JP2001029076A - タンパク質の安定性を高めるための金属イオン結合部位における静電的相互作用の操作 - Google Patents

タンパク質の安定性を高めるための金属イオン結合部位における静電的相互作用の操作

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 金属イオン結合部位を有するタンパク質の安
定性を高めるべくタンパク質を再設計する方法の提供。 【解決手段】 以下の工程 １．金属イオン結合部位をタンパク質安定性についてあ
る種のパラメーターと相関させること、および ２．該部位に極めて近接して存在するアミノ酸残基の置
換、挿入、または欠失により該部位を変化させ、該アミ
ノ酸と金属イオンとの間の静電誘引相互作用を増加させ
ることからなる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質の二価
金属イオン結合部位に変更を加えることにより安定性の
高められたタンパク質の設計に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】タン
パク質は、アミノ酸の直線状ポリマーである。タンパク
質を生成する重合反応からは各アミノ酸から水１分子が
失われる結果となるので、タンパク質はしばしばアミノ
酸「残基」からなると言われる。天然のタンパク質分子は
２０種もの異なるタイプのアミノ酸残基を有しており、
各タイプのアミノ酸残基は特有の側鎖を含有している。
タンパク質中のアミノ酸配列は、タンパク質の一次構造
を決定する。
【０００３】タンパク質は３次元構造に畳み込まれる。
畳み込みは、アミノ酸配列およびタンパク質の環境によ
り決定される。タンパク質の注目すべき性質は、その３
次元コンホメーションに直接依存している。従って、こ
のコンホメーションが、酵素の活性または安定性、結合
タンパク質の結合能および特異性、およびレセプター分
子の構造的貢献度を決定する。タンパク質分子の３次元
構造はそれほど重要であるので、タンパク質の３次元構
造を安定化するための手段が非常に望ましいと長い間認
識されてきた。
【０００４】タンパク質の３次元構造は、多くの方法に
より決定することができる。タンパク質の構造を決定す
るのに知られたおそらく最も優れた方法には、Ｘ線結晶
学の技術を用いることが含まれる。この技術の優れた一
般的な概説は、Ｐhysical Ｂio−chemistry、バン・ホ
ールド(Ｖan Ｈolde,Ｋ.Ｅ.)(プレンティス・ホール(Ｐ
rentice−Ｈall)、ＮＪ(１９７１)、２２１〜２３９頁)
に示されており、該文献を参照のためここに引用する。
この技術を用いて３次元構造を相当正確に解明すること
が可能である。また、円偏光二色性、光散乱を用い、ま
たは放射エネルギーの吸収および発光を測定することに
よってもタンパク質の３次元構造を究明することが可能
である(バン・ホールド、Ｐhysical Ｂiochemistry、プ
レンティス・ホール、ＮＪ(１９７１))。加えて、タン
パク質構造は、中性子回折の技術を用いることによっ
て、または核磁気共鳴によって決定することもできる
(Ｐhysical Ｃhemistry、第４版、ムーア(Ｍoore,Ｗ.
Ｊ.)、プレンティス・ホール、ＮＪ(１９７２)、該文献
を参照のためここに引用する)。
【０００５】数多くの天然のタンパク質を調べることに
より、幾つかの繰り返しパターンがあることがわかっ
た。α−ヘリックス、平行β−シート、および逆平行β
−シートが最も一般的に観察されるパターンである。そ
のようなタンパク質パターンに関する優れた記載が、デ
ィッカーソン(Ｄickerson,Ｒ.Ｅ.)らのザ・ストラクチ
ャー・アンド・アクション・オブ・プロテインズ(Ｔhe
Ｓtructure and Ａctionof Ｐroteins)、ダブリュー・
エイ・ベンジャミン(Ｗ.Ａ.Ｂenjamin,Ｉnc.,)、ＣＡ
(１９６９)に見られる。各アミノ酸をこれらパターンの
１つに割り当てるとタンパク質の二次構造が定められ
る。ヘリックス、シートおよびタンパク質二次構造の折
り返しが一緒になってタンパク質の３次元構造を生成す
る。多くのタンパク質の３次元構造は、内部表面(タン
パク質が通常見出だされる水性環境からは離れて存在)
および外部表面(水性環境に極めて近接して存在)を有す
ることで特徴付けられる。多くの天然タンパク質を研究
した結果、研究者らは、疎水性残基(トリプトファン、
フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、またはメチオニンなど)がタンパク質分子
の内部表面上に非常にしばしば見られることを発見し
た。これとは対照的に、親水性残基(アスパラギン酸
塩、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、グ
リシン、およびプロリン)は、タンパク質の外部表面上
に非常にしばしば見られる。アミノ酸のアラニン、グリ
シン、セリンおよびトレオニンは、タンパク質の内部表
面および外部表面の両方で同じ位の頻度で見出だされ
る。
【０００６】タンパク質は、畳み込まれた秩序ある状態
と畳み込まれていない無秩序な状態との間での動的平衡
で存在する。この平衡は、一部、ポリペプチド鎖の異な
る部分間での短距離相互作用(タンパク質構造を安定化
する傾向)を反映し、一方において、熱力学的な力(分子
の無秩序化を促進する傾向)を反映する。
【０００７】金属イオンは、タンパク質の３次構造中の
特定部位に結合することによりタンパク質を安定化する
ものとして長い間知られてきた。確かに、好熱性菌から
単離した多くのタンパク質は、カルシウムイオン結合部
位を含有することが示されている。これらの部位は、好
熱性菌の存在する上昇温度環境でこれらタンパク質が機
能するために必要な高められた安定性に寄与している。
たとえば、好熱性菌バシラス・サーモプロテオリティッ
クス(Ｂacillus thermoproteolytichs)からの中性プロ
テアーゼであるサーモリシンは、４つのカルシウム結合
部位を含有していることがわかった。熱的不活化の度合
に対するカルシウムイオンの依存性を調べることによ
り、畳み込まれないＧに対するこれら部位の総貢献度が
８.１〜９.２Ｋcal／モルであると推定することが可能
となった(ボルドウ(Ｖorrdouw)らのＢiochemistry １
５:３７１６−３７２４(１９７６))。
【０００８】たとえば、サーパース(Ｓerpersu)ら(Ｂio
chemistry ２６:１２８９〜１３００(１９８７))は、ブ
ドウ状球菌ヌクレアーゼのカルシウム結合部位にある残
基アルパラギン酸４０のカルボン酸塩リガンドをグリシ
ンで置き換えて、カルシウムイオンに対する親和性が
７.４倍増加するという結果を得た。同様に、ツズ(Ｔsu
ju)ら(Ｐroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８３:８１０
７〜８１１１(１９８６))は、発光タンパク質エクオリ
ン中のカルシウム結合ループ付近に存在するグリシンを
正に荷電したアルギニンに変えて、これら部位における
金属結合親和性の減少を起こさせた。しかしながら、特
定のアミノ酸置換によってタンパク質の特定の部位にお
いて二価金属カチオンの結合親和性を増加させることに
より、安定性の高められたタンパク質を設計することが
望ましい。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、タンパク質の
金属イオン結合部位に極めて近接して存在するアミノ酸
残基を変えることにより、タンパク質の安定性を高める
べくタンパク質を再設計する方法を提供するものであ
る。詳しくは、この発明の方法は、以下の工程を含む。 １．金属イオン結合構造部位をタンパク質安定性につい
てある種のパラメーターと相関させること、および ２．該部位に極めて近接して存在するアミノ酸残基の置
換、挿入、または欠失により該部位を変化させ、該アミ
ノ酸と金属イオンとの間の静電誘引相互作用を増加させ
ること。
【００１０】タンパク質安定性のパラメーターとの相関
のために金属イオン結合部位を同定するに当たって、所
望のタンパク質の３次元構造を分析するかまたは進化的
に関連したある種の変異体を分析することができる。そ
のような３次元構造は出版物から入手することもできる
