JP2001504515A - 変形ａ環を有するアシアト酸誘導体 - Google Patents

変形ａ環を有するアシアト酸誘導体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、式(1)で表される変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体、及びこれを活性成分として含む抗ガン剤、及び肝機能保護剤に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体 技術分野 本発明は式１で表示される変形Ａ環を有するアシアト酸(asiaticacid)誘導体 、及びこれを活性成分として含む抗ガン剤、及び肝機能保護剤に関するものであ る。 式１ （式中、R1は炭素数1〜4の低級アルキル基、炭素数1〜4のアルコキシ基、ヒドロ キシメチル基、ハロメチル基、エタンジチオールで保護されても良いアルデビド 基を表し；R2は炭素数1〜4の低級アルキル基、t-ブチルジメチルシリルオキシメ チル基、ハロメチル基、-CH2OCO(CH2)nCO2H(n=0〜3)、-CH2OCOCHCHC6H5、アセチ ル基又はベンゾイル基で保護されても良いヒドロキシメチル基を表し;R3は水素 又はメチル基を表し；２位の二重結合は還元され、単一結合になっていてもよい 。） 背景技術 これらのアシアト酸誘導体は、アシアト酸又はアシアト酸メチルエステルのＡ 環を変形して製造される。このような変形はアシアト 酸の構造式を決定するために、すでに行われており、報告されている。[B.Singh and R.P.Rastogi,Phytochemistry,8,917-921,1969]。アシアト酸、アシアチコ サイド（アシアト酸の３糖類）及びマデカス酸はCentella asiaticaから抽出さ れる化合物として1941年Bantems等によって初めて分離され[J.E.Bontems，Bull ．Sci．Pharmacol.，49,186-96(1941)]、Polonsky等によって構造が決定された[ J.Polonsky,compt，Rend.，232，1878-80(1951)：J．Polonsky，Bull．Soc．Chi m.，173-80(1953)]。 アシアト酸及びアシアチコサイドを含むCentella asiaticaの抽出物は、古く から傷んだ皮膚または慢性潰瘍等の治療に使われてきており、結核やらい病によ る皮膚の変形治療にも使われている[P.Boiteau，A．Buzas，E．Lederer and J． Polonsky，Bull．Soc．Chim.，31，46-51,(1949)]。 最近では、植物から分離されたアシアト酸と類似構造を有する種々のトリテル ペン、特にウルソール酸(Ursolic acid)は、細胞毒性に効果があることが報告さ れている。[K．Yasukawa，Oncology，48,72-76(1991)；Dominic，Y．Alex，Med ，Sci．Res.，21(5)，213-215(1993)；Ryu，ShiYoung，Arch．Pharamacal Res. ，17(5)，375-7(1994)]。またしらかば(White birch)の樹皮から分離した前駆体 から簡単に合成できるベツリン酸(Betulinic acid)は特異な副作用がなく黒色腫 の細胞に対して細胞毒性を表すことが報告されている。[Nat.Med.，１，1046(19 95)]。 発明の開示 本発明者らは様々な医学的用途を持つ新しい製薬組成物を開発するために鋭意 研究した結果、Centella asiaticaから得られるアシアト酸を出発物質として、 変形したＡ環を有する様々な誘導体を合成し、これらが細胞毒性及び肝保護機能 を有していることを知り本発明を完成させた。 本発明の目的はアシアト酸誘導体を提供することにある。 本発明は一般式１で表されるアシアト酸誘導体、及びこれを活性成分として含 む抗ガン剤及び肝機能保護剤に関するものである。 式１（式中、R1は炭素数1〜4の低級アルキル基、炭素数1〜4のアルコキシ基、ヒドロ キシメチル基、ハロメチル基、エタンジチオールで保護されても良いアルデビド 基を表し；R2は炭素数1〜4の低級アルキル基、t-ブチルジメチルシリルオキシメ チル基、ハロメチル基、-CH2OCO(CH2)nCO2H(n=0〜3)、-CH2OCOCHCHC6H5、アセチ ル基又はベンゾイル基に保護されてもよいヒドロキシメチル基を表し;R3は水素 又はメチルを表し；２位の二重結合は還元されて単一結合になっていてもよい。 ） 本発明に係る変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体の製造方法を以下に説明する 。 方法１ 1)アシアト酸(2)をジアゾメタンで処理し、メチルアシアテート(3,R3＝メチル) を定量的に得、これを酸化させＡ環が変形したラクトール構造の化合物(4，R3＝ メチル)を生成させる。