.
Egy adott interferon terápiásán hatásos dózisának célba juttatását befolyásoló, ezen faktorok szelekciója és optimalizálása szakember számára vélhetően felesleges kísérletezés nélkül nyilvánvaló, figyelembe véve a fentebb ismertetett faktorokat és a páciens klinikai kórképét.
Mivel génterápiás módszerünkkel expresszált fehérje szekretált fehérje, még azok a környező sejtek is a hatás alá kerülnek, amelyek nem tartalmazzák a génterápiás vektort (lásd a példákat). Ennek eredményeképpen a találmány szerinti eljárásban tipikusan nem szükséges szelektálható gént alkalmazni. Mindazonáltal legalább egy promoteren és legalább egy, interferont kódoló, izolált polinukleotidon kívül az expressziós vektor adott esetben tartalmazhat szelekciós gént, például neomicinrezisztencia-gént azon sejtek szelekciójának elősegítése céljából, amelyeket az expressziós vektorral transzfektáltunk vagy transzdukáltunk. Más módszer szerint a sejteket kettő vagy több expressziós vektorral transzfektáljuk, legalább az egyik vektor interferon(oka)t kódoló gént tartalmaz, és a másik vektor szelekciós gént tartalmaz. Alkalmas promoter, enhanszer, szelekciós gén és/vagy szignálszekvencia (a lentebb leírtak szerint) kiválasztása szakember számára vélhetően felesleges kísérletezés nélkül nyilvánvaló.
IV. Specifikus génterápiás vektorok előállítására szolgáló módszerek
A szakirodalomból ismert, bármilyen módszert alkalmazhatunk polinukleotidszekvenciák inszertálására egy vektorba. Lásd például Sambrook és munkatársai könyvét: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), és Ausubel és munkatársai könyvét: „Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992). A szokásos vektorok megfelelő transzkripciós/transzlációs szabályozószignálokból állnak, adott interferont kódoló polinukleotidszekvenciához működőképesen kapcsolva. Promotereket és enhanszereket is alkalmazhatunk interferonok expressziójának szabályozására (lásd a III. részt).
HU 224 422 Β1
Tumorsejtek génterápiájában alkalmazható, emlősgazdasejtekkel kompatibilis expressziós vektorok például: plazmidok; madárból, rágcsálóból származó és humán retrovírusvektorok; adenovírusvektorok; herpeszvírusból származó vektorok; parvovírusok; és nem replikálódó himlővírusok. Főleg replikációdefektív, rekombináns vírusokat lehet előállítani csomagoló sejtvonalakban, amelyek csak replikációdefektív vírusokat termelnek. Lásd „Current Protocols in Molecular Biology”, 9.10-9.14. részek, szerk. Ausubel et al., Greene Publishing Associates (1989).
Specifikus vírusvektorok géntranszferrendszerekben való alkalmazásra már jól ismertek. Lásd például: Madzak et al., J. Gén. Virol. 73, 1533-36 (1992) (papovavírus SV40); Berkneret al., Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 39-61 (1992) (adenovírus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 25-38 (1992) (tehénhimlővírus); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 97-123 (1992) (adenoasszociált vírus); Margulskee, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 67-93 (1992) (herpes simplex vírus, HSV, és Epstein-Barr-vírus, HBV); Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 1-24 (1992) (retrovírus); Brandyopadhyay et al., Mól. Cell. Bioi. 4, 749-754 (1984) (retrovírus); Miller et al., Natúré 357, 455-450 (1992) (retrovírus); Anderson, Science 256, 808-813 (1992) (retrovírus).
Az előnyös vektorok DNS-vírusok, amelyek lehetnek adenovírusok (előnyösen Ad2-re vagy Ad5-re alapuló vektorok), herpeszvírusok (előnyösen herpes simplex vírusra alapuló vektorok) és parvovírusok (előnyösen „detektív vagy nem autonóm parvovírusra alapuló vektorok, előnyösebben adenoasszociált vírusra alapuló vektorok, legelőnyösebben AAV-2-re alapuló vektorok). Lásd például Ali et al., Gene Therapy 1, 367-384 (1994); USP 4,797,368 és 5,399,346 számú szabadalmi iratok és a lentebb található tárgyalás.
Például interferonszekvencia transzferálására szolgáló, adott vektorrendszer kiválasztása különféle faktoroktól függ. Az egyik fontos faktor a célsejt-populáció természete. Bár a retrovírusvektorokat alaposan tanulmányozták, és számos génterápiás alkalmazásban használták, általában alkalmatlanok olyan sejtek fertőzésére, amelyek nem osztódnak, de hasznosak lehetnek rákterápiában, mivel csak replikálódó sejtekbe integrálódnak és expresszálják génjeiket. Hasznosak ex vivő megközelítésekben, és ebben a vonatkozásban vonzóak a célsejt genomjába való stabil integrációjuk miatt.
Az adenovírusok eukarióta DNS-vírusok, amelyeket terápiás hatású vagy riportertranszgén különböző sejttípusokba való, hatékony célba juttatására lehet módosítani. Az általánosan elterjedt 2. és 5. típusú adenovírusokat (Ad2 és Ad5), amelyek légzőszervi betegséget okoznak emberekben, jelenleg Duchenne típusú izomdisztrófia (DMD) és cisztás fibrózis (CF) génterápiájára fejlesztik. Az Ad2 és az Ad5 egyaránt olyan adenovírus-alosztályba tartozik, amely nem társult humán malignitásokkal. Az adenovírusvektorok különösen nagy mértékű transzgénszállítást képesek biztosítani gyakorlatilag valamennyi sejttípusba, tekintet nélkül a mitotikus állapotra. Nagy titerben (1011 plakk-képző egység/ml) elő lehet állítani rekombináns vírust 293-sejtekben (adenovírustranszformált, komplementáló, humán embrionális vesesejtvonal: ATCC CRL1573), és kriosztátban lehet tárolni azokat sokáig, észrevehető veszteségek nélkül. Ezen rendszer hatékonyságát kimutatták különböző rendellenességek állatmodelljeiben, terápiás transzgén in vivő célba juttatására, amelyben kiegészítenek genetikai kiegyensúlyozatlanságot. Lásd Y. Watanabe, Atherosclerosis 36, 261-268 (1986); K. Tanawa el al., FEBS Letters, 118 (1), 81-84 (1980); J. L. Golasten et al., New Engl. J. Med. 309 (1983), 288-296 (1983); S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92, 883-893 (1993); és S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 93, 1889-1893 (1994). Valóban, cisztás fibrózis transzmembrán szabályozót (CFTR) kódoló cDNS-t tartalmazó, rekombináns, replikációdefektív adenovírust számos humán CF-et kezelő klinikai kísérletben jóváhagytak alkalmazásra. Lásd például J. Wilson, Natúré 365, 691-692 (1993). Rekombináns adenovírusok génterápiára való alkalmazásának biztonságát alátámasztja továbbá élő adenovírusvakcinák humán populációkban való alkalmazása során szerzett rengeteg tapasztalat.
Humán adenovírusok lineáris, körülbelül 36 kb méretű, dupla szálú DNS-genomot tartalmaznak, amelyet 100 térképezési egységre (m. u.) osztottak fel, amelyek hosszúsága egyenként 360 bp. A DNS rövid, fordított, terminális ismétlődő szekvenciákat (ITR) tartalmaz a genom egyes végeinél, amely virális DNS-replikációhoz szükséges. A géntermékek korai (E 1-től E4-ig) és késői (L1-től L5-ig) régiókra szerveződnek az alapján, hogy az expresszió a virális DNS-szintézis iniciálása előtt vagy után történik. Lásd például Horwitz, „Virology”, 2. kiadás, szerk. B.N. Fields, Raven Press Ltd., New York (1990).
Az adenovírusgenom nagymértékben szabályozott programon megy keresztül normál virális életciklusában. Lásd Y. Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4407-4411 (1994). A virionokat a sejtek internalizálják, belépnek az endoszómába, és innen a vírus belép a citoplazmába, és elkezdi elveszteni fehérjeburkát. A virion-DNS a sejtmaghoz vándorol, ahol inkább megtartja extrakromoszomális, lineáris struktúráját, mint hogy integrálódjon a kromoszómába. E1a és E1b, azonnali korai gének a sejtmagban expresszálódnak. Ezek a korai géntermékek szabályozzák az adenovirális transzkripciót, és ezek szükségesek a virális replikációhoz és különféle gazdagének (amelyek előkészítik a sejtet a vírustermeléshez) expressziójához, és a később expresszálódó, korai gének (például E2, E3 és E4), azt közvetően a késői gének (például L1-L5) kaszkádaktiválásának középpontjában vannak.
Az első generációs, rekombináns, génterápiára kifejlesztett, replíkációdeficiens adenovírusokban deletálva van az egész E1a-régió és az E1b-régió egy része. Ezt a replikációdefektív vírust 293-sejtekben növesztik, amely funkcionális, adenovírusból származó, E1-régiót tartalmaz, amely „in transz” biztosít E1-fehérjéket, ezáltal lehetővé teszi az E1-deletált adenovírus
HU 224 422 Β1 replikációját. Az eredményül kapott vírus sokféle sejttípust képes megfertőzni, és képes a bevitt gént expresszálni (feltéve, ha tartalmaz promotert), de nem képes olyan sejtben replikálódni, amely nem tartalmaz E1-régió-DNS-t. A rekombináns adenovírusok előnye, hogy gazdaszervezetük széles körből származhat, képesek fertőzni nyugvó vagy terminálisán differenciálódott sejteket, például neuronokat, és úgy tűnik, hogy nem onkogének. Úgy tűnik, hogy az adenovírusok nem integrálódnak a gazdaszervezet genomjába. Mivel extrakromoszomálisan léteznek, az inszerciós mutagenezis kockázata nagyban lecsökken. Rekombináns adenovírusokat nagyon nagy titerben lehet előállítani, a vírusrészecskék viszonylag stabilak, az expresszió mértéke magas, és széles körből származó sejteket lehet fertőzni.
Az adenoasszociált vírusokat (AAV) is alkalmazzák vektorként szomatikus génterápiára. Az AAV kisméretű, egyszálú (ss) DNS-t tartalmazó vírus, egyszerű genomi szerveződéssel (4,7 kb), amely ideális alannyá teszi a genetikai módosításokhoz. Két nyitott leolvasási fázis egy sorozat rep- és cap-polipeptidet kódol. A rep-polipeptidek (rep78, rep78, rep62 és rep40) a replikációban, a helyreállításban és az AAV-genom integrációjában játszanak szerepet. A cap-fehérjék (VP1, VP2 és VP3) alakítják ki a virion kapszidját. A rep és cap nyitott leolvasási fázisokat az 5’- és 3’-végeknél 145 bp méretű, fordított, terminális ismétlődő szekvenciák (ITR-ek) szegélyezik, amelyek első 125 bp-ja képes Y vagy T alakú duplex struktúrákat kialakítani. AAV-vektorok kifejlesztésének az a jelentősége, hogy az egész rep- és cap-domént ki lehet vágni, és helyettesíteni terápiás hatású vagy riportertranszgénnel. Lásd B. J. Carter, „Handbook of Parvovíruses, szerk. P. Tijsser, CRC Press, 155-168. old. (1990). Kimutatták, hogy az ITR képviseli azt a minimális szekvenciát, amely szükséges a replikációhoz, helyreállításhoz, csomagoláshoz és az AAV-genom integrációjához.
