JP2001181275A - 新規なカリックスクラウン誘導体、その製造方法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及びその自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法 - Google Patents
新規なカリックスクラウン誘導体、その製造方法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及びその自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法Info
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- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来の蛋白質固定化方法が有していた、濃
度、活性及び配向性等の問題を解決する。 【解決手段】 本発明は、蛋白質単分子層を固定化させ
るために使用される、自己組立単分子層の製造に必須的
な、化学式（１）乃至（３）の、カリックスクラウン誘
導体、及びその合成方法を提供する。本発明は、また、
化学式（１）乃至（３）の化合物を含有する有機溶液
に、真空蒸着された金基質又は関連金属基質を浸して製
造される自己組立単分子層、及びこの自己組立単分子層
上に分子量が２０，０００Ｄ（２０ＫＤ）以上の蛋白質
を固定化させる蛋白質単分子層の固定化方法を提供す
る。
度、活性及び配向性等の問題を解決する。 【解決手段】 本発明は、蛋白質単分子層を固定化させ
るために使用される、自己組立単分子層の製造に必須的
な、化学式（１）乃至（３）の、カリックスクラウン誘
導体、及びその合成方法を提供する。本発明は、また、
化学式（１）乃至（３）の化合物を含有する有機溶液
に、真空蒸着された金基質又は関連金属基質を浸して製
造される自己組立単分子層、及びこの自己組立単分子層
上に分子量が２０，０００Ｄ（２０ＫＤ）以上の蛋白質
を固定化させる蛋白質単分子層の固定化方法を提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なカリックス
クラウン（キャリックスクラウン）誘導体、その製造方
法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及び
自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方
法に関する。より具体的には、本発明は、多重イオン認
識により、蛋白質を固定することができる、自己組立単
分子層の製造に必須的な、チオール基が付着された、新
規なカリックスクラウン誘導体、及びその製造方法、上
記カリックスクラウン誘導体を金基質又は関連金属基質
上に適用して製造される自己組立単分子層、及びその自
己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法
に関する。
クラウン（キャリックスクラウン）誘導体、その製造方
法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及び
自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方
法に関する。より具体的には、本発明は、多重イオン認
識により、蛋白質を固定することができる、自己組立単
分子層の製造に必須的な、チオール基が付着された、新
規なカリックスクラウン誘導体、及びその製造方法、上
記カリックスクラウン誘導体を金基質又は関連金属基質
上に適用して製造される自己組立単分子層、及びその自
己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素、抗原、抗体等を、固体基質に固定
化する方法は、免疫化学と酵素化学等、生命科学や蛋白
質を使用する分野において、全ての分析の最も基礎的な
基盤技術となる。例えば、生命工学分野において多く使
用される、ＥＬＩＳＡ（EnzymeLinked Immunoassay）法
等は、特定の蛋白質又は病原を起こす特異蛋白質を分析
するために、実験室や臨床医学の分野において多く使用
されている方法であって、この方法を使用するために必
要な分析用キットが、既に市場において販売されてい
る。さらに最近では、固体マトリックス上に蛋白質を固
定化させるための改良された方法を必要とする蛋白質チ
ップの開発が、ゲノム研究以後の段階で蛋白質工学研究
をさらに進展させるべく、生物工学分野において大きな
関心になっている。
化する方法は、免疫化学と酵素化学等、生命科学や蛋白
質を使用する分野において、全ての分析の最も基礎的な
基盤技術となる。例えば、生命工学分野において多く使
用される、ＥＬＩＳＡ（EnzymeLinked Immunoassay）法
等は、特定の蛋白質又は病原を起こす特異蛋白質を分析
するために、実験室や臨床医学の分野において多く使用
されている方法であって、この方法を使用するために必
要な分析用キットが、既に市場において販売されてい
る。さらに最近では、固体マトリックス上に蛋白質を固
定化させるための改良された方法を必要とする蛋白質チ
ップの開発が、ゲノム研究以後の段階で蛋白質工学研究
をさらに進展させるべく、生物工学分野において大きな
関心になっている。
【０００３】抗体、抗原及び酵素等の蛋白質の表面を固
定化させる方法としては、従来から、物理吸着方式によ
り、主に高分子基質やニトロセルロース基質に、蛋白質
の表面を固定化させる方式が利用されてきたが、最近
は、蛋白質と基質表面の間に炭素結合を形成する化学反
応による表面固定化方式が登場した。
定化させる方法としては、従来から、物理吸着方式によ
り、主に高分子基質やニトロセルロース基質に、蛋白質
の表面を固定化させる方式が利用されてきたが、最近
は、蛋白質と基質表面の間に炭素結合を形成する化学反
応による表面固定化方式が登場した。
【０００４】また、固体基質上に、ビオチン（biotin）
を付着させた後、そのビオチン層上に、アビジン（avid
in）や、ストレプトアビジン（streptoavidin）を、化
学結合方式により付着させ、ビオチンが付着された蛋白
質を利用する、三重分子層による蛋白質固定化方式が、
文献（Science,1993年 Vol 262,pp. 1706-1708）に発表
された。
を付着させた後、そのビオチン層上に、アビジン（avid
in）や、ストレプトアビジン（streptoavidin）を、化
学結合方式により付着させ、ビオチンが付着された蛋白
質を利用する、三重分子層による蛋白質固定化方式が、
文献（Science,1993年 Vol 262,pp. 1706-1708）に発表
された。
【０００５】しかし、従来から使用されていた物理吸着
方式、最近使用され始めた炭素結合方式、ビオチン−ア
ビジン引力を利用した方式等の、蛋白質固定化方法にお
いて現れている問題点は、次のとおりである。
方式、最近使用され始めた炭素結合方式、ビオチン−ア
ビジン引力を利用した方式等の、蛋白質固定化方法にお
いて現れている問題点は、次のとおりである。
【０００６】１．濃度：従来から知られている蛋白質の
固定化反応において最も問題となることは、表面に固定
化された蛋白質の量がかなり少ないことである。表面に
固定化された蛋白質の濃度が低いと、他の蛋白質が、非
特異性固定化反応により固体基質表面の空間に固定化さ
れ得るので、蛋白質が固定化されていない部分が反応性
を有しないように、化学的な処理等をしなければならな
い。しかし、上記の化学的な処理過程において、固定化
された蛋白質分子の活性に問題が生じる可能性があり、
分析しようとする特定の蛋白質を付着させる時も、その
蛋白質のかなり少ない量のみが認識されるため、分析し
ようとする蛋白質の量が微量となるので、多様な分析実
験方式を通じて確認を行わなければならない。特に、基
質の単位面積当たり、その表面に固定化される蛋白質の
量が多いほど、分析が容易になるので、固定化された蛋
白質の量を最大化した蛋白質単分子層の開発に対し、多
くの研究が行われたが、未だ満足できる結果は得られて
いない。
固定化反応において最も問題となることは、表面に固定
化された蛋白質の量がかなり少ないことである。表面に
固定化された蛋白質の濃度が低いと、他の蛋白質が、非
特異性固定化反応により固体基質表面の空間に固定化さ
れ得るので、蛋白質が固定化されていない部分が反応性
を有しないように、化学的な処理等をしなければならな
い。しかし、上記の化学的な処理過程において、固定化
された蛋白質分子の活性に問題が生じる可能性があり、
分析しようとする特定の蛋白質を付着させる時も、その
蛋白質のかなり少ない量のみが認識されるため、分析し
ようとする蛋白質の量が微量となるので、多様な分析実
験方式を通じて確認を行わなければならない。特に、基
質の単位面積当たり、その表面に固定化される蛋白質の
量が多いほど、分析が容易になるので、固定化された蛋
白質の量を最大化した蛋白質単分子層の開発に対し、多
くの研究が行われたが、未だ満足できる結果は得られて
いない。
【０００７】２．活性：化学結合による方式や、表面に
おける物理吸着による方式等の、既存の固定化方法にお
いては、蛋白質が溶液状で自由に漂う時より、基質の表
面に固定化される時の方が、より容易に活性を失う場合
が多い。その理由は、蛋白質が固体基質に固定化される
時、かなり強く表面に引かれるために、活性位置が変化
するからであると考えられている。
おける物理吸着による方式等の、既存の固定化方法にお
いては、蛋白質が溶液状で自由に漂う時より、基質の表
面に固定化される時の方が、より容易に活性を失う場合
が多い。その理由は、蛋白質が固体基質に固定化される
時、かなり強く表面に引かれるために、活性位置が変化
するからであると考えられている。
【０００８】３．配向性：従来の蛋白質の固定化方法に
