JP2000023697A - 分析対象の検出のための生物学的アッセイの改良 - Google Patents
分析対象の検出のための生物学的アッセイの改良Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の生物学的分析対象を検出するための
蛍光アッセイ法において、蛍光バックグラウンドを従来
のアッセイ法のものより有意に低くすること。 【解決手段】 試料中の分析対象を検出する方法であっ
て、試料に接触する表面を有する不透明ガラス支持体を
提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光
色素で標識されており；蛍光色素を励起させる波長の光
を表面に照射し；そして、試料中の分析対象の存在の指
標として表面から生じる蛍光放射光を検出する、ことを
含んでなる上記方法。
蛍光アッセイ法において、蛍光バックグラウンドを従来
のアッセイ法のものより有意に低くすること。 【解決手段】 試料中の分析対象を検出する方法であっ
て、試料に接触する表面を有する不透明ガラス支持体を
提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光
色素で標識されており；蛍光色素を励起させる波長の光
を表面に照射し；そして、試料中の分析対象の存在の指
標として表面から生じる蛍光放射光を検出する、ことを
含んでなる上記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は分析対象をアッセイ
する生物学的方法に関する。
する生物学的方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に分析対象の検出のための生物学的
アッセイは、分析対象（例えば、核酸、タンパク質、ホ
ルモン、脂質、または細胞）へのシグナル生成部分の付
加を含む。蛍光に基づくバイオアッセイでは微弱な蛍光
シグナルの検出が必要とされる。典型的なアッセイで
は、分析対象をスライドガラスやガラスチップのような
固体基体上に付着させる。生化学的処理および蛍光染色
を行った後、スライドを蛍光顕微鏡のような光学機器で
分析する。一定の波長の光をスライドに適用し、付着さ
せた生体物質から生じる蛍光放射光をシグナルとして収
集する。
アッセイは、分析対象（例えば、核酸、タンパク質、ホ
ルモン、脂質、または細胞）へのシグナル生成部分の付
加を含む。蛍光に基づくバイオアッセイでは微弱な蛍光
シグナルの検出が必要とされる。典型的なアッセイで
は、分析対象をスライドガラスやガラスチップのような
固体基体上に付着させる。生化学的処理および蛍光染色
を行った後、スライドを蛍光顕微鏡のような光学機器で
分析する。一定の波長の光をスライドに適用し、付着さ
せた生体物質から生じる蛍光放射光をシグナルとして収
集する。
【０００３】透明ソーダ石灰およびホウケイ酸ガラス
は、蛍光で標識した試料を保持する基体として一般に使
用される。しかしながら、これらの物質の多くは有意な
自己蛍光を示し、測定可能な吸光度を有し、可視領域に
わたって蛍光放射光を生じる。典型的なソーダ石灰スラ
イドガラスは、一般に使用される蛍光色素の層に相当す
る、１ｘ１０9蛍光体／ｃｍ2より高い表面密度のバック
グラウンド蛍光を生じる。拡散光、レイリー散乱、およ
びラマン散乱のような他の起源から生じるノイズを伴う
このバックグラウンド蛍光は、分析対象から生じる微弱
な蛍光シグナルの検出を不明瞭とし、アッセイの感度を
限定する。
は、蛍光で標識した試料を保持する基体として一般に使
用される。しかしながら、これらの物質の多くは有意な
自己蛍光を示し、測定可能な吸光度を有し、可視領域に
わたって蛍光放射光を生じる。典型的なソーダ石灰スラ
イドガラスは、一般に使用される蛍光色素の層に相当す
る、１ｘ１０9蛍光体／ｃｍ2より高い表面密度のバック
グラウンド蛍光を生じる。拡散光、レイリー散乱、およ
びラマン散乱のような他の起源から生じるノイズを伴う
このバックグラウンド蛍光は、分析対象から生じる微弱
な蛍光シグナルの検出を不明瞭とし、アッセイの感度を
限定する。
【０００４】更に、核酸検出のための多くの蛍光アッセ
イでは、化学リンカーを介して核酸を固相支持体に結合
させる。それらのリンカーはしばしば自己蛍光を有し、
バックグラウンド蛍光を生成する。
イでは、化学リンカーを介して核酸を固相支持体に結合
させる。それらのリンカーはしばしば自己蛍光を有し、
バックグラウンド蛍光を生成する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は生物学的アッ
セイの向上を特徴とする。
セイの向上を特徴とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】ある観点では、本発明
は、従来のアッセイに比較してシグナルのバックグラウ
ンドが有意に低下した蛍光に基づくアッセイを特徴とす
る。これらのアッセイは以下の段階を含む：（i）分析
対象（例えばタンパク質、核酸、多糖類、脂質、または
細胞）を含有する試料と接触する表面を有する不透明ガ
ラス支持体を提供し、ここで分析対象は試料中に存在す
る場合、蛍光色素で標識されており；（ii）蛍光色素を
励起する波長の光を表面に照射し；そして（iii）試料
中の化合物の存在の指標として表面から生じる蛍光放射
光を検出する。ここで使用するところの“不透明ガラス
支持体”とは、アッセイに使用される蛍光色素の励起光
および放射光を透過しないガラス支持体をいう。
は、従来のアッセイに比較してシグナルのバックグラウ
ンドが有意に低下した蛍光に基づくアッセイを特徴とす
る。これらのアッセイは以下の段階を含む：（i）分析
対象（例えばタンパク質、核酸、多糖類、脂質、または
細胞）を含有する試料と接触する表面を有する不透明ガ
ラス支持体を提供し、ここで分析対象は試料中に存在す
る場合、蛍光色素で標識されており；（ii）蛍光色素を
励起する波長の光を表面に照射し；そして（iii）試料
中の化合物の存在の指標として表面から生じる蛍光放射
光を検出する。ここで使用するところの“不透明ガラス
支持体”とは、アッセイに使用される蛍光色素の励起光
および放射光を透過しないガラス支持体をいう。
【０００７】上記のアッセイにおいて、不透明ガラス支
持体の代わりに反射表面を使用することができる。“反
射表面”とは、入射光を表面に垂直に照射した場合、表
面が入射光の少なくとも約１５％（例えば少なくとも２
５％、５０％、７５％、または９０％）を反射し、２０
％未満（例えば１０％、５％、または１％未満）の光を
透過することをいう。反射表面を使用するアッセイで
は、励起光をある角度で、すなわち垂直ではなく表面に
照射することができる。例えば、反射表面は金属（例え
ばクロムまたはアルミニウム）表面、または半金属（例
えばシリコン）表面であってもよい。
持体の代わりに反射表面を使用することができる。“反
射表面”とは、入射光を表面に垂直に照射した場合、表
面が入射光の少なくとも約１５％（例えば少なくとも２
５％、５０％、７５％、または９０％）を反射し、２０
％未満（例えば１０％、５％、または１％未満）の光を
透過することをいう。反射表面を使用するアッセイで
は、励起光をある角度で、すなわち垂直ではなく表面に
照射することができる。例えば、反射表面は金属（例え
ばクロムまたはアルミニウム）表面、または半金属（例
えばシリコン）表面であってもよい。
【０００８】本発明の蛍光アッセイでは、分析対象と特
異的に結合し、表面に固定化された捕獲プローブを介し
て、分析対象を表面に結合させることができる。別の観
点では、本発明は、核酸を金属または半金属表面に効率
的に結合させる方法を特徴とする。これらの方法は以下
の段階を含む：（i）所望の核酸を含有する溶液を提供
