ITMI20102092A1 - Processo per ottenere condroitina solfatata in posizione 4 o 6 dei residui di n-acetil-galattosammina - Google Patents

Description

Descrizione della domanda di brevetto per invenzione dal titolo: "Processo per ottenere condroitina solfatata in posizione 4 o 6 dei residui di N-acetil-galattosammina.â€

Campo dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce al campo dei processi per la modificazione strutturale di polisaccaridi.

Stato deH’arte

La condroitina solfato appartiene alla più ampia famiglia dei glicosamminoglicani, detti GAGs Questi polisaccaridi, legati covalentemente a proteine, come proteoglicani, sono componenti ubiquitari della matrice extracellulare di tutti i tessuti connettivi, in cui assolvono a numerose funzioni.

La condroitina solfato à ̈ un polisaccaride naturale lineare formato dall'alternanza di residui di N-acetil-D-galattosammina β 1→4 e D-glucuronato β 1→3. Nei vertebrati la condroitina à ̈ presente in forma variamente solfatata, i residui coinvolti nella solfatazione sono gli ossidrili 4 e 6 della /V-acetil-D-galattosammina e solo in alcuni casi anche quelli 2 e 3 dell’acido glucuronico.

Il peso molecolare della condroitina e l’entità e i siti della solfatazione dipendono dalla specie, dall’età e dalla tipologia del tessuto.

La condroitina solfato à ̈ utilizzata come farmaco condroprotettivo e antireumatico, con applicazioni nella terapia di osteoartriti tibiofibulari del ginocchio e nelle osteoartriti della cartilagine articolare.

Attualmente la condroitina solfato si ottiene con tecniche estrattive da varie fonti animali, come cartilagini di maiale, pinne di pescecane e cartilagini di teleostei. La scarsità della materia prima e la complessità del downstream di purificazione limitano a livello mondiale la disponibilità di questo principio attivo, il cui mercato à ̈ pertanto controllato daH’impossibiltà di soddisfare una domanda attualmente in crescita. Inoltre le sempre più severe normative in materia di sicurezza di farmaci di derivazione animale, che di continuo sono emanate, potrebbero in prospettiva escludere dal mercato farmaceutico la condroitina solfato estrattiva.

Esiste pertanto un crescente interesse allo sviluppo di strategie produttive alternative di tipo biotecnologia) e chimico sintetico per ottenere questo tipo di polisaccaridi o loro precursori.

Nella letteratura scientifica (Rodriguez ML et al., Eur. J. Biochem., 1988, 177, 117-24; Manzoni M et al., Biotechnology Lettere, 1996, 18, 383-6) e brevettuale (WO 01/02597 A1) à ̈ riportata, la possibilità di produrre per via fermentativa, utilizzando ceppi di E. coli K4 wild type o ricombinanti che producono un derivato della condroitina, il polisaccaride K4, il cui scheletro carbonioso à ̈ identico a quello della condroitina, fatta eccezione per l’innesto a livello del C3 dell’acido glucuronico di residui di α-fruttofuranosio. Dal polisaccaride K4 può essere ottenuta la condroitina con un’idrolisi acida controllata dei residui di fruttosio.

Le alte rese produttive, la semplicità del downstream di purificazione sviluppato, i bassi costi complessivi del processo, il suo ridotto impatto ambientale rendono la sintesi suddetta superiore alle strategie biotecnologiche precedentemente descritte.

Pertanto detto processo fermentativo, se opportunamente integrato con una strategia di solfatazione chimica regioselettiva della condroitina, può rendere la via biotecnologica competitiva nei riguardi dei processi estrattivi convenzionali della condroitina solfato da materie prime di origine animale, che le recenti evoluzioni normative in materia di sicurezza di prodotto potrebbero eliminare dal mercato farmaceutico.

La solfatazione di polisaccaridi relazionati strutturalmente alla condroitina, quali i polisaccaridi K4, e K5, formati, come detto, da sequenze repetitive di acido glucuronico e N-acetil-glucosammina per K5 e acido glucuronico e N- acetilgalattosammina per K4, su cui in questo caso si innestano a livello dell'acido glucuronico in posizione 2 residui di fruttosio, Ã ̈ descritta in una serie di lavori e brevetti, ma nessuno di questi documenti prevede processi di solfatazione regioselettivi che portino a condroitina solfato con le stesse caratteristiche strutturali di quella umana.

Rimane pertanto attuale, ma insoluto, uno schema sintetico per la solfatazione regioselettiva della condroitina che porti a un pattern di solfatazione analogo a quello che caratterizza la condroitina umana e quella di derivazione estrattiva, oggi ampiamente utilizzata come farmaco condroprotettivo e antireumatico nel trattamento delle patologie articolari.