Az AAV életciklusa két fázisból áll, latens és litikus szakaszokat egyaránt tartalmaz. A latens fertőzés alatt az AAV-virionok kapszulázott ssDNS-ként belépnek a sejtbe, röviddel ezután a sejtmaghoz szállítódnak, ahol az AAV-DNS stabilan integrálódik a gazdaszervezet kromoszómájába anélkül, hogy ehhez látszólag szükség lenne sejtosztódásra. Helpervírus nélkül az integrálódott AAV-genom latens marad, de képes aktiválódni és helyreállni. Az életciklus litikus fázisa akkor kezdődik, amikor AAV-provírust tartalmazó sejtet megfertőz egy másodlagos infekció herpeszvírussal vagy adenovírussal, amelyek helperfunkciókat kódolnak, amely az AAV kivágásához szükséges a gazdaszervezet kromatinjából [B. J. Carter, mint fent], A fertőző szülői egyszálú (ss) DNS duplex replikálódó formává (RF) expandál rep-függő módon. A helyreállított AAV-genomok becsomagolódnak az előzőleg kialakult fehérjekapszidokba (körülbelül 20 nm átmérőjű ikozahedrális szimmetria), és (+)- vagy (-)-ssDNS-genomot becsomagolva tartalmazó, fertőző virionokként sejtlízist követően kiszabadulnak.
Az AAV-nek szignifikáns alkalmazási lehetősége van génterápiában. A vírusrészecskék nagyon stabilak, és a rekombináns AAV-k (rAAV) „drogszerű” tulajdonságokkal rendelkeznek, amennyiben az rAAV-t ülepítéssel vagy CsCI-gradiensben lehet tisztítani. Hőstabilak, és por formába lehet azokat liofilizálni, és víz hozzáadásával visszanyerik teljes aktivitásukat. DNS-ük stabilan képes integrálódni a gazdaszervezet kromoszómáiba, így az expresszió hosszan tartó. Gazdaszervezetük széles körből származhat, és az AAV nem okoz ismert betegséget, így a rekombináns vektorok nem toxikusak.
AAV alkalmazásával nagymértékű génexpressziót mutattak ki egerekben, amely stabilan fennmaradt legalább 1,5 évig. Lásd Xiao et al., Journal of Virology 70, 8089-8108 (1996). Mivel nincs bizonyosság virális toxicitásra vagy a gazdaszervezetben fellépő celluláris immunválaszra, ezek felülkerekednek a virális génterápia korlátain.
Kaplitt és munkatársai leírták [Natúré Genetics 8, 148-153 (1994)] tirozin-hidroxiláz hosszan tartó (akár 4 hónapig is) expresszióját patkányagyban, direkt intrakraniális injekció után, AAV-vektor alkalmazásával. Ez emberekben előforduló Parkinson-kór terápiás lehetősége. Az expresszió nagymértékben hatékony volt, és a vírus biztonságos és stabil.
Fisher és munkatársai leírtak [Natúré Medicine 3, 306-312 (1997)] stabil génexpressziót egerekben, AAV izomba adott injekciója után. A vírus ismét biztonságos volt. Celluláris vagy humorális immunválaszt nem detektáltak a vírus vagy az idegen géntermék ellen.
Kessler és munkatársai kimutatták [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14 082-14 087 (1996)] eritropoietingén (Epo-gén) nagymértékű expresszióját egerekben, AAV intramuszkuláris injektálása után. Az epo-fehérjét kimutatták a keringésben, és leírták a vörösvértestszám növekedését, amely terápiás lehetőséget jelentett. Ezen csoport által végzett más munkában is alkalmaztak AAV-t a HSV-tk-gén expresszálására, rák kezelésében. Leírtak nagymértékű génexpressziót szilárd tumorokban.
A közelmúltban rekombináns baculovírusról, elsősorban Autographa californica baculovírusból származó, többmagvas polihedrózisvírusról (AcMNPV) kimutatták, hogy képes emlőssejteket in vitro transzdukálni [lásd Hofmann, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10 099-10 103 (1995); Boyce, F. M. és Bucher, N. L. R„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2348-2352 (1996)].
A rekombináns adenovírusok számos potenciális előnnyel rendelkeznek génterápiában alkalmazva. Ezek: nagyon nagy DNS-inszertálási kapacitás, előzetesen meglévő immunválasz hiánya emberekben, emlősökben nem replikálódik, emlősökben nem toxikus, virális gének nem expresszálódnak emlőssejtekben a baculovírus transzkripciós promotereinek rovarspecifitása miatt, és ezen vírusfehérjék elleni citotoxikus T-limfocita-válasz potenciális hiánya.
V. Interferonok hatékonyságának tesztelése és azonosítása
Interferonpolinukleotidokat expressziós vektor útján viszünk be sejtbe. Általában úgy teszteljük egy adott génterápiás vektor hatékonyságát egy adott celluláris
HU 224 422 Β1 állapoton és metabolizmuson, hogy megmérjük: (i) a celluláris morfológia megváltozását; (ii) a sejtproliferáció gátlását; és (iii) az antivirális aktivitásokat.
Specifikus interferon-géntermék izolált sejtben való expressziójára szolgáló, adott expressziós vektor szelekcióját és optimalizálását úgy végezzük, hogy előállítjuk az interferongént, előnyösen egy vagy több, alkalmas szabályozórégióval (például promoterrel); előállítunk egy olyan vektort tartalmazó vektorkonstrukciót, amelybe az interferongén inszertálva van; tenyésztett sejteket transzfektálunk vagy transzdukálunk in vitro a vektorkonstrukcióval; és meghatározzuk, hogy vajon az interferon-géntermék jelen van-e a tenyésztett sejtekben.
Interferonokat kódoló polinukleotidokkal való transzfekció hatását a számos, könnyen elérhető, humán tumorsejtvonal bármelyikének alkalmazásával lehet in vitro tesztelni. Ilyen sejtvonalak például 5637 jelű, humán hólyagkarcinóma-sejtvonal (ATCC HTB9); MDA-MB-468 jelű, humán mellkarcinóma-sejtvonal (ATCC HTB132); DU145jelű, humán prosztatakarcinóma-sejtvonal (ATCC HTB81); SAOS2 jelű, humán oszteoszarkóma-sejtvonal (ATCC HTB85); Hs913T jelű, tüdőrákra metasztatikus, humán fibroszarkóma-sejtvonal (ATCC HTB152); HeLa jelű, humán cervikális karcinóma-sejtvonal (ATCC ECL 2). Ezen sejtvonalakat transzfektálni lehet interferonokat kódoló, megfelelő polinukleotidokkal, és a transzfekció sejtnövekedésre és celluláris morfológiára kifejtett hatásait lehet tesztelni szakember által ismert módszerek alkalmazásával, például Trypan-blue kizárásos vizsgálati eljárással lehet mérni a sejt életképességét, sejtszámlálással lehet mérni az időbeli szaporodást, és tritiált timidin beépüléssel lehet mérni a DNS-replikációt.
A 3. példában leírt eljárás alkalmazásával könnyen tesztelhetjük a szekretált fehérje hatását az olyan környező sejtekre, amelyek nem tartalmazzák a vírusvektort a fehérjét kódoló, megfelelő polinukleotidokkal.
Célsejtbe való bevitel után az interferonszekvenciákat szokásos eljárásokkal lehet azonosítani, például nukleinsavhibridizációval, olyan próbák alkalmazásával, amelyek az inszertált mutáns interferonszekvenciákkal homológok/komplementer szekvenciákat tartalmaznak. Az interferontranszkripciót reverz transzkriptázt alkalmazó polimeráz-láncreakcióval lehet mérni. Más módszer szerint, interferonfehéijét sejtkondicionált tápközegben mérünk, szokásos antivirális vizsgálati eljárás vagy ELISA-eljárás alkalmazásával. Egy másik megközelítésben a szekvenciá(ka)t egy „markergén”-funkció jelenlétével vagy hiányával lehet azonosítani (például timidin-kináz-aktivitás, antibiotikumrezisztencia és hasonlók), melyet az expressziós vektornak a célsejtbe való bevitelével lehet kiváltani. Például ha béta-interferon-1a-t kódoló polinukleotidot inszertálunk domináns, szelektálható markergént, például neomicin-foszfotranszferáz-gént (SV40 korai promoter külön szabályozása alatt) tartalmazó vektorba, a szekvenciát a markergénfunkció (geneticinrezisztencia) jelenlétével lehet azonosítani. A megfelelő vektor detektálására szolgáló más módszerek szakember számára könnyen elérhetőek.
VI. Hasznosítások
A) Interferonok és fertőző betegségek
Interferonokat bakteriális, gomba- és vírusfertőzések kezelésében alkalmaznak. Az influenza és a hólyagos szájnyálkahártya-gyulladás vírusa (VSV) különösen érzékeny az interferonokkal való gátlásra, és gyakran alkalmazzák azokat interferonaktivitás mérésére szolgáló vizsgálati eljárásokban és az interferon antivirális aktivitásának mechanizmusát célzó kutatásokban. Más, humán patogén vírusok is érzékenynek tűnnek interferonokra, például hepatitis B-vírus (HBV), hepatitis C-vírus (HCV), hepatitis D-vírus, humán papillomavírus, herpes simplex vírus, herpes zoster vírus, citomegalovírus (CMV), rhinovírus és encephalomyocarditisvírus.
A vírusbetegségek között vonzóbb célpont a hepatitis. A vírusos hepatitis egy májbetegség, melyet több vírus okoz, és világszerte jelentős egészségügyi probléma. Öt különböző humán hepatitisvírust izoláltak és klónoztak. Ezek a hepatitis A, B, C, D és E. Úgy tűnik, hogy az akut és krónikus vírusos hepatitis néhány esete más hepatitisvírussal (vírusokkal) társult, mint az eddig jellemzett vírusok, például a közelmúltban felfedezett hepatitis G-vírussal. A legelterjedtebb vírusok az A, B és C. Akut és krónikus májkárosodás és -gyulladás előidézésén kívül a HBV- és HCV-fertőzés hepatocelluláris karcinómához vezethet. Az interferonokról kimutatták, hogy bizonyos mértékű hatékonysággal rendelkeznek in vivő HBV és HCV ellen, valamint sejttenyészetben hepatitis D és hepatitis A ellen.
A vírusos hepatitist interferongén bevitelével lehet kezelni. A gént bevitelének előnyös célpontja a májban lévő hepatociták. Bár ex vivő terápia (például kiveszünk májsejteket, majd azokba beviszünk interferont expresszálni képes polinukleotidot, és azután visszaültetjük a páciensbe) is lehetséges, az in vivő génbevitel különösen előnyös. Műtétet végzünk, amelyben a gént a májkapuvénába injektáljuk, vagy a gént katéteren keresztüli infúzióval juttatjuk a májartériába. Ideális esetben kevésbé behatoló módszert, intravénás injekciót alkalmazunk.
Az interferongént egy alkalmas expressziós vektorban transzkripciós promoter szabályozása alá helyezzük. A transzkripciós promoter lehet celluláris vagy virális (CMV, SV40, RSV stb.) eredetű. Ha májspecifikus génexpresszió kívánatos, hepatocitaspecifikus celluláris promotert, például albumin-enhanszer/promotert, a1 -antitripszin-promotert vagy HBV-enhanszer/promotert részesítünk előnyben. Sok májspecifikus promotert leírtak a szakirodalomban (lásd fentebb).
Olyan vektort is lehet tervezni, amelyben az interferongén csak hepatitisszel fertőzött sejtekben expresszálódik. Például interferongén expresszióját a HBx jelű, HBV transzkripciós faktorral lehet indukálni, amely csak HBV-vel fertőzött hepatocitákban van jelen. Ezenkívül „hordozó’-rendszert is lehet alkalmazni. Ez lehet nem vírusos célba juttató rendszer, például kationos liposzómák vagy fehérje:DNS konjugátumok alkalmazásával (DNS-ből és aszialo-glikoproteinekből álló konjugátumokat vihetünk be elsősorban a májba, a he12
HU 224 422 Β1 patocitákon található aszialo-glikoprotein-receptorhoz való kötődésen keresztül).
Azonban egészen napjainkig a leghatékonyabb génszállító rendszerek vírusos eredetűek voltak. Rekombináns adenovírusokat alkalmaztak gének ex vivő bevitelére humán hepatocitákba. Az állatmodellek azt mutatták, hogy a rekombináns adenovírusok nagyon hatékonyan képesek lokalizálódni a májban intravénás in vivő beadást követően. Az injektált adenovírusok körülbelül 98%-a lokalizálódott a májban.