し；（ii）溶液中で核酸を変性させ；（iii）金属（例
えばクロムまたはアルミニウム）または半金属（例えば
シリコン）表面に溶液を適用し；そして（）溶液を表面
上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる。こ
れらの方法では、ｐＨが少なくとも約１１であるアルカ
リ溶液（例えばＮａＯＨ溶液）中で、または核酸を変性
させるに十分な温度および時間で加熱することにより、
核酸を変性させることができる。必要により顕微鏡用固
定媒体、例えばＧｅｌ／ＭｏｕｎｔTM（Biomeda社、Fos
ter City、CA）を金属または半金属表面に適用して、表
面への核酸の結合を向上させることができる。
異的に結合し、表面に固定化された捕獲プローブを介し
て、分析対象を表面に結合させることができる。別の観
点では、本発明は、核酸を金属または半金属表面に効率
的に結合させる方法を特徴とする。これらの方法は以下
の段階を含む：（i）所望の核酸を含有する溶液を提供
し；（ii）溶液中で核酸を変性させ；（iii）金属（例
えばクロムまたはアルミニウム）または半金属（例えば
シリコン）表面に溶液を適用し；そして（）溶液を表面
上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる。こ
れらの方法では、ｐＨが少なくとも約１１であるアルカ
リ溶液（例えばＮａＯＨ溶液）中で、または核酸を変性
させるに十分な温度および時間で加熱することにより、
核酸を変性させることができる。必要により顕微鏡用固
定媒体、例えばＧｅｌ／ＭｏｕｎｔTM（Biomeda社、Fos
ter City、CA）を金属または半金属表面に適用して、表
面への核酸の結合を向上させることができる。
【０００９】別に定義しない限り、ここで使用する技術
的および科学的用語は全て、本発明の属する分野で当業
者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。代表的
な方法および物質を以下に記載するが、ここに記載する
ものと同様または同等の方法および物質を本発明の実施
または試験に使用することができる。ここに記載する全
ての出版物および他の参考文献は、その全体を本明細書
の一部としてここに引用する。矛盾が生じる場合は、定
義を含み、本明細書が優先する。物質、方法、および実
施例は単に例証であり、制限を意図するものではない。
的および科学的用語は全て、本発明の属する分野で当業
者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。代表的
な方法および物質を以下に記載するが、ここに記載する
ものと同様または同等の方法および物質を本発明の実施
または試験に使用することができる。ここに記載する全
ての出版物および他の参考文献は、その全体を本明細書
の一部としてここに引用する。矛盾が生じる場合は、定
義を含み、本明細書が優先する。物質、方法、および実
施例は単に例証であり、制限を意図するものではない。
【００１０】本発明の他の特徴および利点は以下の詳細
な説明および上記の特許請求の範囲から明白であろう。
な説明および上記の特許請求の範囲から明白であろう。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は（i）バックグラウンド
蛍光が従来の方法に比較して有意に低下した改良型蛍光
バイオアッセイ法、および（ii）固相支持体に核酸を結
合させるための改良法を特徴とする。蛍光バックグラウンドを低下させる方法 蛍光標識が吸収および放射する波長領域において不透明
な基体（例えば黒色ガラス）上で、蛍光で標識した分析
対象を検出する。基体の不透明性により、基体内への励
起光の透過、および反射する蛍光が実質的に低下する。
基体内部からのレイリーおよびラマン散乱も防止される
であろう。更に、基体の側面および裏面上の汚染および
粉塵は実際のシグナルより強度のかなり高いバックグラ
ウンドを生じうるが、これらは検出されない。基体下部
からの拡散光由来のバックグラウンドも低下または除去
される。従って、この種の基体からのバックグラウンド
ノイズは、従来の基体（例えばソーダ石灰ガラス）から
生じるものより有意に低い。
蛍光が従来の方法に比較して有意に低下した改良型蛍光
バイオアッセイ法、および（ii）固相支持体に核酸を結
合させるための改良法を特徴とする。蛍光バックグラウンドを低下させる方法 蛍光標識が吸収および放射する波長領域において不透明
な基体（例えば黒色ガラス）上で、蛍光で標識した分析
対象を検出する。基体の不透明性により、基体内への励
起光の透過、および反射する蛍光が実質的に低下する。
基体内部からのレイリーおよびラマン散乱も防止される
であろう。更に、基体の側面および裏面上の汚染および
粉塵は実際のシグナルより強度のかなり高いバックグラ
ウンドを生じうるが、これらは検出されない。基体下部
からの拡散光由来のバックグラウンドも低下または除去
される。従って、この種の基体からのバックグラウンド
ノイズは、従来の基体（例えばソーダ石灰ガラス）から
生じるものより有意に低い。
【００１２】基体は蛍光を有しないか、または低度の自
己蛍光を有するのが好ましい。基体物質の化学的および
物理的特性もアッセイに適合したものであるべきであ
る。好適な物質には、着色または不透明ガラス、および
不透明のプラスチック系の物質があるが、それらに限定
されるものではない。代表的な着色ガラスは、Ｓｃｈｏ
ｔｔ Ｍ−ＵＧ−２、Ｍ−ＵＧ−６、ＵＧ−１、ＵＧ−
１１、ＮＤ、ＲＧ７１５、ＲＧ９、ＲＧ７８０、ＮＤ−
１、およびＮＤ−１０（ドイツ）；そしてＣｏｒｎｉｎ
ｇ ２０３０、２５４０、２５５０、２６００、５８４
０、５８６０、５８７４、および９８６３である。基体
はスライド、ウェーハー、またはチップのような形態に
することができる。
己蛍光を有するのが好ましい。基体物質の化学的および
物理的特性もアッセイに適合したものであるべきであ
る。好適な物質には、着色または不透明ガラス、および
不透明のプラスチック系の物質があるが、それらに限定
されるものではない。代表的な着色ガラスは、Ｓｃｈｏ
ｔｔ Ｍ−ＵＧ−２、Ｍ−ＵＧ−６、ＵＧ−１、ＵＧ−
１１、ＮＤ、ＲＧ７１５、ＲＧ９、ＲＧ７８０、ＮＤ−
１、およびＮＤ−１０（ドイツ）；そしてＣｏｒｎｉｎ
ｇ ２０３０、２５４０、２５５０、２６００、５８４
０、５８６０、５８７４、および９８６３である。基体
はスライド、ウェーハー、またはチップのような形態に
することができる。
【００１３】あるいはまた、基体の分析対象を受容する
側の表面は反射性のものであり、例えば半金属もしくは
金属の薄いフィルムでコーティングした固相支持体の表
面、または金属もしくは半金属プレートの光沢表面であ
ってもよい。基体が励起光および放射光を透過する場合
でも、反射表面は励起光および蛍光放射光を基体に透過
させない。適当な角度で表面を照射することにより、励
起光は収集レンズ（collection optics）から逸れて反
射し、収集レンズからの自己蛍光が除去される；従っ
て、より効率の低いフィルターを使用して自己蛍光を吸
収させることができる。
側の表面は反射性のものであり、例えば半金属もしくは
金属の薄いフィルムでコーティングした固相支持体の表
面、または金属もしくは半金属プレートの光沢表面であ
ってもよい。基体が励起光および放射光を透過する場合
でも、反射表面は励起光および蛍光放射光を基体に透過
させない。適当な角度で表面を照射することにより、励
起光は収集レンズ（collection optics）から逸れて反
射し、収集レンズからの自己蛍光が除去される；従っ
て、より効率の低いフィルターを使用して自己蛍光を吸
収させることができる。