Sommario

E' descrìtto un processo che permette di ottenere mediante sintesi chimica a partire da condroitìna ottenuta per via biotecnologica il pattern di solfatazione analogo a quello che caratterizza la condroitìna umana e quella di derivazione estrattiva, utilizzando approcci sintetici compatibili con lo scale up industriale.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione, superando i problemi presenti nei processi noti dello stato della tecnica, consente di ottenere mediante sintesi chimica condroitìna solfatata, in cui sulla stessa catena polisaccaridica i residui di N-acetil-galattosammina sono solfatati in posizione 4 o 6, in analogia con quanto si osserva nella condroitìna solfato umana e in quella oggi ottenuta per estrazione da fonti animali.

La presente invenzione si riferisce quindi a un processo per la produzione di condroitìna solfato, in cui sulla stessa catena polisaccaridica sono presenti residui di galattosammina solfatati in posizione 4 o 6, caratterizzato dalle seguenti fasi: a) formazione del rispettivo 4,6-benzilidene derivato sui residui di /V-acetilgalattosammina di condroitìna in forma acida b) acilazione degli ossidrili 2 e 3 dei residui di acido giucuronico; d) apertura ossidativa del ciclo benzilidenico; d) solfatazione degli ossidrili 4 o 6 dei residui di galattosammina; e) eliminazione del gruppo protettore benzoilico dalle posizioni 4 o 6 dei residui di /V-acetilgalattosammina e dei gruppi protettori acetilici sugli ossidrili 2 e 3 dei residui di acido giucuronico; f) purificazione della condroitìna 4 o 6 solfatata.

Il processo secondo l’invenzione à ̈ schematizzato qui di seguito.

SCHEMA

HOOC,

q

V AcHN

α,α-dimetossitoluene DMF

acido canfor-10-solfonico T=80°C

HOOC,

AcHN

anidride acetica

acetoni trile

trietilammina

4-(dimetilaramino)-piridina yj

AcHN

H20 - acetato d'etile

NaBr03>Na2S2C

NaOOC,

AcHN

R=H, R— Bz R=Bz, R^H

DMF

complesso S -piridna

T=50°C

pH=l-2

T=50°C

pH=13

r.t.

V

R=H, R'=S03Na<+>+ R=S03Na<+>, R'=H

Elemento chiave del processo secondo l’invenzione di sintesi à ̈ l’apertura ossidativa del ciclo benzilidenico che consente di proteggere selettivamente le posizioni 4 o 6 della N-acetil-galattosammina con un gruppo benzoilico. In tal modo la catena polisaccaridica, dopo soli 3 passaggi di protezione, presenta unità disaccaridiche aventi un’unica funzione alcolica ancora libera, ed esclusivamente sulla posizione 4 o 6 del residuo di N-acetilgalattosammina. La solfatazione esauriente di un polisaccaride così protetto produce facilmente una condroitina solfato, in cui sulla stessa catena polisaccaridica sono presenti residui di N-acetilgalattosammina solfatati in posizione 4 o 6 . L’eliminazione idrolitica dei gruppi protettori fornisce una condroitina solfato con caratteristiche di peso molecolare e pattern di solfatazione analoghi a quelli della condroitina umana. Lo schema di reazione rivendicato, caratterizzato da un unico processo di purificazione finale basato su processi di membrana facilmente scalabili industrialmente, permette di ottenere condroitina 4 o 6 solfato con buone rese e a costi compatibili con lo scale up industriale.

Di seguito, si riportano esempi che descrivono la produzione di condroitina solfatata, in cui sulla stessa catena polisaccaridica i residui di N- acetilgalattosammina sono solfatati in posizione 4 o 6, una caratteristica strutturale ricorrente nella condroitina solfato umana e in quella oggi utilizzata come farmaco ottenuta per estrazione da fonti animali.

ESEMPIO 1 -. Sintesi del 4,6-benzilidene derivato della condroitina Preparazione della condroitina acida

50 grammi di condroitina ottenuta per via fermentativa come descritto nella Domanda di brevetto italiano n° 1 312 984 avente un peso molecolare di 38 kDa e purezza > 90% sono sciolti in 1,5L di acqua MilliQ e tenuti in batch sotto agitazione per circa 2h a temperatura ambiente con 250g di resina FLUKA Dowex 50 WX8 H+ form 50-100 mesh a scambio cationico, precedentemente lavata e neutralizzata con acqua. Lo slurry successivamente à ̈ sversato in una colonna in vetro con setto poroso (porosità 3) da 50mm di diametro, formando un letto alto circa 50cm. Si eluisce con acqua MilliQ finché l’eluato risulta avere un pH ≤2 . Successivamente si lava ancora con 250mL di acqua MilliQ fino alla neutralità dell’eluato. Per un migliore recupero del prodotto la soluzione di lavaggio à ̈ addizionata al precedente eluato contenente la condroitina acida e la soluzione risultante à ̈ liofilizzata. Il liofilizzato, ridotto in polvere fine in un varing blendor à ̈ ulteriormente essiccato sotto vuoto overnight. La condroitina in forma acida à ̈ ottenuta con una resa molare superiore al 95%.