Úgy tűnik, hogy rekombináns adenoasszociált vírussal (rAAV) is meg lehet fertőzni májat in vivő beadás után. Más típusú vírusokat is alkalmazhatunk, például alfa-vírusokat, lentivírusokat vagy más emlőseredetű vírusokat. Nemrégiben egy nem emlős vírusról, a rovarspecifikus baculovírusról kimutatták, hogy hatékonyan képes géneket szállítani hepatocitákba és expresszálni [Hofman et al. (1995); Boyce és Bucher, mint fent (1996)].
Rekombináns adenovírusokat lehet alkalmazni például interferongén in vivő célba juttatására. Replikációdefektív adenovírusokat már több csoportban előállítottak. Ilyen vírusok első generációja az E1-régió deléciója miatt detektív. Ezt a defektust 293-sejtvonal képes kiegészíteni (komplementálni), amely expresszálja az adenovírus-E1-régiót. Olyan rekombináns adenovírust előnyös alkalmazni, amelyet még nagyobb mértékben elsorvasztunk az E1-, E2a- és/vagy E4-gének deletálásával. Ezen valamennyi deletált funkciót expresszáltatni lehet a csomagoló sejtvonalban. Az interferongént a nagyszámú promoterek (például CMV-ből származó, azonnali korai promoter, RSV-LTR, celluláris aktinpromoter, albuminból származó enhanszer/promoter vagy más, májspecifikus promoter) bármelyike után, szintézisirányban helyezzük el. Ezt a génkazettát behelyezzük egy rekombináns adenovírusba az egyik deletált gén, például E1-gén helyett, így előállítjuk az adenovírus-transzfervektort.
Interferongént tartalmazó rekombináns adenovírusokat közvetlen ligálással vagy homológ rekombinációval állítunk elő, azt követően transzfektáljuk csomagolósejtekbe, standard eljárások alkalmazásával. Interferongént tartalmazó rekombináns víruskészletet többször plakktisztítunk, azután nagyobb léptékű termeltetéssel expandáltatjuk csomagolósejtekbe. Vírust tisztíthatunk CsCI-sávon, oszlopkromatográfiával vagy más módszerrel, és azután csomagolósejteken titráljuk. E1-ben és E2a-ban detektív adenovírusok [Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6196-6200 (1994)], valamint E1-ben és E4-ben detektív adenovírusok [Gao et al., J. Virology 70, 8934-8943 (1996)] előállítására szolgáló eljárásokat részletesen leírtak. E1-ben detektív adenovírusok előállítására szolgáló eljárásokat találhatunk: Graham, F. L. és L. Prevec közleményében: Mól. Biotech. 3, 207-220 (1995).
Különböző vírusdózisokat tesztelhetünk klinikai kísérletekben. A vírusdózis valószínűleg 107 plakkformáló egységnél (pfu) kezdődik, és felmehet egészen 1012 pfu-ig. Ha szükséges, a vírust több alkalommal is beadjuk (például egyszer 1-6 hónapig). Az ismételt vírusbeadásból származó humorális immunválasz korlátozhatja az ismételt beadás hatékonyságát. Ebben az esetben a vírussal beadhatunk immunszuppresszív ágenst, például ciklosporint vagy CD40-ligandumra specifikus antitestet.
A hepatitis elleni, interferon-génterápia hatékonyságát állatmodelleken tesztelhetjük [lásd a C) részben leírtakat]. Hepatitis B-vírus esetén például sok modell áll rendelkezésre. Ilyenek például amerikai mormota, kacsa, facickány, patkány és egér.
Az egér-HBV-modellek között vannak olyan egerek, amelyek HBV-re transzgenikusak, és stabilan replikáinak HBV-DNS-t májukban, amely HBV-vírus állandó termelődéséhez vezet a keringésben. HCV esetén egy csimpánzmodell is rendelkezésre áll. Interferongént tartalmazó adenovírust beadhatunk közvetlenül a májba vagy beadhatunk intravénás injekcióval. A hatékonyságot a virális DNS replikációjának, a vírusrészecskék keringésben való jelenlétének, májenzimek (ALT-k), májpatológia és -gyulladás követésével lehet meghatározni.
B) Rák
Az interferonfehérjékről kimutatták, hogy sok helyzetben antionkogén aktivitással rendelkeznek. Összefoglaló irodalomként lásd Wadler és Schwarz, Cancer Research 50, 3473-3486 (1990); Martin-Odegard, DN&P 4, 116-117 (1991); és Spiegel, Seminars in Oncology 15 (5), 41-45 (1988). Kimutatták, hogy alfa-interferonnal és béta-interferonnal végzett kezelések bizonyos hatékonysággal rendelkeztek számos rákos esetben. A génterápiát végezhetjük egyedül vagy szokásos sebészeti, sugárkezelési vagy kemoterápiával együtt. A génterápiával megközelíthető, rákos megbetegedések lentebb felsorolt listája csak részleges, és az interferon-génterápia valószínűleg hatékony lehet számos betegség esetén, amely nem szerepel a felsorolásban.
Malignus gliomák felelősek az összes, felnőttekben előforduló primer agytumor 60-80%-áért. Humán gliomasejteket beépíthetünk intracerebrálisan immunodeficiens (meztelen) egerekbe, gliomamodell felállítása céljából. Kimutatták, hogy béta-interferont alkalmazó kezelés megnövelte ezen egerek túlélését. A béta-interferonfehérjékkel végzett néhány kísérletben az volt a probléma, hogy béta-interferon parenterális (intravénás vagy intramuszkuláris) beadását nagymértékű toxicitás követte. Béta-interferongén lokalizált célba juttatása az agyba, lehetőleg a sebészeti beavatkozással egyidejűleg, hosszan tartó béta-interferontermelést eredményezett az agyban olyan mellékhatások nélkül, amelyek a szisztémás fehérjebeadást követték.
Melanoma egy kitűnő interferon-génterápiás célpont. Metasztatikus malignus melanoma rosszul jelezhető előre. A betegség előfordulási gyakorisága drámaian növekszik, és a szokásos kemoterápiák hatástalanok. Úgy tűnik, hogy a melanoma immunogén tumortípus annyiban, amennyiben a páciens válasza a gazdaszervezet immunválaszától függhet. A béta-interferon antiproliferatív és immunmodulátor-aktivitása egyaránt hatékony lehet ebben a betegségben. Azt láttuk,
HU 224 422 Β1 hogy a béta-interferonfehérje közvetlen antiproliferatív hatásokkal rendelkezik tenyésztett, malignus melanoma sejtekre.
Haemangioma a kapilláris endotélium proliferációja, amely masztociták, fibroblasztok és makrofágok felhalmozódását eredményezi, és szövetkárosodáshoz vezet. Bár rendszerint veszélytelen, a haemangiomák veszélyeztethetik a létfontosságú szerveket, és halálos kimenetelű lehet. Alfa-interferonfehérjéről kimutatták, hogy szteroidrezisztens haemangiomák korai regresszióját indukálja csecsemőkben (Martin-Odegard, mint fent).
Az interferonfehérjékről kimutatták, hogy hatékonyak leukémiák, limfómák és myelomák kezelésében. A kimutatott hatékonyság ezekben a betegségekben ellentétben van azzal az általános tapasztalattal, hogy bár az interferonfehérjék hatékonysága in vitro rák kezelésében jól jellemzett, az in vivő hatékonyság messze nem általános. Mindamellett az alfa-interferon hatékony hajas sejtes leukémia, krónikus mieloid leukémia, kután T-sejtes limfómák, Hodgkin-féle limfóma és myeloma multiplex ellen emberi klinikai kísérletekben. A béta-interferonfehérje gátolja vesesejt-karcinóma sejtjeinek növekedését tenyészetben. Jóváhagyták az IFN-α vesesejt-karcinóma kezelésében való alkalmazhatóságát.
A colorectalis rák a legfőbb oka a rákkal összefüggő haláleseteknek az USA-ban. Az IFN-α-, IFN-β- és IFN-y-fehérjék potenciális antiproliferatív hatásokat fejtenek ki tenyésztett vastagbél-karcinómasejtekre. A vastagbél-karcinóma gyakran hoz létre metasztázist a májban végzetes következményekkel. Adenovírust és más, májba juttató rendszereket lehet alkalmazni az interferongén májba juttatására, ezen metasztázisok kezelésére. Hepatocelluláris karcinóma egy vonzó célpont, mivel adenovírussal nagy hatékonysággal lehet májba célba juttatni. Megfigyelték, hogy az IFN-6-fehérje szignifikánsan gátolja humán hepatomasejtek proliferációját tenyészetben.
Az interferonfehérjékről néhány klinikai kísérletben kimutatták, hogy hatékonyak inoperábilis kissejtes tüdőkarcinóma kezelésére, de másban nem. Két, humán, tüdőráksejtvonalat találtak, amelyek érzékenyek voltak béta-interferonfehérjével előidézett növekedési gátlásra (a béta hatékonyabb volt, mint az alfa). Egy klinikai kísérletben szignifikáns interferonhoz kapcsolható toxicitást figyeltek meg, az interferon intravénás beadása után. A béta-interferongén tüdőbe való lokális beadása (esetleg rekombináns adenovírusvektor aeroszolos bevitelével) hatékony lehet a szisztémás fehérjebevitel esetén megfigyelt toxicitás nélkül. Megfigyelték kissejtes tüdőkarcinóma-se'fiek proliferációjának in vitro gátlását béta-interferonfehérje alkalmazásával.
Alfa-interferonfehérje gátolja me/írák-xenograftok növekedését meztelen egerekben. A béta-interferon hatékony lehet mellrák ellen, nemcsak antiproliferatív hatásai miatt, hanem ösztrogénreceptorokat és progeszteronreceptorokat indukáló képessége miatt is, amely in vivő szenzibilizálja a mellkarcinómát az antiösztrogén tamoxifénre. Bemutatunk adatokat (lásd 3.
és 4. példa) azokból a kísérletekből, amelyekben IFN^-gén-terápiát alkalmazunk humán mellkarcinóma egerekben felállított modelljében.
Petefészekrák egy olyan betegség, amely lehetséges célpontja a találmány szerinti terápiának. Úgy tűnik, hogy a béta-interferonfehérje kevésbé aktív, mint az alfa-interferon tenyésztett petefészekráksejtek proliferációjának gátlására. Ebben az esetben úgy végezzük a terápiát, hogy génterápiás vektort helyezünk el a hashártyába, mivel ez a tumortípus hajlamos betölteni a hasüreget.
Összefoglalva, az interferonfehérjékről kimutatták, hogy antionkogén tulajdonságokkal rendelkeznek számos betegségben, bár az interferonfehérjéket alkalmazó klinikai eredmények nem egységesen pozitívak. Az IFN-α- és IFN-6-fehérjéket szokásos kemoterápiákkal együtt tesztelték, és szinergiát mutattak ki ezekkel a drogokkal több indikációban, például cervikális ráksejtekben, gégekarcinóma-sejtekben, leukémiasejtekben, vesesejt-karcinómákban, vastagbél-adenokarcinómában és myelomában. Azt is feltételezzük, hogy az interferonok antiangiogenikus aktivitással rendelkeznek. Fordított összefüggés van lokális IFN^-szintek és az angiogénképesség között. Néhány adat azt mutatja, hogy hosszan tartó IFN^-fehérjeszint szükséges az angiogenezis gátlásához. Ebben az esetben interferon-génterápia lenne előnyösebb a fehérjeterápiával szemben, amelyben a nagy mennyiségű interferonfehérje egész gyorsan lecsökken alacsony vagy detektálhatatlan szintekre.
