BRPI0808351A2 - Extrato bacteriano para doenças do trato digestivo ou urinário e proesso para sua preparação. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “EXTRATO BACTERIANO PARA DOENÇAS DO TRATO DIGESTIVO OU URINÁRIO E PROCESSO PARA SUA PREPARAÇÃO”.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Este pedido reivindica prioridade ao Pedido U.S. Provisório N2 60/904.787, depositado em 5 de março de 2007, que é incorporado ao presente documento na íntegra para fins de referência.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a extratos de linhagens bacterianas úteis como um tratamento para sintomas tais como doenças do trato digestivo ou urinário, a composições compreendendo os extratos, e a processos para produzir os extratos usando meios que não representem um risco de doenças relacionadas ao príon.

ANTECEDENTES E SUMÁRIO DA

INVENÇÃO

A presente invenção se refere a composições compreendendo extratos bacterianos úteis para o tratamento de sintomas tais como doenças do trato urinário ou digestivo. Os extratos podem compreender lisados bacterianos de culturas escolhidas dentre uma ou mais espécies de Escherichia coli. Em algumas concretizações, os extratos podem compreender uma ou mais espécies escolhidas dentre as seguintes linhagens de E. coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707, e 9708 e I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089. Essas linhagens estão depositadas sob o Tratado de Budapeste. As linhagens indicadas na lista com o número I foram indexadas pela Collection Nationale de Culture des Microorganismes no Institut 5 Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris, França. Todas as outras linhagens foram indexadas pela National Colleetion of Type Cultures, em Londres.

Em algumas concretizações, um extrato é preparado a partir de todas essas linhagens. Em outras ío concretizações, apenas algumas das linhagens são escolhidas. Em algumas concretizações, por exemplo, uma ou mais linhagens são escolhidas do grupo "1" e uma ou mais linhagens são escolhidas do grupo "NCTC".

Em algumas concretizações, uma ou mais das linhagens específicas listadas acima podem ser omitidas, ou substituídas por uma linhagem diferente de E. coli, ou a partir de uma espécie de bactéria diferente.

Os extratos podem ser obtidos por um processo de Iise alcalina após as células serem cultivadas até uma 20 densidade óptica adequada em um meio de cultura. Em algumas concretizações, cada uma das bactérias é cultivada em um meio que não representa um risco de doenças relacionadas ao príon ou um risco de outras doenças que podem ser transmitidas através da ingestão de produtos obtidos por meios baseados em animais. Por 25 exemplo, em algumas concretizações, um meio baseado em vegetal é usado para cultivar as células, tal como um meio baseado em soja. Um meio sintético pode ser usado para crescimento celular em algumas concretizações, ou um meio incluindo extratos biológicos, tal como extrato de levedura e soro equino, que também não apresentam tais riscos de doenças.

Os lisados também podem ser filtrados para

remover ácidos nucléicos e resíduos celulares maiores. Em conseqüência da filtração, em certas concretizações, a quantidade de ácido nucléico presente nos extratos é menor do que 100 μg/mL. Em certas concretizações, compostos insolubilizados, tais ío como resíduos da parede celular e lipossacarídeos insuficientemente degradados (LPS), também são removidos pela filtração. Logo, em algumas concretizações, o extrato resultante compreende componentes moleculares solúveis e não contém quantidades significativas de material insolúvel ou particulado.

Os componentes dos sacarídeos podem ser

preservados nos extratos, incluindo componentes de lipossacarídeos (LPS). Durante o processo de lise, os sacarídeos podem se tomar quimicamente modificados, por exemplo, serem clivados em estruturas menores ou substituídos por outros grupos funcionais.

A racemização dos aminoácidos durante o processo da lise também cria D-aminoácidos a partir dos Laminoácidos de ocorrência natural encontrados nas proteínas naturais. Os D-aminoácidos podem ser benéficos para aumentar o 25 tempo de eficácia dos extratos, uma vez que não são digeridos suficientemente no intestino de mamíferos. Dessa forma, as moléculas antigênicas nos extratos que são quimicamente modificadas durante a lise para conter D-aminoácidos permanecem no corpo do paciente por um tempo maior, permitindo possivelmente uma ação imunoestimulante mais forte.

Embora os extratos bacterianos tenham sido

usados no estado da técnica para estimular o sistema imunológico contra doenças do trato digestivo e urinário, havia a necessidade de padronizar e controlar melhor esses extratos de modo a tomálo mais seguros, mais eficazes e mais duradouros. Por exemplo, 10 pensava-se que os componentes de sacarídeos, incluindo componentes de lipopolissacarídeos potencialmente tóxicos (LPS), deveriam ser removidos dos extratos bacterianos por razões de segurança. (Consulte, por exemplo, a Patente US 5.424.287). No entanto, a presente invenção propõe um processo 15 que resulta em modificações químicas suficientes dos componentes LPS, de modo que os sacarídeos possam ser retidos com segurança. A retenção desses componentes pode melhorar a eficácia, além de proporcionar antígenos adicionais.

Por exemplo, os inventores descobriram que 20 monitorar o pH e o tempo da lise possibilita a degradação suficiente de componentes da parede celular potencialmente alergênicos ou tóxicos. Em contrapartida, as condições de lise anteriores a pHs inferiores ou tempos menores produziram extratos em que os componentes da parede celular e o LPS foram 25 modificados quimicamente a um nível insuficiente. (Consulte, por exemplo, a GB 2 054 374 A). Os extratos resultantes eram alergênicos demais para serem administrados de forma segura aos pacientes. Em geral, os inventores descobriram que os produtos submetidos à lise a um pH muito baixo e/ou a um tempo muito curto apresentaram maior toxicidade, menor extração protéica e menor capacidade de filtragem.

Além disso, a presente invenção cultiva linhagens bacterianas em meios de cultura que não apresentam riscos de doenças, tal como doenças relacionadas ao príon.

O processo de filtração também pode 10 influenciar as propriedades do extrato resultante em alguns casos, como o tamanho de poro do filtro, e algumas vezes, as propriedades químicas da superfície do filtro, alterando o tipo dos materiais que são removidos e retidos. Por exemplo, a presente invenção usa um processo de filtração que retém certos sacarídeos 15 mas remove outros componentes moleculares, tais como ácidos nucléicos.

Dessa forma, a presente invenção proporciona parâmetros que padronizam os extratos bacterianos para ajudar a manter a segurança e eficácia consistentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Diagrama de um sistema de filtração tangencial lenta (TFF) para preparação de extratos bacterianos após a lise das bactérias. O diagrama mostra duas configurações diferentes para os filtros: um modo paralelo, em que todos os 25 filtros operam simultaneamente, e um modo "serpentina", em que os filtros são configurados em série. Figura 2: Atividade dos extratos em um teste de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a uma concentração de biomassa inicial para lise de 12,5 g/l (parte A) e g/l (parte B). (Vide, por exemplo, o Exemplo 5A para mais detalhes).

Figura 3: Atividade dos extratos em um teste PBMS a uma concentração de biomassa inicial para lise de 25 g/l (parte A) e 100 g/l (parte B).

Figura 4: Atividade dos extratos em um teste de ío células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a um tempo de lise de 24 horas (parte A) e 72 horas (parte B).

Figura 5: Efeito da concentração de NaOH durante a lise na atividade de óxido nitroso (NO) dos macrófagos.

Figura 6: Valores médios de CFU (unidade de formação de colônia) em tecidos da bexiga (parte A) e do rim (parte B) para diferentes grupos experimentais.

Figura 7: Registros de morte nos grupos experimentais durante o período de 21 dias após a infecção com IO4 CFU de Salmonella typhimurium.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Extrato: Um extrato, conforme definido na presente invenção, refere-se a um material obtido após a lise de uma ou mais linhagens bacterianas. Em alguns casos, o extrato é obtido de apenas uma linhagem, enquanto em outros, o extrato é uma mistura de extratos de diversas linhagens diferentes.

Lise alcalina: Trata-se de um método pra submeter as células bacterianas à lise sob condições básicas, tal como pelo uso de uma base orgânica ou inorgânica.

Lisado: Um extrato de bactérias obtido de um procedimento de lise celular.

Filtração: O processo de filtração, conforme definido na presente invenção, refere-se à passagem de um 10 extrato, ou mistura de extratos, através de um ou mais filtros, tais como microfiltros (isto é, microfiltração) ou ultrafiltros (isto é, ultrafiltração). Tal filtração pode não remover necessariamente 100% dos componentes aos quais ela se destina a remover. Em alguns casos, a filtração é repetida em vários passos ou ciclos.

pH inicial: Esse termo significa o pH medido no

início de um procedimento, tal como lise bacteriana ou filtração.

Sacarídeos: Um sacarídeo, conforme definido na presente invenção, inclui monossacarídeos, dissacarídeos, bem como sacarídeos maiores, tais como polissacarídeos lineares e 20 ramificados. Os sacarídeos também incluem sacarídeos quimicamente modificados ou substituídos, tais como lipopolissacarídeos (LPS) e suas variantes quimicamente modificadas.

D-aminoácidos: Esse termo se refere a aminoácidos que existem em formas isométricas destrarrotatórias, em oposição aos L-aminoácidos produzidos biossinteticamente, que existem em formas isoméricas levorrotatórias.

Racemização: Esse termo indica a modificação química pelo menos parcial dos L-aminoácidos em Daminoácidos.

O meio que evita o risco de doenças relacionadas ao príon significa um meio de cultura usado em qualquer estágio da preparação dos extratos, que não compreende materiais como soro ou extratos de carne obtidos de animais, 10 como vacas ou ovelhas, de qualquer outro animal que possa transmitir doenças relacionadas ao príon. Exemplos de tais meios incluem meios definidos quimicamente por via sintética ou baseados em vegetais, e também meios que utilizam soro equino ou meios que compreendem materiais obtidos de espécies de 15 animais que não transmitem doenças relacionadas ao príon. Exemplos de doenças relacionadas ao príon incluem, por exemplo, doença da vaca louca, "scrapie", e a doença de Creutzfeld-Jacob.

Um meio não-animal é um meio que não inclui componentes derivados de animais. Exemplos incluem um meio baseado em vegetal (isto é, vegetal), tal como um meio de soja, e um meio sintético.

O tratamento, conforme usado na presente invenção, refere-se tanto ao tratamento das infecções atuais e de outras condições, por exemplo, bem como à prevenção ou proteção do desenvolvimento de novas infecções, por exemplo. O termo paciente, conforme usado na presente invenção, refere-se a qualquer paciente animal, incluindo pacientes mamíferos, como mamíferos humanos e domésticos.

Entende-se que as linhagens bacterianas 5 específicas identificadas na presente invenção e usadas na invenção podem incluir a linhagem obtida do depósito original citado na presente invenção ou de um clone genético da mesma, incluindo uma linhagem que foi redepositada em um momento posterior com um nome de código de depósito diferente, mas que 10 é considerado geneticamente como sendo a mesma linhagem que a versão originalmente depositada.

Todos os números usados na presente invenção são aproximações, levando em conta erros intrínsecos em sua medição, arredondamento e figuras significativas.

Preparação dos Extratos

Os extratos bacterianos da presente invenção podem ser preparados por fermentação, seguido de inativação térmica, concentração e coleta e biomassa, lise alcalina da biomassa bacteriana única ou lise alcalina de misturas de 20 biomassa bacteriana sob condições definidas. Os lisados alcalinos sob condições diferentes podem ser misturados antes da purificação por filtração. O filtrato obtido pode ser adicionalmente purificado, tal como para remover a matéria particulada, e também pode ser liofilizado e/ou formulado.

Para cada linhagem, para obter uma quantidade

suficiente de material, as culturas de fermentação podem ser iniciadas a partir de um lote-semente de trabalho, seguido de inoculação em recipientes de fermentação maiores.

Os meios usados podem ser os mesmos para cada espécie. No entanto, fatores de crescimento suplementares podem ser introduzidos para melhorar o crescimento de algumas espécies. Em algumas concretizações, utiliza-se um meio que evita o risco de doenças relacionadas ao príon para o cultivo de pelo menos algumas das linhagens ou para todas elas. Exemplos incluem meios não-animais, tal como um meio baseado em vegetal e meios sintéticos. Outros exemplos incluem um meio que inclui soro equino ou outro extrato de animal, que é obtido de uma espécie de animal que não apresenta um risco de doenças relacionadas ao príon, em oposição às linhagens cultivadas na presença de soro bovino ou extratos de carne que podem apresentar tais riscos.

Em algumas concretizações, a fermentação pode iniciar com uma pequena cultura, tal como 0,1 a 1,0 litro, incubada por cerca de 3 a 6 horas a 30-40°C, tal como 37°C, para obter uma densidade óptica (OD) a 700 nm de 3,0 a 5,0 Após uma 20 etapa de cultura em pequena escala, culturas adicionais em um ou em uma série de fermentadores maiores podem ser realizadas a 30°C a 40°C por uma duração de 3 horas a 20 horas, tal como por 3-10 horas, ou 8 horas.