し、またはＸ線結晶学の公知方法により決定することも
できる。
【００１１】アミノ酸残基の置換、挿入、または欠失に
より金属イオン結合部位を変えるに当たって、この発明
の方法において以下の工程を考慮する。 (a)置換、挿入、または欠失のためのアミノ酸として金
属イオン結合部位にできるだけ近接したアミノ酸を選択
するが、立体障害をもたらさないようにすること、(b)
置換、挿入、または欠失のためのアミノ酸として、進化
的に関連した相同タンパク質中に保存されていないアミ
ノ酸を優先して選択すること、(c)結合金属イオンに近
接して存在する正に荷電したアミノ酸残基を非荷電また
は負に荷電したアミノ酸残基に変えること、および
(d)新しいアミノ酸残基の導入をシミュレートするため
にコンピューターグラフィックスを優先して用いるこ
と。
【００１２】さらに、本発明は、この発明の方法に従っ
て安定性が高められるように再設計されたタンパク質に
も関する。
【００１３】定義 本発明の記載に際し以下の定義を使用する。 タンパク質 生きた細胞によって作られアミノ酸からなるヘテロポリ
マー。典型的なアミノ酸は、１００〜１０００個のアミ
ノ酸からなる。アミノ酸の正確な配列は、タンパク質の
構造および機能を決定する。
【００１４】アミノ酸 タンパク質の構築ブロックである天然に存在する２０種
の化合物の１つ。天然のアミノ酸は、第Ｉ表に従って３
文字かまたは１文字に略される。アミノ酸は、頭部と尾
部が結合して長い主鎖を形成する。各アミノ酸は、異な
る側鎖基を有する。
【表１】 第Ｉ表 アミノ酸名および略語 アミノ酸 ３文字コード １文字コード アラニン Ａla Ａ アルギニン Ａrg Ｒ アスパラギン酸 Ａsp Ｄ アスパラギン Ａsn Ｎ システイン Ｃys Ｃ グルタミン酸 Ｇly Ｅ グルタミン Ｇln Ｑ グリシン Ｇly Ｇ ヒスチジン Ｈis Ｈ イソロイシン Ｉle Ｉ ロイシン Ｌeu Ｌ メチオニン Ｍet Ｍ フェニルアラニン Ｐhe Ｆ プロリン Ｐro Ｐ セリン Ｓer Ｓ トレオニン Ｔhr Ｔ トリプトファン Ｔrp Ｗ チロシン Ｔyr Ｙ バリン Ｖal Ｖ
【００１５】原子名 すべてのアミノ酸は主鎖には同じ原子を有し、側鎖にお
いてのみ異なる。主鎖の原子は、１個の窒素原子、２個
の炭素原子、および１個の酸素原子である。第一の原子
は窒素であって、単純にＮと呼ぶ。つぎの原子は炭素で
あって、α−炭素と称す。側鎖はこのα−炭素に結合し
ている。α−炭素は、Ｃと称されるカルボニル炭素に結
合している。Ｃはカルボニル酸素(Ｏと称す)および隣の
残基のＮに結合している。側鎖基は、元素(Ｃ、Ｏ、
Ｎ、Ｓ)、ギリシャ文字(α、β、γ、δ、ε、ζおよび
η)、および側鎖基が分岐しているときはおそらくアラ
ビア数字からなる名前で示される。
【００１６】自由エネルギー 動的平衡における系の挙動を記載する熱力学的量。記号
Ｇは、ギブズ自由エネルギーを表す。
【００１７】静電誘引相互作用 静電誘引相互作用は、クーロンの法則:
【数１】ΔＥ＝ＺａＺｂ e2／Ｄeff ｒab (式中、ΔＥは、最初に無限大に離れていた２つの電荷a
およびbをある距離、rabにもってきた結果によるエネル
ギー変化である)により定義される。ＺaおよびＺbは、
単位電荷のそれぞれの数であり、eは電荷の１単位であ
る。電荷aおよびbが反対の符号であるときは、クーロン
相互作用は誘引性となる。正の電荷が二価の金属イオン
であり、負の電荷がタンパク質構造中の点の配列からく
るものであるときは、タンパク質の折り畳みを解くため
にこの誘引相互作用に係る同じエネルギーに打ち勝たな
ければならない。このことは、金属イオン結合の自由エ
ネルギーが折り畳み解消のための全自由エネルギー変
化、ΔＧμに加えられること、従って、この後者のパラ
メーターが一層増加し平衡が折り畳み状態へシフトする
ことを意味している。
【００１８】金属イオン結合部位 二価金属イオン結合のために適当な幾何学的配列および
静電的配置をとるように畳み込まれたポリペプチド鎖の
構造部分。これは結合金属イオンの回りのタンパク質原
子の物理的配列である。
【００１９】タンパク質安定性 タンパク質は、ここでは畳み込み解消のＧにより定義さ
れる。ΔＧが大きくなればなるほど、畳み込み⇔畳み込
み解消の平衡は畳み込み状態の方へシフトする。走査熱
量測定により測定した畳み込み解消転移の中間点、Ｔm
からΔＧμを推定することができる。別のやり方とし
て、熱的不活化の度合からタンパク質の動力学的安定性
を測定することもできる。
【００２０】
【発明の実施の形態】この発明は、正しく畳み込まれ生
物学的および／または触媒的に活性なタンパク質の状態
の安定性を高めるために、タンパク質の３次構造を再設
計する方法に関する。この発明の方法は、金属イオン結
合の結合定数を大きくするためにタンパク質と二価金属
カチオンとの間の静電相互作用をいかにして増加させる
かを示すものである。解離の自由エネルギー、ΔＧelの
増加により測定されるタンパク質と金属イオンとの間の
静電的誘引の増加は、所望のタンパク質の畳み込み解消
の自由エネルギー、ΔＧμの増加として直接表され、畳
み込みまれたタンパク質構造の安定性が高められる。
【００２１】アミノ酸残基の置換、欠失、または挿入に
より金属イオン結合部位の変更を設計するための指導原
理となるのはクーロンの法則:
【数２】ΔＥ＝ＺａＺｂ e2／Ｄeff ｒab (式中、ΔＥはＫcal／モルで測定され、２点電荷aおよ
びbからなる系において、これら電荷をその隔離距離、r
abの関数として一緒にもってきたときのエネルギー変化
である)である。ＺaおよびＺbは、単位電荷のそれぞれ
の数であり、eは電荷の１単位(４.８０３２×１０-10es
u)であり、Ｄは比誘電率である。二価金属カチオンの場
合は、Ｚa＝２＋である。Ｚbが反対の符号の電荷である
ときは相互作用は誘引性であり、系のエネルギーは減少
する。しかし、Ｚbの符号が正であるときは相互作用は
反発性となり、系のエネルギーは増大する。タンパク質
のような天然の系では電荷が点電荷ではなく、立体障害
が生じる前にrabがどれほど小さくなるかについて限界
がある。それゆえ、rabの下限は低分子量モデル金属イ
オン錯体で２〜３Åの範囲であることがわかっている。
【００２２】静電相互作用が金属イオンと負に荷電した
または双極子リガンドとの間のものである特別の場合に
ついては、ベス(Ｈ.Ｂethe)によって１９２９年に最初
に説明された静電結晶場理論(ＣＦＴ)を使用することに
より充分研究され理解されている。この理論は、金属イ
オンとリガンドとの間の相互作用を純粋に静電的な問題
として扱っており、リガンドは点電荷(または点双極子)
として扱われている。この理論は、幾つかの金属−リガ
ンド相互作用の共有結合的性質を的確に説明することが
できなかったので、共有原子価が可能となるように修正
結晶場理論(ＡＣＦＴ)またはリガンド場理論(ＬＦＴ)に
修正されてきている(コットン＆ウイルキンスン(Ｃotto
n＆Ｗilkinson)のアドバンスト・インオーガニック・ケ
ミストリー(Ａdvanced Ｉnorganic Ｃhemistry)、イン
ターサイエンス、ジョン・ウイリー刊、ＮＹ、第３版
(１９７２))。しかしながら、等式中の二価金属イオン
が第ＩＩ族金属、たとえばＭg2+、Ｃa2+、Ｓr2+、およ
びＢa2+である場合は、ＣＦＴはこれら金属イオン錯体
の幾何配列、親和性(Ｋd)、および他の物理化学的パラ
メーターを予測するのに充分役立つ。これらの場合にＣ
ＦＴがうまくいく理由は、遷移金属イオン錯体の共有原
子価に係るd電子軌道が第ＩＩ族二価金属イオン錯体で
は空であるために、実験結果を理論と相関させることが
極めて簡単になるという事実によるものである。
【００２３】タンパク質における静電相互作用でみられ
る不確実さの主要な要因の１つは、比誘電率である。比
誘電率は、遮蔽効果および荷電効果に依存して一様でな
く変化する。畳み込まれたタンパク質の３次構造内の静
電電荷の効果的なスクリーニング(誘電値)を擬態するた
めに多くの試みがなされてきている(マシュー(Ｍatthe
w)のＡnn.Ｒev.Ｂiophys.Ｃhem.,１４:３８７〜４１７
(１９８５))。しかしながら、最も精巧なモデルでさえ
もタンパク質内部のイオン化し得る基の固有pＫa値を計
算しようとすると５kcal／モルの誤差の範囲が出てしま
う(ラッセル＆ウォーシェル(Ｒussel＆Ｗarshel)、Ｊ.
