ITMI971753A1 - Procedimento per isolare proteine anticongelamento da prodotti alimentari e prodotto alimentare congelato contenente proteine per - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
L'invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di un prodotto alimentare contenente AFP e prodotti alimentari contenenti AFP.
Peptidi anticongelamento (AFP) sono stati suggeriti per migliorare la tolleranza al congelamento dei prodotti alimentari.
Proteine anticongelamento sono state descritte nella letteratura, si veda ad esempio Marilyn Griffith e K. Vanya Ewart in Biotechnology Advances, Voi 13, No 3, pp 375-402, 1995. Proprietà anticongelamento possiedono in generale una o più delle seguenti proprietà: isteresi termica, inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio, controllo della forma dei cristalli di ghiaccio ed interazione con nucleatori del ghiaccio.
L'isteresi termica è la proprietà meglio nota degli AFP e la proprietà viene normalmente utilizzata per analizzare la presenza degli AFP. L'isteresi termica deriva come risultato dall'abbassamento della temperatura di congelamento apparente di una soluzione che contiene AFP attivo per isteresi termica senza influenzare la temperatura di fusione. L'identificazione delle fonti di AFP mediante analisi dell'isteresi,termica viene ampiamente descritta nella letteratura, si veda ad esempio John G Durian in Cryobiology 30, 322-328 (1993).
L'inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio è un'altra proprietà degli AFP. Questa attività è pure indicata come soppressione della crescita dei cristalli di ghiaccio. Questa proprietà può essere esaminata confrontando ad un certo punto nel tempo le dimensioni dei cristalli di ghiaccio dei cristalli in presenza di AFP e in assenza di AFP. L'applicazione di questo procedimento nell'analisi degli AFP di pesce è descritta nel brevetto statunitense 5.118.792 (DNA Plant Technology Corporation).
Una terza proprietà degli AFP è la loro capacità di influenzare la forma dei cristalli di ghiaccio. Questa proprietà ha origine dal legame selettivo degli AFP ad alcune facce del cristallo di ghiaccio limitando in questo modo la crescita del cristallo in alcune direzioni. La presenza di cristalli di ghiaccio con una forma a bipiramide esagonale è quindi considerata indicativa della presenza di AFP. Questo procedimento è descritto ad esempio per analizzare l'attività degli AFP di segale invernale extracellulare in WO 92/22581 (Università di Waterloo).
Una quarta proprietà degli AFP è la loro capacità di inibire 1'attività delle sostanze di nucleazione del ghiaccio. Questa interazione fra un AFP e un nucleatore del ghiaccio può avere come risultato ad esempio una isteresi termica aumentata. Questa proprietà viene ad esempio verificata in WO 96/40973 (Università di Notre dame du Lac).
Gli AFP sono stati suggeriti per migliorare la tolleranza al congelamento dei prodotti. Molte applicazioni sono state suggerite in questo contesto.
Ad esempio, gli AFP sono stati suggeriti per migliorare la crioconservazione di materiali biologici (WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Reagents of thè University of California). Inoltre, gli AFP sono stati suggeriti per.impedire perdite da liposomi, ad esempio in sostanze cosmetiche o farmaceutiche (si veda WO 96/20695). Un'ulteriore possibile applicazione è di aumentare la tolleranza al congelamento di piante includono al loro interno (oppure producendo al loro interno transgeneticamente) un AFP {si veda J. Celi. Biochem. Suppl. voi. 14e, 1990, pag 303 XP002030248, Lee ed al., abstract R228). Inoltre si è suggerito l'impiego di AFP di pesce in prodotti alimentari ad esempio per yogurt congelati oppure gelato (US 5.620.732 a nome Pillsbury e WO 96/11586, HSC Research and development limited partnership).
Finora tuttavia l'impiego degli AFP non è stato applicato su scala commerciale. I richiedenti ritengono che una delle ragioni per la mancanza di implementazione commerciale sia che sebbene siano stati descritti molti AFP, in pratica la realizzazione in prodotti commerciali effettivi incontra seri problemi.