【００１４】コーティング物質の化学的および物理的性
質がアッセイに適合し、分析対象が効率的に結合される
限り、種々の反射コーティングを使用することができ
る。好適な基体には、例えばNanofilm社（Westlake Vil
lage、CA）製のクロムでコーティングされたガラスのよ
うな、ガラスリトグラフィーで使用されるコーティング
されたガラス物質があるが、それに限定されるものでは
ない。
質がアッセイに適合し、分析対象が効率的に結合される
限り、種々の反射コーティングを使用することができ
る。好適な基体には、例えばNanofilm社（Westlake Vil
lage、CA）製のクロムでコーティングされたガラスのよ
うな、ガラスリトグラフィーで使用されるコーティング
されたガラス物質があるが、それに限定されるものでは
ない。
【００１５】図１は、従来のスライドガラスの形状で、
薄いクロムフィルム２でコーティングした平滑な表面を
有する基体１を示す。蛍光標識したＤＮＡフラグメント
３を無作為に、または位置を特定できるように（addres
sably）配列させて表面上に付着させる。付着させた分
子を生化学的に処理した後、必要により、適当なｐＨを
提供する液体媒体５をスライド上に適用し、薄いカバー
ガラス６で被覆する。液体媒体は必要により、蛍光色素
の酸化を防止する組成物である抗退色剤を含有すること
ができる。代表的な抗退色剤は、Aldrich Chem.Co.（Mi
lwaukee、WI）製のｐ−フェニレンジアミンである。ま
た液体媒体は、例えば４’，６−ジアミジノ−２−フィ
ルインドール（“ＤＡＰＩ”）のような対比染色剤を含
有することができる。次いで、励起光をスライドのクロ
ムコーティング面に照射する蛍光イメージングシステム
でスライドを分析する。蛍光放射光の収集レンズ４を、
照射する表面のすぐ上に、コーティングした表面に垂直
な光学軸で配する。そのような配置により収集レンズへ
蛍光が反射し、レンズで検出される蛍光シグナル強度が
約二倍になる。励起光をある角度で適用し、反射光が収
集レンズに入らないようにする。また、ミラー７を使用
して励起光の強度を向上することもできる。
薄いクロムフィルム２でコーティングした平滑な表面を
有する基体１を示す。蛍光標識したＤＮＡフラグメント
３を無作為に、または位置を特定できるように（addres
sably）配列させて表面上に付着させる。付着させた分
子を生化学的に処理した後、必要により、適当なｐＨを
提供する液体媒体５をスライド上に適用し、薄いカバー
ガラス６で被覆する。液体媒体は必要により、蛍光色素
の酸化を防止する組成物である抗退色剤を含有すること
ができる。代表的な抗退色剤は、Aldrich Chem.Co.（Mi
lwaukee、WI）製のｐ−フェニレンジアミンである。ま
た液体媒体は、例えば４’，６−ジアミジノ−２−フィ
ルインドール（“ＤＡＰＩ”）のような対比染色剤を含
有することができる。次いで、励起光をスライドのクロ
ムコーティング面に照射する蛍光イメージングシステム
でスライドを分析する。蛍光放射光の収集レンズ４を、
照射する表面のすぐ上に、コーティングした表面に垂直
な光学軸で配する。そのような配置により収集レンズへ
蛍光が反射し、レンズで検出される蛍光シグナル強度が
約二倍になる。励起光をある角度で適用し、反射光が収
集レンズに入らないようにする。また、ミラー７を使用
して励起光の強度を向上することもできる。
【００１６】この新規方法は、蛍光イムノアッセイ、蛍
光インサイチオハイブリダイゼーション、比較ゲノムハ
イブリダイゼーション（“ＣＧＨ”）、ゲノセンサー系
（genosensor-based）ＣＧＨ（“ｇＣＧＨ”；例えばKa
llioniemiら，Science，258：818-821，1992を参照する
こと）、分子芝（molecular lawn）（米国特許出願第08
/768,177号および08/991,675号を参照すること）、また
は一般的なＤＮＡチップを使用するアッセイ（例えば米
国特許第5,445,934号、5,510,270号、および5,556,752
号を参照すること）のような種々の蛍光アッセイに使用
することができる。
光インサイチオハイブリダイゼーション、比較ゲノムハ
イブリダイゼーション（“ＣＧＨ”）、ゲノセンサー系
（genosensor-based）ＣＧＨ（“ｇＣＧＨ”；例えばKa
llioniemiら，Science，258：818-821，1992を参照する
こと）、分子芝（molecular lawn）（米国特許出願第08
/768,177号および08/991,675号を参照すること）、また
は一般的なＤＮＡチップを使用するアッセイ（例えば米
国特許第5,445,934号、5,510,270号、および5,556,752
号を参照すること）のような種々の蛍光アッセイに使用
することができる。
【００１７】十分確立された方法を使用して、分析対象
核酸または分析対象核酸に特異的な捕獲プローブを、ガ
ラスまたは金属でコーティングした表面に結合させるこ
とができる。例えばJoosら，Analytical Biochemistr
y，247：96-101，1997；Maskosら，Nucleic Acids Rese
arch，20：1679-1684，1992；Fodorら，Science，251：
767-773，1991；Lowe，Chemical Society Reviews，2
4：309-317，1995；Guoら，Nucleic Acids Research，2
2：5646-5465，1994；そしてBischoff，Analytical Bio
chemistry，164：336-344，1987を参照されたい。ガラ
ス表面に使用できる結合方法はシリコン基体にも使用で
きる。これを行うためには、シリコン基体を加熱して表
面層を酸化し、表面にスライドガラスと同様の化学的性
質をもたせる。
核酸または分析対象核酸に特異的な捕獲プローブを、ガ
ラスまたは金属でコーティングした表面に結合させるこ
とができる。例えばJoosら，Analytical Biochemistr
y，247：96-101，1997；Maskosら，Nucleic Acids Rese
arch，20：1679-1684，1992；Fodorら，Science，251：
767-773，1991；Lowe，Chemical Society Reviews，2
4：309-317，1995；Guoら，Nucleic Acids Research，2
2：5646-5465，1994；そしてBischoff，Analytical Bio
chemistry，164：336-344，1987を参照されたい。ガラ
ス表面に使用できる結合方法はシリコン基体にも使用で
きる。これを行うためには、シリコン基体を加熱して表
面層を酸化し、表面にスライドガラスと同様の化学的性
質をもたせる。
【００１８】核酸を金属表面に結合させるために、第一
のシラン化合物（例えばGelestのWAS 7021（Tullytow
n，PA））、次いで第二のシラン化合物（例えば（３−
グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシラン）で表
面を処理することができる。第一のシランコーティング
は金属表面に結合し、第二のシランコーティングは、好
適に修飾された核酸（例えばアミノ化した核酸）を結合
させるための反応基（例えばエポキシ基）を供する。好
ましくは、これら二つのシランコーティングは、最も頻
繁に使用される波長領域で透過性である。
のシラン化合物（例えばGelestのWAS 7021（Tullytow
n，PA））、次いで第二のシラン化合物（例えば（３−
グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシラン）で表