Ｍol.Ｂiol.,１８５:３８９〜４０４(１９８５))。にも
かかわらず、静電相互作用は、並のスクリーニングにお
いてさえも比較的長い距離にわたって重要であると期待
されており、直線距離に反比例して変化する。
【００２４】上記静電力はまた非荷電だが極性の分子間
での相互作用にも関与するが、相互作用のエネルギーは
単純なイオン間のものに比べて一層複雑である。そのよ
うな相互作用のエネルギー発現もまた、一般にそのよう
な分子間の距離に反比例し、通常は１よりは大きいが６
よりは小さい力まで上昇する(クレイトン(Ｃreighto
n)、プロテインズ:ストラクチャー・アンド・モレキュ
ラー・プロパティーズ(Ｐroteins:Ｓtructure and Ｍol
ecular Ｐroperties)、フリーマン(Ｆreeman＆Ｃo)、
Ｎ.Ｙ.(１９８４))。これは、静電場、すなわち第ＩＩ
族金属、Ｍ2+に近接しているときの双極子の分極性によ
るものである。従って、荷電イオンの結果を予測するこ
とは一層容易である。このような理由から、この発明に
おいては第ＩＩ族金属、Ｍ2+、およびアミノ酸残基の荷
電側鎖;ＡspおよびＧluのＣＯＯ-．リジンおよびアミノ
末端のＮＨ3+、およびＡrgのグアニジンカチオン基を用
いるのが好ましい。
【００２５】この発明の方法に従えば、二価金属イオン
に対するタンパク質中の金属イオン結合部位の親和性を
高めることができる。一般に、この発明の方法は以下の
工程からなる。
【００２６】Ａ.)金属イオン結合構造部位をタンパク質
安定性についてある種のパラメーターと相関させること
−このパラメーターは、上昇温度および金属イオンの種
々の濃度での動力学的実験から得られた熱的不活化の度
合であってよい。別のやり方として、熱量測定または畳
み込み解消転移の他の物理的評価から得られた、融点温
度、Ｔm、の熱力学的測定法を用いることもできる。こ
れらの測定により、所望の仕方で安定性が首尾よく得ら
れた程度を推定することができるだけでなく、この部位
の二価金属イオンに対する親和性を推定することもでき
る。
【００２７】タンパク質安定性についてのパラメーター
と相関させるために金属イオン結合部位を同定するに当
たって、所望のタンパク質の３次元構造を分析するかま
たはある種の進化的に関連する変異体を分析することが
できる。そのような３次元構造は、出版物から入手する
こともできるし、またはＸ線結晶学の公知方法により決
定することができる。構造的情報を得るための他の方法
としては、円偏光二色性、光散乱、放射エネルギーの吸
収および発光を測定すること、中性子回折、および核磁
気共鳴が挙げられる。
【００２８】Ｂ,)金属イオン結合部位に極めて近接して
存在するアミノ酸の置換、挿入、または欠失により該部
位を変化させ、アミノ酸と金属イオンとの間の静電誘引
相互作用を増加させること−これらのアミノ酸変化は、
オリゴヌクレオチド部位での(site−directed)インビト
ロ突然変異誘発の技術により、該タンパク質のクローン
された配列遺伝子中へ導入することができる。この方法
は、ブライアン(Ｂryan)らのＰroc.Ｎat'l.Ａcad.Ｓci.
ＵＳＡ８３:３７４３〜３７４５(１９８６)中に詳細に
記載されており、該文献を参照のためここに引用する。
【００２９】部位突然変異誘発による置換、挿入、また
は欠失のために、結合金属イオンに極めて近接して存在
するアミノ酸を選択する基準は以下の通りである。
【００３０】置換、挿入、または欠失のためのアミノ酸
として結合金属イオンにできるだけ近接したアミノ酸を
選択するようにするが、立体障害を招かないようにする
こと。置換、挿入、または欠失のためのアミノ酸は、結
合部位における静電誘引力の距離と幾何配列を最適にす
るものを選択する。
【００３１】(a)アミノ酸を置換するに当たって、進化
的に関連した相同タンパク質中に保存されていないアミ
ノ酸を優先して変化させるべきである。進化的に関連し
た相同タンパク質中に保存されているアミノ酸は、一般
に、これら保存アミノ酸がタンパク質にとって有利なも
のであり保持されるべきであることを示している。一
方、変化させようとするタンパク質と進化的に関連した
相同タンパク質との間で金属イオン結合部位領域が異な
っているアミノ酸置換を評価すべきである。従って、た
とえば、変化させようとするタンパク質が結合領域に中
性残基を含有しており、関連するタンパク質がＡspまた
はＧlu(負に荷電している)を含有しているときは、この
中性残基をＡspまたはＧluで置換することは優先的に行
うべきである。
【００３２】(b)アミノ酸残基を挿入および／または欠
失させるに当たって、リガンド相互作用の距離および幾
何配列を最大にするアミノ酸を優先させるべきである。
一般に、このことには、アミノ酸と金属イオンとの間の
半径をできるだけ２.５Åに近付けることが含まれ、こ
れは立体障害を起こさずに行うことが可能である。たと
えば、ＡspまたはＧluに変化させたときに金属イオンか
らの位置が最適(２.５Å)でないときは、この近接に挿
入または欠失を導入することによりＡspまたはＧluを最
適とわかっている距離に近くなるように回転させること
ができる。
【００３３】(c)結合金属イオンに近接して存在する正
に荷電した残基は、中性または負に荷電した残基に変え
るべきである。正に荷電した残基はまた、単純に欠失さ
せてしまってもよい。中性または負に荷電した残基を挿
入してもよい。この発明の方法に従って、挿入、欠失、
および置換を組合わせることも想起される。二価金属イ
オンは正の電荷を有しているので、正に荷電した残基を
中性または負に荷電した残基に変えることは金属イオン
結合部位の親和性を高めることになる。
【００３４】ついで、上記基準により選択した候補アミ
ノ酸置換を、ＶＡＸ １１／７８０のような適当な構成
のコンピューターと接続したエバンス・サザーランド・
モデル(Ｅvans Ｓutheland Ｍodel)ＰＳ３３０のような
高解析コンピューターグラフィックシステムでシミュレ
ートする。そのようなグラフィックシステムにより、企
図した変化をグラフで表すことができ、ポリペプチド折
り畳みの主鎖原子の移動がないものと仮定して、新たな
アミノ酸残基により明らかな立体障害がもたらされなか
ったかどうかを試験することができる。そのような分析
に用いられる基準は以下の通りである。
【００３５】a)企図した残基の側鎖のほとんどの原子に
おける原子間距離を、タンパク質構造中で最も近接して
存在するほとんどの原子における原子間距離とともに測
定する。
【００３６】b)いずれかの原子のファンデルワールス半
径に重大な障害があったり、いずれかの負の荷電間に激
しい静電反発があるときは、１または２以上の結合を回
転させてこれらの作用を減少させる。a)かまたはb)によ
って構造にそれほどひどいファンデルワールス半径障害
や静電反発がもたらされないときは、該タンパク質中に
企図した変化を部位突然変異により導入する。重大なフ
ァンデルワールス障害や静電反発が持続するときは、そ
の変化には試験評価に対し低い優先性を付与する。
【００３７】この発明の方法により再設計することので
きるタンパク質には、Ｍ2+金属結合部位を有するものが
含まれる。カルシウム以外の二価金属イオン結合部位を
有する酵素も知られてはいるけれども、二価金属イオン
結合部位を有するタンパク質の大部分はカルシウムイオ
ン結合部位を有する酵素である。再設計すべきタンパク
質の選択は、もちろん、再設計タンパク質の最終的な使
用目的に依存する。さらに、本明細書において使用する
タンパク質なる語はまた、ポリペプチドのようなタンパ
ク質断片をも意味することを意図している。
【００３８】天然に存在するタンパク質の最大の部類は
酵素からなる。一般に各酵素は異なる種類の化学反応を
触媒し、通常、その機能は極めて特異的である。生物の
