ITRM970050A1 - 2-amminotetralina otticamente attiva, procedimento per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che la contengono, attive - Google Patents

2-amminotetralina otticamente attiva, procedimento per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che la contengono, attive Download PDF

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ITRM970050A1
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Description

La presente Invenzione riguarda la S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina, un procedimento per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche comprendenti tale composto quale principio attivo.
La S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina, sia sotto forma di base libera che sotto forma di sale farmacologicamente accettabile, esibisce una potente azione terapeutica nel trattamento dello shock settico.
Lo shock settico è una sindrome clinica che può insorgere conseguentemente a gravi infezioni sostenute sia da batteri Gram negativi che da batteri Gram positivi, protozoi e virus ed è caratterizzata da leucocitosi, febbre, tachicardia, ipotensione, insufficienza renale, respiratoria, cardiaca ed epatica. Va tuttavia sottolineato come la gravità dello shock settico sia indipendente dal tipo di microrganismo responsabile della sindrome (Parrillo J. E., Pathogenetic mechanisms of septic shock, N. Engl. J. Med., 328:1471-1477, 1993) e sia piuttosto correlata all’entità della risposta infiammatoria individuale nei confronti dell'agente responsabile dell’insulto tossico.
Benché negli ultimi anni si sia registrato un significativo miglioramento della terapia antibiotica e dei protocolli di intervento nelle unità di terapia intensiva, lo shock continua a rimanere una delle cause importanti di morbilità e mortalità nel paziente ospedalizzato. Si calcola infatti che negli USA sia responsabile di oltre 100.000 decessi annui (Glauser M. P., Zanetti G., Baumgartner J. D., and Cohen J., Septic shock: pathogenesis, Lancet, 338:732-736, 1991).
Lo shock settico trova come momento determinante e qualificante la reazione dell'organismo a prodotti derivanti dalla lisi o dal metabolismo microbico.
Tra queste sostanze, la prima ad essere individuata e la più utilizzata in ricerche sperimentali è il lipopolisaccaride (LPS), presente nella parete di batteri Gram negativi e costituito chimicamente da una porzione polisaccaridica variabile per le varie specie batteriche e da una lipidica (lipide A) costante, rilevabile in forma micellare nel sangue di soggetti setticemici. Se somministrato all’animale, l’LPS è capace di riprodurre tutta la sintomatologia cardiocircolatoria e neurologica riscontrabile nello shock (Olson N. C., Salzer W. L., McCall C. E., Biochemical, physiologlcal and clinical aspects of endotoxemla, Molec. Aspects. Med. 10:511-629, 1988). Quindi ad esso è attribuibile la qualifica di “primum movens” nella catena di eventi che, attraverso l’attivazione della via intrinseca ed estrinseca della cascata coagulativa e la secrezione di citochine di origine prevalentemente macrofaglcaleucocitaria quali TNF, IL-1 e INF-y(Bone R. C., A criticai evaluatlon of new agents for thè treatment of sepsis, J.A.M.A. , 266: 1686-1691, 1991) porta allo scatenamento della sintomatologia clinica.
L’importanza crescente di questa patologia, la sua gravità e gli inadeguati presidi terapeutici oggi disponibili rendono auspicabile la rapida scoperta di nuovi agenti terapeutici atti a contrastarne efficacemente la progressione.
L'approccio metodologico più largamente utilizzato al fine di riuscire a valutare nell'indagine preclinica il possibile effetto protettivo di una sostanza nello shock settico è quello di utilizzare modelli sperimentali di intossicazione da tossina (endo o esotossina), iniettata direttamente nell’animale da laboratorio, o liberata massivamente dalle cellule infettanti inoculate nell’animale.
2-amminotetraline attive nel trattamento dello shock settico sono già note. EP-A-0 730861 i cui insegnamenti sono incorporati per riferimento nella presente descrizione, a nome della stessa richiedente della presente domanda di brevetto, descrive una classe di tali 2-amminotetraline-6,7-sostituite e fra queste in particolare la (R,S)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina (ST 626).
E’ stato ora trovato che l'enantiomero S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina presenta una attività nel trattamento dello shock settico nettamente più potente del racemo (R,S)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina (ST 626).
La S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina può presentarsi sia sotto forma di base libera di formula:
che sotto forma di sale di formula:
in cui X<" >è l’anione monovalente di un acido farmacologicamente accettabile.
Per sale farmacologicamente accettabile della S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina si intende qualsiasi sale di questa con un acido che non dia origine ad indesiderati effetti tossici o collaterali. Tali acidi sono ben noti ai farmacologi ed agli esperti di tecnologia farmaceutica.
Esempi non limitativi di tali sali sono ad esemplo cloruro, bromuro, orotato, aspartato acido, citrato acido, fosfato acido, fumarato e fumarato acido, lattato, maleato e maleato acido, ossalato acido, solfato acido, glucosio fosfato, tartrato e tartrato acido.