面を処理することができる。第一のシランコーティング
は金属表面に結合し、第二のシランコーティングは、好
適に修飾された核酸（例えばアミノ化した核酸）を結合
させるための反応基（例えばエポキシ基）を供する。好
ましくは、これら二つのシランコーティングは、最も頻
繁に使用される波長領域で透過性である。
【００１９】分析対象タンパク質（例えば細胞表面タン
パク質）を多くの標準的な方法のいずれかによって固相
支持体に結合させることができるが、それらの方法には
直接吸着、または表面上の反応基との化学結合がある。
例えば、固相表面を誘導化して活性アミン基を生成し；
次いでアミン−およびスルフヒドリル−反応性ヘテロ２
官能基クロスリンカー（例えばスクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート、または他のPierce（Rockford、IL）製 Ｄ
ＯＵＢＬＥ−ＡＧＥＮＴTMクロスリンカー）を使用し
て、ポリペプチド中の遊離のシステイン基を固相表面上
のアミノ基に結合させることができる。ホモ２官能基ク
ロスリンカーも同様に使用することができる。
パク質）を多くの標準的な方法のいずれかによって固相
支持体に結合させることができるが、それらの方法には
直接吸着、または表面上の反応基との化学結合がある。
例えば、固相表面を誘導化して活性アミン基を生成し；
次いでアミン−およびスルフヒドリル−反応性ヘテロ２
官能基クロスリンカー（例えばスクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート、または他のPierce（Rockford、IL）製 Ｄ
ＯＵＢＬＥ−ＡＧＥＮＴTMクロスリンカー）を使用し
て、ポリペプチド中の遊離のシステイン基を固相表面上
のアミノ基に結合させることができる。ホモ２官能基ク
ロスリンカーも同様に使用することができる。
【００２０】分析対象は、蛍光色素（例えばフルオレセ
イン、フィコエリトリン、テキサスレッド、またはアロ
フィコシアニン）または蛍光反応を触媒する酵素（例え
ばホースラディッシュペルオキシダーゼ）のような検出
可能な標識成分に（直接または間接的に）共有または非
共有結合させることができる。一例として、分析対象核
酸を蛍光色素に結合させたプローブで標識してもよい；
またホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲ
ートさせた特定の抗体で抗原を標識することができる。
イン、フィコエリトリン、テキサスレッド、またはアロ
フィコシアニン）または蛍光反応を触媒する酵素（例え
ばホースラディッシュペルオキシダーゼ）のような検出
可能な標識成分に（直接または間接的に）共有または非
共有結合させることができる。一例として、分析対象核
酸を蛍光色素に結合させたプローブで標識してもよい；
またホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲ
ートさせた特定の抗体で抗原を標識することができる。
【００２１】
【実施例】以下に記載する実験は、新規蛍光バイオアッ
セイ法の実施態様のいくつかを例証する。
セイ法の実施態様のいくつかを例証する。
【００２２】蛍光で標識された化合物から放射されるシ
グナルの定量は、Vysis，Inc.（Downers Grove、IL）で
開発された広域蛍光イメージングシステムを使用して実
施した。イメージングシステムは、４５０Ｗ キセノン
アークランプ（SLM Instruments Inc.、Champaign Urb
ana、IL）、電荷結合素子検出器（ＣＨ２００、Photome
trics、Tucson、AR）、および通常使用される３つの蛍
光色素−−青にＤＡＰＩ、緑にフルオレセインイソチオ
シアネート（“ＦＩＴＣ”）、および赤にテキサスレッ
ド（“ＴＲＥＤ”）用のフィルターセット（Chroma Tec
hnology、Brattleboro、VT）からなる。イメージングシ
ステムは、Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ７１００
／８０で、イメージング取り込み（acquisition）／分
析ソフトウェア（IpLab、Signal Analytics，Corp.、Vi
enna、VA）を使用して制御した。結果を表１に示す。
グナルの定量は、Vysis，Inc.（Downers Grove、IL）で
開発された広域蛍光イメージングシステムを使用して実
施した。イメージングシステムは、４５０Ｗ キセノン
アークランプ（SLM Instruments Inc.、Champaign Urb
ana、IL）、電荷結合素子検出器（ＣＨ２００、Photome
trics、Tucson、AR）、および通常使用される３つの蛍
光色素−−青にＤＡＰＩ、緑にフルオレセインイソチオ
シアネート（“ＦＩＴＣ”）、および赤にテキサスレッ
ド（“ＴＲＥＤ”）用のフィルターセット（Chroma Tec
hnology、Brattleboro、VT）からなる。イメージングシ
ステムは、Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ７１００
／８０で、イメージング取り込み（acquisition）／分
析ソフトウェア（IpLab、Signal Analytics，Corp.、Vi
enna、VA）を使用して制御した。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】 相対バックグラウンド蛍光スライド 青 緑 赤 入手元 ソーダ石灰ガラス １ １ １ VWR Scientific products 溶融シリカ ０．４３ ０．３８ ０．５９ Haraeus Amersil (Duluth，GA) Ｍ−ＵＧ−２ ０．１１ ０．０８ ０．１６ Schott Mainz 黒色ガラス (ドイツ) Ｍ−ＵＧ−６ ０．１０ ０．０８ ０．１８ Schott Mainz 黒色ガラス (ドイツ) Ｃｒコーティング ０．０４ ０．０３ ０．０９ Nanofilm ソーダ石灰 Ａｌコーティング ０．０５ ０．０３ ０．０９ Nanofilm ソーダ石灰 シリコン ０．２６ ０．０６ ０．１３ Nova Electronic Materials (Richardson，TX) 表１は、一般的に使用されるソーダ石灰スライドガラス
（VWR Scientific Products、West Chester、PA）に対
する未処理の物質の相対バックグラウンド蛍光を表す。
相対バックグラウンド蛍光には光散乱、拡散光、および
フィルターの瑕疵（imperfection）からの寄与がある
が、電子ノイズは全て控除した。結果は、黒色ガラスス
ライドおよび金属でコーティングしたスライドでは、バ
ックグラウンドが溶融シリカに対してそれぞれ４倍およ
び１０倍減少することを示した。
（VWR Scientific Products、West Chester、PA）に対
する未処理の物質の相対バックグラウンド蛍光を表す。
相対バックグラウンド蛍光には光散乱、拡散光、および
フィルターの瑕疵（imperfection）からの寄与がある
が、電子ノイズは全て控除した。結果は、黒色ガラスス
ライドおよび金属でコーティングしたスライドでは、バ
ックグラウンドが溶融シリカに対してそれぞれ４倍およ
び１０倍減少することを示した。
【００２４】別の実験で、フルオレセインコンジュゲー
トビーズ（Flow Cytometry Standards Corp.、Hata Re
y、PR）を一般に使用される抗退色媒体（カタログ番号8
24-28、Flow Cytometry Standards Corp.）と混合し、
