JP3237836B2

JP3237836B2 - 抗ウイルス医薬組成物

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Publication number: JP3237836B2
Application number: JP22015889A
Authority: JP
Inventors: ティー．プレンダーガストパトリック
Original assignee: ティー．プレンダーガストパトリック
Priority date: 1988-08-25
Filing date: 1989-08-25
Publication date: 2001-12-10
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: IE882585L; JPH02237996A; AU636574B2; ZA896450B; FI893948A0; US5681831A; FI893948A; AU4025689A; EP0355825A3; DK418489A; IL91415A0; DK418489D0; CA1339854C; KR900002786A; OA09427A; IL91415A; EP0355825A2

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、ウイルスおよびプリオン（蛋白性の感染性
粒子）、たとえばCMV、ヘルペス・シンプレツクス、ヘ
パチチスＢ、スカピー・クロイツフエルト−ヤコブ病
（Scapie Creutzfeldt−Jakob Disease）に対する治療
方法に関する。特に、本発明は、ある種のレトロイウル
ス感染を受けている人間および動物の、そしてヒト免疫
不全ウイルス（HIV）に関係するレトロビールスによる
感染を受けている人間の医薬治療の方法、およびそのよ
うな感染を受けうる人間の予防的医薬処置の方法に関す
る。更に詳しくは、本発明は、治療される人間のたとえ
ばモノサイト／マクロフアージおよびＴリンホサイトの
ような、血球中のHIVウイルスの水準を減少させるため
の治療に関する。本発明はさらに、そのような治療方法
において使用される化合物および医薬の調合物に関す
る。

発明の背景 HIVとして知られているレトロウイルスの種族による
ヒト感染は、感染された人の健康に有害であると信じら
れている。HIV種族に属すると現在信じられているウイ
ルスの例は、リンホアデノパシ−アソシエイテツド・ウ
イルス（LVA）およびヒトＴ−リンホトロピツク・ウイ
ルスIII型（HTLV−III）である。お互いに別個に発見さ
れたLAVとHTLV−IIIとは、同じウイルスであることが今
や知られており、そしてHIV−Ｉとして示されている。
人間から人間へのそのようなウイルスの伝達の様式につ
いては多く知られている〔ザ、ナチユラル、ヒストリ
ー、オブ、HIV、インフエクシヨン、イン、ア、コホー
ト、オブ、ホモセクシユアル、アンド、バイセクシユア
ル、メン（THE NATURAL HISTORY OF HIV INFECTION IN
A COHORT OF HOMOSEXUAL AND BISEXUAL MEN）：ア、デ
ケイド、オブ、フオロー、アツプ（A DECADE OF FOLLOW
UP）。ヘツソル（Nancy A.Hessol）、ルサフオード
（G.W.Rutherford）、リフソン（A.R.Lifson）、オマレ
イ（P.M.O′Malley）、デプト、オブ、パブリツク、ヘ
ルス（Dept.of Public Health）、サンフランシスコ、
カリフオルニア〕けれども、ウイルスとそれらが存在し
ている宿主細胞との間の特定の相互反応に関しては現在
論争がある。一般に、HIVにより感染された人間は、ウ
イルスに対する抗体を発現し、そして同じ点において人
間の免疫系は損傷され、そして疾病からの身体の防御に
おいて効力を有しなくなる。この状態は後天性免疫不全
症候群またはエイズ（AIDS）として知られるようになつ
ている。従つて、彼または彼女の身体の免疫不全の故
に、エイズ患者は１群の日和見感染、たとえばカポジ肉
腫およびニユーモシステイスの１つもしくはそれ以上に
より征服される。

マクロフアージ／モノサイト感染は、HIV感染の進行
における、エイズ患者に生じることが知られている脳損
傷の開始における、そしてT4リンホサイトの終局の深い
涸渇により証拠づけられる如く免疫系の衰退の誘発にお
ける因子であるという証拠がある。抗−HIV p24抗体を
使用して、モノサイド／マクロフアージはHIVで感染さ
れうることが実証されている。個々の供血者からの細胞
の70％までが感染している〔クロウ（Crowe）等、エイ
ズ、リサーチ、アンド、ヒユーマン、レトロバイラセズ
（AIDS Research and Human Retroviruses）３、no.2、
（1987）135〕。ニコルソン（Nicholson）等は、たとえ
ばアメリカヤマゴボウ（pokeweed）分裂誘発因子誘導抗
体合成および溶性抗原に対する増殖性応答の如きモノサ
イト依存性であるＴ細胞検定において観察される異常を
説明するために、生存Ｔ細胞中における内因性欠乏より
はむしろ（またはそれに加えて）モノサイト機能におけ
るHIV−III/LAV−誘導効果を提案した。それらＴ細胞検
定は、Ｔ細胞部分集合（subset）として検定したときで
さえも異常と、先に報告されている〔ザ、ジヤーナル、
オブ、イミユノロジー（Journal of Immunology）、13
7、No.1、（1986）323〕。

異物（たとえば、ウイルス）が身体内に入つたとき生
じる第１の出来事の１つは、単核フアゴサイトによるそ
の摂取であることはよく確定しているので、それら細胞
がHIVの主要標的となることが想定される。ガートナー
（Gartner）等は、HTLV−III/LAV感染マクロフアージに
よるウイルス産生が高度にそして長く生存し、それら細
胞はウイルス伝幡および持続に役割を発揮しうることを
示した。彼等は、マクロフアージにおけるHTLV−III/LA
V複製は、彼等が評価した情況において完全に産生的で
あることを実証した〔サイエンス（Science）233（198
6）215〕。

サラフジン（Salahuddin）等は、インビトロ肺マクロ
フアージがHTLV−IIIで感染されえ、そしてこのレトロ
ウイルスのフイトパシツク効果を受け易くないようであ
ることを観察し、これは組織マクロフアージがインビト
ロでHTLV−IIIの強力な保持体として考慮されなければ
ならないことを示唆する〔ブラツド（Blood）68、No.
1、（1986）281〕。

ホー（Ho D.D.）等は、正常血液−由来モノサイト／
マクロフアージがHTLV−IIIによりインビトロ感染を受
けやすいことを見出した。加えて、HTLV−IIIは、この
ウイルスで感染された患者のモノサイト／マクロフアー
ジから回収された。従つて、HTLV−III感染モノサイト
／マクロフアージは、ビスナ・ウイルス（visna viru
s）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（caprine arthritis
encephalitis virus）を含む他のレンチウイルスにつ
いて示された如く、標的器官へのウイルスの伝幡のため
の担体として、そしてウイルス存続のための保持体とし
て役立ちうると仮定された〔ジエー・クリン・インベス
ト（J.Clin.Invest.）77、（198）1712〕。

すべての感染したHIVを完全に殺すことができ、ある
いはその複製を完全に阻害する（そして同時に受容しう
る毒性プロフアイルを有する）抗ウイルス剤が明らかに
望まれているけれども、情況はそのような薬剤が現在に
おいては入手しえないということである。

ウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤は、1960年代
中頃から知られている〔プロスペクツ、フオア、ザ、プ
リベンシヨン、アンド、セラピー、オブ、インフエクシ
ヨンズ、ウイズ、ザ、ヒユーマン、イミユノデフイシエ
ンシイ、バイラス（PROSPECTS FOR THE PREVENTION AND
THERAPY OF INFECTIONS WITH THE HUMAN IMMUNODEFICI
ENCY VIRUS）、マーカス、ボーグ（Markus Vogt）、ヒ
ルシユ（Martin S.Hirsch）、インフエクシヤス、デジ
ーズ、ユニツト（Infectious Disease Unit）、マサチ
ユセツト、ジエネラル、ホスピタル（Massachusetts Ge
neral Hospital）、ハーバード、メデイカル、スクール
（Harvard Medical School）、ボストン〕。数百もしく
はそれ以上のそれら薬剤が知られているが、アジドチミ
ジン（AZT、ジドブジン）がエイズを担う人々のウイル
スに対する治療のために米国のフエデラル、ドラツグ、
アドミニストレーシヨン（Federal Drug Administratio
n）から認可を受けた唯一の医薬である。エイズ患者の
治療におけるAZTの使用は、多くの欠点を有している。A
ZTは非常に高価である。AZTでの治療はそれで処置され
る人間に副作用をしばしば生じ、そして副作用はしばし
ばそれでの治療を完全に停止しなければならないほど重
篤である〔デベロプメント、オブ、HIV−バリアンツ、
ウイズ、ハイアー、レジスタンス、アゲインスト、AZ
T、アンダー、トリートメント、ウイズ、AZT（DEVELOPM
ENT OF HIV−VARIANTS WITH HIGHER RESISTANCE AGAINS
T AZT UNDER TREATMENT WITH AZT），チンマーマン（F.
Zimmermann）、ビーサート（L.Biesert）、フオンブリ
ーゼン（H von Briesen）、クリニクム、デル、ウニベ
ルシタート（Klinikum der Universitat）、フランクフ
ルト、FRG.〕。AZTでのエイズ患者の治療の長期間有効
性は、AZT治療が感染した人間の身体からライルスの離
脱を生じないと信じられているけれども、なお未知であ
る。HIVのAZT−抵抗株がAZTで治療されたエイズ患者中
に発現するという証拠がある（F.ZimmermanおよびL.Bie
sert）。

従つて、ウイルス復製のための宿主として働くモノサ
イト／マクロフアージおよびT4リンホサイト、ランゲル
ハン・セル（Langerhan Cell）のような、ウイルスが存
在している場合、すべての細胞型においてHIVに対し作
用する、新しくより安価で、毒性が低くそしてより効果
的な治療の必要性がある。それらの新しい療法は、好ま
しくは抵抗性株の促進を阻害するようにウイルス非特異
性であろう。

本発明の特定の態様に対する更なる背景として、以後
に示す式I aを有する化合物N⁶−（Δ^２−イソペンテニ
ル）アデノシン（IPA）が、癌の治療を含む臨床試験に
おいて先に使用されてきた〔サイトカイニンズ、アズ、
ケモセラピユーテイツク、エイジエンツ（CYTOKININS A
S CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS），アナールス、オブ、
ザ、ニユーヨーク、アカデミー、オブ、サイエンス（An
nals of the New York Academy of Science）、25、225
〜234、ミツトルマン（Mittleman,Arnold）等（197
5）〕。IPAは天然に生成する化合物である。たとえば、
それはある種のｔ−RNAs中のアンチコドン−隣接ヌクレ
オシドであることが示された〔N⁶−（Δ^２−イソペンテ
ニル）アデノシン：ザ、レギユレートリー、エフエク
ツ、オブ、ア、サイトカイニン、アンド、モデフアイ
ド、ヌクレオサイド、フロム、ｔ−RNA、オン、ヒユー
マン、リンホサイテス（N⁶−（Δ^２−ISOPENTEYL）ADEN
OSINE:THE REGULATORY EFFECTS OF A CYTOKININ AND MO
DIFIED NUCLEOSIDE FROM t−RNA ON HUMAN LYMPHOCYTE
S）。ビオキミカ、エ、ビオフイジカ、アクタ（Biochim
ica et Biophysica Acta）、281:488〜500、ガロ（Gall
o,Robert C.）等（1972）〕。IPAはヒト白血病ミエロブ
ラストの生長を阻害し、ある濃度においてフイトヘムア
グルチニン（PHA）により促進される培養リンホサイト
の生長を阻害し、そして低濃度においてPHAにより促進
される培養リンホサイトの生長を阻害する（Gallo等）
サイトカイニン性質を有することが示されている（Mitt
leman等）。さらにIPAは、ヒトに対する臨床実験におい
て化学療法剤として使用されてきた（Mittleman等）。

式I q〜I t（以後に示す）の他の化合物がまた知られ
ており、そして次の文献中に見出すことができる： I q バローズ（W.J.Burrows）、アームストロング（D.
J.Armstrong）、スクーグ（F.Skoog）、ヘヒト（S.M.He
cht）、ボイル（J.T.A.Boyle）、レオナルド（N.J.Leon
ard）およびオコロビツチ（J.Occolowitz）、サイエン
ス（Science）、161、（1968）、691。

W.J.Burrows、D.J.Armstrong、F.Skoog、S.M.Hecht、
J.T.A.Boyle,N.J.LeonardおよびJ.Occolowitz、バイオ
ケミストリー（Biochemistry）、８、（1969）3071。

I r シヨウ（G.Shaw）、スモールウツド（B.M.Smallwo
od）およびウイルソン（D.V.Wilson）、ジエー、ケム、
ソス（J.Chem.Soc.）、Ｃ、（1966）921。

I s ヘヒト（S.M.Hecht）、ガロ（Gello）等中の文献2
9。ビオキム、エ、ビオフイジカ、アクタ（Biochim et
Biophysica Acta）、281、（1972）488。

I t I sに同じ。

発明の要約本発明は、任意のウイルス感染に対する治療的または
予防的処置の方法を提供する。更に、本発明はHIVで感
染された生体の治療を提供する。本発明のある種の実施
態様は、未処理検体に関しHIV水準を減少させるために
血液検体を処理する方法を提供する。

更に、本発明は、HIVウイルスゲノムにより、潜在的
または顕在的に感染された細胞の形態または機能の変化
を防止するための処置を提供する。その１例は、表皮ラ
ンゲルハン細胞中のタツト遺伝子生成物（tat gene pro
duct）の発現を阻害し、かくしてHIVで感染された患者
において生成する表皮形態異常および腫瘍を阻害しまた
は退縮を生じさせるIPAの能力である。

本発明は、一般式Ｉの化合物の使用の方法を提供す
る。

式中： R₁はＨまたはCH₃Sであり、そして、 R₄はであり、そして、 R₅はCH₃またはClであり、 R₆はCH₃、CH₂OHまたはClであり、そして、 R₇はＨまたはBrであり、あるいは、 R₁はＨであり、そして R₄はであり、そして、 X₁およびX₂は個々にＨ、メチル、エチル、ヒドロキシ
ル、ハロゲンおよびカルボキシルから選択され、あるい
は、 R₄はであり、または、 R₄はであり、または、 R₄はであり、そして、 R₈はであり、または、 R₈は（CH₂）₇CH₃であり；そして、 R₂はOHであり、そして、 R₃はOH、モノホスフエート、ジホスフエートまたはトリ
ホスフエートであり、または、R₂およびR₃は結合して
３′,5′−サイクリツクモノホスフエート誘導体を形成
し、あるいは、上記のいずれかの生理学的に受容しうる
塩。