Após a fermentação, a biomassa de cada linhagem ou de um conjunto de linhagens pode ser inativada por um tratamento térmico, concentrada e congelada. Após descongelar as biomassas congeladas, a suspensão bacteriana pode então ser diluída e alcalinizada para causar a lise das células bacterianas com uma solução concentrada de íons hidróxido, tal como de NaOH. Em algumas concretizações, cerca de 10 a cerca 5 de 120 g/L de peso seco bacteriano de uma ou de uma mistura de linhagens são submetidos à lise, tal como de cerca de 15 a cerca de 80 g/L, ou de cerca de 15 a cerca de 35 g/L, tal como 15, 20, 25, 30 ou 35 g/L. Em algumas concretizações, cerca de 40 a cerca de 80 g/L são submetidos à lise, tal como 40, 50, 60, 70 ou 80 g/L ío (a concentração em peso seco bacteriana" é definida pela quantidade de biomassa seca por litro de lise. A concentração em peso seco é medida secando 5 mL de material em uma pequena cápsula de porcelana a 105°C até atingir uma massa constante, registrando então a massa em gramas por litro). Em algumas 15 concretizações, utiliza-se uma concentração de base forte de 0,01 N a 1,2 N, tal como, de 0,10 N a 1,1 N, ou de 0,10 N a 0,65 N, ou de 0,10 N a 0,4 N, ou uma faixa iniciando ou terminando a partir de 0,1, 0,2, 0,3 ou 0,4 N, ou a partir de 0,6 N a 1,1 N ou uma faixa iniciando ou terminando de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ou 1,1 N, ou 20 utiliza-se uma concentração de base de modo a atingir um pH inicial de 12 ou superior, ou um pH maior do que 12, um pH maior do que 12 e menor do que 13,5, tal como maior do que

12,5, maior do que 12,6, maior do que 12,8, ou a partir do pH 12,6 ao pH 13,4. O pH durante a lise pode diminuir quando da extração dos compostos solubilizados. Dessa forma, o pH pode ser ajustado durante o procedimento. A temperatura de lise pode variar de 30 a 60°C, tal como de 35 a 40°C, tal como 37°C. O tempo de lise pode variar de 20 horas a vários dias, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias, ou de 30 a 120 horas, ou de 30 a 50 horas, tal como 30, 35, 40, 45 ou 50 horas, ou de 60 a 120 horas, tal 5 como 60, 72, 84, 96, 108 ou 120 horas. Os extratos podem ser então retomados a um pH inferior, misturados juntos conforme desejado e filtrados.

Após a lise, o peso seco solubilizado pode ser de 20 a 180 mg/mL. (O peso seco solubilizado é determinado pelo ío mesmo método que o peso seco bacteriano descrito acima e pode, como alternativa, ser relatado em unidades de mg/g, presumindo que a densidade do lisado solúvel seja lg/mL). A concentração protéica restante medida pelo método de Lowry pode ser de 8 a 75 mg/mL, tal como de 10 a 70 mg/mL, 20 a 60 mg/mL, ou uma faixa iniciando ou terminando a partir de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 70 mg/mL. A concentração de sacarídeos medida pelo método de antrona para açúcar redutor total, após a lise de uma mistura de linhagens, pode ser de 0,8 a 4 mg/mL, tal como de 1 a 3,5 mg/mL, 1,2 a 3 mg/mL, ou uma faixa iniciando ou terminando a partir de 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 ou 4 mg/mL.

A lise pode ser realizada em apenas uma linhagem por vez, ou em uma mistura de todas as linhagens desejadas. Por exemplo, um extrato misturado pode ser obtido pela mistura, por exemplo, de dois ou mais lisados bacterianos. 25 Cada lisado pode conter 10 g/L de peso seco de biomassa a 90 g/L, tal como 15-85 g/L, ou 20-80 g/L, ou 25-75g/L, ou 30-70 g/L, ou 35-65 g/L ou 40-60 g/L, ou 15-35 g/L, ou 40-80 g/L. Cada lisado pode compreender, por exemplo, de cerca de 20% a 80% do extrato total em volume. As proporções de volume da mistura dos lisados podem ser, por exemplo, de 25%-75%, ou 5 75%-25%, 70%-30%, ou 30%-70%, ou 60%-40%, ou 40%-60%, ou 50-50%.

Os lisados podem então ser purificados por centrifugação e/ou filtração. Por exemplo, os lisados podem ser centrifugados à gravidade de 900 x, seguido de uma ou mais 10 sessões de filtração em um filtro de 0,2 mícron, que pode ser usado para purificar o extrato. Em alguns casos, pode-se utilizar sessões sucessivas de filtração em filtros de poros maiores pela filtração em um filtro de 0,2 mícron. Métodos de ultrafiltração também podem ser empregados de modo a ajudar a extrair os 15 materiais solúveis do extrato, por exemplo, recirculando o permeado da ultrafiltração para microfiltração adicional.

Em algumas concretizações, um método de filtração de fluxo tangencial (TFF) pode ser usado para filtrar os extratos e extrair moléculas solubilizadas de resíduos celulares 20 maiores. (Vide a Figura 1). (Consulte, por exemplo, por exemplo, Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson, Editor, lnterpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., p.126 a 135 - ISBN:0-935184-72-4.) No começo de tal processo TFF, um lisado bacteriano diluído 25 pode ser armazenado em um primeiro tanque. Um ciclo de microfiltração (MF) é iniciado, e o produto é bombeado e o retentado da MF resultante é reciclado, ao passo que o permeado da MF é transferido a um segundo tanque.

Após atingir um nível adequado de concentração, inicia-se um ciclo de ultrafiltração (UF). O 5 permeado da UF pode ser recirculado de volta para o primeiro tanque para extração contínua dos compostos solubilizados a partir do lisado, enquanto que o retentado da UF pode ser armazenado no segundo tanque. Durante a extração contínua, os volumes nos tanques 1 e 2 podem ser ajustados mediante a 10 regulagem das taxas de fluxo dos permeados de microfiltração e ultrafiltração.

Vários desses ciclos de extração podem ser realizados, tanto com o TTF como com outro método de filtração. Nas concretizações que usam a TTF, ao final do último ciclo, o 15 ciclo de ultrafiltração pode ser interrompido e o ciclo de microfiltração pode ser realizado sozinho e o permeado da MF transferido para o tanque 2.

O ciclo de microfiltração pode ser equipado com filtros de 1,2 mícron a 0,1 mícron, tais como filtros de 0,65 a 20 0,2 mícron ou 0,45 mícron. O fluxo cruzado pode estar entre 1000 Litros/horas m2 (LHM) e 3000 LHM, tal como entre 1500 e 2500 LHM, ou 2000 LHM com uma pressão de transmembrana (TMP) de 0,6 a 2 bar, tal como entre 0,8 e 1,5 bar, ou 1,0 bar. O ciclo de ultrafiltração pode ser provido de filtros a partir de 10 KDa a 25 1000 KDa, tal como de 10 KDa a 100 KDa, ou de 10 KDa a 30 KDa, ou de 30 KDa a 100 KDa. O fluxo cruzado pode estar entre 30 LHM e 1000 LHM, tal como entre 20 e 500 LHM com uma TMP de 0,2 a 1,5 bar, tal como entre 0,4 e 1,2 bar, ou 0,5 bar.

Pode-se utilizar entre 5 a 20 volumes de diafiltração para extrair os compostos solubilizados das paredes 5 da célula bacteriana. Em algumas concretizações, utilizam-se entre 8 e 15 volumes. Portanto, por exemplo, em algumas concretizações, pode-se utilizar entre 5 e 15 ciclos de filtração, em alguns casos, entre 8 e 15 ciclos, tal como 8, 9. 10, 11 , 12, 13,

14 ou 15 ciclos.

ío Após a filtração, o extrato pode ser

adicionalmente concentrado ou centrifugado, se desejado. Por exemplo, pode-se realizar uma microfiltração adicional usando um filtro de poros menores, tal como um filtro de 0,2 mícron. Após a filtração, o rendimento das proteínas solubilizadas medido 15 por Lowry pode ser de 50 a 90% ou mais de 60%. Após a filtração, o extrato pode ser liofilizado antes de formulá-lo para uso.

Em algumas concretizações da invenção, uma seleção das condições da lise pode ser realizada de modo a obter 20 uma lise "forte" ou "moderada". Por exemplo, em algumas concretizações, pode-se obter uma lise forte através da lise a partir de cerca de 15 a cerca de 35 g/L em peso seco bacteriano, tal como 15, 20, 25, 30 e 35 g/L ou faixas menores delimitadas por essas concentrações (por exemplo, 15-20, 20-25, 20-30, etc.), com 25 0,6 a 1,1 N de íon hidróxido, tal como 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1 N ou faixas menores delimitadas por essas concentrações por 60 a 120 horas, tal como 60, 70, 80, 90, 100, IlOe 120 horas ou faixas menores delimitadas por esses tempos, a 30-40°C, tal como 35-40 °C, 30- 35 0C ou 37 0C. Dessa forma, como usado na presente invenção, uma lise "forte" envolve o uso da concentração em peso 5 seco bacteriana, concentração de íon hidróxido, tempo, e temperatura, todos dentro das faixas mais amplas acima. Em outras concretização, pode-se obter uma lise moderada mediante a lise a partir de cerca de 40 a cerca de 80 g/L em peso seco bacteriano (por exemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80) com ío 0,1 a 0,4 N de íon hidróxido (isto é, 0,1, 0,2, 0,3, ou 0,4) por 30 a 50 horas (por exemplo, 30, 35, 40, 45 ou 50 horas) a 30-40°C, tal como 35-40°C, 30-35°C ou 37°C. Portanto, como usado na presente invenção, uma lise "moderada" envolve o uso da concentração em peso seco bacteriana, concentração de íon 15 hidróxido, tempo, e temperatura, todos dentro das faixas mais amplas acima. Em algumas concretizações, uma mistura de dois lisados bacterianos, tal como um lisado forte e moderado, como descrito acima, pode ser preparada, tal como uma mistura de 10% a 90%, uma mistura de 20/80, 25/75, 35/65, 50/50 em volume. 20 (Vide, por exemplo, os exemplos 8 e 9 abaixo). Em algumas concretizações, todas as linhagens a serem usadas no extrato podem estar sujeitas tanto a uma lise forte quanto moderada, seguido da mistura dos lisados resultantes. Ou, como alternativa, algumas linhagens podem estar sujeitas a uma lise forte, enquanto 25 outras são sujeitas a uma lise moderada. A filtração desses lisados pode ocorrer antes ou após a mistura, por exemplo, pelo método TFF através de um ciclo de MF com um filtro de 0,65 a 0,2 mícron, tal como um filtro de 0,6, 0,55, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3 ou 0,25 micron e ciclo UF com um filtro de 10 ou 30 KDa, para um total de 8 a 15 ciclos, tal como 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, ou 15 5 ciclos. Uma vez preparados, os extratos da presente invenção podem ser purificados para remover a matéria particulada.

Propriedades Químicas dos Extratos

Bacterianos

Algumas concretizações de acordo com a ío presente invenção podem conter, por exemplo, 5-75 mg/mL de proteínas ou 10-65 mg/mL ou 20-45 mg/mL, ou 5-40 mg/mL, ou 5-20 mg/mL, de proteínas ou uma faixa iniciando ou terminando em 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 75 mg/mL; 1,5 a 2,5 mg/mL de aminoácidos livres (A.A.), ou 1,5 a 2 mg/mL, ou 2 a 2,5 mg/mL de A.A. livres, ou uma faixa iniciando ou terminando em 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1 , 2,2, 2,3, 2,4, ou 2,5 mg/mL de A.A. livres, calculada a partir de ácido glutâmico (147,1 g/mol); e 0,3 a 4,5 mg/mL de polissacarídeos e monossacarídeos, ou 0,3 a 4 mg/mL, ou 0,4 a 4 mg/mL, ou 0,5 a 3,5 mg/mL, ou 0,6 a 3 mg/mL ou 0,3 a 1 mg/mL ou uma faixa iniciando ou terminando em 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,

1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, ou 4,5 mg/mL de polissacarídeos e monossacarídeos. Por exemplo, algumas concretizações contêm de 5 a 9 mg/mL de proteínas, 2 mg/mL de aminoácidos livres (A.A.), calculados a partir de ácido glutâmico (147,1 g/mol) e/ou cerca de 0,3 a 0,6 mg/mL de polissacarídeos e monossacarídeos. Em algumas concretizações, a concentração dos equivalentes de LPS baseada em um teste cromogênico de lisado de amebóticos de límulo (LAL) é menor do que 5000 ng/mL, ou menor do que 2000 ng/mL, ou menor do que 1000 ng/mL, ou 5 menor do que 750 ng/mL, ou menor do que 500 ng/mL, ou menor do que 200 ng/mL, ou menor do que 100 ng/mL.

A lise das bactérias de acordo com a presente invenção pode resultar na hidrólise parcial dos compostos anfifílicos, tais como lipopolissacarídeos e lipopeptídeos. A lise ío das bactérias de acordo com a presente invenção também pode resultar na hidrólise parcial das proteínas, bem como na desaminação, desamidação e racemização parcial dos aminoácidos de L a D. Em um estudo analítico de um extrato de acordo com a invenção, após a hidrólise HCI total do extrato e a derivatização dos aminoácidos, picos de cromatografia em fase gasosa representando o ácido D-aspártico e a D-asparagina, ácido D-glutâmico e D-glutamina, D-serina, D-metionina, D-histidina, D-aianina, D-arginina, D-fenilalanina, D-tirosina, D-leucina, Dlisina, D-valina, D-treonina foram observados. A porcentagem de D-aminoácidos dessas espécies neste estudo variou de 3% a 80%. Portanto, algumas concretizações da invenção permitem a racemização de um ou mais dentre serina, metionina, ácido aspártico e asparagina, treonina, histidina, alanina, arginina, tirosina, fenilalanina, leucina e lisina, tal como todos os aminoácidos anteriores, ou qualquer seleção de mais de um, mas menos do que todos os aminoácidos anteriores, tal como, por exemplo, serina, ácido asparático, asparagina, alanina, fenilalanina, tirosina e lisina, ou uma seleção desses aminoácidos. Em algumas concretizações, pelo menos 10% de um ou mais dos aminoácidos anteriores pode se tomar racemizado de L a D. Em 5 outras concretizações, pelo menos 30% de um ou mais dos aminoácidos anteriores pode se tomar racemizado.

