CN103298837B - 获得在n-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位硫酸化的软骨素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生产硫酸软骨素的方法，其中4-或6-位被硫酸化的N-乙酰基-半乳糖胺残基存在于同一多糖链上。

Description

获得在N-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位硫酸化的软骨素的方法

技术领域

本发明涉及多糖结构修饰方法的领域。

背景技术

硫酸软骨素属于糖胺聚糖大家族，称为GAGs。与蛋白质共价结合的这些多糖(如蛋白聚糖)是所有结缔组织的细胞外基质中普遍存在的成分，它们在其中执行多种功能。

硫酸软骨素是一种天然的线性多糖，通过N-乙酰基-D-半乳糖胺残基β1→4和D-葡糖醛酸酯β1→3的交替而形成。在脊椎动物中，软骨素以各种硫酸化的形式存在；涉及硫酸化的残基为N-乙酰基-D-半乳糖胺的4和6羟基，在某些情况下，为葡糖醛酸的2和3羟基。

软骨素的分子量以及硫酸化的数量和位置取决于物种、年龄和组织的类型。

硫酸软骨素作为软骨保护和抗风湿药物，可以用于治疗膝关节的胫腓骨骨关节炎和关节软骨的骨关节炎。

目前，硫酸软骨素可以通过提取技术自各种动物来源获取，如猪软骨、鲨鱼鳍和硬骨鱼类的软骨。原料的稀缺性和下游的纯化过程中的复杂性限制了这种活性成分在世界范围内的可用性，因此，它的市场受控于无法满足目前不断增长的需求。此外，频频颁发的日益严格的动物源性药物的安全法规可能在未来会排除接受医药市场中提取的硫酸软骨素。

因此，越来越大的兴趣在于发展基于生物技术和化学合成的替代生产策略，以获取此类多糖或其前体。

科学文献(RodriguezML等,Eur.J.Biochem.,1988,177,117－24；ManzoniM等,BiotechnologyLetters,1996,18,383－6)和专利文献(WO01/02597A1)报道了通过发酵生产的可能性，采用大肠杆菌K4野生型或重组菌株生产软骨素衍生物(多糖K4)，其碳骨架与软骨素的碳骨架是相同，但是在C3采用α-呋喃果糖残基接枝葡萄糖醛酸。软骨素可以通过受控的果糖残基的水解由多糖K4获取。

高产率、开发的下游纯化工艺的简单性、该方法的总成本较低以及对环境的影响较小使得所述合成方法优于先前所描述的生物技术策略。

与从动物来源的原料提取硫酸软骨素的传统工艺相比，如果适当地辅以软骨素的区域选择性的化学硫酸化策略，所述发酵过程也可以使生物技术方法具有竞争力，前者可能由于近期与产品安全性有关的监管的要求而从药品市场上淘汰。

多糖的硫酸化在结构上与软骨素相关，如多糖K4和K5，据报道，在K5中，它们是由重复序列的葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺形成的，而在K4中，是由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺形成，在这种情况下，在2位的葡糖醛酸上接枝果糖残基，以上在一系列的文章和专利中有述，但这些文件没有涉及能够生产与人类具有相同结构特征的硫酸软骨素的区域选择性的硫酸化方法。

能够使得硫酸化模式与人类软骨素特征相似的软骨素的区域选择性硫酸化的合成方案尚未解决，因此目前提取来源的软骨素作为软骨保护和抗风湿药物在关节疾病的治疗中仍然广泛局部外用使用。

发明内容

本发明公开了通过自生物技术获得的软骨素经化学合成方法生产与人类软骨素以及提取来源的软骨素具有相似硫酸化模式特征的硫酸软骨素的方法，它采用能够适用于工业化大规模生产的合成路线。

发明详述

通过消除现有技术已知方法中存在的问题，本发明通过化学合成方法生产硫酸软骨素，其中N-乙酰基-半乳糖胺残基在同一多糖链的4-或6-位上被硫酸化，该软骨素与人类硫酸软骨素和目前自动物来源提取获得的硫酸软骨素所观察到的相同。

