JP2000502990A - 可溶化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的活性物質、例えば、タンパク質を疎水性溶媒に溶解するための改良された方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶化方法 本発明は、活性物質、例えば、生物学的活性材料を両親媒性物質(amphiphile) に溶解する方法に関するものである。特に、本発明は、局所投与に使用される生 物学的活性物質を浸透助剤と組み合わせる方法に関する。 種々の溶媒に生物学的活性材料を高い程度に可溶化することは、製剤業界にお ける継続的な目標である。可溶化を達成する要求には、いくつかの理由がある。 例えば特に溶媒中での可溶化の達成は、生物学的有効性を改善する。このひとつ の例は、生物学的活性材料のオイルへの溶解である。これを達成する方法の例が 、例えばＷＯ９５／１３７９５、ＷＯ９６／１７５９３およびＷＯ９６／１７５ ９４に見出される。 前記特許公報に開示された方法や応用は、生物学的活性材料を両親媒性物質に 組み合わせるというステップを含む。生物学的活性分子、特に水溶性のものの両 親媒性物質において高い程度に可溶化することを望む状況も存在する。例えば、 ｉ）水性媒質における溶解特性を改良すること、例えば、急速な溶解の達成を 促進すること ｉｉ）オイル混合物などの低ＨＬＢシステムへの取り込みを促進すること；お よび ｉｉｉ）生物学的活性物質と多くの場合両親媒性物質であり局所的使用のため のものである浸透助剤とを組み合わせることを含む。 ここに第一の概念において、本発明は、 （ｉ）活性物質と両親媒性物質とを共通溶媒(common solvent)に組み合わせて 入れ、 （ｉｉ）共通溶媒を除去し、および （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から残分を加熱するステップを含む、両親媒性物 質中の活性物質を溶解する方法を提供するものであり； 第一のステップにおいて、第一に活性物質と両親媒性物質とをそれぞれ別々に共 通溶媒に溶解し、次いで二つの得られた溶液を混合することで好ましく組み合わ せることができる。 溶媒の除去は、両親媒性物質／活性物質残留物の残りが固体状態のままの温度 で行われる。加熱ステップは、固体両親媒性物質を溶融するために、また両親媒 性物質／活性物質配列をオープン形態からより濃縮したものに代えるために、十 分なものとする。 共通溶媒は水であり、例えば、それはステップ（ｉｉ）において、例えば、凍 結乾燥、遠心真空乾燥(centrifugal vacuum drying)または、他の適当な方法に より除去される。 好ましくは、前記方法において、両親媒性物質は、リン脂質、例えばレシチン 、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性剤、親油性硫酸塩（lipophilic sul phate）、ベタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルラン１６（solulan 16） 、ソルランＣ２４(solulan C24)、ポリオキシエチレン４０ステアレート(polyox yethylene 40 stearate)、界面活性剤トウィーンシリーズ（tween series）の１ 種、界面活性剤スパンシリーズ(spanseries)の１種または、ペゴレートされたヒ マシ油誘導体(pegolated castoroil derivative；ポリエチレングリコール分子 の付加により修飾されヒマシ油誘導体)、例えばクレマフォアＥＬ３５（cremaph orEL35）である。 活性物質は、一般的に水溶性溶媒に溶解するが疎水性溶媒に不溶である親水性 物質であることが好ましい。本発明で使用する親水性物質の範 囲は多様だが、使用可能な種類の例示であらわされる親水性高分子化合物などが ある。 本発明では、高分子化合物の幅広い多様種を好ましく使用できる。疎水性高分 子化合物を油性溶液中に溶解することは一般に困難でないため、一般にこの高分 子化合物の混合物は親水性であるか、少なくとも親水性部位を有する。