おいては、蛋白質分子が表面に固定化されると、必然的
に活性位置含有部分が固体基質に向かうようになり、実
際に活性がないものと同じになる場合が生じる。これを
配向性問題といい、固定化蛋白質分子の約半分程度にお
いてこのような現象が発生する。
おいては、蛋白質分子が表面に固定化されると、必然的
に活性位置含有部分が固体基質に向かうようになり、実
際に活性がないものと同じになる場合が生じる。これを
配向性問題といい、固定化蛋白質分子の約半分程度にお
いてこのような現象が発生する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前述
した従来の蛋白質固定化方法が有していた、濃度、活性
及び配向性等の問題を解決するために、蛋白質の固定化
方法において使用する、自己組立単分子層に必須的な、
蛋白質のアンモニウム基を認識することができる認識基
を有するカリックスクラウン誘導体、及びその製造方法
を提供することである。
した従来の蛋白質固定化方法が有していた、濃度、活性
及び配向性等の問題を解決するために、蛋白質の固定化
方法において使用する、自己組立単分子層に必須的な、
蛋白質のアンモニウム基を認識することができる認識基
を有するカリックスクラウン誘導体、及びその製造方法
を提供することである。
【００１０】本発明の他の目的は、上記の化合物を金基
質又は関連金属基質に付着させることにより、全ての種
類の蛋白質について、何等の加工過程を必要とすること
なく、蛋白質が表面に密に満たされた蛋白質単分子層を
生成することができる、カリックスクラウン誘導体の自
己組立単分子層を提供することである。
質又は関連金属基質に付着させることにより、全ての種
類の蛋白質について、何等の加工過程を必要とすること
なく、蛋白質が表面に密に満たされた蛋白質単分子層を
生成することができる、カリックスクラウン誘導体の自
己組立単分子層を提供することである。
【００１１】本発明のさらに他の目的は、上記の自己組
立単分子層上に、分子量が２０，０００Ｄ（２０ＫＤ）
以上の、抗原、抗体、及び酵素等の蛋白質分子を固定さ
せる、蛋白質の固定化方法を提供することである。
立単分子層上に、分子量が２０，０００Ｄ（２０ＫＤ）
以上の、抗原、抗体、及び酵素等の蛋白質分子を固定さ
せる、蛋白質の固定化方法を提供することである。
【００１２】本発明のさらに他の目的は、蛋白質チッ
プ、診断キット、蛋白質分離パック等を製造するため
の、金、銀、ガラス、珪素、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート等の無機又は有機固体基質の上に、下記式（１）
乃至（３）の化合物を適用することによる上記蛋白質分
子の固定化方法を提供することである。
プ、診断キット、蛋白質分離パック等を製造するため
の、金、銀、ガラス、珪素、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート等の無機又は有機固体基質の上に、下記式（１）
乃至（３）の化合物を適用することによる上記蛋白質分
子の固定化方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】蛋白質固定化方法におい
て使用される、自己組立単分子層に必須的な、新規なカ
リックスクラウン誘導体は、下記化学式（１）乃至
（３）の構造を有する化合物である。 上記式（１）中において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互
いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ基を示すか、又はＲ1乃至Ｒ4
のうち二つが、互いに結合してそれぞれ−ＣＨ 2−Ｓ−
Ｓ−ＣＨ2−基を形成することができ；又はＲ1、Ｒ2、
Ｒ3及びＲ4は、独立的に−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−
ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨであり
得る。
て使用される、自己組立単分子層に必須的な、新規なカ
リックスクラウン誘導体は、下記化学式（１）乃至
（３）の構造を有する化合物である。 上記式（１）中において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互
いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ基を示すか、又はＲ1乃至Ｒ4
のうち二つが、互いに結合してそれぞれ−ＣＨ 2−Ｓ−
Ｓ−ＣＨ2−基を形成することができ；又はＲ1、Ｒ2、
Ｒ3及びＲ4は、独立的に−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−
ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨであり
得る。
【００１４】 上記式（２）中において、ｎは１であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ
3及びＲ4は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−Ｃ
Ｈ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2Ｃ
ＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ
2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−
ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4
は、それぞれＨを示すことができ；Ｒ5及びＲ6は、互い
に独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル又はイソブチルを示す。
3及びＲ4は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−Ｃ
Ｈ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2Ｃ
ＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ
2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−
ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4
は、それぞれＨを示すことができ；Ｒ5及びＲ6は、互い
に独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル又はイソブチルを示す。
【００１５】 上記式（３）中において、ｎは２であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ
3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃ
ｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−
ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞ
れ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2Ｃ
ＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2
及びＲ4は、それぞれ−Ｈ基を示し；Ｒ5及びＲ6は、互
いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル又はイソブチルを示す。
3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃ
ｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−
ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞ
れ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2Ｃ
ＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2
及びＲ4は、それぞれ−Ｈ基を示し；Ｒ5及びＲ6は、互
いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル又はイソブチルを示す。
【００１６】
【発明の実施の形態】上記化学式（１）乃至（３）の化
合物を、一般的に命名する時、カリックスクラウン誘導
体といい、具体的には、化学式（１）の化合物は、カリ
ックス［４］アレン−ビスクラウン−４と、化学式
（２）の化合物は、カリックス［４］アレン−クラウン
−５と、化学式（３）の化合物は、カリックス［４］ア
レン−クラウン−６と命名する。
合物を、一般的に命名する時、カリックスクラウン誘導
体といい、具体的には、化学式（１）の化合物は、カリ
ックス［４］アレン−ビスクラウン−４と、化学式
（２）の化合物は、カリックス［４］アレン−クラウン
−５と、化学式（３）の化合物は、カリックス［４］ア
レン−クラウン−６と命名する。
【００１７】化学式（１）乃至（３）の化合物を合成す
るための出発物質は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ 3及びＲ4がＨであ
り、Ｒ5及びＲ6が−ＣＨ3のカリックス［４］アレン−
クラウン−５と、−６、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＨ
のカリックス［４］アレン−ビスクラウン−４であっ
て、これらの出発物質は、文献（米国化学会誌、J.Am.C
hem.Soc.,1995年,Vol 117,pp 2767-2777;Tetrahedron,1
997年,Vol 53,pp 3767-3776）に発表された方法に従っ
て合成する。
るための出発物質は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ 3及びＲ4がＨであ
り、Ｒ5及びＲ6が−ＣＨ3のカリックス［４］アレン−
クラウン−５と、−６、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＨ
のカリックス［４］アレン−ビスクラウン−４であっ
て、これらの出発物質は、文献（米国化学会誌、J.Am.C
hem.Soc.,1995年,Vol 117,pp 2767-2777;Tetrahedron,1
997年,Vol 53,pp 3767-3776）に発表された方法に従っ
て合成する。
【００１８】本発明の化学式（１）乃至（３）の化合物
は、上記の公知の方法により合成された出発物質をクロ
ロメチル化反応に付して、Ｒ1乃至Ｒ4のうち、二つ又は
四つの作用基を−ＣＨ2Ｃｌ基に変換させた後、場合に
より通常の方法で、それぞれのＣｌ基を、チオール（−
ＳＨ）、シアノ（−ＣＮ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、
アミド（−ＮＨ2）又はカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基に
変換させるか、又は二つのＣｌ基をジスルフィド（−Ｓ
−Ｓ−）基に変換させて製造する。
は、上記の公知の方法により合成された出発物質をクロ
ロメチル化反応に付して、Ｒ1乃至Ｒ4のうち、二つ又は
四つの作用基を−ＣＨ2Ｃｌ基に変換させた後、場合に
より通常の方法で、それぞれのＣｌ基を、チオール（−
ＳＨ）、シアノ（−ＣＮ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、
アミド（−ＮＨ2）又はカルボン酸（−ＣＯＯＨ）基に
変換させるか、又は二つのＣｌ基をジスルフィド（−Ｓ
−Ｓ−）基に変換させて製造する。
【００１９】従来のクロロメチル基付着反応において
は、クラウン基にクロロメチル基を付着する時に使用す
るルイス酸（ＳｎＣｌ4等）のためにクラウン基が容易
に破壊されたが、本発明の製造方法においては、クラウ
ン基に全く影響を与えず、クロロメチル基のみを付着さ
せることができ、高収率でカリックスクラウン誘導体を
合成することができる。本発明においては、クロロメチ
ル基への変換試薬として、ＣＨ3−Ｏ−ＣＨ2Ｃｌを使用
し、ルイス酸としては、ＳｎＣｌ4を使用する。Ｒ1、Ｒ
2、Ｒ3及びＲ4が、チオール基を有するか、又はこれら
がジスルフィド基を形成する化学式（１）乃至（３）の
化合物を製造するために、クロロメチル基をチオールや
ジスルフィド基に変換させる場合は、ＮａＳＨを使用し
て直接的にチオールに変える方法と、チオウレアと反応
させた後、ＮａＯＨ等の塩基性水溶液において還流を行
ってチオールに変換させる方法があり、これらの方法
は、いずれも優れた収率で、上記化学式（１）乃至
（３）の化合物を合成することができる。
は、クラウン基にクロロメチル基を付着する時に使用す
るルイス酸（ＳｎＣｌ4等）のためにクラウン基が容易
に破壊されたが、本発明の製造方法においては、クラウ
ン基に全く影響を与えず、クロロメチル基のみを付着さ
せることができ、高収率でカリックスクラウン誘導体を
合成することができる。本発明においては、クロロメチ
ル基への変換試薬として、ＣＨ3−Ｏ−ＣＨ2Ｃｌを使用
し、ルイス酸としては、ＳｎＣｌ4を使用する。Ｒ1、Ｒ
2、Ｒ3及びＲ4が、チオール基を有するか、又はこれら
がジスルフィド基を形成する化学式（１）乃至（３）の
化合物を製造するために、クロロメチル基をチオールや
ジスルフィド基に変換させる場合は、ＮａＳＨを使用し
て直接的にチオールに変える方法と、チオウレアと反応
させた後、ＮａＯＨ等の塩基性水溶液において還流を行
ってチオールに変換させる方法があり、これらの方法
は、いずれも優れた収率で、上記化学式（１）乃至
（３）の化合物を合成することができる。
【００２０】また、本発明は、上記の化学式（１）乃至
（３）の化合物を、金基質又は関連金属基質に付着させ
ることにより、全ての種類の蛋白質について、何等の加
工過程を必要とすることなく、蛋白質が表面に密に満た
された蛋白質単分子層を生成することができる、カリッ
クスクラウン誘導体の、自己組立単分子層を提供するも
のである。関連金属基質とは、Ａｇ、Ｐｔ等の貴金属類
を含むものと理解される。
（３）の化合物を、金基質又は関連金属基質に付着させ
ることにより、全ての種類の蛋白質について、何等の加
工過程を必要とすることなく、蛋白質が表面に密に満た
された蛋白質単分子層を生成することができる、カリッ
クスクラウン誘導体の、自己組立単分子層を提供するも
のである。関連金属基質とは、Ａｇ、Ｐｔ等の貴金属類
を含むものと理解される。
【００２１】さらに、化学式（１）乃至（３）の化合物
は、金属、ガラス、珪素、ポリスチレン、ポリカーボネ
ート等の無機又は有機固体基質の上にコーティングされ
得る。
は、金属、ガラス、珪素、ポリスチレン、ポリカーボネ
ート等の無機又は有機固体基質の上にコーティングされ
得る。
【００２２】図１は、本発明によるカリックスクラウン
誘導体の自己組立単分子層の製造過程を概略的に示す。
誘導体の自己組立単分子層の製造過程を概略的に示す。
【００２３】カリックスクラウン誘導体の自己組立単分
子層を製造するための具体的な方法は、次のとおりであ
る：ＣＨＣｌ3等の有機溶媒に、化学式（１）乃至
（３）の化合物を、１−３ｍＭ濃度に溶かした溶液を製
造する。金基質を、上記製造された溶液中に入れて１乃
至２４時間浸した後取り出し、これをアセトン溶液及び
水でそれぞれ洗滌した後乾燥させると、図１のような、
カリックスクラウン誘導体の、自己組立単分子層が完成
する。ここで使用される金基質は、いろいろな形態で使
用されるが、一般的に、ガラス、溶融石英、シリコンウ
エハー、プラスチック等に、クロム（Ｃｒ）やチタン
（Ｔｉ）等を５−１０ｎｍに蒸着させた後、金を２００
ｎｍ程度蒸着して得られる基質である。このように製造
された金基質は、使用直前に、ピランハ（piranha）溶
液（過酸化水素水：濃硫酸を、１：２〜３程度の割合で
混ぜた混合溶液）に、１分程度浸した後、水で洗滌して
使用することが一般的であるが、塩基性溶液において沸
かして使用するか、又はオゾン中に通過させてもよい。
クリーニング後は、なるべく早く、上記の金基質を使用
しなければならず、単分子層の生成は、表面反射赤外線
分光分析法を利用して確認する。
子層を製造するための具体的な方法は、次のとおりであ
る：ＣＨＣｌ3等の有機溶媒に、化学式（１）乃至
（３）の化合物を、１−３ｍＭ濃度に溶かした溶液を製
造する。金基質を、上記製造された溶液中に入れて１乃
至２４時間浸した後取り出し、これをアセトン溶液及び
水でそれぞれ洗滌した後乾燥させると、図１のような、
カリックスクラウン誘導体の、自己組立単分子層が完成
する。ここで使用される金基質は、いろいろな形態で使
用されるが、一般的に、ガラス、溶融石英、シリコンウ
エハー、プラスチック等に、クロム（Ｃｒ）やチタン
（Ｔｉ）等を５−１０ｎｍに蒸着させた後、金を２００
ｎｍ程度蒸着して得られる基質である。このように製造
された金基質は、使用直前に、ピランハ（piranha）溶
液（過酸化水素水：濃硫酸を、１：２〜３程度の割合で
混ぜた混合溶液）に、１分程度浸した後、水で洗滌して
使用することが一般的であるが、塩基性溶液において沸
かして使用するか、又はオゾン中に通過させてもよい。
クリーニング後は、なるべく早く、上記の金基質を使用
しなければならず、単分子層の生成は、表面反射赤外線
分光分析法を利用して確認する。
【００２４】また、本発明は、カリックスクラウン誘導
体のクラウン環を利用して、蛋白質の活性位置の反対側
に多量に分布するアンモニウム基等の陽イオンを認識す
る多重イオン認識による、蛋白質固定化方法を提供する
ものである。
体のクラウン環を利用して、蛋白質の活性位置の反対側
に多量に分布するアンモニウム基等の陽イオンを認識す
る多重イオン認識による、蛋白質固定化方法を提供する
ものである。
【００２５】本発明の固定化方式は、蛋白質を利用した
全ての種類の分析方法の基盤となるものであり、未だ世
界的に類似する研究結果も発表されたことがない。
全ての種類の分析方法の基盤となるものであり、未だ世
界的に類似する研究結果も発表されたことがない。
【００２６】本発明の固定化方法によれば、従来の、蛋
白質固定化反応において使用されてきた蛋白質分子の化
学的な処理や遺伝子工学的な変換なくして、分子認識作
用のうちの一つである多重イオン認識作用を利用して、
蛋白質を固体基質の表面に簡単に固定化して、固体基質
上に他の蛋白質分子が固定化されない程度に、所望の蛋
白質分子が密に満たされた蛋白質の単分子層を提供する
ことができる。
白質固定化反応において使用されてきた蛋白質分子の化
学的な処理や遺伝子工学的な変換なくして、分子認識作
用のうちの一つである多重イオン認識作用を利用して、
蛋白質を固体基質の表面に簡単に固定化して、固体基質
上に他の蛋白質分子が固定化されない程度に、所望の蛋
白質分子が密に満たされた蛋白質の単分子層を提供する
ことができる。
【００２７】上記のような蛋白質の単分子層が製造され
るなら、次の測定に影響を及ぼさない程度に、空間がほ
とんど存在しないので、従来の固定化方法において発生
していた濃度問題と、非特異性固定化反応に対する問題
等が、同時に解決される。
るなら、次の測定に影響を及ぼさない程度に、空間がほ
とんど存在しないので、従来の固定化方法において発生