I Richiedenti hanno trovato che una delle ragioni chiave per questi problemi è che fra il grande numero di AFP che sono stati descritti nella letteratura solamente un gruppo limitato di AFP può essere opportunamente applicato per ciascuna applicazione; i Richiedenti hanno inoltre trovato che questa scelta di AFP adatta dipende dall'applicazione desiderata e/o dagli attributi di prodotto da ottenere.
WO 90/13571 descrive peptidi anticongelamento prodotti per via chimica o mediante tecniche del DNA ricombinante. Gli AFP possono opportunamente essere utilizzati in prodotti alimentari come ad esempio gelato. L'Esempio 3B mostra forme di cristalli di ghiaccio modificati se una miscela per sorbetto viene congelata in una pellicola in combinazione con lo 0,01% in peso di AFP.
WO 92/22581 descrive AFP derivanti da piante. Questo documento descrive inoltre un procedimento per estrarre una composizione polipeptidica dagli spazi extracellulari di piante infiltrando le foglie con un mezzo di estrazione senza rompere le cellule delle piante.
WO 94/03617 descrive la produzione di AFP da lievito e il loro possibile impiego in gelato. WO 96/11586 descrive AFP derivanti da pesce prodotti da microbi.
La presente invenzione è volta a fornire prodotti alimentari congelati con una consistenza relativamente dura e fragile, detta consistenza essendo conservata anche in seguito a prolungato immagazzinamento a basse temperature.
Diverse fonti della letteratura hanno suggerito che AFP possono essere utilizzati potenzialmente per influenzare in modo favorevole le proprietà di consistenza di prodotti dolciari congelati come ad esempio gelato. Tuttavia, la maggior parte di questi documenti non fornisce insegnamento su come si possano effettivamente ottenere in pratica queste proprietà favorevoli.
WO 96/11586 (non prepubblicato) insegna l'applicazione di polipeptidi anticongelamento di pesce in prodotti alimentari fermentati congelati. Prodotti duri e fragili non sono menzionati.
WO 96/39878 (non prepubblicato) descrive l'applicazione di AFP in un gelato utilizzando un procedimento di congelamento specifico. AFP adatti per questa applicazione possono essere derivati da sangue e da tessuto muscolare di pesci antartici, pesci artici, vermi e insetti. Ancora non si menzionano prodotti fragili e duri.
Si è trovato sorprendentemente che gli AFP possono essere incorporati in modo conveniente in prodotti alimentari congelati per dare come risultato le proprietà di prodotto desiderate posto che il prodotto e le condizioni di trattamento siano variate in modo che la forma dei cristalli di ghiaccio soddisfi gli specifici requisiti.
Di conseguenza, in un primo aspetto, l'invenzione riguarda un procedimento per la produzione di un prodotto alimentare congelato comprendente AFP, in cui le condizioni vengono scelte in modo tale che i cristalli di ghiaccio nel prodotto hanno un rapporto di forma maggiore di 1,9, preferibilmente compreso fra 1,9 e 3,0.
Se i prodotti alimentari vengono congelati, cristalli di ghiaccio si formano in tutto il prodotto. Se gli AFP vengono inclusi nei prodotti alimentari da congelare, ciò può in generale portare ad un cambiamento favorevole nelle proprietà di ricristallizzazione del ghiaccio. L'aggregamento dei cristalli di ghiaccio di prodotti contenenti AFP può provocare fragilità del prodotto.
Molti consumatori sono favorevoli a prodotti alimentari congelati relativamente duri e fragili o loro ingredienti come ad esempio gelato o sorbetto. Per esempio un sorbetto croccante o ghiacciolo croccante può essere utilizzato come ingrediente attraente in prodotti dolciari congelati, pure gelato relativamente duro è apprezzato da un grande gruppo di consumatori.
Sorprendentemente abbiamo trovato gli AFP offrono l'opportunità di formulare prodotti alimentari congelati che da una parte siano relativamente duri e fragili e dall'altra presentino proprietà migliorate di inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio. I Richiedenti hanno trovato sorprendentemente che questa combinazione vantaggiosa delle proprietà può essere ottenuta se il rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio nel prodotto è superiore a 1,9, preferibilmente compreso fra 1,9 e 3.
