JP2000512499A - ヌクレアーゼプロテクションアッセイ - Google Patents

ヌクレアーゼプロテクションアッセイ

Info

Publication number
JP2000512499A
JP2000512499A JP10501695A JP50169598A JP2000512499A JP 2000512499 A JP2000512499 A JP 2000512499A JP 10501695 A JP10501695 A JP 10501695A JP 50169598 A JP50169598 A JP 50169598A JP 2000512499 A JP2000512499 A JP 2000512499A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
probe
acid probe
label
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP10501695A
Other languages
English (en)
Inventor
クマール，ラジャン
Original Assignee
サルノフ コーポレーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サルノフ コーポレーション filed Critical サルノフ コーポレーション
Publication of JP2000512499A publication Critical patent/JP2000512499A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、図に示すように、(A)最初のヌクレオチド配列を含む核酸プローブを固形表面領域に結合させ；(B)相補的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、該核酸プローブを核酸鋳型と接触させ、その鋳型がプローブに相補的なセグメントを含むならば、プローブ-鋳型複合体が生成し；(C)該プローブ-鋳型複合体を(1)最初のヌクレオチド配列が一本鎖である場合には、最初のヌクレオチド配列、または(2)最初のヌクレオチド配列が二重らせん状の核酸である場合には、最初のヌクレオチド配列の誤対合領域のヌクレオチド結合を選択的に切断するのに効果的なヌクレアーゼと接触させ；次いで(D)最初のヌクレオチド配列の存在を検出することにより、プローブと鋳型核酸によって形成された二重らせん核酸の存在を検出することを特徴とするヌクレアーゼプロテクションアッセイを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレアーゼプロテクションアッセイ 本特許出願は以下の関連米国特許出願：ポリヌクレオチド配列決定法、発明者 R．KumarおよびP．Heaney、代理人整理番号(Attorney Docket No.)第DSRC 12024 号；マイクロフルイディック核酸増幅法、発明者Z．LoewyおよびR．Kumar、代理 人整理番号第DSRC 12050号；ポリヌクレオチド増幅法、発明者Z．Loewy、代理人 整理番号第DSRC 12081号；自動核酸製造法、発明者D．SouthgateおよびZ．Loewy 、代理人整理番号第DSRC 12120号；パッドロックプローブ検出法、発明者R．Kum ar、代理人整理番号第DSRC12162号と同時出願されている。本特許出願は、以下 の同時係属米国特許出願：1995年11月3日に出願された出願番号60/009,517、代 理人整理番号第DSRC 11772号のアッセイシステム、；1995年11月3日に出願され た出願番号60/006,202、代理人整理番号第DSRC 11904号のマグネット；および19 96年1月24日に出願された出願番号60/010,513、代理人整理番号第DSRC 11895号 のパラレルリアクションカセットおよび関連装置に関連する。 本発明は契約番号70NANB5H1037の下、米国政府の援助を得てなされたものであ る。米国政府は本発明における一定の権利を有する。 本発明は、固体支持体から標識が遊離し、その結果ヌクレアーゼと接触する程 度を測定することにより、ヌクレアーゼプロテクションアッセイを行う方法に関 する。 ヌクレアーゼの保護は、核酸サンプルが特異的配列を含有するかどうかを決定 する、またはサンプル中の配列量を決定する感度のよい方法を提供した。このア ッセイは、まず、適切なハイブリダイゼーション条件下でサンプル核酸を核酸プ ローブと共に同時インキュベートし、次いでこの同時インキュベートした核酸を 一本鎖である核酸プローブのいずれか一部を加水分解するヌクレアーゼに曝すこ とにより行われる。サンプルが核酸プローブに相補的なポリヌクレオチド配列を 十分な量で含めば、次いで、そのプローブは相補的配列を有するヌクレアーゼか ら保護される二重らせん構造を形成することによって消化から保護される。典型 的には、該アッセイは溶液相で行い、アッセイ後の分析には適切な大きさの核酸 プローブが保護されたかどうかを確認するために用いられる電気泳動工程が必要 とされる。発明の概要 本発明は、(A)最初の核酸配列を含む核酸プローブを固形表面領域に結合させ ；(B)相補的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で 、該核酸プローブを核酸鋳型と接触させ、その鋳型がプローブに相補的であるセ グメントを含むならば、プローブ−鋳型複合体が生成し；(C)該プローブ−鋳型 複合体を(１)最初のヌクレオチド配列が一本鎖である場合には、その最初のヌク レオチド配列、または(２)最初のヌクレオチド配列が二重らせんの核酸である場 合には、最初のヌクレオチド配列の誤対合領域のヌクレオチド結合を選択的に切 断するのに効果的なヌクレアーゼと接触させ；次いで(D)最初のヌクレオチド配 列の存在を検出することにより、プローブと鋳型核酸により形成された二重らせ ん核酸の存在を検出することを特徴とするヌクレアーゼプロテクションアッセイ を提供する。ある具体例では、この結合工程は最初の接触工程に先立って起こる 。ある具体例では、この結合は固形表面領域上で核酸プローブを合成することを 特徴とする。ある具体例では、固形表面領域にプローブを結合させ、次いで、こ のプローブと鋳型ＤＮＡをハイブリダイズさせる。該固形表面領域はプラスチッ ク、ガラス、セルロースまたはセルロース誘導体、ナイロンまたは他の合成膜材 料、もしくはセラミックであることが好ましい。ある具体例では、該固形表面領 域は微粒子であり、それは常磁性であることが好ましい。定義 以下の用語は下記に示す意昧を有するものとする。 ・標識は核酸プローブから遊離可能である 可能な標識とは、そのプローブを、本発明のヌクレアーゼ接触工程後に加水分 解工程なしに洗い流すことができるか、または、核酸プローブを結合対によって 固形表面に結合させる場合には、該標識をその結合対の相互作用を損なうことな く洗い流すことができれば、その標識は核酸プローブから遊離可能である。 ・微粒子 微粒子はいずれの形であってもよいが、球形が好ましい。好ましくは、直径1m m以下であり、さらに好ましくは500ミクロン以下である。ある好ましい具体例で は、微 粒子は約0.5ミクロンないし約25ミクロン、より好ましくは約1ミクロンないし約 5ミクロン、なおさらに好ましくは約2ミクロンないし約4ミクロンの直径を有す る。微粒子は適当な材料のいずれかからなり、材料の選択はその特性によって支 配され、これには好ましくは、ポリスチレンのそれなどの最小の非特異的吸収性 が含まれる。他の具体例では、微粒子は例えば、プラスチック、ガラス、セルロ ース、セルロース誘導体、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン(" TEFLON")）、セラミックなどである。常磁性ビーズは例えば、ポリスチレンマト リックスに分散させた鉄から構成される。このようなビーズは、例えば、このよ うなビーズを生物分子に結合して市販しているDynal(Oslo，Norway)やBang Labo ratories(Carmel，IN)から入手できる。 ・最初のヌクレオチド配列のヌクレオチド結合 「最初のヌクレオチド配列のヌクレオチド結合」とは、最初のヌクレオチド配 列中のヌクレオチドの5'または3'側に対するいずれのヌクレオチド結合であって もよい。ここで、「ヌクレオチド結合」とは、本発明のアッセイで利用されるヌ クレアーゼで切断可能なホスホジエステル結合またはそれらの類似体のエステル の一方または他方である。 ・ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド 本出願の目的のためのヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドとは、自然界 で利用されているリボシド−ホスホジエステル結合を有する相補的オリゴヌクレ オチドとの塩基対合のための適当なスペーシングを有してポリマー内に配列され たプリンまたはピリミジン塩基、またはそれらの類似体である。 ・ヌクレアーゼ耐性結合 ヌクレアーゼ耐性結合とは、本アッセイに用いられる特定のヌクレアーゼによ る切断に耐性のあるヌクレオチド配列のプリンまたはピリミジン塩基、もしくは その類似体間の結合である。ある場合には、この結合は天然のヌクレオチド配列 に見られる典型的なホスホジエステル架橋を含むが、そのヌクレアーゼがリボヌ クレアーゼである場合、2'-ヒドロキシルの存在のような隣接構造のために切断 に対して耐性を有する。 ・選択的に切断する 塩基対合した二重らせん核酸が、サンプル中に核酸配列が存在するかどうかを 決定する、もしくはある場合には、サンプル中のこのような核酸配列を定量する 機能を持 つヌクレアーゼプロテクションアッセイをいかなる程度でも妨げては切断されな いならば、（二重らせん核酸の誤対号部分を含有する）ヌクレオチド配列の一本 鎖エレメントは「選択的に」切断される。図面の簡単な説明 図１は本アッセイの概略図を示す。 図２Ａおよび２Ｂはシリンダーがいかに結合核酸プローブを伴う固形表面を有 する多くのプレートから形成され得るかを図示している。詳説 本発明は、サンプル核酸が、固形表面に結合している核酸プローブとハイブリ ダイズするかどうか、また、それをヌクレアーゼから保護するかどうか試験する 方法を提供する。サンプル核酸は、この核酸と核酸プローブとを容易に区別する ために、本明細書中では「鋳型」と呼ばれている。核酸プローブがヌクレアーゼ 処理工程に先立ってそれを固形表面に結合させることを可能にするものと結合し た適切な結合対を有しているならば、ハイブリダイゼーションは固相で起こり得 る。核酸鋳型が核酸プローブを切断から保護しているならば、核酸プローブは好 ましくは固形表面と結合を維持する標識を有するが、核酸プローブが切断される ならば、標識は固体支持体から遊離する。このようにして、ヌクレアーゼ保護は 、固形表面上の蛍光標識のような標識の存在により簡単に表される。別法として 、アッセイのヌクレアーゼ保護工程の後に、保護された標識を固形表面から除去 して、溶液相にて定量した。例えば、保護核酸鋳型を、例えば熱変性を用いて除 去し、標識を別のヌクレアーゼ処理を用いて除去することができる。 本発明は、核酸増幅法の増幅生成物または生物供給源から単離した核酸溶液の ようなポリヌクレオチド混合物中のポリヌクレオチドの検出方法に関する。この 方法は、ベンチトップの実験室での研究の情況において、ならびに疾病または症 状の分析のため、あるいは犯行現場から採取した証拠の分析のための臨床上のま たは法廷のサンプルの大規模なスクリーニングの実施に用いられる。重要なこと には、この検出法は、反応チャンバーの内部および外部を自動的に流れる液体用 のマイクロフルイディッ クスに基づく装置の情況で用いることが可能であり、このことは、1996年1月24 日に出願された代理人整理番号第11895号である米国特許出願番号第60/010,513 号、題名「並行反応カセットおよび関連装置」に開示されており、この内容は出 典明示して本明細書の一部とみなされ、注目する単一または多数のポリヌクレオ チドの解析および検出のために便宜を図る他の手法の情況においても同様である 。 本発明のヌクレアーゼプロテクション法において用いるハイブリダイゼーショ ン条件は、Ausubelら，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1992年6.4単元，6-7頁から6-10頁の記載に基づいて選択するこ とが可能である。ハイブリダイゼーション条件はまた、1996年6月に最新版が出 されたAusubelら，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & So ns，New York，およびSambrookら，DNA Cloning，A Laboratory Manual，Cold S pring Harbor，1989(これらの原文はひとまとめにして“AusubelらおよびSambro okら”として引用した)に記載されている。ハイブリダイゼーション条件はまた 、Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part IおよびPart II，Elsevier ，New Yorkおよび"Molecular Biology Protocols",ウェブサイト:listeria.nwts c.noaa.gov/protocols.htmlに記載されている。 典型的には、ハイブリダイゼーション工程に先立ち、核酸鋳型を変性させて塩 基対合の相互作用に関与しないヌクレオチド配列の量を増加させる。この相互作 用は核酸プローブとのハイブリダイゼーションを低下させる。 認識されているであろうように、ハイブリダイゼーションの温度は核酸プロー ブのG/C含量、核酸プローブの長さおよびハイブリダイゼーション溶液に依存す ると考えられる。これらの温度変数についての考察は、Ausubelら，Short Proto cols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1992年，6.4単元 ，6-7頁から6-10頁およびHybridization with Nucleic Acid Probes，Part Ｉお よびPart II，Elsevier，New Yorkに見出すことができる。 リボ核酸のスクリーニングに用いるための、ヌクレアーゼ保護条件は、Ausube lら，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York， 1992，4．6-4.7単元，4-14頁から4-20頁に記載されている。ヌクレアーゼ保護に 関する別の実験手引きは、例えば、1996 Catalog，Ambion，Inc.，Austin，TX， 7-21頁;Walmsely およびPatient，“Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by Sl Nuclease Protection Assay,”Mol.Biotechnol，1:265-275 ，1994;Lauら，“Critical Assessment of the RNase Protection Assay as a M eans of Determining Exon Sizes,”Anal．Biochem，209:360-366，1993;Haines およびGillispie，“RNA Abundance Measured by a Lysate RNase Protection A ssay,”Biotechniques 12:736-741，1992;ならびにStraussおよびJacobowitz， “Quantitative Measurement of Calretinin and Beta-Actin mRNA,”Brain Res ．Mol．Brain Res，20:229-239，1993に見出すことができる。 本発明で用いられる固形表面は、例えばビーズのような粒子上にあってもよく 、化学で用いられる多くのビーズ上に見られるような、または多数のウエルを有 するプレートのウエルに見られるような気孔を含んでもよい。本明細書では分離 した固形表面が本明細書中で確認されているが、これらの分離した固形表面は、 平坦な表面上の分離した領域のようなより大きな表面の隣接した領域であっても よい。 本明細書に記載された方法の多くの応用において、多数の分離した位置のそれ ぞれで独自の核酸プローブを有する配置を有することが有用である。かかる配置 を形成する１つの方法は、Zanzucchiらにより“Liquid Distribution System,” PCT/US95/14590号，1995年11月9日に出願されたPCT出願、代理人整理番号第1140 2G-WO号に記載された液体分布系を用いて核酸プローブを製造することである。 その液体分布系は、10,000の反応ウェルのような極めて多数の分離した反応ウェ ル中で異なる合成を行うことができる。各反応ウェルでの合成は、ビーズまたは 微粒子上で起こってもよいし、もしくはウェル表面で起こってもよく、これらの 表面は適切に処理されている。このウェルは、反応試薬と多数の反応ウェルとを 往復させるために用いられる液体分布系の一部から分離可能なプレート上で形成 される。従って、この装置を用いて、各々の反応ウェル中で固形支持体に結合し た別々のオリゴヌクレオチドを合成することができる。次いでこのプレートを本 明細書に記載されたヌクレアーゼプロテクション方法にかける。このPCT/US95/1 4590号特許出願およびそれに対応する1995年11月9日に出願された米国出願第08/ 556,036号，代理人整理番号第11402号はすべて出典明示して本明細書の一部とみ なされる。 