Il procedimento per la preparazione della S(-)-2-ammino-6-fluoro- 7-metossitetralina sotto forma di base libera o di sale farmacologicamente accettabile è rappresentato nel seguente schema di reazione:
In cui X' è l'anione monovalente di un acido farmacologicamente accettabile.
il procedimento comprende i seguenti stadi:
(a) Preparare l'anidride 1. sospendendo l'acido L(+)-aspartlco in CF3COOH. aggiungendo l'anidride trifluoroacetica a freddo (per es. -20°C) e poi scaldando cautamente a ricadere sino a reazione completa; tirare poi a secco e lavare ripetutamente il residuo sotto agitazione con solvente organico che non lo sciolga (per es. esano), (b) Condensare l’anidride i. con 2-fluoroanisolo in eccesso (1.5-3 molare) in presenza di AICI3 agitando vigorosamente a caldo (40-60°C) per 40-50 ore. Per agevolare l’agitazione può essere aggiunto un solvente (per es. CH2CI2). Filtrare il solido, trattarlo a freddo (0-8°C) con HC1 con. (per es. 6 M), estrarre la fase acquosa acida con solvente (per es. etere etilico), tirare a secco la fase organica e purificare il prodotto ottenuto 2 per cristallizzazione.
(c) Ridurre l'acido ottenuto 2 sciogliendolo con CF3COOH, raffreddando la soluzione a 0-8°C. aggiungendo trietilsilano in eccesso (per es. 6 molare) e scaldando poi cautamente a ricadere sino a reazione completa (circa 4 ore). Tirare a secco, sciogliere folio residuo con soluzióne acquosa alcalina (pH 10), filtrare via le parti indisciolte, riacidificare (pH 3) ed estrarre il prodotto che precipita con un solvente (ad es. CH2CI2); tirare a secco e purificare per cristallizzazione il prodotto ottenuto 2-(d) Preparare il tetralone 4 da 2 per condensazione mediante reazione di Friedel-Crafts, con PCI5 e AICI3 in un solvente organico anidro inerte come CH2CI2·
(e) Ridurre il tetralone 4 sospendendolo in trifluoruro di boro eterato aggiungendo a 0-8°C trietilsilano in eccesso (rapporto 3-6 molare) e poi lasciando reagire a temperatura ambiente sino a reazione pressoché completa (60-90 ore). Aggiungere una soluzione acquosa alcalina (pH ~ 9) , estrarre con solvente la fase acquosa, tirare a secco e purificare per cristallizzazione il prodotto ottenuto ϋ· (f) Idrolizzare il prodotto 5 con una soluzione acquosa alcalina, estrarre con solvente (per es. etere etilico), tirare a secco, e purificare mediante cristallizzazione la S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossi tetralina g così ottenuta;
(g) per ottenere eventualmente la tetralina salificata 7 (per es. come cloridrato) ridiscogliere il composto g in un opportuno solvente (per es. CH3OH, etere), acidificare con l'acido H<+>X<" >voluto (ad es.
acido cloridrico), tirare a secco ed eventualmente purificare il prodotto per cristallizzazione.
Con riferimento al precedente schema di reazione, viene di seguito illustrata la preparazione del composto secondo l’invenzione sotto forma di cloridrato (Χ<' >= CI<'>)
ESEMPIO
Preparazione della SM2-ftmmino-e-fluoro-7-metngaitgtralina cloridrato fST 1214)
a) Preparazione del'anidride Si-ltrifluoro acetll aspartlca 1
Si sospese acido L(+) aspartico (100 g; 0,75 moli) in acido trifluoroacetlco (300 mL), si mise sotto agitazione e si raffreddò a -20°C con bagno a ghiaccio e sale. Quindi si aggiunse lentamente sotto agitazione, l'anidride trlfluoroacetlca (300 mL; 2,16 moli). Terminata l'aggiunta, si scaldò cautamente a ricadere a 45°C. Si tenne così per una notte. Al termine della reazione si portò completamente a secco all'evaporatore e sul solido residuo si fecero tre lavaggi con esano, sotto agitazione, decantando l’esano ogni volta; poi si tirò di nuovo completamente a secco. Si triturò infine il residuo sotto agitazione con esano-etere etilico, si filtrò e si essiccò sotto vuoto. Si ottenero 150 g del composto J. (resa 95%)
P.F: 140-2°C
[α] = - 40,7° (c = 1% MetOH) analisi: conformi.
D
b) Preparazione del acido S(+) 4-f3-fluoro-4-metossi fenili- 4-oxo-2(N-trifluoroacetil) animino butanoico 2.
Si sospese l’anidride S(-)-trifluoroacetil-aspartica (150 g; 0,712 moli) nel 2-fluoroanisolo (300 mL: 2.67 moli), si mise sotto vigorosa agitazione e poi si aggiunse lentamente a piccole porzioni il cloruro di alluminio anidro (240 g; 1,57 moli). Terminata raggiunta si tenne sotto vigorosa agitazione a 40-45°C per 24 ore. Poi venne aggiunto CH2CI2 anidro ed altri 60 g di AICI3 e la reazione venne tenuta sotto agitazione per altre 48 ore.
