JP2001083093A - 蛍光分光光度計 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 励起光を生成する光学素子に劣化が生じて
も、蛍光量を正しく補正することにより安定的に感度が
維持される蛍光分光光度計を提供する。 【解決手段】 データ記憶部６４には、励起波長と迷光
比率との関係を示す変換テーブル６５が保存されてい
る。この変換テーブル６５に基づき、データ処理部６３
は、対照光検出器３４が出力する信号の強度に基づいて
求められる光量から、光源１１の点灯により起因する迷
光に相当する量を差し引いた量を真の対照光量として求
める。このように求められた真の対照光量を用いて蛍光
検出器５４の出力信号の強度を補正することにより、迷
光の影響を受けない正しい蛍光量を求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光分光光度計に
関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に蛍光分光光度計は、光源が発する
光から所定波長の光を分離し、その光を励起光として試
料に照射する励起分光系、励起光を受けたときに試料が
発する蛍光から所定波長の光を分離する蛍光分光系、及
び、蛍光分光系により分離された光を検出してその量に
応じた信号（以下、蛍光信号とよぶ）を出力する蛍光検
出器を備えている。このような蛍光分光光度計におい
て、試料が発する蛍光の量はその試料に照射された励起
光の量に比例するため、蛍光信号に基づいて試料の定量
分析を行おうとしても、正しい分析結果は得られない。
このことを考慮し、多くの蛍光分光光度計では、ビーム
スプリッタ等の光学素子を用いて励起光の一部を対照光
（リファレンス光）として取り出し、該対照光の量を光
ダイオード等の検出器（以下、対照光検出器とよぶ）に
より検出し、該対照光検出器の出力信号（以下、対照光
信号とよぶ）に基づいて蛍光信号を補正するようにして
いる。より具体的には、蛍光信号の強度と対照光信号の
強度との比に応じた信号を測定信号として最終的に出力
する。このようにすると、例えば光源光量の変動等によ
り励起光量が変化しても、測定信号がそれに影響される
ことがなくなる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記蛍光分光光度計の
対照光検出器で検出される光には、励起光から抽出され
る対照光だけでなく、光源の点灯に起因する迷光も含ま
れている。この迷光量が対照光量に対して無視しうる程
度に小さい場合は、上記のような補正により十分に正し
い測定信号が得られる。しかし、実際には、対照光量に
対する迷光量の比率が上記補正にとって無視しえない程
度に大きくなる場合もある。例えば、一般に光源の光量
は波長に応じて変化するため、特定の波長又は波長領域
で励起光量が極めて小さくなることがある。このような
場合、励起光から取り出される対照光の量もそれに応じ
て小さくなり、迷光の影響が無視できなくなる。また、
蛍光分光光度計では励起光の光源としてキセノンランプ
等の強力な光源を用いるのが一般的であるが、励起分光
系に用いられる反射鏡や回折格子等の光学素子は、その
ような強力な光を長期に渡って受けることにより徐々に
劣化し、その反射率が短波長側から徐々に低下してく
る。この結果、短波長領域における励起光量が極めて小
さくなり、それから取り出される対照光量が小さくなっ
て、迷光の影響が無視できなくなる。以上のように、迷
光の影響が無視できない程度にまで対照光量が小さくな
ると、上記対照光信号の強度は真の対照光量に対応する
強度よりも大きくなるため、その対照光信号に基づく上
記補正処理により得られる測定信号の強度は正しい強度
よりも小さくなってしまう。しかし、このような問題
は、上記従来の蛍光分光光度計では全く考慮されていな
かった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に成された本発明は、光源が発する光から所定波長の光
を励起光として分離し、該励起光を試料に照射する励起
分光系、前記励起光を受けたときに前記試料が発する蛍
光の一部を検出し、その量を示す蛍光信号を出力する第
一の光検出器、及び、前記励起光の一部を対照光として
受けるように配置された第二の光検出器を備える蛍光分
光光度計において、前記第二の光検出器の出力信号と前
記光源の点灯に起因する迷光に相当する信号成分との差
分に相当する対照光信号を出力する対照光信号生成手
段、及び前記対照光信号に基づいて前記蛍光信号を補正
することにより得られる信号を測定信号として出力する
信号補正手段を備えることを特徴とする蛍光分光光度計
を提供するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明に係る蛍光分光光度計で
は、第二の光検出器が出力する信号をそのまま対照光量
を示す信号とするのではなく、その信号から迷光に相当
する信号成分を差し引いた差分を、対照光量を示す信号
（対照光信号）としている。