多数の異なる部位に異なる核酸プローブを有する配置を形成するもう１つの方 法は、 Affyrmax，Inc.が所有している多数の特許および特許出願に記載された写真平版 合成法を応用することである。これらには、Fodorら，“Very Large Scale Immo bilized Polymer Synthesis,”WO92/10092;Dovorら，“Method of Synthesizing Diverse Collections of Oligomers,”WO93/06121;Campbellら，“Methods for Synthesis of Phosphonates Esters,”米国特許第5,359,115号;Campbell，“Me thods for Synthesis of Phosphonate Esters,”米国特許第5,420,328号;Fodor ら，“Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis,”米国特許第5,424,1 86号;およびPirrungら，“Large Scale Photolithographic Solid Phase Synthe sis of Polypeptides and Receptor Binding Screening Thereof,”米国特許第5 ,143,854号が含まれる。 もちろん、核酸プローブを、ナイロンフィルター、ニトロセルロースフィルタ ー、ポリカーボネート、ポリスチレンまたは他のプラスチックのような適切な吸 収性のある表面上にスポットすることによって、その配置を簡単に構成すること ができる。別法として、核酸プローブが共有結合可能である反応性のある表面を 有する市販の配置上で、この配置を構成することもできる。例えば、Nunc,(Nape rville，IL)は、縮合剤として1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジ イミドのような水溶性カルボジイミドを用いて結合し得る核酸プローブに共有結 合したアミン基(CovaLink NH modules)を有する表面を持つ配置を販売している 。 核酸プローブを合成する方法は、当業者に十分に公知である。かかる方法は、 例えば、Caruthers，Science 230:281-285，1985;Itakuraら，Ann，Rev，Bioche m，53:323-356;Hunkapillarら，Nature 310:105-110，1984;および“Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligon ucleotide Derivatives，CRC Press，Boca Raton，FL，100頁などに総説されて いる。ホスホルアミダイトおよび亜リン酸トリエステルのアプローチは最も広く 用いられているが、他のアプローチとしては、ホスホジエステルアプローチ、ホ スホトリエステルアプローチおよびH-リン酸アプローチが挙げられる。 標識（すなわち、レポーター分子）をポリヌクレオチドに結合する方法もまた 当該技術分野において十分に公知である。例えば、Biosearch Products of PerS eptive Biosystems(Framingham，MA)は、ホスホルアミダイト化学に適合する5' リンカー基を市販している。これらの基の１つには、６個の炭素を有するスペー サーおよびト リフルオロアセチル(“TFAc”)で保護されている末端アミンが含まれる。TFAc保 護基は塩基標識であり、ホスホルアミダイ法によって合成されたオリゴヌクレオ チドの通常の合成後の精密検査中に除去される。この精密検査には水酸化アンモ ニウムの存在下での加水分解が含まれる。同社製のもう１つのアミン含有リンカ ーもまた６個の炭素を有するスペーサー基を有し、メトキシトリチル(“MMT”) 基で保護されたアミンを有している。MMT基は酸標識であり、別途脱保護工程が 必要である。これらのアミンリンカーの双方を用いて、ビオチンまたはフルオレ セインのような分子に結合させることができる。また、これらのアミンスペーサ ー基を用いて、縮合反応を通じてアミン基を用いてアミドを形成するのに用いる ことのできる遊離酸を有する他の分子に結合させることもできる。Biosearch Pr oducts製のもう１つのリンカーは、トリチル基によって保護されたチオール基を 有する６個の炭素のスペーサーを有する。トリチル保護基は、硝酸銀およびジチ オスレイトールを用いて処理することによって除去される。このリンカーを用い てマレイミドを組み込む酵素および分子に結合させることができる。複数の標識 を結合させる方法には、多くのアミノまたはチオール基のような多くの反応性部 位を有するポリマーを結合させることが含まれ、この反応性部位を用いて標識を 結合させることができる。標識法は、SinhaおよびStriepeke，“Oligonucleotid es with Reporter Groups Attached to the 5'Terminus”Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Eckstein編，IRL，Oxford，1991,185頁など; SinhaおよびCook，“The Preparation and Application of Functionalized Syn thetic Oligonucleotides;3．Use of H-Phospate Derivatives of Protected Am ino-Hexanol and Mercapto-Propanol or Mercapto-Hexanol,”Nucleic Acids Re search，1988，第16巻，2659頁など;Haugland，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，inc.,Eugene ,OR，1992，20頁など;Theisenら，“Fluorescent Dye Phosphoramidite Labelli ng of Oligonucleotides,”Tetrahedron Letters，1992，第33巻，3036頁など;R osenthalおよびJones，“Genomic Walking and Sequencing by Oligocassette M ediated Polymerase Chain Reaction,”Nucleic Acids Research，1990，第18巻 ，3095頁など;Smithら，“The Synthesis of Oligonucleotides containing an Aliphatic Amino Group at the 5'Terminus−Synthesis of Fluorescent DNA Primers for Use in DNA-Sequence Analysis,”Nucleic Acids Research，1985，第13巻，2399頁などに記載されている。 もちろん、核酸プローブを標識するさらに一般的な方法の１つは、典型的には ヌクレオチドと結合するホスホジエステル結合中に32Pを導入することか、また はあるヌクレオチドのある塩基に3Hまたは13Cを導入することである。別の標識 戦略として、同一であると証明できる核磁気共鳴または電子スピン共鳴シグナル のような他の物理化学的な性質という有利な点を利用することができる。 核酸プローブ中の標識は、固形表面に結合していないプローブの末端付近に位 置していることが好ましい。この助けにより、アッセイのヌクレアーゼ保護過程 の際に核酸プローブのいずれかの部分が切断され、固形表面を適切に洗浄した後 に標識が固形支持体から分離するということが確実になる。しかしながら、標識 の位置は、ヌクレアーゼプロテクションアッセイの間に切断されるその最初のヌ クレオチド配列のいずれかの部分であるはずの固形支持体との結合から再現性よ く除去できると考えられる場所であればよい。特定の核酸プローブにより、標識 を支持体から分離するために単独では効果がない切断を核酸鋳型を用いた二重ら せん形成を十分に脱安定化させ、その結果、ヌクレアーゼによるさらなる切断が 起こり、それによって支持体から標識が分離するならば、この標識位置を調節す ることが可能である。 例えばサンプルのマイクロリットル当たりに約100コピー未満の標的核酸が存 在すれ場合には、適切な標識はノイズ率を超えて十分なシグナルを提供する。こ のような適切な標識には、放射性同位元素、蛍光染料、またはシグナル発生酵素 や本アッセイの検出工程中、検出可能な部分との結合に使用できる結合対のメン バーが含まれる。適切な放射性同位元素としては、限定されるものではないが、3 H、14Cおよび32Pが挙げられる。