C) Génterápiás állatmodellek
Szakember számára sok állatmodell ismeretes, amelyek ex vivő és in vivő génterápia tesztelésére rendelkezésre állnak. A legelterjedtebben alkalmazott, rágcsálóban kialakított rákmodell humán tumorxenograft-modell meztelen (nu/nu) egerekben. Humán ráksejteket tenyészetben szaporítunk, és megfelelő expressziós szabályozószekvenciákhoz kapcsolt, interferont kódoló génnel transzfektáljuk vagy infektáljuk. Ezeket a sejteket azután meztelen egérbe injektáljuk. A tumorsejteket tipikusan szubkután injektáljuk az egér hátába, amely szilárd tumortömeg kialakulásához vezet (lásd 1. példát). Más módszer szerint a tumorsejteket ortotopikálisan injektálhatjuk abba a szervbe, amelyben természetes körülmények között megjelent (tüdősejteket a tüdőbe injektáljuk; vastagbél-karcinómasejteket a vastagbélbe stb.). A tumornövekedést azután a tumortömeg átmérőjének mérésével követjük az időben (lásd 2. példa).
Okada és munkatársai [Gene Therapy 3, 957-964 (1996)] kísérleti gliomákat hoztak létre egerekben humán gliomasejtek agyba adott, közvetlen intrakraniális, sztereotaktikus injekciójával. Miután detektálható tumorok képződtek, herpes simplex vírusból származó, timidin-kináz-gént (HSV-tk) expresszálni képes AAV-vektort injektáltak közvetlenül ugyanerre a helyre. A HSV-tk enzim a „gancyclovir” (GCV) nem toxikus nukleozidanalógot képes átalakítani toxikus metabolittá. Génterápia után beadtak GCV-t intraperitoneálisan. Azokban az egerekben, amelyek AAV-tk plusz GCV-t
HU 224 422 Β1 kaptak, a tumorméret drámaian lecsökkent, a kontroliegerekben (AAV-t vagy AAV-tk-t GCV nélkül kaptak) viszont nem. Ez a terápia biztonságosnak és hatékonynak tűnt.
Rekombináns adenovírusokat (AdV) szintén alkalmaztak szilárd tumorok kezelésére állatmodellekben és emberen végzett klinikai kísérletek korai szakaszában. Ezen kísérletek közül sokban a fentiekhez hasonló, meztelen egér/humán xenograftmodellt alkalmaztak. Néhány példát lentebb felsorolunk ezekből a modellezési kísérletekből. Clayman és munkatársai [Cancer Research 55, 1-6 (1995)] humán, pikkelysejtes karcinóma modelljét állították fel meztelen egerek fejében és nyakában. Azt találták, hogy vad típusú p53-at expresszáló adenovírus megakadályozta ezen tumorok kialakulását.
Hirschowitz és munkatársai [Humán Gene Therapy 6, 1055-1063 (1995)] humán vastagbél-karcinómasejteket bevittek meztelen egerekbe. Miután a tumorok kialakultak, ezekhez a tumorokhoz közvetlenül E. coliból származó, citozin-deamináz-gént (CD) expresszálni képes adenovírust injektáltak, azután szisztémásán beadtak 5-fluor-citozint (5FC) (CD plusz 5FC egy enzim/prodrog kombináció, amely hasonló a „tk plusz GCV”-hez). A tumorméret 4-5-szörös csökkenését figyelték meg.
Zhang és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4513-4518 (1996)] humán melltumort hoztak létre meztelen egerekben. Ezekbe a tumorokba alfa-interferont expresszálni képes adenovírust injektáltak közvetlenül. Az állatok 100%-ában figyelték meg a tumor regresszióját.
Ko és munkatársai [Humán Gene Therapy 7, 1683-1691 (1996)] humán prosztatatumorokat hoztak létre meztelen egerekben, és azt találták, hogy vad típusú p53-at expresszálni képes adenovírus közvetlen intratumorális injekciója gátolta a tumornövekedést. Valamennyi kezelt egér tumormentes maradt legalább 12 hétig a kezelés megszüntetése után.
Bischoff és munkatársai [Science 274, 373-376 (1996)] humán cervikális karcinómát és glioblasztómatumorokat hoztak létre meztelen egerekben. Olyan adenovírussal kezelték ezeket az egereket, amelyben az E1B-gén deletálva volt. E1B hiányában az adenovírus szelektíven elpusztította a p53-deficiens tumorsejteket. Ha közvetlenül a tumorba injektálták, az adenovírus az állatok 60%-ában okozott tumorregressziót.
Ohwada és munkatársai [Humán Gene Therapy 7, 1567-1576 (1996)] humán vastagbél-karcinómasejteket injektáltak meztelen egerek májába, vastagbélrák májmetasztázisának modellezése céljából. Azután CD-t expresszálni képes adenovírust injektáltak a májba, a tumor közelébe. Szisztémás 5FC-kezelés szuppresszálta a tumornövekedést ezekben az állatokban.
Rákmodellek felállíthatok immunkompetens egerekben és patkányokban is. Ezeket a tumorokat szingenikus, rágcsálóból származó, olyan tumorsejtekből lehet előállítani, amelyek egerekbe vannak injektálva. Más módszer szerint a tumorokat endogén sejtekből lehet származtatni. Ezekben az esetekben az endogén tumorok úgy keletkeznek, hogy az állatot karcinogénnel kezelik, vagy más módszer szerint spontán képződhetnek az egér genetikai hátterének következtében (például p53-deficiens). Néhány példát az alábbiakban ismertetünk.
Elshami és munkatársai [Humán Gene Therapy 7, 141-148 (1996)] endogén mesotheliomát kezeltek immunkompetens patkányokban tk-gént expresszálni képes adenovírussal. A vírust a mellhártya lemezei közé injektálták, és azután beadtak GCV-t szisztémásán. Drámai csökkenést mutattak ki a tumorméretben és növekedést a túlélési időben.
Eastham és munkatársai [Humán Gene Therapy 7, 515-523 (1996)] szingenikus egérből származó, prosztatatumor-sejtvonalakat ültettek be szubkután immunkompetens egerekbe. Adenovírus-tk-t közvetlenül a tumorba injektáltak, és GCV-vel kezelték azokat szisztémásán. A szerzők a tumorméret csökkenéséről és meghosszabbodott életidőről számoltak be.
Bramson és munkatársai [Humán Gene Therapy 7, 1995-2002 (1996)] citokin-IL-12-t expresszálni képes adenovírust injektáltak közvetlenül endogén egérmelltumorokba. Azt találták, hogy az egerek 75%-ában visszafejlődtek a tumorok, és a maradék 33%-uk tumormentes maradt hosszabb ideig.
Riley és munkatársai [Natúré Medicine 2, 1336-1341 (1996)] retinoblasztómagént expresszálni képes adenovírust injektáltak közvetlenül agyalapi malanotróf tumorokba, amelyek spontán képződtek (Rb±)egerekben. Azt találták, hogy a tumorsejt-proliferáció mértéke csökkent, a tumornövekedés mértéke csökkent, és a kezelt állatok életideje meghosszabbodott.
A retrovírusvektorok az első vektorok, amelyeket humán génterápiában alkalmaztak klinikai kísérletekben. Az egyik közleményben leírtak kapcsolatba hozhatók a találmány szerinti megoldással [Roth et al., Natúré Medicine 2, 985-991 (1996)]. Előállítottak rekombináns retrovírust, amely vad típusú p53-gént expresszált. A vírust közvetlen intratumorális injekcióval, egy bronchoszkópba inszertált tű alkalmazásával bevitték kilenc humán páciensbe, amelyek kissejtes tüdőkarcinómában szenvedtek. A kilenc páciens közül háromban visszafejlődött a tumor, míg három másik páciensben stabilizálódott a tumornövekedés.
D) A találmány más előnyös megvalósítási módjai
A genetikailag módosított sejteket például intraperitoneális injekcióval adjuk be, vagy implantáljuk a sejteket vagy graftot vagy sejteket tartalmazó kapszulát a recipiensben sejtkompatibilis helyére. A leírásban a „sejtkompatibilis hely” kifejezésen a recipiensben lévő struktúrát, üreget vagy folyadékot értünk, amelybe implantálni lehet a genetikailag módosított sejte(ke)t, sejtgraftot vagy kapszulázott sejtexpressziós rendszert, káros fiziológiai következmények előidézése nélkül. Jellegzetes sejtkompatibilis hely például a hasüreg, mellüreg és szívburok, valamint szilárd tumorok, amelyből a sejtek származnak, vagy szerv, amelyből a tumort eltávolítottuk.
A genetikailag módosított sejteket sejtkompatibilis helyre implantáljuk egymagukban vagy más genetikai15
HU 224 422 Β1 lag módosított sejtekkel kombinációban. Tehát a találmány tárgya eljárás egy recipiens rendszerének módosítására, genetikailag módosított sejtek keverékének alkalmazásával, így egy első, módosított sejt egy első interferont expresszál, és egy második sejt egy második interferont vagy más szekretált fehérjét expresszál. Hozzáadhatunk más, genetikailag módosított sejttípusokat (például hepatocitákat, simaizomsejteket, fibroblasztokat, gliasejteket, endotél sejteket vagy keratinocitákat) a genetikailag megváltoztatott sejtekkel együtt, bevitt gének komplex készletének expressziója céljából. Továbbá, egynél több rekombináns gént is bevihetünk az egyes genetikailag módosított sejtekbe, ugyanabba vagy különböző vektorokba, ezáltal lehetővé tesszük, hogy egyetlen sejt többféle interferont expresszáljon.
A találmány tárgyát képezi továbbá sejtgraft. A graft fentebb leírt, genetikailag módosított, több sejtet tartalmaz olyan hordozóhoz kapcsolva, amely alkalmas emlősrecipiensbe való implantációra. A hordozó kialakítható természetes vagy szintetikus anyagból. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a graft egy darab hashártyát tartalmaz. A találmány ezen előnyös megvalósítási módja szerint a hordozó természetesen előforduló mátrix, amely a több genetikailag módosított sejtet együtt tartja. Más módszer szerint a graft több, fentebb leírt sejtet tartalmaz, természetesen előforduló mátrixot helyettesítő hordozóhoz [például Gelfoam (Upjohn, Kalamazoo, Mich.), Dacron, Cortex®] kapcsolva.
A találmány tárgya egy másik vonatkozásában kapszulázott sejtexpressziós rendszer. A kapszulázott rendszer emlősrecipiensbe való implantációra alkalmas kapszulát és abban fentebb leírt, genetikailag módosított mezoteliális sejtet tartalmaz. A kapszula kialakítható szintetikus vagy természetesen előforduló anyagból. Ilyen kapszulák formázása szakember számára ismert. Az emlősrecipiensbe közvetlenül implantált (azaz úgy vannak implantálva, hogy a genetikailag módosított sejtek közvetlen fizikai érintkezésbe kerülnek a sejtkompatibilis hellyel) sejtekkel ellentétben a kapszulázott sejtek izolálva maradnak (azaz nem kerülnek közvetlen fizikai érintkezésbe a hellyel) az implantáció után. Tehát a kapszulázott rendszer nem korlátozódik genetikailag módosított, nem immortalizált sejtekre, de tartalmazhat genetikailag módosított, immortalizált sejteket.
VII. Gyógyszerformák
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint genetikailag módosított sejteket tartalmazó preparátum annyi sejtet tartalmaz, amely elegendő terápiásán hatékony interferondózis in situ célba juttatására a recipiensbe. Egy ismert állapothoz szükséges, adott interferon terápiásán hatásos dózisának meghatározása szakember számára nyilvánvaló, amelyhez felesleges kísérletezésre nincs szükség. Tehát a hatásos dózis meghatározásában szakember figyelembe veszi a páciens állapotát, az állapot súlyosságát, valamint az adott, beadandó interferonnal kapcsolatos klinikai kísérletek eredményeit.
Ha a gén vagy a genetikailag módosított sejtek még nincsenek gyógyászatilag elfogadható hordozóban, akkor ezeket ilyen hordozóba helyezzük a recipiensnek való beadás előtt. Ilyen gyógyászatilag elfogadható hordozó lehet például izotóniás sóoldat és más pufferek, amelyek megfelelnek a páciensnek és terápiának.