以下に列挙するのは、本発明に従う好ましい化合物I
a〜I tのそれぞれの化学基である。

I a:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OHそして N⁶−（Δ^２−イソペンテニル）アデノシン I b:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝モノホスフエート、そして、 N⁶−（Δ^２−イソペンテニル）アデノシン−５′−モノ
ホスフエート I c:R₁＝Ｈ、R₂およびR₃は結合して３′,5′−サイクリ
ツクモノホスフエート誘導体を形成する、 N⁶−（Δ^２−イソペンテニル）アデノシン−３′,5′−
サイクリツクモノホスフエート I d:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、 R₄＝CH₂C₆H₆、ベンジルアデノシン、 I e:R₁＝H₂、R₂＝OH、 R₃＝モノホスフエート、そして、 R₄＝CH₂C₆H₆ N⁶−ベンジルアデノシン−５′−モノホスフエート I f:R₁＝Ｈ、R₂およびR₃は結合して３′,5′−サイクリ
ツクモノホスフエート誘導体を形成し、そして、 R₄＝CH₂C₆H₆ N⁶−ベンジルアデノシン−３′,5′−サイクリツクモ
ノホスフエート I g:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、フルフリルアデノシン I h:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝モノホスフエート、そして、 N⁶−フルフリルアデノシン−５′−モノホスフエート I i:R₁＝Ｈ、R₂およびR₃は結合して３′,5′−サイクリ
ツクモノホスフエート誘導体を形成し、 N⁶−フルフリルアデノシン−３′,5′−サイクリツクモ
ノホスフエート I j:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、Ｎ−（プリン−６−イルカルバモイル）−ｏ−クロロア
ニリンリボヌクレオシド I k:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝モノホスフエート、そして、Ｎ−（プリン−６−イルカルバモイル）−ｏ−クロロア
ニリンリボヌクレオシド−５′−モノホスフエート I l:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、 R⁶−アタマンチルアデノシン I m:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝モノホスフエート、そして、 R⁶−アダマンチルアデノシン−５′−モノホスフエート I n:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、Ｎ−（プリン−６−イルカルバモイル）−ｎ−オクチル
アミンリボヌクレオシド I o:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝モノホスフエート、そして、Ｎ−（プリン−６−イルカルバモイル）−ｎ−オクチル
アミンリボヌクレオシド−５′−モノホスフエート I p:R₁＝Ｈ、R₂およびR₃は結合して３′,5′−サイクリ
ツクモノホスフエート誘導体を形成し、そしてＮ−（プリン−６−イルカルバモイル）−ｎ−オクチル
アミンリボヌクレオシド−３′,5′−サイクリツクモノホス
フエート I q:R₁＝CH₃S、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、 N⁶−（Δ^２−イソペンテニル）−２−メチルチオアデノ
シン I r:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、 N⁶−（４−ヒドロキシ−３−メチル−トランス−２−ブ
テニル）アデノシン I s:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH、そして、 N⁶−（３−クロロ−トランス−２−ブテニル）アデノシ
ン I t:R₁＝Ｈ、R₂＝OH、R₃＝OH₃、そして、 N⁶−（３−クロロ−シス−２−ブテニル）アデノシン。

本発明はまた、式Ｉの化合物の種族の代謝物を使用す
る。好ましい代謝物は、次のものを包含する： N⁶−（Δ^２−イソペンテニル）アデニン；６−Ｎ−（３−メチル−３−ヒドロキシブチルアミ
ノ）プリン；アデニン；ヒポキサンチン；尿酸；および、メチル化キサンチン。

式Ｉを有する化合物の種族のある種の化合物は、我々
のインビトロスクリーニングにおいて、従来知られてい
なかつた抗ウイルス剤としての価値ある医薬性質を有す
ることが見出された。

たとえば、化合物I a、IPAは、後記のインビトロ実験
を通して、モノサイト／マクロフアージ細胞中およびT4
リンホサイト中、そしてまたランゲルハン細胞中におけ
るHIV−１の複製を、細胞それら自体に無毒性である水
準において阻害することが見出された。

IPAが、IPAで処理されていない感染されたマクロフア
ージ細胞に関して、IPAで処理されたHIV−感染マクロフ
アージ細胞において、HIVの水準を減少させることを示
す研究が行われた。毒性研究が非感染細胞（ＴおよびＢ
リンホサイト、ならびにモノサイト）を使用して行わ
れ、それはそのような細胞がHIV−感染マクロフアージ
細胞中のHIVの水準を減少させる水準における、IPAに対
するインビトロ暴露に耐えうることを示した。

IPAが、IPAで処理されていないHIV−感染の同様な細
胞に関し、HIV−感染H9、81−66−45およびモノサイト
／マクロフアージ細胞中のHIVのインビトロ水準を減少
させることを示す研究が行われた。

ヒト白血球生存能力に対するIPAのインビトロ効果を
示すための実験を行つた。

IPAが、インビトロ実験において、ヒマラヤ・タール
（Himalayan Tahr）卵巣細胞中のヤギ関節炎脳炎ウイル
ス（CAEV）の水準を減少させることを指示する研究を行
つた。

IPAがヒトフイブロブラストのM413セルライン中のヘ
ルペス・シンプレツクス１型（HSV−１）のインビトロ
水準を示す研究を行つた。

IPAがインビトロにおいて、細胞中のサイトメガロウ
イルスの水準を減少させることを示す研究を行つた。

IPAがインビトロにおいて、P₃HR1中のエプスターン−
バール（Epstern−Barr）ウイルス（EBV）の水準を減少
させることを示す研究を行つた。

本発明に従い使用される化合物は、HIVに対する処置
として、小腸内、非経口、局所、経口、直腸内、鼻内ま
たは膣内経路を包含する任意の適当な経路により投与さ
れる。非経口経路は、皮下、筋肉内、静脉内および舌下
投与を包含する。局所経路は、バツカルおよび舌下投与
を包含する。好ましい投与経路は静脉経路であるが、式
Ｉを有する化合物の経口投与は、第２の好ましい経路で
ある。

本発明は更に、HIVに対する処置における使用のため
の、調合物、そして特に医薬調合物の製造における式Ｉ
の任意の化合物の使用を提供する。本発明はまた、医薬
調合物それら自体を提供する。

本発明は更に、血流中における式Ｉ化合物の半減期を
延長するために、たとえばペントスタチンのようなアデ
ノシンジアミナーゼインヒビターと組合せた式Ｉの任意
の化合物の使用を提供する。

本発明に従い製造される医薬製剤は、ゼラチンカプセ
ル、錠剤形、糖衣錠、シロツプ、懸濁液、局所クリー
ム、坐剤、注射液中に、あるいは使用直前調製用のシロ
ツプ、懸濁液、局所クリーム、坐剤または注射液の製造
のためのキツト中に含有された式Ｉの化合物を包含す
る。また、式Ｉの化合物は、血流中におけるその緩徐な
放出を促進する複合処方（composites）、たとえばシリ
コンデスク、ポリマービース中に包含されうる。

本発明に従い製造される医薬製剤は、通常の賦形剤、
即ち化合物と損傷的に反応しない医薬的に受容しうる有
機または無機の担体物質との混合における式Ｉの化合物
の使用を包含する。適当な医薬的に受容しうる担体は、
水、塩溶液、アルコール類、アラビアゴム、植物油、ゼ
ラチン、炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、ケイ酸、粘稠パラフイン、脂肪酸モノ−およびジ−
グリセライド等を包含するが、それらに限られない。

製造方法は、医薬製剤の滅菌を包含しうる。化合物
は、化合物と損傷的に反応しない補助剤、たとえば滑沢
剤、防腐剤、安定剤、浸透圧に影響する塩類等と混合し
うる。

式I aの化合物は、もしも光から保護され、そして−7
5℃で貯蔵されるならば、殆んど無期限に乾燥貯蔵しう
る。IPAは光感受性であり、そして固体形、あるいは水
性またはエタノール性溶液における場合、室温で損傷す
る。IPAの分解率は、遮光容器中、室温において、１ケ
月当り約３％であることが、実験で認められた。

本発明の範囲内の処置方法はまた、式Ｉの化合物の生
理的に受容しうる塩、たとえば、塩酸、硫酸、リン酸塩
のような無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタ
ンスルホン酸等のような有機硫酸、および酢酸、シユウ
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン
酸等のような有機カルボン酸に由来するものを包含す
る。