適切な蛍光染料としては、限定されるものでは ないが、フルオレセイン、ローダミン、7-アミノ-4-メチルクマリン、塩化ダン シル、Cy3、Hoechst 33258、R-フィコエリスリン、クゥオンタム・レッド(Quant um Red)TM、テキサス・レッド(Texas Red)、それらの適切な類似体および誘導体 などが挙げられる。適切なシグナル発生酵素としては、限定されるものではない が、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼが挙げられ る。前記した標識のいずれもが、Sigma Chemical Co.("Sigma，"St．Louis，MO) からなど、商業的に入手できる。 典型的には、該核酸プローブは5'または3'末端のいずれかで固形表面に結合す るが、多くの場合3'末端で結合する。5'および3'末端、特に固形表面と結合する 末端にあるヌクレオチドは、適当な保護鋳型核酸が核酸プローブと塩基対合する 場合でさえ、ヌクレアーゼ消化に対して最も敏感であるという傾向があろう。従 って、本発明の多くの具体例において、これらのターミナルヌクレオチドは前記 したようなヌクレアーゼ耐性結合によって共に連結されている。前記したように 、それは核酸プローブ中の最初のヌクレオチド配列であり、その配列は、核酸鋳 型とのハイ・フィディリティ・ハイブリダイゼーション(high fidelity hybridi zation)に関して評価される、核酸プローブの全ヌクレオチド配列の一部のみで あってもよい。このようにいくつかの具体例では、最初のヌクレオチド配列はそ の5'または3'末端でヌクレアーゼ耐性結合によって結合されたヌクレオチドまた はポリヌクレオチドに連結されている。最初のヌクレオチド配列のヌクレオチド 間のアッセイに良好なハイブリダイゼーションと不十分なハイブリダイゼーショ ンを識別するのに必要十分な切断部位がこの核酸プローブ中に存在していること を保証するために、この結合の大部分は適切なヌクレアーゼ（すなわち、本アッ セイに用いられるヌクレアーゼ）に反応性を持つ。 さらに本アッセイは、核酸プローブが核酸鋳型とハイブリダイズして核酸プロ ーブが固形表面に結合された後、適切な洗浄液で固形表面を洗浄し、それにより ハイブリダイズしなかった核酸鋳型を除去することを特徴とする。このような洗 浄液はAusubelら、およびSambrokらに示され、典型的にはトリスまたはリン酸な ど中性付近のpHに維持するための緩衝液、EDTAなどのキレート化剤、約0.15M Na Clなどの塩、およびドデシル硫酸ナトリウム("SDS")などの洗剤が含まれる。 ヌクレアーゼ処理後は多くの場合、それ以上固形表面とのハイブリダイゼーシ ョンを維持する必要はないので、固体保養面を十分に洗浄できることに注目され たい。しかしながら、このような洗浄に先立ってヌクレアーゼを不活性化させる ことが重要である。Slヌクレアーゼについては、例えば、エチレンジアミンテト ラ酢酸("EDTA")やｔＲＮＡなどの過剰なＲＮＡを用いてヌクレアーゼの活性を停 止させることができる。リボヌクレアーゼAについては、例えば、SDSなどの変性 洗剤やプロテイナーゼKなどの変性耐性プロテナーゼを適用してこのヌクレアー ゼ活性を停止させることができる。他のヌクレアーゼについては他の停止手段が 当該技術分野で公知である。ま た、核酸プローブが結合対を介して結合している場合には、洗浄条件はその結合 対の相互作用を保存するものでなければならない。 多くの場合、核酸鋳型断片としては、よりハイブリダイズしやすいより短い断 片を作出することが望ましい。このような断片化は、例えば、シアリングによっ て、またはＤＮＡの場合には、平均して所望のサイズの断片を生成する特異性を 有する制限酵素処理によって行うことができる。 本発明で使用するための適切なヌクレアーゼの例としては、先に列挙されてい る。しかしながら、エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を補足するためには 、一般にエクソヌクレアーゼVIIなどのエクソヌクレアーゼが用いられる。エク ソヌクレアーゼを単独で用いるならば、バリデーション実験を行って、完全にハ イブリダイズしなかったヌクレオチド配列を十分除去されることを確認すべきで ある。ヌクレアーゼの供給者としては、緑豆ヌクレアーゼ、ミクロコッカスヌク レアーゼ、ヌクレアーゼP1、S1ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼAおよびリボヌ クレアーゼT1についてはSigma Chemical Co.(St．Louis，MO)、エキソヌクレア ーゼVII、緑豆ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼT1およびS1ヌクレアーゼについ てはBRL GIBCO(Grand Island，NY)、緑豆ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼBAL 31お よびS1ヌクレアーゼについてはPromega Corp.(Madison，WI)、またミクロコッカ スヌクレアーゼについてはWorthington Biochemical Corp.(Freehold，NJ)があ る。 本発明のアッセイはサンプル中に核酸配列が存在するかどうかを調べるために 有用なばかりでなく、このような配列の存在量を表すためにも有用であることが 理解されるべきである。いくつかの異なる固形表面を用いての滴定アッセイと、 注目する核酸の既知量を用いての「標準」曲線を用いて、サンプル中に存在する 注目の核酸の量をより慎重に定量することができる。 現在十分に公知の方法工程を特に挙げずに、本明細書に方法論が引用される場 合、さらなる詳細については、一般に、以下の文献：Ausubelら，Short Protoco ls in Molecular Biology，Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biolo gy，Sambrookら，DNA Cloning，A Laboratory Manual、および"Molecular Biolo gy Protocols"web-site:listeria.nwfsc.noaa.gov/protocols.html.を参照する ことができる。 本発明のある具体例では、核酸プローブの配列または核酸プローブの並びは、 特定 の組織で発現されるｍＲＮＡのｃＤＮＡ断片である発現配列タグ("EST")から誘 導される。 本発明と併用する検出は、この標識の性質に依存するであろう。比色または蛍 光標識を用いる場合、目視検査またはオリンパス(Olympus，Lake Success，NY) 製蛍光顕微鏡、BIoTek Instruments(Winooski，VT)製プレート・リーダー装置(P late Reader device)およびPrinceton Instruments(Princeton，NJ)製CCD(charg e-coupled device)カメラが用いられる。放射性同位元素を用いる場合、検出に はPhosohor Imager device(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)のような空間 感受性検出装置を含んでもよいし、もしくはガンマカウンターや液体シンチレー ションカウンターのような検出器において個々の固形表面を別々に検出してもよ い。 本発明では結合対が２つの方法で使用される。第一には、それらは、本アッセ イのハイブリダイゼーション工程の前または後のいずれかに、核酸プローブを固 形表面に結合させるの用いられる。第二には、それらを、本アッセイのヌクレア ーゼ接触工程後に、検出可能な部分を結合させることによって、核酸プローブ標 識として働かせることができる。基本型の結合対アビジン−ビオチンであり、こ の二者の存在が極めて高い親和性と結びついている。結合対の一方のメンバーは 核酸プローブに結合させることができ、他方は固形表面または検出可能な部分の いずれかに結合させることができる。この結合は典型的には共有結合である。抗 体-抗原結合対はいずれも適切なものであり、これはこの対が本検出法を通じて 結合を保持すると考えられる２つの成分間の十分な親和性を示すことを意味する ものである。このような抗体-抗原の組み合わせとしては、限定されるものでは ないが、抗原がヘプタン、レクチン、免疫グロブリンまたは、それに対して十分 な結合抗体が存在する、もしくは生成し得るいずれの抗原性物質であるような組 み合わせが挙げられる。このような組み合わせには、Sigma Chemical Company(S t．Louis，MO)から市販されているものが含まれる。 本発明のアッセイは、Southgateら,"Parallel Reaction Cassete and Associa ted Devices"、1996年1月24日に出願された米国特許出願第60/101,513号，代理 人整理番号第11895号に記載されているような密閉反応装置で行うことができる 。