A „gyógyászatilag elfogadható hordozó” kifejezés jelentése egy vagy több, olyan természetes vagy szintetikus alkotórész, amellyel az interferont kódoló, izolált polinukleotidot kombináljuk alkalmazásának elősegítése céljából. Alkalmas hordozó lehet steril sóoldat, bár más vizes vagy nemvizes, izotóniás, steril oldatok és steril szuszpenziók is ismeretesek szakember számára, amelyek gyógyászatilag elfogadhatóak. Ebben a vonatkozásban a „hordozó” kifejezésen értünk bármilyen plazmidot és virális expressziós vektort. A „hatásos mennyiség” kifejezés akkora mennyiségre utal, amely képes a betegséget, degeneratív vagy károsodott állapotot javítani vagy előrehaladását késleltetni. A hatásos mennyiséget egyedi alapon lehet meghatározni, és részben a kezelendő szimptómák és az elérendő eredmény figyelembevételére alapozva. Hatásos mennyiséget szakember képes meghatározni ilyen faktorok alkalmazásával, és nem lép túl rutinkísérletek alkalmazásán.
A találmány szerinti előnyös eljárásokban a kísérő vektor (azaz „hordozó”) által tartalmazott, interferont kódoló polinukleotidszekvenciát közvetlenül beadhatjuk a célsejthez vagy tumorszövethez, közvetlen injektálással injekciós tű alkalmazásával, vagy katéteren vagy más adagolócsövön keresztül a rákba vagy tumorba vagy tumort ellátó véredénybe. A dózisok elsősorban olyan faktoroktól függenek, mint a kezelendő állapot, a kiválasztott interferon, a kezelendő alany kora, tömege és egészségi állapota, és eltérhet az egyes alanyok között. Ha virális génterápiás vektort alkalmazunk, a hatásos mennyiség emberi alanyra feltételezhetően körülbelül 1*107 és körülbelül 1*1012 közötti tartományba eső plakkformáló egység (pfu)/ml interferont tartalmazó, virális expressziós vektor, körülbelül 0,1 és körülbelül 10 ml közötti tartományban lévő sóoldatban.
A fentebb tárgyaltak szerint az IFN-gént beadhatjuk közvetlen injekcióval szilárd tumorokba. Más módszer szerint a tumorokba való célba juttatást végezhetjük a tumort ellátó véredénybe adott infúzió alkalmazásával. A vektor parenterális beadása is lehetséges. Interferont kódoló polinukleotidokat beadhatunk topikálisan, intraokulárisan, parenterálisan, intranazálisan, intratracheálisan, intrabronchiálisan, intramuszkulárisan, szubkután vagy bármilyen más módszerrel. A parenterális beadás lehet intravénás, intramuszkuláris, intraperitoneális és szubkután. Egy bonyolultabb megközelítés lehet egy vírus vagy kémiai konjugátum parenterális beadása, amely egy jól elkülöníthető tumortípushoz lokalizálódik természetes tropizmusa miatt vagy olyan felszíni molekulák jelenléte miatt, amelyek csak bizonyos tumortípusokon megtalálható receptorokhoz képesek kötődni.
HU 224 422 Β1
A fentebb leírtak szerint a találmány tárgyát képezik eljárások géntermék (például egy interferon) expresszióját szolgáló, sejtexpressziós rendszer előállítására emlősrecipiensben, az ezáltal előállított expressziós rendszer és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények. Az alábbi példákban be kívánjuk mutatni a sejtgénterápia megvalósíthatóságát állatban felállított modellrendszerben.
1. példa
Példa állatmodellre
Interferont expresszálni képes polinukleotid in vivő tesztelését könnyen elvégezhetjük egy állatmodellben. Tumorokat hozunk létre meztelen egerekben úgy, hogy humán tumorsejtvonalakat injektálunk az egerekbe. A meztelen egér (nu/nu törzs) immunhiányos, és nem löki ki az idegen tumorsejteket. A tumorsejt injektálása után 1-2 héttel kialakul a tumor, bár a pontos időtartam függ az injektált sejtek számától és a sejtvonal tumorogenitásától. Interferont expresszálni képes polinukleotidokat szokásos transzfekciós eljárások alkalmazásával viszünk be tenyészetben lévő tumorsejtekbe, az egerekbe való injektálás előtt. Más módszer szerint a megfelelő polinukleotidot in vivő transzfekcióval vagy virális transzdukcióval vihetjük be a tumorba, miután a tumorok kialakultak az egérben.
Az egyik példa szerint az alkalmazott sejtek vagy HTB9 jelű hólyagkarcinóma-sejtvonalból (Huang et al., mint fent), vagy WERI-Rb27 jelű retinoblasztóma-sejtvonalból származnak [mindkettő Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5257-5261 (1991)]. Interferont kódoló, izolált polinukleotid célba juttatására tenyészetben lévő tumorsejteket transzfektálunk (szokásos eljárások, például kalcium-foszfátos kicsapás, elektroporáció vagy lipofektamintranszfekció alkalmazásával) vagy közvetlenül infektálunk (retrovírus, adenovírus, baculovírus vagy adenoasszociált vírus alkalmazásával). Hatékony vírusfertőzés esetén, amelyben a sejtek 100%-ába sikeresen beépül a megfelelő polinukleotid, nincs szükség a sejtek szelekciójára. Továbbá felismertük (3. példa), hogy a sejteknek csak kis százaléka esetén szükséges, hogy interferongént expresszáljanak, így drogszelekcióra rendszerint nincs szükség.
Ha szelekciót olyan transzfekciók esetén végzünk, amelyek nem annyira hatékonyak, mint a leírás szerinti vírusfertőzések, akkor a sejteket drogrezisztencia-gént (például neo-gént, amely G418-rezisztenciát kódol) és polinukleotidot, például interferongént egyaránt kódoló expressziós vektorral transzfektáljuk. Kontrolltranszfekciót végzünk csak drogrezisztenciát kódoló vektorral.
Körülbelül 2-3 hetes, drogot tartalmazó tápközegben végzett szelekció után a sejtkolóniákat egyesítjük, és szubkután injektáljuk nu/nu (meztelen), nőstény egerek horpaszába, körülbelül 106 sejtszámban, körülbelül 100 μΙ térfogatban. A vírussal fertőzött sejteket közvetlenül injektáljuk, szelekciós lépésre nincsen szükség. A egereket tovább tartjuk legalább két hónapig, és hetente meghatározzuk a tumor méretét tolómércével.
Más módszerben nem transzfektált vagy nem fertőzött tumorsejteket injektálunk szubkután az egerek horpaszába. A tumor kialakulása után interferont kódoló polinukleotidot tartalmazó DNS-t vagy vírust injektálunk közvetlenül a tumorokba. Sok vírus alkalmas erre az eljárásra, bár rekombináns adenovírusok a leghatékonyabbak, és a rekombináns retrovírusok előnye, hogy stabilan integrálódnak a tumorsejt genomjába. DNS-t bevihetünk a sejtekbe úgy, hogy a DNS-t összekeverjük kationos liposzómákkal, és a keveréket injektáljuk. Interferongént nem tartalmazó DNS-t vagy vírusokat injektálunk más egerekben lévő tumorokba, amelyek kontrollként szolgálnak. A tumor előrehaladását vagy csökkenését tolómércével követjük.
2. példa
Tüdőkarcinóma-modell példája
További példa humán kissejtes tüdőkarcinóma kezelése liposzómakapszulázott, interferont kódoló, izolált polinukleotiddal, melyet in vivő hajtunk végre interferont kódoló polinukleotid bevitelével ilyen kezelésre szoruló sejtekbe, liposzómák, különösen kisméretű részecskékből álló liposzómaaeroszolok alkalmazásával. Interferont kódoló polinukleotid aeroszolok útján történő beadása esetén egységesen a garat felső, nazális szakaszának, a tracheobronchiális ágak és a tüdő felszínén rakódik le [liposzómaaeroszolok tárgyalását lásd Knight és Gilbert, Eur. J. Clin. Micro, and Infect Dis. 7, 721-731 (1988)]. Tüdőrákok ily módon való kezelése céljából az interferont kódoló polinukleotidot tisztítjuk bármilyen szokásos módszer alkalmazásával. Az interferont kódoló polinukleotidot összekeverjük liposzómákkal, és nagy hatékonysággal beépítjük azokba. Mivel az aeroszolos bevitel enyhe és normálönkéntesek és páciensek által jól tolerált, az interferont kódoló polinukleotidot tartalmazó liposzómákat adjuk be tüdőrák bármilyen állapotában szenvedő páciensek kezelésére. A liposzómákat nazális inhalálással vagy porlasztókészülékhez csatlakoztatott, endotracheális csövön juttatjuk célba, a tumor növekedésének gátlására elegendő dózisban. Az aeroszolos kezeléseket naponta adjuk be két hétig, ha szükséges, ismételjük.
Ortotopikus, kissejtes tüdőkarcinómát felhasználó, in vivő kísérleteket úgy lehet végrehajtani, hogy tumort injektálunk csecsemőmiriggyel nem rendelkező, meztelen egerek (nu/nu) jobb főhörgőjébe. Három nap múlva az egereket elkezdjük kezelni (naponta, három egymás követő napon) úgy, hogy endobronchiálisan oltjuk liposzómacsomagolt interferongénnel vagy interferon-génszekvenciákat nem tartalmazó kontrollal. A tumor kialakulását és méretét követjük mindkét kezelés alkalmával, tolómérce alkalmazásával, és meghatározzuk az egerek túlélését.
3. példa
Ex vivő génterápia béta-interferon-1a-génnel
Ebben a példában humán mellrákkarcinómából származó, MBA-MD-468 jelű sejtvonalat (az .American Type Culture Collection”-ből szereztük be) alkalmazunk. Sejteket nem fertőzünk vagy fertőzünk humán
HU 224 422 Β1 béta-interferon-1 a-gént expresszálni képes adenovírussal. Ebben az esetben az adenovírusból az E1-gének deletálva vannak, és egy hőmérséklet-érzékeny mutációval rendelkeznek az E2a-génben. Ezen konkrét adenovírus előállítására szolgáló módszer leírását lásd: Engelhardt et al., Gene Therapy 5, 1217-1229 (1994), további részleteket lásd lentebb. Röviden összefoglalva, a béta-interferon-1 a-gént előzőleg pAdCMVIinkl jelű adenovírusvektorba klónoztuk, így a gén transzkripcióját CMV-IE1-promoter vezérli, ezzel előállítottunk egy adenovírus-transzferplazmidot. A gént ebbe a vektorba inszertáltuk a deletált E1-gén helyett. Ezen interferongént tartalmazó, rekombináns adenovírust úgy állítottunk elő, hogy a transzferplazmidot és 293-sejtekben lévő adenovírusgenomot rekombináltunk. A vírust plakktisztítottuk, és szokásosan alkalmazott plakkvizsgálati eljárásokban meghatároztuk a titerét.
Anyagok és módszerek
Sejttenyészet. MDA-MB-468, Huh7, KM12LA4, ME180, HeLa, U87 és 293 jelű humán karcinómasejteket letapadt (adherens) tenyészetekben tartottunk fent, 10% marhaszérumot, 2 mM glutamint, penicillint és sztreptomicint, nem esszenciális aminosavakat és vitaminokat tartalmazó, Dulbecco által módosított, Eagle-féle tápközegben.
Tisztított adenovírusok előállítása. Citomegalovírus korai promoter vezérlete alatt lévő, humán, IFNp-gént kódoló, pAdCMV-hulFNp jelű adenovírus-transzfervektort úgy állítottunk elő, hogy humán IFN-p1a-t kódoló cDNS-inszertet ligáltunk pAdCMVIinkl-plazmidba [lásd Engelhardt et al., mint fent (1994)]. A pAdCMVhulFNp-plazmidot hőmérséklet-érzékeny H5ts125-adenovírusból tisztított, genomi DNS-sel kotranszferáltunk 293-sejtekbe. Egyedi plakkokból származó rekombináns adenovírusokat alkalmaztunk 293-sejtek fertőzésére 39 °C-on, és a felülúszókat IFN-p-gén-expresszióra teszteltük ELISA-eljárással. Az IFN-p-cDNS-t tartalmazó adenovírust (H5.11OhlFNfi) azonosítottuk és tovább amplifikáltuk. Ehhez hasonlóan, kontrollként hőmérséklet-érzékeny, β-galaktozidáz kolorimetriás markert kódoló E2A-adenovírust is előállítottunk (H5.110/acZ). Víruspreparátumokat 293-sejtekben állítottunk elő és CsCI-gradiensen tisztítottunk két ciklus plakkizolálás után. Negatívnak találtuk azokat vad típusú adenovírusra.