Sintesi del 4,6-benzilidene derivato della condroitina

42, 1g (0,1 l imoli) di condroitina acida sono sospesi in 1L di N,N-dimetilformammide anidra e alla miscela sotto agitazione a temperatura ambiente si aggiungono in sequenza 167mL di a ,a -dimetossitoluene (1,11 moli) e 6,2g di acido canfor-1 0-solfonico (26,6mmoli). La miscela à ̈ messa a reagire a 80°C per 20h. Con il procedere della reazione la sospensione diviene sempre più limpida, fino a ottenere una soluzione omogenea. Il 4,6-benzilidene derivato della condroitina à ̈ precipitato con 2,5L di acetone freddo e il precipitato à ̈ separato dal surnatante ed essiccato sotto vuoto overnight. Si ottengono 49, 6g di 4,6-benzilidene derivato della condroitina, con una resa molare del 92,8%. L’avvenuta benzilidenazione viene visualizzata in due porzioni dello spettro<1>H-NMR: presenza di un segnale slargato a circa 7.3ppm (protoni dell’anello aromatico) e di un singoletto a 5.5ppm (protone benzilico di tipo acetalico).

ESEMPIO 2 -. Sintesi del 2,3-diacetile derivato della 4,6-benzilidene condroitina 49, 1g (0,102moli) del prodotto dell’esempio 1 sono sospesi in 300mL di acetonitrile anidro. Alla miscela sotto agitazione si aggiungono nell'ordine 260mL di trietilammina, 107mL di anidride acetica (1,13moli) e 3,74g di 4-(dimetilammino)-piridina. La miscela, lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 22h si solubilizza parzialmente. Si rimuove per centrifugazione la fase solida e al surnatante si addizionano 300mL di isopropil-etere che determinano la precipitazione istantanea del 2,3 diacetile derivato della 4,6-benzilidene condroitina che viene separato dal surnatante ed essiccato sotto vuoto overnight. Si ottengono 55, 9g (87,5mmoli) di prodotto, con una resa molare di 85,8%.

ESEMPIO 3 - Apertura ossidativa del ciclo benzilidenico del prodotto dell’esempio 2

5.59 g (8.75 mmol) del prodotto dell’esempio 2 sono sospesi in 1L di acetato d’etile. Alla sospensione si aggiungono 43, 9g di bromato di sodio (0,291 moli) sciolti in 1L di acqua. Alla miscela raffreddata in bagno d’acqua e ghiaccio, si aggiungono sotto agitazione, in più aliquote per evitare surriscaldamenti, 42, 3g di ditionito di sodio (0,243moli) sciolti in 1 ,45L di acqua. La miscela di reazione à ̈ lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 24h sotto illuminazione da luce visibile. Il surnatante viene quindi allontanato e il precipitato à ̈ essiccato sotto vuoto overnight. Si ottengono 46g (76mmoli) di prodotto costituito da una miscela di 4 o 6-benzoile derivato a livello dei residui di N-acetil-galattosammina con una resa molare di 86,9%. La reazione di apertura del benzilidene viene visualizzata dalla presenza di un segnale a 5.4ppm, questo segnale relativo al protone carbinolico H-4 della N-acetil-galattosammina presenta un Chemical shift più elevato rispetto agli altri protoni carbinolici, dovuto alla benzoilazione. L’analisi 2D-NMR, in particolare esperimenti di Heteronuclear Single Quantum Coherence -Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (HSQC-DEPT), dimostrano che l'apertura del benzilidene avviene in modo casuale, fornendo sia unità di N-acetil-galattosammina aventi la posizione 4 benzoilata e la posizione 6 non protetta, che viceversa. Sono, infatti, riconoscibili tre segnali di carboni secondari, necessariamente associabili alle posizioni 6 della N-acetil-galattosammina. I primi due (Î ́. 4.38/63.9 e 4.21/63.9) sono consistenti con la posizione 6 benzoilata a causa del tipico spostamento per acilazione del valore di Chemical shift protonico. La perfetta coincidenza del Chemical shift di carbonio per i due segnali dimostra che lo sdoppiamento à ̈ dovuto alla diastereotopicità dei due protoni sulla posizione 6 benzoilata. Il terzo segnale di carbonio secondario (Î ́ 3,34/60.3) non presenta alcuno spostamento per acilazione ed à ̈ associabile alla posizione 6 non protetta. ESEMPIO 4 -. Solfatazione del prodotto dell’esempio 3 ed eliminazione dei gruppi protettori