さらに、本発明では、ポンプ、バルブ、貯蔵装置、温度制御装置および本出願 で記載した検出装置を有効に使用することができる。このSouthgateらの出願は その全てにおいて出典 明示して本開示の一部とみなされる。 本発明の装置の温度制御装置は、典型的には、約4℃ないし100℃まで、好まし くは約20℃ないし約65℃までの温度を維持することができる。回転装置は、典型 的には、電子モーター、好ましくは回転速度が電子制御器によって厳密に制御す ることができるステッパーモーターによって駆動される機械装置である。回転を 伴うシリンダーの使用により反応容量を最少にすることができる。 本発明の一連の具体例において、全ての結合組み合わせを用いることが好まし いことに注目されたい。そうでなければ、いくつかの塩基を、この組み合わせの サブセットを用いるか、またはアデノシン、チミジン、グアノシンまたはシトシ ンよりもより広い塩基対合特異性を有するイノシンなどの代わりの塩基で置換す る。サブセットは依然として実質的に完全な、またはある場合には完全な配列情 報をもたらすであろう。 統計学的解析を用いて、問題の核酸セグメントの部分的または完全な配列決定 を可能にする十分に特徴的な重複を有効な確率で生成するのに必要な最初のヌク レオチド配列の数を求めることができる。あらゆる組み合わせを用いることによ り、重複量が確認され得ることに注目されたい。この配列決定法は絶対反復配列 の配列の領域を決定することが困難であるが、このような困難な点に遭遇した場 合には、サンプルポリヌクレオチド長のような他の情報を確認すべきである。い くつかの具体例では、より低いハイブリダイゼーション融解温度を有する最初の ヌクレオチド配列がその配列から排除される。 図１では、24ｘ8の固形表面の並びを図示し、併せて必要な工程および得られ た結果を表示する。 図２Ａでは、そこへ結合した核酸プローブを伴う10,000個の固形表面を各々有 する12枚のプレートのコレクションを図示する。図２Ｂは、これらのプレートを 6枚をシリンダー状に連結したものを示し、好都合なことに、これを本発明に必 要な種々の溶液を通じて回転させることができる。 本発明の最初に注記されたように、ここで示されたアッセイが好適に使用され る１つの情況が、特に液体チャンバーの種々のソートに接続する液体交換チャン ネルを通じて少容量の液体を流すために設計されているマイクロフルイディック ス装置にあることが考慮される。特に、このような装置は、液体の試薬または反 応物の貯蔵のた めに設計されたチャンバー、すなわち供給チャンバー、反応を受ける反応物を入 れるために設計されたチャンバー、すなわち反応チャンバー、液体の容量を測定 するために設計されたチャンバー、すなわち測定チャンバーなどを総称すること ろの液体チャンバーを有してなる。さらに詳しくは、本発明の装置は、例えば、 核酸をハイブリダイズさせ、次いで、ハイブリダイゼーション後に残存するいず れの一本鎖核酸をもヌクレアーゼで消化するために適当な試薬が使用される、反 応チャンバーを含む。該反応チャンバーは、全て液体チャンバーである場合、適 切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、セラミックまたはそれらの組み合わ せなどのいずれかを含み、反応チャンバーの内部および外部の通過物質用の少な くとも２つの液体交換チャンネルに接続されている。この反応チャンバーは約2 ℃以内の一定温度で維持することが好ましく、ここでの温度は約20℃と65℃の間 であることが好ましく、そうでなければ、そこで行われる反応の必要条件に従う ような温度に調整できることが好ましい。また、反応チャンバーは前記した検出 方法を行う部位にあってもよい。本発明の方法がマイクロフルイディックス装置 に関連して使用される場合、記載の方法の固形表面は微粒子であることが好まし く、常磁性微粒子であることがより好ましい。 以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、もちろん、その範囲を 限定するものではない。実施例１ 溶液ハイブリダイゼーション、表面結合、およびヌクレアーゼ保護 以下のオリゴヌクレオチド： を利用した。ポリスチレン製96ウェルプレートのウェルを、室温で一晩ウェル中 で100μｇ/mlのストレプトアビジンをインキュベートすることにより、ストレプ トアビジン(Sigma Biochemicals，St．Louis，MO)で被覆した。ストレプトアビ ジン溶液を除去した後、室温で4時間、50μｍの1％ウシ血清アルブミンの下でそ れらをインキュベートすることにより、ウェル表面をブロッキングした。ハイブ リダイゼーション反応は、125μｌの5X SSPE、1％ SDS[5X SSPE:0.9mM NaCl、50 mM NaH2PO4、pH7,4、50mM ED TA]中にmアクチン-1およびmアクチン-2の双方0.1nmol、またはmアクチン-1単独0 .1nmolのいずれかを反応させることにより行った。このハイブリダイゼーション 反応混合物を65℃にて5分間加熱し、次いで37℃にて2時間インキュベートした。 ハイブリダイゼーション後、反応混合物を96ウェルプレート上のウェルに移し、 室温で10分間インキュベートした。次いで、このウェルを吸引し、100mMトリス 、pH7.5、150mM NaClで２回洗浄した。50μｌの30mM酢酸ナトリウム、pH5、50mM NaClおよび1mM ZnSO4を各ウェルに加え、以下の表に示したように緑豆ヌクレ アーゼ(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)を加え、反応混合物を37℃に て1時間インキュベートした。フルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドの 存在を、2,2-アジノ-ジ-[3-硫酸エチルチアゾリン("ABTS")]基質(Boehringer Ma nnheim，Indianapolis，IN)を用いて作製したフルオレイン-ペルオキシダーゼ複 合体で検出した。 実施例２ 溶液ハイブリダイゼーション、表面結合、およびヌクレアーゼ保護 ヌクレアーゼがS1ヌクレアーゼ(Promega，Madison，WI)であり、ヌクレアーゼ 消化工程で用いる緩衝液が30mM酢酸ナトリウム、pH4.5、50mM硫酸亜鉛、5%グリ セロールであったこと以外は実施例１の方法を繰り返し、室温にて30分間ヌクレ アーゼ消化を行った。 本発明は好ましい具体例に重点を置いて説明したが、本発明が本明細書に特に 記載された以外にも実施され得ることを意図したものであることが当業者に明ら かであろう。従って、本発明は、以下の請求の範囲によって定義される本発明の 精神および範囲内に包含されるあらゆる変形を含むものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. (A)最初のヌクレオチド配列を含む核酸プローブを固形表面領域に接触さ せ； (B)相補的ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で 、核酸プローブを核酸鋳型に接触させ、その鋳型がプローブに相補的なセグメン トを含むならば、プローブ-鋳型複合体が形成され; (C)このプローブ-鋳型複合体を、(１)最初のヌクレオチド配列が一本鎖である 場合には、最初のヌクレオチド配列、または(２)最初のヌクレオチド配列が二重 らせんである場合には、最初のヌクレオチド配列の誤対合領域のヌクレオチド結 合を選択的に切断するのに効果的なヌクレアーゼに接触させ；次いで (D)最初のヌクレオチド配列の存在を検出することにより、プローブと鋳型核 酸によって形成された二重らせん核酸の存在を検出する ことを含んでなる、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ。 2.結合工程が最初の接触工程に先立って起こる請求項１記載のアッセイ。 3.プローブを固形表面領域の配列に接触させて、続いてプローブと鋳型ＤＮＡ をハイブリダイズさせる請求項１記載のアッセイ。 4.核酸プローブが、ヌクレオチド内結合が該ヌクレアーゼに対して耐性を有す るか、または核酸プローブが該ヌクレアーゼに耐性を有する結合によって固形表 面領域に結合されている１以上のジヌクレオチドを含む請求項１記載のアッセイ 。 5.核酸プローブが、最初のヌクレオチド配列のいずれのヌクレオチド結合が切 断される場合でも、核酸プローブから遊離可能である標識を含む請求項１記載の アッセイ。 6.核酸プローブが結合対のメンバーを含む請求項１記載のアッセイ。 7.第一の固形表面領域に第一の核酸プローブを結合させ、次いで第二の別の表 面に第二の核酸プローブを結合させ、第一および第二の表面が双方ともアッセイ 工程を通じて処理され、第一の核酸プローブおよび第二の核酸プローブが双方と も同じであるか、または異なってもよい標識を含み、その最初のヌクレオチド配 列のいずれのヌクレオチド結合が切断される場合でも、各標識がその核酸プロー ブから遊離可能であり、第一の核酸プローブと結合した標識の量が第二の標識に 結合した量とは異なり、しか も、その標識量がそれぞれ第一または第二の核酸プローブに結合する鋳型ポリヌ クレオチドの期待頻度のおよその逆比である請求項１記載のアッセイ。 