この化合物を触媒量の酢酸／ピペリジンで処理し、メチ ル A(1)-ノルウルサ-2，12-ジエン-23-ヒドロキシ-２-ホルミル-28-オエート(5 ，R3＝メチル)を得る。（スキーム式１参照） 2)上記と同様にアシアト酸(2)を利用しラクトール構造を持った化合物(4，R3＝H )を得、得られた化合物を酢酸／ピペリジンの触媒で処理し、Ａ環が変形した化 合物 Ａ(1)−ノルウルサ-2，12-ジエン-23-ヒドロキシ-２-ホルミル28-カルボ ン酸(5，R3＝H)を製造する。（スキーム式１参照） スキーム１方法２ 上記で得られた化合物(5)を触媒の存在下に、R4COOHでエステル化することに よって、一般式(6)で表される化合物を製造する（スキーム式２参照） スキーム２ ［式中、R4は(CH2)nCO2H(n=0〜3)、CHCHC6H5またはC6H5を表す。］ 方法３ 上記で得られた化合物(5)をt-ブチルジメチルシリルクロリドとイミダゾール で処理し、23-OH基が保護された一般式(7)の中間体を得る。得られた化合物のア ルデヒド基を還元して、一般式(8)の化合物を得たのちハロゲン化させ、一般式( 9)の中間体を生成させる。 一般式(9)の中間体化合物を還元剤で処理し、かつ還流下で加熱して、一般式( 10)の化合物を得たのち、この化合物のシリル基をフッ化テトラブチルアンモニ ウムで除去して本発明に係る新規化合物である一般式(11)の化合物を得る。（ス キーム式３参照） スキーム３ 方法４ 上記で得られた化合物(5)のアルデヒド基を還元し本発明に係る新規化合物で ある一般式(12)の化合物を得たのち、これをハロゲン化剤で処理して一般式(13) の化合物を生成させる。 上記で得られた一般式(13)の化合物を還元剤で処理し、還流下で加熱して本発 明に係る新規化合物である一般式(14)の化合物を生成させる。（スキーム式４参 照） スキーム４方法５ 上記で得られた一般式(5)の化合物の23-水酸(OH)基を、アセチル化して保護化 合物、一般式(15)の化合物を得たのち、ジエチルアミンサルファートリフルオラ イド(diethylamine sulfar trifluoride)で処理して本発明に係る新規化合物で ある一般式(16)の化合物を得る。また、上記で得られた一般式(15)の化合物を還 元させ、一般式(17)の化合物を生成させ、続いてジエチルアミンサルファートリ フルオライドで処理して新規化合物、一般式(18)の化合物を得る。（スキーム式 ５参照） スキーム５方法６ 上記で得られた一般式(12)の化合物を還元して、新規化合物、一般式(19)の化 合物を生成させる。（スキーム式６参照）スキーム６ 方法７ 上記で得られた一般式(5)の化合物をエタンジチオールで処理し、チオアセタ ールで保護された化合物(20)を得る。化合物(20)を、ラネーニッケル(Raney Ni )で還元して、本発明の新規化合物である一般 式(21)の化合物を生成させる。（スキーム式７参照） スキーム７方法８ 上記で得られた一般式(8)の化合物のOH基をメチル化して、一般式(22)の化合 物を得たのち、フッ化テトラブチルアンモニウムを用いて、シリル基を取り除い て、一般式(23)の化合物を得る。（スキーム式８参照） スキーム８ 一般式(1)の化合物の投与量は、抗ガン剤としては成人１日0.01〜1000mg、肝 保護剤としては0.05〜50mgである。また投与容量は症状の程度とともに通常、患 者の年齢及び体重に依存する。 本発明に係る抗ガン剤及び肝保護剤は、公知の方法を採用して、 経口投与または非経口投与に適する形態に製剤される。即ち、経口投与の場合に は錠剤、カプセル剤、溶剤、シロップ剤、懸濁剤などとして製剤され、非経口投 与の場合には経皮または皮下注射あるいは腹腔または筋肉に対する注射剤として 製剤される。 発明を実施するための最良の形態 以下に実施例、実験例、製剤例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれら の例に限定されるものではない。 実施例１：メチルアシアテート(3)の製造 アシアト酸(500mg)をメタノール(25ml)に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却 した。過量のジアゾメタン／エーテル溶液を加え、混合物を室温で１時間撹拌し た。溶媒を減圧濃縮して除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー(分離溶媒： ジクロロメタン：メタノール＝30:1)で精製し490mg(収率：95％)の白色の固体を 生成させた。生成物を酢酸エチルで再結晶し、針状の結晶を得た。 実施例２：化合物(4，R3＝メチル)の製造 メチルアシアテート(1000mg，1.99mmol)をメタノール：水=20:1に溶かした後 、NaIO4(645.6mg)を入れ、室温で得られた混合物を３時間程撹拌した。