Szubkonfluens sejteket fertőztünk H5.1 WW/F/Vp-val, 100 fertőzési egységgel (MOI), 2% marhaszérumot tartalmazó, 3 ml tápközegben. 15-18 órával később a felülúszókat összegyűjtöttük, és az IFNp-koncentrációt ELISA-eljárással határoztuk meg.
ELISA-eljárás. 96 mérőhelyet tartalmazó tálcákat burkoltunk egy éjszakán át 4 °C-on B02 jelű, humán IFNp ellen termeltetett antitesttel (Summit Pharmaceuticals Co., Japan). Az antitestet 10 pg/ml koncentrációban alkalmaztuk burkolópufferben, amely 50 mM nátrium-bikarbonát/karbonátot, 0,2 mM magnézium-kloridot és 0,2 mM kalcium-kloridot tartalmazott (pH 9,6). A tálcákat 1% kazeint tartalmazó PBS-sel blokkoltuk 1 óra hosszáig, szobahőmérsékleten, majd hozzáadtuk az IFN-p-fehérjestandardek 1% kazeint és 0,05%
Tween-20-at tartalmazó oldattal hígított IFN-p-mintáit (Avonex™, Biogen). A tálcákat azután szobahőmérsékleten inkubáltuk az alábbi oldatokkal egymás után:
óra hosszáig nyúlban termeltetett anti-IFN-p-szérum (1:2000 hígításban), 1 óra hosszáig tormából származó peroxidázzal (HRP) konjugált, szamárban termeltetett antinyúl-antitesttel (Jackson Immuno Research, 1:5000 hígítás) és a szubsztrátoldattal (4,2 mM TMB és 0,1 M nátrium-acetát/citromsav, pH 4,9). Miután a reakciót leállítottuk 2 N kénsavval, az abszorbanciát megmértük 450 nm-en.
Egérkisérletek. 4-6 hetes, nőstény Balb/c-nu/nuegereket a „Taconic farms” cégtől (Boston, Massachusetts) szereztünk be. Valamennyi egeret patogénmentes, Biogen-létesítményekben tartottunk, legalább hétig a kísérlet előtt. Ex vivő kísérletekhez leválasztottunk fertőzött és nem fertőzött sejteket tripszin/EDTA oldattal, és kétszer mostunk PBS-sel. Ezeket a sejteket az egerekbe való injektálás előtt közvetlenül a lentebb leírt arányok szerint összekevertünk. Összesen 2*10® sejtet 100 μΙ PBS-ben implantáltunk szubkután a jobb oldali horpaszba. A tumorméret hosszát és szélességét mértük tolómércével, és a tumor átlagos átmérőjét (mm) mutatjuk be.
Közvetlen, in vivő injektálási kísérletekhez (4. példa) 2*106 tumorsejtet 100 μΙ PBS-ben implantáltunk először szubkután, meztelen egerekbe. Amikor a tumorméret elérte az 5-6 mm átmérőt, különböző dózis rekombináns adenovírust tartalmazó, 100 μΙ PBS-t injektáltunk közvetlenül a tumor közepébe egyetlen injekció alkalmazásával. A tumorok hosszát és szélességét tolómércével mértük. A tumorméretet a hossz és a szélesség átlagolásával számítottuk. Az állatokat elpusztítottuk, ha az egérben a tumorméret akkora lett, hogy vérzés jeleit kezdte mutatni, vagy tömege elérte a testtömeg 10%-át. Apoptózist „In Situ Apoptosis Detection Kit” (Oncr, Inc., Kát. sz. S7110-KIT) alkalmazásával vizsgáltunk.
Eredmények
Először elemeztük az adenovírusvektorok transzdukciós hatékonyságát és a transzgénexpresszió mértékét. MDA-MB-468 jelű, humán mellkarcinómasejteket fertőztünk H5.110/acZ-vel, növekvő mennyiségű fertőzési egységekkel (MOI). X-gal festéssel meghatároztuk, hogy 100 fertőzési egységet (MOl-t) alkalmazva a géntranszdukciós hatékonyság elérte a körülbelül 100%-ot ezekben a sejtekben (az adatokat nem mutatjuk be). Tehát, mellkarcinómasejteket tenyészetben 100 pfu/sejt (sejtenként alkalmazott plakkformáló egység) arányban fertőztünk, mivel ezen karcinómasejtekkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy ez volt a legalacsonyabb vírus:sejt arány, amely a gén expressziójához vezetett a populáció minden sejtjében.
Az első kísérletben, 18 órával a fertőzés után 2χ106 sejtet injektáltunk szubkután az egyes meztelen egerek hátába. Öt egeret nem fertőzött sejtekkel és öt egeret θόβηονίΓυε-ΙΡΝβ-νθΙ fertőzött sejtekkel injektáltunk. Szignifikáns méretű tumorok jöttek létre a kontroll, nem fertőzött sejtekkel injektált, valamennyi egérben. Nem
HU 224 422 Β1 jelent meg tumor egyik egérben sem, amelyet IFN-p-t expresszálni képes adenovírussal (H5.1 IQhIFNfí: 1. táblázat) kezeltünk.
Annak a lehetőségnek kizárása céljából, hogy a tumorsejtek IFN-p-fehérje in vitro hatása alatt veszthetnek in vivő tumorgenitásukból, MDA-MB-468-sejteket IFN-p-fehérjével kezeltünk olyan fehérjekoncentrációt alkalmazva, amelyet 18 órával a vírusfertőzés után detektáltunk. Alapos mosás után, azonos számú kezelt sejtet vagy kezeletlen sejtet, vagy 10% kezelt sejtet tartalmazó keveréket injektáltunk a meztelen egerekbe. Tumorfejlődést mind a három egércsoportban megfigyeltünk (az adatokat nem mutatjuk be), ami azt mutatja, hogy az ex vivő IFN-p-gén-bevitelnek, és nem az in vitro fehérjekezelésnek van döntő jelentősége a tumor kialakulásának gátlásában.
Annak meghatározása céljából, hogy ráksejtek IFN-p-gén-expressziója a nem transzdukált sejtek elpusztításához vezethet, az alábbi kísérletet végeztük. Ugyanazon ráksejteket egyrészt nem fertőztünk, más- 20 részt IFNp-gént expresszálni képes adenovírussal fertőztünk (H5.H0/7/F/Vp) vagy lacZ-gént expresszálni képes, ugyanilyen típusú adenovírussal fertőztünk (H5.110/acZ), ez utóbbi β-galaktozidáz-riporterfehérjét kódol, amelytől nem várunk semmilyen rákellenes ha- 25 tást, és ennélfogva kontrollként szolgál az adenovírus bármilyen hatására nézve. Az adenovírussal végzett összes fertőzést 100 pfu:sejt aránnyal végeztük. MDA-MB-468-tumorsejteket külön-külön fertőztünk H5.HO/7/F/Vp-val vagy H5.110/acZ-vel 100 MOl-val.
A fertőzés után 18 órával a fertőzött sejteket elkülönítettük, és azoknak egy részét összekevertük nem fertőzött sejtekkel közvetlenül az egerekbe való injektálás előtt. Balb/c meztelen egerekbe szubkután implantáltunk azonos számú fertőzött sejtet, nem fertőzött sejtet vagy 10% fertőzött sejtet és 90% olyan sejtet tartalmazó keveréket, amelyet nem tettünk ki a vírus hatásának. A tumor növekedését 12 nap múlva kezdtük követni. Míg nem fertőzött sejtekkel implantált valamennyi egérben tumorok fejlődtek ki, nem figyeltünk meg tumorkép- 40 ződést azokban az egerekben, amelyek 100% H5.HO/7/F/Vp-val H5.H0/acZ-vel fertőzött sejteket kaptak, ami alapján feltételeztük, hogy bármelyik vírus képes megszüntetni a tumorgenitást (1. táblázat). Azon5 bán, valamennyi egérben, amelyek 10% H5.110/acZ-vel fertőzött sejtet kaptak, tumorok fejlődtek ki, míg azokban az egerekben, amelyek 10% H5.H0/7/F/Vp-val fertőzött sejteket kaptak, nem fejlődtek ki tumorok. Ennélfogva a H5.110/acZ-fertőzés ugyan elegendő a már fer10 tőzött sejtekben kialakult tumor szuppresszálására, nem képes blokkolni az együtt injektált, kezeletlen vagy nem fertőzött sejtek tumorgenitását. Viszont a sejtek 10%-ának transzdukciója H5.110/7/F/vp-val elegendő a vírussal előzőleg nem transzdukált sejtek, valamint az 15 egyáltalán nem transzdukált sejtek tumorgenitásának szuppresszálására. A tumor kialakulásának gátlása H5.110/acZ-vel a 100%-ban transzdukált populációban valamilyen általános toxikus hatásnak tulajdonítható, vagy az adenovírus által létrehozott, valamilyen antitumorális hatásnak, de meg kell jegyeznünk, hogy a transzdukált sejtek képesek voltak in vitro replikálódni (nem közölt adatok).
A tumorgenitás szuppresszálásához szükséges, interferontartalmú vírus mennyiségének meghatározása céljából a H5.HO/7/F/Vp-val és H5.110/acZ-vel fertőzött tumorsejteket külön-külön összekevertük nem fertőzött sejtekkel különböző arányokban, amelyekben a nem fertőzött sejtek valamennyi esetben feleslegben voltak. A így kapott keverékek így olyan különböző mintáknak 30 feleltek meg, amelyekben 10%, 3%, 1%, 0,3% adenovírussal fertőzött sejt, a maradék pedig nem fertőzött sejt volt. Közvetlenül az összekeverés után a sejteket meztelen egerekbe injektáltuk. Az eredményeket bemutatjuk az 1. táblázatban. A tumor átmérőit két di35 menzióban mértük, a sejtek injektálása után különböző időpontokban. Az 1. táblázatban lévő egyes pontok négy egérből származó hosszanti és keresztirányú mérések átlagát jelentik ± standard deviációt. A méréseket a tumorsejtek injektálása után a 12., 19., 26. és 33. napon végeztük.
1. táblázat
Tumor átlagos átmérője (mm-ben)
Minta | 12. nap | 19. nap | 26. nap | 33. nap |
100% nem fertőzött | 4,1±0,6 | 4,9±0,8 | 5,9±0,5 | 6,3±0,6 |
100% AdV-IFN | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
10% AdV-IFN | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
3% AdV-IFN | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
1% AdV-IFN | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
0,3% AdV-IFN | 2,8±0,2 | 2,9+0,3 | 3,0±0,6 | 1,8±2,0 |
100% AdV-lacZ | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
10% AdV-lacZ | 4,8+0,4 | 5,2±0,6 | 6,2±0,5 | 6,5±0,5 |
3% AdV-lacZ | 4,3±0,5 | 4,6±0,6 | 5,8±0,8 | 6,5±1,0 |
1% AdV-lacZ | 4,3±0,4 | 4,6±0,6 | 5,0±0,5 | 6,3±0,9 |
0,3% AdV-lacZ | 4,4±0,5 | 4,7±0,6 | NA | NA |
HU 224 422 Β1
A tumorfejlődés azokban az egerekben teljesen blokkolódott, amelyek már 1% H5.110h/F/Vp-val transzdukált sejteket kaptak (1. táblázat). A sejtek injektálása utáni első héten nagyon kevés, kisméretű tumort lehetett detektálni (érzékelhető, de méréshez nem elég nagy) azokban az egerekben, amelyeket 10,3 és 1% H5.110h/FNp-val injektáltunk. Azonban ezen valamennyi kisméretű tumor teljesen visszafejlődött a 9. napra. Ez alapján feltételezzük, hogy néhány sejt rövidebb ideig túlélt, és ezalatt ΙΕΝ-β-gént expresszált, amely a teljes tumor pusztulásához vezetett. Ezen sejtvonal alkalmazásával, meztelen egereken végzett néhány kísérletben soha nem figyeltünk meg tumorképződést abban az esetben, amikor a sejtek 1%-át transzdukáltuk H5.110b/F/Vp-val, és 100%-os volt a túlélés (az adatokat nem mutatjuk be). Azokban az egerekben, amelyek 0,3% H5.110/?/FA/p-val transzdukált sejteket kaptak, tumorok fejlődtek, azonban a tumorok mérete szignifikánsan kisebb volt, mint a kontrollegerekben, és ebben a 0,3%-os csoportban 5 egérből 2ben teljesen visszafejlődött a tumor a 33. napra (1. táblázat).