8.発現したｍＲＮＡの同定または定量に使用される請求項１記載のアッセイで あって、該核酸プローブがその3'末端にポリTセグメントを有し、かつ最初のポ リヌクレオチド配列がポリTセグメントとは異なる少なくとも約10個のヌクレオ チドを含み、ポリT含有核酸プローブがｍＲＮＡに相補的であるアッセイ。 9.液体充填容積を有するチャンバーと、１以上の核酸プローブをシリンダーの 内表および外表に結合させて、シリンダーの各々の回転によってシリンダーの全 てのプローブ結合表面が液体充填容積と交わるようにした部材からなるシリンダ ーを回転させるための回転装置と、ある温度でチャンバーを維持するための温度 制御装置とを有してなるヌクレアーゼプロテクションアッセイを行う装置。 10.サンプルポリヌクレオチドの配列決定法であって、 (A)既知のヌクレオチド配列の各々が、各々最初のヌクレオチド配列を含み、 その配置中の別々の識別可能な固形表面領域に各々固定化されている、多数の異 なる核酸プローブを有する配置を作製し、各々の固定化核酸プローブが核酸プロ ーブに結合した標識を有してなり、その標識が、結合した核酸プローブのポリヌ クレオチド配列のいずれのヌクレオチド結合が切断される場合でも、核酸プロー ブから遊離可能であり； (B)相補的核酸間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、この配置と サン；プルポリヌクレオチドまたはその断片に接触させ； (C)該配置の固形表面領域を(１)最初のポリヌクレオチド配列が一本鎖である 場には、最初のポリヌクレオチド配列、または(２)このような最初のポリヌクレ オチド配列が二重らせん状の核酸である場合には、最初のポリヌクレオチドの誤 対合領域のヌクレオチド結合を選択的に切断するのに効果的なヌクレアーゼと接 触させ； (D)固形表面領域から遊離した標識を除去し；次いで (E)固形表面領域に残存するいずれの標識をも検出し、標識が検出される固形 表面領域に固定化された核酸プローブを同定する ことを含んでなる、該方法。 11.さらに、 (F)相補的な最初のポリヌクレオチド配列の固形表面領域での標識の検出の結 果として保護が生じる、ヌクレアーゼ消化からのそれらの保護によって同定され たサンプルポリヌクレオチドの部分配列を作出し；次いで (G)作出された部分配列間の配列重複を同定することによって検出された配列 を整列する ことを含んでなる、請求項１０記載の方法。 12.最初のヌクレオチド配列が８量体であり、かつ、配置が65,536個の可能性 あるかかる配列の各々に対する最初のポリヌクレオチド配列を含むか、または共 に65,536個の可能性あるかかる配列の各々に対する最初のポリヌクレオチド配列 を含む複数の配置が処理される請求項１０記載の方法。
JP10501695A 1996-06-14 1997-06-16 ヌクレアーゼプロテクションアッセイ Pending JP2000512499A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/665,104 1996-06-14
US08/665,104 US5770370A (en) 1996-06-14 1996-06-14 Nuclease protection assays
PCT/US1997/009800 WO1997047640A1 (en) 1996-06-14 1997-06-16 Nuclease protection assays

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2000512499A true JP2000512499A (ja) 2000-09-26

Family

ID=24668724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10501695A Pending JP2000512499A (ja) 1996-06-14 1997-06-16 ヌクレアーゼプロテクションアッセイ

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5770370A (ja)
EP (1) EP0918786A4 (ja)
JP (1) JP2000512499A (ja)
AU (1) AU735583B2 (ja)
CA (1) CA2258745A1 (ja)
IL (1) IL127562A0 (ja)
WO (1) WO1997047640A1 (ja)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4663824B2 (ja) * 1996-12-31 2011-04-06 ハイ スループット ジェノミクス インコーポレイテッド 多重化分子分析装置および方法
AU2007231625B2 (en) * 1997-12-19 2011-04-07 Stephen Felder High Throughput Assay System
WO2000037684A1 (en) * 1998-12-22 2000-06-29 Kris Richard M High throughput assay system using mass spectrometry
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
US6458533B1 (en) 1997-12-19 2002-10-01 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system for monitoring ESTs
US6238869B1 (en) * 1997-12-19 2001-05-29 High Throughput Genomics, Inc. High throughput assay system
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US6232066B1 (en) 1997-12-19 2001-05-15 Neogen, Inc. High throughput assay system
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
JP2002517981A (ja) * 1998-01-13 2002-06-25 ビオヒプ テヒノロギース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸配列を検出するための方法
DE19824900B4 (de) * 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6908770B1 (en) 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
US6326149B1 (en) * 1998-11-03 2001-12-04 Sarnoff Corporation Method for controlled electrostatic adherent deposition of particles on a substrate
US20030092012A1 (en) * 2001-11-09 2003-05-15 Ahmed Chenna Methods for detecting a plurality of analytes by chromatography
US6589779B1 (en) * 1999-07-16 2003-07-08 Board Of Regents, The University Of Texas System General signaling protocol for chemical receptors in immobilized matrices
ATE542916T1 (de) 1999-08-18 2012-02-15 Illumina Inc Methoden zur erzeugung von oligonukleotidlösungen
WO2001055701A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Board Of Regents, The University Of Texas System System and method for the analysis of bodily fluids
FR2805826B1 (fr) * 2000-03-01 2002-09-20 Nucleica Nouvelles puces a adn
