ITRM940794A1 - Antagonisti di interleuchina-6(il-6) che consistono di forme solubili del ricettore alfa di il-6, mutate nell'interfaccia che si lega a gp 130 - Google Patents

Antagonisti di interleuchina-6(il-6) che consistono di forme solubili del ricettore alfa di il-6, mutate nell'interfaccia che si lega a gp 130 Download PDF

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ITRM940794A1 IT000794A ITRM940794A ITRM940794A1 IT RM940794 A1 ITRM940794 A1 IT RM940794A1 IT 000794 A IT000794 A IT 000794A IT RM940794 A ITRM940794 A IT RM940794A IT RM940794 A1 ITRM940794 A1 IT RM940794A1
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Carlo Toniatti
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Description

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo :
"ANTAGONISTI DI INTERLEUCHINA-6 (IL-6) CHE CONSISTONO DI FORME SOLUBILI DEL RECETTORE α DI IL-6, MUTATE NELL'INTERFACCIA CHE SI LEGA A GP 130"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce al settore dell'immunologia. Più precisamente oggetto della presente invenzione sono mutanti delle forme solubili del recettore oc di interleuchina 6 che interferiscono negativamente sulla formazione del complesso recettoriale dimerico fra il complesso recettoriale monomerico IL-6/sIL-6Ra e gp 130. L'invenzione ha per oggetto anche l'uso di questi mutanti come antagonisti di interleuchina-6 per controllare, prevenire e curare le malattie causate da una anormale attività di IL-6.
Il termine "interleuchina 6" o "IL-6", nel contesto della presente invenzione, ha il significato di IL-6, e di suoi frammenti, delezioni, inserzioni, sostituzioni, mutazioni e modificazioni che mantengono le caratteristiche biologiche della IL-6 naturale. Il termine, a meno che non sia specificato altrimenti, si riferisce alla IL-6 umana.
L 'interleuchina 6 suscita una molteplicità di risposte biologiche in diverse cellule bersaglio. Tuttavia - mentre la produzione fisiologica di IL-6 regola la produzione e la maturazione di cellule B, l'attivazione di cellule T e la produzione di proteine di fase acuta nel fegato durante la risposta infiammatoria - la produzione anomala di questa citochina gioca un ruolo importante nella patogenesi di molte malattie di natura infiammatoria, autoimmune e neoplastica.
Come è noto, si registrano nello stato della tecnica diversi tentativi di mettere a punto inibitori della bioattività di IL-6 sia per studiare il ruolo di questa citochina nella genesi delle singole malattie sia per la definizione di preparati farmaceutici a scopo terapeutico.
E' noto anche che la proteina IL-6 umana matura {h IL-6), è un polipeptide di 185 amminoacidi contenente due legami disolfuro (Cys 45 - Cys 51, e Cys 74 - Cys 84). IL-6 funziona attraverso l'interazione di due siti di legame (detti sito I e sito II) con almeno due recettori specifici (IL-Ra e gp 130) sulla superficie delle cellule bersaglio dando origine ad un complesso trimerico IL-6-(recettore)2. Questo complesso si forma in modo sequenziale: un primo recettore (IL-6Ra) si lega al sito I di IL-6 con bassa affinità senza trasmettere il segnale; successivamente un secondo recettore (gp 130) dopo essersi legato al sito II di IL-6 ad alta specificità trasduce il segnale .
Sulla base di questo meccanismo, sono stati progettati mutanti di hIL-6 capaci di legare un primo recettore al sito I, ma incapaci di dimerizzare il recettore per effetto di mutazioni che inibiscono stericamente il legame del secondo recettore al sito II. Mutanti di questo tipo sono stati descritti in WO 94/09138 (Cetus Oncology Corporation) , e WO 94/011402 e PCT/IT 94/00095 (Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A.).
Si è ora trovato inaspettatamente, e questa scoperta costituisce la base della presente invenzione, che sono antagonisti di interleuchina 6 forme solubili del recettore α di IL-6 (SIL-6Rα) contenenti una o più mutazioni nella regione che interferisce con gp 130.