Al termine si trattò il residuo solido con 1 litro di CH2CI2, macinandolo sotto agitazione. Il cloruro di metilene contenente il fluoro anisolo in eccesso venne separato. Il solido residuo, filtrato, venne aggiunto a porzioni a 2 litri di HC1 6 M tenuto sotto vigorosa agitazione. Al termine dell'aggiunta si tenne sotto agitazione per 30 minuti. Successivamente la fase acida venne ripetutamente estratta con etere etilico. Le fasi eteree vennero riunite, lavate con acqua, essiccate su Na2S04 anidro e poi tirate a secco. Si ottenne un residuo solido grezzo che venne cristallizzato da AcOEt/esano 1:1. g ottenuti: 188 (resa 78,3%)
P.F.: 113-5°C
[a] = 27,5° (c = 1% MetOH) analisi: conformi.
D
c) Preparazione delucido S(+l-4-(3-fluoro-4-metossifenil)-2-(N-trlfluoro acetllì animino butanoico 3.
II. composto 2. (100 g; 0,297 moli) venne sciolto in acido trifluoroacetico (500 mL). La soluzione venne raffreddata a 0°C e si aggiunse lentamente il trietilsilano (300 mL; 1,89 moli). Terminata raggiunta si portò lentamente all'ebollizione per 4 ore.
Al termine si tirò completamente a secco all’evaporatore e si fecero due lavaggi con etere etilico, tirando a secco ogni volta per eliminare completamente l’acido trifluoroacetico. L’olio residuo venne raffreddato a -20°C con bagno a ghiaccio e sale e poi venne trattato sotto agitazione con una soluzione satura di NaHC03 portata a pH 10 con NaOH 4N. La fase alcalina finale venne cautamente acidificata a 0°C sino a pH = 3 con HCl 6N. Precipitò il prodotto che venne estratto con CH2Cl2 più volte. Gli estratti organici vennero riuniti, lavati con poca acqua, essiccati su Na2S04 anidro e tirati a secco. L'olio residuo venne sciolto in poco acetato di etile e precipitato con esano sotto agitazione. Si lasciò una notte sotto agitazione e poi si filtrò e si essiccò,
g ottenuti: 72 g (resa 75%) -P.F.: 113-5°C
[a] = 11,3° (c = 1% in metanolo) analisi: conformi.
D
d ) Preparazione del Sf-HN-trifluoroacetil) ammino-6-fluoro-7-metossi-1-tetralone 4.
Il composto 2. (70 g; 0,217 moli) venne sciolto in cloruro di metilene anidro, 1400 mL, si raffreddò a 0°C con bagno a ghiaccio e quindi si aggiunse lentamente un po’ alla volta il pentacloruro di fosforo (70 g; 0,336 moli). Terminata raggiunta si tenne sotto agitazione a 0°C per 2 ore circa, quindi si raffreddò a -20°C e si aggiunse a piccole porzioni tricloruro di alluminio (56 g; 0,42 moli). Terminata l’aggiunta si tenne per circa 2 ore a temperatura ambiente e poi si scaldò cautamente all’ebollizione per 6 ore circa. Al termine, si raffreddò a 0°C e si aggiunse, sotto agitazione, un pò alla volta, ghiaccio triturato (circa 300 mL) per distruggere l’eccesso di reattivi. La miscela venne estratta 3 volte con CH2CI2. Le fasi organiche vennero riunite, essiccate su Na2SC>4, e tirate a secco; si ottenne un solido giallastro che venne sciolto con poco acetato di etile e poi riprecipitato con esano,
g ottenuti: 40 (resa 60,4%)
P.F.: 184-185°C
[a] = - 55,4° (c = 1% in metanolo) analisi: conformi.
D
e) Preparazione di Sf-)-2-(N-trifluoro acetil) ammino-6-fluoro-7-metossi tetralina 5.
Il prodotto 4 (40 g; 0, 131 moli) venne sospeso in trifluoruro di boro eterato (340 mL) alla temperatura di 0°C.
Si aggiunse trietilsilano (90 mL; 0,567 moli) a 0°C e si tenne sotto agitazione per circa 4 giorni a temperatura ambiente. Al termine della reazione si aggiunse una soluzione satura di NaHCOa (pH 8-9) e la fase acquosa venne estratta per 4 volte con CH2CI2. Le fasi Organiche riunite vennero lavate con acqua, essiccate su Na2S04 anidro, filtrate e tirate a secco. Il grezzo ottenuto venne ricristallizzato da etere isopropilico.
g ottenuti: 30 (resa 78,63%)
P.F.: 45-7°C
[α ] = - 80° (e = 1% in metanolo) NMR: conforme.
D
f) Preparazione di S(-)-2-ammlno-6-fluoro-7-metossl tetrallna cloridrata fST 1214).
Il prodotto 5. (30 g; 0,103 moli) venne sciolto in metanolo 225 mL e H2O 225 mL contenente K2CO3 (54 g; 0,391 moli).