Ezzel ellentétben, azokban az egerekben, amelyek 10% és 0,3% közötti H5.110/acZ-vel kezelt sejteket kaptak, hasonló méretű tumorok fejlődtek ki, mint a nem fertőzött sejtekkel kezelt csoportban, és nem figyeltünk meg tumorregressziót egyik kontrollcsoportban sem (1. táblázat).
Nyilvánvaló, hogy humán béta-interferon (hlFN-β) expressziója a sejteknek csak nagyon kis részében blokkolta a tumorgenezist meztelen egerekben. A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy H5.110ft/F/Vp-val fertőzött sejteket alkalmazva melyik az a legalacsonyabb arány, amely tumorképződésre (nem feltétlenül blokkolására) és az egér túlélésére hatással van. Azonos számú, 0,3%, 0,1%, 0,03%, 0,01% és 0% H5.110h/FNp-val fertőzött sejteket tartalmazó MDA-MB-468-sejteket implantáltunk meztelen egerekbe, és követtük a tumor növekedését. A 0,3%-kal vagy 0,1%-kal fertőzött sejteket kapott egerekben sokkal kisebb méretű tumorok fejlődtek a nem fertőzött sejteket kapott egerekhez képest (1 A. ábra). A 0,3% és 0,1% transzdukció esetén 5-ből 3, illetve 5-ből 1 tumor teljesen visszafejlődött. A 0,3%-kal és 0,1%-kal transzdukált csoportban szignifikánsan meghosszabbodott túlélést figyeltünk meg. Miközben 0%-kal, 0,01%-kal vagy 0,03%-kal fertőzött sejtek valamennyi állatban pusztulást eredményeztek 75 napon belül, a 0,1%-kal és 0,3%-kal fertőzött csoportokban 5-ből 1, illetve 5-ből 3 állat tumorok nélkül életben maradt a kísérlet 109. napon való befejezésekor (1B. ábra).
Valószínű, hogy az összes tumorsejtnek csak kis részét (több mint 0,3%-át, előnyösen körülbelül 1,0%-ánál nagyobb részét) szükséges transzfektálni vagy infektálni a hatékonyság céljából. Ez eltér az ilyen rákellenes génterápiákban alkalmazott megközelítésektől, például vad típusú tumorszuppresszorok (például p53) célba juttatásától, amelyekben szükséges, hogy a tumorban lévő minden sejt megkapja a tumorszuppresszorgént.
Tehát kimutattuk az interferongén in vivő antiproliferatív hatását, in vitro fertőzés után. A kontrollok azt mutatják, hogy ez a hatás inkább az interferonnak tulajdonítható, mint az adenovírusnak.
Ex vivő IFN-fi-gén-terápia más humán xenografttumorokban
A H5.110hlFNp-transzdukció hatását más tumorsejttípusokra is teszteltük ex vivő humán xenograftmodellben. KM12L4A jelű, humán vastagbél-karcinómából származó sejteket, Huh7 jelű, humán májkarcinómából származó sejteket vagy ME180 jelű, humán cervikális karcinómából származó sejteket transzdukáltunk H5.110h/F/\^-val. Azonos számú, 10%, 1% vagy 0% transzdukált sejtet tartalmazó sejtet teszteltünk arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben képesek tumorokat létrehozni meztelen egerekben. A három típusú, nem fertőzött sejtek injektálása tumorok gyors növekedését okozta valamennyi egérben. Ezzel ellentétben, 10% Ηδ.ΙΙΟΛ/ΕΛ/β-νθΙ fertőzött sejt bevitele esetén nem fejlődött ki tumor, vagy lassan növekvő tumorok késleltetve jelentek meg valamennyi vizsgált állatban (2A. ábra). Az MDA-MB-468-sejtekkel kapott eredményektől eltérően, amelyekben H5.11O/7/F/\^-val végzett 1 %-os transzdukció teljesen megakadályozta a tumor kialakulását, ezen három sejttípus 1%-os transzdukciója tumorok kialakulását eredményezte, bár méretük kisebb volt, mint a nem fertőzött kontroliokban, minden egyes időpontban. 10% és 1% transzdukált sejtet kapott egerek túlélése meghosszabbodott azokhoz képest, amelyek nem fertőzött sejteket kaptak (2B. ábra). Tehát, adenovírussal médiáit, ex vivő ΙΕΝ-β-gén célba juttatása több különböző tumorsejtbe a tumorgenitás hatékony gátlását eredményezte, és az állatok túlélési idejének növekedéséhez vezetett.
4. példa
In vivő génterápia béta-interferon-1 a-génnel
Az ex vivő megközelítés helyett közvetlen, in vivő génterápiát végeztünk. In vivő génterápiában a gént közvetlenül beadjuk a páciensbe. Ebben a példában humán ΙΕΝ-β-gént tartalmazó adenovírust (H5.1 tOhlFNfi) közvetlenül szilárd tumorokba injektálunk. Röviden összefoglalva, 2«106 MDA-MD-468 jelű, humán mellkarcinómasejtet injektáltunk szubkután ötven meztelen egér hátába. Körülbelül 5-6 mm átmérőjű, szubkután tumorok képződtek meztelen egerekben MDA-MB-468-sejtek szubkután injekciója után 24 nappal. Ekkor a tumorokat PBS-sel vagy H5.110hlFN$- és H5.110/3cZ-vektorok különböző dózisaival kezeltük 1«107 és 3«109 pfu/egér közötti tartományban, egyetlen intratumorális injekcióval.
A 3. ábrán bemutatott adatok azt mutatják, hogy 14 napon belül egyetlen, 3«109, 1«109 vagy 3« 10® totál pfu dózist tartalmazó kezelés H5.110hlFNfi-vai a tumor regresszióját okozta. A tumor teljes regressziója történt 5 egérből 4-ben a 3«109 pfu csoportban, és 5 egérből 3 állatban az 1«109 pfu csoportban. 1«109 pfu H5.11OhIFNfi-val injektált tumorokban magas, körülbelül 1500 lU/ml lokális IFN^-koncentrációt lehetett detektálni, míg a szérumban csak 37 lU/ml ΙΕΝ-β-kon20
HU 224 422 Β1 centrációt lehetett detektálni. Alacsonyabb, például 1*10®, 3*107 és 1*107 pfu H5.110/7/F/\/p-dózisoknak kis hatásuk volt, vagy nem volt hatásuk (3. ábra, és az adatokat nem mutatjuk be), ami azt mutatja, hogy az antitumorválasz dózisfüggő. PBS vagy H5.110/acZ injektálása azonos dózisban nem vezetett tumorregresszióhoz (3. ábra). Ha a tumorokat hosszabb ideig követtük, lassú növekedést és visszafejlődést figyeltünk meg néhány egyedi, 3*109 pfu H5.H0/acZ-vel injektált tumorban, ami alapján feltételezzük, hogy a kontrolivírus ekkora dózisban a tumornövekedés gyenge gátlását okozhatja. Kezelés 3*109, 1*109 vagy 3*10® pfu H5.110/)/F/Vp-val szignifikánsan megnövelte a túlélést a PBS-sel vagy H5.H0/acZ-vel való kezelt egerekhez képest (az adatokat nem mutatjuk be). Több injekciót is teszteltünk, 5 injekció 1*10® pfu H5.110h/F/Vp, melyeket minden harmadik napon adtunk kifejlődött MDA-MB-468- és HeLa-tumorokba, mindkét tumortípus lassúbb növekedését és visszafejlődését eredményezte (nem közöltük). Hasonló in vivő kísérletet végeztünk U87 jelű, humán gliomasejtvonallal. Ezek a sejtek nagyon érzékenyek IFN-p-ra, mivel a tumor teljes visszafejlődését láttuk 4 egérből 4-ben, melyeket 1*109 pfu H5.110/j/FNp-val kezeltünk, és 4 egérből 2-ben, melyeket 1*10® pfu-val kezeltünk (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IFN-p-gén adenovírussal való közvetlen és lokális in vivő célba juttatása szignifikáns antitumorhatást képes kifejteni.
Négy nappal 1*109 pfu vírus injektálása után az MDA-MB-468-tumorokat elkülönítettük hisztológiai vizsgálat céljából. Ekkor a H5.110/7/F/Vp-val injektált tumorok regresszió jeleit mutatták. MDA-MB-468-tumorok hisztológiai analízisét hematoxilin-eozinos festéssel végeztük. Több apoptotikus sejtet figyeltünk meg a H5.110/?/FA/p-val injektált tumorokban, mint a H5.110/acZ-vel injektált tumorokban. Az apoptózist végükön megjelölt, fragmentált genomi DNS direkt immunfluoreszcens detektálásával igazoltuk. Nagyon kevés infiltráló, mononukleáris sejtet figyeltünk meg a H5.110/?/FNp-val vagy H5.110/acZ-vel injektált tumorokban, ami azt mutatja, hogy a celluláris immunválasz nem játszik fontos szerepet a H5.110/r/FWp-val irányított tumorregresszióban, ebben a modellben.
A fentebb bemutatott ex vivő és in vivő kísérletek egyaránt az interferonnak csak közvetlen antiproliferatív hatását mérték. Mivel ezek immunhiányos egerek voltak, immunstimulátor-aktivitás, amellyel az interferon rendelkezik, és amely a tumor pusztulását stimulálhatja, nincsen jelen. Mivel az interferonok fajspecifikusak is, azaz nem vihetők át emberből egérbe, nem várható, hogy ezekben az egerekben humán ráksejtek gátlására alkalmazott humán IFN-p-angiogenezist gátol, mivel a humán IFN-β nem hat egér vaszkuláris endotél sejtjeire. Ennélfogva még drámaibb rákellenes aktivitást is létrehozhatnánk, ha humán pácienseket humán IFN-p-val rendelkező adenovírussal kezelünk. Ezt immunkompetens, nem humán főemlősökben lehet modellezni. Más módszer szerint rágcsálóból származó IFN-p-gént adenovírust lehet alkalmazni immunkompetens, rágcsálóeredetű tumorokkal rendelkező egerekben. Sok ilyen szingenikus egértumormodell áll rendelkezésre.
A leírásban ismertetett adatok azt mutatják, hogy az IFN-p-gén-terápia figyelemre méltó képességgel rendelkezik tumorok de novo képződésének blokkolására, valamint kialakult tumorok visszafejlődését képesek kiváltani. Az ex vivő transzdukciós kísértetek igazolták, hogy potenciálisan szekretálható fehérje bevitele már 0,3%-1,0% transzdukált sejtbe már blokkolta MDA-MB-468-tumorok kialakulását. Sokféle más tumorsejtvonalat teszteltünk, és míg az IFN-β hatása változó volt, valamennyit blokkolni lehetett 1-10% IFN-p-val transzdukált sejtekkel. Arra alapozva, hogy viszonylag kis százalékban alkalmazott IFN-p-t szekretáló sejt szükséges a tumorképződés befolyásolásához, előzőleg kialakult tumorokat fertőztünk adenovírusok közvetlen intratumorális injekciójával. Az IFN-p-gén-bevitel hatása egyetlen vírust tartalmazó injekcióval ismételten döntő volt, amely a tumorok részleges vagy néhány esetben teljes visszafejlődését eredményezte.