In una forma di realizzazione, sIL-6Ra contiene almeno una mutazione in una posizione scelta tra Ala 228, Asn 230, His 280 e Asp 281. Le mutazioni possono ad esempio essere scelte dal gruppo comprendente: Asn230Asp (SEQ ID NO:l);
In una forma di realizzazione preferita, sIL-6 Ra contiene mutazioni multiple nelle posizioni Ala 228, Asn 230, His 280 e Asp 281. Una mutazione multipla che ha dato buoni risultati è
)
Gli antagonisti di IL-6, che consistono secondo l'invenzione di forme solubili del recettore a di IL-6, mutate nell'interfaccia che si lega a gpl30, possono essere somministrati a concentrazioni terapeuticamente efficaci per la cura e la prevenzione di malattie correlate all'anomala attività di IL-6. A questo fine, gli antagonisti secondo l'invenzione sono somministrati preferibilmente per via endovenosa e/o sottocutanea. Gli esperti del settore conoscono molto bene queste metodologie di somministrazione .
Si è data finora dell'invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà ora fornita una descrizione più dettagliata dell'invenzione, finalizzata a farne meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative.
La figura 1A mostra la risoluzione su gel SDS/PAGE (12%) dei coimmunoprecipitati, in vitro, di mutanti secondo l'invenzione con sgp 130 (forma solubile di gp 130) marcata con <35>S. La figura 1B mostra la posizione del gel corrispondente alla <125>I-IL-6 migrata.
La figura 2 mostra, in forma di istogramma, le diverse capacità del recettore sIL-6Ra selvatico e dei recettori sIL-6Rα mutanti ad interagire con gp 130 sulla membrana di cellule A 375 .
La figura 3 mostra la risoluzione su gel SDS/PAGE (12%) dei coimmunoprecipitati, in vitro, di sgp 130 marcato con <35>S o con 2,0 μg di recettore selvatico o con 2,0 μg di recettore mutante (SEQ ID No:4).
La figura 4 mostra l'attività antagonista del mutante SEQ ID No:4 su cellule HepG2 in confronto alle proprietà agonistiche di shIL-6Rα di tipo selvatico .
La figura 5 mostra la risoluzione su gel del complesso formato da APRF con il sito di legame al DNA (SIE, Serum Inducible Elementi.(Il mutante SEQ ID No:4 non inibisce l'attivazione di APRF dipendente da OM su cellule HepG2).
Antagonisti di IL-6 secondo l'invenzione possono essere prodotti sinteticamente oppure con tecniche ricombinanti. In quest'ultimo caso il cDNA che codifica per il sIL-6Ra può essere incorporato in un plasmide per essere poi espresso in cellule procariotiche oppure eucariotiche. I batteri sono i microrganismi procariotici preferiti .
In alternativa, il cDNA che codifica per i mutanti di sIL-6Ra secondo l'invenzione può essere introdotto in cellule di mammifero: Queste cellule di mammifero possono essere scelte dal gruppo comprendente CHO, COS, C127, HepG2, SK Hep. Inoltre, la proteina può anche essere espressa in cellule di insetto (Sf9 o HighFive) utilizzando la ben nota tecnologia del Baculovirus (ceppo AcNPV) ricombinante .
ESEMPIO 1
Preparazione di mutanti di sIL-6 Rα
Il cDNA di sIL-6Ra è stato ottenuto come frammento di 5'EcoRI-3'XbaI mediante PCR usando il cDNA completo di IL-6Rcx come stampo (Sporeno E., Paonessa G., Salvati A.L., Graziani R., Delmastro P., Ciliberto G. e Toniatti C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 10991-10995. Il primer 3' è stato progettato al fine di introdurre un codone di stop (TAG) artificiale alla posizione amminoacidica 324, preceduto da una sequenza codificante per sei residui di istidina Quest'ultimo accorgimento è stato adottato per far sì che il SIL-6Rα ed i suoi mutanti da noi prodotti posseggano una "coda" di sei istidine, all'estremità carbossi-terminale della molecola, che può risultare utile per la purificazione della molecola mediante cromatografia di affinità per metalli. Il frammento così generato è stato quindi introdotto nel vettore di espressione per cellule COS-7 pcDNAI (Invitrogen), ottenendo così il plasmide pC6FRH .
Il plasmide pC6FRH è stato a sua volta usato come stampo per ottenere costrutti che codificano per i seguenti quattro mutanti: Asn230Asp (SEQ ID
NO :4); mediante una POR a due stadi secondo una metodologia già descritta (Landt 0., Grunert H.P., e Hahn, U. (1990) Gene 96, 125-128).