溶媒を減 圧下濃縮して除去し、残渣を酢酸エチルで希釈、洗浄、乾燥した。ろ過後、ろ液 を減圧下濃縮して生成した残渣をカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン： メタノール＝50:1)で分離し、白色の固体790mgを生成させた。（収率：79.3％） 化合物(4，R3＝H)の製造 メチルアシアテートの代わりにアシアト酸を使用した以外は、実施例２と同じ 製造方法を用いた。（収率：72.8％） 実施例３：メチルA(1)-ノルウルサ-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-2- ホルミル28-オエート(5，R3＝メチル)の製造 化合物(4，830mg，1.66ml)を減圧下で乾燥した後、窒素置換して無水ベンゼン に溶解した。そこに酢酸(20ml)とピペリジン(20ml)を添加した。得られた溶液を 約１時間60℃で加熱還流させた。１時間後、無水硫酸マグネシウムを加え約５時 間加熱還流した後、溶媒を減圧下で蒸留除去し、残渣を酢酸エチルで希釈、洗浄 、乾燥した。ろ液を減圧下で濃縮したのち、カラムクロマトグラフィー(ジクロ ロメタン：メタノール=80:1)で分離精製し、白色の固体580mgを生成させた。（ 収率：72.5％） 実施例４：メチルA(1)-ノルウルサ-2,12-ジエン-23-アルキルカルボニルオキ シ-2-ホルミル28-オエート(6，R4＝-C2H4CO2H)の製造 化合物(5，31.5mg，0.065ml)、コハク酸(succinicacid，8.49ml)、1,3-ジシク ロヘキシルカボイミド(14.98mg)、4-ジメチルアミノピリジン(0.80mg)を減圧下 で乾燥した後、アルゴンで置換し、無水ジクロロメタンに溶解し、室温で約22時 間撹拌した。反応液をろ過し、ろ液を希塩酸、水、飽和食塩水で洗浄、乾燥した 。ろ液を減圧下で乾燥し、カラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノ ール＝ 20:1)で分離精製し、17.3mgを得た。（収率：45.5％） 化合物(6，R4＝-C3H6CO2H) コハク酸の代わりにグルタル酸を使用した以外は、実施例４と同じ製造方法を 用いた。（収率：51.2％） 化合物(6，R4＝-CHCHC6H5) コハク酸の代わりにケイ皮酸を使用した以外は、実施例４と同じ製造方法を用 いた。（収率：73.0％） 化合物(6，R4＝-C6H5) コハク酸の代わりに安息香酸を使用した以外は、実施例４と同じ製造方法を用 いた。（収率：60.l％） 実施例５：メチルA(1)-ノルウルサ-2,12-ジエン-23-O-t-ブチルジメチルシリ ル-2-ホルミル28-オエート(7)の製造 上記で得られた化合物(5，50mg，0.104mmol)とイミダゾール(24.8mg)、t-ブチ ルジメチルシリルクロリド(62.7mg)を減圧下で乾燥した後、アルゴンで置換した 。得られた混合物を無水ジクロロメタンに溶解し、室温で６時間撹拌した。溶媒 を減圧下で蒸留除去した。残渣を酢酸エチルで希釈、洗浄、乾燥し、ろ過した。 ろ液を減圧下で乾燥し、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル＝10: 1) で分離精製して、透明なオイル状の化合物56.2mgを得た。（収率：90.7％） 実施例６：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル-2,12-ジエン-23-O-t- ブチルジメチルシリル-28-オエート(8)の製造 上記で得られた化合物(7，91.7mg，0.154mmol)と水素化ホウ素ナトリウム(sod ium borohydride 11.9mg)を減圧下で乾燥後、アルゴンで置換した。得られた混 合物に無水メタノールを入れて溶解し、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で 蒸留除去し、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル=15:1)で分離精 製し、91.4mgの化合物を得た。（収率：99.3％） 実施例７：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ブロモメチル-2,12-ジエン-23-O-t-ブチ ルジメチルシリル-28-オエート(9，R5=Br)の製造 上記で得られた化合物(8，54mg，0.090mmol)とPPh3(35.8mg)、四臭化炭素(45. 2mg)を減圧下で乾燥した後、アルゴンで置換した。