La soluzione venne tenuta a ricadere sotto agitazione per 3 ore. Il metanolo venne allontanato sotto vuoto e si aggiunsero altri 100 mL di H2O. La fase acquosa venne estratta ripetutamente con CH2CI2. Le fasi organiche vennero riunite, essiccate su Na2S04 anidro, filtrate e tirate a secco. Il solido oleoso così ottenuto venne sciolto in etere etilico, acidificato con HC1 (sol. al 15% in etanolo), ed il solido precipitato venne filtrato e poi ridlsciolto in metanolo, decolorato con carbone attivo, filtrato, concentrato sotto vuoto ed infine cristallizzato da n-propanolo.
La cristallizzazione venne ripetuta 2 volte, ottenendo il composto 7 (con X' = CI").
g ottenuti: 12,6 (resa 52.80%)
La presente Invenzione riguarda inoltre l’uso della S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina, sia sotto forma di base libera che di sale farmacologicamente accettabile, per la preparazione di un medicamento atto al trattamento terapeutico dello shock settico.
Tale medicamento può assumere la forma di una composizione farmaceutica somministrabile per via orale oppure parenterale, il cui principio attivo è costituito dalla S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina base libera o suo sale farmacologicamente accettabile in associazione ad opportuni eccipienti farmacologicamente accettabili la cui scelta risulterà evidente agli esperti di tecnologia farmaceutica.
Mentre la forma di somministrazione orale è adatta alla prevenzione dello shock settico, la composizione atta alla somministrazione parenterale, particolarmente per via endovenosa, è la composizione di scelta per la somministrazione a pazienti in stato di shock settico. .
I test farmacologici che seguono illustrano i risultati ottenuti con il composto dell’invenzione, S(-)-2-amino-6-fluoro-7-metossi-tetralina, sotto forma di cloridrato (ST 1214), in confronto con il composto di riferimento (R,S)-2-ammino-6-fluoro-7-metóssitetralina cloridrato (ST 626) in modelli sperimentali di shock settico. Tali test di confronto evidenziano una ben maggiore efficacia preventiva e terapeutica del composto secondo l'invenzione ST 1214 rispetto al composto noto ST 626. fornendo altresì indicazioni su alcuni possibili meccanismi di azione alla base del favorevole profilo farmacologico della sostanza: drastica riduzione dei livelli ematici e tessutali di TNF e del rilascio serico di NO in concomitanza con un significativo incremento dei livelli della citochina antiinfìammatoria IL- 10.
Valutazione dell’effetto dei composti ST 626 e ST 1214 sulla mortalità indotta da Lipopolisaccaride (LPS di Escherichia coli sierotipo 026:B6 o di Salmonella typhosdì nel topo BALB/c
Animali
Sono stati utilizzati topi maschi inbred BALB/c (Iffa Credo) di circa 7 settimane di età (20-40 animali per gruppo sperimentale).
Procedura sperimentale
Le sostanze ST 626 e ST 1214, solublllzzate in soluzione fisiologica sterile, sono state somministrate endovena alla dose di 6 mg/kg (pari a 1/10 della DL50) 30 minuti prima e 5 minuti dopo il challenge tossico (LPS). Il lipopolisaccaride utilizzato (di Escherichia coli slerotlpo 026 :B6 o di Salmonella typhosa ) è stato disclolto in soluzione fisiologica sterile prima di essere iniettato per via endoperitoneale alla dose di 10 mg/kg (LPS di E. colti e di 23 -mg/kg (LPS di S. typhosa ) in un volume di 0.1 mi per ogni 10 grammi di peso corporeo dell'animale. Gli animali sono stati osservati quotidianamente, per un periodo di 10 giorni, annotando il giorno del decesso di ciascuno.
Risultati
I risultati conseguiti con ST 626 e ST 1214 in questi due modelli di shock endotossico sono riportati nelle Tabelle 1 e 2.
La sostanza ST 626 appare in qualche misura in grado di ridurre la mortalità causata dall'endotossina di E. coli e la mortalità indotta dall'LPS di S. typhosa con un incremento di sopravvivenza degli animali pari rispettivamente al 14% e 40%.
La sostanza ST 1214 risulta più efficace del composto ST 626 inducendo nei modelli di shock con LPS di E. coll e S. typhosa un incremento di sopravvivenza pari rispettivamente al 37% (p<0.002) e 65% (p<0.001).
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Tabella 2 Effetto di somministrazioni endovena di ST 626 e di ST 1214 sulla letalità indotta nel topo<8 >dalla somministrazione di LPS di S. typhosa.
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Valutazione dell effetto dei composti ST 626 e ST 1214 sulla mortalità indotta da lipopolisaccaride (LPS di £. coli sierotipo 026:B6) nel topo BALB/c sensibilizzato con D-galatto samina
Animali
Sono stati utilizzati topi maschi inbred BALB/c (Iffa Credo) di circa 7 settimane di età (28-30 animali per gruppo sperimentale).
Procedura sperimentale
Gli animali sono stati sensibilizzati con D-galattosamina (1000 mg/kg, i.p.), e contemporaneamente hanno ricevuto l'LPS di E. coli (0.05 mg/kg, i.p.), in un volume totale di 200 μΐ. La dose di LPS utilizzata corrisponde a circa una DL80 dell’endotossina nell’animale sensibilizzato con D-galattosamina.