スライドとカバーガラスの間に挟んで、蛍光強度を測定
した。イメージの定量分析により、Ｃｒ−コーティング
スライドの総バックグラウンドは通常のガラスのわずか
２１％であることが明らかとなった。総バックグラウン
ドには光散乱、拡散光、およびフィルターの瑕疵だけで
なく、固定媒体およびカバーガラスからの自己蛍光も含
まれる。特に、正味のシグナル強度は２倍であり、これ
は入射光が反射して蛍光体を２度通過し、また、反射し
た蛍光は検出（detection optics）に入らないからであ
る。
トビーズ（Flow Cytometry Standards Corp.、Hata Re
y、PR）を一般に使用される抗退色媒体（カタログ番号8
24-28、Flow Cytometry Standards Corp.）と混合し、
スライドとカバーガラスの間に挟んで、蛍光強度を測定
した。イメージの定量分析により、Ｃｒ−コーティング
スライドの総バックグラウンドは通常のガラスのわずか
２１％であることが明らかとなった。総バックグラウン
ドには光散乱、拡散光、およびフィルターの瑕疵だけで
なく、固定媒体およびカバーガラスからの自己蛍光も含
まれる。特に、正味のシグナル強度は２倍であり、これ
は入射光が反射して蛍光体を２度通過し、また、反射し
た蛍光は検出（detection optics）に入らないからであ
る。
【００２５】別の実験から、新規蛍光アッセイ法を使用
してＤＮＡ複合体分析対象を検出できることが示され
た。この実験では、表１に示すスライド物質をゲノセン
サー系比較ゲノムハイブリダイゼーション（“ｇＣＧ
Ｈ”）のアレイ支持体（すなわちチップ）として使用し
た。ｇＣＧＨの技術は標準的なＣＧＨを改良して開発さ
れたものであり、試料組織由来のＤＮＡを１つの蛍光体
（例えばＴＲＥＤ）で標識し、別の蛍光体（例えばＦＩ
ＴＣ）で標識した等量の参照ＤＮＡと混合し、次いでス
ライドガラスに付着させた分裂中期染色体と共ハイブリ
ダイズさせる。ｇＣＧＨでは、中期染色体の代わりに、
アレイ形式でチップ表面に固定化されたクローン化ＤＮ
Ａフラグメントを使用する。ハイブリダイゼーションの
後、標的のスポットを洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色して
全てのＤＮＡを青色に染色する。次いでスライドを多色
蛍光イメージングシステムで分析する。イメージ分析ソ
フトウェアを用いてＤＡＰＩの蛍光によって標的スポッ
トの存在を測定し、次いで赤色と緑色の蛍光の比率を測
定して試料と対照ＤＮＡのハイブリダイゼーションの相
対量を測定する。
してＤＮＡ複合体分析対象を検出できることが示され
た。この実験では、表１に示すスライド物質をゲノセン
サー系比較ゲノムハイブリダイゼーション（“ｇＣＧ
Ｈ”）のアレイ支持体（すなわちチップ）として使用し
た。ｇＣＧＨの技術は標準的なＣＧＨを改良して開発さ
れたものであり、試料組織由来のＤＮＡを１つの蛍光体
（例えばＴＲＥＤ）で標識し、別の蛍光体（例えばＦＩ
ＴＣ）で標識した等量の参照ＤＮＡと混合し、次いでス
ライドガラスに付着させた分裂中期染色体と共ハイブリ
ダイズさせる。ｇＣＧＨでは、中期染色体の代わりに、
アレイ形式でチップ表面に固定化されたクローン化ＤＮ
Ａフラグメントを使用する。ハイブリダイゼーションの
後、標的のスポットを洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色して
全てのＤＮＡを青色に染色する。次いでスライドを多色
蛍光イメージングシステムで分析する。イメージ分析ソ
フトウェアを用いてＤＡＰＩの蛍光によって標的スポッ
トの存在を測定し、次いで赤色と緑色の蛍光の比率を測
定して試料と対照ＤＮＡのハイブリダイゼーションの相
対量を測定する。
【００２６】Ｃｒ−コーティングスライドガラスはNano
film社製のＣｒ−コーティングガラスで作成した。以下
の段階を実施してＤＮＡを結合させるための金属表面を
調製した。これらの段階はまた、Ａｌ−コーティング表
面のような他の金属表面にも適用できる。要約すれば、
金属表面をシレスキオキサン（silesquioxane）オリゴ
マー（Gelest，Inc.）の２％水溶液で、室温で１０分間
処理し、水で洗浄した。次いで、グリシドオキシプロピ
ルトリメトキシシラン（“ＧＰＴＳ”；Gelest，Inc.）
の５％水溶液を用いて、室温で２時間、シラン処理をし
た。その後第１級アミンをエポキシ基と反応させて、処
理した表面にアミノ化したＤＮＡを結合させた。
film社製のＣｒ−コーティングガラスで作成した。以下
の段階を実施してＤＮＡを結合させるための金属表面を
調製した。これらの段階はまた、Ａｌ−コーティング表
面のような他の金属表面にも適用できる。要約すれば、
金属表面をシレスキオキサン（silesquioxane）オリゴ
マー（Gelest，Inc.）の２％水溶液で、室温で１０分間
処理し、水で洗浄した。次いで、グリシドオキシプロピ
ルトリメトキシシラン（“ＧＰＴＳ”；Gelest，Inc.）
の５％水溶液を用いて、室温で２時間、シラン処理をし
た。その後第１級アミンをエポキシ基と反応させて、処
理した表面にアミノ化したＤＮＡを結合させた。
【００２７】標準的な条件下でＣＯＬＯ ３２０（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”）＃ＣＣＬ−２２０）または
ＨＴＢ−１８（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１８）細胞から抽出
したＤＮＡを実験に使用した。ハイブリダイゼーション
混合液２０μｌ中に、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄで標識
したヒト参照ＤＮＡ（すなわちヒト血液ＤＮＡ）プロー
ブ２００ｎｇ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎで標識し
た被験ＤＮＡプローブ（ＣＯＬＯ３２０またはＨＴＢ−
１８細胞由来）２００ｎｇ、２Ｘ ＳＳＣ、１０％ 硫
酸デキストラン、１μｇ／μｌ Ｃｏｔ１ ＤＮＡ、１
μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘ Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔｓ溶液を含有させた。混合液を３７℃で４時間イ
ンキュベートした後、標的ＤＮＡを固定化させておいた
チップに添加した。
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”）＃ＣＣＬ−２２０）または
ＨＴＢ−１８（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１８）細胞から抽出
したＤＮＡを実験に使用した。ハイブリダイゼーション
混合液２０μｌ中に、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄで標識
したヒト参照ＤＮＡ（すなわちヒト血液ＤＮＡ）プロー
ブ２００ｎｇ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎで標識し
た被験ＤＮＡプローブ（ＣＯＬＯ３２０またはＨＴＢ−
１８細胞由来）２００ｎｇ、２Ｘ ＳＳＣ、１０％ 硫
酸デキストラン、１μｇ／μｌ Ｃｏｔ１ ＤＮＡ、１
μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘ Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔｓ溶液を含有させた。混合液を３７℃で４時間イ
ンキュベートした後、標的ＤＮＡを固定化させておいた
