IT9041589A1 - Processo per la modulazione selettiva dell'espressione e della funzione di un determinante sulla superficie cellulare attraverso appropriati agenti chimici - Google Patents
Processo per la modulazione selettiva dell'espressione e della funzione di un determinante sulla superficie cellulare attraverso appropriati agenti chimiciInfo
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Description
Descrizione di una invenzione industriale dal titolo "PROCESSO PER LA MODULAZIONE SELETTIVA DEL-L'ESPRESSIONE E DELLA FUNZIONE DI UN DETERMINANTE SULLA SUPERFICIE CELLULARE ATTRAVERSO APPROPRIATI AGENTI CHIMICI"
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
La presente invenzione è diretta ad un processo di inibizione dei meccanismi del sistema immunitario mediante la modulazione selettiva dell'espressione di un determinante specifico sulla superficie cellulare, determinante chiamato CD4 , sulle cellule umane, attraverso appropriati agenti chimici. Gli agenti chimici sono gangliosidi opportunamente modificati che inducono una rapida e selettiva scomparsa dei determinanti CD4 sulla superficie cellulare in presenza di siero. Mediante modulazione selettiva dell'espressione e della funzione del determinante CD4 sulla superficie cellulare, impiegando gangliosidi modificati che inducono una rapida e selettiva scomparsa del CD4, il punto di attacco e di entrata di virus nelle cellule T-helper, che portano all'infezione delle cellule umane attraverso i determinanti CD, cellulari di superficie, è eliminato, e la ricettività di queste linee cellulari è inibita, senza inibire gli altri determinanti presenti nella superficie cellulare .
BACKGROUND DELL'INVENZIONE
La presente invenzione è collegata éil processo nel quale l'espressione e la funzione di un determinante presente sulla superficie cellulare di cellule umane è selettivamente modulato.
Mediante una modulazione selettiva dell'espressione e della funzione di determinanti specifici, le cellule umane possono rimanere protette da agenti debilitanti anche di origine endogena e mantenere contemporaneamente inalterata la loro funzione.
Il sistema immune, quando opera correttamente, agisce per proteggere l'organismo contro agenti infettivi, inclusi virus, batteri, parassiti e agenti analoghi. L'abilità di combattere questi agenti o altre sostanze, chiamate antigeni, riconosciuti come agenti estranei del sistema immune, è critica per la salute e la sopravvivenza. In condizioni normali, il sistema immune è in grado di contrastare molte infezioni, riportando un totale recupero. Quando il sistema immune è inadeguato, possono intervenire diverse infezioni. L'inadeguatezza del sistema immune può anche evidenziarsi come una sua eccessiva attività biologica, che si può esprimere in una sovrapproduzione delle componenti naturali ed un riconoscimento, come antigeni, delle componenti biologiche normalmente presenti nell'organismo.
Macrofagi e linfociti sono principalmente coinvolti nei processi immunitari. I macrofagi attaccano e distruggono l'agente infettivo e contemporaneamente forniscono informazioni sulla struttura di questi agenti ai linfociti. I linfociti a loro volta sono divisi in due categorie. Una classe di linfociti, cellule B, produce: anticorpi in risposta ad agenti infettivi. Gli anticorpi hanno siti di combinazione specifici che discriminano fra le diverse strutture dei singoli antigeni. Quando l'anticorpo lega l'antigene, l'interazione può bloccare l'effetto della sostanza estranea. Un altro gruppo di linfociti, cellule T, produce esclusivamente recettori di membrana, che riconoscono le singole strutture antigeniche presentate dai macrofagi. Quando le cellule T interagiscono con l'antigene, un largo numero di ormoni (linfochine) sono rilasciati, i quali possono indurre infiammazione, ampliare o sopprimere la formazione di anticorpi da parte delle cellule B o distruggere direttamente le cellule estranee come tumori o organi trapiantati.