得られた混合物を無水ジクロ ロメタンに溶かし、室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸留除去し、残渣 を酢酸エチルで希釈、洗浄、乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラム クロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル＝20:1)で分離精製し、化合物53.7mg を得た。（収率：90％） 実施例８：メチルA(1)-ノルウルサ-2-クロロメチル-2,12-ジエン-23-O-t-ブチ ルジメチルシリル28-オエート(9，R5＝C1)の製造 上記で得られた化合物(8，10.3mg，0.017mmol)を減圧下で乾燥した後、アルゴ ンで置換した。得られた混合物を無水ジクロロメタンに溶解し、０℃でピリジン (1.38μ1)とSOCl2(3.76μl)を添加し、24時間撹拌した。少量の水を添加し、さ らに溶媒を減圧下で蒸留除去した。残渣を酢酸エチルで希釈、洗浄、乾燥した。 ろ液を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル＝30: 1)で分離精製し、化合物0.6mgを得た。（収率：5.7％） 実施例９：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヨードメチル-2,12-ジエン-23-O-t-ブチ ルジメチルシリル-28-オエート(9，R5＝I)の製造 上記で得られた化合物(8，3lmg，0.052mmol)を減圧乾燥後、アルゴンで置換し た。得られた混合物を無水THFに溶解し、０℃で撹拌した。無水THFに溶かしたメ チルトリペノキシホスホニウムヨーダイド((Ph0)3P+CH3I-)を、得られた溶液に 添加し、３０分間撹拌した。さらに溶液に５％の炭酸カリウムを入れた後、溶媒 を減圧下で蒸留除去した。残渣を酢酸エチルで希釈、洗浄、乾燥した。ろ液を減 圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル＝10:1)で分離精製 し、化合物を得た。 実施例10：メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12-ジエン-23-O-t-ブチルジメ チルシリル-28-オエート(10)の製造 上記で得られた化合物(9，15.3mg，0.023mmol)と水素化ホウ素ナトリウム(1.7 9mg)を減圧下で乾燥し、アルゴンで置換した。得られた混合物を無水DMSOに溶解 し、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸留除去し、カラムクロマトグラフ ィー(ヘキサン：酢酸エチル＝30:1)で分離精製し、化合物12mgを得た。（収率： 89％） 実施例11：メチルA(1)-ノルウルサ-z-メチル-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28- オエート(11)の製造 上記で得られた化合物(10，12mg，0.021mmol)を減圧下で乾燥した後、無水THF に溶解した。フッ化テトラブチルアンモニウム(6.0mg)を得られた混合物に室温 で加え、24時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸留除去し、カラムクロマトグラフィ ー(ヘキサン：酢酸エチル＝10:1)で分離精製し、化合物3.8mgを得た。（収率：5 4.7％） 実施例12：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル-2,12-ジエン-23-ヒド ロキシ-28-オエート(12)の製造 化合物(7)の代わりに化合物(5)を使用した以外は、実施例６と同じ製造方法を 用いた。（収率：89.9％） 実施例13：メチルA(1)-ノルウルサ-2-フルオロメチル-2,12-ジエン-28-オエー ト(13，R5＝F)の製造 上記で得られた化合物(12，25mg，51.7μmol)を減圧下で乾燥した後、アルゴ ンで置換し、さらに無水ジクロロメタンに溶解した。得られた混合物に-78℃で ジエチルアミノスルホトリフルオライド(DAST，20.5μl)を添加し、室温で１時 間３０分撹拌した。飽和炭酸ナトリウムを０℃で得られた混合物に添加し、洗浄 および乾燥した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン ：酢酸エチル＝15:1)で分離精製し、化合物8.3mgを得た。（収率：32.9％） 実施例14：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ブロモメチル-23-ブロモ- 2,12-ジエン-28-オエート(13，R5＝Br)の製造 化合物(8)の代わりに化合物(12)を使用した以外は、実施例７と同じ製造方法 を用いた。（収率：53.9％） 実施例15：メチルA(1)-ノルウルサ-2-クロロメチル-23-クロロ-2,12-ジエン-2 8-オエート(13，R5＝Cl)の製造 化合物(8)の代わりに化合物(12)を使用した以外は、実施例８と同じ製造方法 を用いた。（収率：12.8％） 実施例16：メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12-ジエン-28-オエート(14)の 製造 化合物(9)の代わりに化合物(13)を使用した以外は、実施例10と同じ製造方法 を用いた。（収率：27.0％） 実施例17：メチルA(1)-ノルウルサ-2,12-ジエン-23-アセチルオキシ-2-ホルミ ル-28-オエート(15)の製造 上記で得られた化合物(5，101.2mg，0.210mmol)を減圧下で乾燥した後、アル ゴンで置換した。得られた混合物を無水THFに溶解した。無水酢酸(39.6μl)を室 温で加え、２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸留除去し、残渣を酢酸エチルで希 釈、洗浄、乾燥した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー(ヘキ サン：酢酸エチル＝10:1)で分離精製し、化合物94mgを得た。（収率：85.5％） 実施例18：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ジフルオロメチル-2,12-ジエン-23-アセ チルオキシ-28-オエート(16)の製造 化合物(12)の代わりに化合物(15)を使用した以外は、実施例13と同じ製造方法 を用いた。（収率：38.8％） 実施例19：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル-2,12-ジエン-23-アセ チルオキシ-28-オエート(17)の製造 化合物(7)の代わりに化合物(15)を使用した以外は、実施例６と同じ製造方法 を用いた。（収率：78.2％） 実施例20：メチルA(1)-ノルウルサ-2-フルオロメチル-2,12-ジエン-23-アセチ ルオキシ-28-オエート(18)の製造 化合物(12)の代わりに化合物(17)を使用した以外は、実施例13と同じ製造方法 を用いた。（収率：27.9％） 実施例21：メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル-12-エン-23-ヒドロキ シ-28-オエート(19)の製造 上記で得られた化合物(12，15mg，0.031mmol)をエタノールに溶解し、10％Pd/ C(3mg)を添加した。混合液を水素化反応装置を使って５時間反応させた。Pd/Cを ろ過した後、メタノールで洗浄した。溶媒を減圧下で蒸留除去し、さらに残渣に 酢酸エチルを加え、洗浄および乾燥した。ろ液を減圧下で濃縮し、カラムクロマ トグラフイー(ヘキサン：酢酸エチル＝15:1)で分離精製し、化合物13.6mgを得た 。（収率：90％） 実施例22：化合物(20)の製造 上記で得られた化合物(5，11mg，0.023mmol)を減圧下で乾燥した後、アルゴン で置換した。得られた混合物を無水ジクロロメタンに溶解し、BF3・OEt2(0.28μ l)および1，3-エタンジシオール(2.39μl) (2.39μl)を逐次的に添加した。反応液を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラ フィー(ヘキサン：酢酸エチル＝10:1)で分離精製し、化合物7.8mgを得た。（収 率：61.3％） 実施例23:メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-12-エン-23-ヒドロキシ-28-オエ ート(21)の製造 上記で得られた化合物(20，7.8mg，0.014mmol)を減圧下で乾燥した後、アルゴ ンで置換した。得られた混合物は無水エタノールに溶かし、ラネーニッケル(0.4 7ml)を滴加した後、４時間撹拌した。反応液をろ過した後、溶媒を減圧下で蒸留 除去した。カラムクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル=10:1)で分離精製 し、化合物4.4mgを得た。（収率：66.97％） 実施例24：メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチルオキシメチル-2,12- ジエン-23-O-t-ブチルジメチルシリルオキシ-28-オエート(22)の製造 上記で得られた化合物(8，15mg，0.025mmol)を減圧乾燥後、アルゴンで置換し たのち、無水THFに溶解した。得られた溶液をヘキサンで洗浄した水素化ナトリ ウム(1.505mg)に添加し、さらに１時間後MeI(1.72μl)を添加した。