HIVに対する処置において有効である式Ｉを有する任
意の１つもしくはそれ以上の用量は、使用する特定の化
合物または化合物の組合せ、投与の様式、および処置さ
れる生物体を包含する多くの因子に依存する。所与の宿
主のための、各々が式Ｉにより限定される種類に属する
特定化合物または化合物の組合せの用量は、通常の考慮
を使用し、たとえば、主題化合物と公知薬剤との特異活
性の通常の比較により、即ち適当な薬理学的プロトコー
ルにより決定しうる。更に、特定基準の有効性は、処置
される生物体の血液検体中のHIVの存在を時間を追つて
追跡することにより監視しうる。HIV抗原の検出のため
のキツトが商業的に入手しうる。HIV−１の抗原を検出
するために、そのようなキツトの１つが、本発明の例I
aに記載する如く使用された。式Ｉの化合物の投与によ
り、患者の血清中の検出しうるp24抗原の水準の約２ケ
月間にわたる減少を生じることが可能である。感染の水
準の進行のよりよい測定は、感染されたマクロフアージ
数のパーセントである。式Ｉの化合物での処置の過程で
血液または肺のいずれかから得られたモノサイト／マク
ロフアージ細胞は、治療の進行につれて回復可能HIV抗
原の減少を示す。

本発明の１態様、式Ｉを有する化合物からなる医薬調
合物は、１日当り１単位量から10単位量まで、そして好
ましくは１日当り１単位量から４単位量までの割合で投
与される。この用量は12週までの期間与えられ、そして
ある場合には患者の１生涯与えることができ、あるいは
患者の医薬要求に依存し、より低い頻度の間隔で与えう
る。

本発明の１態様においては、単位量は、式Ｉを有する
化合物からなる調合物0.01から500mgまでを包含する。

本発明の１態様においては、医薬調合物は、化合物が
徐放形であるとき、１日当り単位量１回、あるいは化合
物がその天然形であるとき、１日当り８単位量まで、経
口投与される。別途にまたは付加的に、医薬調合物は、
体重1kg当り0.3mgから80mgまでの範囲において式Ｉを有
する化合物を包含する単位量において静脉内投与され
る。

本発明の１態様においては、式Ｉを有する化合物から
なる医薬調合物は、経皮パツチの使用により投与され
る。

本発明の１態様においては、式Ｉを有する化合物から
なる医薬調合物は、小腸からの吸収を改善するために、
乳化または半乳化調合物を使用して投与される。そのよ
うな乳剤は、ココナツ油の誘導体、たとえばミグリオー
ル（Miglyol）812を使用して調合しうる。

本発明の特定の態様においては、ウイルス感染を治療
する方法はまた、化合物デヒドロエピアンドロステロン
および（または）その同族体からなる医薬調合物で患者
を同時に治療することを包含する。別途に、医薬調合物
は、式Ｉの任意の化合物、デヒドロエピアンドロステロ
ンおよび（または）その同族体、またはエチオコラノロ
ンの組合せにおける治療の方法を包含する。

本発明の他の態様においては、本発明の方法は、骨髄
によるＴ−細胞の産生を高めるために、公知の免疫系ブ
ースターまたは免疫系モジユレーターで患者を治療する
過程を包含する。患者は、式Ｉを有する化合物からなる
医薬調合物の投与に先立ち免疫系ブースターで治療され
る。他の場合においては、患者は、骨髄によるＴ−細胞
の産生の水準（感染により減少している）が安定しまた
は増加し始めるまで、免疫系ブースターで治療される。
特に、免疫系ブースターは、Ｔ−４細胞の水準が安定化
しまたは増加し始めるまで投与される。

本発明の他の態様においては、方法は、式Ｉを有する
化合物からなる医薬調合物が投与されながら、患者をそ
れに先立ちまたは同時にの両方で、免疫系ブースターで
治療する過程を包含する。

図面の簡単な記述第１図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当
りのカウントのグラフである。

第２図は、検定におけるIPAの濃度に対する増殖能力
の増加または減少パーセントのグラフである。

第３図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当
りのカウントのグラフである。

第４図は、検定におけるIPAの濃度に対するＴおよび
Ｂリンホサイト増殖の増加または減少のパーセントのグ
ラフである。

第５図は、検定におけるIPAの濃度に対するMLC反応性
の増加または減少のパーセントのグラフである。

第６図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当
りのカウントのグラフである。

第７図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当
りのカウントのグラフである。

第８図は、検定におけるIPAの濃度に対するＴおよび
Ｂリンホサイト機能の増加または減少のパーセントのグ
ラフである。

第９図および第10図は、検定におけるAZTの濃度に対
するＴリンホサイト増殖のグラフである。

第11図および第12図は、検定におけるddCの濃度に対
するＴリンホサイト機能のグラフである。

第13図は、H9細胞のインビトロHIV感染に対するIPAの
効果のグラフである。

第14図は、HIV産生に対するIPAの効果のグラフであ
る。

第15図は、検定におけるIPAの濃度に対するウイルス
復製の阻害のグラフである。

第16図および第17図は、検定におけるIPAの濃度に対
する細胞毒性およびウイルス阻害のグラフである。

第18図は、検定におけるN⁶−アダマンチルアデノシン
の濃度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラ
フである。

第19図は、検定におけるN⁶−ベンジルアデノシンの濃
度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフで
ある。

第20図は、検定におけるN⁶−フルフリルアデノシンの
濃度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフ
である。

第21図は、検定におけるN⁶−フルフリルアデノシンの
濃度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフ
である。

第22図は、検定におけるN⁶−ベンジルアデノシンの濃
度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフで
ある。

第23図は、検定におけるN⁶−アダマンチルアデノシン
の濃度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラ
フである。

例感染したマクロフアージ中のHIV−Ｉの水準の減少に
おけるIPAの有効性を決定するために試験を行つた。試
験はまた、非感染Ｔリンホサイト、Ｂリンホサイトおよ
びモノサイトに対するIPAの毒性効果を決定するために
行つた。

以後の例中に記載する実験を行い、それはインビトロ
でHIV−Ｉ−感染マクロフアージ細胞中のHIV−Ｉの水準
の減少におけるIPAの有効性を示す。行つた実験はま
た、感染したマクロフアージ細胞中のHIV−Ｉの水準の
減少におけるAZTおよびジデオキシシチジン（ddC）の相
対有効性を示す。さらに、ヒトＴおよびＢリンホサイ
ト、ならびにモノサイトが、インビトロでIPAに高い耐
性を有することを示す実験を行つた。

一般に、ウイルス抗原の濃度を減少させるIPAの能力
を試験するための実験において、IPAは先ず滅菌塩水中
の10ミリモル（mM）貯蔵溶液に作られる。これは、1mM
から１μＭまでの終濃度にして使用される。IPAは水に
容易には溶けず、そして光感受性であるので、それは、
若干の場合には、生長培地中に直接2mMで溶かし、そし
てこれを所望濃度の溶液を作るために使用した。

実験I a（ａ）：マクロフアージ細胞、HIV−Ｉ、抗体検
定１列当りウエル６個を有するマイクロタイタープレー
トのウエルに、ロイコパツク（leukopak）から得た単核
細胞を直接インキユベートすることにより、新たなマク
ロフアージ培養物を得た。非粘着細胞の除去の後、各列
の粘着マクロフアージを、HIV−Ｉの10倍段階希釈で、
ウイルスの摂取を高めるためにポリブレンを使用して減
染させた。１から２時間後に、ウイルス媒質を除去し、
そして新たな正常生長媒質で置換した。各列の新たな媒
質は、表I a（ａ）の左欄に示すように、特定濃度のAZ
T、ジデオキシシチジン（ddC）、または化合物I aを含
有した。第１列のウエルは対照であり、そしてそれには
３種の医薬のどれも含有していない新たな媒質を加え
た。媒質水準は、残留ウイルス接種物を除去するために
完全な液体取換えを少くとも１回行つて、ウイルスの複
製が生じるように、２から４週間維持した。ついで、各
ウエルの内容を、存在するHIV p24抗原の水準につき、
商業的に入手しうる抗原捕獲キツトを使用し、検体中に
存在するp24の10^-9gmほどの少量を検出しうる放射免疫
検定を用いて試験した。上記方法は二重操作で行つた。

