JP2000228980A5 - - Google Patents
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Description
この発明による当該非還元性糖質生成酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズS34(FERM BP−6450)などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、20乃至50℃、望ましくは、25乃至37℃、培養pHは通常pH4乃至10、望ましくは、pH5乃至9、培養時間は10乃至150時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該非還元性糖質生成酵素をコードするDNAを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、20乃至65℃、培養pHは通常、pH2乃至9、培養時間は通常、1乃至6日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物1ml当たりに換算すると0.01乃至1,000単位である。
この発明による当該トレハロース遊離酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズS34(FERM BP−6450)などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、20乃至50℃、望ましくは、25乃至37℃、培養pHは通常pH4乃至10、望ましくは、pH5乃至9、培養時間は10乃至150時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該トレハロース遊離酵素をコードするDNAを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、20乃至65℃、培養pHは通常、pH2乃至9、培養時間は通常、1乃至6日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物1ml当たりに換算すると0.01乃至3,000単位である。
合一した溶液を10mM燐酸緩衝液(pH7.0)に対して透析し、その透析内液を10,000rpmで30分間遠心分離した。この上清を回収し、約40mlの陰イオン交換樹脂(東ソー株式会社製、商品名『DEAE−トヨパール650Sゲル』)を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い0Mから0.2Mまで直線的に濃度が上昇する食塩水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約0.15M食塩で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。合一した液を、引き続き、約380mlの『ウルトロゲルAcA44ゲル』(フランス、セプラコル社製)を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供し、顕著な当該酵素活性の認められた画分を回収した。以上の、精製の各工程における非還元性糖質生成酵素の酵素活性量、比活性、収率を表2に示す。
表4に示すように、実施例2によるこの発明の非還元性糖質生成酵素は、中温域以外に至適温度を有する公知の酵素のうちではリゾビウム・スピーシーズM−11由来の酵素と最も高い56.9%というアミノ酸配列の相同性を示した。この結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列番号1に示すアミノ酸配列に対して57%以上の相同性を有するアミノ酸配列を通常は含有することを意味している。また、アミノ酸配列の比較結果から、実施例2による当該酵素と上記の4種類の公知の酵素は、配列表における配列番号2及び3に示すアミノ酸配列を共通して含有していることが判明した。実施例2による当該酵素は、配列表における配列番号1のアミノ酸配列における第84乃至89番目及び第277乃至282番目のアミノ酸からなる部分に見られるとおり、配列番号2及び3のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含有している。上記で比較の対象とした4種類の酵素も、いずれも、それぞれ対応する部分にこれらの部分アミノ酸配列を含有している。実施例2による当該酵素ならびに比較の対象とした酵素がいずれも共通して還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有していることから、上記で見出された配列表における配列番号2及び3に示す部分アミノ酸配列が斯かる作用の発現に関わっていることが示唆された。したがってこの結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列表における配列番号2及び3に示すアミノ酸配列を含有するとともに中温域に至適温度を有することにより特徴づけられることを示している。
【0175】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、中温域に至適温度を有し、望ましくは、酸性域に至適pHを有する、新規な非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素の発見に基づくものである。この発明の両酵素は、例えば、斯かる酵素を産生する微生物の培養によりその所望量を得ることができる。また、この発明による両酵素をコードするそれぞれのDNAは、組換え型蛋白質としての両酵素の製造に極めて有用であり、当該DNAを導入してなる形質転換体を用いる場合にも、この発明の両酵素の所望量を得ることができる。この発明の両酵素は、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。しかも、この発明の両酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品への配合使用を前提とする当該非還元性糖質の製造に安心して使用し得る。斯くして得られる非還元性糖質ないしは斯かる非還元性糖質を含む低還元性糖質は、温和で上品な甘味を有し、そして、何よりも、糖質中の還元性基を有しないか又は大幅に低減しているので、着色や変質の懸念なく飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益がある。
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、中温域に至適温度を有し、望ましくは、酸性域に至適pHを有する、新規な非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素の発見に基づくものである。この発明の両酵素は、例えば、斯かる酵素を産生する微生物の培養によりその所望量を得ることができる。また、この発明による両酵素をコードするそれぞれのDNAは、組換え型蛋白質としての両酵素の製造に極めて有用であり、当該DNAを導入してなる形質転換体を用いる場合にも、この発明の両酵素の所望量を得ることができる。この発明の両酵素は、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。しかも、この発明の両酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品への配合使用を前提とする当該非還元性糖質の製造に安心して使用し得る。斯くして得られる非還元性糖質ないしは斯かる非還元性糖質を含む低還元性糖質は、温和で上品な甘味を有し、そして、何よりも、糖質中の還元性基を有しないか又は大幅に低減しているので、着色や変質の懸念なく飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益がある。
Claims (1)
- 非還元性糖質を生成させる工程において、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトトリオース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ、澱粉枝切り酵素、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ及び/又はα−グルコシダーゼをさらに作用させる請求項52又は53に記載の糖質の製造方法。
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