好ましい 高分子化合物は、タンパク質、糖蛋白質、オリゴもしくはポリ核酸、例えば、Ｄ ＮＡおよびＲＮＡ、多糖類またはこれらを含む超分子集合体であり、ある場合は 全細胞または細胞器官を含む。高分子化合物、特にシクロデキストリン等の多糖 類と組み合わせてビタミンなどの小分子を共溶解することは都合もよい。ビタミ ン１２などの小分子は、高分子化合物と化学的に抱合し、このようにして混合物 に含有されうる。 本発明の方法により首尾よく溶解された特にタンパク質の例には、インシュリ ン、カルシトニン、ヘモグロビン、チトクロムＣ、西洋ワサビ過酸化酵素、アプ ロチニン、マシュルームチロシナーゼ(mushroomtyrosinase)、エリスロポエチン 、ソマトトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ガラニン、ウロキナ ーゼ、第９因子、組織プラスミノーゲン活性因子、スーパーオキシドジムスター ゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン、第８因子 、またはこれらの断片（前タンパク質の全ては好ましい源からのものである）。 使用され得る他の高分子化合物には、ＦＩＴＣラベルデキストランおよびトルラ イースト（torulla yeast）からのＲＮＡ抽出物がある。 本発明の方法によって分子量１，０００，０００のデキストリンが容易に溶解 されるため、高分子化合物混合物の分子量に上限はないようにみえる。 高分子化合物に加えて、本発明の方法は、より小さな有機分子の溶解 に有用である。小有機分子の例として、グルコース、カルボキシフルオレシン(c arboxyfluorescin)、および多くの製剤学的活性物質、例えば、抗がん剤がある が、もちろん、この方法は、例えばビタミンや製剤学的もしくは生物学的活性物 質などの他の小有機分子へ等しく応用され得る。加えて、塩化カルシウムやリン 酸ナトリウムなどの化合物もこの方法を用いて溶解することができる。非水性溶 液の使用は、分子が体内に入り多様化し、例えば生物学的活性を上昇させる経路 を可能にするから、実際、本発明は特に薬理学的および生物学的に優れている。 本発明の疎水性組成物に含有される別のタイプの種類は、小無機分子、コロイ ド物質、例えばコロイド金属などの無機材料である。本発明の方法は、通常の状 況下で分子が凝集するであろう疎水性溶媒中においても、コロイド金、パラジウ ム、プラチナまたはルビジウムなどのコロイド金属の特性を維持することができ る。これは、有機溶媒中でなされる触媒反応に特に有用である。 前記方法は、特に局所投与用活性物質や浸透助剤の活性物質間を会合させるの に適している。前者のものとして酢酸亜鉛（ＺｎＡｃ₂）がある。 特に適する両親媒性物質は室温で固体のもの、例えばソルラン１６またはソル ランＣ２４(ｓｏｌｕｌａｎ １６、ｓｏｌｕｌａｎ Ｃ２４)である。 他の概念において、本発明は、 ｉ）ここで述べた方法のいずれかで得られる両親媒性物質中に溶解された活性 物質、特に、浸透助剤であるアフィフィル（ａｐｈｉｐｈｉｌｅ）中に溶解され た局所投与用活性物質を含む組成物；および ｉｉ）局所投与用医薬の製造における本発明の組成物の使用、特に、活性物質 が酢酸亜鉛である炎症および／または関節炎の治療用組成物の 製造における本発明の組成物の使用を提供するものである。 本発明の各概念の好ましい特徴は、各他の概念に準ずる。 本発明を次の実施例を参照しながら説明するが、本発明を限定するものではな い。実施例１ （１） １０0ｍｇ／ｍｌの酢酸亜鉛溶液を、1ｍｌの蒸留水に１００ｍｇの酢 酸亜鉛を加えて調製し、ついで室温で溶解するまで混合した。 （２） １００ｍｇ／ｍｌのソルラン１６を４．５ｍｌの蒸留水にソルラン５ ００ｍｇを加えて調製し、ついで６０℃で溶解するまで混合した。 （３） ステップ１と２の溶液を４ｍｌのガラスねじ込みキャップのバイアル 中に下記のように分配し、よく混合した。 （４） バイアルと内容物を液体窒素で凍結し、コンデンサー温度−４０℃、 ０．１ミリバールで一昼夜凍結乾燥した。 （５） 翌日、凍結乾燥物を、ソルランＳ１６（Ｓｏｌｕｌａｎ Ｓ１６）の 固体ケークが溶融するよう、６０℃のヒーティングブロック上でインキュベート した。 （６） 溶液が室温で凝固した事実から、ソルラン１６中で溶解しまたは他の 状態にある酢酸亜鉛を、吸光度の記録よりこの液状製剤の透明度、懸濁度の試験 により視覚的に評価した。視覚観察の結果を下記表に記録する。 実施例２ （１） ソルラン１６と酢酸亜鉛の溶液を前述のように調製し、２ｍｌのガラ スねじ込みキャップのバイアル中に下記のように分配した。 （２）凍結乾燥および６０℃での加熱後、Ｓ１６中の酢酸亜鉛の溶解 性を実施例１で述べたと同様にして評価した。観察結果を下記表に示す。 ^*＝白色固体が残ったサンプル ＋＝粘性のガラス質の液体に変化したサンプル −＝極めて透明な液体実施例３ （１） １００ｍｇ／ｍｌのソルランＣ２４を、４．５ｍｌの蒸留水にソルラ ンＣ２４を５００ｍｇを加えて調製し、ついで６０℃で溶解するまで混合した。 （２） ５００ｍｇの酢酸銅を１０ｍｌの蒸留水に溶解し、５０ｍｇ／ｍｌ濃 度とした。 （３） １５０μｌの酢酸銅溶液（７．５ｍｇ固体）と９２５μｌのソルラン Ｃ２４溶液（９２．５ｍｇ固体）とを４ｍｌのガラスねじ込みキャップのバイア ル中に分配した。バイアル内容物をよく混合し、液体窒素中で凍結し、一昼夜凍 結乾燥した。 （４） １０ｍｇの酢酸銅を２ｍｌガラスバイアル中に分配し、１００ｍｇの ソルランＣ２４を加えた。バイアルの蓋をし、６０℃でオイルが溶融するよう加 熱した。試験管内の内容物は、オイル中で酢酸銅が分散するため渦巻き、ついで ８時間６０℃でインキュベートした。インキュベートの後、バイアルは、酢酸銅 の不溶性結晶上にある無色のオイル 状溶液からなっていた。 （５） 翌日、凍結乾燥物は、６０℃で２分間の加熱によるインキュベーショ ンで強い青色溶液に変化した。 （６） ステップ（４）と（５）からのバイアルは、このオイルが凝固する前 に、不溶性の酢酸銅が沈澱するよう室温においた。 （７） ２０μｌの固体オイルをステップ（６）の各サンプルの表面から取り 、１８０μｌの蒸留水に溶解した。 （８） ステップ（７）で得られた水溶性溶液の吸光度を６５０ｎｍで測定し 、蒸留水中にステップ２で得た酢酸銅溶液を希釈して調製した基準溶液に対して 比較した。結果を下記表に報告する。油中に溶解した酢酸銅のより高濃度のもの は、単なる成分の混合より、前述した凍結乾燥方法によって測定できるようにみ える。 実施例４ ウイルス懸濁液（サビン株(Sabin strain)、タイプ１、２、３）含有５×１０⁸ 分子／ｍｌ（含有タンパク質を除去したスパン(spun)）を、２００μｌの懸濁 液を９．９ｍｌの蒸留水に加えることで５０倍に希釈し、１０⁷分子／ｍｌ濃度 にした。この懸濁液を、２．５ｍｌ量づつ４つに等しく分け７ｍｌのねじ込みキ ャップのガラスバイアルに分配した。２．５ｍｌの蒸留水をウイルス分子の一定 量に加え、このグループを“Ｗ” とラベルした。２．５ｍｌのソルランＣ２４（１００ｍｇ／ｍｌ）を、他の一定 量に加え、丁寧に混合した。このグループを“Ｓ”とラベルした。 ２００μｌの各調製液を、１０の凍結乾燥バイアルに分配し、残りの１００μ ｌを他の試験管に前乾燥対照物として分配した。この対照物を＋４℃で一昼夜保 存した。凍結乾燥バイアルを凍結乾燥器の遠心ローターにおき、一昼夜凍結乾燥 した。 翌日、１００μｌの培養基をグループＷの各バイアルに加え、丁寧に混合した 。グループＳのバイアルを密封し、加熱バス中で６０℃で５秒間ソルランＣ２４ が溶融するよう加熱した。この結果透明溶液となった。室温まで冷却すると、こ の材料は固体状になった。９０μｌの培養液をＳグループのバイアルに加え、全 量を１００μｌにした。サンプル１０μｌを各グループＳとＷから１ｍｌの新し いバイアルに移し、１ｍｌの培養液をこれらに加え、よく混合した。 各前乾燥グループから２０μｌの４つのサンプルを、新たな１ｍｌバイアルに 加え、ついで１ｍｌの培養液をそれぞれに加えた。各バイアルの内容物をよく混 合した。 ここで述べられた調製懸濁液を、ベロ(vero)細胞培養液で１０倍に希釈し、存 在するポリオウイルスの生存率測定に使用した。５０％の細胞変性効果が観察さ れた最も高い希釈のものを結果として示す。 サンプル 50％のCPEの最も高い希釈 非乾燥対照物 ＋ 水 １０^-4／１０^-6 非乾燥対照物 ＋ ソルランC24 １０^-5／１０^-5 凍結乾燥対照物 ＋ 水 １０^-2／１０^-2 凍結乾燥対照物 ＋ ソルランC24 １０^-6／１０^-8