AU2001285219A1 (en) * 2000-08-24 2002-03-04 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization
US6900013B1 (en) 2000-08-25 2005-05-31 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
US20040058385A1 (en) * 2000-11-17 2004-03-25 Abel Andreas Peter Kit and method for determining multiple analytes, with provisions for refrencing the density of immobilised recognition elements
US7604807B2 (en) * 2000-12-01 2009-10-20 Auburn University Use of pullulan to isolate and preserve biological material
AU2002241550A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Auburn University Use of acacia gum (arabic gum) to isolate and preserve biological material
WO2002061392A2 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the confinement of materials in a micromachined chemical sensor array
US20020160363A1 (en) * 2001-01-31 2002-10-31 Mcdevitt John T. Magnetic-based placement and retention of sensor elements in a sensor array
US20030003436A1 (en) * 2001-02-05 2003-01-02 Willson C. Grant Use of mesoscale self-assembly and recognition to effect delivery of sensing reagent for arrayed sensors
DE10109779A1 (de) * 2001-03-01 2002-09-19 Infineon Technologies Ag Vorrichtung und Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren
KR100436554B1 (ko) * 2001-04-17 2004-06-18 삼성전자주식회사 혼성화된 핵산의 검출감도를 증가시키는 방법
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
KR20030049802A (ko) * 2001-12-17 2003-06-25 권윤정 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법
GB0205455D0 (en) * 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
AU2003228711C1 (en) 2002-04-26 2010-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the detection of cardiac risk factors
US20040018495A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Xing-Xiang Li Microparticle based signal amplification for the detection of analytes
WO2004009840A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Capture and detection of microbes by membrane methods
WO2004011606A2 (en) * 2002-07-26 2004-02-05 Alfa Wasserman, Inc. Macromolecular protection assay
US20050064452A1 (en) * 2003-04-25 2005-03-24 Schmid Matthew J. System and method for the detection of analytes
US9317922B2 (en) 2003-05-16 2016-04-19 Board Of Regents The University Of Texas System Image and part recognition technology
WO2004104922A2 (en) * 2003-05-16 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Image and part recognition technology
US20040265883A1 (en) * 2003-06-27 2004-12-30 Biocept, Inc. mRNA expression analysis
JP4342890B2 (ja) * 2003-09-30 2009-10-14 富士フイルム株式会社 ミスマッチ結合ポリヌクレオチドの除去方法
US7651868B2 (en) * 2003-12-11 2010-01-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method and system for the analysis of saliva using a sensor array
US20060257854A1 (en) * 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Membrane assay system including preloaded particles
US20060257941A1 (en) * 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle and membrane sensor elements
US7781226B2 (en) * 2004-02-27 2010-08-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Particle on membrane assay system
US8105849B2 (en) 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
US20060257991A1 (en) * 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle-based sensor elements and membrane-based sensor elements
US7985541B2 (en) 2004-03-24 2011-07-26 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Quantitative assay for detection of newly synthesized RNA in a cell-free system and identification of RNA synthesis inhibitors
JP2005283304A (ja) * 2004-03-29 2005-10-13 Lintec Corp プローブアレイ
US20060008823A1 (en) * 2004-05-12 2006-01-12 Kemp Jennifer T DNA profiling and SNP detection utilizing microarrays
US8377398B2 (en) 2005-05-31 2013-02-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts
AU2006261953B2 (en) * 2005-06-24 2012-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods including self-contained cartridges with detection systems and fluid delivery systems