一定の種内においては、天然に存在する酵素の個々のタ
イプにおいてはわずかな変異があるものの、同種生物に
よって産生される特定のタイプの酵素は、基質特異性、
熱安定性、種々の条件下(たとえば、熱およびpＨ)での
活性レベル、酸化安定性などに関して実質的に同一であ
る。天然に存在する、または「野生型」酵素のそのような
特性は、酵素の天然環境の範囲を越えて利用するために
最適化することは必ずしもできない。従って、酵素のあ
る種の性質を特定の使用目的のために最適化するため
に、あるいはこの発明に従って特定の環境中で使用する
ために酵素の天然の特性を変えることが望ましい。
【００３９】この発明による方法は、セリンプロテアー
ゼを変異させ、ある種の特性、特に熱安定性を高めるた
めに使用するのが好ましい。プロテアーゼは、ペプチド
結合を開裂させる触媒である。セリンプロテアーゼは活
性部位に本質的なセリン残基を有する酵素であり、ペプ
チド結合の加水分解を触媒する。セリンプロテアーゼ
は、フェニルメタンスルホニルフルオリドにより、また
はジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害する
ことができる。サブチリシンは、グラム陽性細菌または
真菌により産生されるセリンプロテアーゼである。これ
らのセリンプロテアーゼには、バシラス・アミロリケフ
ァシエンス(Ｂacillus amyloliquefaciens)からのサブ
チリシンＢＰＮ'、バシラス・リシェニフォルミス(Ｂac
illus licheniformis)からのサブチリシンカールスバー
グ(Ｃarlsberg)、バシラスＤＹからのサブチリシンＤ
Ｙ、バシラス・アミロサッカリチクス(Ｂacillus amylo
sachariticus)からのサブチリシンアミロサッカリチク
ス、およびメセンテリコペプチダーゼ(mesentericopept
idase)のようなバシラス種からのものが含まれるが、こ
れらに限られるものではない。プロテアーゼＫ、サーモ
ミコラーゼ(thermomycolase)、およびサーミターゼ(the
rmitase)(サーモアクチノマイセス・ブルガリス(Ｔherm
oactinomyces vulgaris)から)のような真菌プロテアー
ゼもまた、細菌宿主中で産生される哺乳動物プロテアー
ゼと同様、本発明に従って高めることができる。
【００４０】この発明の方法に従って再設計すべき他の
好ましいタンパク質としては、弱い二価金属イオン結合
部位を有するタンパク質が挙げられる。そのようなタン
パク質の例には、α−アミラーゼ、グルコースイソメラ
ーゼ、テモリシン(themolysin)、および中性プロテアー
ゼが含まれる。カルシウム以外の二価金属との結合部位
も知られてはいるが、野生型タンパク質における二価金
属は一般にカルシウムである(クレイトン、プロテイン
ズ:ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパテ
ィーズ、フリーマン、Ｎ.Ｙ.(１９８４))．
【００４１】アミノ酸置換、欠失、および挿入は、部位
(すなわち、オリゴヌクレオチド)突然変異誘発により行
うことができる。部位突然変異誘発は当該技術分野でよ
く知られており、詳細はブライアンらのＰro.Ｎat'l Ａ
cad.Ｓci.ＵＳＡ ８３:３７４３〜３７４５(１９８６)
に記載されており、該文献を参照のためここに引用す
る。
【００４２】さらに、この発明の他の態様において、領
域での(regional directed)インビトロランダム突然変
異誘発を用いることにより、所望のタンパク質の金属イ
オン結合に係るループ中のアミノ酸残基を変えることが
できる。インビトロランダム突然変異誘発の好ましい手
順は、米国特許出願第８２８,５４５号およびＰＣＴ出
願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００３４８号各明細書に詳細に
記載されており、両文献を参照のためここに引用する。
この手順により生成する新たな変異体は、タンパク質安
定性の高められた所望のパラメーターを示す変異体につ
いてスクリーニグし選択することができる。これらのス
クリーニグし選択した変異体を、ついで、まず遺伝子操
作によりアミノ酸残基の変化を同定してさらに特徴付け
を行うことができる。加えて、安定性を動力学的および
熱力学的に特徴付けることにより、これらのスクリーニ
グし選択した変異体をさらに同定することができる。最
後にこれらの変異体タンパク質を結晶化させ、Ｘ線結晶
学的構造を高解析で得て、増大した安定性を知られたタ
ンパク質構造情報と相関させることができる。
【００４３】これらの変異体タンパク質の安定性をさら
に高めるために、この発明の上記方法に従って金属イオ
ン結合部位に極めて近接して存在するアミノ酸残基の修
飾をさらに行うことができる。
【００４４】一般に、所望の酵素をコードする遺伝子を
突然変異させるに先立って、一般に遺伝子をまずその天
然源から単離し、クローニングベクターにてクローニン
グする。別法として、所望の遺伝子から転写したmＲＮ
Ａを細胞源から単離し、クローニングベクター中に挿入
するために逆転写によりcＤＮＡに変換することができ
る。クローニングベクターはファージまたはプラスミド
であってよく、一般に微生物のゲノムとは独立して該微
生物中でベクターの自律複製を行うためのレプリコンを
含んでいる。クローニングベクターは、該ベクターによ
り形質転換した微生物の選択を容易にするために、抗生
物質耐性をコードするＤＮＡのような１または２以上の
表現型マーカーを含んでいるのが有利である。
【００４５】クローニングのためにＤＮＡまたはcＤＮ
Ａをベクター中に挿入する手順は、当該技術分野でよく
知られている。一般にこれらの手順には、ベクターの制
限エンドヌクレアーゼ開裂部位に所望の遺伝子を挿入す
ることが含まれ、またデオキシヌクレオチドのポリマー
末尾を該遺伝子の末端に付加し、それと相補的なポリマ
ー末尾を有するクローニングベクターの開裂末端に該遺
伝子を結合させることが含まれる。
【００４６】部位突然変異により変えようとする所望の
遺伝子は、発現ベクター中に存在してもよい。発現ベク
ターは、通常、典型的なクローニングベクターの要素、
すなわち１または２以上の上記レプリコン、および１ま
たは２以上の選択用表現型マーカーを含んでいるので、
一般にクローニングベクターの定義の中に含まれる。加
えて、発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、
リボソーム結合部位、および翻訳開始シグナルをコード
する調節配列を含んでいる。調節配列の指揮の元に発現
するために、本発明に従って処理すべき標的遺伝子を該
調節配列と適当な解読枠で作動するように結合させる。
目的のＤＮＡ配列を含む発現ベクターはファージであっ
てもプラスミドであってもよいが、プラスミドであるの
が好ましい。
【００４７】この発明の方法を用いることにより、Ｐro
１７２をＡspにアミノ酸置換したサブチリシン７１７
２を生成した。図４に示すように、この新規なサブチリ
シン７１７２は、野性型サブチリシンＢＰＮ'と比べて
カルシウムに対する親和性が５倍増加している。Ｐro
１７２をＧluにアミノ酸置換したサブチリシン８３１２
もまた生成した。サブチリシン８３１２はサブチリシン
７１７２と同様であることがわかった。Ｇly １３１を
Ａspにアミノ酸置換したサブチリシン７１４８もまた生
成した。図５は、新規なサブチリシン７１４８が野性型
サブチリシンＢＰＮ'と比べてカルシウムに対する親和
性が２倍増加している。実施例で論述するように、この
結合力の相異は置換物と結合部位との間の距離によるも
のと思われ、サブチリシン７１７２および８３１２では