していた濃度問題と、非特異性固定化反応に対する問題
等が、同時に解決される。
【００２８】また、本発明は、従来の固定化反応とは確
然と区別される、化学結合力に比して相対的に弱い力に
よる多重イオン認識により固定化が行われるので、表面
に引かれる力による活性減少効果が、従来の方法に比し
て相対的に小さく現れる。これは、蛋白質の二重分子層
の製造により確認することができる。
然と区別される、化学結合力に比して相対的に弱い力に
よる多重イオン認識により固定化が行われるので、表面
に引かれる力による活性減少効果が、従来の方法に比し
て相対的に小さく現れる。これは、蛋白質の二重分子層
の製造により確認することができる。
【００２９】また、本発明の方法により製造された蛋白
質単分子層において、ほとんどの抗原、抗体、及び酵素
を含む蛋白質は、アンモニウム基等の陽イオンが最も多
く分布する場所が、ほとんどの場合、蛋白質の活性位置
の反対側にあるため、配向性問題を適切な水準で解決す
ることができる。
質単分子層において、ほとんどの抗原、抗体、及び酵素
を含む蛋白質は、アンモニウム基等の陽イオンが最も多
く分布する場所が、ほとんどの場合、蛋白質の活性位置
の反対側にあるため、配向性問題を適切な水準で解決す
ることができる。
【００３０】実際に、図３において認められるように、
抗原−抗体反応を、抗原又は抗体単分子層において実施
して、実時間帯に微細重さ変化を直接的に測定すると、
全ての固定化された抗原分子に抗体分子が、又は固定化
された全ての抗体分子に抗原分子が付着されるという結
果を得ることができるので、本発明により製造された蛋
白質単分子層に固定化された蛋白質の活性が、既存の方
式に比して、画期的に改善されることを確認することが
できる。
抗原−抗体反応を、抗原又は抗体単分子層において実施
して、実時間帯に微細重さ変化を直接的に測定すると、
全ての固定化された抗原分子に抗体分子が、又は固定化
された全ての抗体分子に抗原分子が付着されるという結
果を得ることができるので、本発明により製造された蛋
白質単分子層に固定化された蛋白質の活性が、既存の方
式に比して、画期的に改善されることを確認することが
できる。
【００３１】図２は、化学式（１）乃至（３）の化合物
により製造された自己組立単分子層に、カリックスクラ
ウン分子の分子認識機能により、蛋白質の−ＮＨ3 +基が
自発的に固定化される、多重イオン認識による、抗原、
抗体、酵素等の蛋白質の固定化反応を、概略的に示す図
面である。蛋白質が溶けている溶液に、化学式（１）乃
至（３）の化合物の自己組立単分子層を浸すと、自発的
な認識作用による固定化反応により、約３分から１時間
の間に、表面が完全に蛋白質で覆われた、蛋白質の単分
子層が形成される。原子間力顕微鏡を使用した表面分析
と、クワルツ振動微視秤（Quartz Crystal Microbalanc
e：ＱＣＭ）を利用して、溶液状において、蛋白質分子
が、化学式（１）乃至（３）の化合物の自己組立単分子
層上に固定化されて、完全な蛋白質単分子層を形成する
ことを確認することができる。また、サイクリックボル
タンメトリーを利用して、静電容量（capacitance）を
測定する。いずれの場合も共通して、完全な蛋白質単分
子層が、１時間程度で完成されることを確認することが
できる。
により製造された自己組立単分子層に、カリックスクラ
ウン分子の分子認識機能により、蛋白質の−ＮＨ3 +基が
自発的に固定化される、多重イオン認識による、抗原、
抗体、酵素等の蛋白質の固定化反応を、概略的に示す図
面である。蛋白質が溶けている溶液に、化学式（１）乃
至（３）の化合物の自己組立単分子層を浸すと、自発的
な認識作用による固定化反応により、約３分から１時間
の間に、表面が完全に蛋白質で覆われた、蛋白質の単分
子層が形成される。原子間力顕微鏡を使用した表面分析
と、クワルツ振動微視秤（Quartz Crystal Microbalanc
e：ＱＣＭ）を利用して、溶液状において、蛋白質分子
が、化学式（１）乃至（３）の化合物の自己組立単分子
層上に固定化されて、完全な蛋白質単分子層を形成する
ことを確認することができる。また、サイクリックボル
タンメトリーを利用して、静電容量（capacitance）を
測定する。いずれの場合も共通して、完全な蛋白質単分
子層が、１時間程度で完成されることを確認することが
できる。
【００３２】図３は、図２において製造された蛋白質単
分子層の活性を研究するためのものであり、抗原又は抗
体の単分子層と、溶液状の蛋白質との認識過程を示して
いる。クワルツ結晶微視秤を利用して、蛋白質単分子層
が形成される時と蛋白質二重分子層が形成される時の微
細な重さ変化を測定した結果、抗原単分子層を利用した
場合、これに最適の認識を示す抗体の抗原−抗体引力に
よる認識の程度が、その抗体を利用して蛋白質単分子層
を製造した場合と、ほとんど一致する変化が現れる。ま
た、反対に、抗体の自己組立単分子層と、溶液状の抗原
との反応においても、抗原の自己組立単分子層を製造し
た場合と、ほとんど同一の結果が得られる。これは、多
重イオン認識により、化学式（１）乃至（３）の化合物
の自己組立単分子層上に固定化された蛋白質の活性が、
極めて優れていることを意味するものである。
分子層の活性を研究するためのものであり、抗原又は抗
体の単分子層と、溶液状の蛋白質との認識過程を示して
いる。クワルツ結晶微視秤を利用して、蛋白質単分子層
が形成される時と蛋白質二重分子層が形成される時の微
細な重さ変化を測定した結果、抗原単分子層を利用した
場合、これに最適の認識を示す抗体の抗原−抗体引力に
よる認識の程度が、その抗体を利用して蛋白質単分子層
を製造した場合と、ほとんど一致する変化が現れる。ま
た、反対に、抗体の自己組立単分子層と、溶液状の抗原
との反応においても、抗原の自己組立単分子層を製造し
た場合と、ほとんど同一の結果が得られる。これは、多
重イオン認識により、化学式（１）乃至（３）の化合物
の自己組立単分子層上に固定化された蛋白質の活性が、
極めて優れていることを意味するものである。
【００３３】本発明の、蛋白質単分子層の製造方法を、
具体的に説明すると、次のとおりである：分子量が２
０，０００Ｄ（２０ＫＤ）以上である蛋白質を、数ｎＭ
乃至数μＭの濃度で含有している緩衝溶液に、上記にお
いて製造した、カリックスクラウン誘導体の自己組立単
分子層を入れた後、１時間乃至２時間が過ぎた後に取り
出すと、蛋白質単分子層の製造が完了する。この時、蛋
白質が溶けている、緩衝溶液の陽イオン濃度が低いほ
ど、より早く単分子層が生成され、その生成過程は、ク
ワルツ結晶微視秤を利用した、重さ変化の測定により確
認することができる。蛋白質単分子層の製造時の、最適
の陽イオン濃度は、０．０８３ｍＭ−１．４ｍＭであっ
て、０．０８３ｍＭ未満の低い濃度において、又は１０
ｍＭ以上の高い濃度においては、蛋白質単分子層の生成
に要する時間が３時間以上と長くなる。
具体的に説明すると、次のとおりである：分子量が２
０，０００Ｄ（２０ＫＤ）以上である蛋白質を、数ｎＭ
乃至数μＭの濃度で含有している緩衝溶液に、上記にお
いて製造した、カリックスクラウン誘導体の自己組立単
分子層を入れた後、１時間乃至２時間が過ぎた後に取り
出すと、蛋白質単分子層の製造が完了する。この時、蛋
白質が溶けている、緩衝溶液の陽イオン濃度が低いほ
ど、より早く単分子層が生成され、その生成過程は、ク
ワルツ結晶微視秤を利用した、重さ変化の測定により確
認することができる。蛋白質単分子層の製造時の、最適
の陽イオン濃度は、０．０８３ｍＭ−１．４ｍＭであっ
て、０．０８３ｍＭ未満の低い濃度において、又は１０
ｍＭ以上の高い濃度においては、蛋白質単分子層の生成
に要する時間が３時間以上と長くなる。
【００３４】蛋白質単分子層が製造された後、表面にお
いて、蛋白質分子等が、ある程度完全に固体基質上を満
たしているかは、原子間力顕微鏡を使用して、ｎｍのレ
ベルまで直接的に確認することができる。
いて、蛋白質分子等が、ある程度完全に固体基質上を満
たしているかは、原子間力顕微鏡を使用して、ｎｍのレ
ベルまで直接的に確認することができる。
【００３５】図５及び図６は、カリックスクラウン誘導
体の自己組立単分子層上に生成された、二種類の抗原、
抗体の単分子層と、使用した金基質の表面との差を、ｎ
ｍ水準において確認したＡＦＭイメージである。金基質
の表面と比較すると、上記自己組立単分子層の表面に
は、他の蛋白質分子が入る程度の大きさの空間がない程
に蛋白質分子等が位置しており、完全な単分子層を形成
していることを確認することができる。
体の自己組立単分子層上に生成された、二種類の抗原、
抗体の単分子層と、使用した金基質の表面との差を、ｎ
ｍ水準において確認したＡＦＭイメージである。金基質
の表面と比較すると、上記自己組立単分子層の表面に
は、他の蛋白質分子が入る程度の大きさの空間がない程
に蛋白質分子等が位置しており、完全な単分子層を形成
していることを確認することができる。
【００３６】また、高さの変化を見ると、蛋白質単分子
層上に他の蛋白質が乗っている（積層している）なら、
蛋白質の直径から見て、数ｎｍ以上の高さの差を示す筈
であるが、ここではその程度の高さの差を示さない。こ
のことから見ても、蛋白質単分子層上に、同一の種類の
蛋白質が物理吸着により二重層を形成してしまうような
現象はほとんど現れず、蛋白質が大部分単分子層を形成
することが分かる。これは、分子認識機能を有するクラ
ウン環の特性により、カリックスクラウン誘導体の自己
組立単分子層において、蛋白質のアンモニウム基が認識
される時にのみ、蛋白質分子の固定化が進行し、適切な
大きさの空間がもはや残っていない場合は、蛋白質が金
基質の表面に接近することができないので、蛋白質の表
面固定化がそれ以上進行せず、また固定された単分子層
上に蛋白質がさらに積層されることもないからである。
層上に他の蛋白質が乗っている（積層している）なら、
蛋白質の直径から見て、数ｎｍ以上の高さの差を示す筈