【０００６】上記対照光信号生成手段の一例としては、
前記励起分光系により生成する励起光の波長を設定する
ための波長設定手段前記波長設定手段により設定される
波長と、該波長の励起光を生成している間に前記第二の
検出器が受ける光量に対する迷光量の比率との関係を示
すデータを保存するための記憶手段、及び前記波長設定
手段により設定された波長及び該波長に対応する迷光量
の比率に基づいて前記第二の光検出器の出力信号を処理
することにより前記対照光信号を生成する信号処理手段
を備えるものが挙げられる。

【０００７】上記記憶手段に保存するデータは、例えば
次のような手順で作成される。まず、波長設定手段によ
り励起光の波長を設定するとともに、その波長の光を遮
断するような光学フィルタを前記対照光の光路上に配置
し、光源を点灯する。このような条件下では、第二の光
検出器は迷光だけを検出する。従って、そのときの第二
の光検出器の出力信号の強度に基づいて光の量を求めれ
ば、それがすなわち先に設定された波長に対応する迷光
量となる。このようにして、所定波長範囲内の各波長に
対応する迷光量を求める。こうして励起光の波長と迷光
量との関係を示すデータを収集し、そのデータを、例え
ば波長から迷光量への変換テーブルや関数の形で記憶手
段に保存する。

【０００８】上記のようなデータは、励起光の波長を設
定可能な波長領域全体について作成してもよいが、迷光
比率の比較的小さい波長領域では迷光の影響が無視でき
ることから、迷光比率の比較的大きい特定の波長領域
（つまり、光源の発光量の小さい波長領域）についての
み、データを作成するようにしてもよい。また、上記の
ようなデータは、データ作成の対象とされた波長領域内
で設定可能な全ての波長について予め作成しておくこと
が好ましいが、これは本発明にとって必須ではない。例
えば、上記波長領域内において適度な波長間隔をおいて
選択された複数の波長についてのみ上記のようなデータ
を予め作成し、実際の測定時には、上記データに基づく
周知のデータ補間処理により、実際に設定された波長に
対応する迷光量を算出するようにしてもよい。

【０００９】

【発明の効果】以上のような本発明に係る蛍光分光光度
計では、迷光比率が比較的大きい波長領域の励起光を用
いても、迷光の影響を補償した正しい測定信号が出力さ
れるため、従来よりも広い波長範囲の励起光を測定に利
用することができる。また、回折格子等の光学素子の劣
化によりある波長領域で励起光量が減少しても、測定信
号はそれに影響されない。このように本発明によれば、
蛍光分光光度計の感度が広い波長範囲に渡って長期的に
維持される。

【００１０】

【実施例】図１は本発明の一実施例である蛍光分光光度
計の概略的構成を示す図である。図１の蛍光分光光度計
１は、光源部１０、励起分光部２０、モニタ部３０、試
料室４０及び蛍光分光部５０から主として成る。光源部
１０は、光源１１（例えば、キセノンランプ）の発する
光を集めるための集光鏡１２を備えている。集光鏡１２
により集められた光は、第一のスリット１３を通って励
起分光部２０に入る。励起分光部２０に入った光は反射
鏡２１により第一の回折格子２２へ向けて反射され、該
回折格子２２により波長方向に分散される。回折格子２
２により分散された光の一部は第二のスリット２３を通
ってモニタ部３０へ入る。こうしてモニタ部３０へ入っ
た光が本発明にいう励起光に相当する。更に、励起分光
部２０には、回転軸２２ａを中心として回折格子２２を
回転駆動するための格子駆動機構２４が備えられてい
る。励起光の波長は、格子駆動機構２４で回折格子２２
の向きを適宜変えることにより、所定波長範囲内で任意
に設定することができる。

【００１１】モニタ部３０における励起光の光路上には
ビームスプリッタ３１が配置されており、これにより励
起光は２方向に分離される。すなわち、励起光の一部は
ビームスプリッタ３１を通過し、第一のレンズ３２によ
り集められ、試料室４０内に配置された試料セル４１に
到達する。一方、励起光の他の部分はビームスプリッタ
３１により反射され、第二のレンズ３３により集めら
れ、対照光検出器３４（例えばフォトダイオード）によ
り検出される。なお、励起光のうちビームスプリッタ３
１により反射された部分が本発明にいう対照光に相当す
る。

【００１２】試料セル４１に励起光が到達すると、その
中の試料が蛍光を発する。この蛍光の一部は、第三のレ
ンズ４２により集められ、蛍光分光部５０へ入る。蛍光
分光部５０へ入った蛍光の一部は、第三のスリット５１
を通って第二の回折格子５２に到達し、該回折格子５２
により波長方向に分散される。こうして分散された光の
うち、ある波長を有する一部の光は第四のスリット５３
を通じて蛍光検出器５４（例えば、光電子増倍管）によ
り検出される。更に、蛍光分光部５０には、回転軸５２
ａを中心として回折格子５２を回転駆動するための格子
駆動機構５５が備えられている。蛍光検出器５４により
検出される光の波長は、格子駆動機構５５で回折格子５
２の向きを適宜変えることにより、所定波長範囲内で任
意に設定することができる。