二価金属カチオンから５Å、サブチリシン７１４８では
１０Å離れている。
【００４８】この発明は、種々の条件下で他種類のタン
パク質の安定化のために有用であることを意図してい
る。たとえば、微生物のセリンプロテアーゼは、界面活
性剤の性能を高めるために界面活性剤組成物の活性成分
として用いる。サブチリシン様プロテアーゼは、現在、
衣類から血液やミルクのようなタンパク質のしみの除去
を改善するために界面活性剤組成物中で用いられてい
る。これらの界面活性剤組成物のpＨ、温度、遊離金属
イオン濃度、および界面活性剤含量(疎水性)などの条件
は、しばしば、正しく畳み込まれた状態の酵素、すなわ
ちサブチリシン様プロテアーゼに対し有利なものではな
い。それゆえ、本発明は、これらの応用例に使用できる
安定性の高められたサブチリシン酵素を提供するもので
ある。
【００４９】とりわけ、この発明のサブチリシン酵素
は、液体界面活性剤、特に、織物のクリーニングに用い
るクエン酸ベース液体界面活性剤のような洗浄剤組成物
の添加剤として用いることができる。この発明のサブチ
リシン酵素は野性型サブチリシンよりも熱的に安定であ
るので、界面活性剤とともに溶液中に貯蔵したりクリー
ニングに使用中に高熱にさらされたときでも野性型のも
のほど急速に活性を失うことはない。この発明のサブチ
リシン酵素を洗浄剤組成物中で添加剤として使用するこ
とにより、織物上のタンパク質性のしみの除去が向上す
る。洗浄剤組成物の添加剤として使用するサブチリシン
酵素の量は、当該技術分野でよく知られており、または
日常的な実験により容易に確かめることができる。酵素
濃度の最適範囲は、もちろん、酵素コストおよび必要な
クリーニングの量と関係するであろう。一般に、洗浄剤
組成物に添加するサブチリシン酵素の量は、約２０００
〜約４０００アルカリデルフトユニット(Ａlkaline Ｄe
lft Ｕnits)／g(ＡＤＵ／g)洗浄剤組成物であろう。
【００５０】以下の実施例は、本発明を説明するための
ものであるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】実施例Ｉ サブチリシンＢＰＮ'の再設計 １.３Å解析でのサブチリシンＢＰＮ'のＸ線結晶学的構
造を図１に示す。この球状タンパク質の反対側の端部に
２つの金属イオン結合部位があるのがわかった。一方の
部位はＮＨ2末端の近くに位置しており、この部位は４
℃でＥＤＴＡが存在しているときでもカルシウムイオン
に優先的に結合することがわかったのでカルシウム部位
Ａと名付ける。この部位の一層詳細な観察を図２に示し
てある。２つのＡsp ４１酸素リガンドを１つの部位と
して考えるならば、７つのタンパク質由来酸素リガンド
が部位Ａの周囲におよそ八面体の幾何学構造で配置され
ている。これらリガンドのうち３つは主鎖カルボニル酸
素原子であり、Ｉle ７９、Ｖal ８１、およびＬeu ７
５に由来する。他の４つはＡsp ４１、Ｇln ２、および
Ａsn ７７の側鎖に由来する。７つのすべては、２.４Å
の酸素−カルシウム平均距離を有する。
【００５２】第二の金属結合部位はカルシウム部位Ｂと
表示され、部位Ａから約２０Åのところに位置してい
る。この第二の部位は、ポリペプチド鎖の２つの部分で
定められる裂け目に位置する。このうち第一の部分は、
リガンドとしての３つの主鎖カルボニル酸素原子:Ｇly
１６９、Ｔyr １７１、およびＶal １７４(図３参照)を
付与し、また第二の部分は、側鎖カルボキシル基(Ａsp
１９７)に由来する酸素原子とともにさらに別の主鎖酸
素原子(Ｇlu １９５)を付与する。２つの水分子が、７
座配位球を完成させる。この部位は表面に位置するの
で、部位Ａよりも一層溶媒にさらされる。カチオン−酸
素リガンドの平均距離もまた部位Ｂの方が長い(部位Ａ
の２.９Åに対して２.４Å)。これら２つの部位での実
際のカルシウム−リガンド距離については第ＩＩ表を参
照のこと。
【表２】 第ＩＩ表 １３Å解析Ｘ線モデルからのカチオン−リガンド* 距離 カルシウム部位Ａ カルシウム部位Ｂ 残基 リガンド 距離 残基 リガンド 距離 Ｇln−２ ＯＥ１ ２.３７Å Ｇly−１６９ Ｏ ２.６６Å Ａsp−４１ ＯＤ１ ２.４２Å Ｔyr−１７１ Ｏ ２.９７Å Ａsn−４１ ＯＤ２ ２.５２Å Ｖal−１７４ Ｏ ２.６６Å Ｌeu−７５ Ｏ ２.２９Å Ｇlu−１９５ Ｏ ３.００Å Ａsn−７７ ＯＤ１ ２.４１Å Ａsp−１９７ ＯＤ１ ２.８４Å Ｉle−７９ Ｏ ２.２９Å 水 １ Ｏ ２.７１Å Ｖal−８１ Ｏ ２.３７Å 水 ２ Ｏ ２.９７Å 平均 ２.３９Å 平均 ２.８９Å *リガンドとは、金属イオンの第一の配位球中に存在し、名目上の負電荷また は部分的な負電荷を有する原子として定義される。
【００５３】これら２つの部位の化学的性質は、それら
の構造が示唆するほどの相異を示す。たとえば、野性型
サブチリシンの単一結晶を４℃近くの５mＭ ＥＤＴＡ中
に２４時間浸漬し、回折データを２.０Å解析まで集め
た。示差フーリエ(Ｄifference Ｆourier)[Ｆ(天然)−
Ｆ(ＥＤＴＡ)]分析により、部位Ａでは変化が生じなか
ったことがわかった。この結果は、４℃で１mＭ ＥＤＴ
Ａ溶液(２０mＭ Ｈepes)に対して充分に透析した後の野
性型タンパク質の金属イオン分析の結果と一致するもの
である。これらの条件下で該タンパク質は、酵素１モル
当たりなおカルシウム０.４５モルを結合させたことが
わかった。これと同様の結果はボードゥー(Ｖoordouw)
ら、Ｂiochemistry、１５:３７１６〜３７(１９７６)に
よって報告されており、彼等は、２５℃においてカルシ
ウムのサブチリシンＢＰＮ'に対する結合のＫdはＥＤＴ
Ａに対するＫd(Ｋd １０-11)よりも小さいと推定した。
本発明者らは、異なる金属イオンキレートの存在下での
示差走査熱量測定により判断されるように、この部位に
対するカルシウム結合のＫdは６０℃近くで１０-8〜１
０-12であると推定した。
【００５４】カルシウム結合部位Ｂの化学的性質は、若
干異なる。Ｆ(天然)−Ｆ(ＥＤＴＡ)示差フーリエ分析に
より、結晶を５mＭ ＥＤＴＡで処理した後に部位Ｂにお
けるイオン環境の再配列が示された。この電子密度差異
を他のサブチリシン結晶調製物で行った観察とともに解
釈することにより、部位Ｂにおけるカルシウムイオンは
ナトリウムのような小さな一価カチオンにより容易に置
換されることが示唆された。この置換には、配位数が７
から５に減少するように、イオン位置の小さなシフトと
該イオンの周囲の溶媒の再構成が伴う。他の一価カチオ
ン(Ｋ+、およびＴl+)の結合もまたドレンス(Ｄrenth)
ら、Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.,２６:１７７〜１８１(１９７
２)によって報告されている。
【００５５】弱いカルシウム結合部位についての最初の
証拠は、遊離カルシウムイオン濃度の関数として行った
熱的不活化の速度論的実験から得られた。カルシウム濃
度が０.１mＭよりも増加すると、６５℃における熱的不
活化速度の半減期は、カルシウムイオン濃度の１００m
Ｍから３００mＭにつれて約１分から約２００分に増加
することが観察された(図４参照)。このデータは、単一
のカルシウムイオンに対して３２mＭのＫd値を有する結
合部位についての理論的な滴定曲線とぴったりと一致す
ることがわかった。Ｍg2+、Ｂa2+、およびＳr2+のよう
な他の第ＩＩ族金属イオンもまた同様に試験した。前者
の２つの金属イオンについては、図４に示したこの同じ
濃度範囲でサブチリシンの安定化に有効でないことがわ
かった。しかしながら、Ｓr2+イオンはこの酵素の熱的
安定性を増大させることがわかったが、効果を示すため
により高い濃度が必要であることから、この部位に対し
て遥かに弱い親和性を有することを示唆された。ＣaＣl
2と等しい安定化をもたらすのに必要なＳrＣl2濃度は約
２０倍高く、Ｓr2+の結合に対するＫdが０.７Ｍの範囲
にあることが示唆された。これらの結果はタンパク質に
おけるカルシウム結合部位には典型的なことであり(ス
チュアート(Ｓtuart)らのＮature ３２４:８４〜８７
(１９８６))、サイズ優先性に基づく選択性を反映す
る。Ｍg2+のイオン半径、０.７８Å(ラッド半径(Ｌadd
radius);コットン＆ウイルキンスン、Ａdvanced Ｉnorg
anic Ｃhemistry、インターサイエンス、ジョン・ウイ
リー、Ｎ.Ｙ.第３版(１９７２))は明らかに小さすぎ、
Ｂa2+のイオン半径、１.４３Åは明らかに大きすぎる。
Ｓr2+のイオン半径、１.２７Åは収容することができる
が、Ｃa2 +のイオン半径、１.０６Åが明らかに最もよく
フィットする。筋小胞体からの精製Ｃa−ＡＴＰaseにつ
いて、ホルギン(Ｈolguin)(Ａrch.Ｂiochem.Ｂiophys.,
２５１:９〜１６(１９８６))により同様の結果が得られ
ている。
【００５６】示差走査熱量測定法(ＤＳＣ)を用いること
により、遊離のカルシウムイオン濃度がサブチリシンＢ
ＰＮ'の熱的安定性に及ぼす効果を測定することもまた
可能である。カルシウムイオン濃度を０.１mＭよりも増
大させると、熱的に誘発された畳み込み解消転移の中
点、Ｔmが、単離したときに１モルカルシウム／モルタ
ンパク質と結合するタンパク質についての約６９.５℃
から、１５０mＭ ＣaＣl2の存在下での該タンパク質に
ついての約８０℃まで高くなる。
【００５７】つぎにとった必要な手順は、図４のデータ
をＸ線結晶学により同定した２つの構造部位のうちの１
つと相関させることであった。入手し得るすべての上記
化学的または物理学的情報に基づいて、野性型サブチリ
シンＢＰＮ'について図４に示した弱いカルシウム結合
に寄与する可能性の最も高い部位としてカルシウム部位
Ｂを指定することが可能であった。
【００５８】変えるべきアミノ酸残基の選択についての
上記規則を使用することにより、Ｐro １７２をＡspに
変えることに決定した。Ｐro １７２は、カルシウム部
位Ｂを含むループの１つの一部をなす。シミュレートし
たカルボキシル鎖は、結合金属イオンから約５Åの位置
にある。この特定のアミノ酸残基は、関連するサブチリ
シン配列において若干変わり得る。(該アミノ酸はサブ
チリシンカールスバーグ中でＡspとして存在する。) 最
後にグラフスクリーン上のシミュレーションにより、フ
ァンデルワールス半径障害をきたすことなく適合すべき
ことがわかった。この変化は、本質的に上記およびブラ
イアンら、Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、８３:３
７４３〜３７４５(１９８６)(参照のためにここに引用
する)により記載された部位突然変異誘発により導入
し、変化したサブチリシン遺伝子を含有するバシラス・
サブチリス(Ｂ.Ｓubtilis)の新規株をＧＸ７１７２と称
した。該遺伝子の変異体タンパク質生成物を精製し、高
められた金属イオン結合能および安定性について分析し
た。その結果を図４に野性型タンパク質についての結果
と比較して示す(新規なタンパク質を７１７２と称す
る)。
【００５９】サブチリシン７１７２の熱的不活化の半減
期(t１／２)に対するカルシウムイオン依存性は、明ら
かに低カルシウムイオン濃度の方へシフトする。該デー
タを最もよく近似する理論的な滴定曲線は、Ｋd＝６mＭ
の単一部位に対するものである。それゆえ、Ｐro １７
２をＡspに変えることは、部位Ｂのカルシウムに対する
親和性を野性型のものに比べて約５倍増加させるものと
思われる。この変化の大きさ、ΔpＫ＝０.７は、タンパ
ク質への静電理論の適用に現在付随する知られた困難を
仮定して、金属カチオンから約５Åの位置に負の電荷を
導入するための理論的な考慮と矛盾しない。この仮定の
さらに別の支持がスタヒロコッカスのヌクレアーゼを用
いた突然変異誘発実験から得られ、Ａsp ４０カルボキ
シレートリガンドをＧlyに変えることにより、このタン
パク質中の弱いカルシウム部位へのカルシウム結合が８
倍減少(Ｋd＝１mＭ)することがわかった(スーパースら
のＢiochemistry ２６:１２８９〜１３００(１９８
７))。それゆえ、これらの結果は、熱的不活化により測
定した弱いカルシウム結合部位がＸ線結晶学により同定
したカルシウムＢ部位に対応するという説得力のある証
拠を提供する。さらに、これらの結果は、該部位の金属
結合親和性を高めることにより、減少濃度のカルシウム
の存在下でサブチリシンＢＰＮ'を安定化させることが
できるということを明らかに示している。部位Ｂの連続
した変化の外挿結果が滴定曲線の最終的なシフトであ
り、Ｋdが極めて小さいために、野性型タンパク質に対
して１００mＭのＣaで得られる安定性を得るために過剰
の金属イオン(または急激に減少させた量)を必要としな
い。
【００６０】Ｐro １７２をＡspに変えることに加え
て、Ｐro １７２をＧluにも変えた。この新たな変異体
(８３１２)に対しても、熱的不活化の速度に対するカル
シウムの依存性を調べた。その結果は、サブチリシン７
１７２の結果とほとんど同じであることがわかった。
【００６１】カルシウム部位Ａにおけるアミノ酸をも変
化させて熱的安定性を増大させた。株８３４７ではＡsn
７６をＡspに変えた。株８３６４ではＳer ７８をＡsp
に変えた。株８３７４ではこれらの変異、ＡspへのＡsn
７６およびＡspへのＳer ７８をオリゴヌクレオチド−
突然変異誘発により組み合わせた。第ＩＩＩ表に示すよ
うに、８３７４のカルシウム結合親和性は、各変異単独
のものに比べて付加的に増加した。３つのすべての株
は、野性型(ＢＰＮ')およびサブチリシンカールスバー
グに比べて増加した安定性を示した。
【００６２】さらに、安定性を増大させるために、カル
シウムＢ結合部位で行った変化をカルシウムＡ結合部位
で行った変化と組み合わせてもよい。従って、たとえ
ば、Ａsn ７６のＡspへの変異およびＰro １７２のＡsp
(またはＧlu)への変異を行うことができる。さらにその
他の例としては、Ａsn ７６→Ａsp、Ｓer ７８→Ａsp、
Ｐro １７２→Ａsp(またはＧlu)およびＧly １３１→Ａ
sp;Ａsn ７６→ＡspおよびＧly １３１→Ａsp;Ｓer ７
８→ＡspおよびＧly １３１→Ａsp;Ｓer ７８→Ａspお
よびＰro １７２→Ａsp(またはＧlu);およびＳer ７８
→Ａsp、Ｇly １３１→ＡspおよびＰro １７２→Ａsp
(またはＧlu)が挙げられる。
【表３】第ＩＩＩ表 ３７℃のクエン酸ベース界面活性剤中での安定性 酵素 変化 半減期(hr) 野性型(ＢＰＮ') − ７ ＧＸ ８３４７ Ａsn 76→Ａsp ３０ ＧＸ ８３６４ Ｓer 78→Ａsp ２４ ＧＸ ８３７４ Ａsn 76→Ａspおよび 〜８０ Ｓer 78→Ａsp サブチリシン カールスバーグ ８２変化 １２
【００６３】実施例ＩＩ アミノ酸残基の挿入および／または欠失 アミノ酸残基の置換に加えて、所望の結合部位に近接し
て位置するアミノ酸残基の挿入および／または欠失をさ
らに別の試みにおいて行い、該部位での静電力に影響を
及ぼすことができる。これは、リガンド相互作用の距離
および幾何構造を最適にするための方法として考えるこ
とができる。たとえば、サブチリシン７１７２中でカル
シウムＢ部位を含むループの１つにおいて、残基１７２
のＡspを結合金属に一層近接するように移動させてこれ
を正式のリガンドとし、可能なら結合した水分子の１つ
を置換するために、該残基１７２と１７３との間に挿入
を行うことができる。
【００６４】残基１６８から残基１７５のサブチリシン
ＢＰＮ'ループの部分と一致するコンフォメーション構
造を有するペプチド配列を得るためにブルックヘブン・
プロテイン・データ・バンク(Ｂrookhaven Ｐrotein Ｄ
eta Ｂank)を調査している際に、残基１７０−１７１お
よび残基１７３−１７４ではよく一致するが１個余分な
アミノ酸残基が挿入されている幾つかの配列が見つかっ
た。これらのペプチドはすべて、残基１７２の側鎖がカ
ルシウム結合部位の方へ先端が一層向くように主鎖が変
形されていた。カルシウムに結合するカルボニル酸素
は、このコンピューターシミュレーションにおいては有
為には妨害されていなかった。挿入された残基がたまた
まＡspまたはＧluであるときは、この部位における静電
相互作用にさらに影響を与える別の機会を得ることがで
きるであろう。
【００６５】アミノ酸欠失もまた、電荷間距離および隣
接する残基の幾何構造を変えることにより金属イオン結
合のためのより有利な環境を生じさせることができる。
【００６６】実施例ＩＩＩ ランダム突然変異誘発を用いて安定性を高めること 全サブチリシン遺伝子を突然変異原にさらすランダム突
然変異誘発の方法により、サブチリシンの７１４２変異
体を生成させ同定した。(米国特許出願第８２８,５４５
号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００３４８号
各明細書参照。) この特定の場合において突然変異原は
重硫酸ナトリウムであり、フィルターアッセイによりこ
のタンパク質を安定な変異体として同定した。ＤＮＡシ
ークエンシングによりサブチリシン７１４２は２つのア
ミノ酸変化:Ｇly １３１→Ａsp、およびＡla １１６→
Ｔhrを有していることがわかった。ついで、個々のアミ
ノ酸置換の物理的性質を調べるために、部位突然変異誘
発によりこれらの変化を個々に導入した。Ｇly １３１
→Ａsp単独変化のみが、観察された安定性に寄与するこ
とがわかった。この新しい変異体をサブチリシン７１４
８と名付けた。Ａla １１６→Ｔhr変化は、熱的不活化
の速度に何等影響を及ぼさないことがわかった。Ｇly
１３１→Ｇluの変化によっても、熱的不活化の速度に対
するカルシウム依存性の結果はＡspへのアミノ酸置換の
場合と同様である。
【００６７】サブチリシン７１４８の速度論的安定性に
ついてカルシウムイオン濃度の関数として分析したとこ
ろ、図５に示すようにカルシウムイオンに対する親和性
がわずかに増大したことがわかった。この場合、このデ
ータは、単一結合部位についてのＫdが１５mＭの理論的
滴定曲線により最もよく近似されることがわかった。金
属イオン親和性におけるこの見掛けの２倍の増加、また
はΔpＫ＝０.３３は、サブチリシン７１４２のＸ線結晶
学的データと非常によく相関する。サブチリシン７１４
２の１.８Å解析結晶構造は、この新しいＡsp １３１残
基のカルボキシレート基がカルシウムＢ部位で金属イオ
ンから約１０Åに位置することを示している。それゆ
え、観察された金属イオン親和性の増加の大きさは、こ
の電荷間距離からおよそ予想できたものである。たとえ
ば、トーマス(Ｔhomas)ら、Ｎature３１８:３７５〜３
７６(１９８５)は、Ａsp ９９を１４Å離れたＳerに変
えた後にサブチリシンＢＰＮ'のＨis ６４のpＫaが０.
２９±０.０４シフトするのを観察した。さらに、カル
シウムＢ部位に結合した金属イオンから５Å離れた位置
に負荷電を導入することによりΔpＫ＝０.７が得られる
とすれば、該部位から１０Åのところに負荷電基を導入
することによりΔpＫ＝０.３３が得られるという理論
(等式１)と完全に一致する。
【００６８】オリゴヌクレオチド突然変異誘発により、
Ｇly １３１→ＡspおよびＰro １７２→Ａspの変異を組
み合わせて株８３３１を創成した。８３３１のカルシウ
ム結合親和性は付加的に増加する。
【００６９】熱的安定性を高めるようサブチリシンＢＰ
Ｎ'を変えるために、領域インビトロランダム突然変異
誘発を用いることができる。ランダム突然変異誘発のこ
の特定の適用においては、サブチリシン遺伝子のうち金
属イオン結合に係るループ中のアミノ酸残基をコードす
る部分のみを突然変異誘発に供した。ランダム突然変異
誘発に用いる方法は、米国特許出願第８２８,５４５号
およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００３４８号各
明細書に記載されており、両明細書を参照のためここに
引用する。
【００７０】サブチリシンＢＰＮ'において、カルシウ
ムＢ部位はポリペプチド鎖の２つの短い伸び(残基１６
９〜１７４および１９５〜１９７)のみからなる。この
ため、この領域を特異的に狙ってインビトロランダム突
然変異誘発を引き起こすには比較的都合がよい。このこ
とは、この２つの標的領域の側面に位置する配列にてク
ローニングサブチリシン遺伝子中に制限エンドヌクレア
ーゼ認識領域を創成することにより行った。たとえば、
Ｂ−部位の残基１６９〜１７４ループを標的として、オ
リゴヌクレオチド突然変異誘発を用いて残基１６２にＸ
hoＩ切断部位を、残基１７６にＢglＩ部位を創成した。
遺伝暗号の重複を利用することにより、該遺伝子により
特定されたアミノ酸配列を変えることなくこれらの制限
部位を導入した。該遺伝子をＸhoＩおよびＢglＩで開裂
し、ついでこの２つの制限酵素により該遺伝子中に生成
した裂け目に合成ＤＮＡ断片をライゲートすることによ
り、標的領域中にランダム突然変異誘発を生じさせた。
天然ＤＮＡ配列からの変化がランダムに起こるようにＤ
ＮＡ断片を合成した。この手順を用いることにより、天
然配列からは非常に少ない変異から完全にランダムな配
列に至るまであらゆる頻度で突然変異が起こるように挿
入ＤＮＡの合成をコントロールすることができる。
【００７１】明瞭および理解の目的のために説明および
実施例によりある程度詳細に上記発明を記載したが、本
発明の範囲内で変化および変更を行うことは可能であ
り、添付の請求の範囲によってのみ限定されることは明
白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 サブチリシンＢＰＮ'の１.３Å解像Ｘ線立体
構造を示す。２つのカルシウム結合部位をＣaＡおよび
ＣaＢで表してある。
【図２】 カルシウムＡ(ＣaＡ)結合部位の詳細な立体
構造情報を示す。
【図３】 カルシウムＢ(ＣaＢ)結合部位の詳細な立体
構造情報を示す。
【図４】 ６５℃におけるサブチリシンの熱的不活化の
度合に対するカルシウムイオンの依存度を示す。サブチ
リシン７１７２に関するデータは(▲)で、野生型サブチ
リシンＢＰＮ'に関するデータは(■)で示す。(●)はサ
ブチリシンＢＰＮ'に及ぼすＭgＣl2の影響を示す。実線
は、図示した親和性(Ｋd)を有する単一の金属イオン結
合部位についての理論的な滴定曲線を示す。
【図５】 ６５℃におけるサブチリシン７１４８の熱的
不活化の度合に対するカルシウムイオンの依存度を示
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年７月１２日（２０００．７．１
２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 バリー・シー・フィンゼル アメリカ合衆国デラウェア19702、ニュー アーク、コブル・クリーク・カーブ721番 (72)発明者 フィリップ・エヌ・ブライアン アメリカ合衆国メリーランド20902、シル バー・スプリング、ダブリン・ドライブ 1720番 (72)発明者 ロバート・シー・ラドナー アメリカ合衆国メリーランド21754、イジ ャムスビル、グリーン・バレー・ロード 3827番

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 金属イオン結合部位を含有するセリンプ
    ロテアーゼの安定性を、対応する野生型プロテアーゼの
    安定性と比較して増大させる方法であって、 下記工程 （ｉ）該プロテアーゼの金属イオン結合部位を、プロテ
    アーゼ安定性のパラメーターと相関させること、および
    （ii）該金属結合部位に存在するおよび／または極めて
    近接して存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基の置
    換、挿入、および／または欠失により、該金属イオン結
    合部位の構造を変化させ、該金属イオン結合部位のアミ
    ノ酸残基と該金属イオンとの間の静電誘引を増大させる
    こと、からなり、 該プロテアーゼが、以下の６つのサブチリシンＢＰＮ’
    変異体 （１）Ｓer２１８およびＡsp１３１ （２）Ｓer２１８、Ａsp１３１およびＡla２５４ （３）Ｔhr１１６およびＡsp１３１ （４）Ａsp１３１ （５）Ａla１６９、および （６）Ｓer１６９ 以外であることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 該金属イオン結合部位とプロテアーゼ安
    定性の該パラメーターとの間の相関を、該プロテアーゼ
    または進化的に関連のある相同変異体の、３次元構造の
    分析による金属イオン結合部位の同定によって行うもの
    である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 オリゴヌクレオチドインビトロ突然変異
    誘発により該変化を行う、請求項１または２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 インビトロランダム突然変異誘発を行
    い、変異体をスクリーニングまたは選択することにより
    該変化を行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】 さらに、金属イオン結合構造部位のアミ
    ノ酸残基の位置を調べること、および許容できない立体
    障害を起こすことなく結合した金属イオンにできるだけ
    近接して存在し、且つ該金属イオンとの距離と該金属イ
    オン結合部位における静電誘引力の幾何学とを最適にし
    得る残基を、置換、挿入、または欠失のために選択する
    ことを含む、請求項１、２または４のいずれかに記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 置換、挿入、または欠失のために選択し
    たアミノ酸残基が、進化的に関連のある相同タンパク質
    において保存されていないアミノ酸残基である、請求項
    １〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 （ａ）正に荷電したアミノ酸を、負に荷
    電したアミノ酸に置換すること；（ｂ）負に荷電したア
    ミノ酸を、金属イオン結合部位に挿入すること；および
    （ｃ）正に荷電したアミノ酸を金属イオン結合部位から
    欠失させることの内のいずれかまたは全てを含む、請求
    項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 プロテアーゼの金属結合部位に存在する
    および／または極めて近接して存在するアミノ酸残基を
    変化させて金属イオン結合部位のアミノ酸残基と金属イ
    オンとの間の静電誘引を増大させることにより得られ
    る、野生型プロテアーゼに対し増大した安定性を有す
    る、金属イオン結合部位を含有するセリンプロテアーゼ
    であって、 該プロテアーゼが、以下の６つのサブチリシンＢＰＮ’
    変異体 （１）Ｓer２１８およびＡsp１３１ （２）Ｓer２１８、Ａsp１３１およびＡla２５４ （３）Ｔhr１１６およびＡsp１３１ （４）Ａsp１３１ （５）Ａla１６９、および （６）Ｓer１６９ 以外のものであるセリンプロテアーゼ。
  9. 【請求項９】 該金属イオン結合部位が二価金属イオン
    結合部位であり、該金属イオンがＣa2+、Ｍg2+、Ｂa2+
    またはＳr2+である、請求項８に記載のプロテアーゼ。
  10. 【請求項１０】 サブチリシンである、請求項８または
    ９に記載のプロテアーゼ。
  11. 【請求項１１】 野生型サブチリシンがサブチリシンＢ
    ＰＮ'、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤ
    Ｙ、サブチリシンアミロサッカリチクス、またはメセン
    テリコペプチダーゼである、請求項１０に記載のプロテ
    アーゼ。
  12. 【請求項１２】 金属イオン結合部位が、カルシウム結
    合部位Ａ、カルシウム結合部位Ｂ、またはカルシウム結
    合部位ＡとＢ両方である、請求項１０または１１に記載
    のプロテアーゼ。
  13. 【請求項１３】 サブチリシンＢＰＮ’に関して、Ａsn
    ７６→Ａsp、Ｓer７８→Ａsp、Ｇly１３１→ＡspとＰro
    １７２→ＡspまたはＧluのうちの、１またはそれ以上の
    アミノ酸置換、またはサブチリシンＢＰＮ’以外の野生
    型サブチリシンについては対応する置換、を有し、置換
    の結果得られたサブチリシンが、以下の６つのサブチリ
    シンＢＰＮ’変異体 （１）Ｓer２１８およびＡsp１３１ （２）Ｓer２１８、Ａsp１３１およびＡla２５４ （３）Ｔhr１１６およびＡsp１３１ （４）Ａsp１３１ （５）Ａla１６９、および （６）Ｓer１６９ 以外のものである、請求項１０〜１２のいずれかに記載
    のプロテアーゼ。
  14. 【請求項１４】 突然変異させたサブチリシン遺伝子に
    よってコードされる、請求項１０〜１３のいずれかに記
    載のプロテアーゼ。
  15. 【請求項１５】 サブチリシンＢＰＮ’に関して、Ｐro
    １７２→Ａｓｐのアミノ酸置換を有するサブチリシン７
    １７２、Ｐro１７２→Ｇluのアミノ酸置換を有するサブ
    チリシン８３１２、Ｇly１３１→ＡspとＰro１７２→Ａ
    spのアミノ酸置換を有するサブチリシン８３３１、Ａsn
    ７６→Ａspのアミノ酸置換を有するサブチリシン８３４
    ７、Ｓer７８→Ａspのアミノ酸置換を有するサブチリシ
    ン８３６４、またはＡsn７６→ＡspとＳer７８→Ａspの
    アミノ酸置換を有するサブチリシン８３７４。
  16. 【請求項１６】 金属イオン結合部位のアミノ酸配列
    が、野性型金属イオン結合部位含有プロテアーゼの金属
    イオン結合部位のアミノ酸配列と、少なくとも１つのア
    ミノ酸で相違している、請求項８〜１４のいずれかに記
    載のプロテアーゼ。
  17. 【請求項１７】 アミノ酸配列の相違が、 （ａ）アミノ酸の置換； （ｂ）アミノ酸の欠失；または （ｃ）アミノ酸の付加 によるものである、請求項１６に記載のプロテアーゼ。
  18. 【請求項１８】 請求項８〜１７のいずれかに記載のプ
    ロテアーゼを、２,０００〜４,０００アルカリデルフト
    ユニットの濃度で含有する洗浄用組成物。
  19. 【請求項１９】 織物上のタンパク質性のしみの除去を
    向上させる方法であって、該織物を請求項１８に記載の
    洗浄用組成物と接触させ、ついで該しみのついた織物を
    該洗浄用組成物で洗浄することを含んでなる方法。
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