L'equilibrio e l'interscambio tra cellule T, cellule B e macrofagi determina la forza della risposta immune del singolo all'infezione. In generale si pensa che le attività delle cellule immuni sono controllate per larga parte da linfochine e monochine, ciascuna delle quali ha proprietà chimiche e funzionali ben distinte. Nell'articolo "The CD4. Molecule: Function and Structure" di Dalgleish A.G., pubblicato sulla rivista Immunology Today, volume 7, pagina 142, 1986, è riportato che uno specifico determinante presente sulla superficie cellulare, ad esempio la molecola CD4, definisce una sottopopolazione di linfociti T maturi che, dopo il riconoscimento antigenico ristretto agli antigeni del complesso maggiore di istocompabilità (MHC), classe II, portano un'ampia varietà di funzioni regolatorie ed effettorie. La modifica del determinante CD4 presente sulla superficie cellulare determina anche apparentemente un segnale negativo verso le cellule T e può agire come chiusura della funzione delle cellule T.
L'antigene CD4 (T4) è un recettore fondamentale delle cellule linfocitarie T-helper ed è individuato giocare un ruolo fondamentale come recettore per il retrovirus associato all'AIDS (Dalgleish A.G. et al., Nature 312:763, 1984).
La precisa funzione della molecola CD4 non è stata ancora definita, ma evidenze sperimentali indicano la sua interazione con le. molecole del complesso maggiore di istocompatibilità classe li (MHC-II), in modo da mediare in modo più efficiente il riconoscimento da parte delle cellule T-helper dei targets di posizionamento dell'antigene (Gay D. et al., Nature, 328:626, 1987; Doyle C. et al., Nature 330:256, 1938). Inoltre, è stato studiato il ruolo del CD4. come trasduttore di segnale a livello di membrana (Bank I. et al., J. Exp. Med. 162:1294, 1985). L'esposizione delle cellule T-helper agli esteri del forbolo determina l'internalizzazione della molecola CD4, con la fosforilazione del residuo della serina citoplasmatica da parte di una delle proteine kinasi C (Hoxie J.A. et al.; J. Immunol. 137:1194, 1986; Acies R.B. et al., J. Biol. Chem. 261:1610, 1986; Hoxie et al., J. Immunol. 140:786, 1986).
Un'azione di modulazione o mascheramento è stata anche descritta mediante incubazione delle cellule che esprimevano il CD4 con alcuni glicosfingolipidi acidi, come i gangliosidi (Offner H. et al., J. Immunol. 139:3295, 1987; Patent; Offner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 158:1050, 1989; Life Science 1989), azione che può essere ottenuta anche mediante gangliosidi modificati chimicamente in modo opportuno sul gruppo funzionale carbossilico dell'acido sialico (Grassi F. et al., J. Immunol. 1990, in press), azione di modulazione che per il monosialoganglioside GM1 (nomenclatura in accordo con Svennerholm, 1963) è stata dimostrata anche rallentare l'infezione del virus HIV-1 impiegando opportune linee cellulari (Chieco Bianchi L. et al., AIDS 3:501, 1989). Questa azione di modulazione o di mascheramento del CD4 da parte di alcuni gangliosidi, come il GM1, GD1a, GD1b, GT1b o loro miscele o loro opportuni derivati modificati chimicamente, non è stata, ad oggi ancora chiarita. La proprietà comune di tutte queste molecole è che la loro attività di modulazione o di mascheramento del recettore CD4 scompare completamente quando gli esperimenti in vitro si eseguono in presenza di siero o suoi derivati, anche in concentrazioni molto basse. Questo limita totalmente l'impiego in vivo di queste molecole per la modulazione del CD4.
Avere a disposizione molecole che modulino o mascherino il CD4 in modo selettivo presenta una notevole importanza se questa azione viene svolta in presenza dei normali componenti biologici, come il siero o suoi componenti. Oggetto della presente invenzione sono quindi molecole chimiche che svolgano la loro azione sulla proteina CD4 in presenza di siero.