Atividades Biológicas dos Extratos Bacterianos Os extratos de acordo com a invenção podem ser eficazes no tratamento de pacientes que sofrem de ou que ío estejam sob risco de desenvolver doenças do trato urinário ou digestivo, tal como infecções do trato digestivo e urinário. Os extratos de acordo com a invenção podem ser eficazes na prevenção de infecções recorrentes do trato urinário. Exemplos de doenças que podem ser tratados pelos extratos da invenção incluem E. coli e outras infecções bacterianas, uretrite, nefrite túbulo-intersticial, pielonefrite obstrutiva, infecções do trato urinário devido à uropatia obstrutiva e de refluxo, cistite, incluindo cistite crônica, prostatite, incluindo prostatite crônica, prostatocistite, doenças inflamatórias pélvicas em mulheres, doença de Crohn e síndrome do intestino irritável.

A atividade biológica dos extratos pode ser determinadas por diversos ensaios. Por exemplo, um ensaio de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) testa a produção da citocina IL-6 a partir das PBMCs e pode examinar a 25 capacidade de um extrato em estimular o sistema imunológico. Por exemplo, em algumas concretizações, a concentração in vitro de IL-6 medida em sobrenadantes de PBMCs estimuladas com os extratos da invenção variaram de 2000 pg/mL a 70.000 pg/mL, 2000 pg/mL a 50.000 pg/mL, 2000 pg/mL a 30.000 pg/mL, 2000 pg/mL a 20.000 pg/mL, 2000 pg/mL a 10.000 pg/mL, ou 5000 5 pg/mL a 70.000 pg/mL, 5000 pg/mL a 50.000 pg/mL, 5000 pg/mL a 30.000 pg/mL, 5000 pg/mL a 25.000 pg/mL, ou 5000 pg/mL a 10.000 pg/mL, ou 15.000 pg/mL a 25.000 pg/mL. Quando o LPS foi usado como um controle agonista (a 0,01 μg/mL), os valores obtidos variaram, dependendo dos doadores, ío de 5,000 pg/mL a 70,000 pg/mL.

Um teste de óxido nítrico murino (NO) mede a produção de NO por macrófagos murinos, o que também indica a estimulação imunológica. Por exemplo, os macrófagos produzem NO de modo a matar as bactérias invasoras. Em algumas

concretizações, a atividade de óxido nitroso (NO) in vitro para as concretizações da presente invenção testada a concentrações variando de 0,001 mg/mL a 10 mg/mL de peso seco solúvel proporcionou respostas máximas variando de 3 μΜ a 100 μΜ de óxido nítrico, ou 3 μΜ a 90 μΜ, 3μΜ a 80 μΜ, 3 μΜ a 70 μΜ, 3 20 μΜ a 60 μΜ, 3 μΜ a 50 μΜ, 3 μΜ a 40 μΜ, 3 μΜ a 30 μΜ, 3 μΜ a 20 μΜ, 3 μΜ a 10 μΜ, ou 5 μΜ a 80 μΜ, 5 μΜ a 60 μΜ, 5 μΜ a 40 μΜ, 5 μΜ a 20 μΜ, ou 10 μΜ a 80 μΜ, 10 μΜ a 70 μΜ, 10 μΜ a 50 μΜ, 10 a 30 μΜ, ou 10 μΜ a 15 μΜ, ou faixas iniciando ou terminando em 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 25 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 μΜ. As atividades observadas nas células mononucleares do sangue periférico humano e nos macrófagos murinos in vitro podem depender de variáveis, tal como a quantidade de peso seco bacteriano a ser submetido à lise, isto é, 5 o "material inicial" para a lise, a duração da lise alcalina, e a porcentagem inicial de NaOH ou o pH inicial usado na lise.

A combinação de testes de atividade in vitro, tal como PBMC e NO, com a determinação da concentração de LPS, tal como por LAL, também pode fornecer informações relativas ao balanço de atividade vs. o risco de toxicidade para um dado extrato bacteriano.

As atividades observadas in vitro em animais em modelos de infecção mostram que algumas concretizações da presente invenção possuem um efeito protetor. Vide, por 15 exemplo, o exemplo 9, ilustrando o tratamento repetido de animais com extratos exemplificativos de acordo com a invenção. Em um modelo in vivo de infecção do trato urinário com E. coli (exemplo 8), os animais que receberam administrações orais repetidas por prevenção de extratos exemplificativos de acordo 20 com a invenção exibem uma quantidade menor de bactérias no trato urinário (bexiga e rins).

Por exemplo, a taxa de sobrevivência 13 dias após o desafio de pelo menos 8 camundongos insensíveis ao LPS com a linhagem de E. coli uropatogênica 1677 é de pelo menos 60% quando esses camundongos são primeiramente tratados por dias com quantidades eficazes de algumas concretizações da presente invenção. A dose de E. coli uropatogênico para o desafio pode ser escolhida de modo que os camundongos não-tratados, ou os camundongos tratados com um controle de água ou formulação em branco contendo excipientes, mas sem extrato, tenham uma 5 taxa de sobrevivência de 60% ou menor, tal como 50% ou menos. Em alguns casos, a taxa de sobrevivência dos camundongos tratados com as concretizações da presente invenção em tal modelo é de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%.

Como outro exemplo, a taxa de sobrevivência

13 dias após o desafio de pelo menos 8 camundongos tendo sensibilidade ao LPS tipo selvagem com Salmonella thyphimurium é de pelo menos 60% quando esses camundongos são primeiramente tratados por 10 dias com quantidades eficazes 15 de algumas concretizações da presente invenção. A dose de Salmonella thyphimurium para o desafio pode ser escolhida de modo que os camundongos não-tratados, ou os camundongos tratados com um controle de água ou formulação em branco contendo excipientes, mas sem extrato, tenham uma taxa de 20 sobrevivência de 60% ou menor, tal como 50% ou menos. Em alguns casos, a taxa de sobrevivência para os camundongos tratados com extrato é de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%.

Composições Compreendendo os Extratos

Bacterianos Um extrato de acordo com a invenção pode ser formulado de diversas formas diferentes para administração eventual. Por exemplo, tabletes orais, cápsulas e pílulas podem ser preparados, bem como formulações líquidas ou aerossóis.

Formulações para infusão ou injeção também podem ser preparadas.

As concretizações da presente invenção podem ser formuladas, por exemplo, como formas de dosagem sólidas ou formas de dosagem líquidas. Exemplos de formas de dosagem sólidas incluem, por exemplo, um tablete, por exemplo, um tablete revestido, tablete mastigável, tablete efervescente, tablete sublingual, pó ou uma cápsula) contendo o extrato, e, como opção, um ou mais suplementos nutricionais e/ou dietéticos. As formas de dosagem sólidas também podem conter diluentes, enchimentos e/ou outros excipientes. Outros componentes de excipientes podem ser adicionais, tais como conservantes, corantes, aromatizantes e edulcorantes. Também é possível preparar formulações em pó ou granuladas. Formas de dosagem líquidas, como soluções, xaropes, suspensões ou gotas também podem ser utilizadas para a via oral.

EXEMPLOS FUNCIONAIS Exemplo 1. Preparação de uma Cultura de Linhagens de E. coli

O meio para E. coli 1-081 (E81), E. coli 1-082 (E82), E. coli 1-083 (E83), E. coli 1-084 (E84), E. coli 1-085 (E85), E. coli 1-086 (E86), E. coli 1-087 (E87), E. coli 1-088 (Ε88), E. coli 1-089 (E89), E. coli NCTC 8603 (E8603), E. coli NCTC 8621 (E8621 ), E. coli NCTC 8622 (E8622), E. coli NCTC 8623 (E8623), E. coli NCTC 9026 (E9026), E. coli NCTC 9111 (E9111), E. coli NCTC 9119 (E9119), E. coli NCTC 9707 5 (E9707), e E. coli NCTC 9708 (E9708) foi preparado dissolvendo-se os seguintes componentes em água purificada: Cloreto de sódio 3,75 g/L; Monoidrogenofosfato de sódio 2,5 g/L; Acetato de sódio 0,625 g/L; Peptona vegetal (Digesto papaico de soja) 50 g/L; Inosina 0,125 g/L; Cloreto de cálcio 0,025 g/L; ío Cloreto de potássio 0,125 g/L; Hidrogênio carbonato de sódio 0,75 g/L; Arginina 1 g/L; Piruvato de sódio 0,35 g/L; Glicose 3 g/L; e uma "solução de elementos concentrados" 0,625 mL/L (que contém Sulfato de cobre 3 mg/L; Cloreto de ferro 830 mg/L; Sulfato de zinco 860 mg/L; e Ácido sulfurico 1,1 mL/L).

0,1 L de meio foi inoculado com 1,5 mL de

bactérias congeladas e incubado em um frasco de Erlenmeyer de 300 mL a 37°C por 3 horas com agitação. Em seguida, 1,0 L de meio em um Erlenmeyer de 3000 mL foi inoculado com 30 mL da cultura anterior de 300 mL e incubado novamente a 37°C por 4 horas sob agitação.

TABELA 1.1: DENSIDADE ÓPTICA PARA

ETAPAS DE CULTURA SUCESSIVAS

OD ERLEN a 700 nm Etapa 100 mL 100 mL IOOOmL IOOOmL 1 2 E8603 Duração 4 4 4 4 [horas] Cultura 1 2,84 2,67 2,41 2,29 E89 Duração 4 4 4 4 [horas] Cultura 2 2,46 2,45 2,39 2,42 E9111 Duração 5 5 4,25 4,25 [horas] Cultura 3 3,13 2,92 2,45 2,50 O mesmo meio utilizado acima foi preparado

para pré-fermentadores, mas com a adição de 0,08 mL/L de polipropileno glicol. Um litro da cultura da etapa de incubação anterior foi transferido para o pré-fermentador. A temperatura de incubação foi regulada a 30°C, e o pré-fermentador foi agitado, e o pH não foi regulado. A taxa do fluxo de ar estéril foi ajustada a

3,3 L/min. Após 6 horas, dois pré-fermentadores de 25 litros foram transferidos para um fermentador maior.

TABELA 1.2: DENSIDADE ÓPTICA PARA CULTURAS DE PRÉ-FERMENTADORES:

Número do Linhagem Duração da OD ao final OD ao final Exemplo Cultura da cultura da cultura Pref 1 Pref 2 [H1 H [-1 Cultura 1 E8603 6 2,43 2,41 Cultura 2 E89 6,75 1,95 2,05 Cultura 3 E9111 12,25 2,00 2,45 O mesmo meio descrito acima foi preparado

para a próxima incubação em fermentadores em escala maior, mas com a adição de 0,05 mL/L de polipropilenoglicol e 6 g/L de glicose antes da esterilização. A temperatura de incubação foi regulada a 37°C, com agitação e aeração durante a incubação. O pH foi regulado a 6,8. Doze Kg de glicose foram adicionados durante a cultura. Após aproximadamente 10,5 horas, as culturas foram inativadas por aquecimento até entre 90 e IOO0C e transferidas a um tanque de coleta. A biomassa foi então separada para o meio de cultura e concentrada por centrifugação.

De acordo com o meio e as condições de cultura

descritas, prepararam-se as culturas, como ilustrado nas tabela e descrições a seguir.

TABELA 1.3

Núme Linhag Duraç OD ao Volu Volum Volu Peso Quantida ro do em ão da fínal do me e de me de seco de de Exem cultur crescime Total Bioma 1 da peso pio a[h] nto a [L] ssa alíquo biomas seco para 700 nm Coleta ta sa 1 do [mL] [mg/m alíquota ImLl L] [g] 1.2 E81 5 18,72 498 61758 1196 168,4 201 17,84 498 18,28 497 1.3 E82 8,5 23,52 491 69584 1062 176,6 188 8,00 22,52 491 7,75 17,08 489 1.4 E83 7 18,4 489 49275 1481 170,6 253 7 19,48 490 7 18,92 489 1.5 E84 5,45 23,8 492 66647 928 182,9 170 5,45 21,08 466 5,45 23,2 492 1.6 E85 7,5 21,28 493 73275 1262 183,4 224 7,5 20,4 494 8,5 20,52 494 1.7 E86 4,75 19,960 491 66898 1116 168,9 188 4.75 20,840 491 4,75 19,200 491 1.8 Ε87 5,25 21,24 490,5 73043 978 172,4 169 6,5 23,76 492,5 6,5 23,36 490,5 1.9 Ε88 5,25 16,04 496 47478 906 151,6 137 5,25 15,2 494 5,25 15,4 492 1.10 Ε89 5,5 12,00 489 46801 939 179,2 168 6,5 17,72 492 6,75 17,48 492 1.11 Ε8621 5 23,3 493 64830 539 143,6 77,4 21 491,5 21,6 494 1.12 Ε8622 4,75 19,36 492 67671 343 187 64 4,75 18,80 493 4,75 18,80 493 1.13 Ε8623 4,75 24,36 498 75748 347 178 62 4,75 24,72 498 4,75 24,8 496 1.14 Ε9026 4,75 28,32 492 63091 346 180,2 62 4,75 28,08 492 4,75 28,40 492 1.15 Ε9111 4,75 14,36 489 41990 621 133,6 83 4,75 12,92 489 4,75 13,6 488 1.16 Ε9119 4,5 28 493 58396 313 190,5 60 4,5 26,08 493 4,5 26,64 492 1.17 E9707 4,5 20 492 83381 564 133,8 75 5,5 21,48 492,5 5,25 22,16 493 1.18 E9708 4,75 20,24 492 71942 387 167,1 65 4,75 19,52 491,5 4,75 19,6 492 1,19 E8603 5,75 23,2 491 76115 336 179,2 60 4,75 23,48 491 25,4 493 Exemplo 1.20

A NCTC9111 foi cultivada com um meio

sintético nas mesmas condições descritas no exemplo 1.2 0 meio foi preparado por dissolução em 540 L de água purificada: 0,2220 5 Kg de inosina, 0,3330 Kg de monoidrato de ácido cítrico, 1,4430 Kg de ácido glutâmico, 1,1655 Kg de cloreto de amônio, 0,7825 Kg de sulfato de magnésio-2 H2O, 1,5096 Kg de fosfato de potássio (KH2PO4), 0,3330 Kg de arginina, 0,1110 Kg de uracila, 0,0189 Kg de cloreto de cálcio, 11,8200 Kg de cloreto de sódio, 10 0,5435 Kg de L-leucina, 0,5435 Kg de L-Iisina HCL, 0,5435 Kg de L-serina, 0,5435 Kg de L-metionina, 0,5435 Kg de L-valina, 0,5435 Kg de L-alanina, 0,5435 Kg de L-asparagina, 14,0000 L de hidróxido de amônio, 0,3420 L de hidróxido de potássio, 40,5000 Kg de glicose, 4,1667 g de cloreto de ferro, 4,1667 g de cloreto de cobalto, 4,1667 g de molibdato de sódio, 4,1667 g de sulfato de manganês, 4,1667 g de sulfato de zinco, 4,1667 g de sulfato de níquel, 0,0833 g de ácido bórico, 0,1667 g de sulfato de cobre, 1,8333 mL de ácido sulfurico (95-97%).

Exemplo 2: Lise alcalina das Células

Exemplo 2.1

Uma alíquota de cada uma das seguintes linhagens, E81, E82, E83, E084, E085, E086, E087, E088, E89, E9111, E8603, E8621 , E8622, E8623, E026, E9119, E9707 e E9708, contendo 1810 g de peso seco bacteriano foi descongelada à temperatura ambiente, e então diluída com água purificada para atingir 26 g/L de biomassa bacteriana (peso seco). A alcalinização a 0,8 M de hidróxido de sódio foi realizada, o pH foi medido após 2 horas de lise e foi de 13.1. Em seguida, a lise foi incubada por 120 horas a 35-40°C sob agitação contínua. Após a incubação, o pH foi ajustado para 11,3 com HCI concentrado. (Peso Seco Solúvel); SDW: 59,4 mg/mL; Prot: 17,4 mg/mL. O peso seco solúvel foi determinado obtendo 5 mL da fração solúvel resultante da lise e secando-a a uma massa constante em uma cápsula de porcelana a 105°C.

Exemplo 2.2

De acordo com os exemplos 1.1 a 1.19, 3 alíquotas de E81, E82, E084, E086, E89, 2 alíquotas de E83 e E085, 4 alíquotas de E088, 6 alíquotas de E9111, 9 alíquotas de E8603, E9119, 7 alíquotas de E8621, E9707 e 8 alíquotas de Ε8622, Ε8623, Ε9026 e Ε9708 contendo um total de 9264 g de peso seco bacteriano foram congeladas à temperatura ambiente, e então diluída com água purificada, para atingir 50.1 g/L de concentração de biomassa bacteriana (peso seco). A alcalinização 5 a 0,2 N de íon hidróxido foi de 12,3. A lise foi incubada por 32 horas a 35-40°C sob agitação contínua. Durante a lise o pH foi monitorado de modo que ele não diminuísse mais do que 1.3 unidades de pH. O pH foi ajustado para 11.3 com adjunção do HCI concentrado. (Peso Seco Solúvel); SDW: 60,7 mg/mL; Prot: ío 32,0 mg/mL.

Exemplo 2.3

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 58 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 1 dia a 35-40°C sob agitação contínua. (Peso Seco Solúvel); SDW: 96,8 mg/mL; Prot: 35,3 mg/mL.

Exemplo 2.4

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 92 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M com NaOH a 10N. A lise foi incubada por 1 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 146,6 mg/mL; Prot: 62,9 mg/mL.

Exemplo 2.5

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 58 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 7 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 97,7mg/mL; Prot: 42,4 mg/mL.

Exemplo 2.6

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 92 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 7 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 153,0 mg/mL; Prot: 78,9 mg/mL.

Exemplo 2.7

ío De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram

diluídas a 58 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 98,6 mg/mL; Prot: 29,6 mg/mL.

Exemplo 2.8

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 92 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 127,4 mg/mL; Prot: 60 mg/mL.

Exemplo 2.9

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 43 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,2 M de NaOH. A lise foi incubada por 168 horas a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 43,2 mg/mL; Prot: 8,2 mg/mL. Exemplo 2.10

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 57 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 69,5 mg/mL; Prot: 20,2 mg/mL.

Exemplo 2.11

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 30 g/L de concentração de biomassa bacteriana. ío Realizou-se a alcalinização a I M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 86,9 mg/mL; Prot: 13 mg/mL.

Exemplo 2.12

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 27 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a I M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 91,3 mg/mL; Prot: 11,8 mg/mL.

Exemplo 2.13

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram

diluídas a 14 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,1 M de NaOH. A lise foi incubada por 1 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 25,2 mg/mL; Prot: 5,8 mg/mL.

Exemplo 2.14 De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 14 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,2 M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 26,6 mg/mL; Prot: 5,7 mg/mL.

Exemplo 2.15

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 14 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,1 M de NaOH. A lise foi incubada ío por 10 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 20,0 mg/mL; Prot: 2,1 mg/mL.

Exemplo 2.16

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 114 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a I M de NaOH. A lise foi incubada por 1 dia a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 163,3 mg/mL; Prot: 68,4 mg/mL.

Exemplo 2.17

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 114 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,4 M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 163,0 mg/mL; Prot: 60,3 mg/mL.

Exemplo 2.18

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram

diluídas a 114 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a I M de NaOH. A lise foi incubada por 10 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 171,2 mg/mL; Prot: 71,0 mg/mL.

Exemplo 2.19

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram

diluídas a 25 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,45 M de NaOH. A lise foi incubada por 4 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 48,5 mg/mL; Prot: 15,2 mg/mL; A.A: 4,0 mg/mL; Açúcar: 0,86 ío mg/mL.

Exemplo 2.20

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 28 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,6 M de NaOH. A lise foi incubada por 4 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 59,4 mg/mL; Prot: 16,8 mg/mL; A.A: 5,4 mg/mL; Açúcar: 1,22 mg/mL.

Exemplo 2.21

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 58 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,2 M de NaOH. A lise foi incubada por 4 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 64,4 mg/mL; Prot: 32,4 mg/mL; A.A: 5,6 mg/mL; Açúcar: 1,84 mg/mL.

Exemplo 2.22

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 56 g/L de concentração dé biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,2 M de NaOH. A lise foi incubada por 3 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 61,0 mg/mL; Prot: 30,0 mg/mL; A.A: 5,6 mg/mL; Açúcar: 1,88 mg/mL.

Exemplo 2.23

De acordo com a Tabela 2, as biomassas foram diluídas a 39 g/L de concentração de biomassa bacteriana. Realizou-se a alcalinização a 0,7 M de NaOH. A lise foi incubada por 4 dias a 35-40°C sob agitação contínua. SDW: 78,32 mg/mL; Prot: 20,60 mg/mL; A.A: 7,8 mg/mL; Açúcar: 1,54 mg/mL.

Exemplo 2.24

ío Uma alíquota de cada uma das seguintes

linhagens, E82, E83, E084, E086, E087, E088, E9111 , E 8603, E 8621 , E 8622, E8623, E 026, E9119, E9707 e E9708, contendo 1810 g de peso seco bacteriano foi descongelada à temperatura ambiente, e então diluída com água purificada para atingir 25 g/L 15 de biomassa bacteriana (peso seco). A alcalinização a 1,0 M de hidróxido de sódio foi realizada, o pH foi medido após 2 horas de lise e foi de 13,5. Em seguida, a lise foi incubada por 72 horas a 35-40°C sob agitação contínua. Após a incubação, o pH foi ajustado para 11,4 com HCI concentrado.

(Peso seco solúvel); SDW: 75,4 mg/mL; Prot:

14,8 mg/mL; A.A: 5,4 mg/mL; Açúcar: 0,9 mg/mL.

TABELA 2: COMPOSIÇÃO DAS LISES DE

E.COLI E81 exemplo 1.2 E82 exemplo 1.3 E83 exemplo 1.4 E84 exemplo 1.5 E85 exemplo 1.6 E86 exemplo 1.7 [E87 exemplo 1.8 E88 exemplo 1.9 E89 exemplo 1.10 E8603 exemplo E8621 exemplo p8622 exemplo ^8623 exemplo ^9026 exemplo E9111 exemplo E9119 exemplo E9707 exemplo E9708 exemplo E9111 exemplo 2.3 X 2.4 X 2.5 X 2.6 X 2.7 X X X X X X X X 2.8 X x X X X X X X X 2.9 X 2.10 X 2.11 X X X X X X X X 2.12 X X X X X X X X X 2.13 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.14 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.15 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.16 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.17 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.18 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.19 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.20 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.21 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.22 X X X X X X X X X X X X X X X X X X 2.23 X X X X X X X X X X X X X X X X X X Exemplo 3: Misturas de Lisados

Vários extratos bacterianos foram misturados e tiveram seu pH ajustado, com os resultados abaixo:

Exemplo 3.1

0,845 Kg de E. coli Exemplo 2.4 foi misturado

com 1,4 kg de E. coli Exemplo 2.3. A mistura foi diluída com água purificada até 12 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida a um tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: Peso Seco Solúvel (SDW): 29.7 mg/mL; Prot:

10.0 mg/mL.

Exemplo 3.2

1.4 Kg de E. coli Exemplo 2.7 foi misturado com 0,85 kg de E. coli Exemplo 2.8. A mistura foi diluída com água purificada até 12 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida a um tanque de microfiltração. Os resultados

io analíticos foram: Peso Seco Solúvel (SDW): 32,3 mg/mL; Prot:

10,3 mg/mL. O SWD foi medido conforme descrito no Exemplo 2. A concentração protéica foi medida por um ensaio de Lowry (vide a Farmacopéia Européia 2.5.33, sob "total protein - method 2").

Exemplo 3.3

1.4 Kg de E. coli Exemplo 2.5 foi misturado com 0,86 kg de E. coli Exemplo 2.6. A mistura foi diluída com água purificada até 12 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida a um tanque de microfiltração. Os resultados

analíticos foram: SDW: 26,8 mg/mL; Prot: 9,6 mg/mL.

Exemplo 3.4

2.4 Kg de E. coli Exemplo 2.7 foi misturado com 1,5 kg de E. coli Exemplo 2.8. A mistura foi diluída com água purificada até 20 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído

foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 22,0 mg/mL; Prot: 9,5 mg/mL. Exemplo 3.5

9.0 Kg de E. coli Exemplo 2.9 foram diluídos com água purificada a 9,3 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados

analíticos foram: SDW: 45,7 mg/mL; Prot: 20,6 mg/mL.

Exemplo 3.6

8.1 Kg de E. coli Exemplo 2.10 foram diluídos com água purificada a 12 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados

analíticos foram: SDW: 39,7 mg/mL; Prot: 17,3 mg/mL.

Exemplo 3.7

3.2 Kg de E. coli Exemplo 2.11 foram misturados com 3,2 kg de E. coli Exemplo 2.12. A mistura foi diluída com água purificada até 12,8 Kg. A mistura de lisado

bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 39,9 mg/mL; Prot: 8,0 mg/mL.

Exemplo 3.8

248 Kg de E. coli Exemplo 2.19 foram diluídos com água purificada a 400 Kg. A mistura de lisado bacteriano 20 diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos são: SDW: 31,6 mg/mL; Prot: 10,2 mg/mL; aminoácidos livres (A.A.): 2,6 mg/mL; Açúcar: 0,59 mg/mL. A concentração de açúcar foi analisada após a hidrólise do ácido e a derivatização segundo D. Herbert e col., Meth. Microbiol. 5B: 25 266 et seq. (1971). A concentração de aminoácidos livres foi medida convertendo os aminoácidos livres em derivados de isoindol e medindo a absorbância a 340 nm, de acordo com Roth M., Fluorescence "reaction for amino acids", Anal.Chem., 43, 880-882, (1971). Os resultados são expressos em equivalentes de ácido glutâmico.

Exemplo 3.9

248 Kg de E. coli Exemplo 2.20 foram diluídos com água purificada a 400 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos são: SDW: 38,9 mg/mL; Prot: 10,8 mg/mL; A.A.: 3,6 mg/mL; Açúcar: 0,74 mg/mL.

Exemplo 3.10

247 Kg de E. coli Exemplo 2.21 foram diluídos com água purificada a 400 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 40,08 mg/mL; Prot: 20,0 mg/mL; A.A.: 3,6 mg/mL; Açúcar: 1,17 mg/mL.

Exemplo 3.11

247 Kg de E. coli Exemplo 2.22 foram diluídos com água purificada a 400 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 43,9 mg/mL; Prot: 19,1 mg/mL; aminoácidos (A.A.): 3,9 mg/mL; Açúcares: 1,27 mg/mL.

Exemplo 3.12

1,9 Kg de E. coli Exemplo 2.21 foi misturado com 6 kg de E. coli Exemplo 2.23. A mistura foi diluída com água purificada até 12 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 45,4 mg/mL; Prot: 12,6 mg/mL; A.A.:

3,8 mg/mL; Açúcar: 0,82 mg/mL.

Exemplo 3.13

4 Kg de E. coli Exemplo 2.21 foram misturados

com 4 kg de E. coli Exemplo 2.23. A mistura foi diluída com água purificada até 12 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 47,0 mg/mL; Prot: 15,0 mg/mL; A.A.: 3,9 mg/mL; Açúcares: 1,14 mg/mL.