因此，本发明涉及生产其中在同一多糖链上存在4-或6-位上被硫酸化的半乳糖胺残基的硫酸软骨素的方法，其特征在于下列步骤：a)以酸的形式在软骨素的N-乙酰基-半乳糖胺残基上分别形成4,6-苯亚甲基衍生物；b)将葡萄糖醛酸残基的羟基2和3酰化；c)氧化打开苯亚甲基环；d)将半乳糖胺残基的4或6羟基硫酸化；e)除去N-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位苯甲酰基保护基团和葡萄糖醛酸残基的2和3羟基上的乙酰基保护基团；f)纯化4或6硫酸化软骨素。

本发明的方法如下面的流程所示：

流程

p5

本发明的合成方法中的关键因素为苯亚甲基环的氧化打开，它使得采用苯甲酰基选择性地保护N-乙酰基-半乳糖胺的4-或6-位。这样，在只有3个保护步骤后，该多糖链仅在N-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位上存在只有单一醇官能团的二糖单元，并且其仍然保持游离状态。因此，很容易保护的多糖的彻底硫酸化产生了硫酸软骨素，其中在4-或6-位硫酸化的N-乙酰基-半乳糖胺残基存在于同一多糖链上。保护基团的水解分裂产生了分子量和硫酸化模式特征与人类软骨素相同的硫酸软骨素。要求保护的反应流程能够以高收率生产软骨素4或6硫酸盐，其成本符合工业化规模生产的要求，其特征在于基于膜工艺的单一最终纯化方法，并且易于工业化规模生产。

下面的实施例描述了硫酸软骨素的生产，其特征在于所述N-乙酰基-半乳糖胺残基在同一多糖链的4-或6-位被硫酸化，该硫酸软骨素的结构特征与人类硫酸软骨素和通过动物来源提取的现今作为药物使用的硫酸软骨素相同。

实施例1–衍生自软骨素的4,6-苯亚甲基衍生物的合成

酸软骨素的制备

将根据意大利专利申请号1,312,984所述通过发酵获得的50克软骨素(分子量38kDa，纯度>90%)溶于1.5LMilliQ水中，与250g的FLUKADowex50WX8H+型阳离子交换树脂(50－100目，预先洗涤并用水中和)一起于室温下搅拌约2h。然后将该浆状物倾入玻璃柱中，该柱有50mm直径的多孔隔膜(孔隙率为3)，形成约50cm高的柱床。将浆状物用MilliQ水洗脱直到洗脱液的pH≤2，再用250mL的MilliQ水洗涤直到洗脱液为中性。为了确保获得更好的产品回收率，将洗涤液加至前述含有酸软骨素的洗脱液中，将获得的溶液冷冻干燥。将冻干物在Waring搅拌器中制成细粉，再在真空下干燥过夜。获得酸形式的软骨素，摩尔收率超过95%。

衍生自软骨素的4,8-苯亚甲基衍生物的合成

将42.1g(0.111mols)软骨素酸悬浮于1L无水N,N-二甲基甲酰胺中，然后，于室温下，在搅拌下向混合物中顺序加入167mL的α,α-二甲氧基甲苯(1.11mols)和6.2g樟脑-10-磺酸(26.6mmols)。将混合物于80℃反应20h。当反应进行时，该悬浮液逐渐变得澄清，直到获得均匀的溶液。衍生自软骨素的4,6-苯亚甲基衍生物采用2.5L的冷丙酮沉淀，将沉淀物自上清液分离，真空干燥过夜。获得衍生自软骨素的49.6g的4,6-苯亚甲基衍生物，摩尔收率为92.8%。苯亚甲基化在¹H-NMR谱的两处可以具体观察到：约7.3ppm处的宽峰信号(芳族环质子)和5.5ppm处的单峰(缩醛苄基质子)。

实施例2–衍生自4,6-苯亚甲基软骨素的2,3-二乙酰基衍生物的合成

将49.1g(0.102mols)实施例1中所述的产物悬浮于300mL无水乙腈中。在搅拌下，向混合物中顺序加入260mL三乙胺、107mL乙酸酐(1.13mols)和3.74g的4-(二甲基胺)-吡啶。将混合物于室温下搅拌22h，部分溶解。离心除去固相，将300mL异丙醚加至上清液中，使得4,6-苯亚甲基软骨素的2,3-二乙酰基衍生物立即沉淀出来，将其自上清液分离，真空干燥过夜。获得55.9g(87.5mmols)产物，摩尔收率为85.8%。