45g (74,4mmoli) del prodotto dell’esempio 3 sono sospesi in 650mL di N,N-dimetilformammide anidra. Alla sospensione sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente sono aggiunti, in più aliquote, 245g (1 ,54moli) del complesso piridina-anidride solforica sciolti in 1,25L di N, N-dimetilformammide anidra. Rapidamente la miscela di reazione diviene limpida e la soluzione à ̈ messa ad agitare a 50°C per 23h. Il prodotto di reazione à ̈ precipitato con 6L di una soluzione satura di NaCI in acetone. Il precipitato, ripreso nella minima quantità d’acqua, dà una soluzione acida (pH = 1-2), questa à ̈ riscaldata a 50°C sotto agitazione per 1h per eliminare per via idrolitica gli eventuali cicli benzilidenici presenti sui residui di N-acetil-galattosammina che sono sopravvissuti alla reazione di apertura ossidativa descritta nell’esempio 3. Successivamente si raffredda a temperatura ambiente, si porta a pH<«>13 con NaOH e la soluzione basica à ̈ mantenuta sotto agitazione per 6h per rimuovere i gruppi protettori acilici dalle posizioni 2 e 3 dei residui di acido glucuronico e il gruppo protettore benzoilico dalle posizioni 4 o 6 dei residui di N-acetil-galattosammina. Il volume di reazione à ̈ ridotto a circa 1/4 per rotoevaporazione e la soluzione à ̈ diafiltrata a 4°C con 10 volumi (cut-off della membrana: 10 kDa). Per successiva liofilizzazione si ottengono 33,8g di condroitina O-solfatata nelle posizioni 4 o 6 della N-acetilgalattosammina (67,2mmoli) con una resa molare del 90,3%.

ESEMPIO 5 -. Identificazione strutturale del prodotto dell’esempio 4

78 mg (0,155 mmol) del prodotto dell'esempio 4 sono solubilizzati nella minima quantità di acqua bidistillata e filtrati su una cartuccia Sep-Pak C18. Il prodotto secco, ottenuto per successiva liofilizzazione, à ̈ sciolto in 3,5mL di tampone TRIS-HCI 0.1 M, pH 8. Si aggiungono, in 4 aliquote in un intervallo di 48h, 3,2 unità di condroitinasi ABC da Proteus vulgaris sciolte in 3,2mL di acqua bi- distillata. L’enzima viene quindi disattivato riscaldando la miscela di reazione a 100°C per 5min. Il digerito enzimatico à ̈ analizzato mediante HPLC su colonna a scambio ionico (eluizione in gradiente di NaCI da 0.01 a 0.2M). I componenti della miscela, identificati mediante successive coiniezioni con standard puri, risultano essere il 2-acetammido-2-deossi-3-0-(acido p-D-gluco-4-ene-piranosiluronico)-6-0-solfo-D-galattosio, il 2-acetammido-2-deossi-3-0-(acido p-D-gluco-4-ene-piranosiluronico)-4-O-solfo-D-galattosio e il 2-acetammido-2-deossi-3-0-(acido p-D-gluco-4-enepiranosiluronico)-D-galattosio in rapporti relativi pari a 47:40:13, rispettivamente, come valutato dall’integrazione dei picchi del cromatogramma senza coiniezione di standard. L'ordine di eluizione à ̈ in accordo con la letteratura (Volpi N. 2004. Carbohydr. Polym. 2004, 55, 273-281).

Lo studio di risonanza magnetica nucleare (NMR) del prodotto dell’esempio 4 à ̈ effettuato sciogliendo 20mg di prodotto liofilizzato in 0.6mL di acqua deuterata ed eseguendo esperimenti di tipo monodimensionale<1>H e<13>C e bidimensionale COrrelation SpectroscopY (COSY), TOtal Correlatìon SpectroscopY (TOCSY) e Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC). I dati spettroscopici sono riportati nella tabella 1.