Exemplo 3.14

72.4 Kg de E. coli Exemplo 2.1 foram misturados com 185.2 kg de E. coli Exemplo 2.2. A mistura foi diluída com água purificada até 400 Kg. A mistura de lisado

bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 40,8 mg/mL; Prot: 17,7 mg/mL; A.A.: 3,7 mg/mL; Açúcares: 1,24 mg/mL.

Exemplo 3.15

75.4 Kg de E. coli Exemplo 2.24 foram misturados com 185,2 kg de E. coli Exemplo 2.2. A mistura foi

diluída com água purificada até 400 Kg. A mistura de lisado bacteriano diluído foi transferida ao tanque de microfiltração. Os resultados analíticos foram: SDW: 43,6 mg/mL; Prot: 17,0 mg/mL; A.A.: 3,3 mg/mL; Açúcares: 1,16 mg/mL.

Exemplo 4: Purificação dos Lisados

Exemplo 4.1 A mistura do lisado bacteriano do Exemplo 3.1 foi transferida para um tanque de microfiltração (MF). A unidade de microfiltração (MF) utilizou um filtro (PALL Procette) de filtração de fluxo tangencial (TFF) de 0,45 mícron em um modo 5 "serpentina" ou um filtro Schleicher & Schuell em modo paralelo. (Vide a Figura 1 para um exemplo de diagrama de uma configuração TFF). O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2000 L/h m (LHM) e a Pressão Transmembrana (TMP) a 1,3 bar. O permeado foi transferido a um tanque de io ultrafíltração (UF).

Uma vez que o volume do lisado no tanque de microfiltração tenha atingido metade do volume inicial, a unidade UF foi iniciada. O fluxo cruzado foi ajustado para 1500 LHM e o a TMP para 0,3 bar. Os volumes tanto do tanque MF quando do 15 tanque UF (o Volume Inicial do MF é chamado de ViMF) foram mantidos no mesmo nível. Em cada volume de diafiltração (correspondendo ao ViMF), a extração protéica foi seguida de uma medição das proteínas pelo ensaio em microplaca de Bradford. Por essa medição, o número de ciclos de extração foi 20 definido para extrair todos os compostos solubilizados.

Após 10 volumes de diafiltração, o UF foi interrompido, e o lisado bacteriano foi concentrado nos tanques MF. O volume recuperado foi de 9,55 kg. Esse produto foi então diluído ate 7,0 mg/mL e então filtrado através de um filtro estéril 25 de 0,2 mícron. Peso Seco Solúvel (SDW): 24,2 mg/mL; Prot: 6,4 mg/mL. A.A: 1,3 mg/mL, açúcares: 0,5 mg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 29 % D-Ala, 4 % D-Thr, 11 % D-Leu, 45 % DSer, 36 % D-Asx, 29 % D-Met, 26 % D-Phe, 21 % D-Glx, 25 % D-Tyr, 9 % D-Lys.

A produção de NOx (óxido nítrico macrófago) foi medida após uma diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3) com resultados como segue: Cl : 6,3 μΜ, C2:7^MeC3 : 13,1 μΜ.

Várias misturas adicionais foram filtradas por Filtração de Fluxo Tangencial (TFF), como descrito abaixo. io Exemplo 4.2

O lisado do exemplo 3.2 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo transversal, para o modo serpentina, foi ajustado em 2500 LHM e a TMP a 1,30 bar. O UF foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 38,2 LHM. O rendimento de extração em peso seco foi de 65%, o rendimento de extração protéica foi de 80% e o rendimento de volume foi de 80%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 26,1 mg/mL; Prot: 8,1 mg/mL; A.A.: 1,4 mg/mL; Açúcares: 0,6 mg/mL; DNA: 4,8 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 29% D-Ala, 4% D-Thr, 11 % D-Leu, 45 % DSer, 36 % D-Asx, 29 % D- Met, 26 % D-Phe, 21 % D-Glx, 25 % D-Tyr, 9 % D-Lys. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl : 5,5 μΜ, C2: 7,5 μΜ, C3 : 5,5 μΜ.

Exemplo 4.3 O lisado do exemplo 3.3 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2450 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,3 bar. O UF foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 26,2 L/h.m . O rendimento de extração em peso seco foi de 65%, o rendimento de extração protéica foi de 75% e o rendimento de volume foi de 88%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 24,5 mg/mL; Prot: 7,0 io mg/mL; A.A.: 2,1 mg/mL; Açúcares: 0,5 mg/mL; DNA: 8,2 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 45 % D-Ala, 11 % DLeu, 48 % D-Ser, 44 % D-Asx, 41 % D-Met, 26 % D-Phe, 25 % D-Glx, 38 % D-Tyr, 27 % D-Lys. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl : 5,1 μΜ, C2: 6,8 μΜ, C3 : 13,7 μΜ.

Exemplo 4.4

O lisado do exemplo 3,4 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2000 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,8 bar. O UF

foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de

• 2 ·

permeado no primeiro ciclo foi de 22,5 L/h.m . O rendimento de

extração em peso seco foi de 67%, o rendimento de extração protéica foi de 84% e o rendimento de volume foi de 92%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 21,5 mg/mL; Prot: 6,1 mg/mL; A.A.: 1,5 mg/mL; Açúcares: 0,3 mg/mL; DNA: 5,6 μ^ιηL. Porcentagem de D-aminoácidos: 44 % D-Ala, 15 % DThr, 12 % D-Leu, 48 % D-Ser, 40 % D-Asx, 40 % D-Met, 30 % D-Phe, 26 % D-Glx, 31 % D-Tyr, 18 % D-Lys.

Exemplo 4.5

O lisado do exemplo 3.5 foi transferido a um

tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2000 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,3 bar. O UF foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de 10 permeado no primeiro ciclo foi de 27,7 L/h.m2. O rendimento de extração em peso seco foi de 72 %, o rendimento de extração protéica foi de 69% e o rendimento de volume foi de 86%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 36,9 mg/mL; Prot: 16,9 mg/mL; A.A.: 2,8 mg/mL; Açúcares: 0,815 mg/mL; DNA: 46,7 15 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 27% D-Ala, 16 % DThr, 11 % D-Leu, 48 % D-Ser, 40 % D-Asx, 39 % D-Met, 36 % D-Phe, 32 % D-Glx, 31 % D-Tyr. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl : 6,2 μΜ, C2: 10,9 μΜ, C3 : 18,3 μΜ.

Exemplo 4.6

O lisado do exemplo 3.6 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2000 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,3 bar. O UF 25 foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 15,7 L/h.m . O rendimento de extração em peso seco foi de 53 %, o rendimento de extração protéica foi de 51 % e o rendimento de volume foi de 81 %. O concentrado obtido compreendia: SDW: 30,1 mg/mL; Prot: 12,7 mg/mL; A.A.: 2,6 mg/mL; Açúcares: 0,364 mg/mL; DNA: 4,8 5 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 40 % D-Ala, 16 % DThr, 12 % D-Leu, 49 % D-Ser, 43 % D-Asx, 44 % D-Met, 40 % D-Phe, 38 % D-Glx, 36 % D-Tyr, 24 % D-Lys. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl : 5,8 μΜ, C2: 7,1 μΜ, C3 : 15,1 μΜ.

Exemplo 4.7

O lisado do exemplo 3.7 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2000 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,35 bar. O UF 15 foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 30,0 L/h.m . O rendimento de extração em peso seco foi de 82 %, o rendimento de extração protéica foi de 83 % e o rendimento de volume foi de 92 %. O concentrado obtido compreendia: SDW: 38,2 mg/mL; Prot: 5,4 20 mg/mL. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl : 0,4 μΜ, C2: 2,1 μΜ, C3 :

16,3 μΜ.

Exemplo 4.8

500 mL do lisado do exemplo 2.13 foram centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μπι, 0,45 μιη e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O rendimento do volume foi de 45%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 25,21 mg/mL; Prot: 5,85 mg/mL; DNA: 7,5 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 24 % D-Ala, 16 % D5 Thr, 9 % D-Leu, 43 % D-Ser, 20 % D-Asx, 16 % D-Met, 10 % DPhe, 8 % D-Glx, 7 % D-Tyr.

Exemplo 4.9

500 mL do lisado do exemplo 2.14 foram centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi ío filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μιη e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O rendimento do volume foi de 53%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 26,62 mg/mL; Prot: 5,75 mg/mL; DNA: 6,5 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 35 % D-Ala, 22 % D15 Thr, 10 % D-Leu, 45 % D-Ser, 35 % D-Asx, 35 % D-Met, 31 % D-Phe, 24 % D-Glx, 22 % D-Tyr, 12 % D-Lys. PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL: IL-6:9232 pg/mL.

Exemplo 4.10

500 mL do lisado do exemplo 2,15 foram 20 centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μιη e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O rendimento do volume foi de 53%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 20 mg/mL; Prot: 2,13 mg/mL; DNA: 3,5 25 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 35 % D-Ala, 4 % D-Thr,

11 % D-Leu, 46 % D-Ser, 34 % D-Asx, 32 % D-Met, 24 % DPhe, 24 % D-Glx, 15 % D-Tyr. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,01 mg/mL (Cl), 0,1 mg/mL (C2) e 1,0 mg/mL (C3); Cl : 3,6 μΜ, C2: 4,4 μΜ, C3: 7,9 μΜ.

Exemplo 4.11

500 mL do lisado do exemplo 2.16 foram

centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μηι e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O rendimento do volume foi de 33%. O concentrado obtido ío compreendia: SDW: 163,33 mg/mL; Prot: 68,42 mg/mL; DNA:

14,1 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 38 % D-Thr, 1 % D-Leu, 49 % D-Ser, 43 % D-Asx, 64 % D-Met, 30 % D-Phe, 31 % D-Glx, 4 % D-Tyr.

Exemplo 4.12

500 mL do lisado do exemplo 2.17 foram

centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μτη e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O rendimento do volume foi de 17%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 162,78 mg/mL; Prot: 60,26 mg/mL; DNA:

14,8 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 10 % D-Leu, 40 % D-Ser, 34 % D-Asx, 62 % D-Met, 27 % D-Phe, 23 % D-Glx, 5 % D-Tyr.

Exemplo 4.13

5 00 mL do lisado do exemplo 2.18 foram

centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μιη e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O rendimento do volume foi de 13%. O concentrado obtido compreendia: SDW: 171,16 mg/mL; Prot: 71,02 mg/mL; DNA: 16,9 μg/mL.

Exemplo 4.14

O lisado do exemplo 3.8 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2300 (L/h ío m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,5 bar. O UF foi interrompido após 11 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 32,5 L/h.m . O rendimento de extração em peso seco foi de 86%, o rendimento de extração protéica foi de 87% e o rendimento de volume foi de 90%. O concentrado obtido compreendida: SDW: 26,6 mg/mL; Prot: 8,1 mg/mL; A.A.: 2,3 mg/mL; Açúcares: 0,42 mg/mL; DNA: 68,5 μg/mL. PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL : IL-6 :29898 pg/mL, IL-10 : 446 pg/ml, TNF-α : 3429 pg/mL. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,02 mg/mL (Cl), 0,2 mg/mL (C2) e 2,0 mg/mL (C3); Cl : 2,3 μΜ, C2: 16,6 μΜ, C3:

4,0 μΜ.

Exemplo 4.15

O lisado do exemplo 3.9 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2375 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,3 bar. O UF foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 32,5 L/h.m2. O rendimento de extração em peso seco foi de 83%, o rendimento de extração protéica foi de 79% e o rendimento de volume foi de 92%. O 5 concentrado obtido compreendida: SDW: 24,9 mg/mL; Prot: 7,2 mg/mL; A.A.: 2,3 mg/mL; Açúcares: 0,49 mg/mL. PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL: IL-6 : 23709 pg/mL, IL-IO : 385 pg/ml, TNF-α : 2917 pg/mL. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,02 mg/mL (Cl), 0,2 mg/mL (C2) e 2,0 mg/mL (C3); ío Cl : 1,1 μΜ, C2: 13,8 μΜ, C3: 4,2 μΜ.

Exemplo 4.16

O lisado do exemplo 3.10 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2500 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,0 bar. O UF foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 15,0 L/h.m . O rendimento de extração em peso seco foi de 58%, o rendimento de extração protéica foi de 59% e o rendimento de volume foi de 79%. O concentrado obtido compreendida: SDW: 22,0 mg/mL; Prot: 8,1 mg/mL; A.A.: 1,6 mg/mL; Açúcares: 0,46 mg/mL; DNA: 23,9 μg/mL. PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL : IL-6 :21458 pg/mL, IL-10 : 281 pg/ml, TNF-α : 123 pg/mL. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,02 mg/mL (Cl), 0,2 mg/mL (C2) e 2,0 mg/mL (C3); Cl : 14,6 μΜ, C2: 23,8 μΜ, C3: 16,9 μΜ. Porcentagem de D-aminoácidos: 27% D-Ala, 22 % D-Thr, 11% D-Leu, 44 % D-Ser, 27 % D-Asx, 26 % D-Met, 22 % D-Phe, 16 % D-Glx, 15 % D-Tyr, 8 % D-Lys.