であるが、ここではその程度の高さの差を示さない。こ
のことから見ても、蛋白質単分子層上に、同一の種類の
蛋白質が物理吸着により二重層を形成してしまうような
現象はほとんど現れず、蛋白質が大部分単分子層を形成
することが分かる。これは、分子認識機能を有するクラ
ウン環の特性により、カリックスクラウン誘導体の自己
組立単分子層において、蛋白質のアンモニウム基が認識
される時にのみ、蛋白質分子の固定化が進行し、適切な
大きさの空間がもはや残っていない場合は、蛋白質が金
基質の表面に接近することができないので、蛋白質の表
面固定化がそれ以上進行せず、また固定された単分子層
上に蛋白質がさらに積層されることもないからである。
【００３７】上記の結果は、ＱＣＭを利用した、重さ変
化を測定する時にも確認されたが、単分子層が製造され
た後は、同一の蛋白質の濃度を増加させても、これ以上
の重さ変化は現れない。即ち、同一の蛋白質分子間の物
理吸着は、蛋白質単分子層が、一旦形成された後は、ほ
とんど進行されないことが分かる。
化を測定する時にも確認されたが、単分子層が製造され
た後は、同一の蛋白質の濃度を増加させても、これ以上
の重さ変化は現れない。即ち、同一の蛋白質分子間の物
理吸着は、蛋白質単分子層が、一旦形成された後は、ほ
とんど進行されないことが分かる。
【００３８】図４ａ、４ｂ及び４ｃは、表面において起
こるナノグラムからマイクログラム水準の重さ変化を直
接的に測定することができるクワルツ結晶微視秤を使用
して、蛋白質単分子層の生成を測定したものである。表
面に固定化された物質の重さが増加すると、クワルツ板
の振動数が相対的に減少するようになり、この振動数の
減少値を、下記サウベリ式（Saubery Equation）に代入
して、重さの変化値を得る。 △ｆ＝−Ｃf△ｍ
こるナノグラムからマイクログラム水準の重さ変化を直
接的に測定することができるクワルツ結晶微視秤を使用
して、蛋白質単分子層の生成を測定したものである。表
面に固定化された物質の重さが増加すると、クワルツ板
の振動数が相対的に減少するようになり、この振動数の
減少値を、下記サウベリ式（Saubery Equation）に代入
して、重さの変化値を得る。 △ｆ＝−Ｃf△ｍ
【００３９】上記式において、△ｆは振動数の変化を、
△ｍは重さの変化を表し、また、Ｃ fの値は２．２６×
１０2ｃｍ2ＭＨｚ／ｇであって、１Ｈｚの変化は、４．
４２ｎｇ／ｃｍ2の重さ変化を示す。上記式によると、
図４ｃのβ−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）抗体投入
において見られるように、分子量が１６０ＫＤの抗体を
使用した場合は、表面に固定化された分子等の重さが約
４．２μｇ／ｃｍ2の水準であり、これは約２６ピコモ
ルの分子が表面に固定化されることを意味する。図４ａ
と図４ｂにおいて図示されているように、重さが相対的
に軽いβ−Ｇａｌ抗原やＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ）抗原の場合は、相対的に、固定化さ
れた蛋白質の重さが小さく示されることが分かる（図４
ａ及び４ｂ参照）。
△ｍは重さの変化を表し、また、Ｃ fの値は２．２６×
１０2ｃｍ2ＭＨｚ／ｇであって、１Ｈｚの変化は、４．
４２ｎｇ／ｃｍ2の重さ変化を示す。上記式によると、
図４ｃのβ−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）抗体投入
において見られるように、分子量が１６０ＫＤの抗体を
使用した場合は、表面に固定化された分子等の重さが約
４．２μｇ／ｃｍ2の水準であり、これは約２６ピコモ
ルの分子が表面に固定化されることを意味する。図４ａ
と図４ｂにおいて図示されているように、重さが相対的
に軽いβ−Ｇａｌ抗原やＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ）抗原の場合は、相対的に、固定化さ
れた蛋白質の重さが小さく示されることが分かる（図４
ａ及び４ｂ参照）。
【００４０】固定された蛋白質が極めて高い活性を示す
ことは、図４ａ及び４ｃにおいて示されるように、固定
化されたβ−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）抗原や、
抗体に対応する抗体や抗原を、それぞれ投入するか、又
はＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）抗
原単分子層に、抗体（ＧＳＴ抗体）が１０−２０％の濃
度で存在する蛋白質混合溶液を投与して、抗原−抗体引
力を通じて、表面に固定化される抗体の量を、直接重さ
変化により測定して分かる。図４ｂは、ＧＳＴ抗原の単
分子層に、分子量が１５０ＫＤのＧＳＴ抗体が付着され
る時の重さ変化を示すが、その重さ変化は、図４ａにお
いて見られるように抗原単分子層にＧＳＴ抗体と分子量
が類似するβ−Ｇａｌ抗体（分子量１６０ＫＤ）を投入
する時と、ほとんど類似することが分かる。図４ｃは、
β−Ｇａｌ抗体単分子層を製造した場合の重さ変化を示
すが、図４ａにおいて見られるように、β−Ｇａｌ抗原
の単分子層にβ−Ｇａｌ抗体が二重分子層として付着す
る時の重さ変化と、ほとんど同じである。
ことは、図４ａ及び４ｃにおいて示されるように、固定
化されたβ−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）抗原や、
抗体に対応する抗体や抗原を、それぞれ投入するか、又
はＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）抗
原単分子層に、抗体（ＧＳＴ抗体）が１０−２０％の濃
度で存在する蛋白質混合溶液を投与して、抗原−抗体引
力を通じて、表面に固定化される抗体の量を、直接重さ
変化により測定して分かる。図４ｂは、ＧＳＴ抗原の単
分子層に、分子量が１５０ＫＤのＧＳＴ抗体が付着され
る時の重さ変化を示すが、その重さ変化は、図４ａにお
いて見られるように抗原単分子層にＧＳＴ抗体と分子量
が類似するβ−Ｇａｌ抗体（分子量１６０ＫＤ）を投入
する時と、ほとんど類似することが分かる。図４ｃは、
β−Ｇａｌ抗体単分子層を製造した場合の重さ変化を示
すが、図４ａにおいて見られるように、β−Ｇａｌ抗原
の単分子層にβ−Ｇａｌ抗体が二重分子層として付着す
る時の重さ変化と、ほとんど同じである。
【００４１】この結果は、大きさが大きい抗体分子が、
大きさが相対的に小さい抗原分子の単分子層に付着する
時、１対１結合をすると、該抗体の分子層が、抗体のみ
から形成された単分子層の場合とほとんど同一の程度に
密に形成されることを意味する。図４ｃは、抗体単分子
層上に、相対的に大きさが小さい抗原分子が付着される
時、ほとんど１対１水準の結合がなされても、抗原の単
分子層を製造した場合より、実際に積層される抗原の分
子数が少ないので、重さ変化が抗原単分子層を製造した
場合より少ないことを示す。単分子層の製造に必要な濃
度の抗原が含まれている緩衝溶液を投与して、単分子層
の製造を行った後、更に、抗原をより高い濃度により投
与した時は、これ以上の意味のある重さ変化が現われな
いので、単分子層の製造以後は、これ以上同一の蛋白質
が、物理吸着により付着はされないことが分かる。
大きさが相対的に小さい抗原分子の単分子層に付着する
時、１対１結合をすると、該抗体の分子層が、抗体のみ
から形成された単分子層の場合とほとんど同一の程度に
密に形成されることを意味する。図４ｃは、抗体単分子
層上に、相対的に大きさが小さい抗原分子が付着される
時、ほとんど１対１水準の結合がなされても、抗原の単
分子層を製造した場合より、実際に積層される抗原の分
子数が少ないので、重さ変化が抗原単分子層を製造した
場合より少ないことを示す。単分子層の製造に必要な濃
度の抗原が含まれている緩衝溶液を投与して、単分子層
の製造を行った後、更に、抗原をより高い濃度により投
与した時は、これ以上の意味のある重さ変化が現われな
いので、単分子層の製造以後は、これ以上同一の蛋白質
が、物理吸着により付着はされないことが分かる。
【００４２】各実験時に使用した抗原又は抗体の溶液
を、次の蛋白質の投入前に除去し、緩衝溶液を満たした
後、次の蛋白質を投入する。上記の実験結果は、表面に
固定化された抗原と抗体が、対応する蛋白質と反応（抗
原−抗体反応）をするのに十分な程度の、活性を維持し
ていることを示している。以下において、上述した本発
明を例証するために、下記実施例を提供するが、この実
施例が、本発明の範囲を限定し、又は制限するものでは
ない。
を、次の蛋白質の投入前に除去し、緩衝溶液を満たした
後、次の蛋白質を投入する。上記の実験結果は、表面に
固定化された抗原と抗体が、対応する蛋白質と反応（抗
原−抗体反応）をするのに十分な程度の、活性を維持し
ていることを示している。以下において、上述した本発
明を例証するために、下記実施例を提供するが、この実
施例が、本発明の範囲を限定し、又は制限するものでは
ない。
【００４３】
【実施例】実施例１ 乾燥した容器にＣＨＣｌ3 ２０ｍＬを入れた後、その
容器を氷槽に入れて冷やしながら、窒素気流下に攪拌し
た。その容器内に、ＣＨ3ＯＣＨ2Ｃｌ ０．４６８ｍｌ
（６．１６ｍｍｏｌ）を入れ、２分ほど過ぎた後、Ｓｎ
Ｃｌ4 ０．５７７ｍｌ（４．９３ｍｍｏｌ）を、３〜
４分に亙って徐々に入れた。１５分後に、ＣＨＣｌ3の
適当量（３０乃至５０ｍｌ）に溶かしたカリックス
［４］アレン−ビスクラウン−４（ＣＡＢＣＲ−４）１
００ｍｇ（０．１５４ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。５分
後に、氷槽を除去し、常温に温度を上げながら、１時間
反応させる。反応溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2の適当量（３０乃
至５０ｍｌ）を加えて希釈した後、氷を入れて、冷たい