Le sostanze ST 626 e ST 1214 sono state somministrate l.v. in 200 μl di soluzione fisiologica sterile, alla dose di 6 mg/kg corrispondente a circa 1/10 della DL50, 30 minuti prima del challenge. Una successiva somministrazione i.v. delle molecole (alla stessa dose) è stata effettuata 5 minuti dopo l’inoculo della endotossina.
Gli animali sono stati osservati quotidianamente per un periodo di 1 0 giorni, annotando il giorno del. decesso di ciascuno.
RISULTATI
L’incremento di sopravvivenza registrato negli animali trattati con ST 1214 rispetto a quello determinato con ST 626 risulta decisamente superiore (26% vs. 1 1%) (Tab. 3).
Anche nel modello di intossicazione instaurato con endotossina nell’animale sensibilizzato con D-galattosamina, la somministrazione di appare quindi più efficace di ST 626 termini di numero di animali sopravvissuti al challenge tossico.
nitrico indotto da LPS di E. coli in topi BALB/c.
MATERIALI E METODI
Animali
Sono stati utilizzati topi maschi BALB/c (Iffa Credo) di 6-7 settimane di età (5-9 animali per gruppo sperimentale).
Trattamento
L'endotossina di E. coli (LPS sierotipo 026:B6) è stata disciolta in soluzione fisiologica sterile prima dell'utilizzo sperimentale e iniettata per via endoperitoneale (5 mg/kg). Il trattamento con ST 626 e ST 1214 è stato invece effettuato per via endovenosa (8 mg/kg) ai tempi 5' e 30' rispetto al challenge con LPS (tempo 0). Il trattamento con il composto di riferimento Aminoguanidina (20 mg/kg) è stato effettuato per via endoperitoneale seguendo le modalità temporali sopra riportate per ST 626 e ST 1214.
Prelievi ematici
Negli esperimenti effettuati per valutare l'effetto di ST 626 e ST 1214, i prelievi ematici sono stati effettuati 20 ore dopo il challenge con LPS, picco ematico di NOx (Nitriti e Nitrati che sono prodotti-stabili dell’ossido nitrico). Il sangue è stato prelevato dal plesso retroorbitale degli animali, precedentemente anestetizzati con etere, e raccolto in provette eparinate. I campioni sono stati centrifugati a 2000 x g per 10 minuti e il plasma è stato poi congelato a -80°C in attesa del dosaggio di NOx.
Prima del saggio, 1 campioni sono stati diluiti 1:3 in acqua distillata e quindi centrifugati 90' a 4700 x g su filtri Millipore Ultrafree-MC, 10,000 NMWL (Cat. No. UFC3LGC00).
II dosaggio del contenuto di NOx nei campioni è stato effettuato utilizzando il kit commerciale della Cabru [Nttrate/ Nitrite assay Kit, Cat. No. 780001).
Analisi Statistica
La valutazione dei dati ottenuti è stata effettuata utilizzando il test “t” di Student a due code.
RISULTATI
Per quanto concerne la sostanza ST 1214, somministrata ai tempi 5' e 30' rispetto al challenge con LPS, l’entità della riduzione del livelli plasmatici di NOx (38%) è risultata significativa (p<0.01) (Tab. 4). Decisamente di minor rilievo è apparso invece il decremento del livelli circolanti di NOx causato dal trattamento con ST 626 (Tab.
4).
NOx (μΜ) indotti dall'LPS di E. coli in topi BALB/c. Le sostanze sono state somministrate endovena (8 mg/kg) dopo 5 e 30 minuti dall’iniezione endoperitoneale dell’LPS (5 mg/kg). L’Aminoguanidina (AG, composto di riferimento) è stata somministrata (20 mg/kg) per via endoperitoneale secondo le stèsse modalità temporali adottate per le sostanze esaminate.
topi BALB/c iniettati con LPS di Salmonella typhosa.
Animali
Sono stati utilizzati topi maschi BALB/c (Iffa Credo) di 6 settimane di età (6-7 animali per gruppo sperimentale).
Trattamento
L'endotossina (LPS) di S. typhosa è stata disciolta in soluzione fisiologica sterile e Iniettata per via endoperitoneale alla dose di 15 mg/kg. I composti. ST 626 e ST 1214 sono stati anch’essi diluiti in soluzione fisiologica e somministrati per via endovenosa (8 mg/ kg) mediante una doppia somministrazione a -30’ e 5' rispetto al challenge con LPS.
Prelievi ematici
Per gli studi relativi alla cinetica ematica della citochlna, i prelievi sono stati effettuati a vari tempi dopo la somministrazione di LPS. Negli esperimenti condotti per valutare Γ effetto delle sostanze, i prelievi ematici sono stati effettuati 45 e 90 minuti dopo il challenge. Il sangue è stato prelevato dal plèsso retro-orbitale degli animali, precedentemente anestetizzati .mediante breve inalazione con etere. I campioni ematici sono stati incubati 2 ore a T.A e il siero ottenuto è stato poi centrifugato a 2000 x g per 20 minuti prima di esser congelato a -80°C in attesa dei dosaggi di IL- 10.