Il rapporto di forma di cristalli di ghiaccio è definito come il rapporto fra la lunghezza e la larghezza dei cristalli di ghiaccio. Un rapporto di forma superiore, preferibilmente fra 1,9 e 3 corrisponde a cristalli di ghiaccio allungati, che non sono arrotondati di forma. Il rapporto di forma di cristalli può essere stabilito mediante un qualsiasi procedimento adatto. Un procedimento preferito è illustrato negli esempi. Preferibilmente il rapporto è compreso fra 2,0 e 2,9, in modo altamente preferito fra 2,1 e 2,8.
Preferibilmente, il prodotto congelato dell'invenzione è fragile. Preferibilmente lo spessore minimo di strato al quale si può osservare il comportamento di frattura è minore di 10 ira , maggiormente preferito 1-5 mm. Il comportamento da frattura può essere misurato o preparando strati con vario spessore determinando a quale spessore minimo si verifica comportamento da frattura oppure lo si può calcolare dal modulo di Young come descritto negli esempi.
Durante la formulazione e il successivo congelamento di prodotti alimentari diversi parametri possono influenzare il rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio da formare. Esempi di fattori che influenzano il rapporto di forma sono elencati nel seguito. I Richiedenti ritengono che rientri nella capacità dell'esperto del ramo scegliere quelle condizioni per cui il rapporto di forma di cristalli di ghiaccio rientra nell'intervallo desiderato.
Un fattore che influenza il rapporto di forma dei cristalli di ghiacciò è la velocità di congelamento del prodotto. In termini generali, aumentando la velocità di congelamento si diminuisce il rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio. In questo contesto, la temperatura di congelamento può influenzare la velocità di congelamento e quindi il rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio. In questo procedimento, si preferiscono talvolta procedimenti di congelamento che comprendono una fase di indurimento ad esempio ad una temperatura inferiore a -30°F. La temperatura di immagazzinamento e il tempo di immagazzinamento possono pure influenzare il rapporto di forma, per cui temperature di conservazione più elevate e/o tempi di conservazione più lunghi tendono a favorire la formazione di rapporti di forma elevati.
Un altro fattore che influenza il rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio è la mobilità del prodotto durante il congelamento. Ad esempio se si deve congelare una miscela per sorbetto o gelato liquida, il congelamento coescente porta ad un rapporto di forma piuttosto alto per i cristalli di ghiaccio, mentre l'agitazione porta ad un rapporto di forma minore. Miscelazione con alto taglio porta a rapporti di aspetto anche minori..
Un altro fattore che influenza il rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio è la presenza e la quantità degli ingredienti. Ad esempio, la presenza di ingredienti che tendono a formare una struttura reticolare nel prodotto (ad esempio le gomme o i grassi) possono portare ad un rapporto di forma minore dei prodotti senza questi ingredienti. Inoltre altri ingredienti possono condurre ad rapporti di forma minori, come ad esempio livelli di solidi elevati, ad esempio alti livelli di zuccheri possono portare a bassi rapporti di forma.
Infine, la natura e la quantità degli AFP presenti può portare variazioni nei rapporti di forma. Alcuni AFP sembrano favorire la formazione di bassi rapporti di aspetto mentre altri AFP sembrano indurre a rapporti di forma maggiori. Un testo adatto per scegliere questi AFP è descritto negli esempi. La variazione di quantità di AFP può pure portare a variazione dei rapporti di forma.
In conformità con una seconda forma di realizzazione, l’invenzione riguarda un procedimento per la produzione di un prodotto alimentare congelato comprendente AFP, in cui la formulazione, le condizioni di congelamento ed immagazzinamento vengono scelte in modo tale che i cristalli di ghiaccio nel prodotto abbiano un rapporto di aspetto compreso fra 1,9 e 3.
Il procedimento dell'invenzione può essere applicato a qualsiasi prodotto alimentare congelato che contenga AFP. Esempi di prodotti adatti sono le salse, pasti pronti, ecc. Prodotti alimentari preferiti sono prodotti dolciari congelati come ad esempio gelato e sorbetto.
I Richiedenti hanno trovato che gli AFP da utilizzare nel procedimento secondo l'invenzione possono derivare da una pluralità di fonti come ad esempio piante, pesci, insetti e microorganismi. Si possono utilizzare sia specie presenti in natura che specie ottenute mediante modifica genetica. Ad esempio, microorganismi o piante possono essere modificati geneticamente per esprimere AFP e gli AFP possono essere quindi utilizzati secondo la presente invenzione.
Tecniche di manipolazione genetica possono essere utilizzate per produrre AFP come segue. Una cellula o organismo ospite appropriato viene trasformato mediante un "costruttore di geni" che contiene il polipeptide desiderato. La sequenza di nucleotidi che codifica il polipeptide può essere inserita in un vettore di espressione adatto che codifica gli elementi necessari per la trascrizione e la traduzione in modo tale che verranno espressi nelle condizioni appropriate (ad esempio nell’orientamento corretto e nello schema di lettura corretto e con le sequenze desiderate e di espressione appropriate) . I procedimenti richiesti per costruire questi vettori di espressione sono ben noti agli esperti del ramo.
Una pluralità di sistemi di espressione può essere utilizzata per esprimere la sequenza di codifica dei polipeptidi. Questi comprendono, ma non limitatamente, batteri, lievito, sistemi di cellule di insetti, sistemi di colture di cellule di piante e piante, il tutto trasformato con i vettori di espressione appropriati.
Un'ampia varietà di piante e di sistemi di cellule di piante possono essere trasformati con i costrutti di acidi nucleici dei polipeptidi desiderati. Forme di realizzazione preferite comprendono ma non limitatamente mais, pomodoro, tabacco, carote, fragole, semi di colza e bietola da zucchero.
Allo scopo dell'invenzione gli AFP preferiti vengono derivati da pesce (cioè vengono ottenuti direttamente da pesce o dalle proteine di pesce prodotte transgeneticamente da altri organismi. Particolarmente preferito è l'impiego di proteine di pesce del tipo III, maggiormente preferito HPLC 12 come descritto nel nostro caso non prepubblicato PCT/EP96/02936 (WO 97/2343).
Per alcune fonti naturali gli AFP possono consistere di una miscela di due o più AFP differenti.
Preferibilmente si scelgono quegli AFP che hanno proprietà di inibizione della ricristallizzazione del ghiaccio significative. Preferibilmente, gli AFP secondo l'invenzione forniscono dimensioni delle particelle di ghiaccio dopo la ricristallizzazione - preferibilmente misurate secondo gli esempi - minori di 20 μπν, maggiormente preferito è l'intervallo di 5-15 pm. Si ritiene che piccole dimensioni dei cristalli di ghiaccio in combinazione con il rapporto di forma specifico sia particolarmente vantaggioso per ottenere le caratteristiche strutturali desiderabili.
Una forma di realizzazione molto vantaggiosa dell'invenzione riguarda formulazioni di prodotto che vengono scelte in modo tale che nella preparazione del prodotto si possono utilizzare condizioni di congelato coescente, pur ottenendo ancora il rapporto di forma come descritto sopra.
Esempi di tali prodotti alimentari congelati sono: miscele per dolci congelati come ad esempio miscele per gelato e miscele per sorbetto che sono destinate ad essere conservate a temperatura ambiente o di frigorifero. Forme di prodotto adatte sono ad esempio: una miscela in polvere che viene confezionata ad esempio in un sacchetto o in buste. Detta miscela essendo in grado di costituire la base del prodotto alimentare congelato, ad esempio dopo l'aggiunta di acqua e opzionalmente altri ingredienti e - opzionale - aerazione.
Un altro esempio di una miscela adatta potrebbe essere una miscela liquida (opzionalmente aerata) che se necessario dopo l'aggiunta di ulteriori componenti e ulteriore aerazione opzionale può essere congelata.
Il chiaro vantaggio delle miscele menzionate sopra è che la presenza degli ingredienti AFP consente di congelare le miscele in condizioni coescenti ad esempio in un congelatore da negozio o domestico.
In modo estremamente conveniente queste miscele vengono confezionate in contenitori chiusi (ad esempio cartoni, sacchetti, scatole, contenitori di plastica, ecc). Per porzioni singole il formato della confezione sarà in generale da 10 a 1000 g. Per porzioni multiple formati di confezioni di fino a 500 kg possono essere opportuni. In generale il formato della confezionato sarà compreso fra 10 g e 5000 g.
Come indicato sopra, i prodotti preferiti in cui si utilizzano gli AFP sono prodotti dolciari congelati come ad esempio gelato o sorbetto. Preferibilmente il livello di AFP è compreso fra 0,0001 e 0,5% in peso rispetto al prodotto finale. Se si utilizzano miscele secche o concentrati, la concentrazione può essere maggiore al fine di garantire che il livello del prodotto congelato finale rientri negli intervalli indicati sopra.
Sorprendentemente si è trovato che combinazioni dell’invenzione possono contenere quantità molto basse di AFP pur presentando ancora buona qualità.
Finora, si riteneva in generale che livelli piuttosto elevati di AFP fossero necessari per ottenere un miglioramento ragionevole delle proprietà di ricristallizzazione. Una ragione di ciò è che si riteneva comunemente che gli AFP agiscono su parti significative della superficie dei cristalli di ghiaccio e che quindi dovessero essere presenti a livelli piuttosto elevati, ad esempio 0,01% o più per ottenere un effetto ragionevole.
Sorprendentemente si è trovato anche che per prodotti congelati si possono già ottenere proprietà migliorate di ricristallizzazione e tolleranza maggiore alla temperatura se si utilizzano livelli bassi di AFP. si è trovato sorprendentemente che i livelli di AFP possono essere persino di 0,1-50 ppm e tuttavia fornire ancora proprietà di ricristallizzazione adeguate e tolleranza alla temperatura adeguata in prodotti dolciari congelati. Sebbene i Richiedenti non desiderino essere limitati in qualsiasi modo da una teoria, la ragione può consistere nel fatto che l'interazione fra i solidi del dolce congelato e gli AFP fornisce un meccanismo eccellente per inibire la crescita dei cristalli. In modo altamente conveniente, il livello degli AFP è compreso fra 1 e 40 ppm, si preferisce in particolare 2-10 ppm.
Per gli scopi dell'invenzione, il termine prodotti dolciari congelati comprende dolci congelati contenenti latte come ad esempio gelato, yogurt congelato, sorbetto, latte congelato (ice milk) e creme congelate, ghiaccioli, granite e purè di frutta congelati. Per alcune applicazioni, si preferisce meno 1'impiego di AFP in prodotti alimentari fermentati congelati.
Preferibilmente, il livello di solidi nel dolce congelato (ad esempio zucchero, grasso, aromatizzante, ecc.) è maggiore del 4% in peso, più preferibilmente maggiore del 30% in peso, maggiormente preferito il 40-70% in peso.
In una forma di realizzazione particolarmente preferita dell’invenzione, si utilizzano formulazioni per dolci congelati duri e croccanti per creare un contrasto di consistenza nel gelato. Preferibilmente, tali gelati contengono come elementi discreti nella loro struttura la composizione contenente AFP secondo l'invenzione. Ad esempio, un nucleo di gelato relativamente morbido può essere rivestito con un sottile strato della composizione dell'invenzione così da fornire uno strato relativamente duro e croccante che circonda il nucleo di gelato. Un'altra forma di realizzazione potrebbe essere l'incorporazione della formulazione dell'invenzione come inclusioni nei gelati. Una terza forma di realizzazione è di alternare le strati di gelato con la formulazione dell'invenzione per creare sottili strati croccanti alternati con strati di gelato.
Questa miscela può essere convenientemente immagazzinata a temperatu- -ra ambiente ad esempio in un contenitore di plastica.
Le miscele possono essere utilizzate nella preparazione di un gelato mediante omogeneizzazione a 2000 libbre per pollice quadrato e a 65°C con successivo invecchiamento durante la notte .a 5°C. La miscela è stata congelata utilizzando un freezer (MF50 SSHE.Technohoy dotato di uno sminuzzatore di solidi rotante a 240 giri al minuto). La temperatura di estrusione era -4,5°C, l'overrun era del 110%. Il prodotto è stato quindi congelato a -35°C e conservato a -80°C.
Dopo una conservazione o immagazzinamento di due mesi, la composizio-
ne secondo l'invenzione presentava una consistenza nettamente migliore del
campione di controllo.