チップに添加した。
【００２８】チップ上でのハイブリダイゼーションは３
７℃で一晩実施した。２Ｘ ＳＳＣを用いて室温で５分
間、２Ｘ ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４
０℃で３０分間、更にその後、２Ｘ ＳＳＣを用いて室
温で１０分間、チップを洗浄した。次いで、チップを暗
所において室温で乾燥した。イメージングに先立ち、１
０μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをチップ上のアレイ部分
に配し、次にこれをカバーガラスで被覆した。積算時間
２０秒でクロムチップをイメージングした。比較のため
に、標準的なエポキシシラン化学を経てＤＮＡをソーダ
石灰ガラスチップ（すなわちスライドガラス）に結合さ
せ、同一条件下でハイブリダイズさせた；そしてガラス
チップを１０秒間イメージングした。結果は、Ｃｒ−コ
ーティングスライドでは総バックグラウンドが４倍より
多く減少することを示した。暗色ガラススライド、シリ
コンスライド、およびＡｌ−コーティングスライドでも
同様の結果が得られた。
７℃で一晩実施した。２Ｘ ＳＳＣを用いて室温で５分
間、２Ｘ ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４
０℃で３０分間、更にその後、２Ｘ ＳＳＣを用いて室
温で１０分間、チップを洗浄した。次いで、チップを暗
所において室温で乾燥した。イメージングに先立ち、１
０μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをチップ上のアレイ部分
に配し、次にこれをカバーガラスで被覆した。積算時間
２０秒でクロムチップをイメージングした。比較のため
に、標準的なエポキシシラン化学を経てＤＮＡをソーダ
石灰ガラスチップ（すなわちスライドガラス）に結合さ
せ、同一条件下でハイブリダイズさせた；そしてガラス
チップを１０秒間イメージングした。結果は、Ｃｒ−コ
ーティングスライドでは総バックグラウンドが４倍より
多く減少することを示した。暗色ガラススライド、シリ
コンスライド、およびＡｌ−コーティングスライドでも
同様の結果が得られた。
【００２９】Ｃｒ−コーティング表面を使用する利点
は、適当なハイブリダイゼーション溶液であれば、クロ
ムの疎水性により、チップ表面から未結合のプローブを
除去するのが非常に容易なことである。適当なハイブリ
ダイゼーション溶液は、クロム表面の疎水性を変化させ
うる界面活性剤を含有しないものであればよい。結果と
して、プローブの非特異的結合による蛍光バックグラウ
ンドは減少するか、あるいは除去されることさえある。
非特異的結合が減少することにより特異的結合に利用可
能なプローブが増加するため、ハイブリダイゼーション
の効率も向上しうる。基体への核酸の結合方法 本発明は、核酸を固相表面に結合させるための迅速で非
常に簡便な方法を提供する。新規結合法では、核酸を基
体表面、例えば金属または半金属表面に非共有結合させ
る。これを行うためには、変性させた核酸を含有する溶
液を基体に適用し、室温またはオーブンで乾燥させる。
溶液のｐＨを約１１．０以上に上げることにより核酸を
変性させることができる。種々のアルカリ物質、例えば
ＮａＯＨ、ＫＯＨなどのようなアルカリ金属またはアル
カリ土類金属の水酸化物を使用して溶液を高ｐＨにする
ことができる。
は、適当なハイブリダイゼーション溶液であれば、クロ
ムの疎水性により、チップ表面から未結合のプローブを
除去するのが非常に容易なことである。適当なハイブリ
ダイゼーション溶液は、クロム表面の疎水性を変化させ
うる界面活性剤を含有しないものであればよい。結果と
して、プローブの非特異的結合による蛍光バックグラウ
ンドは減少するか、あるいは除去されることさえある。
非特異的結合が減少することにより特異的結合に利用可
能なプローブが増加するため、ハイブリダイゼーション
の効率も向上しうる。基体への核酸の結合方法 本発明は、核酸を固相表面に結合させるための迅速で非
常に簡便な方法を提供する。新規結合法では、核酸を基
体表面、例えば金属または半金属表面に非共有結合させ
る。これを行うためには、変性させた核酸を含有する溶
液を基体に適用し、室温またはオーブンで乾燥させる。
溶液のｐＨを約１１．０以上に上げることにより核酸を
変性させることができる。種々のアルカリ物質、例えば
ＮａＯＨ、ＫＯＨなどのようなアルカリ金属またはアル
カリ土類金属の水酸化物を使用して溶液を高ｐＨにする
ことができる。
【００３０】あるいはまた、加熱により、例えば核酸を
含有する溶液を９５℃以上で２〜５分間加熱することに
より、核酸を変性させることができる。次いで、変性さ
せた核酸を含有する溶液を金属または半金属表面に適用
して乾燥させる。
含有する溶液を９５℃以上で２〜５分間加熱することに
より、核酸を変性させることができる。次いで、変性さ
せた核酸を含有する溶液を金属または半金属表面に適用
して乾燥させる。
【００３１】変性した一本鎖核酸に存在する静電力は、
一般に基体へ効率的に結合するのに十分であると考えら
れる。上記の方法は長鎖ポリヌクレオチド（例えば約５
５０ヌクレオチド（“ｎｔ”）より長いもの）について
特に良く機能する。
一般に基体へ効率的に結合するのに十分であると考えら
れる。上記の方法は長鎖ポリヌクレオチド（例えば約５
５０ヌクレオチド（“ｎｔ”）より長いもの）について
特に良く機能する。
【００３２】約５５０ｎｔより短いポリヌクレオチドの
結合を向上するために、基体表面にスポットした核酸
を、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMまたはＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM
均等物のような顕微鏡用固定媒体で処理することができ
る。特定の理論に拘束されることは望まないが、ＧＥＬ
／ＭＯＵＮＴTMはポリマー分子を含有しており、容量排
出剤（volume displacement reagent）として作用し、
基体表面に核酸をより近接させると考えられる。あるい
はまた、この固定剤は核酸を互いにより接近させ、それ
によって基体表面に直接結合していない核酸を捕捉する
核酸のネットワークの形成を促進するのかもしれない。
核酸に対して同様の効果を有する試薬のいずれも使用で
きる。
結合を向上するために、基体表面にスポットした核酸
を、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMまたはＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM
均等物のような顕微鏡用固定媒体で処理することができ
る。特定の理論に拘束されることは望まないが、ＧＥＬ
／ＭＯＵＮＴTMはポリマー分子を含有しており、容量排
出剤（volume displacement reagent）として作用し、
基体表面に核酸をより近接させると考えられる。あるい
はまた、この固定剤は核酸を互いにより接近させ、それ
によって基体表面に直接結合していない核酸を捕捉する
核酸のネットワークの形成を促進するのかもしれない。
核酸に対して同様の効果を有する試薬のいずれも使用で
きる。
【００３３】従来の核酸の結合法では、ほとんどの化学
リンカーが自己蛍光を有するため、バックグラウンド蛍
光が生成されることが知られている。新規結合法では、
そのようなリンカーを使用しないことによりこの問題を
回避する。
リンカーが自己蛍光を有するため、バックグラウンド蛍
光が生成されることが知られている。新規結合法では、
そのようなリンカーを使用しないことによりこの問題を
回避する。