【００１３】図２は蛍光分光光度計１の制御系６０の概
略的構成を示すブロック図である。この制御系６０の中
心は中央制御部６１であり、使用者は操作部６２を通じ
て中央制御部６１へ各種命令や設定データを入力するこ
とができる。使用者が、励起光を生成する波長（励起波
長）や蛍光を検出する波長（蛍光波長）を設定し、測定
開始命令を中央制御部６１へ入力すると、中央制御部６
１は、上記２つの回折格子２２、５２が設定された各波
長に対応する方向に向くように上記２つの格子駆動機構
２４、５５を制御し、光源１１を点灯する。測定の間、
中央制御部６１は、蛍光検出器５４の出力信号を蛍光信
号として、また対照光検出器３４の出力信号を対照光信
号としてそれぞれモニタし、各信号の強度を示すデジタ
ルデータをデータ処理部６３へ送る。

【００１４】データ処理部６３は、データ記憶部６４に
予め保存された変換テーブル６５を用いて蛍光信号及び
対照光信号の強度データを処理する。変換テーブル６５
には、励起波長と迷光比率との関係を示すデータが保存
されている。なお、本実施例において迷光比率とは、励
起波長をλに設定して光源１１を点灯したときに対照光
検出器３４が出力する信号の強度をＲ(λ)とし、Ｒ(λ)
のうち迷光に起因する強度成分をｓ(λ)としたときに、
次式 β(λ)＝ｓ(λ)／｛Ｒ(λ)−ｓ(λ)｝ （１） で求められるβ(λ)の値と定義する。なお、迷光比率の
定義は上記に限られるものではないことは言うまでもな
く、Ｒ(λ)のうち迷光に起因する強度成分を求めるため
に利用可能な値であれば、その値は迷光比率とみなすこ
とができる。

【００１５】いま、励起波長をλ１、蛍光波長をλ２と
したときに、蛍光検出器５４の出力信号強度がＦ(λ２)
であったものとする。このとき、従来の方法では次式 Ｉ(λ１，λ２)＝α×Ｆ(λ２)／Ｒ(λ１) （２） ただし、αは定数で求められるＩ(λ１，λ２)を分析に
利用していた。しかし、式（２）の計算では、迷光に起
因する強度成分がＲ(λ１)に含まれているため、正しい
分析結果が得られない。そこで、本実施例の蛍光分光光
度計１のデータ処理部６３は、Ｒ(λ１)の代わりに、Ｒ
(λ１)からｓ(λ１)を差し引いた値を用いた次式 Ｐ(λ１，λ２)＝α×Ｆ(λ２)／｛Ｒ(λ１)−ｓ(λ１)｝ （３） で求められるＰ(λ１，λ２)を分析に利用する。式
（３）を式（１）及び式（２）を用いて変形すると次式 Ｐ(λ１，λ２)＝Ｉ(λ１，λ２)×｛１＋β(λ１)｝ （４） のようになる。式（４）には、従来の方法で用いられて
いる関数Ｉ(λ１，λ２)がそのまま含まれている。これ
は、従来のデータ処理プログラムに新たなモジュールを
追加するだけで容易に本実施例のデータ処理部６３を実
現することができることを意味している。

【００１６】変換テーブル６５のデータの作成方法につ
いて説明する。式（１）から分かるように、ある励起波
長λに対応する迷光比率β(λ)を求めるには、波長λの
励起光を生成したときに対照光検出器３４に到達する迷
光の強度ｓ(λ)を求めることが必要である。この強度ｓ
(λ)は、例えば次のようにして求められる。まず、第一
の回折格子２２を励起波長λに対応する方向へ向けた状
態で光源１１を点灯する。そして、ビームスプリッタ３
１から対照光検出器３４へ至る光路上に、波長λの光を
遮断する一方、他の波長の光を通過させるような光学フ
ィルタを配設する。このような条件下で対照光検出器３
４により検出される光は、光源１１の点灯により発生す
る迷光のみであるから、その出力信号強度は迷光強度ｓ
(λ)とみなすことができるのである。このように、デー
タを得ようとする各励起波長λ毎に迷光強度ｓ(λ)を測
定することにより、変換テーブル６５のデータが得られ
る。