实施例3-实施例2中所述产物的苯亚甲基环的氧化开环

将5.59g(8.75mmol)实施例2中所述产物悬浮于1L乙酸乙酯中。将溶于1L水的43.9g溴酸钠(0.291mols)加至上述悬浮液中。将溶于1.45L水的42.3g连二亚硫酸钠(0.243mols)在搅拌下分多次加至在冰水浴中冷却的上述混合物中以防止过热。将反应混合物于室温下在可见光照射下搅拌24h。然后弃去上清液，将沉淀物真空干燥过夜。获得46g(76mmols)产物，它由在N-乙酰基-半乳糖胺残基上的4或6-苯甲酰基衍生物组成，摩尔收率为86.9%。苯亚甲基开环反应因为5.4ppm处存在的信号而显而易见；该信号与N-乙酰基-半乳糖胺的甲醇质子H-4有关，由于苯甲酰基化使其较其它甲醇质子具有较高的化学位移。2D-NMR分析，特别是异核单量子相干效应-无畸变极化转移增强(HeteronuclearSingleQuantumCoherence-DistortionlessEnhancementbyPolarizationTransfer)(HSQC-DEPT)实验，证明苯亚甲基开环是随机发生的，从而得到N-乙酰基-半乳糖胺单位，其中4位苯甲酰基化并且6位是未保护的，反之亦然。可辨识到三个仲碳信号，它必然与N-乙酰基-半乳糖胺的6位有关。前面二个(δ4.38/63.9和4.21/63.9)与苯甲酰基化的6位一致，因为其具有典型的质子化学位移值的酰化位移。两个信号的碳化学位移的完美契合说明裂解是由于苯甲酰基化的6位上的两个质子的diastereotopicity。第三个仲碳信号(δ3.34/60.3)不存在任何酰化位移，它与未保护的6位有关。

实施例4–实施例3中所述产物的硫酸化以及保护基团的去除

将45g(74.4mmols)实施例3中所述产物悬浮于650mL无水N,N-二甲基甲酰胺中。于室温下，将溶于1.25L无水N,N-二甲基甲酰胺的245g(1.54mols)吡啶-硫酸酐复合物在磁力搅拌下分多次加至上述悬浮液中。反应混合物快速变得澄清，将溶液于50℃搅拌23h。反应产物采用6LNaCl在丙酮中的饱和溶液沉淀。将沉淀物溶于最小量的水中，得到酸溶液(pH≈1-2)；将该溶液于50℃在搅拌下加热1h，通过水解除去N-乙酰基-半乳糖胺残基上存在的任何苯亚甲基环，它是在实施例3中所述氧化开环反应过程中残存的环。然后将溶液冷却至室温，用NaOH调节至pH≈13，将该碱性溶液搅拌6h以除去葡萄醛酸残基2和3位上保护的酰基以及N-乙酰基-半乳糖胺残基4-或6-位上的苯甲酰基保护基团。通过旋转蒸发使得反应物体积减少至约1/4，将溶液于4℃对10倍体积透析(膜截留值：10kDa)。随后冷冻干燥，获得33.8g的在N-乙酰基-半乳糖胺4-或6-位上O-硫酸化的软骨素(67.2mmols)，摩尔收率为90.3%。

实施例5-实施例4中所述产品的结构鉴定

将78mg(0.155mmol)实施例4中所述产品溶于最小量的双蒸水中，通过Sep-PakC18柱过滤。随后冷冻干燥获得的干燥的产物，将其溶于3.5ml的0.1MTRIS-HCl缓冲液(pH8)中。以48h的间隔，分四等份加入溶于3.2mL双蒸水中的获自普通变形杆菌(Proteusvulgaris)的3.2单位的软骨素酶ABC。然后通过将反应混合物于100℃加热5分钟使将酶失活。在离子交换柱上通过HPLC(0.01-0.2MNaCl梯度洗脱)分析该酶消化物。通过与纯标准品的连续共同注射鉴别该混合物的成分为2-乙酰胺-2-脱氧基-3-O-(β-D-葡糖(gluco)-4-烯-吡喃醛酸(pyranosyluronicacid))-6-O-磺基(sulpho)-D-半乳糖、2-乙酰胺-2-脱氧基-3-O-(β-D-葡糖-4-烯-吡喃醛酸)-4-O-磺基-D-半乳糖和2-乙酰胺-2-脱氧基-3-O-(β-D-葡糖-4-烯-吡喃醛酸)-D-半乳糖，其相对比例为47:40:13，无需共同注射标准品，通过整合色谱峰而加以判断即可。洗脱的顺序与文献报道相符(VolpiN.2004.Carbohydr.Polym,2004,55,273-281)。