状態において攪拌しながら、余分のＳｎＣｌ4を除去し
た。有機層を分離した後、冷たい脱イオン水で２回洗滌
した。乾燥剤を入れて乾燥した後、乾燥剤を除去し、溶
媒を減圧蒸留して除去した後、目的物のＴＣＣＡＢＣＲ
−４（１０２ｍｇ、８０％収率）を得た。
容器を氷槽に入れて冷やしながら、窒素気流下に攪拌し
た。その容器内に、ＣＨ3ＯＣＨ2Ｃｌ ０．４６８ｍｌ
（６．１６ｍｍｏｌ）を入れ、２分ほど過ぎた後、Ｓｎ
Ｃｌ4 ０．５７７ｍｌ（４．９３ｍｍｏｌ）を、３〜
４分に亙って徐々に入れた。１５分後に、ＣＨＣｌ3の
適当量（３０乃至５０ｍｌ）に溶かしたカリックス
［４］アレン−ビスクラウン−４（ＣＡＢＣＲ−４）１
００ｍｇ（０．１５４ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。５分
後に、氷槽を除去し、常温に温度を上げながら、１時間
反応させる。反応溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2の適当量（３０乃
至５０ｍｌ）を加えて希釈した後、氷を入れて、冷たい
状態において攪拌しながら、余分のＳｎＣｌ4を除去し
た。有機層を分離した後、冷たい脱イオン水で２回洗滌
した。乾燥剤を入れて乾燥した後、乾燥剤を除去し、溶
媒を減圧蒸留して除去した後、目的物のＴＣＣＡＢＣＲ
−４（１０２ｍｇ、８０％収率）を得た。
【００４４】実施例２ ＴＣＣＡＢＣＲ−４ １１５ｍｇ（０．１３６ｍｍｏ
ｌ）と、チオウレア ４１．３ｍｇ（０．５４４ｍｍｏ
ｌ）を、エタノール ３０ｍＬに溶かした。Ａｒガスを
１分程度混合物に通過させた後、Ａｒ気体雰囲気下にお
いて反応を行った。反応物を、４５℃〜５５℃において
６０分間ソニック処理（sonication）した。この混合物
に、ＮａＯＨ ３２．６４ｍｇ（０．８１６ｍｍｏｌ）
を入れた後、３０分間ソニック処理した。反応後、１Ｎ
ＨＣｌにより反応溶液のｐＨを４に合わせた。反応物
を、ＣＨ2Ｃｌ2の適当量（３０乃至５０ｍｌ）に溶かし
た後、水でリンスし、有機溶媒を乾燥させた後、有機溶
媒を減圧下において除去し、得られた物質を、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン−エチ
ルアセテート）により精製して、ＴＭＣＡＢＣＲ−４
５４ｍｇを得た。ＮａＳＨを使用して−Ｃｌを−ＳＨに
変える過程は、ＴＣＣＡＢＣＲ−４の８倍モル濃度のＮ
ａＳＨを使用して、エタノール溶媒３０ｍＬにおいて１
時間ソニック処理し、同じ精製過程を経て行われ、上記
の反応と同じ収率の結果物が得られた。
ｌ）と、チオウレア ４１．３ｍｇ（０．５４４ｍｍｏ
ｌ）を、エタノール ３０ｍＬに溶かした。Ａｒガスを
１分程度混合物に通過させた後、Ａｒ気体雰囲気下にお
いて反応を行った。反応物を、４５℃〜５５℃において
６０分間ソニック処理（sonication）した。この混合物
に、ＮａＯＨ ３２．６４ｍｇ（０．８１６ｍｍｏｌ）
を入れた後、３０分間ソニック処理した。反応後、１Ｎ
ＨＣｌにより反応溶液のｐＨを４に合わせた。反応物
を、ＣＨ2Ｃｌ2の適当量（３０乃至５０ｍｌ）に溶かし
た後、水でリンスし、有機溶媒を乾燥させた後、有機溶
媒を減圧下において除去し、得られた物質を、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン−エチ
ルアセテート）により精製して、ＴＭＣＡＢＣＲ−４
５４ｍｇを得た。ＮａＳＨを使用して−Ｃｌを−ＳＨに
変える過程は、ＴＣＣＡＢＣＲ−４の８倍モル濃度のＮ
ａＳＨを使用して、エタノール溶媒３０ｍＬにおいて１
時間ソニック処理し、同じ精製過程を経て行われ、上記
の反応と同じ収率の結果物が得られた。
【００４５】実施例３ ＴＣＣＡＢＣＲ−４ １１５ｍｇ（０．１３６ｍｍｏ
ｌ）と、チオウレア ４１．３ｍｇ（０．５４４ｍｍｏ
ｌ）を、エタノール ３０ｍＬに溶かした。溶媒内の酸
素を除去せず、反応を行った。反応物を、４５℃〜５５
℃において６０分間ソニック処理した。この混合物に、
ＮａＯＨ ３２．６４ｍｇ（０．８１６ｍｍｏｌ）を入
れた後、３０分間ソニック処理した。反応後、１Ｎ Ｈ
Ｃｌを使用して反応溶液のｐＨを４に合わせた。反応物
を、ＣＨ2Ｃｌ2 ３０乃至５０ｍｌに溶かした後、水で
リンスし、有機溶媒を乾燥させた後、有機溶媒を減圧下
に除去し、得られる物質を、シリカゲルカラムクロマト
グラフィー（溶出液：ヘキサン−エチルアセテート）に
より精製して、ＤＤＳＣＡＢＣＲ−４ ６０ｍｇを得
た。
ｌ）と、チオウレア ４１．３ｍｇ（０．５４４ｍｍｏ
ｌ）を、エタノール ３０ｍＬに溶かした。溶媒内の酸
素を除去せず、反応を行った。反応物を、４５℃〜５５
℃において６０分間ソニック処理した。この混合物に、
ＮａＯＨ ３２．６４ｍｇ（０．８１６ｍｍｏｌ）を入
れた後、３０分間ソニック処理した。反応後、１Ｎ Ｈ
Ｃｌを使用して反応溶液のｐＨを４に合わせた。反応物
を、ＣＨ2Ｃｌ2 ３０乃至５０ｍｌに溶かした後、水で
リンスし、有機溶媒を乾燥させた後、有機溶媒を減圧下
に除去し、得られる物質を、シリカゲルカラムクロマト
グラフィー（溶出液：ヘキサン−エチルアセテート）に
より精製して、ＤＤＳＣＡＢＣＲ−４ ６０ｍｇを得
た。
【００４６】実施例４ 乾燥した容器にＣＨＣｌ3 ２０ｍＬを入れ、その容器
を氷槽に入れて冷やしながら、窒素気流下に攪拌した。
その容器に、ＣＨ3ＯＣＨ2Ｃｌ ０．５１５ｍＬ（６．
５６ｍｍｏｌ）を入れ、２分程度過ぎた後、ＳｎＣｌ4
０．６１２ｍＬ（５．２３ｍｍｏｌ）を３〜４分に亙
って徐々に入れた。１５分後に、１，３−ジメトキシカ
リックス［４］アレンクラウン−５（ＤＭＣＡＣＲ−
５） １００ｍｇ（０．１６４ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ
３適当量（３０乃至５０ｍｌ）に溶かした後、上記容器
に徐々に加えた。ＤＭＣＡＣＲ−５を全て加えた後、５
分間、氷槽において攪拌した後、１０分に亙って常温に
温度を上げた後、１時間反応させた。反応溶液に、ＣＨ
2Ｃｌ2適当量（３０乃至５０ｍｌ）を加えて希釈した
後、氷を入れて冷たい状態において攪拌して、余分のＳ
ｎＣｌ4を除去した。有機層を分離した後、冷たい脱イ
オン水により２回洗滌した。その後、乾燥剤を入れて乾
燥した後これを除去し、溶媒を減圧蒸留して除去した
後、結果物ＴＣＤＭＣＡＣＲ−５（９９ｍｇ、７５％収
率）を得た。
を氷槽に入れて冷やしながら、窒素気流下に攪拌した。
その容器に、ＣＨ3ＯＣＨ2Ｃｌ ０．５１５ｍＬ（６．
５６ｍｍｏｌ）を入れ、２分程度過ぎた後、ＳｎＣｌ4
０．６１２ｍＬ（５．２３ｍｍｏｌ）を３〜４分に亙
って徐々に入れた。１５分後に、１，３−ジメトキシカ
リックス［４］アレンクラウン−５（ＤＭＣＡＣＲ−
５） １００ｍｇ（０．１６４ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ
３適当量（３０乃至５０ｍｌ）に溶かした後、上記容器
に徐々に加えた。ＤＭＣＡＣＲ−５を全て加えた後、５
分間、氷槽において攪拌した後、１０分に亙って常温に
温度を上げた後、１時間反応させた。反応溶液に、ＣＨ
2Ｃｌ2適当量（３０乃至５０ｍｌ）を加えて希釈した
後、氷を入れて冷たい状態において攪拌して、余分のＳ
ｎＣｌ4を除去した。有機層を分離した後、冷たい脱イ
オン水により２回洗滌した。その後、乾燥剤を入れて乾
燥した後これを除去し、溶媒を減圧蒸留して除去した
後、結果物ＴＣＤＭＣＡＣＲ−５（９９ｍｇ、７５％収
率）を得た。
【００４７】実施例５ ＴＣＤＭＣＡＣＲ−５ １００ｍｇ（０．１２４ｍｍｏ
ｌ）と、チオウレア３８ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）を、
エタノール ２５ｍＬに溶かした。Ａｒガスを１分程度
混合物に通過させた後、Ａｒ気体雰囲気下において反応
を行った。反応物を、４５℃〜５５℃において６０分間
ソニック処理した。この混合物にＮａＯＨ ３０ｍｇ
（０．７５ｍｍｏｌ）を入れた後、３０分間ソニック処
理した。反応後、１Ｎ ＨＣｌにより、反応溶液のｐＨ
を４に合わせた。反応物を、ＣＨ 2Ｃｌ2適当量（３０乃
至５０ｍｌ）に溶かした後、水で３回リンスし、これを
乾燥した後、有機溶媒を減圧下において除去し、得られ
る物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出
液：ヘキサン−エチルアセテート）により精製して、Ｔ
ＭＤＭＣＡＣＲ−５ ５５ｍｇを得た。
ｌ）と、チオウレア３８ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）を、
エタノール ２５ｍＬに溶かした。Ａｒガスを１分程度
混合物に通過させた後、Ａｒ気体雰囲気下において反応
を行った。反応物を、４５℃〜５５℃において６０分間
ソニック処理した。この混合物にＮａＯＨ ３０ｍｇ
（０．７５ｍｍｏｌ）を入れた後、３０分間ソニック処
理した。反応後、１Ｎ ＨＣｌにより、反応溶液のｐＨ
を４に合わせた。反応物を、ＣＨ 2Ｃｌ2適当量（３０乃
至５０ｍｌ）に溶かした後、水で３回リンスし、これを
乾燥した後、有機溶媒を減圧下において除去し、得られ
る物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出
液：ヘキサン−エチルアセテート）により精製して、Ｔ
ＭＤＭＣＡＣＲ−５ ５５ｍｇを得た。
【００４８】実施例６ 図１のような、カリックスクラウン誘導体の自己組立単
分子層を、ＴＭＤＭＣＡＣＲ−５化合物を利用して製造
した。真空蒸着された金基質をクリーニングした後、窒
素雰囲気下において乾燥させた。この基質を、ＴＭＤＭ
ＣＡＣＲ−５が２ｍＭ濃度に溶けているＣＨＣｌ3適当
量（３０乃至５０ｍｌ）の溶液に３時間程度浸した。金
基質を、アセトンで洗い、乾燥させて、ＴＭＤＭＣＡＣ
Ｒ−５自己組立単分子層の製造を完了した。この基質