Ezekben a kísérletekben úgy tűnt, hogy a tumorok drámai regressziója az IFN-β közvetlen antiproliferatív vagy citotoxikus aktivitásának eredménye. Ezt a következtetést alátámasztja az a tény, hogy ezekben a kísérletekben alkalmazott IFN-p-gén humán eredetű, és humán IFN-β nem keresztreagál észrevehetően az egér-gazdaszervezet sejtjeivel. Az alkalmazott immunhiányos meztelen egerek nem tartalmaztak T-limfocitákat sem, amely egy fontos effektorsejt az I. típusú, IFN-indukált immunstimulációban [Tough, D. F. et al., Science 272, 1947-1950 (1996), és Rogge, L. et al., J. Exp. Med. 185, 825-831 (1997)]. Továbbá az IFN-p-gén-bevitelt követően, a gyorsan visszafejlődő tumorokban nem figyeltünk meg egyértelmű növekedést az infiltráló mononukleáris sejtek számában. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elképzelést, hogy az IFN-p-mediált antiproliferatív aktivitás egymagában elégséges tumorregresszió kiváltására. Úgy tűnik, hogy adataink összhangban vannak a korábban megfigyelt klinikai összefüggéssel, amelyet malignus sejtek IFN-indukált antiproliferatív aktivitásra mutatott in vitro érzékenysége és az in vivő terápiás hatás között figyeltek meg [Einhorn és Grander, J. Interferon Cytokine Rés. 16, 275-281 (1996)].
Összefoglalva, azt találtuk, hogy adenovírussal médiáit IFN-p-génterápia hatékony antitumorális hatást fejthet ki egérmodellekben. IFN-p-gén ex vivő bevitele a sejtek nagyon kis százalékába elegendő volt a tumorképződés blokkolására, és egyetlen dózist tartalmazó, közvetlen intratumorális IFN-p-gén-bevitel kialakult tumorok visszafejlődéséhez vezetett. Anélkül, hogy bármilyen hatástani elmélethez kötődnénk, kijelenthetjük, hogy ez a potenciális antitumorhatás az IFN-β autokrin és parakrin hatásából származhat. Ez az antitumorhatás döntő faktor lehet génterápiát alkalmazó, rákkezelést célzó klinikai kísérletekben, amelyekben a génbevitel foka valószínűleg limitált, és szignifikáns „bystander’-hatásra (azaz a szomszédos sejtek hatására, amelyek tartalmazzák a gént és szekretálják a fe21
HU 224 422 Β1 hérjét) van szükség. Ennélfogva, lokális IFN-p-gén-terápia ígéretes stratégiát biztosít emberekben kialakuló tumorok kezelésére.
Ekvivalensek
Nyilvánvaló, hogy a fentebb leírtakkal csak a találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjait ismertetjük részletesen. Szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző módosításokat és ekvivalens megoldásokat lehet létrehozni anélkül, hogy az eltérne a találmányi gondolattól és az igényelt oltalmi körtől.
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Az adenovírusvektorok, lentivírusvektor, baculovírus-vektor, Epstein-Barr-vírusvektor, papovavírus-vektor, vacciniavírus-vektor és herpes simplex vírusvektor által alkotott csoportból választott, egy interferon-béta-fehérjét kódoló gént kifejeződésre képesen tartalmazó vírusvektor alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a vírusvektor egy adenovírusvektor.
- 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az adenovírusvektor E1-génjében deléció van.
- 4. Az adenovírusvektorok, lentivírusvektor, baculovírus-vektor, Epstein-Barr-vírusvektor, papovavírus-vektor, vacciniavírus-vektor és herpes simplex vírusvektor által alkotott csoportból választott, egy interferon-béta-fehérjét kódoló gént kifejeződésre képesen tartalmazó, replikációdefektív vírusvektor alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a vírusvektor egy adenovírusvektor.
- 6. Az 5. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben az adenovírusvektor E1-, E2a- és/vagy E4-génjében deléció van.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás a vírusvektor injekcióval közvetlenül a tumorba vagy közelébe történő, helyi, intraokuláris, inranazális, intratracheális, intrabronchiális és szubkután beadására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás a vírusvektor parenterális beadására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás az intravénás beadás, intramuszkuláris beadás és intraperitoneális beadás közül választható parenterális beadásra szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 10. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás a malignáns glioma, melanoma, haemangioma, leukémia, limfóma, myeloma, colorectalis rák, nem kissejtes karcinóma, mellrák és petefészekrák által alkotott csoportba tartozó rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a gén humán béta-interferonfehérjét kódol.
- 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amelyben a gyógyszerkészítmény markergént kódoló nukleinsavtól mentes.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5725497P | 1997-08-29 | 1997-08-29 | |
PCT/US1998/017606 WO1999010516A2 (en) | 1997-08-29 | 1998-08-25 | Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0002913A2 HUP0002913A2 (hu) | 2000-12-28 |
HUP0002913A3 HUP0002913A3 (en) | 2003-08-28 |
HU224422B1 true HU224422B1 (hu) | 2005-08-29 |
Family
ID=22009467
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0002913A HU224422B1 (hu) | 1997-08-29 | 1998-08-25 | Eljárások és készítmények szekretált fehérjéket, például béta-interferont kódoló géneket alkalmazó terápiára |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1007717B8 (hu) |
JP (3) | JP4124565B2 (hu) |
KR (1) | KR100699285B1 (hu) |
CN (1) | CN100342019C (hu) |
AT (1) | ATE316145T1 (hu) |
AU (1) | AU740428B2 (hu) |
BR (1) | BR9812138A (hu) |
CA (1) | CA2300480C (hu) |
CY (1) | CY1105029T1 (hu) |
CZ (2) | CZ299095B6 (hu) |
DE (1) | DE69833264T2 (hu) |
DK (1) | DK1007717T3 (hu) |
EA (1) | EA003256B1 (hu) |
EE (1) | EE04873B1 (hu) |
ES (1) | ES2257817T3 (hu) |
HK (1) | HK1029599A1 (hu) |
HU (1) | HU224422B1 (hu) |
IL (2) | IL134593A0 (hu) |
IS (1) | IS2318B (hu) |
NO (1) | NO20000990L (hu) |
NZ (1) | NZ503401A (hu) |
PT (1) | PT1007717E (hu) |
SK (1) | SK286821B6 (hu) |
TR (1) | TR200000532T2 (hu) |
WO (1) | WO1999010516A2 (hu) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2283524T3 (es) * | 2001-01-22 | 2007-11-01 | Biogen Idec Ma Inc. | Metodo para mejorar el suministro de un acido nucleico terapeutico. |
US8058248B2 (en) * | 2001-04-26 | 2011-11-15 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Foot and mouth disease virus vaccine comprising interferons |
CN1388248A (zh) * | 2001-05-25 | 2003-01-01 | 钱其军 | 高效表达干扰素的肿瘤细胞内特异性增殖的腺病毒及其构建方法 |
EP1835032A1 (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-19 | Université de Liège | A self-inactivating recombinant lentiviral vector for the inhibition of HIV replication |
MD23Z (ro) * | 2008-12-02 | 2010-01-31 | Василе ЖОВМИР | Metodă de tratament diferenţiat al carcinomului lobular in situ neinvaziv al glandei mamare |
MD36Z (ro) * | 2008-12-02 | 2010-01-31 | Василе ЖОВМИР | Metodă de tratament diferenţiat al carcinomului ductal in situ neinvaziv al glandei mamare |
MD35Z (ro) * | 2008-12-02 | 2010-01-31 | Василе ЖОВМИР | Metodă de apreciere a riscului dezvoltării carcinomului neinvaziv in situ al glandei mamare |
MD24Z (ro) * | 2008-12-02 | 2010-01-31 | Василе ЖОВМИР | Metodă de tratament diferenţiat al carcinomului neinvaziv al glandei mamare |
CN103505722B (zh) * | 2012-06-19 | 2016-04-13 | 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 | 干扰素在治疗/预防对常规抗肿瘤疗法有抗性的肿瘤中的用途及相关的产品和方法 |
WO2017214706A1 (en) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Tissue Regeneration Therapeutics Inc. | Anti-cancer use of genetically modified human umbilical cord perivascular cells (hucpvc) |
WO2020247321A1 (en) * | 2019-06-01 | 2020-12-10 | Sivec Biotechnologies, Llc | A bacterial platform for delivery of gene-editing systems to eukaryotic cells |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2122519C (en) * | 1994-04-29 | 2001-02-20 | Rudolf Edgar Dr. Falk | Cancer treatment and metastasis prevention |
DE69531387T2 (de) * | 1994-08-16 | 2004-04-22 | Crucell Holland B.V. | Von Adenovirus abgeleitete rekombinante Vektoren, für Gentherapie |
US5952221A (en) * | 1996-03-06 | 1999-09-14 | Avigen, Inc. | Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence |
-
1998
- 1998-08-25 DE DE69833264T patent/DE69833264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 DK DK98944526T patent/DK1007717T3/da active
- 1998-08-25 AT AT98944526T patent/ATE316145T1/de active
- 1998-08-25 CZ CZ20060489A patent/CZ299095B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 IL IL13459398A patent/IL134593A0/xx active IP Right Grant
- 1998-08-25 TR TR2000/00532T patent/TR200000532T2/xx unknown
- 1998-08-25 PT PT98944526T patent/PT1007717E/pt unknown
- 1998-08-25 ES ES98944526T patent/ES2257817T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 WO PCT/US1998/017606 patent/WO1999010516A2/en active IP Right Grant
- 1998-08-25 CN CNB988094878A patent/CN100342019C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-25 SK SK248-2000A patent/SK286821B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 BR BR9812138-3A patent/BR9812138A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-08-25 AU AU92051/98A patent/AU740428B2/en not_active Ceased
- 1998-08-25 EA EA200000270A patent/EA003256B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 CZ CZ20000733A patent/CZ297314B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 HU HU0002913A patent/HU224422B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 CA CA002300480A patent/CA2300480C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-25 KR KR1020007002157A patent/KR100699285B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 EP EP98944526A patent/EP1007717B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-25 EE EEP200000102A patent/EE04873B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 NZ NZ503401A patent/NZ503401A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-08-25 JP JP2000507824A patent/JP4124565B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-11 IS IS5374A patent/IS2318B/is unknown
- 2000-02-17 IL IL134593A patent/IL134593A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-02-28 NO NO20000990A patent/NO20000990L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-12-07 HK HK00107877A patent/HK1029599A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-12-10 JP JP2003412621A patent/JP3953458B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-23 JP JP2005085060A patent/JP4219335B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-04-17 CY CY20061100525T patent/CY1105029T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4219335B2 (ja) | インターフェロンβのような分泌タンパク質をコードする遺伝子を使用する治療のための方法および組成物 | |
Mastrangeli et al. | Direct in vivo adenovirus-mediated gene transfer to salivary glands | |
AU722042B2 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer | |
US6210939B1 (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
NZ275956A (en) | A recombinant adenovirus expression vector useful against tumours | |
US6696423B1 (en) | Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta | |
US5831062A (en) | Use of the human interferon consensus gene for gene therapy | |
US20040266006A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
Acsadi et al. | Interferons impair early transgene expression by adenovirus-mediated gene transfer in muscle cells | |
WO1997016547A1 (en) | ADENOVIRUS-ANTISENSE K-ras EXPRESSION VECTORS AND THEIR APPLICATION IN CANCER THERAPY | |
WO1997016547A9 (en) | ADENOVIRUS-ANTISENSE K-ras EXPRESSION VECTORS AND THEIR APPLICATION IN CANCER THERAPY | |
EP1679375A1 (en) | Methods and compositions for cancer therapies using genes encoding interferon-beta | |
MXPA00002101A (es) | Metodos y composiciones para terapias que utilizan genes que codifican proteinas secretadas como beta-interferon | |
US20090175825A1 (en) | Interferon alpha and antisense k-ras rna combination gene therapy | |
WO2000050618A1 (fr) | Vecteur viral | |
US20030223962A1 (en) | Delivery of gene products to the lung parenchyma via gene transfer to the pleura | |
US20020137212A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050720 |
|
MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |