JP2000514653A

JP2000514653A - 立体特異的分割のためのエステラーゼのスクリーニングおよびその使用

Info

Publication number: JP2000514653A
Application number: JP10505751A
Authority: JP
Inventors: グレッドヒル，リンデン; ケル，クリストファー・マーティン
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1996-07-15
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 2000-11-07
Also published as: WO1998002556A3; EP0937152A2; WO1998002556A2

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）の化合物を分割する能力を有する微生物のスクリーニング方法であって、式（Ｉ）の化合物を唯一の炭素源として用いることのできる生物を選択し、その生物の細胞を特異的なエステラーゼ活性についてアッセイすることからなる方法を用いて、パロキセチンの製造に有用な酵素を同定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】立体特異的分割のためのエステラーゼのスクリーニングおよびその使用本発明は式（Ｉ）の化合物の異性体の分割に有用な酵素、該酵素の製法、該酵素をコードするＤＮＡおよび該酵素を用いる生物学的方法に関する。［式中、ＲはＣ_1-6アルキルを意味する］本発明はまた、新規なスクリーニング方法および本発明の酵素を含有するこのスクリーニング法により単離した新規な微生物を提供する。国際出願ＷＯ93/22284（SmithKline Beecham）（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）は、エステラーゼ酵素を使用する式（Ｉ）の化合物の分割を特許請求し、具体的にはブタ肝臓またはウシ肝臓エステラーゼの使用を開示する。しかし、動物肝臓から由来のエステラーゼの使用は、酵素を制限なく供給することを必要とする、大規模な商業的操作には適していない。ＷＯ94/03428（Sepracor）は、単離されたAchromobacter sp.および７と８の間に最適なｐＨを有するその種から単離した酵素抽出物を用いる、パロキセチンの光学的に純粋な先駆体の生物学的触媒調製法を記載する。ＷＯ94/03428（Sepracor）もまた、Achromobacter属に属する単離微生物から、パロキセチンの合成に適するエステラーゼの同定方法を概説する。実際には、「オーバーレイ（overlay）」法を基礎とする後者の同定方法には問題が多い。一の問題は基質が凝集することであり、「クリアー域」を生成するのに時間（数週間）を要することである。本発明者らは、この度、これらの問題を解決し、さらには個々の単離生物（例えば、カルチャーバンクより由来）、または微生物の混合物を含有する生物学的試料（例えば、土壌）のいずれかからの生物の供給源を用いるのに特に適する、所望の活性を有する微生物をより特異的にスクリーニングする手段を提供するものである。したがって、本発明は、パロキセチンエステルを唯一の炭素源として用いることのできる生物を選択し、ついで適当にはＨＰＬＣを用いて微生物の細胞を検定し、特異的なエステラーゼ活性を有する微生物を同定することにより、（Ｉ）の分割能を有する微生物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法の他の利点は、クリアー域に依存しない点で、より信頼かつ特異的であることである。該方法は、さらに感度のよい、直接的な方法でもある。本発明者らは、この度、本発明にて使用するのに適する他の微生物酵素が、前記したスクリーニング法を用いることで特定の生物から誘導されうることを見出した。特に適当な微生物としては、Alcaligenes属に属する生物が挙げられる。ＮＣＩＭＢ40700菌株は新規な微生物であり、それ自体が本発明のさらに別の態様を形成する。この菌株はthe National Collection of Industrial and Mari ne Bacteria(ＮＣＩＭＢ)、Aberdeen、Scotlandに、受入れ番号ＮＣＩＭＢ40700 の下に1994年12月１日に寄託されている。該生物の特性を実施例５に記載する。本発明者らは、前記した反応の実施能を有するＮＣＩＭＢ40700から酵素を単離した。本発明のさらなる態様において、（Ｉ）を該酵素と接触させてなる（Ｉ）の分割方法が提供される。したがって、本発明は、式（Ｉ）：［式中、ＲはＣ_1-6アルキルを意味する］で示される化合物の（＋）および（−）異性体の混合物を、微生物ＮＣＩＭＢ40 700または本発明のスクリーニング法を用いて同定される微生物あるいは該微生物より単離される酵素を用いて立体特異的に加水分解し、（ｉ）式（IIA）：の化合物を形成させ、その後に、得られた式（IIA）の化合物を式（Ｉ）の残りの（−）異性体から分離するか；または（ii）式（IIB）：の化合物を形成させ、その後に、得られた式（IIB）の化合物を残りの式（Ｉ）の（＋）異性体から分離することからなる方法を提供するものである。方法（ｉ）が好ましい。方法（ｉ）を用いた場合の該方法の立体選択性は、式（Ｉ）の化合物のラセミ混合物を酵素と作用させると、式（Ｉ）の化合物の（−）異性体の（＋）異性体に対する割合が６０％より大きく、好ましくは７０％より大きく、さらに好ましくは８０％より大きく、最も好ましくは８５％より大きいようなものである。方法（ii）を用いた場合の該方法の立体選択性は、式（Ｉ）の化合物のラセミ混合物を酵素と作用させると、式（Ｉ）の化合物の（＋）異性体の（−）異性体に対する割合が６０％より大きく、好ましくは７０％より大きく、さらに好ましくは８０％より大きく、最も好ましくは８５％より大きいようなものである。該方法は、適当には、非分割の式（Ｉ）の（±）化合物を水性／有機溶媒の混合溶媒などの適当な溶媒に溶かし、酵素を添加し、得られた混合物を反応が完了するまで攪拌することで行う。該反応を行うのに適当な温度として、０−５０℃、より適当には１０−４０℃ 、さらに適当には２５−３５℃、最適には３０℃が挙げられる。適当な水性／有機溶媒の混合溶媒として、ＤＭＳＯを混合したトリス緩衝液などの緩衝水性溶媒が挙げられる。反応を実施する場合の適当なｐＨは、ｐＨ４ないし８、さらに適当には５ないし７、好ましくはｐＨ５.５を包含する。可変基Ｒについての適当な基はメチルおよびエチルを包含する。Ｒはエチルであることが好ましい。カルボキシルエステラーゼ酵素が式（Ｉ）の化合物の（＋）形態を立体特異的に加水分解する方法（ｉ）においては、残っている式（Ｉ）の化合物の（−）形態は、常法、例えば酢酸エチルなどの非水性混和性溶媒を用いて式（Ｉ）の化合物を溶媒抽出に付して単離し、ついで得られた式（Ｉ）の（−）化合物を沈殿操作などの従来技術を用いて単離してもよい。本発明はさらに、その後、前記のように調製した式（Ｉ）の（−）化合物をパロキセチンまたはその医薬上許容される塩および／または溶媒和物、例えば塩酸塩・半水和物（例えば、米国特許第4902801号および第4721723号に概説されている操作を用いる）および塩酸塩・無水和物（ＷＯ96/24595に記載の操作を用いる）に変換する方法にまで及ぶものである。カルボキシルエステラーゼ酵素が式（Ｉ）の化合物の（−）形態を立体特異的に加水分解し、式（II）の化合物の（−）形態を生成する方法（ii）においては、前記したように式（II）の化合物の（−）形態から残っている式（Ｉ）の化合物の（＋）形態を単離してもよい。まず、通常のエステル化方法を用いて、式（II）の（−）化合物を式（Ｉ）の（−）化合物に変換することにより、該化合物をパロキセチンに変換してもよい。その場合、該エステルを、例えば、米国特許第4902801号および米国特許第472 1723号に記載の操作を用い、塩酸塩・半水和物などのその医薬上許容される塩および／または溶媒和物に変換してもよい。別法として、式（II）の（−）化合物は、そのカルボン酸基をヒドロキシメチル基に還元し、ピペリジン環にある２個のケト基を水素化アルミニウムリチウムなどの通常の還元剤を用いて還元することでパロキセチンに直接変換してもよい。その後、得られたピペリジンカルビノール化合物を、例えば、米国特許第4902801号および米国特許第4721723号に記載の操作に従って、パロキセチンまたは塩酸塩・半水和物などのその医薬上許容される塩および／または溶媒和物に変換してもよい。式（Ｉ）の化合物は米国特許第4902801号に記載の操作に準じて調製してもよい。この変化は、新規なエステラーゼがパロキセチンメチルエステルおよび／またはエチルエステルの分割能を有し、（−）異性体を９０％より大きなエナンチオマー過剰で得る点でパロキセチン合成におけるイミドエステルの分割にて特に有用である。本発明に従って単離した微生物を培養するための培地は、適当には、無機塩と同化しうる炭素および窒素の供給源を含有しており、適当には、リッチ培地、例えばＡＪ３Ｂ（実施例４を参照のこと）である。本発明の方法は、全細胞、無細胞抽出物、透過細胞あるいは微生物より由来の単離酵素または固定された形態のものを用いて行うことができる。生体内変化を全細胞を用いて行う場合、微生物は成長培養物、静止培養物、洗浄菌糸体、固定細胞またはプロトプラストの形態であってもよい。無細胞抽出物を用いる場合、その抽出物は、適当には、剪断および／または化学的あるいは酵素的溶解操作または他の破壊方法、好ましくは高圧均質化操作に付すことで生成され、その後所望により細胞残骸を除去し、溶液がその酵素活性を保持するようにしてもよい。酵素は以下の実施例に従って調製するのが適当であり、本発明のさらなる態様を形成する。酵素は微生物を慣用的方法、特に好気性条件下、適当な液体または半固体培地中で培養することで調製してもよい。培養条件は、温度が１５−３５ ℃の範囲にあり、ｐＨが６−８の範囲、最も好ましくは６.８である。酵素は、ＮＣＩＭＢ40700または好ましくは適当な組換え体、例えば以下に記載されるような供給源より単離されてもよく、精製された形態、部分的に精製された形態、不純な状態で得られる場合、破壊細胞調製物から濾過した物として、または粗製細胞ホモジネートとして用いられる。該酵素は、例えば、少なくとも精製され、出発物質または該酵素の破壊をも触媒する可能性のある他の酵素を除去することが最も適している。本発明のさらなる態様において、以下の実施例６に従ってＮＣＩＭＢ40700より由来の細胞を処理することで、すなわち、遠心分離および細胞破壊（高圧ホモジナイザー）に付し、つづいて分画化およびクロマトグラフィーに付すことによって得られる式（Ｉ）の化合物の分割能を有する酵素が提供される。その活性酵素は、各々が略３５０００の分子量（ＬＣＭＳによる）を有し、以下の実施例２１に記載される他の特性を有する、２個の等しいサブユニットの２量体として存在すると思われる。好ましくは、該酵素は、実質的に、配列番号２に示される配列を有する。「実質的に」なる語は、少なくとも８５％相同的、好ましくは９０ −９５％相同的、より好ましくは９５％以上相同的であることを意味する。本発明はまた、触媒性トライアド（triad）の酸性残基がストランド６の末端にあり、ジスルフィド結合により連結される、活性部位の近くに隣接する２個のシステイン残基を有するαβ−ヒドロラーゼホールド（fold）を有する酵素を提供する。さらなる態様において、本発明はさらに式（Ｉ）の化合物の分割能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。特に、該ＤＮＡは、実質的に配列番号１のＤＮＡ配列を有する。本発明はまた、好ましくは、高ストリンジェントな条件下、配列番号１のＤＮＡまたはそのフラグメントとハイブリダイデーションするＤＮＡ配列を包含する。適度にストリンジェントな条件は、例えば、０.１％ｗ／ｖＳＤＳ、０.１ｘＳＳＣ、６０℃での条件である。該ＤＮＡは適当なベクターに含まれているのが好ましい。本発明のさらなる態様において、本発明のベクターにより形質転換された宿主が提供される。好ましい宿主は、E．coliおよびAgrobacterium、特にAgrobacteriumである。適当には、例えば、Powell（1990）が、Microbial Enzymes and Biotechnology、FogartyおよびKelly編、p369-394において記載している操作により、本発明の酵素を不溶性支持物質に固定させる。この操作により、収率および処理能の向上という利点が得られる。該方法を全細胞を用いて実施する場合、インキュベーション培地としては培地Ａ（後記参照のこと）などの培地が挙げられる。該方法を無細胞抽出物を用いて実施する場合、そのインキュベーション培地は適当な緩衝液を有してなる。反応のｐＨは、典型的には、６−８の間にある。反応温度は一般に２２−４８℃、好ましくは３７−４７℃の間にあり、最も好ましくは４７℃である。該反応は、別法として、有機溶媒、例えば、アセトン、トルエン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の存在下で行うこともできるが、典型的には、水性培地中で行う。反応時間は、反応物および共同因子の濃度、温度およびｐＨなどの因子に依存する。反応終了後、生成物は従来技術および以下の実施例に示されるように単離することができる。最初の精製は、都合よくは、溶媒抽出または濾過操作を伴う。図面の記載図１は、コスミドｐＲＯＸ１、ｐＲＯＸ２およびｐＲＯＸ３に共通の７１３番のゲノムＤＮＡフラグメントの塩基性制限地図を示す。図２−８は、プラスミド地図（一般的特徴）を示す。斜線を付した部分はエステラーゼのコード領域に対応する。Ｐtrcはtrcプロモーターをいい、rrnB Ｔ₁Ｔ₂ はｒＲＮＡ転写ターミネーターをいい、Ａｍｐ^Rはアンピシリン耐性をいい、ｐＢＲ３２２起点は複製起点をいい、ＬａｃＩｑは過剰発現性ｌａｃレセプター遺伝子をいう。図２はｐＲＯＸ６のプラスミド地図を示す。図３はｐＲＯＸ１２のプラスミド地図を示す。図４はｐＲＯＸ１８のプラスミド地図を示す。図５はｐＲＯＸ２９のプラスミド地図を示す。図６はｐＲＯＸ２４のプラスミド地図を示す。図７はｐＲＯＸ２６のプラスミド地図を示す（Ｃｍ^Rはクロラムフェニコール耐性をいう）。図８はｐＲＯＸ３６のプラスミド地図を示す（Ｃｍ^Rはクロラムフェニコール耐性をいう）。以下の実施例を用いて本発明を説明する。実施例１-一次選択スクリーンパロキセチンステージ１エステル（paroxetine stage１ester）［式Ｉの化合物の混合物（Ｒ＝ＣＨ₂ＣＨ₃（８５％ｗ／ｗ）およびＲ＝ＣＨ₃（１５％ｗ／ｗ））として定義される］を唯一の炭素源として利用する能力を有する生物を単離するための選択スクリーンを開発した。パロキセチンステージ１エステルを唯一の炭素源として含有する最小培地中で生物を増殖させ、この基質の修飾能を有する酵素を含む生物を単離した。（＋）−異性体にキラル偏向のあるステージ１パロキセチンよりメチルおよび／またはエチルエステルのいずれかを除去するエステラーゼを有する生物について、これら生存体の副次集団を試験した。英国および外国の土壌試料を入手した。これらの試料の少量（マイクロスパチュラ量）を、K₂HPO₄ 1g/l、KH₂PO₄.3H₂O 3g/l、MgSO₄ 0.5g/l、(NH₃)₂SO₄.7H₂O 2g/l、FeSO₄ .7H₂O 10mg/l、MnCl₂.4H₂O 10mg/l、ZnSO₄ 10mg/lを含む１０mlの最小培地Ａと、滅菌処理した固体として添加された１０g/lのパロキセチンステージ１とを一緒に入れた１００mlの振盪フラスコに加えた。これらのフラスコをオルビタルインキュベーター上２６℃で７日間インキュベーションし、その後、１mlの試料を取り出し、別のセットの同じフラスコの接種源として用いた。この継代培養を２回目も繰返し行い、２日間インキュベーションした後、１０μｌのループ試料をグリセロール（7.5g/l）、糖蜜（7.5g/l）、酵母抽出物（5g/l）、MgSO₄．7H₂O （0.05g/l）、KH₂PO₄（6mg/l）、NH₃FeSO₄. 12H₂O（16mg/l）、CuSO₄．7H₂O（10mg/l）、CaSO₄ 0.25g/lおよび寒天番号３（2 5g/l）を含有するＧＭ寒天プレートにストリークさせ、単一のコロニーを得た。２６℃で６日間インキュベーションした後、単一の形態学的に異なるコロニー（プレート当たり１または２個）を掻き取り、２６℃で７日間インキュベーションし、つづいて４℃で貯蔵し、ＧＭスロープ上にストリークさせた。懸濁固体として添加した１％パロキセチンステージ１（ｗ／ｖ）を含有するＧＭ寒天誘導プレート上に菌叢として平板培養することで、２次スクリーン用の各単離体を調製した。エステラーゼが誘発を必要とする場合には、基質をこの培地に加えた。合計１８００種の土壌試料を１次スクリーンにて処理し、その結果２１１１種の生物を単離し、それを２次スクリーンにてエステラーゼ活性について分析した。実施例２−２次選択スクリーン２次スクリーンアッセイは、単離した生物がパロキセチンステージ１に含まれるエチルまたはメチルエステルのいずれを加水分解し、対応するカルボン酸（トランス-3-カルボキシ-4−(4'−フルオロフェニル)-N-メチルピペリジン-2,6-ジオン）を得ることができるかどうかを同定するように設計した。細胞をＧＭ寒天誘導プレートより掻き取り、０.１６ＭトリスＨＣｌ、２０％ｖ／ｖＤＭＳＯおよび０.１％ｗ／ｖパロキセチンステージ１エステルを含有するパロキセチンステージ１アッセイ混合物（１ml）中にｐＨ５.５で攪拌することで懸濁させた。反応を３０℃で一夜インキュベーションし、１４０００ｒｐｍで４分間遠心分離（エッペンドルフ・マイクロ遠心機（Eppendorf micro-centrifuge））に付すことで細胞を除去した。上澄みを０.４５μｍのフィルターを介して濾過し、２０ μｌを逆相カラム（Partisphere、Ｃ18、５μｍ、110mm x 4.7mm径）上に注入し、パロキセチンステージ１酸を測定した。緩衝液Ａ(０.０５Ｍ酢酸アンモニウム、１０％アセトニトリル含有（ｐＨ４.０））および緩衝液Ｂ（０.０５Ｍ酢酸アンモニウム、６０％アセトニトリル含有（ｐＨ４. ０））を混合した、表１に示すプロフィールのグラジエント溶出を用いて分離を行った。表１ HPLC装置検出器、Waters 490E システム調整器、Waters 600E 注入器、Waters Autosampler 717 約５０種の単離体はカルボン酸生成物の形成（保持時間約３.５分）と一致するピークを示したが、そのほとんどはレベルが極端に低かった。上位１５個の最も活性な単離体の分析に集中した。これらの酸のピークの信頼度はＰＬＥ反応より得られた酸標体をスパイクし、共同溶出することにより証明された（国際出願ＷＯ93/22284 SmithKline Beecham）。実施例３−３次スクリーンカルボン酸産生生物がキラル選択性を有するかどうかを同定するために３次スクリーンを設計した。酵素の選択に応じて化合物Ｉの純粋なエチルまたはメチルエステルのいずれかを用いることを除いて、２次スクリーンと同じ方法にて反応を行った。反応上澄（８００μｌ）をエーテル（５００μｌ）と一緒に１０秒間攪拌した。１４０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離に付すことで相を分け、上部のエーテル相を取り出した。ついで、エーテル抽出液（１００μｌ）を、２５％ｖ／ｖエタノールを含有するヘキサンで溶出（１ｍｌ／分）することで、シリカ上の４-メチル安息香酸セルロースをベースとするChiralcel OJカラム（Diace l Chemical Industries）25cm x 4.6mm径）を用いて分離した。分割された異性体を２６５ｎｍで検出した。キラル選択性を＋および−エステルの割合で表した。実施例４−微生物分析および活性な単離体の貯蔵単一のコロニーをＧＭおよびＴＳＡ培地上で平板培養し、２６℃でインキュベーションすることにより、単離体を純度について調べた。純粋なプレートからの単一のコロニーを用いて、２０ｍｌのＡＪ３Ｂ（酵母抽出物（25g/l）、NaH₂PO₄ （2g/l）、MgSO₄.7H₂O（１g/l）、MnSO₄.4H₂O（0.01g/l）、FeSO₄.7H₂O（0.01g/ l）、CaCl₂.2H₂O（0.08g/l）、グリセロール（15g/l）、ｐＨ６.８）を含有する２５０ｍｌのフラスコを接種し、一夜インキュベーションした。各々、０.５ｍｌの培養物を、低温試験管中、等容量の滅菌４０％グリセロールと混合し、−７０℃に凍結させた。貯蔵培養物を純度ならびにＧＭおよびＴＳＡの両方にて平板培養することで生存能について分析した。実施例５−単離されたＮＣＩＭＢ40700の同定および特徴化ＧＭプレート上での外観；灰白色、環状、１−３ｍｍ、平滑、光沢性、ドーム状；ＡＪ３Ｂ振盪フラスコ培地中での外観；混濁した灰白色分散成長体。適当な成長条件はＡＪ３Ｂ液体培地で２６℃で１-２日間であり、接種物は２６℃で４日間ＧＭプレート培地を用いる新鮮な寒天プレートまたはスロープからのものが最適である。生物は３７℃で運動能を有しているのは明らかであり、黄色に着色しており、オキシダーゼ陰性で、炭水化物からほとんど酸を産生しない。ＰＣＲ増幅した１６ＳｒＤＮＡを直接配列決定することで、単離されたＮＣＩＭＢ40700の部分的１６ＳｒＤＮＡ配列分析を行った。配列データをドメインBacteriaのメンバーの１５００種以上の配列と比較した。類似性は、ＮＣＩＭＢ40700がAlcaligenes xylosoxidansと最も密接に関係していることを示した（９７.７％配列類似性）。次に最も近い類似性がAlcaligenes faecalis（９５.５％）について見られた。菌株をその種レベルにまで同定することはできなかったが、このデータはＮＣＩＭＢ40700をProteobacteriaのベータサブクラスに位置づけるものである。実施例６−土壌単離体ＮＣＩＭＢ40700細胞破壊物より由来のエステラーゼの精製２００リットルのＮＣＩＭＢ 40700 AJ3B醗酵ブロス（６０時間）を脱スラッジ式遠心機（West Falia Separator Ltd.、Milton Keynes、UK.）を用いて収穫し、４５リットルの細胞懸濁液を得た。ついで、該細胞を１００００ｐｓｉで温度を２０℃以下に調節しながら連続的ホモジナイザー（A.P.V．Gaulin BV，S-Gr avelandseweg，Hilversum，Holland）に４回通すことで均質化した。酵素捕獲および濃縮ついで、ホモジネートを蒸留水と１：１に希釈し、１３.１ｋｇのＷＫ−10イオン交換樹脂（三菱化成株式会社、東京都千代田区）と一緒に攪拌した。酵素摂取は５ＭＮａＯＨを用いてｐＨを６.５に連続的に調整しながら３時間で完了した。負荷した樹脂を濾過で除去し、８０リットルの蒸留水で２回洗浄した。ついでエステラーゼ活性を、５ＭＮａＯＨを用いてｐＨを７.５に調整しながら８０リットルの１ＭＮａＣｌと一緒に９０分間攪拌することにより樹脂から溶出させた。ついで、その酵素を限外濾過（Spiral wound 10,000mw cut off、 Amicon）により６リットルにまで濃縮し、５ＭＮａＯＨを用いてｐＨを７.０に調整しながら、５１５ｇのＡ５６８樹脂（Rohm Haas、Chavny、France）と共に１６時間攪拌した。不要なタンパク質を吸着した樹脂を濾過により取り除き、５ .５リットルの清澄な酵素溶液を得た。フェニルアガロースクロマトグラフィーＡ５６８処理後の抽出物（４リットル）を限外濾過（Spiral wound 10,000mw cut off、Amicon）により１.８リットルに濃縮した。その濃縮抽出物を０.３９Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍｌ）を添加することによりｐＨ６.５に調整し、５０ｍＭの最終緩衝液濃縮物を得た。この溶液を氷上で攪拌し、３９６ｇの(NH₄)₂SO₄（Sigma Ultra）をゆっくりと加え、(NH₄)₂SO₄を１.３Ｍの最終濃度とした。ついで、該溶液を５ＭＮａＯＨでｐＨ６.５に再び調整し、８℃で一夜放置した。沈殿したタンパク質を１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離操作に付すことで除去した。次に、エステラーゼ活性をフェニルアガロース６ｘＬカラム (11.5cm x 5.0cm径、Affinity Chromatography Ltd、Isle of Man、UK)に２０ml ／分の流速で吸着させた。このカラムは１.５Ｍの(NH₄)₂SO₄を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６.５）（緩衝液Ｃ）（９００ｍｌ）を用いて予め平衡にした。未結合タンパク質をその負荷カラムを１.２リットルの緩衝液Ｃで洗浄することで除去した。ついでエステラーゼを２リットル以上の１００％緩衝液Ｃから１００％緩衝液Ｄ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６.５）の直線状勾配を用いて溶出した。８０ｍｌづつのフラクションを集め、実施例２に記載の標準ＤＭＳＯ含有アッセイ法を用いて検定した。活性フラクション２４、２５および２６をプールし、５リットルの水に対して一夜透析させた（室温）。Ｑ−セファロースクロマトグラフィーフェニルアガロース精製工程からの透析抽出物をNa．₂HPO₄飽和溶液でｐＨ８. ６に調整した。濾過（０.４５μｍ）後、該溶液を、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.８）で予め平衡にしたＱ−セファロースイオン交換カラム（Hiloa d HP、10cm x 1.6cm径、Phamacia）に３ｍｌ／分で通した。エステラーゼ活性はこのカラムには保持されず、不要タンパク質が結合することで精製がなされた。Ｓ−セファロースクロマトグラフィーＱ−セファロース精製工程に付した活性フラクション（３２０ｍｌ）をNaH₂PO₄ 飽和溶液を用いてｐＨ７.０に調整した。濾過後（45μｍ）、エステラーゼを２５ｍＭリン酸ナトリウム含有の緩衝液Ｅ（ｐＨ６.８）で予め平衡にしたＳ−セファロースイオン交換カラム(Hiload HP、10cm x 1.6cm径、Phamacia)に３ｍｌ／分で結合させた。ついで、該負荷カラムを緩衝液Ｅ（１００ｍｌ）で洗浄した。ついでエステラーゼを３００ｍｌ以上の１００％緩衝液Ｅから１００％緩衝液Ｆ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１ＭＮａＣｌ）の直線状勾配を用いて３ｍｌ／分で溶出した。７.８ｍｌずつのフラクションを集め、含ＤＭＳＯ方法を用いてアッセイした。２つの重複する活性ピークが、少なくとも２種の異なる電荷活性種で観察された。フラクション９、１０、１１および１２をプールして活性種Ｉを得、フラクション１３および１４をプールして種IIを得た。ブルーセファロースクロマトグラフィー活性エステラーゼ種Ｉをさらにブルーセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。Ｓ−セファロース精製工程のプールしたフラクション（０.６ｍｌ）を緩衝液Ｅ（７.５ｍｌ）を添加して希釈した。この混合液（７ .５ｍｌ）を、緩衝液Ｅで予め平衡にした、HiTrapブルーアフィニティーカラム上に１ｍｌ／分（５ｍｌ、Pharmacia）で負荷した。ついで、その負荷カラムを２０ｍｌの緩衝液Ｅで洗浄した。ついでエステラーゼを３０ｍｌ以上の１００％緩衝液Ｅから１００％緩衝液Ｆの直線状勾配を用いて１ｍｌ／分で溶出した。フラクションを１ｍｌずつ集めてアッセイした。ＵＶ溶出プロフィールは、２種の活性種、最初の溶出ピークは種Ｉで、濃度が略２倍の種IIの分割を示した。フラクションIIないし１６をプールして純粋な精製種Ｉおよびフラクション１７ないし２１をプールして種IIを得た。この工程をＳ−セファロースからの主として種IIを含有するプールしたフラクションについて繰返した。この分離によりフラクション２３ないし２９において優勢的に種IIを得、それをプールして純粋な種IIを得た。種ＩおよびIIをＬＣ−ＭＳにより分析して、１種以上の分子量を含有するこれらの両方の種を含むさらに複雑な混合物が明らかにされた。これらのうち幾つかの形態は、表２に示されるようなＮおよびＣ末端の違いにより説明することができる。実施例７：土壌単離体ＮＣＩＭＢ40700からの染色体ＤＮＡの単離単離体ＮＣＩＭＢ40700をＡＪ３Ｂ寒天（Bacto寒天含有のＡＪ３Ｂ液体培地、４１５ｇ／ｌ；ｐＨ６.８）上に２５℃で３日間培養した。この後、完全に環状（loopfull）の細胞を１リットルの円錐形フラスコ内のＡＪ３Ｂ培地（２００ml ）に移し、この培養基を２６℃で通気（２７５ｒｐｍ）しながら３日間増殖させた。ついで、ついで、Sorval GSAローター（7,500rpm、15分間、４℃）を用い、 Sorval RC-5B冷凍超高速遠心機で遠心分離に付すことで細胞を収穫した。上澄みを捨て、細胞ペレットを−２０℃で１６時間貯蔵した。この時間経過後、細胞を氷上で解氷し、５０ｍｌの５０ｍＭ Tris.ＨＣＬ、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）溶液に再び懸濁させた。その後、等量の懸濁液（5ml）を３０ｍｌの滅菌ガラス製万能瓶に移し、それに０.５ｍｌのリゾチーム溶液（０.２５Ｍトリす塩酸１ｍｌ中１０ｍｇ、ｐＨ8.0）を加えた。試料を緩やかに反転させることで混合し、ついで氷上に３０分間静置した。この後、６ｍｌの溶菌溶液（SDS0.5%(w/v)、 50mM Tris.HCl、0.4M EDTA（pH8.0）およびプロテイナーゼＫ１mg/ml）を加えた。再び緩やかに反転させた後、溶菌が明らかになるまで、試料を５０℃に加熱し、ついで室温に冷却した。この時点で１０ｍｌの５０mM Tris.HCl、５０mM ED TA（pH8.0）を各清澄な溶菌液に加え、つづいて５ｍｌのビフェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２５：２４：１の混合液、ｐＨ８.０）を加えた。緩やかに反転して抽出を行い、続いてDenley BR401冷凍式遠心機（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）にて相を分離した。各試料の水相を内径の大きなピペットで取り出し、５ｍｌのビフェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２５：２４：１の混合液、ｐＨ８.０）で再び抽出した。この段階で、すべての水相を、内径の大きなピペットを用いて滅菌１５０ｍｌプラスチック製スクリューキャップ式ビーカーにプールした。０.１容量の３Ｍ非緩衝酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を、つづいて１容量の冷（−２０℃）無水エタノールを添加することによりＤＮＡを沈降させた。沈降したＤＮＡの塊りが明らかになるまで緩やかに反転することで溶液を混合した。これを小さな滅菌プラスチック製ループを用いて取り出し、１ｍｌのＴＥ溶液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）中に再び懸濁させた。実施例８：土壌単離体ＮＣＩＭＢ40700のゲノムライブラリーの構築プラスミドｐＷＥ１５（Wahl，G．（1989）Strategies２：17）は土壌単離体のＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムＤＮＡのライブラリーを構築するのに用いたコスミドベクターであった。この場合、ＤＮＡ（５μｇ）を４０単位の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Gibco BRL、Paisley、PA3 4EF、Scotland）を用いて５０μｌの適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL）中３７℃で５．５時間消化した。次いで反応混合物をビフェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２５：２４：１の混合液、ｐＨ８.０）で１回、ＣＨＣｌ₃で１回抽出した。回収した水相を０.１容量の３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ４.８）および２．５容量のエタノールで処理した。混合した後、溶液を−２０℃で１６時間インキュベーションし、ＤＮＡを沈降させた。Jouan MR 14.11遠心分離器を用いて１.５ｍｌのマイクロ遠心分離管中で遠心分離に付した後（１４０００ｒｐｍ、２５分、４℃）、上澄みＤＮＡペレットを３６μｌの滅菌した二回蒸留水に溶かした。これに４μｌのシュリンプアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）反応緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８.０）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂）および０.５単位のＳＡＰ酵素（Amersham L ife Science、Little Chalfont、HP7 9BR、英国）を加えた。末端部の脱リン酸化を３７℃で３０分間行った。この期間経過後、さらに０.５単位の酵素を加え、インキュベーションを３７℃で３０分間続けた。反応混合物を６５℃にセットした熱水浴に２０分間入れ、ついでベンチ上で室温までゆっくりと冷却した。脱リン酸化ｐＷＥ１５ＤＮＡを、SephaglasTMBandprep Kit（Pharmacia Biotech L td.、St．Albans、ALl 3AW英国）を用い、使用説明書に従って、最後に０.７％（ｗ／ｖ）トリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲルより単離した。コスミドライブラリーを構築するのに所望の大きさ（２５−５０ｋｂ）の部分ＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムＤＮＡフラグメントを得るために、以下のプロトコルを用いた。単離体ＮＣＩＭＢ４０７００（実施例７を参照のこと）から由来の無傷のゲノムＤＮＡ（１６０μｇ）を０.１５６単位の制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ（Gibco BRL）を用いて適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL）（１００μｌ）中、３７℃で２５分間消化した。ついで、２０単位のＲＮace−Ｉｔ^T ^M リボヌクレアーゼカクテル（Stratagene Ltd.、Cambridge、CB4 4GF、英国）を加え、さらに５分間反応させた。この時間経過後、７０℃の熱水浴中に１０分間該試料を入れることで反応を停止させた。消化されたＤＮＡ（１００μｌ）を４ .８ｍｌのシュークロース勾配（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＮａＣｌ中１０−４０％；ｐＨ８.０）上に負荷し、Beckman SW50.1振動ローターを用いてBeckman L5-65B Ultra-centrifuge（３６０００ｒｐｍ、１６時間、４℃）で遠心分離に付し、フラグメントを分離した。所望の範囲の大きさのＤＮＡフラグメントを含有するフラクション（２００μｌ）を、１.５ｍｌのマイクロ遠心管中、酵母トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）（１.２５μｌ）と一緒に１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）に加えた。これにプロパン−２−オール（３００μｌ）を添加し、ＤＮＡを−２０℃で１６時間沈降させた。この物質をJuan MRl4.11 Centrifuge（１２０００ｒｐｍ）２０分、４℃）を用いる遠心分離により回収し、得られたＤＮＡペレットを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、室温で３０分間風乾した。その後、ＤＮＡを５０μｌのＴＥ緩衝液中に４℃で１６時間再度懸濁させた。限定ｐＷＥ１５ＤＮＡおよびサイズ分画ＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムフラグメントをライゲーションし、Gigapack II Gold Packaging Kit(Stratagene Ltd.) を使用説明書（カタログ番号251201、251202、1991年11月20日）に従って使用してインビトロにてパッケージした。その後、パッケージライブラリーをE.coli菌 XL−1Blue MRF（Stratagene Ltd．）について滴定し、合計４.６ｘ１０⁵個の形質導入体が得られたことがわかった。実施例９：エステラーゼ活性を特異化するクローンの同定個々のイーコリＸＬ−１ブルーＭＲＦ組換えコロニー（実施例８を参照のこと）を、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの最終濃度で含有する、２ｍｌの２ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ；ｐＨ７ .２）に接種し、２５℃で１６時間通気（２９８ｒｐｍ）しながら増殖させた。試料（０.５ｍｌ）を各培養基から取り出し、一群３本の１.５ｍｌのマイクロ遠心管にプールした。Eppendorf 5415 Centrifuge（１４０００ｒＰｍ、３分、室温）で遠心分離に付すことで細胞を収集し、メチルエステルとして化合物Ｉを１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０.１Ｍリン酸ナトリウム；ｐＨ７.０に溶かして含有する基質溶液（１.５ｍｌ）に再度懸濁させた。ついで、Vortex-Genie２^TMシェーカー（CP Laboratories、Bishop's Stortford、CM23 3DX、英国）を用いて室温で１８時間激しく混合した。この期間の経過後、７００μｌを各反応混合物から取り出し、１.５ｍｌのマイクロ遠心管中、メタノールで１：１に希釈した。次に、Eppendorf 5415 Centrifuge（１４０００ｒｐｍ、４分、室温）を用いて遠心分離に付すことで試料を清澄にした。ついで、実施例２に記載されるように高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により清澄な溶液を分析した。試験した１２８７組換え体のうち、カルボン酸標体と一緒に溶出した、３本のピークはフォトダイオードアレイスペクトロメーターにより測定されるような、標体と同じＵＶ吸光スペクトルを示した。実施例１０：イーコリ株ＸＬ−１ブルーＭＲＦ’から由来のコスミドｐＲＯＸ１、ｐＲＯＸ２およびｐＲＯＸ３の単離および特徴化最初のＨＰＬＣスクリーン（実施例９を参照のこと）より同定された３つの陽性クローンからのコスミドＤＮＡを、Sambrookら、(1989)“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”（第２版）に記載されているように、大規模なアルカリ性溶菌／ＣｓＣｌプロトコルを用いて単離した。これらを、各々、ｐＲＯＸ１、ｐＲＯＸ２およびｐＲＯＸ３と称する。制限エンドヌクレアーゼ分析により、各クローンが約１２.０ｋｂの大きさのゲノム領域を覆う、共通のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII制限フラグメントを含有することがわかった（図１を参照のこと）。前記したクローンの関連性はさらにサザン分析により証明された。それによれば、各クローンのＤＮＡ（約１０μｇ）は４０μｌの適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL）中、３０単位の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Gibco BRL）で３７℃、５時間で消化された。無傷のＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムＤＮＡ（３２μｇ）を同一条件下、同様の方法で消化した。ＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動法によりサイズ分画に付し、Sambrookら、（１９８９）前掲に記載されているように、Hybond^TM− Ｎナイロン膜（Amersham Life Science）に移した。変性および再生した後、ECL^TM Random Prime Labelling and Detection System（Amersham Life Science）を使用説明書に従って、コスミドｐＲＯＸ２より精製した、３.８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント（共通領域内に位置する）で膜をプローブした。結果は該プローブがｐＲＯＸ１、ｐＲＯＸ２およびｐＲＯＸ３から由来の３.８ｋｂＢａｍＨＩフラグメント、ならびにＮＣＩＭＢ４０７００ゲノム消化物中の同時移動フラグメントとハイブリダイゼーションしたことを示した。実施例１１：プラスミドｐＲＯＸ６の構築５μｇのプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Amann，E.ら、（1988）Gene 69：301-31 5）ＤＮＡを、４０単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎdIII（Gibco BRL）のいずれかを用い、３７℃で４時間、６０μｌの適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL）中で消化した。この期間経過後、各反応混合物をビフェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２５：２４：１混合液、ｐＨ８.０）で１回、ＣＨＣｌ₃で１回抽出した。ついでＤＮＡを実施例８に前記したようにエタノール沈降、脱リン酸化およびゲル精製に付した。コスミドｐＲＯＸ１ＤＮＡ（１０μｇ）を４０単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Gibco BRL）を用いて３７℃で５時間、５０μｌの適当なReact^TMBuffer（ Gibco BRL）中で消化させた。加えて、コスミドｐＲＯＸ２ＤＮＡ（１０μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩまたはＨｉｎdIII（Gibco BRL）のいずれかを用いて同様の方法にて消化させた。３種すべての反応混合物を０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動操作によりサイズ分画させた。５.７ｋｂＥｃｏＲＩ、３.８ｋｂＢａｍＨＩまたは５.０ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメントのいずれかを含有するグル部を削り取り、前記したように（実施例８を参照のこと）Sephaglas^TMBandprep Kit（Pharmacia Biotech Ltd.）を用いてＤＮＡを回収した。精製コスミドＤＮＡ（約５００ｎｇ）を精製脱リン酸化ベクターＤＮＡ（約５００ｎｇ）（同様の方法にて消化で消化されている）と１.５ｍｌのマイクロ遠心管中で混合し、合計１８μｌの容量を得た。遠心管を６５℃に保持した水浴中に７分間入れ、ついでベンチに取り出し、１０分間そのＤＮＡ混合物を室温にまでゆっくりと冷却させた。この後、２μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液(Boehrin ger Mannheim、Lewis、BN7 １LG、英国）および１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（B oehringer Mannheim）を加え、１６℃で１６時間反応させた。ついで、そのライゲーションミックスを用いて、Sambrookら（１９８９）前掲に記載されるように、能力イー・コリ株ＸＬ−１ブルーＭＲＦ’細胞を形質転換させた。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したＬ−寒天プレート（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ；ｐＨ７.２）上に細胞を広げ、３７℃で１６時間増殖させた。この期間経過後、各形質転換による１２個のアンピシリン耐性組換えコロニーを、個々に、５ｍｌの２YT培地に植え、３７℃で１６時間通気（２７５ｒｐｍ）しながら増殖させた。その後、Sambrookら、（１９８９）前掲に記載されているように、アルカリ性溶菌操作を用いて、プラスミドＤＮＡの小規模の単離を行った。各クローンの一部のＤＮＡ調製物（１０μｌ）を適当な制限エンドヌクレアーゼ（複数でも可）を用いて消化し、所望のＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムＤＮＡフラグメントのサブクローニングを確かめ、ベクターのｔｒｃプロモーター領域に関して前記したフラグメントの配向を決定した。その後、０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動により、各ＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムフラグメントは両配向にてうまくクローンされていることがわかった。組換え細胞（クローンの各型を示す）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した１０ｍｌの２ＹＴ培地ならびに５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０.５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する２ＹＴ培地に植えた。培養基を２５℃で１６時間通気（２７５ｒｐｍ）しながら増殖させ、ついでDenley BR401 Regrigerated Centrifugeにて遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分、４℃）に付すことで収穫した。得られた細胞ペレットを１．５ｍｌの化合物Ｉメチルエステル基質溶液に再度懸濁させ、実施例９に記載されているようにエステラーゼ活性についてアッセイした。３.８ｋｂＢａｍＨＩまたは５.０ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメントクローンを有する細胞では、いずれの配向においてもエステラーゼ活性は検出できなかった。しかしながら、対照的に、５. ７ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントクローンを有する細胞はエステラーゼ活性を示し、そのレベルは配向に依存した。より高いレベルの酵素活性を付与する種類から由来の単離体の一つを確保し、ｐＲＯＸ６と称する（図２を参照のこと）。実施例１２：プラスミドｐＲＯＸ１２の構築ミニ調製物（mini−preparation）のプラスミドｐＲＯＸ６ＤＮＡ（１０μｌ）を２０単位の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Gibco BRL）を用いて３０ μｌの適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL）中、３７℃で４時間消化させた。ついで、２０単位のＲ Nace−It^TMRibonuclease Cocktail（Stratagene Ltd.）を加え、インキュベーションを３７℃でさらに２０分間続けた。その後、ＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル上に負荷し、サイズ分画に付した。９.２ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを含有するゲルの部分を削り取り、実施例８に記載されているように、Sephaglas^TMBandprep Kit（Pharmacia Biotech Ltd.）を用いてＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡの、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim）を用いての再環化は実施例１１に記載されているように行つた。ライゲーションミックスを用いてイー・コリＸＬ−１ブルーＭＲＦ’能力細胞を形質転換させ、つづいてアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したＬ−寒天プレート上に置き、３７℃で１６時間増殖させた。ついで、実施例１１に概説するように、８個のアンピシリン耐性クローンから小規模でＤＮＡを調製した。ＤＮＡ調製物の一部（１０μｌ）を２０単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いて３０μｌの適当なRe act^TMBuffer（Gibco BRL）中、３７℃で３時間消化させた。ＲＮＡを取り出し、前記したように、ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動操作によりサイズ分画に付した。分析したクローンのすべてで９.２ｋｂＤＮＡフラグメントが得られ、それはｐＲＯＸ６からの７００ｂｐのＢａｍＨＩ領域の喪失を示唆する。組換え細胞のＨＰＬＣ分析を実施例３に記載されるように行い、それによればエステラーゼ活性が保持されていることがわかった。一の代表的クローンを確保し、ｐＲＯＸ１２と称した（図３を参照のこと）。実施例１３：プラスミドｐＲＯＸ１８の構築ミニ調製物のｐＲＯＸ１２ＤＮＡ（２０μｌ）を２０単位の制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩ（Gibco BRL）を用いて４０μｌの適当なRe act^TMBuffer（Gibco BRL）中、３７℃で２時間消化させた。反応混合物をＲ Nac e−It^TMRibonuclease Cocktail（Stratagene Ltd.）を用いて３７℃で１時間さらに処理した後、ＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画に付した。３.０ｋｂＤＮＡフラグメントを含有するゲルの部分を削り取り、実施例８に記載されているように、Sephaglas^TMBandp rep Kit（Pharmacia Biotech Ltd.）を用いてＤＮＡを精製した。精製した３.0ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIＮＣＩＭＢ４０７００フラグメント（約５００ｎｇ）および精製したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡＤＮＡ（約５００ｎｇ、予め同じ制限エンドヌクレアーゼで消化され、脱リン酸化に付されている）を含有するライゲーション反応物を実施例１１に記載されているように行った。ライゲーションミックスを用いてイー・コリＸＬ−１ブルーＭＲＦ’能力細胞を形質転換させ、つづいてアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補足したＬ−寒天プレート上に広げ、３７℃で１６時間増殖させた。この期間経過後、６個のアンピシリン耐性コロニーを、個々に、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌの２ＹＴ培地に植え、２５℃でさらに１６時間増殖させた。プラスミドＤＮＡを実施例１１に記載されているように３ｍｌの培養基から小規模で調製し、この一部（１０μｌ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ III（Gibco BRL）を用いて消化した。ＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動操作によりサイズ分画に付し、３.０ｋｂＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムフラグメントはすべてのケースにてうまくサブクローンされる結果が得られた。かかる１のクローンを確保し、ｐＲＯＸ１８と称した（図４を参照のこと）。実施例１４：プラスミドｐＲＯＸ１８中のＮＣＩＭＢ４０７００ＤＮＡのヌクレオチド配列の決定プラスミドｐＲＯＸ１８ＤＮＡをSambrookら（１９８９）前掲に記載されたアルカリ性溶菌／CsCl精製操作を用いて大規模に調製した。これを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎdIII（Gibco BRL）を用いて消化し、３.０ｋｂＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムフラグメントを放出させ、つづいてそれをプラスミドp BluescriptIIＳＫ^-（Stratagene Ltd）中の対応する部位にサブクローンした。ついで、得られた構築物を用いてイー・コリ株ＸＬ−１ブルー能力細胞を形質転換させた。次に、プラスミドＤＮＡをSambrookら（１９８９）前掲に記載されるようにアルカリ性溶菌操作を用いて精製した。Erase- a-Base^TMSystem Kit（Promega limited、Southampton、英国）を用い、Henikoff ，S.（１９８４）Gene 28：351−359の操作に従って、Ｔ７およびＴ３の両末端よりネステッド欠失体を得た。欠失クローンをアガロースゲル電気泳動によりサイズ選択し、ＤＮＡ配列決定を７−デアザｄＧＴＰおよび標識としての［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰを含む標準的ジデオキシヌクレオチド末端反応を用いて行った。激しいＧＣバンド圧縮を分解するために、７−デアザｄＩＴＰを加えた。配列決定反応はすべて８Ｍ尿素含有の６％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドウェッジゲル上で分析した。配列決定のギャップを埋めるために、必要ならば内部オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。両鎖（配列番号１）で合計３０３２ｂｐの配列を得た。６つすべての可能なリーディングフレーム中のこの領域の翻訳は３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の存在を明示する。もちろん、最初のＯＲＦ（ヌクレオチド位置３３７−１４０４）は完全であり、大きさが３８.３キロダルトン（ｋＤａ）の推定３５５アミノ酸ポリペプチドをコードする。これは精製したＮＣＩＭＢ４０７００エステラーゼ酵素をＮ−末端配列決定することにより決定されたアミノ酸領域と同じ相同性（残基２６−５４）を有する。したがって、これは前記の酵素をコードする構造遺伝子であると提案される。同じリーディングフレーム内で、第２の完全なＯＲＦは１番目の下流にあり（ヌクレオチド位置１５５８−２４６６）、大きさが３２.６ｋＤａの推定３０２アミノ酸ポリペプチドをコードする。最後に、第３の不完全なＯＲＦは、同じリーディングフレーム内の２番目の下流にあり（ヌクレオチド位置２６４１−３０３２）、大きさが１３.５ｋＤａの推定１３０アミノ酸末端切断ポリペプチドをコードする。実施例１５：プラスチドｐＲＯＸ２９の構築配列決定された３.０ｋｂのＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムフラグメント内の領域（ヌクレオチド３２５−１４９０、エステラーゼ構造遺伝子およびフランキング領域を有してなる）を、GeneAmp^RＰＣＲReagent Kit(Perkin Elmer Cetus、761Main Avenue、Netwalk、CT06859、USA)を用い、本質的に使用説明書に従って、CsCl−精製プラスミドｐＲＯＸ１８テンプレートより増幅させた。簡単には、一連の修飾された１００μｌの反応混合物（１Ｘ Reaction Buffer／１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５０−４００ｎｇのｐＲＯＸ１８ＤＮＡ含有）；１μＭのオリゴヌクレオチド dTGAGGAGACACCATGGCTATGCACCGTAC(Cruachem Ltd.、Glasgow、G20 OUA、英国);１ μＭのオリゴヌクレオチドdTATTAGCGCTAAGCTTAGTGCCAACAG(Cruachem Ltd.)および２００μＭｄＮＴＰ）をキャップ式の０.５ｍｌのポリプロピレン製マイクロ遠心管に入れた。次に９８℃に維持した熱水浴に５分間入れ、ついでベンチ上でさらに１０分間ゆっくりと冷却した。この時間の経過後、遠心管をHybaid^TMTher mal Cycler（Hybaid Ltd.、Teddington、Middlesex、TW11 8LL、英国）に入れ、５単位のAmplitaq^RＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を各反応混合物に加えた。ＤＮＡの増幅を３０サイクル以上行った。各サイクルは、９４℃で１分間の変性工程；６５℃で２分間のアニール工程；および７２℃で２分間の延長工程からなる。最後のサイクルは少し修飾して、さらに１０分間の延長工程を含めた。この後で、反応混合物を３０℃に冷却し、つづいて氷上に置いた。次にサンプルをプールし、実施例８の記載のように、ビフェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２５：２４：１混合液、ｐＨ８.０）で１回、ＣＨＣｌ₃で１回抽出し、最後にエタノール沈降に付した。ＰＣＲ−増幅したＤＮＡを２０単位の制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIII（Gibco BRL）を用いて４０μｌの適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL ）中、３７℃で４時間消化し、その時間経過後、ＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動操作によりサイズ分画に付した。１. １ｋｂＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIＤＮＡフラグメントを含有するゲルの部分を削り取り、実施例８に記載したように、Sephaglas^TMBandprep Kit（Pharmacia Biote ch Ltd.）を用いてＤＮＡを回収した。予め同じ制限エンドヌクレアーゼで消化され、脱リン酸化されている、約５００ｎｇの精製した１.１ｋｂＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIＰＣＲ生成物および約５００ｎｇのプラスミドｐＫＫ２３３−２ＤＮＡ（Amann，E.およびBrosius、J.（１９８５）Gene40：183−190）を含有するライゲーション反応物を実施例１１に記載されているように作動させた。次に該ライゲーションミックスを用いてイー・コリＪＭ１０９能力細胞を形質転換させ、つづいてそれをアンピシリン（５０μ ｇ／ｍｌ）および１％（ｗ／ｖ）グルコースを補足したＬ−寒天プレート上に広げた。３７℃で１６時間増殖させて、その後、１２個のアンピシリン耐性コロニーを個々に３ｍｌのアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）および１％（ｗ／ｖ）グルコース含有の２ＹＴ培地に接種した。培養基を２５℃でさらに１６時間通気（２７５ｒｐｍ）しながら増殖させ、プラスミドＤＮＡを実施例１１に記載されるように小規模で調製した。この一部（１０μｌ）をＮｃｏｌおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動操作によりサイズ分画に付した。結果は１.１ｋｂＮＣＩＭＢ４０７００ゲノムフラグメントがすべてのケースにてうまくサブクローンされることを示唆した。イー・コリＪＭ１０９組換え培養のＨＰＬＣ分析を実施例２に示されるように行った（ブロス全体および洗浄細胞）。結果はエステラーゼ活性が保持されていた。１のクローンを確保し、ｐＲＯＸ２９と称した（図５を参照のこと）。実施例１６：プラスミドｐＲＯＸ２６の構築約５μｇのプラスミドｐＫＫ−２ＤＮＡを１０単位の制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII（Gibco BRL）を用いて適当なReact^TMBuffer中、３７℃で３時間完全に消化した。ついで該反応混合物をビフェノール：ＣＨＣｌ₃：イソアミルアルコール（２５：２４：１混合液、ｐＨ８.０）で１回、ＣＨＣｌ₃で１回抽出した。ベクターＤＮＡを最後にエタノール沈降に付し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Gibco BRL）を用い、使用説明書に従って脱リン酸化し、実施例８に記載されるようにゲル精製した。プラスミドｐＲＯＸ１２ＤＮＡ（約５μｇ）を前記した方法と同様の方法にて消化し、反応混合物を０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動操作によりサイズ分画に付した。３.０ｋbのＨｉｎｄIIIＤＮＡフラグメントを含有するゲルの部分を削り取り、前記したように、Sephaglas^TMBandprep Kit（Pharmac ia Biotech Ltd.）を用いてＤＮＡを回収した（実施例８を参照のこと）。ライゲーション反応物（約５００ｎｇの精製したｐＲＯＸ１２ＤＮＡ、約５００ｎｇの精製した脱リン酸化ｐＫＫ２３３−２ＤＮＡおよび１単位のＴ４リガーゼ；Gibco BRLを含有する１５μｌの１Ｘリガーゼ緩衝液（Gibco BRL））を１. ５ｍｌのマイクロ遠心管中で作動させた。インキュベーションを１６℃で１８時間生じさせて、その後、反応混合物を用いてイー・コリＪＭ１０９能力細胞を形質転換させた。これらをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）および１％（ｗ／ｖ９グルコース含有のＬ−寒天上に置き、３７℃で１６時間増殖させた。抗生物質耐性コロニーを個々にアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有の３ｍｌの２ＹＴ培地に植え、さらに１６時間同じ温度で培養した。ついで、ＤＮＡを小規模で調製し、２０μｌのＴＥ緩衝液に再び懸濁させた。この一部（５μｌ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Gibco BRL）で消化し、実施例８に記載されるように、０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動操作によりＤＮＡフラグメントをサイズ分画に付した。一のクローンより大きさが３.３ｋｂおよび４.３ｋｂのＤＮＡフラグメントが得られ、それはｐＲＯＸ１２ＨｉｎｄIIIフラグメントのクローニングに成功したことを意味する。これを確保し、ｐＲＯＸ２４と称する（図６を参照のこと）。約３μｇのCsCl−調製プラスミドｐＲＯＸ２４およびｐＷＯＲ９０４ＤＮＡ（国際特許公開ＷＯ９４／００５７７に引用）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Gibco BRL）を用いて適当なReact^TMBuffer（Gibco BRL）中、前の実施例に記載の方法と同様の方法により完全に消化した。各プラスミド消化物を次に０. ７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画に付した。３.３ｋｂｐＲＯＸ２４ＢａｍＨＩフラグメントおよび１０.４ｋｂｐＷＯＲ９０４ＢａｍＨＩフラグメントを含有するゲルの部分を削り取り、実施例８に記載されているように、SephaglasTMBandprep Kit（Pharmacia Biotech Ltd. ）を用いてＤＮＡを精製した。約１００ｎｇの前記した精製ＤＮＡフラグメントを含有するライゲーション反応を実施例１１に記載されているように作動させた。次に該混合物を用いてイー・コリＪＭ１０９能力細胞を形質転換させ、つづいてそれをクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）含有のＬ−寒天上に置き、３７℃で一夜インキュベーションした。この時間経過後、２４個の抗生物質耐性コロニーをクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）含有の２ｍｌのＬ−ブロスに植え付けるのに用い、３７℃ でさらに１８時間増殖させた。ついでプラスミドをSambrookら（１９８９）前掲に記載されるアルカリ性溶菌操作を用いて小規模で単離し、２０μｌのＴＥ緩衝液に再び懸濁させた。この一部（５μｌ）を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII（ Gibco BRL）で消化し、０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画した。あるクローンは大きさが１０.８ｋｂと２.９ｋｂのＤＮＡバンドを付与し、それはｐＲＯＸ２４フラグメントがクロラムフェニコール耐性マーカーに拮抗して作動するエステラーゼ構造遺伝子と共に、ｐＷＯＲ９０４にサブクローンされるのに成功したことを示す。この構築物を確保し、プラスミドｐＲＯＸ２６と称する（図７を参照のこと）。実施例１７：プラスミドｐＲＯＸ３６の構築約２μｌのCsCl−調製したｐＷＯＲ９０４ＤＮＡを５０単位の制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ（Gibco BRL）を用いて６０μｌの適当なReact^TMBuffer（Gibc o BRL）中、３７℃で４時間消化した。同様に、５μｇのCsCl−調製したｐＲＯＸ２９ＤＮＡを５０単位の制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII（Gibco BRL）を用いて同様の方法にて消化した。各反応混合物を次にビフェノール：ＣＨＣｌ₃ ：イソアミルアルコール（２５：２４：１混合液；ｐＨ８.０）で１回、ＣＨＣｌ₃で１回抽出し、エタノール沈降に付した（実施例８を参照のこと）。ついで回収したＤＮＡを、Sambrookら（１９８９）前掲に記載されるように、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Promega Ltd.、Southampton、SOl 7NS、英国）を用いて末端切断し、さらに制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Gibco BRL）で完全に消化した。反応物を０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画に付し、１０.４ｋｂｐＷＯＲ９０４フラグメントおよび１. ４ｋｂｐＲＯＸ２９フラグメントを含有するゲルの部分を削り取り、実施例８に記載されているように、ＤＮＡを精製した。約５００ｎｇの精製ｐＷＯＲ９０４およびｐＲＯＸ２９ＤＮＡを含有するライゲーション反応を実施例１１に記載されているように作動させて行った。次に該反応混合物を用いてイー・コリＪＭ１０９能力細胞を形質転換させ、つづいてそれをクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）および１％（ｗ／ｖ）グルコース含有のＬ−寒天プレート上に広げ、３７℃でさらに１６時間増殖させた。ついでプラスミドＤＮＡを実施例１１に記載されるように小規模で調製し、この一部（１０μｌ）をＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ（Gibco BRL）で消化した。得られたＤＮＡフラグメントを０.７％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、あらゆるケースにて大きさが１０.４ｋｂと１.４ｋｂのバンドが検出された。これはｐＲＯＸ２９フラグメントがクロラムフェニコール耐性マーカーに拮抗して作動するエステラーゼ構造遺伝子と共に、ｐＷＯＲ９０４にサブクローンされるのに成功したことを示す。一のクローンを確保し、ｐＲＯＸ３６と称する（図８を参照のこと）。実施例１８：プラスミドｐＲＯＸ２６とｐＲＯＸ３６のAgrobacteriumへの導入約４００ｎｇの「midi−preparation」プラスミドＤＮＡ（Sambrookら（１９８９）前掲に記載されるアルカリ性溶菌操作のスケールアップしたバージョンを用いて１０ｍｌの組換えイー・コリ培養基より予め調製）を使用して、Wen-jun ，S.およびForde，B.G．（1989）Nucleic Acids Research 17(20)：8385 に記載されているように、エレクトロー能力Agrobacterium sp.“15-10”細胞（国際特許公開ＷＯ９４／００５７７に引用）を形質転換した。発現させた後、組換え細菌をクロラムフェニコール（１０μｌ／ｍｌ）を補足したＬ−寒天上に広げ、３０℃で３日間インキュベーションした。この期間経過後、抗生物質耐性コロニーをクロラムフェニコール（１０μｌ／ｍｌ）含有のＬ−寒天上に置き、３０℃で一夜培養した。ついでプラスミドＤＮＡを、国際特許公開ＷＯ９４／００５７７に記載されているように、急速煮沸法（Rapid Boiling Method）（Holmes ，D.S．およびQuigley，M.（1981）Analytical Biochemistry 114：193）の変法を用いて小規模にて精製し、そのＤＮＡの存在および構造の両方を確認するために適当な制限エンドヌクレアーゼで消化した。実施例１９：Agrobacteriumにおけるエステラーゼ活性の測定プラスミドｐＲＯＸ２６またはプラスミドｐＲＯＸ３６のいずれかを含有する組換えAgrobacterium細胞をクロラムフェニコール（１０ｐｇ／ｍｌ）を含有するＬ−寒天上に置き、３０℃で２日間インキュベーションした。ついでループフル細胞を用いて、２５０ｍｌの円錐形フラスコ中のクロラムフェニコール（１０ μｇ／ｍｌ）含有の２０ｍｌのＡＪ３Ｂ培地に植え付けた。３０℃で２０時間通気（２７５ｒｐｍ）しながら培養させた。この時間の経過後、実施例９に記載の方法を少し修飾した方法を用いてエステラーゼ活性について培養物を検定した。今回は、培養物のサンプルまたは洗浄細胞のいずれかをリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６.５）中１０倍に希釈することにより、全ブロスまたは全細胞活性を測定した。この一部（０.２ｍｌ）をガラス製万能瓶中にて１.６ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６.５）と混合し、その内容物を水浴中で４０℃に予備加熱した。これにメチルエステル基質として５％（ｗ／ｖ）化合物Ｉを含有するＤＭＳＯ（０.２ｍｌ）を加え、４０℃でさらに１５分間インキュベーションを続けた。この期間の経過後、１ｍｌのメタノールを加えて反応を停止させた。ついで、サンプルを１.５ｍｌのEpp endorf試験管に移し、Eppendorf5415遠心機（１４０００ｒｐｍ、５分間、室温）中で回転させた。実施例９に記載されているように、上澄みを最後にＨＰＬＣで分析した。数箇所を修飾したことを除いて、上記したと同じ方法を用いて可溶性細胞抽出物のアッセイを行った。今回は、無細胞抽出物のサンプル（０.１ｍｌ）を１.５ｍｌのEppendorf試験管中で０.３５ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６.５）と混合した。メチルエステル基質として５％（ｗ／ｖ）化合物Ｉを含有するＤＭＳＯ（０.０５ｍｌ）を加えて反応を開始し、０.２５ｍｌのメタノールを添加して反応を停止させた。全体として、プラスミドｐＲＯＸ２６を含有する組換えAgrobacterium“15-10 ”細胞が、ｐＷＯＲ９０４を有するAgrobacterium“15−10”細胞と比較して７００倍のレベルのエステラーゼ活性を生成するという結果を示した。さらには、ｐＲＯＸ３６を含有するAgrobacterium“15-10”細胞は上記と比較してわずかに低い活性レベルを示した。実施例２０：エステラーゼのAgrobacteriumクローンからの精製遺伝子操作したAgrobacterium生成生物からの物質をＷＫ１０工程にプロセッシングし（実施例６を参照のこと）、ついで濃縮し、結晶学的研究（実施例２２を参照のこと）および固定研究（実施例２４を参照のこと）に用いた。この過剰生成物はエステラーゼとして細胞タンパク質の約６％を付与する。遺伝子操作されたイー・コリにより産生される物質と異なり、Agrobacteriumクローンは少なくとも２種のイソエンザイムを産生する。加えて、リーダー配列もＮＣＩＭＢ４０７００およびイー・コリクローンで観察されるのと異なる点で切断される。実施例２１：一般的酵素特性酵素を１０６５個の塩基対の遺伝子よりコードし、約２５個のアミノ酸のリーダー配列を減じたポリペプチドとして発現させる（表２を参照のこと）。これは酵素が周辺腔に輸出されたことを示唆する。このリーダー配列の切断部位は発現宿主により２ないし３個のアミノ酸で変化する。原タンパク質は約３５５００の大きさのサブユニットを有し、活性タンパク質は約７１０００の分子量を有する酵素を付与するこれら２種のサブユニットを有してなる。一のサブユニットに付き４個のシステイン残基があり、それは４個までのジスルフィド結合があり得ることを示唆するものである。これらの観察は該酵素が細胞質の外部に作用するように発達し、かなり過酷な環境に耐えるように設計されていることを示すものである。そのジスルフィド結合がサブユニットを相互に結合させているか、または各サブユニット内で架橋しているだけであるか不明である。該酵素はＤＴＴＡで阻害され、それはジスルフィド結合がコンホメーションおよび活性に臨界的であることを示唆する。酵素のカルボキシル末端から１、２または３個のアミノ酸を欠失しうることが液体クロマトグラフィー質量分析を用いて証明された（表２を参照のこと）。これにより、単離され、同じキラル選択性を有することがわかっている一連のイソ酵素が導かれる。これらの修飾は翻訳後に起こると考えられる。該酵素は等電点が平均８.９であり、相互に極めて密接に分類されるイソ酵素である。この高ｐＩ値により、パイロットプラント規模であっても約９０％の純度で酵素調製を可能とするＷＫ１０精製工程の極めて良好な選択性が説明される。ポストＷＫ１０抽出物は次の加水分解速度を示す（表３）：表３実施例２２：エステラーゼの結晶化およびｘ−線回折分析用いた操作は、CCP4 software，Daresbury laboratory(Collaborative Comput ational Project Number 4（1994）Acta CrystD50，760-763"The CCP4 Suite:Pr ograms for Protein Crystallography")を用いる、標準的な結晶化および結晶学的手法であった。結晶化実験凝集物および微量な不純物を除去するのにSuperose 12^TMのゲル濾過工程に付した後の活性タンパク質フラクションを用いる結晶化実験を最初に行った。タンパク質を１４ｍｇ／ｍｌ（Ａ２６０／Ａ２８０を用いて評価）に濃縮し、蒸気相拡散を用いて結晶化した。沈殿剤として３０−３５％硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６.５）または１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.０）のいずれかを用いて、１週間後、良質な結晶が得られた。最初に得られた結晶は、細針状のクラスターから大きな薄片までのものであった。１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.０）で成長したプレート様結晶を低温冷却しながら１.７Å分解能で回折し、ｘ-線データを９７.７％の完成度で収集した。結晶対称は、単位細胞変数ａ＝１３４.７Å、ｂ＝５５.８Å、ｃ＝１１０.３Å、α＝γ＝９０°、ｂ＝１２５°のスペース群、単斜晶系Ｃ２である。接種前記の実験より得られた結晶のフラグメントを更なる結晶化実験の種子として用いた。これで大きな結晶が得られた（異なる斜方晶形態F）。結晶をSynchrotr on放射線源に曝し、ネイティブな回折データを１.５Åの分解能で８８.１％の完成度にて収集した。該結晶は単位細胞変数がａ＝５６.７Å、ｂ＝１１５.２Å、ｃ＝１３１.５Å、α＝ｂ＝ｇ＝９０°のスペース群Ｐ2₁2₁2₁の対称性を有した。個々の結晶は非同形体であるが、結晶を数個のフラグメントに切断することにより、一の結晶の種々の破片のネイティブなデータおよび誘導データを収集することができた。構造多同形体の置換および多結晶を平均化する技法を用いて構造を解決した。酢酸ウラン（５ｍＭ）、酢酸水銀（１５ｍＭ）または塩化金（２ｍＭ）のいずれかの溶液に浸けた３次元結晶より収集したデータを用いて実験モデルの形相を得た。その構造物を全Ｒ因子＝２０.８７％およびフリーＲ因子＝２３.１０％の１.６ Å分解能にまで細かく分類した。該酵素の全体構造はαβ―ヒドロラーゼ層である。他のヒドロラーゼ酵素構造を用いて類推することで、セリン（２３３）、グルタミン酸（２５７）およびヒスチジン（３２５）で形成される触媒的三組（triad）を同定することができる。データについて研究されたすべてのヒドロラーゼ酵素は、鎖７の末端のループに触媒的三組の酸性残基を有する。本発明の酵素は鎖６の末端に酸性残基を有する。ダイマーの各サブユニットには２つのジスルフィド結合があり、Ｃｙｓ（２６１）−Ｃｙｓ（２９６）およびＣｙｓ（９８）−Ｃｙｓ（９９）の間に形成される。Ｃｙｓ（９８）とＣｙｓ（９９）の間に形成されるジスルフィド結合は、ジスルフィドを形成する隣接するシステイン残基の第２の報告例にすぎない（他のものはMethylobacterium extorquensからのメタノールデヒドロゲナーゼである）。シス配置には２つのプロリン残基がある；これらはＰｒｏ（１７９）とＰｒｏ（２１０）である。（アミノ酸残基はすべて配列番号２に従って番号を付している）。実施例２３：エステラーゼ酵素動態の修飾ＮＣＩＭＢ４０７００より直接単離した酵素を用いる初期実験は、メチルエステルが好ましい基質であり、該酵素のキラル選択性が良好である（９５：５のキラル比で９０−９５％収率）ことを示した。コード化遺伝子をイー・コリにクローニングすると、該酵素はほとんど特異的でないことが判明した。該酵素は貧キラル選択性を示し、エチルエステルに対する加水分解速度を増加させた。この違いはいくらか宿主によるが、その作用は精製方法により強化された。この運動の修飾はまた、同じ精製方法を単離体のＮＣＩＭＢ４０７００からの酵素に適用した場合にも見られた。動態の変化は、ｐＨを高くする必要のある、イオン交換クロマトグラフィー工程にも関連して認められた。加えて、該酵素をまた高レベルの硫酸アンモニウムに曝した。したがって、これらの因子のキラル選択性に対する効果を実験し、以下に示す。アッセイはＮＣＩＭＢ４０７００酵素および標準ＤＭＳＯ反応混合物を用いて行った（実施例２を参照のこと）。表５これらの結果は、高ｐＨおよび硫酸アンモニウム処理が共にエステラーゼのキラル選択性を減少させることを示した。硫酸アンモニウムの作用が最も劇的であり、透析により回復しうることは明らかである。ｐＨは不可逆的であった。硫酸アンモニウムにより惹起されるキラル選択性の減少は反応速度の増加に関連付けられ、それは９５：５のキラル割合に達するのに必要な時間よりわかる。これらの処理が酵素の３次元構造に作用しているにちがいない。 Agrobacteriumにて酵素を発現させると、キラル選択性をさらに有する酵素が得られる。加えて、醗酵および下流プロセッシングはすべて、選択性の低下を避けるためにｐＨ７.０以下に調整する。実施例２４：エステラーゼのＯＣ１０５０樹脂への固定 Agrobacterium"15-10 ｐＲＯＸ３６からの３.６リットルのＷＫ１０精製したエステラーゼ酵素（８ｍｇ／ｍｌ、０.１８ｍＭ/ｍｇ/時間エチル基質）を、セルロース透析管（分子量カットオフ１２０００−１４０００）を用いて流水に対して一夜透析した。回収された酵素の導電率を塩化ナトリウム固体を添加することで４.５ｍＳに上げた。ついで該酵素溶液を４００ｇのＯＣ１０５０樹脂（Bay erより供給される湿潤体(damp)）と一緒に攪拌し、ｐＨを１ＭＨ₂ＳＯ₄を用いて６.５に調整した。吸着は室温、２０時間で終了し、活性の９９％が摂取された。酵素−樹脂を静置し、上澄みをデカンテーションして捨てた。ついで、酵素 −樹脂を３.６リットルの蒸留水に再懸濁させることで洗浄し、デカンテーションにより回収した。酵素−樹脂を７リットルの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）含有の０.５％グルタルアルデヒドに再び懸濁させることにより、酵素と樹脂とを共有結合させた。室温で１時間攪拌させた後、該樹脂を３ｘ５リットルの蒸留水、５リットルの０.１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７.０）（３０分間）および５リットルの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）（１時間）で洗浄し、各洗浄工程の間の酵素−樹脂はデカンテーションで回収することで、過剰なグルタルアルデヒドを除去した。最後に、固定酵素（３９７ｇ）をBuchner漏斗上で真空濾過を用いて回収し、湿潤体を密閉したプラスチック製容器に貯蔵した。１．使用した酵素溶液メチル基質活性 - 5.22mM/ml/h エチル基質活性 - 0.18mM/ml/h メチル：エチル活性比 - 29:1 タンパク質 - 7.97mg/ml．２．酵素攻撃メチル活性攻撃 - 47.0mM/g/h エチル活性攻撃 - 1.62mM/g/h タンパク質攻撃 - 71.7mgタンパク質/g樹脂３．吸着後上澄みメチル基質活性 - 88,500nM/ml/hr． (98％吸着) エチル基質活性 - 2,400nM/ml/hr． (99％吸着) タンパク質 - 0.28mg/ml． (96％吸着) ４．吸着後酵素／樹脂エチル活性 - 0.87mM/g/hr．５．最終固定酵素エチル活性 - 0.58mM/g/hr．６．全体の効力吸着後発現 54.9％架橋効力 66.7％全体の固定効力 36.3％実施例２５：典型的なバッチ式生物形質転換反応器を用いるステージ１のパロキセチンエステルの分割１２０ｇの非分割のステージ１のパロキセチンエステルを乳鉢および乳棒にて予め粉砕し、ついでSilverson Laboratory Mixer-Emulsifierを用いて３０分間、７５０ｍｌの蒸留水に均質化させた。次に基質懸濁液を真空下で３０分間脱気した。その脱気した基質をサーモスタットで調整した水ジャケット式ガラス製反応容器（２リットル、４７℃）に加え、１３ｍｌの１.０ＭＮａＯＨ（Fist ons分析用グレード）の滴下をpHが８.０を越えないように注意して行いながら、懸濁液のｐＨを調整した。使用前に、２００ｇの固定したＯＣ１０５０エステラーゼ樹脂を１００ミクロのワイヤーメッシュフィルターを介して４リットルの蒸留水で洗浄し、Whatman５４フィルターで乾燥させた。１２０ｇの樹脂を秤量した。１２０ｇの樹脂を、反応器中にある２５０ｍｌの蒸留水で洗浄した、基質に添加することにより反応を開始させた。反応器の全容量は１リットルであった。反応物を攪拌（ＰＴＦＥ７６ｘ１９ｍｍ、平坦ブレード）し、ｐＨをｐＨ滴定装置を用い１.０Ｍ水酸化ナトリウムで６.５に維持した。反応を酸生成について直接的に、苛性物（caustic）を添加し、導電率を用いて間接的に反応をモニター観察した。キラル測定を操作全体を介して行い、−／＋エチルキラルエステル比が ≧９５：５となった時に反応を停止した。反応の終わりに（約２０時間）、反応器を緩やかに攪拌し、樹脂を静置し、懸濁したエステルを１００ミクロンのワイヤーメッシュフィルターを介して濾過することで、分割したパロキセチンエステルを反応器より回収した。この攪拌および濾過工程を、各１リットルの新鮮な蒸留水を反応器に添加することで４回繰り返した。３８ｇの固体（−）異性体を番号５４のWhatman濾紙で濾過することにより合した洗浄液より回収した。ついでエステルを５００ｍｌのトルエンに溶かし、番号５４のWhatman濾紙を介して濾過し、ロータリーエバポレーターで乾固させた。デシゲーター中、真空下で２４時間、生成物をシリカゲル上で乾燥させた。分割した生成物はまた、トルエンに抽出することで樹脂より直接抽出することもできる。実施例２６：酸生成物の連続的除去ならびに固定条件および支持体の選択による反応速度の向上エステラーゼの作用により得られたカルボン酸生成物が酵素触媒反応の阻害剤として働くことがわかった。この生成物は反応が進行し、酸が蓄積した場合に、反応速度を減少させる作用を有する。したがって、スラリー状反応器システムを電気透析ユニットを含有する再検討（recalculation）システムで調整し、酸を該システムより連続して除去することで速度増加が達成された。カラム形態の種々のイオン交換樹脂を用いることで同様に速度を増加させることができた。これらの方法は共に反応時間を減少させる利点を有する。加えて、固定条件および樹脂支持体を注意して選択することで、酵素の動態特性をキラル選択性、反応速度および酸阻害に関して調整することができる。実施例２４に記載されているようにＯＣ１０５０樹脂上の固定が、速度、キラル選択性および生成物阻害に対する耐性の関して最も優れた意見の一である。実施例２７：(-)トランス-3-エトキシカルボニル-4−(4'フルオロフェニル)-N- メチルピペリジン-2,6-ジオン (±)トランス-3-エトキシカルボニル-4−(4'-フルオロフェニル)-N-メチルピペリジン-2,6-ジオン（１.５１ｇ、５.１５ミリモル）のＤＭＳＯ（１００ｍｌ）中溶液をトリス緩衝液（９００ｍｌ、０.２Ｍ、ｐＨ５.５）に加える。そのｐＨを５.５に調整し、３５ｍｇの酵素を加え、反応物を２０時間攪拌した。要すれば、水性水酸化ナトリウム（０.１０５Ｍ、２５ｍｌ、２.６３ミリモル）を添加することでｐＨを調整した。反応混合物をエーテル（３ｘ３００ｍｌ）で抽出し、合した有機抽出液をトリス緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ８.５、２ｘ２５０ｍｌ）で洗浄し、トリス緩衝液抽出液をエーテル（１ｘ２００ｍｌ）で洗浄し、合した有機抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。混合物を（２０時間までに）エナンチオマー比についてアッセイした。溶液を油状物にまで蒸発させ、トルエン／ＴＨＦで置き換えた。この溶液を水素化アルミニウムリチウムで還元した。寄託菌に関連する指示（ＰＣＴ規則１３の２）Ａ．明細書第２頁１７行で引用した微生物に関する所望ページＢ．寄託物の表示別の寄託物が追加頁に示されている□ 寄託機関の名称ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）寄託機関のあて名（郵便番号および国名を含む）アバディーンスコットランドユナイテッド・キングダム寄託日受託番号１９９４年１２月１日ＮＣＩＭＢ４０７００Ｃ．追加の指示（不要の場合は空白）この情報は添付別紙に続く□ 欧州特許を求める指定国に関して、欧州特許の公報が公開されるまで、または該出願が拒絶または取り下げられるまで、寄託菌の試料を要求する人が任命した代理人に当該試料を付与することによってのみ、該試料を入手することができる。Ｄ．指示された指定国（全指定国でない場合）Ｅ．指示の別途供給（不要の場合は空白）下記指示が追って国際事務局に提出される（指示の一般的性質を記載。例「寄託物の受託番号」） □この頁は出願時に国際出願と共に受付けた（受理官庁記載欄）（認証官） □（出願人からの）国際事務局受付日（認証官）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｐ 41/00 ＨＣ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/04 1/44 1/44 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ケル，クリストファー・マーティンイギリス、シーエム19・５エイダブリュー、エセックス、ハーロウ、サード・アベニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイエンス・パーク・サウス、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．式（Ｉ）の化合物の分割能を有する微生物のスクリーニング法であって、式（Ｉ）の化合物を唯一の炭素源として用いることのできる生物を選択し、その生物の細胞を特異的エステラーゼ活性についてアッセイすることからなる方法。［式中、ＲはＣ_1-6アルキルを意味する］２．請求項１の方法を用いて同定される微生物。３．微生物ＮＣＩＭＢ40700。４．ＮＣＩＭＢ40700より得ることのできる、式（Ｉ）の化合物の分解能を有する酵素。５．ＬＣＭＳによれば見かけ分子量が３５ｋＤである請求項４記載の酵素。６．二量体の形態の請求項４または５記載の酵素。７．実質的に配列番号２に示されるアミノ酸の配列を有してなる請求項４ないし６のいずれか１つに記載の酵素。８．ＮＣＩＭＢ40700の破壊細胞をＷＫ１０イオン交換樹脂と一緒に攪拌し、酵素をｐＨ７.５でNaClで溶出し、その酵素溶液を限外濾過で濃縮し、Ａ５６８樹脂と混合し、ついでその抽出物をフェニルアガロース、Ｑ−セファロース、Ｓ −セファロースおよびブルーセファロースクロマトグラフィーに付すことからなる、請求項４ないし７のいずれか１つに記載の酵素の製法。９．請求項４ないし７のいずれか１つに記載の酵素をコードするヌクレオチド配列と全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド；または該単離されたポリヌクレオチドに相同的なヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。１０．ポリヌクレオチドが配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号１に含まれるヌクレオチド配列を有してなる請求項９記載のポリヌクレオチド。１１．ポリヌクレオチドが配列番号１のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有してなる請求項９記載のポリヌクレオチド。１２．配列番号１のポリヌクレオチドである請求項１１記載のポリヌクレオチド。１３．ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項９ないし１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。１４．請求項９ないし１３のいずれか１つに記載のＤＮＡまたはそのフラグメントと、高ストリンジェントな条件下、ハイブリッド形成するＤＮＡ。１５．適当な宿主生物にてエステラーゼ活性を有する酵素を発現するための請求項９ないし１４のいずれか１つに記載のＤＮＡを有してなるベクター。１６．請求項１５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。１７．宿主細胞がAgrobacterium種より由来する請求項１６記載の宿主細胞。１８．酵素の発現を可能とする条件下、形質転換された宿主細胞を培養し、そのタンパク質を回収することからなる、請求項１６または１７の宿主細胞にてエステラーゼ活性を有する組換え酵素を産生する方法。１９．式（Ｉ）の化合物の（＋）および（−）異性体の混合物を請求項４ないし７のいずれか１つに記載の酵素あるいは請求項２、３、１６または１７の微生物を用いて立体特異的に加水分解する方法であって、（ｉ）式（IIA）：の化合物を形成させ、その後に、得られた式（IIA）の化合物を式（Ｉ）の残りの（−）異性体から分離するか；または（ii）式（IIB）：の化合物を形成させ、その後に、得られた式（IIB）の化合物を残りの式（Ｉ）の（＋）異性体から分離することからなる方法。２０．方法の立体選択性が、式（Ｉ）の化合物のラセミ混合物を酵素と作用させると、式（Ｉ）の化合物の（−）異性体の（＋）異性体に対する割合が６０％より大きいようなものである、請求項１９の方法（ｉ）に記載の方法。２１．方法の立体選択性が、式（Ｉ）の化合物のラセミ混合物を酵素または微生物と作用させると、式（Ｉ）の化合物の（＋）異性体の（−）異性体に対する割合が６０％より大きいようなものである、請求項１９の方法（ii）に記載の方法。２２．非分割（±）の式（Ｉ）の化合物を水性／有機溶媒の混合液に溶かし、酵素または微生物を加え、その得られた混合物を反応が完了するまで攪拌することによって行われる、請求項１９ないし２１のいずれか１つに記載の方法。２３．式（Ｉ）の可変基Ｒがメチルまたはエチルである請求項１９ないし２２のいずれか１つに記載の方法。２４．微生物がAlcaligenes属に属する請求項１９ないし２３のいずれか１つに記載の方法。２５．微生物がＮＣＩＭＢ40700である請求項１９ないし２３のいずれか１つに記載の方法。２６．微生物の無細胞抽出物を用いる請求項１９ないし２５のいずれか１つに記載の方法。２７．酵素、抽出物または微生物が固定されている請求項１９ないし２６のいずれか１つに記載の方法。２８．請求項１９ないし２３のいずれか１つに記載の方法により調製した式（ IIB）の化合物を、その後、パロキセチンまたはその医薬上許容される塩および／または溶媒和物に変換する方法。２９．第１に請求項１９に記載の式（IIB）の化合物を通常のエステル化方法を用いて変換し、その後つづいてパロキセチンまたはその医薬上許容される塩および／または溶媒和物に変換することからなる、請求項２８記載の方法。３０．式（IIB）の化合物のカルボン酸基をヒドロキシメチル基に還元し、ピペリジン環の２個のケト基を還元し、その後、得られたピペリジンカルビノールをパロキセチンまたはその医薬上許容される塩および／または溶媒和物に変換することからなる、請求項２８記載の方法。３１．医薬上許容される塩がパロキセチン塩酸塩である請求項２８ないし３０のいずれか１つに記載の方法。３２．医薬上許容される塩がパロキセチン塩酸塩半水和物である請求項３１記載の方法。３３．医薬上許容される塩がパロキセチン塩酸塩無水和物である請求項３１記載の方法。３４．触媒性トライアドの酸性残基がストランド６の末端にあるαβ−ヒドロラーゼホールドを有するタンパク質。３５．ジスルフィド結合により連結される、その活性部位の近くに隣接する２個のシステイン残基を有するヒドロラーゼ酵素。