に、外部反射赤外線分光分析（ＦＴ−ＩＲ ＥＲＳ）を
行うと、１０４０ｃｍ-1において、クラウン環の特徴的
な、Ｃ−Ｏストレッチングモードと、１４８０ｃｍ-1に
おいて、カリックスアレンの特徴的な芳香族ストレッチ
ングモードの、強い吸収バンドが現れるので、カリック
スクラウン化合物が、基質の表面に、単分子層を形成し
ていることを確認することができた。
分子層を、ＴＭＤＭＣＡＣＲ−５化合物を利用して製造
した。真空蒸着された金基質をクリーニングした後、窒
素雰囲気下において乾燥させた。この基質を、ＴＭＤＭ
ＣＡＣＲ−５が２ｍＭ濃度に溶けているＣＨＣｌ3適当
量（３０乃至５０ｍｌ）の溶液に３時間程度浸した。金
基質を、アセトンで洗い、乾燥させて、ＴＭＤＭＣＡＣ
Ｒ−５自己組立単分子層の製造を完了した。この基質
に、外部反射赤外線分光分析（ＦＴ−ＩＲ ＥＲＳ）を
行うと、１０４０ｃｍ-1において、クラウン環の特徴的
な、Ｃ−Ｏストレッチングモードと、１４８０ｃｍ-1に
おいて、カリックスアレンの特徴的な芳香族ストレッチ
ングモードの、強い吸収バンドが現れるので、カリック
スクラウン化合物が、基質の表面に、単分子層を形成し
ていることを確認することができた。
【００４９】実施例７ 図２のような蛋白質単分子層は、次のように製造するこ
とができた。実施例６において製造した、金基質上のカ
リックスクラウン誘導体の単分子層を、β−ガラクトシ
ダーゼ抗原が０．１μｍ濃度で存在する０．８３ｍＭ
ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液、Ｎａ+及びＫ+含有）緩衝溶
液に浸し、１時間後に、緩衝溶液により洗滌すると、β
−ガラクトシダーゼ抗原単分子層が製造された。この実
験の結果は、クワルツ結晶微視秤を利用して測定した図
４ａに示されている。実時間帯に、この蛋白質単分子層
の製造を行うと、２．４μｇ／ｃｍ2、即ち、２．４μ
ｇ程度の抗原が、１ｃｍ2に固定化された。また、ＱＣ
Ｍ実験時に、固定化がなされるまでは、３分程度の時間
が必要であった。固定化された抗原単分子層に対し、原
子間力顕微鏡を利用して、実際使用した基質と表面にお
ける変化を観察した実験結果が、図５と６に提示されて
いる。図５と６を見ると、表面が蛋白質単分子層製造の
前後で完全に相違しており、蛋白質が表面に固定化され
ていることを確認することができる。たとえ、３分程度
で、蛋白質単分子層の製造が完了しても、原子間力顕微
鏡測定時のチップ（AFM tip）による摩擦力に耐えるた
めには、１時間の固定化時間が必要である。図４ａ、４
ｂ及び４ｃにおいて、最初に投入した蛋白質の濃度は、
全て０．１μＭである。図４ａ、４ｂ及び４ｃは、それ
ぞれの蛋白質単分子層に対応する蛋白質を、０．１μＭ
濃度により投入した時に現れる重さ変化を図示する。図
４ａは、抗原単分子層に１６０ＫＤの分子量を有する抗
体単分子層を投入すると、抗原の二倍に近い重さ変化が
生じることを示しており、図４ｂは、軽いＧＳＴ抗原単
分子層に分子量が１５０ＫＤの抗体を投入すると、１６
０ＫＤ分子量の抗体をβ−ガラクトシダーゼ抗原単分子
層に投入した時と、ほとんど同じ重さ変化が表面におい
て起こることを示す。このような重さ変化は、蛋白質が
表面に密に満たされた時の重さ変化と一致するものであ
り、これは、表面に固定化された蛋白質等が活性をほと
んど完全に維持していることを示す。
とができた。実施例６において製造した、金基質上のカ
リックスクラウン誘導体の単分子層を、β−ガラクトシ
ダーゼ抗原が０．１μｍ濃度で存在する０．８３ｍＭ
ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液、Ｎａ+及びＫ+含有）緩衝溶
液に浸し、１時間後に、緩衝溶液により洗滌すると、β
−ガラクトシダーゼ抗原単分子層が製造された。この実
験の結果は、クワルツ結晶微視秤を利用して測定した図
４ａに示されている。実時間帯に、この蛋白質単分子層
の製造を行うと、２．４μｇ／ｃｍ2、即ち、２．４μ
ｇ程度の抗原が、１ｃｍ2に固定化された。また、ＱＣ
Ｍ実験時に、固定化がなされるまでは、３分程度の時間
が必要であった。固定化された抗原単分子層に対し、原
子間力顕微鏡を利用して、実際使用した基質と表面にお
ける変化を観察した実験結果が、図５と６に提示されて
いる。図５と６を見ると、表面が蛋白質単分子層製造の
前後で完全に相違しており、蛋白質が表面に固定化され
ていることを確認することができる。たとえ、３分程度
で、蛋白質単分子層の製造が完了しても、原子間力顕微
鏡測定時のチップ（AFM tip）による摩擦力に耐えるた
めには、１時間の固定化時間が必要である。図４ａ、４
ｂ及び４ｃにおいて、最初に投入した蛋白質の濃度は、
全て０．１μＭである。図４ａ、４ｂ及び４ｃは、それ
ぞれの蛋白質単分子層に対応する蛋白質を、０．１μＭ
濃度により投入した時に現れる重さ変化を図示する。図
４ａは、抗原単分子層に１６０ＫＤの分子量を有する抗
体単分子層を投入すると、抗原の二倍に近い重さ変化が
生じることを示しており、図４ｂは、軽いＧＳＴ抗原単
分子層に分子量が１５０ＫＤの抗体を投入すると、１６
０ＫＤ分子量の抗体をβ−ガラクトシダーゼ抗原単分子
層に投入した時と、ほとんど同じ重さ変化が表面におい
て起こることを示す。このような重さ変化は、蛋白質が
表面に密に満たされた時の重さ変化と一致するものであ
り、これは、表面に固定化された蛋白質等が活性をほと
んど完全に維持していることを示す。
【００５０】
【発明の効果】本発明は、従来の蛋白質固定化方法とし
て使用された化学結合方式や物理吸着方式等において現
れた問題点を解決することができる、分子認識を利用し
た、新規な蛋白質固定化方法である。この方法は、単純
に、カリックスクラウン化合物が自己組立単分子層をな
している固体基質を、固定化させる蛋白質の水溶液に浸
しておくだけで、１時間以内に、分子量２０，０００Ｄ
（２０ＫＤ）以上の全ての種類の蛋白質を、活性を失わ
ない状態で、他の蛋白質が固定化される空間を残さない
程度に密に付着させることができる。これにより、非特
異性蛋白質の固定化を誘発していた、従来の固定化反応
における大きな問題点が解決されると同時に、非特異性
蛋白質の固定化を抑制するために、必須的に使用しなけ
ればならなかった化学物質の使用を不要にして、時間を
節約するとともに、固定化された蛋白質の活性維持を画
期的に改善し、また、特定蛋白質の認識に必要な蛋白質
単分子層を直接製造して使用するので、時間と経費の節
減の効果が極めて大きい。従って、本発明は、蛋白質チ
ップ、診断キット及びバイオセンサーの未来の開発に対
し幅広く適用することができる。また、カリックスクラ
ウン誘導体を、既存の方式により製造する時は、クラウ
ン環の安定性が問題となっていたが、本発明において
は、このような問題点は解決され、高い収率で所望のカ
リックスクラウン分子の合成をすることができるように
なった。
て使用された化学結合方式や物理吸着方式等において現
れた問題点を解決することができる、分子認識を利用し
た、新規な蛋白質固定化方法である。この方法は、単純
に、カリックスクラウン化合物が自己組立単分子層をな
している固体基質を、固定化させる蛋白質の水溶液に浸
しておくだけで、１時間以内に、分子量２０，０００Ｄ
（２０ＫＤ）以上の全ての種類の蛋白質を、活性を失わ
ない状態で、他の蛋白質が固定化される空間を残さない
程度に密に付着させることができる。これにより、非特
異性蛋白質の固定化を誘発していた、従来の固定化反応
における大きな問題点が解決されると同時に、非特異性
蛋白質の固定化を抑制するために、必須的に使用しなけ
ればならなかった化学物質の使用を不要にして、時間を
節約するとともに、固定化された蛋白質の活性維持を画
期的に改善し、また、特定蛋白質の認識に必要な蛋白質
単分子層を直接製造して使用するので、時間と経費の節
減の効果が極めて大きい。従って、本発明は、蛋白質チ
ップ、診断キット及びバイオセンサーの未来の開発に対
し幅広く適用することができる。また、カリックスクラ
ウン誘導体を、既存の方式により製造する時は、クラウ
ン環の安定性が問題となっていたが、本発明において
は、このような問題点は解決され、高い収率で所望のカ
リックスクラウン分子の合成をすることができるように
なった。
【図１】本発明のカリックスクラウン誘導体の自己組立
単分子層の製造過程の概略図である。
単分子層の製造過程の概略図である。
【図２】本発明の蛋白質単分子層の固定化方法について
の概略図である。
の概略図である。
【図３】図２において製造された蛋白質単分子層の活性
を研究するために、抗原又は抗体の単分子層と、溶液状
の蛋白質との認識過程を示す概略図である。
を研究するために、抗原又は抗体の単分子層と、溶液状
の蛋白質との認識過程を示す概略図である。
【図４】蛋白質単分子層の製造と、その蛋白質単分子層
に対応する蛋白質を投与して、実時間帯において、抗原
−抗体引力を測定した結果を示す図である。
に対応する蛋白質を投与して、実時間帯において、抗原
−抗体引力を測定した結果を示す図である。
【図５】カリックスクラウン単分子層上に製造されたβ
−ガラクトシダーゼ抗原蛋白質単分子層を、原子間力顕
微鏡（Atomic Force Microscope：ＡＦＭ）で撮った写
真である。
−ガラクトシダーゼ抗原蛋白質単分子層を、原子間力顕
微鏡（Atomic Force Microscope：ＡＦＭ）で撮った写
真である。
【図６】カリックスクラウン単分子層上に製造されたβ
−ガラクトシダーゼ抗体蛋白質単分子層を、原子間力顕
微鏡で撮った写真である。
−ガラクトシダーゼ抗体蛋白質単分子層を、原子間力顕
微鏡で撮った写真である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C022 NA04 4C071 AA03 AA07 AA08 CC15 CC22 DD31 DD34 EE08 EE16 FF18 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 HH05 HH08 4H045 AA20 BA62 BA63 DA86 EA50 FA81