Exemplo 4.17

O lisado do exemplo 3.11 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2500 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,0 bar. O UF foi interrompido após 10 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 17,5 L/h.m . O rendimento de ío extração em peso seco foi de 69%, o rendimento de extração protéica foi de 69% e o rendimento de volume foi de 78%. O concentrado obtido compreendida: SDW: 22,2 mg/mL; Prot: 8,3 mg/mL; A.A.: 1,8 mg/mL; Açúcares: 0,5 mg/mL; DNA: 33,3 μg/mL. PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL : IL-6 :19304 pg/mL, IL-10 : 343 pg/ml, TNF-α : 220 pg/mL. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,02 mg/mL (Cl), 0,2 mg/mL (C2) e 2,0 mg/mL (C3); Cl : 14,4 μΜ, C2: 20,5 μΜ, C3: 18,9 μΜ. Porcentagem de D-aminoácidos: 30% D-Ala, 18% D-Thr, 10 % D-Leu, 44 % D-Ser, 29 % D-Asx, 28 % D-Met, 23 % D-Phe, 18 % D-Glx, 18 % D-Tyr, 11 % D-Lys.

Setenta litros da forma líquida foram neutralizados com 196 mL de HCI 25% e então misturados com 10,44 kg de manitol. Em seguida, a mistura foi liofilizada. Durante o ciclo de liofilização, o produto foi congelado a -5 O0C e 25 então aquecido a -25°C. A pressão no liofílizador foi mantida entre 0,2 e 0,5 mbar e controlada por meio de injeções de ar filtrado. Em seguida, na dessecação secundária, o produto foi aquecido até sua temperatura de liofilização final (+30°C) mantendo, ao mesmo tempo, um nível de vácuo inferior a 0,2 mbar. Quando o ciclo de liofilização estava completo, a pressão 5 normal foi restabelecida no liofilizador com ar filtrado. O liofilizado foi peneirado através de uma peneira vibratória acoplada. Foram recuperados 1,95 Kg de produto liofilizado.

Exemplo 4.18

500 mL do lisado do exemplo 3,13 foram ío centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μιη e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCI. O concentrado obtido compreendida: SDW: 42,8 mg/mL; Prot: 12,5 mg/mL; A.A.: 3,5 mg/mL; Açúcares: 1,13 mg/mL; DNA: 14,1 15 μg/mL. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl: 0,4 μΜ C2: 5,7 μΜ C3:

25,1 μΜ. PBMC para mL de volume diluído do concentrado: Diluição 100: IL-6 : 2101 pg/mL. Porcentagem de Daminoácidos: 25% D-Ala, 12% D-Thr, 10% D-Leu, 45 % D-Ser, 35 % D-Asx, 35 % D-Met, 29 % D-Phe, 26 % D-Glx.

Exemplo 4.19

500 mL do lisado do exemplo 3.12 foram centrifugados por 30 minutos a 9000 g. O sobrenadante foi filtrado através de filtros sucessivos com porosidades de 0,8 μιη, 0,45 μηι e 0,2 μιη. O pH foi ajustado a 10,5 com HCL. O concentrado obtido compreendida: SDW: 38 mg/mL; Prot: 9,7 mg/mL; A.A.: 3,1 mg/mL; Açúcares: 0,82 mg/mL; DNA: 80,1 μg/mL. Produção de NOx após diluição em 20.000 vezes (Cl), 2000 vezes (C2) e 200 vezes (C3): Cl: 0,3 μΜ, C2: 2,6 μΜ, C3:

19,2 μΜ. PBMC para mL de volume diluído do concentrado: Diluição 100: IL-6 : 2802 pg/mL. Porcentagem de Daminoácidos: 35% D-Ala, 25% D-Thr, 10 % D-Leu, 46 % D-Ser, 40 % D-Asx, 38 % D-Met, 34 % D-Phe, 32 % D-Glx, 32 % DTyr, 24 % D-Lys.

Exemplo 4.20

ío O lisado do exemplo 3.14 foi transferido a um

tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2500 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,2 bar. O UF foi interrompido após 13 volumes de diafiltração e o fluxo de permeado no primeiro ciclo foi de 16,0 L/h.m2. O rendimento de extração em peso seco foi de 64%, o rendimento de extração protéica foi de 62% e o rendimento de volume foi de 78%. O concentrado obtido compreendida: SDW: 22,4 mg/mL; Prot: 8,7 mg/mL; A.A.: 1,8 mg/mL; Açúcares: 0,54 mg/mL; DNA: 39,1 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 32% D-Ala, 18% D-Thr, PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL, PBMC a 1 mg de peso seco ativo/mL : IL-6 :22303 pg/mL, IL-10 : 561 pg/ml, TNF-α : 336 pg/mL. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,02 mg/mL (Cl), 0,2 mg/mL (C2) e 2,0 mg/mL (C3); Cl : 11,3 μΜ, C2: 15,3 μΜ, C3: 13,5 μΜ. Porcentagem de D-aminoácidos: 32% D-Ala, 18% D-Thr, 10 % D-Leu, 44 % D-Ser, 26 % D-Asx, 23 % D-Met, 17 % D-Phe, 15 % D-Glx, 14 % D-Tyr, 9 % D-Lys.

Exemplo 4.21

O lisado do exemplo 3,15 foi transferido a um tanque MF. A instalação da TFF foi similar ao exemplo 4.1. O fluxo cruzado, para o modo serpentina, foi ajustado a 2500 (L/h m2) (LHM) e a (Pressão Transmembrana) TMP a 1,0 bar. O UF foi interrompido após 13 volumes de diafiltração e o fluxo de

'j

permeado no primeiro ciclo foi de 15,0 L/h.m . O rendimento de io extração em peso seco foi de 69%, o rendimento de extração protéica foi de 66% e o rendimento de volume foi de 77%. O concentrado obtido compreendida: SDW: 21,4 mg/mL; Prot: 7,6 mg/mL; A.A.: 1,6 mg/mL; Açúcares: 0,5 mg/mL; DNA: 25,9 μg/mL. Porcentagem de D-aminoácidos: 12,5% D-Ala, 3,4% Vai, 15 16,6%, 65 % D-Ser, 26,1 % D-Asx, 18,8 % D-Met, 15,6 % DGlx, 9,1 % D-Lys. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL: 0,02 mg/mL (Cl), 0,2 mg/mL (C2) e 2,0 mg/mL (C3): Cl: 10,3 μΜ, C2: 15,2 μΜ, C3: 12,3 μΜ.

A forma líquida foi liofilizada conforme 20 descrito no exemplo 4.17. O teor de proteínas (Lowey) foi de: 44 mg de proteína por grama de produto liofilizado. A produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL de produto liofilizado: 0,01 mg/mL (Cl), 0,1 mg/mL (C2) e 1,0 mg/mL (C3); Cl : 6,4 μΜ, C2: 12,9 μΜ, C3: 19,4 μΜ.

As cápsulas foram produzidas misturando-se

50,4 Kg de produto liofilizado com 64,68 Kg de amido 1500 PT, 2,52 de estearato de magnésio e 50,4 Kg de manitol. Produção de NOx em mg de peso seco ativo/mL de cápsulas: 0,01 mg/mL (Cl), 0,1 mg/mL (C2) e 1,0 mg/mL (C3); Cl : 6,8 μΜ, C2: 12,1 μΜ, C3: 19,1 μΜ.

Exemplo 5

Exemplo 5A: Efeito da Quantidade do "Material Inicial" sobre a atividade dos lisados bacterianos medida a secrecão da IL-6 pela PBMC humana.

Preparação da PBMC humana e da cultura

ío celular:

O sangue periférico de doadores saudáveis (Centre de transfusion, Hopital Universitaire, Geneva) foi centrifugado para obter uma capa leucocitária. A capa leucocitária foi misturada com solução salina balanceada de Hanks (HBSS, 15 Sigma, Buchs, Suíça), disposta em camadas sobre Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia) até 1,077 g/mL e centrifugada (2800 rpm, 20°C, 25 min). As células coletadas da interfase foram lavadas duas vezes em HBSS a 800 rpm por 15 min à temperatura ambiente e as células precipitadas foram ressupensas em HBSS. 20 As contagens de células foram realizadas usando uma célula de Neubauer. Todas as culturas celulares foram realizadas em meio RPMI-1640 suplementado com penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL), L-glutamina (2 mmol/L) e soro fetal bovino (FCS), todos obtidos pela Sigma. Para a estimulação in 25 vitro, as células foram cultivadas a uma concentração de 1 x IO6 células viáveis/poços. Estimulação e medição da IL-6 em sobrenadantes de cultura:

Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram incubadas a 37 0C e sob atmosfera de CO2 a 5% 5 com os produtos da invenção foram testadas a 0,25, 0,5, 1 e 2 mg/mL de "peso seco solúvel, SDW" em meio de cultura RPMI1640.

Os sobrenadantes das culturas foram coletados após 24 h e a concentração de IL-6 foi medida por um 10 imunoensaio enzimático (ELISA) (Conjunto ELISA UL-6 humana, BD OptEIA, San Diego, EUA), segundo as instruções do fabricante. O limite de detecção foi de 10 pg IL-6/mL. A atividade foi primeiro testada no teste PBMC. (Refira-se à Figura 2a e 2b, mostrando o efeito do aumento da quantidade de 15 "material inicial" (concentração de biomassa bacteriana expressa em gramas de peso seco por litro de lisado) de 12,5 g/L (Figura 2a) para 25 g/L (Figura 2b). A atividade dos extratos era dependente da quantidade do "material inicial", que passa pela lise alcalina (12,5 g/L vs 25 g/L). A porcentagem de NaOH (2% 20 (v/v) e o tempo da lise alcalina (72 h) eram constantes. As Figuras 3a e 3b mostram o efeito de aumentar o material inicial de 25 g/L para 100 g/L. O tempo de lise alcalina foi fixado em 168 h e a porcentagem de NaOH foi fixada em 1%.

De acordo com as Figuras 2 e 3, quanto maior o nível de "Material Inicial", maior a atividade resultante. Exemplo 5B: Efeito da duração da lise sobre a atividade dos produtos da invenção no teste da PBMC humana.

O "Material Inicial" foi 12,5 g/L e foi tratado com NaOH a 2% durante 24 h (Figura 4a) ou 72 h (Figura 4b). De acordo com essas figuras, o maior tempo de lise resultou em menor atividade.

Exemplo 6: Efeito da porcentagem inicial de NaOH ív/v) sobre a atividade dos lisados bacterianos da Invenção sobre o teste de óxido nítrico murino.

ío Camundongos C57/BL6 machos, com seis

semanas de idade (machos com seis semanas de idade, SPF quality, Charles Rivier, FR) foram mortos por inalação de CO2. Removeu-se o quadril, o fêmur e a tíbia do apêndice posterior. A medula óssea foi extraída do lúmen injetando o Meio de Eagle 15 modificado por Dulbecco (DH) através do osso após cortar ambas as partes de extremidade. Após a lavagem, as células-tronco foram ressupensas (40.000 cells/mL) em meio DH suplementado com soro equino a 20% e sobrenadante de células L929 a 30%. A suspensão celular foi incubada por 8 dias em uma incubadora a 20 37°C sob C02 a 8% e atmosfera saturada de umidade. Os macrófagos foram então removidos com PBS em gelo frio, lavados e ressuspensos em meio DH suplementado com soro fetal bovino 5% (FCS), aminoácidos e antibióticos (meio DHE). A densidade celular foi ajustada para 700Ό00 células/mL. Soluções 25 aquosas dos produtos foram diluídas em série em meio DHE diretamente em placas de microtitulação. Os produtos foram testados em triplieatas e cada placa de microtitulação compreendia um controle negativo composto do meio. O volume final em cada poço foi de 100 μΐ,. 100 \ih das suspensão de células foram adicionados aos produtos diluídos e as células foram incubadas por 22 h em uma incubadora a 37°C sob C02 a 8% e uma atmosfera saturada com umidade. Ao final do período de incubação, 100 μΐ, de sobrenadante foram transferidos para outra placa de microtitulação e a concentração nitrito produzida em cada sobrenadante foi determinada realizando uma reação de Griess. 100 μΐ. de reagente Griess (5 mg/mL de sulfanilamida + 0,5 mg/mL de cloridrato de N-(l-naftil)etileno-diamina) em ácido fosfórico aquoso a 2,5% foram adicionados a cada poço. As placas de microtitulação foram lidas com um espectrofotômetro (SpectraMax Plus, Molecular Devices) em 562 nm comparado a uma referência em 690 nm. A concentração de nitrito foi proporcionado ao teor de óxido nítrico sendo formado. O teor de nitrito foi determinado com base em uma curva padrão. Os resultados foram dados em óxido nítrico (NO) como valor médio ± desvio padrão e representados como uma curva de doseresposta.

Nos testes apresentados na Figura 5, a quantidade de material inicial (25 g/L) e o tempo de lise (168h) foram similares, a variável testada foi a concentração de NaOH (1% na Parte A vs 4% Parte B) usada para obter ambos os lisados. 25 Observou-se atividade inferior quando se utilizou NaOH a 4% (B na Figura 5) vs NaOH a 1% (A na Figura 5), sugerindo uma degradação dependendo da dose alcalina provável das moléculas do tipo endotoxina.

Dependendo do material inicial, da concentração de NaOH, e do tempo de lise, diferentes atividades imunológicas no teste de macrófagos de NO podem ser geradas.

Exemplo 7: Teste cromogênico do Lisado de Amebócitos de Límiilo (LAL)

Para determinar a presença de moléculas do tipo endotoxina, um teste LAL foi realizado com o Kit Cromogênico LAL da Bio-Whittaker.

Esse teste se baseia na ativação por lipopolissacarídeos (LPS) ou produtos de estrutura similar, por uma cascata enzimática presente no LAL. Essa ativação enzimática é demonstrada pela divisão de um cromogênio ligado 15 a um peptídeo por uma protease. A reação enzimática é realizada a 37°C e a formação do cromogênio ao longo do tempo é medida a 405 nm. O tempo necessário para atingir 0,2 unidade de D.O. é registrado e a atividade endotóxica é calculada em relação a um padrão LPS (curva padrão).