Esempio II
Un gelato è stato preparato con la formula seguente:
Ingrediente % in peso
Polvere di latte scremato 10,00
Saccarosio 13.00
Maltodestrina (MD40) 4,Ó0
Gomma di semi di carruba 0,14
Olio di burro 8.00
Monogliceride (palmitato) 0,30
Vanillina 0,01
AFP (Tipo III HPLC-12) 0,01 o niente (controllo) Acqua il resto
Il procedimento di preparazione è stato come nell'Esempio I.
Campioni di entrambi i prodotti sono stati posti all'equilibrio a
-18°C in un armadietto ambientale Prolan per approssimativamente 12 ore.
Vetrini da microscopio sono stati preparati strisciando un sottile strato
di gelato dal centro dei sottili vetrini di vetro.
Ciascun vetrino è stato trasferito ad uno stadio di microscopio con-
trollato in temperatura (a -18°C) ove sono state raccolte immagini di cri-
stalli di ghiaccio (circa 400 cristalli di ghiaccio singoli) che sono sta-
ti inviati attraverso una telecamera ad un sistema di memorizzazione e di
analisi delle immagini.
Le immagini memorizzate dei cristalli di ghiaccio sono state eviden-
ziate a mano tracciando il perimetro che quindi evidenzia l'intero cristallo. Le immagini dei cristalli evidenziati sono state quindi misurate utilizzando software di analisi dell'immagine che conta il numero di pixel richiesti per completare la linea retta più lunga (lunghezza), la linea retta più breve (larghezza), il rapporto di forma (lunghezza/larghezza).
Si è controllato il rapporto di forma medio per i cristalli.
Per il campione di controllo il rapporto di forma era 1,45.
Per il campione contenente AFP il rapporto di forma era 2,24.
Esempio III
La fragilità del gelato dell'Esempio 2 è stata determinata mediante calcoli sul comportamento da frattura del gelato- Il modulo di Young è stato misurato mediante un test di piega a 3 punti.
Il modulo di Young è stato misurato preparando strisce di gelato, ponendole in equilibrio per 18 ore in un armadio congelatore e trasferendole ad un armadietto in temperatura. Le strisce sono state poste su una maschera di piegatura a 3 punti come descritto nel Handbook of Plastica Test Methods (2a Edizione1. ed. R.P. Brown, George Godwin Ltd, 1981. L'analisi dei campioni è stata svolta immediatamente ad una velocità di deformazione di 50 mm/min. Dalla curva forza-deformazione, si è misurata l’inclinazione ovvero il coefficiente angolare iniziale e lo si è utilizzato per calcolare il modulo di Young secondo l'equazione seguente:
- ove L = estensione della trave (110 mm), B = larghezza del campione, W = altezza del campione. Solitamente si sono analizzati otto campioni per fornire un valore medio del modulo di Young.
Utilizzando i calcoli descritti da Williams & Cawood in Polymer Testing 915-26 (1990) si può calcolare la durezza alla frattura.
I risultati erano i seguenti: Per il campione di controllo si è calcolato uno spessore di 966 metri come necessario per ottenere uno strato fragile. Per il campione contenente AFP si è già trovata fragilità (comportamento da frattura) ad uno spessore di 3 mm. Ciò mostra chiaramente la migliore fragilità dei prodotti dell'invenzione. Entrambi i campioni davano prodotti relativamente morbidi.
Esempio IV
Questo esempio descrive una metodologia per scegliere quegli AFP che favoriscono la formazione di forme di cristalli di ghiaccio come preferito nell'invenzione.
La crescita dei cristalli di ghiaccio in circostanze normali avviene lungo l'asse a del cristallo. Se sono presenti AFP, la crescita cambia. Questa influenza selettiva della forma dei cristalli può essere spiegata dal fatto che gli AFP tendono a legarsi ad alcune parti di cristalli dei ghiaccio e cosi facendo inibiscono la crescita del cristallo di ghiaccio in alcune direzioni, il legame può avvenire ad esempio in corrispondenza dei piani del prisma (perpendicolare all'asse a) oppure in corrispondenza di piani piramidali (che sporgono da questi piani).