その後３時 間加熱還流し、反応液を減圧濃縮し、さらにカラムクロマトグラフィー(ヘキサ ン：酢酸エチル＝30:1)で分離精製して10.9mgの化合物（収率：71％）を得た。 実施例25：メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチルオキシメチル-2,12-ジエン-23-ヒ ドロキシ-28-オエート(23)の製造 上記で得られた化合物(22)を減圧下で乾燥した後、無水THFに溶解した。フッ 化テトラブチルアンモニウム(5μl)を添加した。その後減圧濃縮し、カラムクロ マトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル＝10:1)で分離精製し、4mgの化合物を得 た。（収率：70.2％） 実験例１：化合物の細胞毒性 化合物の細胞毒性は、天然物に由来する成分の細胞毒性を試験可能なシステム のP388リンパ腫細胞系およびMTTアッセイを用いて試験した。現在までにアシア ト酸誘導体の臨床的な使用が、皮膚などに限られていることを考慮して、黒色腫 の細胞系(Malme-3M)および正常細胞系(Detoit551)を利用して細胞毒性を試験し た。 単一化合物の場合、４μg/mlまでのED50値は、細胞毒性があるものとして見な す。これを基本にして評価した。 試験方法は以下の通り記載される。 細胞は、種々の濃度のアシアト酸誘導体の存在下で、マイクロタイタープレー ト(microtitre plate)上に37℃、５％ CO2 培養器中で１日間培養した。3-(4 ,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-2,5-ジフェニル-テトラゾリウム臭素(MTT、sigma 、St．Louis、MO、USA)溶液をそこに添加し、形成されたホルマザン(formazane) の量を分光学的な方法で測定した。細胞毒性の評価として、ED50値（細胞成長を 50％抑制する化合物の濃度）を使用した。対照としてアドリアマイシン(adriamy cin)のED50値を使用した。 表１：変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体の種々の細胞系 (P388D1,Malme-3M,Detroit551)に対する細胞毒性表２：P338D1における変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体 を分化促進剤と併用する効果 P388D1:（ATCC CCL 46）リンパ腫のラットからの細胞系 MTT:ミクロ培養検定を使用した ＥＤ50(μg/ml,mean，+sd,n=3) HMPA:ヘキサメチレンビスアセトアミド DMSO:ジメチルスルホキシド NaB:臭化ナトリウム LiCl:塩化リチウム 実験例２：四塩化炭素またはガラクトサミンによって誘発される肝細胞毒性に 対するアシアト酸誘導体の肝保護および治療効果 本発明に係る一般式(1)の化合物の中でメチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12 -ジエン-23-ヒドロキシ-28-オエート、メチルA(1)-ノルウルサ-2,12-ジエン-23- スクシニルオキシ-2-ホルミル28-オエート、メチルA(1)-ノルウルサ-2,12-ジエ ン-23-グルタリルオキシ-2-ホルミル28-オエート、メチルA(1)-ノルウルサ-2,12 -ジエン-23-ベンゾイルオキシ-2-ホルミル28-オエート、メチルA(1)-ノルウルサ -2,12-ジエン-23-シンナミルオキシ-2-ホルミル-28-オエート、およびメチルA(1 )- ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28-オエートの肝 保護および治療効果を実験した。 実験では、150〜200gの体重の雄Wisterを用いた。実験に先立ち、Westerは１ 日間食べ物を与えないでおき、その肝細胞をBerry and Friend方法[M．N．Berry and D．S．Friend，J．Cell Biol.，43，5006(1969)]を若干変更した２段階コ ラゲナーゼ剤貫流法[D．M.Crisp and C.I.Pogson,Biochem.，126，1009(1972)] で分離した。 四塩化炭素(CCl4)の使用による肝細胞中の毒性は、分離した肝細胞を24時間培 養した後、さらに10mMの四塩化炭素を含んだ培養液で1.5時間同様に培養して誘 発させた。[Y.Kiso,Y.Suzuki and H.Hikoni,Plant Med.,49,222(1983)]。 一方、ガラクトサミン(galactosamine)による肝細胞の毒性は、分離した肝細 胞を1.5時間培養した後、さらに1.5mMのガラクトサミンが含まれた培養液で同様 に14時間培養して誘発させた［Y.Kris,M.Tohkin,H.Hikino,and J.Nat.Prod.,46, 841(1983)]。 