【００１７】上記のような変換テーブル６５の作成を容
易にするため、本実施例の蛍光分光光度計１には、ビー
ムスプリッタ３１から対照光検出器３４へ至る光路上に
光学フィルタ３５を配置している。この光学フィルタ３
５はモータ３６により駆動されるアーム３７の先端に取
り付けられており、モータ３６を適宜駆動することによ
り、上記光路上へ光学フィルタ３５を配置したりそこか
ら退避させることができる。光学フィルタ３５は、光を
遮断しようとする波長に応じて適宜交換することができ
るようにすることが好ましいが、迷光が問題となる程に
励起光量が低下する波長領域が比較的狭い場合は、その
波長領域の光を遮断する一方、他の波長領域の光を通過
させるような光学フィルタ３５をアーム３７の先端に固
定してもよい。このようにすると、測定の度毎に変換テ
ーブル６５のデータを容易に更新することができる。

【００１８】変換テーブルの別の形態について図３を参
照しながら説明する。図３の変換テーブル７０のデータ
は励起波長λと迷光強度ｓ(λ)との関係を示すものであ
る。この変換テーブル７０の特徴は、光源１１の発光が
ない波長領域（例えば、キセノンランプであれば１８５
ｎｍより短い波長領域）で予め定められた波長（以下、
基準波長とよぶ）λ10に対応する迷光強度ｓ(λ10)のデ
ータを含んでいることである。励起波長λと迷光強度ｓ
(λ)との関係を示すデータは、例えば装置の組み立て時
に予め実測により（又は、光学系の設計に基づいて理論
的に）求めておき、データ記憶部６４に保存しておく。
実測による場合は、図１の変換テーブル６５の作成に関
して説明したように光学フィルタを用いればよい。この
ような変換テーブル７０を予め作成しておけば、実際の
測定時に、以下のような手順で各励起波長λに対応する
迷光比率β(λ)を算出することができる。

【００１９】まず、基準波長λ10に対応する方向に第一
の回折格子２２を向けた状態で光源１１を点灯する。こ
のとき、理論的には波長λ10の励起光が生成されるはず
であるが、先に述べたように波長λ10においては光源１
１の発光がないため、実際には励起光は生成されない。
しかし、光源１１の点灯により迷光は発生しており、対
照光検出器３４はこの迷光を受けて信号を出力する。こ
の信号の強度Ｒ(λ10)は波長λ10に対応する迷光強度ｓ
(λ10)に相当する。そして、変換テーブル７０に予め保
存された迷光強度ｓ10を実測で得られた上記迷光強度ｓ
(λ10)に一致させるような補正演算を、変換テーブル７
０の全ての迷光強度に対して行えば、各励起波長λに対
応する迷光強度ｓ(λ)が得られる。こうして得られた迷
光強度ｓ(λ)から、上記式（１）により迷光比率β(λ)
が求められる。こうして各励起波長λに対応する迷光比
率β(λ)を求めれば、後は先に説明したように式（２）
〜式（４）を用いた演算を行うことができる。

【００２０】なお、図３の変換テーブル７０を用いる上
記方法は、励起波長λに対応する迷光強度ｓ(λ)を演算
で求めるものであるため、光学フィルタ３５は必要では
ない。

【００２１】本発明に係る蛍光分光光度計の実施例は上
記に限られるものではない。例えば、図１の蛍光分光光
度計１では、ビームスプリッタ３１により励起光から取
り出された光を対照光としたが、このように対照光を取
り出すことは本発明にとって必須ではない。例えば、従
来の蛍光分光光度計の中には、図１の破線Ｂ１で示した
ような位置にレンズ及び蛍光検出器を配置したものもあ
るが、このような蛍光分光光度計にも本発明は適用可能
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の一実施例である蛍光分光光度計の概
略的構成を示す図。

【図２】 上記蛍光分光光度計の制御系の概略的構成を
示すブロック図。

【図３】 変換テーブルの別の形態を示す図。

【符号の説明】

１０…光源部 ２０…励起分光部 ２２…回折格子 ３４…対照光検出器 ３５…光学フィルタ ４１…試料セル ５０…蛍光分光部 ５２…回折格子 ５４…蛍光検出器 ６０…制御系 ６１…中央制御部 ６２…操作部 ６３…データ処理部 ６４…データ記憶部 ６５、７０…変換テーブル

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光源が発する光から所定波長の光を励起
   光として分離し、該励起光を試料に照射する励起分光
   系、前記励起光を受けたときに前記試料が発する蛍光の
   一部を検出し、その量を示す蛍光信号を出力する第一の
   光検出器、及び、前記励起光の一部を対照光として受け
   るように配置された第二の光検出器を備える蛍光分光光
   度計において、 前記第二の光検出器の出力信号と前記光源の点灯に起因
   する迷光に相当する信号成分との差分に相当する対照光
   信号を出力する対照光信号生成手段、及び前記対照光信
   号に基づいて前記蛍光信号を補正することにより得られ
   る信号を測定信号として出力する信号補正手段を備える
   ことを特徴とする蛍光分光光度計。