I richiedenti hanno trovato che gli AFP che favoriscono la formazione di rapporti di forma secondo la presente invenzione possono essere trovati scegliendo ad esempio quegli AFP che tendono a legarsi sul piano del prisma. La metodologia per scegliere questi AFP a legame specifico può essere una qualsiasi metodologia adatta. Un test adatto impiega il cosiddetto esperimento di crescita "dell'emisfera di cristallo di ghiaccio singolo" che si basa sulla tecnica descritta in Knight C.A., C.C. Cheng e A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of a-helical antifreeze peptides on speci fic ice crystal sur face planes .
Un beaker di plastica ben isolato da 5 litri è stato riempito con acqua deionizzata e lo si è posto in un armadio a temperatura controllata a -1“C. Lo si è quindi lasciato congelare lentamente alla sommità. Dopo due giorni un singolo cristallo di ghiaccio di approssimativamente 4 cm di spessore copriva il beaker. L'orientamento cristallografico di questo cristallo è stato determinato utilizzato procedimenti di diffrazione dei raggi X per cristallo singolo. Cubetti di ghiaccio di approssimativamente 2 cm di dimensione sono stati tagliati dal cristallo singolo grande, in modo tale che una superficie fosse parallela al piano del prisma e un'altra parallela al piano basale. Si sono prodotti singoli cristalli di ghiaccio così orientati.
Si è utilizzata un'apparecchiatura che consiste di un dito freddo di ottone (diametro di approssimativamente 1 cm) su cui si è congelato un cristallo a semenza orientato. La semenza è stata dapprima cavata in modo tale che il cristallo di semenza si adattasse attorno ad essa. Refrigerante è stato quindi fatto circolare attraverso il dito e la semenza si è congelata rapidamente ad esso.
Il dito con il cristallo di semenza è stato quindi immerso in un beaker da 100 mi isolato contenente una soluzione di materiale che veniva investigato. La temperatura iniziale della soluzione era la temperatura ambiente (circa 18°C)f e l'unico raffreddamento è stato fornito dal dito freddo. Inizialmente il cristallo di semenza si è sciolto parzialmente ma quindi è cresciuto in un singolo cristallo emisferico. Dopo diverse ore (6-8) si era formata un'emisfera con diametro di 5-7 cm.
L'esperimento è stato svolto con varie soluzioni di AFP. Le soluzioni di AFP utilizzate avevano una concentrazione di AFP di 10-3 mg/ml.
L'emisfera è stata quindi rimossa dal dito freddo e portata ad un armadietto a temperatura controllata a -15°C. La superficie è stata rigata ed è stato lasciato nell'armadietto almeno durante la notte (16 ore o più). Aria è stata fatta circolare attraverso 1'armadietto mediante una ventola integrale. Durante questo tempo si è verificata evaporazione degli strati superficiali del ghiaccio. La superficie dell'emisiera di ghiaccio quindi giungeva ad avere una superficie liscia come uno specchio. Tuttavia, per un'emisfera contenente ASP si osservano sulla superficie chiazze grossolane. Queste corrispondono alle chiazze in cui l'AFP si era legato sulla superficie dell'emisfera. Grandi molecole di AFP impediscono che le molecole di ghiaccio evaporino e quindi un grossolano intreccio di molecole di AFP si accumula sulla superficie in corrispondenza delle superfici ove si verifica il legame preferenziale al ghiaccio. Poiché l'orientamento dell'emisfera è noto, e si può misurare la distanza angolare fra tali chiazze grossolane e le direzioni basale e del prisma mediante un goniometro ottico, si può facilmente determinare la natura del piano di legame.
Questo test può essere utilizzato per scegliere quegli AFP che tendono a legarsi ai piani primari o secondari del prisma. Ad esempio, pleuronectes flesus (Winter flounder) oppure da pleuronectes platessa (Alaskan plaice) tende a legarsi al sito di legame (20 - 21 mentre AFGP da merluzzo dell'Antartico tende a legarsi al sito di legame (10-10)<3 >° <5>, mentre AFP III da zoarces (Antartic eel pout) tende a legarsi al sito di legame (10 - IO)<2 >° <3>.
Rientra nella capacità dell'esperto del ramo utilizzare l'analisi di cui sopra per determinare questi AFP che tendono a favorire la formazione di elevati rapporti di forma dei cristalli di ghiaccio. Per verificare se sono adatti in prodotti congelati dell'invenzioné, si può realizzare l'effettivo prodotto e si può determinare il rapporto di forma dei cristalli nel prodotto.