Una proprietà importante del materiale biologicamente attivo nell'uomo è la sua capacità di discriminare, ad esempio modulando selettivamente l'espressione e la funzione di un dato determinante presente sulla superficie cellulare. Gli anticorpi appartengono alla classe di molecole che discriminano in modo selettivo, ma possono presentare alcuni effetti collaterali. Le composizioni chimiche, come i farmaci, in generale possono non essere discriminatorie e possono interessare molti tipi di cellule umane. Di conseguenza, c'è la necessità di composizioni chimiche che possano discriminare e selettivamente abbiano la capacità di modulare i determinanti presenti nelle cellule umane in modo da prevenire infezioni o altri effetti non desiderati correlati al sistema immunitario .
RIASSUNTO DELL'INVEN2IONE
La presente invenzione è diretta ad un processo per inibire in modo non irreversibile un'azione biologica nell'uomo, mediante una selettiva modulazione dell'espressione di un determinante presente sulla superficie cellulare, chiamato CD4 per le cellule umane, attraverso agenti chimici opportunamente modificati. L'agente chimico è una composizione di gangliosidi modificati o miscele di gangliosidi modificati e gangliosidi naturali che inducono una rapida e selettiva scomparsa della molecola CD4 sulle linee cellulari umane. Le cellule umane dopo trattamento con queste miscele o con gangliosidi modificati non esprimono a lungo il CD4 e ne rallentano l'azione biologica, ad esempio la sua interazione con il virus dell'HIV.
Per gli scopi dell'invenzione,, il termine ganglioside modificato definisce un composto ottenuto attraverso una serie di definite e riproducibili reazioni chimiche a partire da gangliosidi naturali singoli o loro miscele. La modulazione selettiva sulle cellule umane avviene in presenza di siero, il quale non neutralizza l'azione del ganglioside modificato.
I gangliosidi modificati della presente invenzione sono degli analoghi semisintetici dei gangliosidi e si differenziano da essi per la presenza di un unico gruppo N-acilico nella parte sfingosinica e precisamente un gruppo N-dicloroacetilico. Tali complessi, da noi citati come N-dicloroacetil lisogangliosidi, sono stati già descritti nella domanda di brevetto italiana dal titolo "Nuovi derivati di lisogangliosidi" depositata il 2.12.1988 con n. 48618A88.
Oggetto dell'invenzione sono pure le preparazioni farmaceutiche comprendenti come sostanze attive uno o più dei derivati o analoghi semisintetici sopra menzionati, e in particolare quelli messi in rilievo. Tali preparazioni farmaceutiche possono essere destinate all'uso orale, rettale, parenterale, locale. Esse sono quindi in forma solida o semisolida, per esempio confetti, compresse, opercoli gelatinosi, capsule, supposte, capsule di gelatina molle. Per l'uso parenterale si possono usare forme predestinate alla somministrazione intramuscolare, sottocutanea o atte a infusioni o iniezioni endovenose o intracerebrali e si possono quindi presentare come soluzioni dei composti attivi e come polveri liofilizzate dei composti attivi da unirsi ad uno o più eccipienti o diluenti accettabili dal punto di vista farmaceutico, convenienti per gli usi suddetti e di osmolarità compatibile con i liquidi fisiologici. Per l'uso locale entrano in considerazione preparazioni in forma di spray, per esempio spray nasali, creme o unguenti per uso topico.
Le preparazioni dell'invenzione possono essere destinate alla somministrazione all'uomo o all'animale. Esse contengono di preferenza da 0.01% al 10% di componente attivo per le soluzioni, gli spray, gli unguenti e le creme e dall'1% al 100% e preferibilmente da 5% al 50% del composto attivo per i preparati in forma solida. Il dosaggio da somministrarsi dipenderà dall'indicazione, dall'effetto desiderato e dalla via di somministrazione prescelta.
L'invenzione comprende pure l'uso terapeutico di tutti i nuovi derivati. I dosaggi giornalieri all'uomo per via iniettiva (sottocutanea o intramuscolare o intracerebrale) variano da 5 mg a 25 mg di sostanza attiva per kg di peso corporeo.