Ή N-acetil-galattosammina acido glucuronico

<,3>NCO CH

C 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 63NCOCHj4.45 3.92 3.89 4.64 3.72 3.68 4.36 3.62

4- 100.7 51.2 75.6 76.3 74.4 60.9 103.6 81.3

solfato 3.26 3.48 3.59 1.92

4.42 3.90 3.73 4.07 3.86 4.11 4.39 72.2 73.5 3.64 76.2 174.0 22.4 174.7 6- 100.9 50.6 79.9 67.2 72.3 67.3 104.2 79.9

solfato

Tabella 1 - Dati di<1>H- e<13>C-NMR della condroitina 4 o 6 solfato.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per la produzione di condroitina solfato, in cui sulla stessa catena polisaccaridica sono presenti residui di N-acetil-galattosammina solfatati in posizione 4 o 6, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi di reazione: a) preparazione del 4,6-benzilidene derivato sui residui della N-acetilgalattosammina di condroitina in forma acida; b) acilazione degli ossidrili 2 e 3 dei residui di acido glucuronico; d) apertura ossidativa del ciclo benzilidenico; d) solfatazione degli ossidrili 4 o 6 dei residui di N-acetil-galattosammina; e) eliminazione del gruppo benzoilico protettore dalle posizioni 4 o 6 dei residui di N-acetil-galattosammina e dei gruppi acilici protettori sugli ossidrili 2 e 3 dei residui di acido glucuronico; f) purificazione della condroitina 4 o 6 solfatata così ottenuta.
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase a) Ã ̈ ottenuta facendo reagire in fase eterogenea per 10-30h a 70-90°C la condroitina in forma acida con a, a -dimetossitoluene in presenza di un catalizzatore acido.
3. 3. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase b) per l'inserimento di gruppi protettori acilici sugli ossidrili 2 e 3 dei residui di acido glucuronico del 4,6-benzilidene derivato della condroitina à ̈ ottenuta facendo reagire in fase eterogenea a temperatura ambiente, per 10-30h il prodotto della fase a) con l’anidride di un acido carbossilico in presenza di trietilammina e 4-(dimetilammino)-piridina.
4. 4. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase c) per l’apertura ossidatìva dell’anello benzilidenico à ̈ realizzata facendo reagire in fase eterogenea, a bassa temperatura, in presenza di luce visibile, per 10-30h il prodotto della fase b) con bromato di sodio e ditionito di sodio.
5. 5. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase d) per la solfatazione in 4 o 6 dei residui di /V-acetil-galattosammina à ̈ realizzata facendo reagire in fase eterogenea, a temperature tra 10 e 100°C, per 10-60h il prodotto della fase c) con il complesso piridina-anidride solforica.
6. 6. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui la fase e) per l’eliminazione del gruppo benzoilico protettore dalle posizioni 4 o 6 dei residui di N-acetilgalattosammina e dei gruppi acilici protettori sugli ossidrili 2 e 3 dei residui di acido glucuronico prevede prima un’idrolisi acida per l’eliminazione di eventuali residui benzilidenici ancora presenti sulle posizioni 4-6 delia N-acetil-galattosammina e una successiva idrolisi alcalina per l'eliminazione dei gruppi acilici.
7. 7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui l’idrolisi acida à ̈ realizzata sciogliendo in acqua il prodotto della fase d) e riscaldando a 50°C per 0,1-1 Oh e la successiva idrolisi basica à ̈ realizzata portando a pH 13 con NaOH la soluzione dell’Idrolisi acida e mantenendo a temperatura ambiente per 1-20h.
8. 8. Processo secondo la rivendicazione 1 , in cui la fase f) di purificazione della condroitina 4 o 6 solfatata sui residui di N-acetil-galattosammina prevede l’ultrafiltrazione/diafiltrazione su membrane con cut off di 2-20KDa e l’essiccamento del retentato.
9. 9. Processo secondo la rivendicazione 8, in cui l’ultrafiltrazione/diafiltrazione à ̈ realizzata con membrane con cut off 10KDa.
10. 10. Condroitina solfato, ottenuta secondo le rivendicazioni da 1 a 9, in cui su ciascuna catena polisaccaridica i residui di N-acetil-galattosammina sono solfatati in posizione 4 o 6 in una percentuale variabile dal 20 al 95%.
11. 11. Condroitina solfato secondo la rivendicazione 10 in cui il rapporto tra la solfatazione in 4 e quella in 6 dei residui di galattosammina varia da 0,1 a 10.
12. 12. Condroitina solfato secondo le rivendicazioni 10 e 11 avente un peso molecolare tra 5 e 50KDa.
13. 13. Condroitina solfato secondo la rivendicazione 12 avente un peso molecolare tra 12 e 30KDa.
14. 14. Condroitina solfato secondo la rivendicazione 13 avente un peso molecolare tra 15 e 25KDa.