細胞毒性が誘発された肝細胞は、５μg/mLと50μg/mLの濃度の化合物を含む培 養液中で培養した。その後その培養液を取り出し、グルタミンピルビックトラン スアミナーゼ(GPT)の活性をReitman-Frankel法で測定した。[S．Reitman，S．Fr ankel，Am，J．Cli．Pathol.,28,56(1957)]。 毒性を誘発していない正常な肝細胞のGPT値を100％とし、化合物を投与しない 毒性誘発肝細胞のGPT値を０％とした。そして化合物による肝毒性回復効果を、 相対保護（％）として表した。 結果を表３に示す。 表３：アシアト酸誘導体の毒性誘発肝細胞における肝保護効果 本発明に係る一般式(1)の変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体であるメチルＡ( 1)-ノルウルサ-2,12-ジエン-23-スクシニルオキシ-2-ホルミル28-オエート及び メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28-オ エートは、５μg/mlの四塩化炭素によって誘発された毒性を有する肝細胞中では 、23〜41％の肝保護を示し、ガラクトサミンによって誘発された毒性を有する肝 細胞中では、40〜72％の肝保護を示した。 製剤例 １．錠剤（抗ガン剤）の調製 活性成分 2.5mg ラクトースＢＰ 151.0mg デンプンＢＰ 30.0mg プレゼラチン化コーンスターチＢＰ 15.0mg 活性成分をふるい分けて、ラクトース、澱粉及びプレゼラチン化コーンスター チと混合した。次いで適量の精製水を添加したのち、混合物を顆粒化した。乾燥 させた後、ステアリン酸マグネシウムと顆粒とを混合し、さらに圧縮して錠剤を 調製した。 ２． 注射剤（抗ガン剤）の調製 活性成分 800μg/ml 希塩酸ＢＰ pH3.5まで 注射可能な塩化ナトリウムBP 最大 1ml 活性成分を適当量の注射可能な塩化ナトリウムBP中に溶解し、得られた溶液の pHを希塩酸BPを添加してpHを3.5に調節した。次に注射用塩化ナトリウムBPを用 いて容積を調節し、かつ充分に混合した。溶液を透明ガラス製5mlタイプ１アン プル中に充填し、ガラスを溶融させることによって空気の上部格子の下で封止し た。次いで、アンプルを120℃で15分以上オートクレーブ処理して殺菌し、注射 剤を得た。 ３． 錠剤（肝保護剤）の調製 メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12-ジエン-28-オエート 5.0mg ラクトースＢＰ 150.0mg デンプンＢＰ 30.0mg プレゼラチン化コーンスターチＢＰ 15.0mg ステアリン酸マグネシウムＢＰ 1.0mg メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28-オエートを ふるい分けし、ラクトース、デンプン及びプレゼラチン化コーンスターチと混合 した。適量の精製水を加え、混合物を顆粒化した。顆粒を乾燥させた後、ステア リン酸マグネシウムと混合させ圧縮して錠剤を調製した。 ４． カプセル剤（肝保護剤）の調製 メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12-ジエン-28-オエート 5.0mg デンプン１５００ 100.0mg ステアリン酸マグネシウムＢＰ 1.0mg メチルA(1)-ノルウルサ-2-メチル-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28-オエートを ふるい分けし、賦形剤と混合した。混合物をゼラチンカプセル中に充填した。 ５． 注射剤（肝保護剤）の調製 メチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキシメチル -2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28-オエート 1000μg/ml 希塩 ＢＰ pH3.5まで 注射可能な塩化ナトリウムＢＰ 最大 1ml 適当量の注射可能な塩化ナトリウムBP中にメチルA(1)-ノルウルサ-2-ヒドロキ シメチル-2,12-ジエン-23-ヒドロキシ-28-オエートを溶解させ、得られた溶液の pHを希塩酸BPを添加してpH3.5に調節した。次いで注射可能な塩化ナトリウムBP を用いて容積を調節し、さらに充分に混合した。溶液を透明ガラス製5mlタイプ １アンプル中に充填し、ガラス溶解させることによって空気の上部格子を封止し た。次いでアンプルを120℃で15分以上オートクレーブ処理して殺菌し、注射剤 を生成した。 