US20080076121A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Paul Kenneth Wolber Microarray nuclease protection assay
JP2012500993A (ja) * 2008-08-25 2012-01-12 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 潰瘍性大腸炎及び関連した疾患における抗ｔｎｆ処置のためのバイオマーカー
RU2476597C2 (ru) * 2009-06-16 2013-02-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) Способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты
US8236574B2 (en) * 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
AU2012330817A1 (en) 2011-11-04 2014-05-22 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
WO2013104990A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
CN104220876A (zh) 2012-02-21 2014-12-17 奥斯陆大学医院 用于宫颈癌的检测和预后的方法和生物标志物
IN2014DN08312A (ja) 2012-03-06 2015-05-15 Univ Oslo Hf
US9315807B1 (en) 2013-01-26 2016-04-19 New England Biolabs, Inc. Genome selection and conversion method
US9708658B2 (en) 2013-03-19 2017-07-18 New England Biolabs, Inc. Enrichment of target sequences
US10087481B2 (en) 2013-03-19 2018-10-02 New England Biolabs, Inc. Enrichment of target sequences
WO2018127786A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for determining a treatment course of action
EP3929306A1 (en) * 2017-01-26 2021-12-29 QIAGEN GmbH Method for enriching template nucleic acids
WO2023021330A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 University Of Oslo Compositions and methods for determining a treatment course of action

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4946773A (en) * 1985-12-23 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Detection of base pair mismatches using RNAase A
US5525464A (en) * 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5424186A (en) * 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5380662A (en) * 1990-06-01 1995-01-10 Robbins Scientific Corporation Hybridization incubator with rotisserie mechanism
JPH06504997A (ja) * 1990-12-06 1994-06-09 アフィメトリックス，　インコーポレイテッド 非常に大きい規模の固定化されたポリマーの合成
ATE148889T1 (de) * 1991-09-18 1997-02-15 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5359115A (en) * 1992-03-26 1994-10-25 Affymax Technologies, N.V. Methods for the synthesis of phosphonate esters
AU3919293A (en) * 1992-03-27 1993-11-08 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
US5420328A (en) * 1992-09-11 1995-05-30 Affymax Technologies, N.V. Methods for the synthesis of phosphonate esters
SE9500341D0 (sv) * 1995-01-30 1995-01-30 Ulf Landegren Method for detecting DNA sequence variations
DE69605803T2 (de) * 1995-05-11 2000-07-20 Ulf Landegren Nachweis von fehlpaarungen durch spaltung mit resolvase auf einem festträger
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods

Also Published As

Publication number Publication date
AU3232097A (en) 1998-01-07
EP0918786A1 (en) 1999-06-02
CA2258745A1 (en) 1997-12-18
IL127562A0 (en) 1999-10-28
US5770370A (en) 1998-06-23
AU735583B2 (en) 2001-07-12
EP0918786A4 (en) 2002-03-20
WO1997047640A1 (en) 1997-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2000512499A (ja) ヌクレアーゼプロテクションアッセイ
US5912124A (en) Padlock probe detection
JP2742905B2 (ja) 核酸配列の検出方法
KR100245284B1 (ko) 이중 d-루프 형성의 진단학적 응용
EP1488000B1 (en) Signal amplification by hybrid capture
US20030082607A1 (en) Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
JP2000512498A (ja) ポリヌクレオチドのシークエンス法
JP2002525125A (ja) 核酸増幅および配列決定の方法
AU782408B2 (en) Multiple tag analysis
CN102625838A (zh) 用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒
JPH0630637B2 (ja) 分離による核酸検出法
JP2005521411A (ja) Ｄｎａ−結合タンパク質の検出法
EP1606415A1 (en) Lab-on-chip system for analyzing nucleic acid
JP2003516166A (ja) ハイブリダイゼーション反応のための標準化コントロール及び二重鎖プローブ
US6620586B2 (en) Methods and compositions for analyzing nucleic acids
WO2002079488A2 (en) Oligonucleotide microchips to detect protein-nucleic acid interactions
EP1649060B1 (en) Mrna expression analysis
JPH0646899A (ja) 核酸結合因子の検出のための迅速な検定
JP2001522588A (ja) 特異的ヌクレオチド配列を検出するための方法および組成物
JP2004069489A (ja) プローブ担体及びその製造方法
JP2006262797A (ja) キャピラリアレイを用いて遺伝子発現を検出する方法