結果は次の如く解釈された：たとえば、2/2は両操作
の対応ウエルの両方がHIV−I p24につき陽性であつたこ
とを意味し、他方0/2はどちらのウエルも陽性でなかつ
たことを意味する。力価は最終欄の次の与えられ;1/2ウ
エルが陽性である場合、対数尺度で計算したとき２つの
希釈の間の半分である中間値が力価として与えられた。
３μM IPAは1/10,000の希釈において両ウエルで陽性で
あり、そして1/100,000において両ウエル共陽性でなか
つた。従つて、10⁴と10⁵の間の半対数間隔は、10^４・５
または30,000である。

３つの実験の間に、モノサイト／マクロフアージ培養
物は、使用したIPAのすべての濃度において健康である
らしかつたけれども、大きい粘着性マクロフアージ細胞
への小さい未成熟モノサイトの分化は、IPAの存在にお
いて生じないことが観察された。

実験I a（ｂ）:H9細胞、HIV−１、抗体検定感染したH9細胞を使用して、実験I a（ａ）と同様な
方法で行い、H9細胞はパーマネントヒトＴ−セルライン
である。結果を表I a（ｂ）に示す。

実験I a（ｂ）:H9細胞、HIV−１、抗体検定パーマネントヒトＴ−セルラインである感染したH9細
胞を使用し、実験I a（ａ）と同様な方法で行つた。結
果を表I a（ｂ）（ｉ）に示す。

それら実験を繰返し、そして結果を表I a（ｂ）（i
i）に示す。

実験I a（ｃ）：ヒマラヤタール卵巣細胞、CAEV、抗体ヤギに白質脳炎および関節炎を生起させるヤギ関節炎
脳炎ウイルス（CAEV）、レント（lent）ウイルス関連HI
V−Ｉに暴露したヒマラヤタール卵巣細胞を使用し、実
験I a（ａ）と同様な方法で行つた。ウイルスの存在を
決定するために、CAEV p28を検出する放射免疫検定を使
用した。結果を表I a（ｃ）に示す。

実験I a（ｄ）：ヒト細胞生存性に対するIPA、AZTおよ
びddCの効果ヒト末梢血液単核細胞を各種濃度のIPAおよびアチド
チミジン（AZT）の存在において、37℃で18時間インキ
ユベートし、その時間の後、細胞の生存性を、トリパン
ブルーの存在において細胞の視覚計数により決定した。
結果を表I a（ｄ）（ｉ）に示す。無毒性が、AZTにつ
き、0.1μＭから6mMまでの間の濃度で観察された。6mM
IPAの存在において細胞生存性に僅かな減少があつた
が、0.1μＭから3mMまでの濃度を使用して毒性は観察さ
れなかつた。

他のセルラインに対するIPA、AZTおよびddCの毒性効
果を決定するために、実験をまた行つた。結果を表I a
（ｄ）（ii）からI a（ｄ）（ｖ）までに示す。

２ロツトのIPA（検体１および検体２）を試験した。
４ケ月にわたる検体１の試験は、化合物に変化がなかつ
たことを示した。

脚注：モノサイト／マクロフアージ細胞はウエルに緊
密に粘着しているので、それらは染色および計数のため
にトリプシン処理しえない。我々はまたウエル中で直接
染料摂取を有効に観察しえず、そこで上記になされた観
察は細胞、そしてまた細胞数の明らかな健康の定性的指
示を示す。

それにもかかわらず、それらモノサイト／マクロフア
ージ細胞が、たとえば、Ｔセルラインに比しIPAの毒性
効果に対しかなり大きく抵抗性であるらしいことを認め
るのは重要である。CAEV試験に使用したタール細胞はま
た、IPAに対し比較的抵抗性であるので、最も急速に生
長する細胞は、最も傷害を受けやすいらしい。

実験I a（ｅ）：ヒトＴおよびＢリンホサイト機能に対
する医薬の効果正常なヒトＴおよびＢリンホサイト機能に対する化合
物I aの効果を決定するために、試験を行つた。

正常なヒト供血者からのＴおよびＢリンホサイトを、
各種用量水準の指示した化合物と30分間インキユベート
した。リンホサイトイを、ゲンタマイシンおよびフイト
ヘムアグルチニン（PHA）（Ｔ細胞分裂誘発因子）、ア
メリカヤマゴボウ分裂誘発因子（PWM）（Ｂ細胞誘発因
子）および同種異系単核細胞（混合した白血球培養物;M
LC）中で、三重複製ウエル中に、あるいは上記添加物を
含有する媒質中に加えた。リンパ球幼若化（lymphocyte
blastogenesis）検定を以下に詳細に記述する。

各種検定の結果は、チヤートI a（ｅ）（ｉ）〜I a
（ｅ）（xii）（第１〜12図）に要約する。高められた
細胞の胚発生は、細胞活性の刺激を示すものと解釈され
た。

データーは、三重複製の平均として示す。結果は、チ
ヤートI a（ｅ）（ｉ）およびI a（ｅ）（ii）（第１お
よび２図）に示す。チヤートI a（ｅ）（ｉ）（第１
図）は、１分間当りの総カウント（CPM）（分裂誘発因
子含有ウエル中の平均CPM）としてデータを示し、そし
てチヤートI a（ｅ）（ii）（第２図）は、IPAなしの細
胞培養物と比較して、IPAが加えられた細胞培養物の増
殖能力における増加または減少％〔％変化＝（IPAを有
するウエルの総CPM/媒質を有するウエルの総CPM）×10
0〕を示す。増殖に対する両方のＴリンホサイトの能力
の減少は、100μＭもしくはそれ以上の濃度のIPAを細胞
培養物に加えたときに得られた。実験において、30μＭ
濃度のIPAで、25％のＴリンホサイトの増殖活性。Ｔお
よびＢリンホサイト増殖における効果なしまたは増加
は、0.1〜10μＭ濃度のIPAを細胞培養物に加えたときに
観察された。

第２の実験は、より狭い用量水準範囲のIPAを細胞培
養物に加えて行い、そしてＴおよびＢリンホサイト増殖
を測定した（チヤートI a（ｅ）（iii）およびI a
（ｅ）（iv）−−第３および４図）。Ｔリンホサイト増
殖の認めうる減少は、30から10μＭまでの範囲内のIPA
の用量水準で観察されなかつた。約30〜50％のＢリンホ
サイトの減少が30〜10μＭ濃度水準の間で観察された。
実験間で観察されたばらつきの程度は、それら試験にお
いて共通である。〔ラスター（Luster）等。デベロプメ
ント、オブ、ア、テステイング、バツテリー、ツー、ア
セス、ケミカル−インジユースト、イミユノトキシシテ
イ（Development of a Testing Battery to Assess Che
mical−Induced Immunotoxicity）：ナシヨナル、トキ
シコロジー、プログラムズ、ガイドラインズ、フオア、
イミユノトキシシテイ、エバリユエシヨン、イン、マイ
ス（National Toxicology Program's Guidelines for I
mmunotoxicity Evaluation in Mice）〕。

混合白血球培養物（MLC）反応は、ヒト組織相容性抗
原を認識し、そして免疫的に反応するヒト単核細胞の能
力を評価するために使用しうる（抗原に対する第１次免
疫反応を載せる細胞の能力の測定）。１組のヒト単核細
胞の培養物を、リンホサイト胚発生検定における無関係
供血者からの単核細胞と反応させ、そして第１組の細胞
の増殖を定量した。結果を、チヤートI a（ｅ）（ｖ）
およびI a（ｅ）（vi）（第５および６図）に示す。ま
た、分裂誘発因子でのリンホサイト胚発生における如
く、MLCを３つの複製で行い、そして平均値を得た。MLC
反応性の僅かな増加が、100μＭのIPAを培養物に加えた
ときに見られた。MLC反応性に対する効果は、10μＭのI
PAでは見られず、そしてMLC反応性の50％減少が１μＭ
濃度で得られた。