Esempio V
Test per determinare la dimensione di cristalli di ghiaccio dopo ricristallizzazione.
Un campione di soluzione contenente AFP in acqua è stato regolato con un livello di saccarosio del 30% in peso (se il livello di partenza del campione è maggiore del 30% questo può essere effettuato mediante diluizione, se il livello di partenza è inferiore si aggiunge saccarosio fino al livello del 30%).
In generale, la prova può essere applicata a qualsiasi composizione adatta comprendente AFP e acqua. In generale, il livello di AFP in una tale composizione di prova non è particolarmente critico e può essere compresa ad esempio fra 0,0001 e lo 0,5% in peso, maggiormente preferito fra lo 0,0005 e lo 0,1% in peso, altamente preferito è fra lo 0,001 e lo 0,05% in peso, ad esempio 0,01% in peso.
Una goccia da 3 pL del campione è stata posta su un vetrino coprioggetto da 22 mm. Un vetrino coprioggetto di diametro da 16 mm è stato quindi posto in cima e si è posto un peso da 200 g sul campione per garantire uno spessore uniforme del vetrino. I bordi del vetrino coprioggetto sono stati sigillati con smalto per le unghie trasparente.
Il vetrino è stato posto su uno stadio di microscopio a temperatura controllata Linkham THM 600. Lo stadio è stato raffreddato rapidamente (50°C al minuto) fino a -40°C per produrre una grande popolazione di piccoli cristalli. La temperatura dello stadio è stata quindi aumentata rapidamente (50°C al minuto) fino a -6"C e tenuta a tale temperatura.
La fase dei gas è stata osservata a -6°C utilizzando un microscopio Leica Aristoplan. Condizioni di luce polarizzata in congiunzione con una piastra lambda sono state utilizzate per aumentare il contrasto dei cristalli di ghiaccio. Lo stato della fase di ghiaccio (dimensione dei cristalli di ghiaccio) è stata registrata mediante fotomicrografia a 35 mm a T=0 e T=1 ora. Una dimensione di particelle medie (determinazione visiva, media numerica) minore di 20 μm, maggiormente preferito fra 5 e 15 pm indica gli AFP preferiti da utilizzare in prodotti secondo l'invenzione.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di un prodotto alimentare congelato comprendente AFP, in cui le condizioni vengono scelte in modo tale che i cristalli di ghiaccio nel prodotto abbiano un rapporto di forma maggiore di 1,9.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il rapporto di forma è compreso fra 1,9 e 3,0.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui le condizioni per influenzare il rapporto di forma vengono scelte dal gruppo di; velocità di congelamento, mobilità del prodotto durante il congelamento, temperatura di immagazzinamento e tempo di immagazzinamento, formulazione del prodotto e natura e quantità degli AFP e delle loro combinazioni.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il prodotto alimentare congelato è un prodotto dolciario congelato.
- 5. Prodotto dolciario congelato comprendente dallo 0,0001 allo 0,5% in peso di AFP, detto prodotto avendo un rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio maggiore di 1,9.
- 6. Prodotto dolciario congelato secondo la rivendicazione 5, in cui il rapporto di forma è compreso fra 1,9 e 3,0.
- 7. Prodotto dolciario congelato secondo la rivendicazione 5, in cui 1'AFP si lega preferibilmente ai piani del prisma primario o secondario dei cristalli di ghiaccio.
- 8. Prodotto dolciario congelato con un contrasto di consistenza, detto prodotto comprendendo elementi discreti di un prodotto dolciario secondo la rivendicazione 5.
- 9. Prodotto dolciario congelato secondo la rivendicazione 8, comprendente sottili strati di gelato alternati con sottili strati di sorbetto o ghiacciolo, in cui gli strati di sorbetto o ghiacciolo comprendono dallo 0,0001 allo 0,5% in peso di AFP e hanno un rapporto di forma dei cristalli di ghiaccio compreso fra 1,9 e 3,0.
- 10. Miscela per gelato adatta all'impiego nella preparazione di un prodotto dolciario congelato secondo la rivendicazione 5.
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