Os resultados de tal experimento

exemplificativo nos extratos de acordo com a invenção são expressos na tabela abaixo em EU (Unidade de Endotoxina) em relação a uma preparação padronizada de LPS de E. coli (I EU corresponde a 0,09 ng de LPS equivalente).

Condições da lise (Tempo de lise, EU/ml quantidade de Material Inicial,

ng LPS equivalente/ porcentagem inicial de NaOH) mL T=24h-12,5g/l-2% NaOH 343 ±6 22 ± 0,4 T=24h-12,5 g/l-1 %NaOH 33530±176 2163 ±11 T=24h-25 g/1-2% NaOH 908 ±5,1 58 ± 0,3 T=24h-50 g/1-4% NaOH 48 ± 0,4 3 ±0,1 T=24h-50 g/1-3% NaOH 355 ± 11 23 ± 0,7 T=72h-12,5 g/1-2% NaOH <50 <3 T=72h-25 g/1-3% NaOH 65 ±0,9 4, ± 0,1 T=72h-50 g/1-2% NaOH 196 ±6 13 ± 0,4 T=72h-50 g/1-3% NaOH 45 ±3 3 ± 0,2 T=72h-50 g/1-4% NaOH 162 ±3 11 ± 0,2 T=168h-12,5 g/1-2% NaOH 26 ± 0,7 2 ± 0,1 T=168h-12,5 g/1-3% NaOH 45 ±3 3 ± 0,2 T=168h-25 g/1-3% NaOH 25 ±1 2 ± 0,04 T=168h-50 g/1-2% NaOH 55 ± 1 4 ± 0,04 T=168h-50 g/1-3% NaOH 1035 ±42 67 ± 2,7 T=168h-50 g/1-4% NaOH 46 ±2 3 ± 0,1 Agua < 0,005 < 0,0003 Exemplo 8: Efeito das concretizações da

Invenção em um modelo de infecção do trato urinário por Escherichia coli em uma linhagem de camundongos insensível ao LPS

As concretizações de acordo com a invenção

foram testadas em um modelo de infecção do trato urinário por E. coli em camundongos insensíveis ao LPS. (Refíra-se a Hopkins e col., "Inheritance of susceptibility to induced Escherichia coli bladder and kidney infections in female C3H/HeJ mice.", J Infect

ío Dis. 1 de fev de 2003; 187(3): 418-23). Esses grupos de camundongos C3H/HeJ fêmeas com 10 a 12 semanas de idade (8 camundongos em cada grupo) foram tratados oralmente com um dentre três extratos diferentes (vide abaixo) por 10 dias antes da infecção por E. coli. Os camundongos C3H/HeJ contêm uma mutação no gene receptor do tipo "toll" TLR4, e são insensíveis aos agonistas do TLR4, tal como os lipopolissacarídeos (LPS). Portanto, esse modelo é adequado para detectar os efeitos dos fármacos agindo por outras vias além do TLR4.

Os camundongos foram mantidos durante o período de tratamento sob condições normais à temperatura ambiente de 18-26 0C e uma umidade relativa de 30 a 70%. O programa de luz foi configurado em um ciclo de luz-escuridão de ío 12:12 horas. Os animais foram alimentados com uma dieta padrão fornecida pelos laboratórios Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN). Pode-se utilizar água de torneira à vontade, a menos que seja indicado no texto.

Os três extratos testados foram:

a) Um extrato obtido por uma forte lise de 18

linhagens de E. coli

b) Um extrato obtido por uma lise moderada de 18 linhagens de E. coli

c) Um extrato obtido por uma mistura de a) e b) (1/4 e 3/4, respectivamente)

Vinte e cinco mg de extrato bacteriano foram administrados a cada camundongo por via oral uma vez por dias durante 10 dias seguidos. Os camundongos foram inoculados por via intravesical com solução tampão fosfato (PBS) ou com a 25 linhagem de E. coli uropatogênica 1677 de acordo com um protocolo de inóculo mínimo que reduz a probabilidade de inoculação associada ao refluxo dos rins e induz infecções em todos os animais inoculados. A linhagem de E. coli 1677, isolada da urina de uma mulher com uma UTI febril, foi usada nesses experimentos. Essa linhagem é a 06 e contém genes para, por 5 exemplo, hemolisina, aerobactina, P fimbriae, e fimbriae tipo 1, mas não para, por exemplo, adesina afimbrial I, fator de necrotização citotóxico IeS fimbriae. Para preparar o inóculo, as bactérias foram cultivadas a partir de estoque congelado por 2 passagens em caldo de triptose (Difco Laboratories), lavadas com ío PBS e ressuspensas a uma concentração 2 x IO10 bactérias/mL. Os camundongos foram destituídos de água por 1 hora e a urina foi removida de suas bexigas imediatamente antes da inoculação. Dez microlitros de inóculo bacteriano foram instilados na bexiga por cateterização uretral sob anestesia de isoflurano, resultando em

O

uma dose de 2 * 10 de E. coli por camundongo. Os animais foram deixados se recuperar da anestesia e a água foi realimentada 1 h depois.

Os camundongos foram mortos 10 dias após a inoculação para avaliar as intensidades das infecções da bexiga e 20 do rim. A bexiga e os dois rins de cada animal foram removidos, pesados, e homogeneizados em PBS estéril, após o que os homogeneizados foram colocados em série em placa sobre ágar de azul de metileno-eosina de Levine (Difco Laboratories). O número de colônias de E. coli em cada placa foi contado após 25 incubação durante a noite a 37°C e foi usado para calcular o número total de bactérias em cada bexiga ou par de rins. Utilizou-se o teste de diferença menos significativa protegido de Fisher para determinar as diferenças estatisticamente significativas entre os valores de unidade de formação de colônia (CFU) total médios para diferentes grupos de 5 camundongos (PBS, grupo infectado não-tratado e grupo infectado e tratado). Os dados de infecção do rim e da bexiga foram transformados usando CFU total = Iog 10 [(CFU + 100)/mg de tecido], em que CFU é o número total de unidades de formação de colônia calculado por amostra de tecido. io Os resultados obtidos são ilustrados nas Figuras

6a e 6b, para a bexiga e para os rins, respectivamente. Em suma, os 3 lisados bacterianos testados diminuíram, por um fator > 3 (bexiga) e > 2 (rins), os valores logarítmicos obtidos, sugerindo que o número de colônias cultivado a partir da bexiga e dos rins 15 foi diminuído pelo menos por um fator de 1000 e 100, respectivamente. Uma vez que os resultados foram gerados em camundongos C3H/HeJ, os efeitos observados são independentes do TLR4.

Exemplo 9: Efeito das concretizações da Invenção em um modelo miirino de infecção intraperitonial por Salmonella typhimurium em uma linhagem de camundongos sensível ao LPS.

Três extratos da invenção, descritos no Exemplo 8, também foram testados em camundongos C57/bl, que possuem uma sensibilidade normal ao LPS. Os três extratos testados foram: a) Um extrato obtido por uma lise forte de 18 linhagens de E. coli

b) Um extrato obtido por uma lise moderada de 18 linhagens de E. coli

c) Um extrato obtido por uma mistura de a) e b)

(1/4 e 3/4, respectivamente)

Os camundongos C57BL/6 foram mantidos por 7 dias antes do tratamento oral com as substâncias mencionadas acima. O experimento consistia de 4 grupos experimentais - 3 ío grupos tratados com os compostos da invenção, e um grupo controle. Cada grupo experimental envolvia 20 camundongos. Os camundongos no grupo controle receberam um tratamento simulado usando a administração oral de 0,5 mL de água diariamente por 10 dias. Para os outros grupos, os extratos foram dissolvidos diariamente em água destilada de modo a ter uma dose única em um volume final de 0,5 mL. Esse volume de 0,5 mL foi administrado por via oral a cada camundongo uma vez por dia durante 10 dias seguidos antes de todos os camundongos serem desafiados com Salmonella. 10 mg de extrato bacteriano foram administrados a cada animal em cada administração.

Para o desafio, uma suspensão da linhagem de Salmonella typhimurium 415 (I. Mechnokov Institute for Vaccines and Sera, Russian Academy of Medicai Sciences) foi injetada por via intraperitonial em cada camundongo.

Um desafio de descoberta de dose preliminar

2 5

(não ilustrado) variou de 10 a 10 CFU de Salmonellae por camundongo. Uma dose de IO4 foi selecionada para o experimento principal, pois essa dose apresentou aproximadamente 50% de sobrevivência nos animais nãotratados. Após o desafio, os camundongos foram mantidos sob as 5 condições padrão para animais de laboratório. Realizou-se observação diária e registros de morte durante um período de 21 dias após a infecção.

A eficácia anti-infecção dos compostos (vide as tabelas abaixo) foi estimada de acordo com a taxa de ío sobrevivência pós-infecção (SR), a duração média de vida pósinfecção (ADL), o fator de defesa (DF), e o índice de eficácia de preparação (EI), que foram calculados para cada grupo experimental. A SR foi obtida como uma porcentagem de animais vivos no grupo experimental no dia 21 após a infecção. O ADL, 15 DF e EI foram calculados usando as seguintes fórmulas:

ADL = (XI + X2 +...+ Xn): N , sendo que o ADL é uma duração média da vida, Xla Xn são durações de vida pós-infecção para os camundongos experimentais #1 a #n, e N é o número total de animais no grupo experimental.

DF = CD : ED ,

sendo que DF é o fator de defesa, CD é uma porcentagem de morte no grupo controle, e ED é uma porcentagem de morte no grupo experimental.

EI = [(DF - 1 ): DF] x 100% , sendo que EI é o índice de eficácia de preparação e DF é o fator de defesa.

Registros de morte nos grupos experimentais durante o período de 21 dias após a infecção com IO4 CFU de Salmonella typhimurium. Os mesmos resultados também são representados na Figura 7.

Pré

trata

ment

o

Númer

o de

camun

dongos

antes

do

desfio

Dias após a infecção

2

8

Mo

rte

Taxa

de

sobrev ivênci a (%)

H7O

19

42

58

Forte

20

15

85

Mode

rado

16

94

Mistu

ra

20

1

1

10

90

10

Número de camundongos mortos encontrados mortos no dia apresentado.

Eficácia de defesa dos extratos no modelo de infecção letal com Salmonella Thyphimurium em camundongos C57BL/6.

Pré- Taxa de índice de ADL DF EI tratamento Morte Sobrevivênci (dias) com (%) a Substâncias H2O 42 58 15,3 1 0 Forte 15 85 19,1 2,8 64 Moderado 94 6 3,3 Sem Sem defesa eficácia Mistura 10 90 20,2 4,2 76 Os extratos (a) e (c) formados a partir C e uma forte lise alcalina (forte) e a partir de uma mistura de lises fortes e moderadas (mistura) foram bem toleradas. O extrato (b) formado a partir de uma lise moderada (moderada) demonstrou uma

toxicidade maior do que a dos outros. Uma redução no tamanho do corpo dos camundongos, e retardos no crescimento dos camundongos foram observados, apesar de não terem sido medidos, no grupo tratado com o extrato (b). Quatro dos 20 camundongos nos grupos experimentais (b) ou "moderados" ío morreram no decorrer do tratamento. Sendo assim, apenas 16 camundongos nesse grupo foram desafiados com Salmonellae.

No grupo controle de camundongos pré-tratados com água, uma taxa de sobrevivência durante o período de observação (21 dias) foi de 58%, e a ADL foi de 15,3 dias. O 15 extrato (b) pareceu não oferecer defesa alguma contra a infecção da Salmonella, e o extrato acelerou a morte dos animais infectados. Especificamente, 90% dos camundongos morreram ao sétimo dias após a infecção, e a ADL foi de 3,3 dias. A taxa de sobrevivência nesse grupo ao vigésimo-primeiro dias após a 20 infecção foi baixa, chegando a 6% (vide as tabelas acima e a figura 7).

Em contrapartida, os extratos (a) e (c), formados a partir de uma lise forte (Forte) ou a partir de uma mistura de lises fortes e moderadas (Mistura) aumentaram a resistência dos camundongos à infecção com Salmonella thyphimurium. Ambas as substâncias apresentaram eficácia de proteção satisfatória. Especificamente, a taxa de sobrevivência após o desafio com o 5 extrato (c) (Mistura) foi de 90%, enquanto que, com o extrato (a) (Forte), ela foi de 85% (tabelas acima e Figura 7).

Exemplos Adicionais

Um extrato de uma ou mais linhagens bacterianas de Escherichia coli, sendo que, durante a preparação ío do extrato, a uma ou mais linhagens bacterianas são submetidas à lise a um pH maior do que 12, e o extrato é tratado de modo a remover os ácidos nucléicos; e sendo que o extrato não apresenta o risco de doenças relacionadas ao príon após a administração ao paciente.

O extrato do parágrafo anterior, obtido a partir

de pelo menos uma linhagem de E. coli escolhida dentre: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081,

082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089.

O extrato do parágrafo anterior, obtido a partir de cada uma das seguintes linhagens de E. coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081, 082,

083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089.

O extrato de qualquer um dos três parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende menos do que 100 μg/mL de ácido nucléico. O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende pelo menos 0,3 mg/mL de sacarídeos.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que pelo menos um sacarídeo é selecionado dentre o grupo que consiste de monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que pelo menos um polissacarídeo é um polissacarídeo ramificado.

O extrato de qualquer um dos parágrafos

anteriores, sendo que pelo menos um sacarídeo é quimicamente modificado.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende entre 0,3 e 4,5 mg/mL de sacarídeos.