Saggio della citochina IL- 10
Per il dosaggio di IL- 10 si è utilizzato il kit ELISA della Genzyme seguendo le istruzioni accluse.
L'analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il test di Student a 1 coda.
RISULTATI
I primi esperimenti sono stati condotti per determinare la cinetica del rilascio serico della citochina IL- 10. I dati sperimentali ottenuti hanno indicato che i livelli di IL- IO sono già rilevabili dopo 1 ora dall’iniezione di LPS di S. typhosa. Nelle nostre condizioni sperimentali, i livelli massimali di IL- 10 appaiono in circolo dopo 1.5 ore dal challenge con 15 mg/kg di LPS (Fig 1).
Gli esperimenti successivi sono stati condotti per indagare se i composti ST 626 e ST 1214 risultassero in grado di modulare i livelli di IL- ÌO, a seguito di un protocollo temporale di trattamento degli animali basato sulla somministrazione delle sostanze a -30' e 5' rispetto al challenge (tempo 0).
I dati ottenuti hanno mostrato che il composto ST 1214 era in grado di aumentare di circa 3 volte i livelli di IL- 10 indotti dall’LPS 90' dopo l’iniezione. Al contrario ST 626 non aveva alcun effetto significativo nella modulazione dei livelli circolanti della citochina antinfiammatoria provocati dall'inoculo delTendotossina (Fig. 2). I livelli di IL- 10 dopo 45' dal challenge non risultavano modulati, anche se occorre sottolineare che i valori ottenuti erano al limite della sensibilità del saggio. E' interessante notare che ST 1214 di per sè non aveva alcun effetto modulante diretto sui livelli serici di IL- 10.
E’ pertanto verosimile postulare che gli effetti osservati in seguito al trattamento con ST 1214 siano dovuti alla capacità di questo intracellulari innescati dall’LPS.
in topi BALB/c trattati con LPS di Sahnoneìla typhosa
MATERIALI E METODI
Animali
Sono stati utilizzati topi maschi BALB/c (Iffa Credo) di 5-6 settimane di età (4-7 animali per gruppo sperimentale).
Trattamento
L'endotossina (LPS di S. typhosa ) è stata disciolta in soluzione fisiologica sterile prima della somministrazione per via endoperitoneale di una dose (10 mg/kg) corrispondente a circa una DL80. I composti ST 1214 e ST 626 sono stati parimenti diluiti in soluzione fisiologica prima del trattamento effettuato mediante una doppia somministrazione (8 mg/kg) a -30' e 5' rispetto alla somministrazione di LPS. -Prelievi ematici
I prelievi ematici sono stati effettuati sia 45 che 90 minuti dopo il challenge (picco ematico del TNF). Il sangue è stato prelevato dal plesso retro-orbitale degli animali, precedentemente anestetizzati mediante breve inalazione con etere. I campioni ematici sono stati incubati 2 ore a T.A. e il siero ottenuto è stato poi centrifugato a 2000 x g per 20 minuti prima di esser congelato a -80°C in attesa del dosaggio della citochina.
Saggio per la determinazione del TNF
L'attività biologica del TNF è stata determinata utilizzando le sensibili all'attività citotossica del TNF (V.Ruggiero, C, Chiapparino, S. Manganello, L. Pacello. P. Foresta & E. Arrigoni Martelli. Beneficiai effects of a novel Platlet Activating Factor receptor antagonist, ST 899. on endotoxin-induced shock in mice. SHOCK, 2, 4:275-280, 1994).
In dettaglio, le cellule L929 sono state seminate a una densità di 3.2x105 celi. /mi, in una piastra microtiter a fondo piatto a 96 pozzetti (100 μΐ/pozzetto) in terreno RPMI 1640 contenente 10% di FCS.
Dopo 18 ore di incubazione a 37°C e 5% di CO 2. il terreno di coltura è stato aspirato e ai pozzetti sono stati aggiunti diluizioni seriali del supematanti da saggiare (le diluizioni sono state effettuate in RPMI alTl% di FCS). Infine, a tutti i pozzetti è stata aggiunta, in ragione di 100 μΐ/pòzzetto, Actinomicina-D a una concentrazione finale di 1 μg/ml.
La funzione di questo inibitore della biosintesi degli RNA cellulari è quella di amplificare la sensibilità delle L929 all'effetto citotossico del TNF.
Dopo 18-24 ore di ulteriore incubazione, le cellule sono state colorate con una soluzione così costituita: sodium 3’-[l-[(phenylamino)-carbonyl]-3.4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benzene-sulfonic acid <~ >hydrate (XTT) lmg/ml e phenazine methosulfate (PMS) 125 μΜ preparata al momento (N.W. Roehm, G.H. Rodgers, S.M. Hatfìeld & A.L. Glasebrook. An improved colorimetrie assay for celi proliferation and viability utilizing thè tetrazolium salt XTT. J. Immunol. Meth., 142:257-265, 1991).
della soluzione colorante XTT/PMS.