ESEMPIO 1
La selettiva inibizione e scomparsa dell'espressione e funzione dei determinanti CD4. sulla superficie cellulare mediante un agente chimico rappresentato da una composizione di gangliosidi modificati o da una specifica classe di molecole modificate è stata dimostrata sperimentalmente.
Cellule linfocitarie umane sono state incubate a varie concentrazioni del gariglioside modificato N-dicloroacetil liso GM1. Le cellule sono state colorate direttamente mediante anticorpi monoclonali (MAb) specifici per i CD4, CD8, CD3 (T4, T8, T3 Coulter Clone, Coulter Electronics, Hialeah, Florida, USA) e OKT4 (Ortho Diagnostics, Roriton, New Jersey, USA), anticorpi monoclonali coniugati con fluoresceina. Mediante il metodo della misura dell'intensità di fluorescenza (MFI) della popolazione cellulare marcata a ciascuna concentrazione di N-dicloroacetil liso GM1, è stato possibile quantizzare la quantità di N-dicloroacetil liso GM1 necessaria per produrre inibizione di fluorescenza del 50% (I50). Il valore di I50 per i linfociti minori era di 5 pM. La concentrazione della composizione di N-dicloroacetil liso GM1 per ridurre la MFI a 0% era stata sperimentalmente risolta.
Più specificamente, cellule umane sono state incubate con una soluzione salina a varie concentrazioni di N-dicloroacetil liso GM1 in presenza di siero a 37°C per un'ora. Le cellule sono state successivamente lavate, incubate con gli opportuni monoclonali, fissate con formalina 1% ed analizzate per MFI dopo eccitazione a 488 mm lunghezza laser impiegando una opportuna strumentazione. I valori sono riportati nella Tabella 1.
TABELLA 1
Dai valori riportati nella Tabella 1 risulta che l'N-dicloroacetil liso GM1 modula selettivamente il recettore CD4 senza alterare il recettore CD3.
ESEMPIO 2
Le cellule Molt 3 (5x10<6>) sono state incubate con diverse concentrazioni di N-dicloroacetil liso GM1 (da 1 μg/ml a 250 μg/ml) per 60 minuti a 37°C
in presenza di BMS. Dopo l'incubazione la percentuale di CD4 espresso è stata rilevata mediante un MAb specifico per il CD4 (T4 Coulter Clone, Coulter Electronics, Hialeh, Florida, USA).
Come controllo positivo è stato effettuato un esperimento con il monosialoganglioside GM1 nelle medesime condizioni sperimentali riportate per l'N-dicloroacetil liso GM1.
Nella Tabella 2 sono riportati i dati relativi alla percentuale di CD4 ancora espresso nelle cellule Molt 3 dopo l'incubazione con le diverse molecole chimiche alle diverse concentrazioni come descritto nell'esempio 1.
Il CD4 espresso in assenza di agenti chimici durante l'esperimento era dell'89%.
TABELLA 2
I risultati riportati nella Tabella 2 indicano come l'effetto modulante del GM1 e del suo derivato chimico siano funzione di una curva dose/risposta.
ESEMPIO 3
Le cellule Molt 3 (5x10°) sono state incubate con diverse concentrazioni dell'N-dicloroacetil liso GM1 (da 1 μg/ml a 125 μg/ml) per 60 minuti a 37°C in presenza di diverse concentrazioni di siero bovino fetale (FCS) (dall'1% al 5%). Dopo l'incubazione la percentuale di CD4 espresso è stata rilevata mediante un MAb specifico per il CD4 (T4 Coulter Clone, Coulter Electronics, Hialeh, Florida, USA)
Come controllo positivo è stato effettuato un esperimento con il monosialoganglioside GM1 nelle medesime condizioni sperimentali riportate per l'N-dicloroacetil liso GM
Nella Tabella 3 sono riportati i dati relativi alla percentuale di CD4 ancora espresso nelle cellule Molt 3 dopo l'incubazione con le due molecole alle loro diverse concentrazioni ed a diverse concentrazioni di siero bovino fetale. Il CD4 espresso in assenza di agenti chimici durante l'esperimento era dell'84%.