ＴおよびＢリンホサイト機能に対するIPAの“無効”
用量水準をより厳密に観察するために、より近接した用
量水準間隔でリンパ球幼若化検定操作する実験を行つ
た。この実験で、広い用量水準の比較効果（1000〜１μ
ＭのAZTおよびddCをまた、ＴおよびＢリンホサイト機能
につき評価した）。結果を、チヤートI a（ｅ）（vii）
〜I a（ｅ）（xii）（第７〜12図）に示す。また、Ｔお
よびＢリンホサイト機能の減少が、IPAで1000μＭから1
0μＭの範囲の用量水準において得られた。ＴおよびＢ
リンホサイト機能における約25％減少が30〜35μＭ濃度
のIPAで見られた（チヤートI a（ｅ）（vii）およびI a
（ｅ）（viii）−−第７および８図）。増加したＴおよ
びＢリンホサイト応答が10μＭ用量水準において観察さ
れた。

Ｔリンホサイト増殖の認めうる減少は、AZTの100〜１
μＭ濃度において得られなかつた（チヤートI a（ｅ）
（ix）およびI a（ｅ）（ｘ）−−第９および10図）；
約25％減少が、Ｔ細胞に対し1000μＭ用量水準のAZTで
見られた。すべての用量水準、1000〜１μＭにおいて、
AZTはＢリンホサイト増殖の（50〜90％）減少を生じ
た。

Ｔリンホサイト機能の10〜25％減少が、ddCの広範囲
（100〜１μＭ）の用量水準で見られた。AZTにおける如
く、Ｂリンホサイト増殖応答のより大きな減少が、ddC
で観察された。1000μＭ濃度において、80から85％まで
の減少が見られ、そして20〜35％減少が１μＭ用量水準
のddCで得られた（チヤートI a（xi）およびI a（ｅ）
（xii）−−第11および12図）。

実験I a（ｆ）：ヒトモノサイト機能に対する医薬の効
果各ヒト供血者からのモノサイトを、３つの異つた用量
水準の化合物I aと、三重複製において、30分間インキ
ユベートした。それら細胞をアガロースに加え、そして
細胞を含有するアガロースの液滴を小室に加えた。単核
細胞の高められた転移を誘導するために、化学走性剤を
加えた。詳細な検定方法を以下に記載する。

お互いの30％以内の三重複製の細胞転移型が、一般に
受容された。結果を表I a（ｆ）（ｉ）に示す。

100〜1000μＭ濃度のIPAを使用して、自発転移に対す
るモノサイトの能力の22〜37％減少があつた。30μＭ濃
度のIPAで、自発転移のより少ない15％減少があつた。
高められた自発転移が、0.1〜0.3μＭのIPAを使用して
観察された。

３〜30μＭの最初に観察された遷移水準を取囲むIPA
の濃度を使用して、IPAの効果を研究した。結果を表I a
（ｆ）（ii）に示す。

表I a（ｆ）（ｉ）およびI a（ｆ）（ii）から知りう
るように、IPAの存在において、細胞の自発転移の減少
の程度は、２組の実験の間で若干異つている。たとえ
ば、15％減少が30μM IPA（表I a（ｆ）（ii）における
細胞の転移で観察され、そして34％減少が表I a（ｆ）
（ii）中に示される。この大きさのばらつきは、この型
の検定では普通である（Luster等、前掲）。

AZTおよびddCの相対効果を、また研究した。結果を表
I a（ｆ）（iii）に示す。

ヒトリンホサイト胚発生検定の詳細な記述１）単核細胞を、全血から、合成分離媒質を使用して、
差動遠心分離により分離し、あるいは冷凍貯蔵製剤から
解凍した。細胞を洗滌し、そして媒質（RPMI−1640、Ｌ
−グルタミン2mM、ヘルペスバツフアー25mM、ゲンタマ
イシン50μg/ml、ヒトAB血清−熱不活性化（56゜、30
゜）20％）中に再懸濁する。

２）生存細胞数を決定する。

３）細胞濃度を、媒質中２×10⁶/mlに調節する。

４）細胞懸濁液を、96−ウエル平底プレートのウエル
に、0.1ml部分（２×10⁵細胞）で加える。

５）選択した分裂誘発因子および（または）抗原（媒質
中、血清なし）を、ウエル中の細胞に、また0.1ml部分
で加える。

６）培養物を、加湿５％CO₂雰囲気中、37℃において、
３〜７日間（分裂誘発因子または抗原に依存する）イン
キユベートする。

７）培養終了の６から８時間前に、0.05ml（１μCi）の
³H TdR比活性6.7Ci/mM（20μCi/ml貯蔵物）を、各ウエ
ルに加える。

８）培養終了時に、多数検体採取器を使用して、細胞を
シンチレーシヨン−等級ガラス繊維紙片上に採取する。

９）採取した培養物のガラス繊維紙からの穿孔デスク
を、各々シンチレーシヨンバイアルに入れ、それについ
てトルエン基礎シンチレーシヨンカクテル5mlを加え
る。

10）バイアルを液体シンチレーシヨンカウンターで計数
し、そこで合体した³H TdRが決定される。

結果の計算総CPM＝分裂誘発因子／抗原培養物の×CPM−媒質培養物
の×CPM プレコールグラジエント分離を使用するモノサイトの単
離１）6mlホスフエート緩衝化塩水（PBS）２×をプレコー
ル7mlに加える。

２）混合物を15ml容ポリカーボネート遠心分離管（ソル
バール（Sorvall）^＊03243、18×100mm、pt.^＊00770 5
0/ボツクス、W/カツプ）に加える。

３）管を21,000×ｇで45分間遠心分離する（ソルバー
ル、RC2−Ｂ遠心分離W/SS−34ローター、34固定角、−1
5,000rpm W/ブレークオフ、＠４℃）。プレコールグラ
ジエントは２週間でよい。

４）単核細胞を、全血から、合成分離媒質を使用し、差
動遠心分離により分離する。

５）細胞を基礎塩溶液（BSS）で洗滌２×する。

６）細胞をBSS＋10％BCSに再懸濁し、ついで混合物を、
仔牛血清（BCS）30〜40mlを含有する50ml容遠心分離管
に加え、そして400×ｇで10分間遠心分離する。

７）細胞をBCSなしのBSSに再懸濁する。

８）生存細胞数を決定する。

９）細胞の濃度を2.0〜2.5×10⁴/mlに調節する。

10）細胞2mlを、プレコールグラジエントの頂上部に注
意深く積層する。管を、ブレイクオフで４℃において、
100×ｇで20分間遠心分離する。

11）モノサイト層を滅菌ピペツトで採取し、そして50ml
容遠心分離管に分注する。死滅細胞は頂上帯中に存在す
る。モノサイトは中間グラジエント上約5mlにある。リ
ンホサイトは中間グラジエント下約5mlにある。50ml容
遠心分離管１個中へのモノサイトの６プレコールグラジ
エント管を超える分注はしない。

12）細胞をBCSなしのBSSで洗滌３×する。

13）細胞を所望媒質中に再懸濁する。

14）モノサイトの比率を決定するために、モノサイト細
胞懸濁物にエステラーゼ染色を行う。比率は50〜80％の
範囲である。

化学走性検定１）アガロース〔シーケム（Seakem）HE〕おより蒸留H₂
Oの0.4％溶液を製造し、１ドラムバイアルに分注し、オ
ートクレーブし、そして使用するまで４℃で貯蔵する。

２）グルタミン2mM、ゲンタマイシン50g/mlおよび仔牛
血清−熱不活性化（56℃、30℃）20％を含有するメデイ
ア（Media）199 ２×中の３×10²/ml細胞の懸濁液を同
量の0.4％アガロースと組合せる。