I mutanti sIL-6Ra vengono quindi espressi in cellule COS-7. A questo riguardo, le cellule COS-7 vengono mantenute in un terreno di Eagle modificato da Dulbecco addizionato con 10% di FCS, più glutammina e antibiotici, al 5% di C02. Per l'espressione delle proteine, 2,5 x 10<6 >cellule COS-7 vengono seminate in piastre da 100 mm per la coltura di tessuti ed il giorno dopo vengono trasfettate con 2 μg dei vari vettori di espressione di sIL-6Rα usando la tecnica DEAE-destrano come descritta in Seed B., Aruffo A (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84, 3365-3369.
16 ore dopo trasfezione le cellule vengono separate, poste in piastre da 100 mm e fatte crescere in terreno completo a 37°C. Dopo 72-96 ore il terreno viene raccolto, centrifugato e usato per esperimenti di co-immunoprecipitazione ed analisi di legame. Per valutare il livello di espressione di ciascun mutante, 2,5 x 10<5 >cellule COS-7 trasfettate vengono poste in piastre da 35 mm e, 48 ore dopo la trasfezione, marcate metabolicamente con [<35>S]metionina per 4 ore. I surnatanti vengono immunoprecipitati con l'anticorpo monoclonale I6R1/9.G11 anti hIL-6Ra. Il materiale immunoprecipitato viene quindi analizzato mediante elettroforesi attraverso un gel di poliacrilammide contenente SDS.
Analisi di legame a IL-6 dei mutanti
Per determinare l'affinità per IL-6 dei mutanti di sIL-6Rα, contenuto nel terreno condizionato di cellule COS, si è sfruttata la presenza nelle proteine da noi prodotte della "coda" di sei istidine.
Quantità appropriate di surnatante di cellule COS trasfettate, precedentemente determinate in esperimenti di titolazione, a cui è stato aggiunto imidazolo fino alla concentrazione finale di 5 mM, vengono mescolate con 20-40pM <125>I-IL-6 e concentrazioni crescenti di citochina non marcata. Nelle condizioni di equilibrio, vengono aggiunti 40 μΐ di Ni<2+>-NTA-Agarosio (Qiagen), resina in grado di legare selettivamente proteine contenenti "code" di istidina, e l'incubazione viene prolungata di un'altra ora. Il ligando legato dal recettore e, quindi, indirettamente associato alla resina viene separato dal ligando libero (surnatante) per centrifugazione mediante uno strato di saccarosio al 30% in PBS. Tutte le operazioni vengono eseguite a 4°C. I valori di cpm {conta di radioattività per minuto) , libera e legata, permettono di tracciare curve di autocompetizione. La Kd apparente dei vari recettori solubili per IL-6 viene determinata mediante la trasformazione di Scatchard dei risultati (v. articolo di Sporeno, Paonessa, Salvati, Graziani, Delmastro, Ciliberto e Toniatti (1994) J. Biol. Chem. 269, 10991-10995). L'analisi dei dati di legame e dell'andamento delle curve è stato fatto usando il software UltraFit (Biosoft<(R)>) su computer Macintosh .
Come si vede dalla tabella 1, l'affinità di legame: 1) non viene sostanzialmente pregiudicata per i mutanti Asn230Asp (SEQ ID NO: 1), Asn230Asp/ Ala228Asp {SEQ ID N0:2); b) viene ridotta in modo lieve ma riproducibile (da 2,5 nM a 6 nM) per His280 Ser/Asp281Val (SEQ ID NO: 3); e c) viene del tutto mantenuta l'attività della forma nativa per il mutante Ala228Asp/Asn230Asp/His280Ser/Asp 281Val (SEQ ID NO: 4).
TABELLA 1
Affinità di legame a IL-6 del recettore solubile di interleuchina 6 (selvatico e mutato) marcato con istidina ed espresso in cellule COS
Mutante Affinità di legame
a IL-6
nM
Legame dei mutanti a ero 130
La formazione dipendente da IL-6 di eterodimeri sIL-6Ra/sgp 130 può essere facilmente determinata in vitro mediante coimmunoprecipitazioni con l'uso di anticorpi monoclonali adatti. Si sono pertanto selezionati i mutanti che mostrano un'affinità di legame per IL-6 dello stesso ordine di grandezza del tipo selvatico ed è stato determinato il loro legame a sgpl30 mediante co-immunoprecipitazione in presenza di IL-6.