Al termine della colorazione, sono stati determinati allo spettrofotometro i valori in assorbanza a 450 nm e a 620 nm (lunghezza d'onda di riferimento) di ciascun campione, che sono stati quindi convertiti in unità di TNF, corrispondenti al reciproco della diluizione che determina il 50% di citotossicità delle cellule.
Statistica
L’analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il test di Student a 1 coda.
RISULTATI
Come riportato in Fig. 3, ST 1214 riduce in maniera statisticamente significativa i livelli circolanti di TNF sia a 45 minuti dall’inoculo dell’LPS (p<0.01) sia, soprattutto, a 90 minuti dal challenge endotossico (picco ematico dèi TNF) (p<0.001). -Anche ST 626 modula negativamente i livelli serici di TNF in topi intossicati con LPS, ma in modo meno efficace di quanto osservato con ST 1214 (decremento dell'80% vs. 99%).
Da aggiungere che sia ST 1214 che ST 626 di per sé non hanno alcun effetto modulante sui livelli serici di TNF in topi non trattati con LPS.
somministrati a -30 e 5 minuti rispetto al challenge, sulla produzione di TNF indotta da LPS di S. typhosa (10 mg/kg, i.p.) in topi BALB/c.
Valutazione del effetto di ST 626 e di ST 1214 sui livelli di mRNA per il TNF-alfa in diversi organi di topi trattati con LPS
MATERIALI E METODI
Animali
Sono stati utilizzati topi maschi BALB/c (C. River), di circa cinque settimane di età (4 animali per gruppo sperimentale).
Trattamento e prelievo organi
Il trattamento con ST 626 e ST 1214 è stato effettuato per via endovenosa mediante una doppia somministrazione (8 mg/kg) a -30 minuti e 5 minuti rispetto alla somministrazione di LPS. Quest'ultimo (LPS da S. typhosa} è stato somministrato i.p. ad una dose di 23 mg/kg, corrispondente ad una DL 80.
Gli animali sono stati sacrificati, mediante asfissia con CO2. 45 min. dopo l'inoculo di LPS. Gli organi di interesse (polmone, milza, fegato e rene) sono stati prontamente prelevati, congelati in azoto liquido e conservati a -80°C fino al momento della estrazione dell’RNA Estrazione dell'RNA
E' stata eseguita con il metodo di purificazione mediante centrifugazione su gradiente di cloruro di cesio (J. Sambrook, E.F. Fritsch. T. Maniatis, Molecular Cloning. A Laboratori} ManuaL Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 7.3-7.79, 1989).
Brevemente, gli organi sono stati omogenizzatl in 9.5 mi di una soluzione di guanidina isotiocianato (4 M). Il Usato è stato quindi stratificato su 4 mi di una soluzione di cloruro di cesio (5.7 M) e centrifugato per 24 ore a 174000 kg
Il pellet di RNA così ottenuto è stato risospeso in 300 μΐ di sodio acetato 0.3M pH 6.0 e precipitato con 700 μΐ di etanolo assoluto a -80°C per 24 ore. Il giorno seguente l'RNA è stato centrifugato, essiccato e rlsospeso in un opportuno volume di H2O trattata con dietilpirocarbonato. Allo scopo di migliorare il grado di purezza dei campioni, si è proceduto ad una estrazione con un pari volume di una soluzione 1:1 di Fenolo/ Cloroformio seguita da una con un pari volume di Cloroformio.
URNA così ottenuto è stato nuovamente precipitato con etanolo, essiccato e risospeso in H20 trattata con dietil-pirocarbonato.
La concentrazione di RNA è stata misurata allo spettrofotometro e la sua integrità è stata controllata mediante elettroforesi su gel di agarosio.
Reverse Trans criptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Per la sintesi di cDNA a singola elica è stato utilizzato il kit commerciale della Boheringer Manheim seguendo le istruzioni suggerite dal produttore. Brevemente, a ciascun campione di RNA totale (1 4g) sono state aggiunte circa 20 unità di trascrittasi inversa del virus della mioblastosi aviària e 1.6 μg di un primer oligo-dT in un volume finale di 20 μΐ.
I campioni sono stati quindi incubati per 10 minuti a 25 °C per consentire l'annealing dei primers. La reazione di polimerizzazione è stata eseguita per 2 ore a 42°C e successivamente bloccata denaturando l’enzima a 100°C per 5 minuti.
I campioni, a ciascuno del quali sono stati aggiunti 80 μl di H20, sono stati mantenuti a -20°C fino al momento della amplificazione.
I campioni di cDNA ottenuti con la metodica precedentemente descritta sono stati amplificati utilizzando una coppia di primers specifici per il TNF-α della Clontech seguendo le istruzioni suggerite dal produttore. Brevemente, a 4 μl di ciascun campione sono stati aggiunti 2.5 unità diTaq polimerasi, 0.4 μΜ di primers per il TNF-α e 0.2mM di deossiribonucleotidi. La reazione di amplificazione è stata eseguita per un totale di 30 cicli, ciascuno dei quali costituito dai seguenti step:
Step 1 94°C 45 sec (denaturazione)
Step 2 60°C 45 sec (annealing)
Step 3 72°C 2 min (polimerizzazione).