実験例から分かるように、本発明に係るアシアト酸誘導体は黒色腫細胞に対す る細胞毒性試験、および四塩化炭素またはガラクトサミンによって誘発された肝 細胞毒性に対する肝保護効果試験から、優れた効果を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｃ 69/757 Ｃ０７Ｃ 69/757 Ｚ Ｃ０７Ｆ 7/18 Ｃ０７Ｆ 7/18 Ｊ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＮ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 パク，ヒュング，ゲウン 大韓民国 ソウル 151―057，クワナク― グ，ポングチョン ７―ドング，フォアム ファカルティー エーピーティー．，イ ースト ビルディング，207 (72)発明者 キム，ヒー，ドー 大韓民国 ソウル 121―110，マポ―グ, シンス―ドング，サミク エーピーティ ー．，102―1005 (72)発明者 ジュング，ヤング，ホーン 大韓民国 キョングギ―ドー 427―050, クワチョン，ブリム―ドング，ジュゴング エーピーティー．，913―501 (72)発明者 キム，ヤング，チョーング 大韓民国 ソウル 143―752，クワングジ ン―グ，クワングジャング―ドング，ウォ ーカー ヒル エーピーティー．，51― 302 (72)発明者 キム，ホング，ピョ 大韓民国 ソウル 121―781，マポ―グ, ソングサン―ドング，シヨング エーピー ティー．，17―1308 (72)発明者 リー，ミ，キオング 大韓民国 ソウル 151―761，クワナク― グ，シリム ２―ドング，ヒュンダイ エ ーピーティー．，111―907 (72)発明者 チョイ，ヒー，スング 大韓民国 ソウル 138―050，ソングパ― グ，パング―アイ―ドング，オリンピック ソンスチョン エーピーティー．，326 ―206 (72)発明者 リー，ユング，セオク 大韓民国 ソウル 138―050，ソングパ― グ，パング―アイ―ドング，オリンピック ソンスチョン エーピーティー．，326 ―206 (72)発明者 ヨー，チ，ヒョング 大韓民国 プサン 613―131，スヨング― グ，マングミ １―ドング，サムスング エーピーティー．，４―1201 (72)発明者 リム，ドー，ヨン 大韓民国 ソウル 135―795，カングナム ―グ，ヨクサム ２―ドング，ガエナリ エーピーティー．，３―205 (72)発明者 キム，ジェオング，ホーン 大韓民国 ソウル 135―082，カングナム ―グ，ヨクサム ２―ドング，スングボ エーピーティー．，Ａ―1402 (72)発明者 キム，ヒー，マン 大韓民国 ソウル 135―775，カングナム ―グ，タエチ ２―ドング，ミド エーピ ーティー．，208―905 (72)発明者 セオ，スング，キ 大韓民国 プサン 617―042，ササング― グ，トクポ ２―ドング，ブウォン パー クタウン，107―207 (72)発明者 ナム，タエ，ギュ 大韓民国 チャングチョングブク―ドー 361―270，チョングジュ，ヒュングドク― グ，ポクダエ―ドング，230―19 (72)発明者 ハン，ダッキー 大韓民国 ソウル 130―021，トングダエ ムン―グ，チョンノング １―ドング, 643―67 (72)発明者 シム，ピル，ジォング 大韓民国 ソウル 143―210，クワングジ ン―グ，クワングジャング―ドング，ヒュ ンダイ エーピーティー．，309―605 (72)発明者 ジュング，ジュ，ユン 大韓民国 ソウル 140―133，ヨングサン ―グ，チョングパ―ドング―３―ガ，118 ―９ (72)発明者 ベオム，ヒー，ヤング 大韓民国 ソウル 136―045，ソングブク ―ク，サムソン―ドング ５―ガ，243

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．下記一般式１で表される変形Ａ環を有するアシアト酸誘導体またはその製薬 学的に許容される塩あるいはエステル。 （式中R1は炭素数1〜4の低級アルキル基、炭素数1〜4のアルコキシ基、ヒドロキ シメチル基、ハロメチル基、エタンジシオールで保護されても良いアルデヒド基 を表し、；R2は炭素数1〜4の低級アルキル基、t-ブチルジメチルシリルオキシメ チル基、ハロメチル基、-CH2OCO(CH2)nCO2H(n=0〜3)、-CH2OCOCHCHC6H5、アセチ ルまたはベンゾイル基で保護されても良いヒドロキシメチル基を表し；R3は水素 またはメチル基を表し；２位の二重結合は還元して単一結合になっていてもよい 。） ２．請求項第１項記載の一般式１で表示される変形Ａ環を有するアシアト酸誘導 体、またはその製薬学的に許容される塩あるいはエステルを含む抗ガン剤。 ３．請求項第１項記載の一般式１で表示される変形Ａ環を有するアシアト酸誘導 体、またはその製薬学的に許容されている塩あるいはエステルを含む肝保護剤。
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