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/04 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｇ 38/16 39/12 38/21 45/00 38/22 37/26 38/23 37/30 38/27 37/14 38/28 37/54 38/44 37/66 Ｈ 38/46 37/50 38/48 37/547 39/00 37/43 39/12 37/36 45/00 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ｉ）活性物質と両親媒性物質とを組み合わせて共通溶媒に入れ、 （ｉｉ）共通溶媒を除去し、および （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から残分を加熱するステップを含む両親媒 性物質中の活性物質を溶解する方法。 ２． 第一に活性物質と両親媒性物質とをそれぞれ別々に溶解し共通溶媒に入 れ、その後に二つの得られた溶液を混合する、請求の範囲第１項記載の方法。 ３． 共通溶媒が水である、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４． 水が、凍結乾燥、遠心真空乾燥または、他の適当な方法によりステップ （ｉｉｉ）で除去される、請求項３記載の方法。 ５． 両親媒性物質が、レシチン、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性 剤、親油性硫酸塩、ベタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルラン１６、ソル ランＣ２４、ポリオキシエチレン４０ステアレート、界面活性剤トウィーンシリ ーズの１種、界面活性剤スパンシリーズの１種または、ペゴレートされたヒマシ 油誘導体、例えばクレマフォアＥＬ３５である、請求の範囲第１項から第４項の いずれかに記載の方法。 ６． 両親媒性物質が浸透助剤である、請求の範囲第１項から第４項のいずれ かに記載の方法。 ７． 活性物質が局所に投与されるものである、請求の範囲第１項から第６項 のいずれかに記載の方法。 ８． 活性物質が酢酸亜鉛である、請求の範囲第１項記載の方法。 ９． 両親媒性物質がソルラン１６またはソルランＣ２４である、請 求の範囲第８項記載の方法。 １０． 活性物質が、高分子化合物、有機もしくは無機小分子またはコロイド物 質である、請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。 １１． 高分子がタンパク質、糖蛋白質、オリゴもしくはポリ核酸、多糖類また はこれらの超分子集合体からなる、請求の範囲第１０項記載の方法。 １２． タンパク質がインシュリン、カルシトニン、ヘモグロビン、チトクロム Ｃ、西洋ワサビ過酸化酵素、アプロチニン、マシュルームチロシナーゼ、エリス ロポエチン、ソマトトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ガラニン 、ウロキナーゼ、第９因子、組織プラスミノーゲン活性因子、スーパーオキシド ジムスターゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン 、第８因子、またはこれらの断片である、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３． 活性物質が、経口投与のためのものである、請求の範囲第１０項から第 １２項のいずれかに記載の方法。 １４． 活性物質がウイルスである、請求の範囲第１３項記載の方法。 １５． 請求の範囲第１項から第１４項のいずれかに記載の方法により得られる 両親媒性物質中に溶解された活性物質を含む組成物。 １６． 局所投与用医薬の製造における、請求の範囲第１５項記載の組成物の使 用。 １７． 医薬が炎症および／または関節炎の処置または予防のためのものである 、請求の範囲第１６項記載の使用。 １８． 免疫反応処置用医薬の製造における、請求の範囲第１５項記載の組成物 の使用。 １９． 医薬がワクチンである、請求の範囲第１８項記載の使用。