JP2000502109A - 作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを含有してなるコンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを含有してなるコンジュゲート、その製造方法ならびにその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを含有してなるコンジュゲート 本発明は、作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを含有してなるコンジ ュゲート、かかるコンジュゲートの製造方法ならびにその使用に関する。 作用部位において、作用物質を集中させることの大きな要望がある。これは、 特に腫瘍、炎症組織のそれぞれを治療するための作用物質に適用する。作用物質 の多量の投与により、作用物質集中を得ることは、大変しばしば行なわれる。し かしながら、これは患者、特に患者の肝臓および腎臓に重大な副作用をあたえる 。 したがって、本発明の目的は、作用部位で作用物質を集中させる可能性を提供 することにある。 本発明によれば、これを請求項に規定された主題により達成する。 したがって、本発明の主題は、作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを 含有してなるコンジュゲートに関する。 「作用物質」という表現は、疾患、特に、腫瘍疾患および／たは炎症疾患を治 療および／または診断するために使用されうるいかなる種類の物質をも含有する 。かかる物質としては、例えば、化学療法剤、光活性物質、放射性物質、蛍光可 能な物質または蛍光放射可能な物質、フッ素−核磁気共鳴分光法のための物質、 放射線増感剤としての物質および／または金属化合物の結合部位を有する物質で ある。化学療法剤としては、例えば、ウイルス増殖抑制剤、抗原虫剤、細胞増殖 抑制剤および抗生物質である。その具体例としては、例えば、ドキソルビシン、 ダウノルビシン、テトラサイクリンメトトレキサート等の代謝拮抗薬、ならびに これらの誘導体などがある。光活性物質としては、例えば、ｏ−、ｍ−および／ またはｐ−テトラカルボキシフェニルポルフィリン（ＴＣＰＰ）などのポルフ ィリン類、クロリンおよびバクテリオクロリンである。放射性物質としては、例 えば、放射性ヨウ素で標識されたチロシンである。蛍光放射可能な物質としては 、例えば、フルオレセイン、アミノフルオレセイン（ＡＦ１）等の蛍光色素、な らびにその誘導体およびアナログである。フッ素−核磁気共鳴分光法のための物 質としては、例えば、トリフルオロ酢酸等のポリフルオロカルボン酸である。放 射線増感剤としては、例えば、ｍ−アミノ安息香酸アミドである。金属化合物の 結合部位を有する物質としては、例えば、ヒドロキシル、カルボニルまたはカル ボキシル基を含む物質である。それらは、１個以上の結合部位、好ましくは少な くとも２個、より好ましくは３〜６個の結合部位を有する。複数の結合部位が存 在する場合、それらは互いに同一であっても、異なっていてもよい。金属化合物 の結合部位を有する物質としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレ ントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸、アリザリ ンおよびその誘導体である。金属化合物の結合部位を有する物質は、好ましくは 、１以上の検出可能な金属および／または金属イオンを含むまたはからなる検出 可能な金属化合物を有する。かかる金属としては、例えば、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｃｏ、 Ｆｅ、Ｎｉ、Ｐｔ、ＧｄおよびＩｎであり、それは好ましくは２価または３価で あり、Ｇｄ³⁺であることが特に好ましい。金属および／または金属イオンは、^{11 1} Ｉｎ等、放射活性であってもよい。 １以上の前記作用物質は、本発明のコンジュゲート中に存在してもよい。複数 個存在する場合、それらは、互いに同一でもよく、または異なっていてもよい。 「ポリペプチド」という表現は、５０までのアミノ酸、好ましくは７〜３０ア ミノ酸、特に好ましくは１０〜３０アミノ酸を有するいかなる種類のポリペプチ ドをも含有する。該ポリペプチドは同一または異なるアミノ酸を有していてもよ い。該アミノ酸は、好ましくは、側鎖基にアミノ、カルボキシルまたはフェノー ル性ＯＨ基を有するものである。それらは、非天然由来および／または、リシン 、チロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸等の天然由来のアミノ酸であっ てもよい。