sgp 130 marcato con <35>S viene incubato con <125>I-IL-6 (come standard interno per la immunoprecipitazione) e aliquote di mezzo di coltura di cellule COS-7 trasfettate, contenenti sia il recettore nativo che quello mutante. Dopo legame in vitro, viene aggiunto ai miscugli mAb I6/R19.G11 anti IL-6Rα e gli immunoprecipitati vengono risolti su gel SDS/PAGE. I risultati vengono mostrati in figura 1. Come si vede, il mutante His280Ser/Asp281Val (SEQ ID NO:3) riduce fortemente l'associazione del complesso IL-6/sIL-6Rα alla molecola sgpl30 (percorso 4). Anche il mutante con una sola mutazione Asn230Asp (SEQ ID NO:l) esibisce una ridotta interazione con sgpl30 (percorso 2). L'effetto di questo mutante sull'interazione con sgpl30 è dello stesso ordine di grandezza del mutante Ala228Asp/Asn230Asp (SEQ ID NO:2). Infine, la più bassa capacità di coimmunoprecipitare <35>S-gpl30 viene esibita dal mutante quadruplo Ala228Asp/Asn230Asp/His280 Ser/Asp281Val (SEQ ID NO:4, percorso 5).
E' stata anche valutata la capacità dei mutanti di interagire con gpl30 sulla superficie cellulare. A questo fine, sono stati condotti esperimenti di legame su cellule di melanoma umano A375 che hanno un eccesso di molecole gpl30 rispetto a IL-6Ra. Infatti, il legame di <125>I-IL-6 a monostrati di A375 può essere notevolmente esaltato per aggiunta di recettore solubile. Questo fenomeno è dato dalla capacità del sIL-6Ra di legare la <125>I-IL-6 e di interagire successivamente con le molecole di gpl30 presenti sulla superficie delle cellule. La specificità di questa interazione è dimostrata dal fatto che l'aumentato legame di <125>I-IL6 in presenza del sIL-6Ra viene annullato dall'aggiunta di un eccesso di <125>I-IL6 in presenza del sIL-6Ra viene annullato dall'aggiunta di un eccesso di Oncostatina M umana non marcata radioattivamente (OM) (fig.2). Questa citochina è infatti capace di legarsi direttamente a gpl30 e di far concorrenza al legame del complesso IL-6/IL-6Ra con gpl30. A differenza del caso shIL-6Ra di tipo selvatico, si osserva solo un incremento minimo nel legame specifico quando le cellule vengono messe in contatto con <125>I-IL-6 più i recettori solubili mutanti con funzione di antagonisti {figura 2). L'effetto maggiore di disturbo nei confronti dell'interazione con gpl30 viene pertanto esibito dai mutanti His280Ser/Asp281Val (SEQ ID NO:3) e
Dimostrazione che il mutante Ala228Asp/Asn230 Asp/His280Ser/Asp281Val (SEP ID NO:4) è un antagonista di IL-6
I risultati mostrati in precedenza hanno permesso di stabilire che questo mutante è quello che, senza nessuna diminuzione di affinità nei confronti di IL-6, pregiudica in modo maggiore il legame a gpl30. Al fine di studiare l'attività biologica di questo mutante, la sua produzione e quella del recettore solubile nativo sono state aumentate usando il sistema MaxBac<(R) >(Baculovirus Expression System della Invitrogen). I recettori espressi e purificati sono stati provati in esperimenti di immunoprecipitazione.
Cellule Sf9, cresciute in terreno per cellule di insetto di Grace, sono state usate per la trasfezione di vettori di trasferimento, per l'isolamento dei virus ricombinanti e per la preparazione di stock di virus ad alto titolo. Cellule High-Five<(R) >(Invitrogen) sono state invece usate per la produzione delle proteine. In breve, 4 x 10<7 >cellule High-Five<(R) >, cresciute in terreno completo di Grace per cellule di insetto, sono state seminate in flask da 750 mi e infettate con il virus ricombinante appropriato ad una MOI (molteplicità di infezione) di 10. Dopo due ore, le cellule vengono lavate e viene aggiunto il terreno SF-900 esente da siero. I surnatanti della coltura vengono raccolti 36 ore dopo l'infezione, dializzati contro PBS e caricati direttamente su una colonna di Ni<2+>-NTA-agarosio. Dopo lavaggio con PBS/8 mM imidazolo, sia shIL-6Rα selvatico che mutante vengono eluiti in PBS/80 mM imidazolo. La proteina purificata viene dializzata contro PBS ed usata direttamente oppure immagazzinata a 4°C fino a tre settimane.