Claims (7)
- 【請求項１】 下記化学式（１）のカリックス［４］ア
レン−ビスクラウン−４の誘導体： 上記式（１）中において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互
いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ基を示すか、又はＲ1乃至Ｒ4
のうち二つが、互いに結合してそれぞれ−ＣＨ 2−Ｓ−
Ｓ−ＣＨ2−基を形成することができ；又はＲ1、Ｒ2、
Ｒ3及びＲ4は、独立的に−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−
ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨであり
得る。 - 【請求項２】 下記化学式（２）のカリックス［４］ア
レン−クラウン−５の誘導体： 上記式（２）中において、ｎは１であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ
3及びＲ4は、それぞれ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−Ｃ
Ｈ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2Ｃ
ＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞれ−ＣＨ
2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−
ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2及びＲ4
は、それぞれＨを示すことができ；Ｒ5及びＲ6は、互い
に独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル又はイソブチルを示す。 - 【請求項３】 下記化学式（３）のカリックス［４］ア
レン−クラウン−６の誘導体： 上記式（３）中において、ｎは２であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ
3及びＲ4は、互いに独立的に−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃ
ｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−
ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示すか；又はＲ1及びＲ3は、それぞ
れ−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2Ｃ
ＨＯ、−ＣＨ2ＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＯＨ基を示し、Ｒ2
及びＲ4は、それぞれ−Ｈ基を示し；Ｒ5及びＲ6は、互
いに独立的に、−Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソ
プロピル又はイソブチルを示す。 - 【請求項４】 請求項２又は請求項３に記載の化学式に
おいて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＨであり、Ｒ5及びＲ6
が−ＣＨ3の化合物、又は請求項１に記載の化学式にお
いて、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＨの化合物を、クロロメ
チル化反応させて、Ｒ1乃至Ｒ4のうち二つ又は四つの作
用基を−ＣＨ2Ｃｌ基に変換させた後、場合によってそ
れぞれのＣｌ基を、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＨＯ、−ＮＨ
2又は−ＣＯＯＨ基に変換させるか、又は二つのＣｌ基
を、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）基に変換させて製造す
ることを特徴とする、請求項１乃至請求項３のいずれか
一項記載のカリックスクラウン誘導体の製造方法。 - 【請求項５】 蛋白質チップ、診断キット又は蛋白質分
離パックを製造するための、請求項１乃至請求項３によ
る化学式（１）乃至（３）の少なくとも一つの化合物
を、金、銀、ガラス、珪素、ポリスチレン及びポリカー
ボネートからなる群から選ばれる無機又は有機固体基質
の上に適用することを特徴とする蛋白質の固定化方法。 - 【請求項６】 請求項１乃至請求項３の少なくとも一つ
の化合物が、１乃至３ｍＭの濃度で溶けている有機溶液
に、真空蒸着された金基質又は関連金属基質を、１乃至
２４時間浸して製造されることを特徴とする、請求項１
乃至請求項３のいずれか一項記載のカリックスクラウン
誘導体の自己組立単分子層。 - 【請求項７】 請求項６のカリックスクラウン誘導体の
自己組立単分子層を、分子量が２０，０００Ｄ（２０Ｋ
Ｄ）以上の蛋白質が数ｎＭ乃至数μＭの濃度で溶けてい
る緩衝溶液に、１乃至２時間浸して、上記蛋白質を上記
自己組立単分子層上に固定化させることを特徴とする、
蛋白質単分子層の固定化方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990061074A KR100352815B1 (ko) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | 신규한 캘릭스크라운 유도체, 그의 제조 방법, 그를이용하여 제조된 자기조립 단분자층 및 그의 자기조립단분자층을 이용하는 단백질 단분자층의 고정화 방법 |
| KR1999P61074 | 1999-12-23 | ||
| US09/632,157 US6485984B1 (en) | 1999-12-23 | 2000-08-03 | Calixcrown derivatives, a process for the preparation thereof, a self-assembled mono-layer of the calixcrown derivatives prepared by using the same and a process for immobilizing a protein mono-layer by using the self-assembled mono-layer of the calixcrown derivatives |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006130163A Division JP2006219499A (ja) | 1999-12-23 | 2006-05-09 | 新規なカリックスクラウン誘導体、その製造方法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及びその自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001181275A true JP2001181275A (ja) | 2001-07-03 |
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ID=26636530
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000242413A Expired - Fee Related JP3831183B2 (ja) | 1999-12-23 | 2000-08-10 | 新規なカリックスクラウン誘導体、その製造方法、それを利用して製造された自己組立単分子層、及びその自己組立単分子層を利用する蛋白質単分子層の固定化方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6485984B1 (ja) |
| EP (1) | EP1110964A1 (ja) |
| JP (1) | JP3831183B2 (ja) |
| KR (1) | KR100352815B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005336135A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | ビスアミノフェノール化合物 |
| JP2008233011A (ja) * | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Chube Univ | 腸管出血性大腸菌ｏ−１５７：ｈ７産生ベロ毒素の検出法、検出用器具、及び検出用キット |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020005085A (ko) * | 2000-07-06 | 2002-01-17 | 최의열 | 아민기가 부착된 고체기질에 비스크라운-4 유도체를화학결합시켜 비스크라운 -4단분자층의 제조법 및 이기질을 이용한 단백질 단분자층의 제조방법 |
| AU7595701A (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-30 | Harvard College | Surfaces that resist the adsorption of biological species |
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