特に好ましいポリペプチドは、ポリリシン（ＰＬ）、ポリチロシン、 ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸である。 当業者は、前記ポリペプチドに精通している。前記ポリペプチドは、購入また はメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｅｆｉｅｌｄ）法等の公知の技術により調製す ることができる。 ポリエーテルは、本発明のコンジュゲート中に存在する。それは、特に腎臓を 介する排出からコンジュゲートを保護し、よい水溶性でそれを提供する。ポリエ ーテルは、好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有する。該ポ リエーテルは、末端ヒドロキシル基において、Ｃ₁〜Ｃ₁₂のアルキル基、特にメ チル基によってエーテル化またはエステル化されていてもよい。該ポリエーテル は好ましくは、メトキシポリエチレングリコール等のポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）であり、メトキシポリエチレングリコール−ｐ−ニトロフェニルカーボ ネート、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルスクシネート、メト キシポリエチレングリコールトレシレート、メトキシポリオキシエチレンアミン 、メトキシポリオキシエチレンカルボン酸およびメトキシポリオキシエチレンイ ミダゾールカルボニル等の、活性基を介してポリペプチドに結合させる。 本発明のコンジュゲートは、さらに複数個、好ましくは２〜６個の前記ポリエ ーテルを含んでいてもよい。それらは、同一または異なっていてもよい。複数個 のポリエーテルが存在する場合、その分子量の合計は、好ましくは１０，０００ 〜５０，０００ダルトンである。 本発明のコンジュゲートにおいては、酸アミドもしくは酸エーテル結合を介し て共有結合等により直接的に、または塩化シアヌル等のリンカーを介して間接的 に各成分を結合することができる。作用物質およびポリエーテルの両方をポリペ プチドに結合することが好ましい。 本発明のコンジュゲートの前記成分は、遊離体として与えられる。したがって 、それらは本発明のコンジュゲートにおいては誘導体化された型で存在する。 図１および実施例１に、本発明のコンジュゲートの例を示す。 前記コンジュゲートの製造方法をも、本発明によって提供する。このような方 法で、好ましくは共有結合により、ポリペプチド、作用物質およびポリエーテル が通常互いに結合する。実施例１において、本発明のコンジュゲートの製造が参 照される。 本発明のコンジュゲートは、腫瘍および炎症疾患によってダメージをうけた組 織において、よく集中することを特徴とする。さらに、それらは、免疫原となる ことなく、特に同時に、もっとも異なる作用物質でチャージすることができる。 これは、複数の作用物質が同時に存在する場合、患者に望まれない免疫応答を度 々引き起こす従来技術によるコンジュゲートを超える大きな利点である。したが って、本発明のコンジュゲートは、疾患の治療、特に腫瘍疾患および炎症疾患に よく適する。 さらに、本発明のコンジュゲートは、疾患の診断、特に腫瘍疾患および炎症疾 患によく適する。例えば、本発明のコンジュゲートの作用物質は、蛍光放射可能 な物質であってもよい。これらのコンジュゲートを、例えば、手術前、腫瘍患者 に与える。本発明のコンジュゲートは、ついで、腫瘍に集中する。手術の間、蛍 光放射可能な物質をＵＶランプ等の光で剌激し、蛍光を放出させることができる 。したがって、健常な組織を腫瘍組織と区別化することができる。図面の簡単な説明 図１は、ポリリシン（ＰＬ）、４個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、８ 個のアミノフルオレセイン（ＡＦ１）および¹¹¹Ｉｎで標識したジエチレントリ アミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含有する本発明のコンジュゲートを示し、ＡＦ１は ＰＬの遊離アミノ基に塩化シアヌルを介して結合し、ＤＴＰＡは酸アミド架橋を 介してＰＬに結合する。 図２は、腫瘍組織においてシンチスキャニングによって測定した、本発明の図 １のコンジュゲートの分布を示す。 下記実施例により本発明を説明する。実施例１：ＰＬ、８個のＡＦ１、２個のＤＴＰＡおよび４個のメトキシポリエチ レングリコール（ＭＰＥＧ）を含有する、本発明のコンジュゲートの製造 ５０ｍｇの５（〔４，６−ジクロロトリアジン−２−イル〕アミノ）フルオレ セイン（ＡＦ１、分子量５３１．７、シグマ）を４ｍｌのジメチルスルフォキシ ド（ＤＭＳＯ）に溶解し、２ｍｌ ＤＭＳＯおよび２ｍｌの蒸留水に溶解した１ ００ｍｇのポリリシン（ＰＬ−分子量約１０００Ｄ、シグマ）に添加した。