【００３４】一つの実施例では、水または１００ｍＭ
ＮａＯＨに溶解した０．９μｇ／μｌの未修飾かつ未消
化のプラスミドＤＮＡ（６ｋｂ）を未処理のＣｒ−コー
ティングチップ上に手作業でスポットして乾燥した。２
Ｘ ＳＳＣで洗浄した後、ＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴ
TM／ＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩの蛍光シグナルを測定
した。結果は、未変性のＤＮＡ、すなわち水に溶解した
ＤＮＡのスポットは洗い出され；これに対し、変性した
ＤＮＡ、すなわちＮａＯＨ処理したＤＮＡのスポットは
十分結合し、ＮａＯＨ変性条件下で生成した４９ｋｂの
長さのラムダＤＮＡのスポットと同様のＤＡＰＩ強度で
あることを示した。ニックトランスレーション処理をし
たプラスミドプローブを使用し、標準的なハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄条件下で、結合させたＤＮＡへの
特異的ハイブリダイゼーションが観察された。
ＮａＯＨに溶解した０．９μｇ／μｌの未修飾かつ未消
化のプラスミドＤＮＡ（６ｋｂ）を未処理のＣｒ−コー
ティングチップ上に手作業でスポットして乾燥した。２
Ｘ ＳＳＣで洗浄した後、ＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴ
TM／ＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩの蛍光シグナルを測定
した。結果は、未変性のＤＮＡ、すなわち水に溶解した
ＤＮＡのスポットは洗い出され；これに対し、変性した
ＤＮＡ、すなわちＮａＯＨ処理したＤＮＡのスポットは
十分結合し、ＮａＯＨ変性条件下で生成した４９ｋｂの
長さのラムダＤＮＡのスポットと同様のＤＡＰＩ強度で
あることを示した。ニックトランスレーション処理をし
たプラスミドプローブを使用し、標準的なハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄条件下で、結合させたＤＮＡへの
特異的ハイブリダイゼーションが観察された。
【００３５】上記のアルカリ法が短鎖ＤＮＡ分子にも十
分機能するかどうかを試験するために、平均約５００ｎ
ｔの長さである、ＮａＯＨで処理して超音波処理をした
ラムダＤＮＡを、ここに記載したようにＣｒ−コーティ
ングチップにスポットした。２Ｘ ＳＳＣで洗浄した
後、スポットしたＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM／ＤＡ
ＰＩで染色し、蛍光シグナルを測定した。結果は、ＤＮ
Ａが洗浄後もなおチップに結合したままであることを示
した。
分機能するかどうかを試験するために、平均約５００ｎ
ｔの長さである、ＮａＯＨで処理して超音波処理をした
ラムダＤＮＡを、ここに記載したようにＣｒ−コーティ
ングチップにスポットした。２Ｘ ＳＳＣで洗浄した
後、スポットしたＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM／ＤＡ
ＰＩで染色し、蛍光シグナルを測定した。結果は、ＤＮ
Ａが洗浄後もなおチップに結合したままであることを示
した。
【００３６】これらの結果は、新規方法によって得られ
るＤＮＡのＣｒ−またはＡｌ−コーティング表面への結
合が、従来の共有結合法によって得られる結合と同程度
に過酷なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に耐え
ることを示している。
るＤＮＡのＣｒ−またはＡｌ−コーティング表面への結
合が、従来の共有結合法によって得られる結合と同程度
に過酷なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に耐え
ることを示している。
【００３７】別の実施例で、ＤＮＡの結合およびハイブ
リダイゼーションに対するＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理の
効果を試験した。超音波処理した種々の長さ（すなわ
ち、それぞれ４８ｋｂ、２．５ｋｂ、９００ｎｔ、５５
０ｎｔ、４００ｎｔ、および３００ｎｔ）のラムダＤＮ
Ａをこの実験に使用した。
リダイゼーションに対するＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理の
効果を試験した。超音波処理した種々の長さ（すなわ
ち、それぞれ４８ｋｂ、２．５ｋｂ、９００ｎｔ、５５
０ｎｔ、４００ｎｔ、および３００ｎｔ）のラムダＤＮ
Ａをこの実験に使用した。
【００３８】超音波処理したＤＮＡを１００ｍＭ Ｎａ
ＯＨに懸濁して上記のように未処理のクロムチップに結
合させた。次いで１５μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをＤ
ＮＡチップに添加し、室温で１時間インキュベートし
た。チップを２Ｘ ＳＳＣで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し
た。図２に示すデータは、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理に
よりクロムチップへのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡ（例えば
約３００〜４００ｎｔの長さ）の結合が有意に向上する
ことを示している。例えば、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴ TM処理
した３００ｎｔのスポットからの青色ＤＡＰＩシグナル
は、相当するＳＳＣ−処理スポットから生じるものより
７倍高いことが見出された。
ＯＨに懸濁して上記のように未処理のクロムチップに結
合させた。次いで１５μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをＤ
ＮＡチップに添加し、室温で１時間インキュベートし
た。チップを２Ｘ ＳＳＣで洗浄し、ＤＡＰＩで染色し
た。図２に示すデータは、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理に
よりクロムチップへのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡ（例えば
約３００〜４００ｎｔの長さ）の結合が有意に向上する
ことを示している。例えば、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴ TM処理
した３００ｎｔのスポットからの青色ＤＡＰＩシグナル
は、相当するＳＳＣ−処理スポットから生じるものより
７倍高いことが見出された。
【００３９】ハイブリダイゼーションに対するＧＥＬ／
ＭＯＵＮＴTMの効果を試験するために、ＤＮＡチップを
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒｅｅｎで標識したラムダＤＮＡ
２０ｎｇおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｄで標識したラ
ムダＤＮＡ２０ｎｇと共にインキュベートした。３００
ｎｔまたは４００ｎｔの長さの標的ＤＮＡを含むスポッ
トについて、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理チップの蛍光シ
グナルは未処理のチップのものより４〜７倍高かった。
ＭＯＵＮＴTMの効果を試験するために、ＤＮＡチップを