Al termine dei 30 cicli i campioni sono stati incubati per 7 minuti alla temperatura di 72°C (reazione di allungamento).
I prodotti dell'amplificazione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2% e l'intensità delle bande è stata analizzata mediante un densitometro.
Tutti i campioni sono stati amplificati anche per un gene costitutivo (β-actina) per assicurarsi che le quantità di cDNA amplificate fossero uguali nei diversi campioni.
In ciascuna reazione sono stati inclusi un controllo positivo, un controllo negativo costituito da solo tampone di reazione e infine un campione in cui durante la reazione di sintesi dei cDNA era stata omessa la trascrittasi inversa. Quest’ultimo controllo permette di escludere la presenza di DNA genomico nel campione iniziale di RNA. Sia la sintesi di cDNA che la reazione di amplificazione sono state eseguite con l'apparecchiatura GENEAMP PCR SYSTEM 2400 [Perkin Elmer).
RISULTATI E CONCLUSIONI
In Fig. 4 sono riportati i dati relativi ad una analisi densitometrica delle bande risultanti dall' amplificazione per il TNFa dei cDNA dei diversi campioni. Come si può osservare, in tutti e quattro gli organi (Rene, Milza, Polmone. Fegato) di animali trattati con ST 1214 si riscontra una drastica riduzione dei livelli di mRNA per il TNFa rispetto agli animali sottoposti unicamente al challenge con l’LPS. Il Desametazone. utilizzato come controllo positivo, determina una riduzione dell’mRNA per il TNFa che solo nel fegato risulta essere di maggiore entità rispetto a ST 626. I valori di intensità delle bande sono espressi in unità arbitrarie e sono stati normalizzati rispetto alle espressione di un gene costitutivo (β-actina).
In ciascun esperimento è stato incluso un controllo negativo (Neg), costituito da solo tampone, e uno senza la trascriptasi inversa (-AMV).
Si può quindi affermare che ST 1214 è in grado di interferire nella espressione del TNFa a livello di mRNA in diversi organi e che questa si traduce quindi in una riduzione del rilascio serico di questa citochina.
Anche la molecola ST 626 è in grado di ridurre i livelli di mRNA per il TNFa, ma questa riduzione risulta di minore entità rispetto a quella riscontrata con ST 1214.
800 700 600 500 400 300 200 100
30
25
20
15
10

Claims (1)

  1. in cui X<~ >è l'anione monovalente di un acido farmacologicamente accettabile. 3. Sale secondo la rivendicazione 2, in cui l'anione farmacologicamente accettabile è scelto tra cloruro, bromuro, orotato, aspartato acido, citrato acido, fosfato acido, fumarato e fumarato acido, lattato, maleato e maleato acido, ossalato acido, solfato acido, glucosio fosfato, tartrato e tartrato acido. 4. Uso di un composto della rivendicazione 1, 2 o 3 per preparare un medicamento atto al trattamento dello shock settico. 5. Procedimento per la preparazione della S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossitetralina sotto forma di base libera o di sale farmacologicamente accettabile secondo lo schema di reazione:
    in cui X<~ >è l’anione monovalente di un acido farmacologicamente accettabile, comprendente gli stadi consistenti nel: (a) preparare l’anidride X sospendendo l'acido L(+)-aspartico in CF3COOH, aggiungendo anidride trifluoroacetica a freddo e poi riscaldando a ricadere sino a reazione completa; (b) condensare l'anidride X con 2-fluoroanisolo in eccesso (1,5-3 molare) in presenza di AICI3 a 40-60°C, per 40-50. ottenendo l'acido 2; (c) ridurre l’acido 2. sciogliendolo con CF3COOH, raffreddando la soluzione così ottenuta a 0-8°C, aggiungendo trietilsilano in eccesso e scaldando a ricadere sino a reazione completa ottenendo il composto 3; (d) preparare il tetralone 4. dal composto fi. per condensazione mediante reazione di Friedel-Crafts, con PCI5 e AICI3 in un . solvente organico anidro inerte; _ (e) ridurre il tetralone 4 sospendendolo in trifluoruro di boro eterato e aggiungendo a 0-8°C trietilsilano in eccesso e lasciando reagire a temperatura ambiente sino a reazione completa e aggiungere una soluzione acquosa alcalina, estrarre con solvente la fase acquosa, tirare a secco e purificare per cristallizzazione ottenendo il composto 5. (f) idrolizzare il composto 5. con una soluzione acquosa alcàllna, ottenendo la S(-)-2-ammino-6-fluoro-7-metossi tetralina fi; e (g) eventualmente dlsciogliere il composto fi in un solvente organico, acidificare con l’acido H<+>X<' >desiderato e tirare a secco ottenendo il sale 7. ' ^ 6. Composizione farmaceutica somministrabile per via orale o parenterale per la prevenzione e il trattamento dello shock settico comprendente un composto delle rivendicazioni 1, 2 0 3 come principio attivo ed un eccipiente farmacologicamente accettabile
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