O extrato de qualquer um dos parágrafos acima, sendo que a lise é realizada a um pH de 12,6 a 13,4.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato é obtido por lise durante um período de 30 a 120 horas com uma biomassa de 15 a 80 g/L.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato é tratado de modo a remover os componentes particulados e/ou insolúveis.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende entre 1,5 e 2,5 mg/mL de aminoácidos livres. O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que cada linhagem bacteriana é cultivada em um meio que não apresenta um risco de doenças relacionadas ao príon.

O extrato de qualquer uma dos parágrafos

anteriores, sendo que cada linhagem bacteriana a partir da qual o extrato é derivado é cultivada em um meio vegetal ou sintético.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que pelo menos um aminoácido escolhido dentre ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, histidina, alanina, arginina, tirosina, metionina, fenilalanina e lisina é racemizado em pelo menos 10%.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que os aminoácidos livres do extrato compreendem entre 1 e 80% de D-aminoácidos.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que os aminoácidos livres do extrato compreendem entre IOe 45% de D-aminoácidos.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que os aminoácidos livres do extrato compreendem entre 25 e 35% de Daminoácidos.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende pelo menos um Daminoácido escolhido dentre ácido D-aspártico e D-asparagina, ácido D-glutâmico e D-glutamina, D-serina, D-metionina, Dhistidina, D-alanina, D-arginina, D-fenilalanina, D-tirosina, Dleucina, D-lisina, D-valina e D-treonina.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a concentração de qualquer D-aminoácido compreende entre 1 e 50% da concentração de aminoácidos livres.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a concentração de qualquer D-aminoácido compreende entre 10 e 40 % da concentração de aminoácidos livres.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a concentração de qualquer D-aminoácido compreende entre 15 e % da concentração de aminoácidos livres.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende menos do que 5000 ng de equivalentes de LPS por um teste cromogênico de lisado de amebócitos do límulo (LAL).

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o extrato compreende entre 8 e 75 mg/mL de uma ou mais proteínas.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a uma ou mais proteínas possuem pesos moleculares de menos de 30 kDa.

O extrato de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a uma ou mais proteínas possuem pesos moleculares de menos de 10 kDa.

O extrato de qualquer um dos parágrafos

anteriores, sendo que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos insensíveis ao LPS 13 dias após o desafio com a linhagem de E. coli uropatogênica 1677 é de pelo menos 70%, sendo que a dose da linhagem de E. coli uropatogênica 1677 é escolhida de modo que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos controle seja de 60% ou inferior.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 80%.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 90%.

O extrato de qualquer um dos parágrafos

anteriores, sendo que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos sensíveis ao LPS tipo selvagem 13 dias após o desafio com Salmonella thyphimurium é de pelo menos 70%, sendo que a dose de Salmonella thyphimurium é escolhida de 15 modo que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos controle seja de 60% ou inferior.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 80%.

O extrato do parágrafo anterior, sendo que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 90%.

Uma composição farmacêutica compreendendo o extrato de qualquer um dos parágrafos acima.

Um método de tratamento de um indivíduo sofrendo ou sob risco de desenvolver uma doença do trato digestivo ou urinário, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de qualquer um dos extratos dos parágrafos anteriores ao referido indivíduo. O método de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o referido indivíduo é um ser humano.

O método de qualquer um dos parágrafos 5 anteriores, sendo que a doença do trato digestivo ou urinário é escolhida dentre uretrite, nefrite túbulo-intersticial, pielonefrite obstrutiva, infecções do trato urinário devido à uropatia obstrutiva e de refluxo, cistite incluindo cistite crônica, prostatite incluindo prostatite crônica, prostatocistite, doenças inflamatórias pélvicas 10 em mulheres, doença de Crohn e síndrome do intestino irritável.

Um processo para preparação de um extrato obtido a partir de uma ou mais linhagens de E. coli, compreendendo:

(a) cultivar cada linhagem em um meio que não apresenta um risco de doenças relacionadas ao príon;

(b) submeter cada linhagem à Iise a um pH maior do que 12; e

(c) passar o produto de (b) pelo menos uma vez através de um microfiltro e pelo menos uma vez através de um

ultrafiltro.

O processo do parágrafo anterior, sendo que o extrato é obtido a partir de pelo menos uma linhagem de E. coli escolhida dentre: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 0 89. O processo do parágrafo anterior, sendo que o extrato é obtido a partir de cada uma das seguintes linhagens de E. coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089.

O processo de qualquer um dos parágrafos

anteriores, sendo que a Iise é realizada a um pH inicial maior do que 12,5.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a Iise é realizada a um pH inicial de 12,6 a ío 13,4.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a Iise é realizada a uma concentração de íon hidróxido inicial de 0,1 N a 1,1 N.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a Iise é realizada a uma concentração de íon hidróxido inicial de 0,2 N a 1 N.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a Iise é realizada por um período de 20 horas a 10 dias a 30-60 0C.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a Iise é realizada por um período de 40 horas a 72 horas a 35-40 0C.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que o microfiltro é de 0,45 mícron e o ultrafiltro é de 30 KDa

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, adicionalmente compreendendo passar o produto de (c) através de um segundo microfiltro a 0,2 mícron. O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a parte (c) é realizada por filtração de fluxo tangencial.

O processo do parágrafo anterior, sendo que a filtração de fluxo tangencial é realizada por 5 a 15 ciclos.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a filtração de fluxo tangencial é realizada conforme apresentado na Figura 1.

O processo de qualquer um dos parágrafos

anteriores, sendo que a filtração de fluxo tangencial é realizada conforme apresentado na Figura 1, no modo serpentina.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores, sendo que a parte (b) é realizada com 10-120 g/L de peso seco bacteriano de material.

O processo de qualquer um dos parágrafos anteriores,

sendo que a parte (b) é realizada com 15-80 g/L de peso seco bacteriano de material.

Um produto obtido por qualquer um dos processos dos parágrafos anteriores.

Um método de tratamento de um indivíduo sofrendo ou

sob risco de desenvolver uma doença do trato digestivo ou urinário, compreendendo administrar uma quantidade eficaz do produto de qualquer um dos processos dos parágrafos anteriores ao referido indivíduo.

O método do parágrafo anterior, sendo que o indivíduo é

um ser humano.

Claims (55)

1. Extrato de uma ou mais linhagens bacterianas de Escherichia coli, caracterizado pelo fato de que, durante a preparação do extrato, a uma ou mais linhagens bacterianas são submetidas à Iise a um pH maior do que 12, e o extrato é tratado de modo a remover os ácidos nucléicos; e pelo fato de que o extrato não apresenta o risco de doenças relacionadas ao príon após a administração ao paciente.

2.. Extrato, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser obtido a partir de pelo menos uma linhagem de E. coli escolhida dentre: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089.

3.. Extrato, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser obtido a partir de cada uma das seguintes linhagens de E. coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111,9119, 9707 e 9708 e I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e089.

4.. Extrato, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende menos de 100 μg/mL de ácido nucléico.

5..Extrato, de acordo com a reivindicação 1, 2,3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende pelo menos 0,3 mg/mL de sacarídeos.

6. Extrato, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende entre 0,3 e4,5 mg/mL de sacarídeos.

7. Extrato, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um sacarídeo é selecionado dentre o grupo que consiste de monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.

8. Extrato, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos um polissacarídeo é um polissacarídeo ramificado.

9.Extrato, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um sacarídeo é modificado quimicamente.

10.Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a Iise é realizada a um pH de 12,6 a 13,4.

11. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o extrato é tratado de modo a remover os componentes particulados e/ou insolúveis.

12. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que cada linhagem bacteriana é cultivada em um meio que não apresenta um risco de doenças relacionadas ao príon.

13. Extrato, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que cada linhagem bacteriana a partir da qual o extrato é derivado é cultivada em um meio vegetal ou sintético.

14. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende entre 1,5 a 2,5 mg/mL de aminoácidos livres.

15. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende ao menos um aminoácido escolhido dentre ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, histidina, alanina, arginina, tirosina, metionina, fenilalanina e lisina, que é racemizado em pelo menos 10%.

16. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 -15, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos livres no extrato compreendem entre 1 e 80% de Daminoácidos.

17. Extrato, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos livres no extrato compreendem entre 10 e 45% de D-aminoácidos.

18. Extrato, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos livres no extrato compreendem entre 25 e 35% de D-aminoácidos.

19. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende pelo menos um D-aminoácido escolhido dentre ácido D-aspártico e D-asparagina, ácido D-glutâmico e D-glutamina, Dserina, D-metionina, D-histidina, D-alanina, D-arginina, Dfenilalanina, D-tirosina, D-leucina, D-lisina, D-valina e Dtreonina.

20. Extrato, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a concentração de qualquer Daminoácido está entre 1 e 50% da concentração de aminoácidos livres.

21. Extrato, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a concentração de qualquer Daminoácido está entre 10 e 40 % da concentração de aminoácidos livres.

22. Extrato, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a concentração de qualquer Daminoácido está entre 15 e 35 % da concentração de aminoácidos livres.

23. - Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende menos do que 5000 ng de equivalentes de LPS por um teste cromogênico de lisado de amebócitos do límulo (LAL).

24. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende entre 8 e 75 mg/mL de uma ou mais proteínas.

25. Extrato, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas possuem pesos moleculares de menos de 30 kDa.

26. Extrato, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas possuem pesos moleculares de menos de 10 kDa.

27. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos insensíveis ao LPS 13 dias após o desafio com a linhagem de E. coli uropatogênica 1677 é de pelo menos 70%, sendo que a dose da linhagem de E. coli uropatogênica 1677 é escolhida de modo que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos controle tratados com água seja de 60% ou inferior, e sendo que os camundongos experimentais e controle são tratados com o extrato ou com água por um período de 10 dias antes do desafio.

28. Extrato, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 80%.

29.Extrato, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 90%.

30. Extrato, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos com sensibilidade ao LPS tipo selvagem 13 dias após o desafio com Salmonella thyphimurium é de pelo menos 70%, sendo que a dose de Salmonella thyphimurium é escolhida de modo que a taxa de sobrevivência de pelo menos 8 camundongos controle tratados com água seja de 60% ou inferior, e sendo que os camundongos experimentais e controle são tratados com o extrato ou com água por um período de 10 dias antes do desafio.

31. Extrato, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 80%.

32. Extrato, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a taxa de sobrevivência é de pelo menos 90%.

33. Composição farmacêutica adequada para administração a um indivíduo humano, caracterizada por compreender o extrato de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32.

34. Método de tratamento de um indivíduo sofrendo de ou sob risco de desenvolver uma doença do trato digestivo ou urinário, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz do extrato de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32 ou da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33 ao referido indivíduo.

35. Método, de acordo com a reivindicação34, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é um mamífero humano ou doméstico.

36. - Método, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que a doença do trato digestivo ou urinário é escolhida dentre uretrite, nefrite túbulo-intersticial, pielonefrite obstrutiva, infecções do trato urinário devido à uropatia obstrutiva e de refluxo, cistite incluindo cistite crônica, prostatite incluindo prostatite crônica, prostatocistite, doenças inflamatórias pélvicas em mulheres, doença de Crohn e síndrome do intestino irritável.

37. Processo para preparação de um extrato obtido a partir de uma ou mais linhagens de E. coli, caracterizado por compreender: (a) cultivar cada linhagem em um meio que não apresenta um risco de doenças relacionadas ao príon; (b) submeter cada linhagem à Iise a um pH maior do que 12; e (c) passar o produto de (b) pelo menos uma vez através de um microfiltro e pelo menos uma vez através de um ultraflltro.

38. Processo, de acordo com a reivindicação37, caracterizado pelo fato de que o extrato é obtido a partir de pelo menos uma linhagem de E. coli escolhida dentre: NCTC:8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081,082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o extrato é obtido a partir de cada uma das seguintes linhagens de E. coli: NCTC: 8603, 8621,8622, 8623, 9026 , 9111, 9119, 9707 e 9708 e I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 e 089.

40. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que a Iise é realizada a um pH inicial maior do que 12,5.

41. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a Iise é realizada a um pH inicial de 12,6 a 13,4.

42. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da Iise é realizada a uma concentração de íon hidróxido inicial de 0,1 N a 1,1 N.

43. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da Iise é realizada a uma concentração de íon hidróxido inicial de 0,2 N a 1 N.

44. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 43, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da Iise é realizada por um período de 30 a 50 horas a 30 a 40°C.

45. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 43, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma parte da Iise é realizada por um período de 60 a 120 horas a 30 a 40°C.

46. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 45, caracterizado pelo fato de que o microfiltro é de 0,45 mícron e o ultrafiltro é de 30 KDa.

47. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 46, caracterizado por adicionalmente compreender passar o produto de (c) através de um segundo microfiltro a 0,2 mícron.

48. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 47, caracterizado pelo fato de que a parte (c) é realizada por filtração de fluxo tangencial.

49. Processo, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a filtração de fluxo tangencial é realizada por 5 a 15 ciclos.

50. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 49, caracterizado pelo fato de que a parte (b) é realizada com 10-120 g/L de peso seco bacteriano de material.

51. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 50, caracterizado por compreender submeter à Iise pelo menos uma linhagem sob condições de Iise forte e submeter à Iise pelo menos uma linhagem sob condições de Iise moderada, e por adicionalmente compreender misturar os produtos das lises forte e moderada juntos.

52. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 50, caracterizado por compreender submeter à Iise cada linhagem tanto sob condições de Iise forte quanto moderada, e por adicionalmente compreender misturar os produtos das lises forte e moderada juntos.

53. Produto, caracterizado por ser obtido por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a53.

54. Método de tratamento de um indivíduo sofrendo de ou sob risco de desenvolver uma doença do trato digestivo ou urinário, caracterizado por compreender administrar uma quantidade eficaz do produto da reivindicação 53 ao referido indivíduo.

55.Método, de acordo com a reivindicação54, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero humano ou doméstico.