３）５μ液滴の細胞／アガロース混合物を、ステリリ
ン（Sterilin）プレート〔サーレイ（Surrey）、英国〕
の中心に加える。

４）２μ液滴のアガロース／媒質混合物を、細胞／ア
ガロース液滴の１側３〜5mmに加え、そして２μ液滴
のアガロース／ケモ−アトラクタント〔Ｎ−ホルミル−
Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フエニルアラニン
10^-4M（Ｆ−Met−Leu−Phe）〕を細胞／アガロース液滴
の他側３〜5mmに加える。

５）液滴を固化させ、その後グルタミン2mM、ゲンタマ
イシン50μg/mlおよび仔牛血清10％を含有する0.5mlのR
PMI−1640をウエルに加える。カバースリツプをついで
ウエルにかぶせる。

６）プレートを５％CO₂/加湿空気中、37℃で約18時間イ
ンキユベートする。

７）プレートをインキユベーターから取出し、そして細
胞が対照媒質およびケモアトラクタント液滴にむかつて
移動した距離を追跡しそして測定する。

実験I a（ｇ）:M413細胞、CMV、視覚方法 48ウエルミクロタイタープレート中のM413細胞（二倍
体ヒトフイブロブラスト細胞の１つの型）の融合性単層
を使用した。それらを、10％牛胎児血清および50μg/ml
ゲンタマイシンを補充したダルベツコMEM（minimum ess
ential medium）中で生長させた。

貯蔵サイトメガロウイルス（CMV）を、上記媒質中、
１連の10倍希釈で希釈し、そして0.1mM量をマイクロタ
イタープレートのウエルに加え、そしてウイルスを37℃
で90分間吸収させた。

非吸収ウイルスを吸引により除去し、そして医薬の希
釈物を含有する媒質0.5mlを複製ウエルに、ウイルスの
各濃度において加えた。５日間インキユベートした後、
新たな媒質を各ウエルに加え、追加医薬は包含させず、
そしてプレートを翌日、細胞変性効果につき点数評価し
た。ウイルスは、特徴的に拡大し円形化した細胞を、そ
のような細胞を完全に欠いた細胞性背景中で産生する。

データーは、特徴的に円形化した細胞を産生する最大
希釈の逆数（“力価”）として表わし、そして実験I a
（ａ）のそれの如く説明される中間結果で、パーセント
阻害は実験力価を対照力価と比較することにより計算し
た。結果を表I a（ｇ）に要約する。

実験は、それら実験の条件下の非感染細胞の生存性を
決定するために行つた。

非感染細胞を各種濃度のIPAに暴露し、そしてそれら
の生存性を、トリパンブルー排除により、対照細胞に関
係して、24時間後に決定した。

実験I a（ｈ）:M413細胞、HSV−Ｉ、視覚方法ヘルペス・シンプレツクス（herpes simplex）ウイル
ス−Ｉ型（HSV−Ｉ）を使用したことを除いで、実験I a
（ｇ）につき記載したと同様の方法に従つて行つた。結
果を表I a（ｈ）に示す。

それら条件下に非感染細胞の生存性を決定するために
実験を行い、そして表I a（ｇ）に示す。

実験I a（ｉ）:EBVで急性感染されたP₃HR1細胞、螢光抗
体法実験は、濃縮P₃HR1細胞を使用して行つた。ウイルス
は、EBVゲノムを含有しているが、核抗原（EBNA）を除
きEBV蛋白質を発現しないラジ（Raji）セルラインのス
ーパー感染により力価検定した。感染性EBVによるラジ
細胞の感染は、細胞中に感染性ウイルスの力価に比例し
て早期抗原（EA）を誘導する。EAはモノクローナル抗体
を使用して検出した。

検定は、ラジ細胞をP₃HR1ウイルスの段階10倍希釈に
２時間暴露することにより開始した。過剰のウイルス
は、遠心分離により分離しそして除去した。各希釈にお
ける感染された細胞の１部分を12ウエルトレイに分配
（0.5ml/ウエル）し、そして所望最終媒質濃度の２倍を
含有する媒質0.5mlを各ウエルに加えた。

24および72時間目に、各ウエルの１部分を洗滌し、ガ
ラススライドのテフロン（商標）上掛けウエルに加え、
空気乾燥してそれらをガラスに付着させ、ついでアセト
ン−メタノール（50:50）で固定した。標準螢光抗体法
を行つて、各時間、ウイルス希釈および医薬濃度におけ
る、ウイルスを含有する細胞のパーセントを測定した。
結果を表I a（ｉ）に示す。

それらパーセント値は、各点において、約200細胞を
計数し、そして抗原陽性の細胞のパーセントを計算する
ことにより得られた。

実験I a（ｉ）:M413細胞、HSV−１、螢光抗体検定実験は複製M413細胞で行い、タイタ−テツク（Titer
−Tek）スライド（４ウエル、ガラス）中で開始し、１
日以内に融合性であつたものを実験に使用した。24〜48
時間内に、感染での処理に充分であることを確認するた
めに、細胞密度をチエツクした。貯蔵HSV−１を10−倍
ステツプ（１、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4）で段階希釈し
て2mlの各希釈を提供し:0.2/1.8ml希釈で、約10^-1、10
^-2、10^-3、10^-4、10^-5の全希釈を最終的に生成した。ウ
イルス吸収を37℃で90分間行わせ、その時間の後接種物
を取出し、そしてIPAを表I a（ｊ）に指示する濃度で含
有する溶液で置換した。スライドを３日間インキユベー
トし、そして次の抗血清で染色した:1:20におけるHSV−
１ウイルス・カプシド（capsid）抗原（VCA）に対する
モノクロナール抗体；対照モアズ（mores）IgG、1:20。
結果を表I a（ｊ）に報告する。

比較の目的で、アシクログアノシン（アシクロビル）
を使用して、同様の１連の試験を行つた。それらの結果
を表I a（jb）に示す。

実験I a（ｋ）:M413細胞、CMV、螢光抗体検定MABをHS
Vに置換し、サイトメガロウイルス（CMV）で、実験I a
（ｊ）に記載した方法を行つた。

実験I a（ｌ）:81−66−45細胞に感染させたHIV−１に
対するIPAの試験 81−66−45セルラインは、HTLV−１修飾非産生剤であ
る。実験I a（ａ）の方法に従つて行つた。結果を表I a
（ｌ）に要約する。

実験I a（ｍ）:IPAの安定性試験以下に記載する如き時間を追つてとつたIPAの赤外線
スペクトルを、時間の経過でIPAに生じているかも知れ
ない変化を監視するために使用した。本化合物は、一般
に−10℃で貯蔵した。新らしいIPAのFT−IRデーター
は、表I a（ｍ）の第１欄に示す。同じ化合物の第２のF
T−IRスペクトルを、−10℃で110日間貯蔵した後にと
り、そしてデーターは表I a（ｍ）の第２欄に示す。本
化合物の融点を同時点でとつた。もとの融点は128〜130
℃であり、そして110日後の第２の融点は129〜130℃で
あつた。

表I a（ｍ）から分るように、本化合物のFT−IRスペ
クトルに殆んど変化はなく、そして本化合物の融点に著
しい変化はなかつた。観察された融点は126℃から138℃
までの範囲内である文献の融点とよく一致している。

IPAに対する付加インビトロ試験 HIV−１複製に対する医薬IPAの効果を、急性および持
続的に感染させた細胞で、インビトロ試験した。培養物
上清中のHIV−１の産生は、HIV p24の存在により決定し
た。