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒｅｅｎで標識したラムダＤＮＡ
２０ｎｇおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｄで標識したラ
ムダＤＮＡ２０ｎｇと共にインキュベートした。３００
ｎｔまたは４００ｎｔの長さの標的ＤＮＡを含むスポッ
トについて、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理チップの蛍光シ
グナルは未処理のチップのものより４〜７倍高かった。
【００４０】本発明について、その詳細な説明と関連し
て記載してきたが、上記の説明は例証を意図するもので
あり、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲
を制限するものではない。
て記載してきたが、上記の説明は例証を意図するもので
あり、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲
を制限するものではない。
【００４１】他の観点、利点、および変更は上記の特許
請求の範囲内のものである。
請求の範囲内のものである。
【図１】図１は、分析対象であるＤＮＡの支持体として
クロムでコーティングしたソーダ石灰スライドガラスを
使用した蛍光アッセイを示す図式である。
クロムでコーティングしたソーダ石灰スライドガラスを
使用した蛍光アッセイを示す図式である。
【図２】図２は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM（耐久水性固定
媒体（permanent aqueous mounting medium）。Biomeda
社（Foster City、CA）製）による処理でクロムチップ
へのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡの結合が向上することを示
すグラフである。Ｙ軸は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMで処理
したＤＮＡスポットから生じるシグナルと、２ＸＳＳＣ
で処理した対照ＤＮＡスポットから生じるシグナルの比
率を示す。
媒体（permanent aqueous mounting medium）。Biomeda
社（Foster City、CA）製）による処理でクロムチップ
へのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡの結合が向上することを示
すグラフである。Ｙ軸は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMで処理
したＤＮＡスポットから生じるシグナルと、２ＸＳＳＣ
で処理した対照ＤＮＡスポットから生じるシグナルの比
率を示す。
１ 基体 ２ クロムフィルム ３ ＤＮＡフラグメント ４ 収集レンズ ５ 液体媒体 ６ カバーガラス ７ ミラー
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０２Ｂ 21/00 Ｇ０２Ｂ 21/00 21/16 21/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 597060357 3100 Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ, Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎ ｏｉｓ 60515−5400，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ディピン・チェ アメリカ合衆国イリノイ州60559，ウエス トモント，デミング・プレイス 217 (72)発明者 イイジャ・バオ アメリカ合衆国イリノイ州60564，ナパー ビル，ウィッシング・ウェル・レーン 1128
Claims (20)
- 【請求項１】 試料中の分析対象を検出する方法であっ
て、 試料に接触する表面を有する不透明ガラス支持体を提供
し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素
で標識されており；蛍光色素を励起させる波長の光を表
面に照射し；そして、 試料中の分析対象の存在の指標として表面から生じる蛍
光放射光を検出する、ことを含んでなる上記方法。 - 【請求項２】 分析対象が、（i）分析対象に特異的に
結合し、かつ（ii）表面に固定化された捕獲プローブを
介して表面に結合している、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 分析対象が核酸である、請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】 試料中の分析対象を検出する方法であっ
て、 試料に接触する反射表面を提供し、ここで分析対象は試
料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；蛍光
色素を励起させる波長の光を表面に照射し；そして、 試料中の分析対象の存在の指標として表面から生じる蛍
光放射光を検出する、ことを含んでなる上記方法。 - 【請求項５】 分析対象が、分析対象に特異的に結合
し、表面に固定化された捕獲プローブを介して反射表面
に結合している、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 分析対象が核酸である、請求項４記載の
方法。 - 【請求項７】 反射表面が金属または半金属表面であ
る、請求項４記載の方法。 - 【請求項８】 金属表面がクロム表面である、請求項７
記載の方法。 - 【請求項９】 金属表面がアルミニウム表面である、請
求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 半金属表面がシリコン表面である、請
求項７記載の方法。 - 【請求項１１】 金属または半金属表面に核酸を結合さ
せる方法であって、核酸を含有する溶液を提供し；溶液
中で核酸を変性させ；溶液を金属または半金属表面に適
用し；そして、 溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合
させる、ことを含んでなる上記方法。 - 【請求項１２】 溶液のｐＨが少なくとも約１１であ
る、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 溶液が水酸化ナトリウムを含有する、
請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 核酸を変性させるに十分な温度および
時間で溶液を加熱することにより核酸を変性させる、請
求項１１記載の方法。 - 【請求項１５】 金属表面がクロム表面である、請求項
１１記載の方法。 - 【請求項１６】 金属表面がアルミニウム表面である、
請求項１１記載の方法。 - 【請求項１７】 半金属表面がシリコン表面である、請
求項１１記載の方法。 - 【請求項１８】 表面への核酸の結合を向上させるため
に金属または半金属表面に顕微鏡用固定媒体を適用する
ことを更に含む、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１９】 顕微鏡用固定媒体がＧＥＬ／ＭＯＵＮ
ＴTMである、請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 励起光をある角度で表面に照射する、
請求項４記載の方法。
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