つい で、１ｍｌの０．３４Ｍ ＮａＨＣＯ₃を添加し、わずかに濁った溶液を約３０ 分間放置した。 １ｇのメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）−ニトロフェニルカーボ ネートを１０ｍｌのジオキサンに溶解し、前記ＡＦ１−ＰＬ溶液に添加した。５ ０μ１の１Ｎ ＮａＯＨをそれに添加した。約４８時間後コンバージョンを終了 した。ＰＬ−ＡＦ１−ＭＰＥＧ₄を得た。所望でない付随する物質を限外濾過（ ＹＭ１０）により分離した。分子量を通常のように、ＧＰＣによって決定した。 ＰＬ−ＡＦ１−ＭＰＥＧ₄を核医学用途のために^IIIＩｎまたは腫瘍透過ＭＲコ ントラスト剤としてガドリニウム（Ｇｄ）で標識したジエチレントリアミン五酢 酸（ＤＴＰＡ）と以下のように反応させた。 ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を加熱によってＤＭＳＯ中２０ｍｇ ／ｍｌの濃度に溶解した。透明の溶液を室温まで冷却後、１．５〜２倍モル量の Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および５倍モル量のＮ− ヒドロキシスクシンイミド（ＨＳＩ）を添加した。約１４〜１５時間の反応時間 後、スクシンイミジルエステル（ＤＴＰＡ−ＳＥ）の生成を完了した。それを引 き続くＰＬ−ＡＦ１−ＭＰＥＧ₄への結合に使用した。 この目的のために、前記ＤＴＰＡ−ＳＥ溶液を、前記限外濾過により精製した ＰＬ−ＡＦ１−ＭＰＥＧ₄溶液に定常攪拌させながら、非常にゆっくり添加し、 最初は透明な溶液が過剰で未反応のＤＣＣといまだに溶解したジーシクロヘキシ ル尿素（ＤＣＣＨ）により濁るようになった。ＤＴＰＡ−ＳＥの添加を終了させ 、反応混合物を室温でさらに６０分間、全反応液を攪拌した。その後、濁った物 質を滅菌フィルターユニット（ミリポア、Ｓｔｅｒｉｃｕｐ−ＧＶ）０．２２μ ｍ、ローバインディング ドュロポア メンブラン）を介して分離し、低分子の 水溶性成分（ＤＭＳＯ，ＨＳＩおよび結合していないＤＴＰＡ）を１０ｋＤ排除 限界のメンブラン（アミコン）を介して限外濾過により分離した。分析純度をＨ ＰＬＣにより制御した。本発明のＰＬ−ＡＦＬ−ＭＰＥＧ₄−ＤＴＰＡ₂（Ａ）コ ンジュゲートを得た。 ¹¹¹Ｉｎでの標識（Ａ）のために、低い担体含量を有する¹¹¹ＩｎＣｌ３の０． １Ｍの塩酸溶液としてチャージした１８５ＭＢｑの¹¹¹Ｉｎ（５ ｍＣｉ）に、 １０〜２０μｌの０．２Ｍ クエン酸−Ｎａ溶液を添加した。この目的のために 、１〜２ｍｌの０．１７Ｍ ＮａＨＣＯ₂に溶解した約５ｍｇの（Ａ）を添加し た。その後、反応混合物を限外濾過により、非結合の¹¹¹Ｉｎおよびクエン酸塩 から分離した。この目的のために、反応容量を２ｍｌまで満たし、ディスポーザ ブル ウルトラフィルトレーション ユニット（セントリコンＣ３０、アミコン ）に入れ、低分子の混入物の分離を４５゜に傾斜させることができるローター中 で遠心分離により行なった。¹¹¹Ｉｎで標識した（Ａ）を得た。 Ｇｄでの（Ａ）のチャージを、より多い物質の量を要求されただけで、¹¹¹Ｉ ｎでの標識と同様の方法で行なった。実施例２：本発明のコンジュゲートの腫瘍組織における吸収 ａ）Ｗａｌｋｅｒ ２５６癌肉腫を有するラットを静脈内に、約７０μＣｉ（２ ｍｇ／ｋｇ）の本発明の図１のコンジュゲートを与えた。該ラットにおけるコン ジュゲートの分布を、５分、１、３、２４および４８時間後、シンチスキャニン グにより示した。結果を図２に示す。 図２は、本発明のコンジュゲートが腫瘍に集中するが、心臓または肝臓領域 には集中しないことを開示する。 ｂ）前記ラットを４８時間後屠殺し、器官における放射能分布を決定した。結果 を表１に示す。 表１は、本発明のコンジュゲートが、腫瘍において集中していることを開示 する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月３日（１９９７．１２．３） 【補正内容】 請求の範囲 １． 作用物質が、光活性物質、蛍光放射可能な物質および／または放射線増感 剤であることを特徴とする、作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを含有 してなるコンジュゲート。 ２． 複数個の作用物質が存在することを特徴とする、請求項１記載のコンジュ ゲート。 ３． ポリペプチドが、７〜３０個のアミノ酸を有することを特徴とする、請求 項１または２記載のコンジュゲート。 ４． ポリペプチドが、同一または異なるアミノ酸を有することを特徴とする、 請求項１〜３いずれか記載のコンジュゲート。 ５． ポリペプチドが、側鎖基にアミノ、カルボキシルまたはフェノール性ＯＨ 基を有するアミノ酸を有することを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載のコ ンジュゲート。 ６． ポリペプチドが、天然由来のアミノ酸を有することを特徴とする、請求項 １〜５いずれか記載のコンジュゲート。 ７． アミノ酸が、リシン、チロシン、アスパラギン酸および／またはグルタミ ン酸であることを特徴とする、請求項６記載のコンジュゲート。 ８． ポリペプチドが、ポリリシン、ポリチロシン、ポリアスパラギン酸または ポリグルタミン酸であることを特徴とする、請求項７記載のコンジュゲート。 ９． ポリエーテルが、２，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有すること を特徴とする、請求項１〜８いずれか記載のコンジュゲート。 １０． 複数個のポリエーテルが存在することを特徴とする、請求項１〜９いず れか記載のコンジュゲート。 １１． ２〜６個のポリエーテルが存在することを特徴とする、請求項１０記載 のコンジュゲート。 １２． ポリエーテルが、ポリエチレングリコールであることを特徴とする、請 求項１〜１１いずれか記載のコンジュゲート。 １３． 作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルが互いに共有結合により結 合していることを特徴とする、請求項１〜１２いずれか記載のコンジュゲートの 製造方法。 １４． 疾患を治療および／または診断するための請求項１〜１２いずれか記載 のコンジュゲートの使用。 １５． 疾患が、腫瘍疾患および／または炎症疾患である、請求項１４記載の使 用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュレンク，ハンス―ヘルマン ドイツ連邦共和国 ツァイスカム デー― 67728 ミッテルヴェーク（番地なし) (72)発明者 ステーレ，ゲルト ドイツ連邦共和国 マンハイム デー― 68305 カッセレル シュトラーセ ８ (72)発明者 フィービック，ハインツ―ハー. ドイツ連邦共和国 フライブルク デー― 79110 ヨス―フリッツ―シュトラーセ 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルを含有してなるコンジュゲー ト。 ２． 作用物質が、腫瘍疾患および／または炎症疾患を治療および／または診断 するのに適する物質であることを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。 ３． 作用物質が、化学療法剤、光活性物質、放射性物質、蛍光放射可能な物質 、フッ素−核磁気共鳴分光法のための物質、放射線増感剤としての物質および／ または金属化合物の結合部位を有する物質であることを特徴とする、請求項１ま たは２記載のコンジュゲート。 ４． 複数個の作用物質が存在することを特徴とする、請求項１〜３いずれか記 載のコンジュゲート。 ５． ポリペプチドが、７〜３０個のアミノ酸を有することを特徴とする、請求 項１〜４いずれか記載のコンジュゲート。 ６． ポリペプチドが、同一または異なるアミノ酸を有することを特徴とする、 請求項１〜５いずれか記載のコンジュゲート。 ７． ポリペプチドが、側鎖基にアミノ、カルボキシルまたはフェノール性ＯＨ 基を有するアミノ酸を有することを特徴とする、請求項１〜６いずれか記載のコ ンジュゲート。 ８． ポリペプチドが、天然由来のアミノ酸を有することを特徴とする、請求項 １〜７いずれか記載のコンジュゲート。 ９． アミノ酸が、リシン、チロシン、アスパラギン酸および／またはグルタミ ン酸であることを特徴とする、請求項８記載のコンジュゲート。 １０． ポリペプチドが、ポリリシン、ポリチロシン、ポリアスパラギン酸また はポリグルタミン酸であることを特徴とする、請求項９記載のコンジュゲート。 １１． ポリエーテルが、２，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有するこ とを特徴とする、請求項１〜１０いずれか記載のコンジュゲート。 １２． 複数個のポリエーテルが存在することを特徴とする、請求項１〜１１い ずれか記載のコンジュゲート。 １３． ２〜６個のポリエーテルが存在することを特徴とする、請求項１２記載 のコンジュゲート。 １４． ポリエーテルが、ポリエチレングリコールであることを特徴とする、請 求項１〜１３いずれか記載のコンジュゲート。 １５． 作用物質、ポリペプチドおよびポリエーテルが互いに共有結合により結 合していることを特徴とする、請求項１〜１４いずれか記載のコンジュゲートの 製造方法。 １６． 疾患を治療および／または診断するための請求項１〜１４いずれか記載 のコンジュゲートの使用。 １７． 疾患が、腫瘍疾患および／または炎症疾患である、請求項１６記載の使 用。