L'uso di proteine purificate ha permesso di quantificare l'entità di recettore, e di confrontare la capacità del recettore selvatico e del recettore mutante ad interagire con sgpl30 in presenza di un ampio intervallo di concentrazioni di IL-6. I risultati (figura 3) sono in buon accordo con quelli ottenuti in precedenza con recettori derivati da cellule COS. E' interessante osservare che a ciascun punto della curva la quantità di sgpl30 coimmunoprecipitato è minore per il recettore mutante che per il recettore selvatico e questo è vero anche alle concentrazioni più elevate di citochina {100 nM). Questi risultati confermano che l'interazione tra IL-6 e sIL-6Ra mutante genera un complesso con affinità minore per sgpl30.
Per esaminare l'antagonismo potenziale del mutante per l'attività di IL-6, si è scelta l'attivazione dipendente da IL-6 del fattore di trascrizione APRF (Acute Phase Response Factor) /STAT 3 in cellule di epatoma umano. L'attivazione di APRF, che è dipendente dalla fosforilazione di tirosine, è un evento citoplasmatico rapido che ha luogo entro qualche minuto di stimolazione con tutte le citochine della famiglia della IL-6.
Le cellule HepG2 umane vengono stimolate con concentrazioni crescenti di IL-6 insieme ad una quantità fissa di recettori selvatici e mutanti (100 nM). Come si vede in figura 4, mentre shIL-6 Ra potenzia l'induzione di APRF mediante IL-6 (confrontare i percorsi 2-4 e 5-7 in figura 4), il recettore solubile mutante non solo perde qualsiasi attività agonistica, ma riduce anche l'attività della citochina (figura 4, percorsi 8-10) . Come previsto dagli esperimenti di coimmunoprecipitazione , l 'inibizione è completa quando le cellule vengono trattate con IL-6 fino a 20 pM (percorsi 8 e 9 di figura 4) e si evidenzia solo una piccola induzione alle concentrazioni più elevate di IL-6 (200 pM, percorso 10 di figura 4).
Per valutare se l'antagonismo è specifico per IL-6, il mutante viene addizionato a cellule HepG2 indotte con la citochina OM, che è noto essere efficace nell'indurre fosforilazione di APRF. Come si vede dalla figura 5, il mutante non antagonizza l'attività di OM.
LISTA DI SEQUENZE

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Antagonista di interleuchina-6 (IL-6), caratterizzato dal fatto di consistere in forme solubili del recettore a di IL-6 (sIL-6Ra) contenenti una o più mutazioni nell'interfaccia di legame con gpl30.
  2. 2. Antagonista di interleuchina-6 come da rivendicazione 1, in cui sIL-6Ra contiene almeno una mutazione in una posizione scelta dal gruppo comprendente Ala 228, Asn 230, His 280 e Asp 281.
  3. 3 . Antagonista di interleuchina 6 come da rivendicazione 1 o 2, in cui sIL-6Ra contiene la mutazione Asn230Asp (SEQ ID NO:l).
  4. 4. Antagonista di interluchina-6 come da rivendicazione 1 o 2, in cui sIL-6Ra contiene la mutazione Ala228Asp/Asn230Asp (SEQ ID NO:2).
  5. 5. Antagonista di interluchina-6 come da rivendicazione 1 o 2, in cui SIL-6Rα contiene le mutazioni His280Ser/Asp281Val (SEQ ID NO:3).
  6. 6 . Antagonista di interluchina-6 come da rivendicazione 1 o 2, in cui sIL-6Rα contiene le mutazioni Ala228Asp/Asn230Asp/His280Ser/Asp281Val (SEQ ID NO:4).
  7. 7. Uso degli antagonisti di interleuchina 6, come da rivendicazioni da 1 a 6, per lo studio e come da rivendicazioni da 1 a 6, per lo studio e la preparazione di farmaci capaci di controllare, prevenire e curare le malattie causate da una anormale attività di IL-6.
  8. 8. Recettori solubili con funzione di antagonisti di IL-6 e loro uso come precedentemente descritto, esemplificato e rivendicato .
ITRM940794A 1994-12-06 1994-12-06 Antagonisti di interleuchina-6(il-6) che consistono di forme solubili del ricettore alfa di il-6, mutate nell'interfaccia che si lega a gp 130 IT1274350B (it)

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