实施例4中所述产物的核磁共振(NMR)研究如下进行：将20mg的冻干产品溶解在0.6mL氘化水中，进行一维¹H和¹³C以及二维关联谱Y(COSY)、全关联谱Y(TOCSY)、异核单量子相干谱(HSQC)实验。光谱数据列于表中。

Claims (14)

1.生产硫酸软骨素的方法，其中4-或6-位上被硫酸化的N-乙酰基-半乳糖胺残基存在于同一多糖链上，该方法特征在于它包括下列步骤：a)以酸的形式在软骨素N-乙酰基-半乳糖胺残基上制备4,6-苯亚甲基衍生物；b)将葡糖醛酸残基的2和3羟基酰化；c)使得苯亚甲基环氧化开环；d)将N-乙酰基-半乳糖胺残基的4或6羟基硫酸化；e)除去N-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位上的苯甲酰基保护基团和葡糖醛酸残基的2和3羟基上的酰基保护基团；f)纯化所获得的4或6硫酸化软骨素。

2.权利要求1所要求保护的方法，其中步骤a)通过使得酸形式的软骨素与α,α-二甲氧基甲苯在酸催化剂存在下以多相形式于70－90℃反应10－30h而完成。

3.权利要求1所要求保护的方法，其中步骤b)为在软骨素的4,6-苯亚甲基衍生物的葡糖醛酸残基的2和3羟基上插入酰基保护基团，该步骤通过使得在多相中的步骤a)的产物与羧酸酐于室温下在三乙胺和4-(二甲基胺)-吡啶存在下反应10－30h而完成。

4.权利要求1所要求保护的方法，其中步骤c)为苯亚甲基环的氧化开环反应，该步骤通过使得在多相中的步骤b)的产物与溴酸钠和连二亚硫酸钠在可见光存在下于室温下反应10－30h而完成。

5.权利要求1所要求保护的方法，其中步骤d)为N-乙酰基-半乳糖胺残基的4或6硫酸化反应，该步骤通过使得在多相中的步骤c)的产物与吡啶-硫酸酐复合物于10－100℃的温度间反应10－60h而进行。

6.权利要求1所要求保护的方法，其中步骤e)为除去N-乙酰基-半乳糖胺残基的4-或6-位上的苯甲酰基保护基团和葡糖醛酸残基的2和3羟基上的酰基保护基团的反应，该步骤包括酸水解以除去N-乙酰基-半乳糖胺的4-或6-位上仍然存在的任何苯亚甲基残基，随后通过碱水解以除去酰基。

7.权利要求6所要求保护的方法，其中所述酸水解通过将步骤d)的产物溶于水并将其于50℃加热0.1－10h而进行，随后的碱水解通过采用NaOH将酸水解溶液调节至pH13并将其于室温下保持1－20h而进行。

8.权利要求1所要求保护的方法，其中步骤f)包括将N-乙酰基-半乳糖胺残基上4或6硫酸化的软骨素进行纯化的步骤，该步骤包括采用截留值为2－20kDa的膜进行超滤/透析过滤并将保留物干燥。

9.权利要求8所要求保护的方法，其中超滤/透析过滤采用截留值为10kDa的膜进行。

10.根据权利要求1－9中任一项所获得的硫酸软骨素，其中所述在每个多糖链上的N-乙酰基-半乳糖胺残基在4-或6-位上被硫酸化的百分比范围在20至95％之间。

11.权利要求10所要求保护的硫酸软骨素，其中半乳糖胺残基的4和6位上硫酸化的比例范围在0.1至10之间。

12.权利要求10或11所要求保护的硫酸软骨素，其分子量在5至50kDa之间。

13.权利要求12所要求保护的硫酸软骨素，其分子量在12至30kDa之间。

14.权利要求13所要求保护的硫酸软骨素，其分子量在15至25kDa之间。