TABELLA 3
N-DICLOROACETIL LISO GM1
GM1
I risultati riportati nella Tabella 3 indicano che per quanto riguarda il composto N-dicloroacetil liso GM1 l'aumento di concentrazione del siero non altera l'azione di modulazione sul recettore CD4, mentre per quanto riguarda il questa azione di modulazione scompare in presenza di siero .
Claims (21)
- Ciò che rivendica: 1. Un processo per modulare i determinanti CD4 presenti sulla superficie cellulare di cellule umane attraverso un'azione selettiva di espressione e funzione specifica sul CD4 fornita da una famiglia di agenti chimici che svolgono la loro azione di modulazione anche in presenza di siero, cioè in condizioni fisiologiche.
- 2. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove le cellule umane comprendono le cellule della glia del cervello.
- 3. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove le cellule umane comprendono le cellule umane T-helper .
- 4. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove le cellule umane comprendono le cellule epiteliali umane.
- 5. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove le cellule umane comprendono i macrofagi umani.
- 6. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove la modulazione è selettiva per il CD4 e non crea problemi di espressione per gli altri determinanti presenti sulla superficie cellulare.
- 7. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove la composizione chimica è formata da un gruppo di N-dicloroacetil lisogangliosidi.
- 8. Un processo secondo la rivendicazione 1, dove la modulazione viene effettuata da queste molecolle in presenza di siero.
- 9. Un processo secondo la rivendicazione 1 dove, oltre al passaggio di selezione, il mantenimento della modulazione avviene attraverso un mantenimento delle dosi di N-dicloroacetil liso GM1 per prevenire la riespressione del CD4 .
- 10. Un processo secondo la rivendicazione 9, dove il passaggio di allontanamento dell 'N-dicloroacetil liso GM1 riporta alla riespressione del CD4 .
- 11. Un processo secondo le rivendicazioni da 1 a 10, dove la modulazione da parte dell'N-dicloroacetil liso GM1 avviene sul CD4 senza modulare altri determinanti presenti sulla superficie cellulare.
- 12. Una preparazione farmaceutica contenente come ingrediente attivo un N-dicloroacetil lisoganglioside .
- 13. Una preparazione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, contenente un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico.
- 14. L'uso terapeutico dell 'N-dicloroacetil liso GM1 secondo una delle rivendicazioni 1-13.
- 15. L'uso terapeutico dell 'N-dicloroacetil liso GM1 secondo la rivendicazione 14 per il trattamento di condizioni neuroimmunopatologiche comprendente la somministrazione al paziente di una quantità efficace del suddetto complesso .
- 16. L'uso dell'N-dicloroacetil liso GM1 secondo una delle rivendicazioni 1-15 dove la condizione neuroimmunopatologica è la sclerosi multipla.
- 17. L'uso dell'N-dicloroacetil liso GM1 secondo una delle rivendicazioni 1-15 dove la condizione neuroimmunopatologica è la poliradiculo neuropatia .
- 18. L'uso dell'N-dicloroacetil liso GM1 secondo una delle rivendicazioni 1-15 dove la condizione neuroimmunopatologica è associabile ad infezione da virus infettivi con HIV-I.
- 19. L'uso dell'N-dicloroacetil liso GM1 secondo le rivendicazioni 14 e 15 dove la condizione neuroimmunopatologica è una malattia cronica neurodegenerativa o una malattia cronica immunologica che intacca il sistema nervoso.
- 20. L'uso dell'N-dicloroacetil liso GM1 per la preparazione di un prodotto farmaceutico per il trattamento di condizioni neuropatologiche.
- 21. L'uso dell'N-dicloroacetil liso GM1 per il trattamento di condizioni neuropatologiche date dall'invecchiamento del sistema nervoso, o di malattie croniche neurodegenerative o di malattie croniche immunologiche che attaccano il sistema nervoso.
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