方法 H9細胞のインビトロ感染は、先に記載した如くに行つ
た。簡略には、５×10⁶H9細胞をDEAE−デキストラン（2
5μg/ml）で20分間処理した。細胞をついで、無細胞HIV
−１（１×10⁵RT単位）1mlで、37℃において１時間感染
させた。細胞をついで洗滌し、そして各種濃度のIPAの
不存在または存在において12日間インキユベートした。
３〜４日目毎に、媒質を、医薬の適当な濃度を含有する
新たな媒質に取りかえた。感染後の各日に、上清中のHI
V−１の存在を、抗原捕獲試験（the antigen capture t
est）を使用して、HIV−1 p24を測定することにより監
視した〔デユポン（DuPont）（商標）、デラウエア〕。

エイズ患者のリンホサイトからのHIV−１産生は、先
に記載した如くに行つた。簡略には、５×10⁶患者リン
ホサイトを、20％FBS、５％インターロイキン２〔セル
ラー・プロダクツ（Cellar Products）、バツフアロ
ー、ニユーヨーク〕および各種濃度のIPAを含有するRPM
I1640媒質中の５×10⁶PHA−刺激正常PBLと共培養した。
培養を４週間継続した。培養物に、２〜３×10⁶PHA−刺
激正常PBLを１週間に２回供給した。培養媒質を１週間
に２回取り出し、そして抗原捕獲試験によりHIVの存在
を試験した。培養媒質は、医薬を含有しまたは含有しな
い新たな媒質に、３〜４日間隔で置換した。

HIV−１で持続的に感染させたH9細胞中のHIV−１の産
生に対するIPAの効果を試験するために、５×10⁶HIV−
１−感染H9細胞をIPAの不存在または存在においてイン
キユベートした。４〜５日目毎に、総細胞の2/3を取除
き、そして媒質を取りかえた。医薬を含有しまたは含有
しない新たな媒質を加えて、もとの容量にした。指示さ
れた日に、培養上清を取り、そしてRT−活性によりHIV
−１の産生を試験した。上清1ml当り20,000cpmもしくは
それ以上のTCA不溶放射活性は、RT検定において陽性と
考えた。

結果 H9細胞、ＴセルラインのインビトロHIV−１感染に対
するIPAの効果の試験を行つた。医薬はウイルスの１時
間吸収に引続いて加え、そしてインキユベーシヨン期間
を通して培養媒質中に維持した。第13図に示される如
く、IPAは、インビトロHIV−１感染を、用量依存様式で
阻害した。HIV−１産生の５対数阻害以上が、用量3.75
μＭもしくはそれ以上で得られた。

30μＭもしくはそれ以下の濃度におけるIPAは、生存P
HA刺激PBLの生長に対し培養10日目まで顕著な細胞毒性
効果を有しなかつた（表G1）。

HIV−１血清反応陽性患者のリンホサイトからのHIV−
１産生のIPA阻害の研究を行つた。この目的で、エイズ
患者および無症候患者からのリンホサイトを、IPAの存
在または不存在において、PHA刺激PBLと共培養した。第
14図に示す結果は、IPAがHIV−１産生を用量依存様式で
阻害したことを指示している。HIV−1 p24抗原捕獲検定
により決定されるウイルス産生は、IPAにより、3.75μ
Ｍもしくはそれ以上の濃度で、完全に遮断した。対照的
に、HIV−１は、未処理培養物中で、共培養に引続く７
日目に早くも検出された。

HIV−１の複製に対するIPAの効果をまた、HIV−１で
持続的に感染させたH9細胞（H9−HIV−１）で試験し
た。生存細胞数の測定により判定して、細胞毒性は、30
μＭおよびそれ以下の濃度でIPAとインキユベートしたH
9−HIV−１で、30日目まで観察されなかつた。

それらの結果は、IPAが活性な抗HIV−１剤であり、細
胞外ウイルスによるインビトロ感染、そしてまた血清反
応陽性人間のリンホサイトからのHIV−１産生を制圧し
うることを実証する。HIV−１−感染患者からのリンホ
サイトと正常な分裂誘発因子刺激PBLとの共培養の間
に、感染細胞から未感染細胞へのHIV−１の伝幡が細胞
間移転（cell−to−cell transmission）により、そし
てまた細胞外ウイルスを通した感染により生じることが
最近示されてた。AZTは細胞外ウイルスによるHIV−１感
染を阻害するが、HIV−１の細胞間転移に引続くウイル
ス生長に対し効果を有していない。IPAが感染患者のリ
ンホサイトからのHIV−産生を阻害する事実は、この医
薬が細胞外ウイルスによる感染を阻害するばかりでなく
またHIV−１の細胞間転移生じるウイルス産生を遮断す
ることを指示している。

結果の要約およびデーター操作表I a（ａ）、I a（ｂ）、およびI a（ｃ）に示した
選択された結果を、第15図に作図する。それらの結果
は、IPAの任意の可能な毒性効果を考慮しない。第１図
から読んでIC₅₀およびIC₉₀値を決定することができ、そ
して表Ａに示す。

第15図から、IPAが３から30μＭ、そしてそれ以上の
範囲内の濃度でHIV−１およびCAEVの複製を阻害するよ
うであることは明らかである。適当な毒性データーなし
に、各種医薬濃度において治療係数を計算することは不
可能である。にもかかわらず、IC₅₀はウイルスおよびセ
ルラインに依存して約２〜６μＭの間であるとみること
ができ、そしてIC₉₀はそれら実験において３〜30μＭの
間である。

実験I a（ｂ）（表I a（ｂ）（ii））および実験I a
（Ｉ）（表I a（ｉ））からの結果を、表１に要約す
る。

“死滅細胞”を表I a（ｄ）（iii）およびI a（ｄ）
（ｖ）から10日値を使用して取り、そして治療係数を各
医薬濃度について計算した。IPAの結果をまた、第16お
よび17図に図表化する。細胞毒性（破線）は生存細胞パ
ーセントとして計算する。

抗ウイルス有効性の決定に必要とされると同じ時間枠
で採取される毒性データーの有効性は、２つの異つたセ
ルラインについての値の決定を許容した。第16および17
図は、H9および81−66−45細胞を試験したときの、HIV
−１複製の阻害のパーセント（対照力価のパーセントと
して）に対するIPAの細胞毒性（対照細胞生存性のパー
セントとして）を作図することにより得られる曲線を示
す。10日が感染性試験を行うのに必要な長さの時間であ
つたので、未感染細胞を使用する10日間連続暴露で得ら
れた細胞毒性データーを使用した。表I a（ｄ）（ii）
〜I a（ｄ）（ｖ）から明らかなように、毒性は、医薬
を細胞に１日間加え、ついで除去するとき、あるいは細
胞を１または４日間だけ暴露するときにより低い。イン
ビボ暴露時間を模倣することは、特にもしも代謝物が親
化合物に比しより毒性であり、またインビボで容易に明
らかとなるがインビトロではそうでない場合には、困難
である。

第16および17図の解析は、次の如く計算される２つの
セルラインについての阻害値のリスト化を許容する： H9細胞 81−66−45細胞 IC₅₀ ^＊ 6μＭ 6μＭ IC₉₀ ^＊＊ 10μＭ 10μＭ IC₅₀ ^＊＊＊ 50μＭ 40μＭ IC₅₀/ID₅₀ 0.12 0.20 ＊IC₅₀−HIV−１の複製を50％阻害するIPAの濃度。

＊＊IC₉₀−HIV−１の複製を90％阻害するIPAの濃度。

＊＊＊ID₅₀−細胞の50％を殺すIPAの濃度。

化合物I d、I g、I hおよびI lを包含する実験 81−66−45細胞約５×10⁷を含有する溶液約100mlを遠
心分離によりペレツト化し、35ml中に再懸濁し、そして
5ml部分に分割した。７つの5ml部分のうちの６つを再び
遠心分離し、そして形成したペレツトの各々を、未希釈
ウイルスから出発して10倍方式で段階希釈したHIV−１
の5ml中に懸濁した。ウイルスの段階希釈は、ポリブレ
ン10g/mlを含有する完全媒質を使用して行つた。ついで
細胞を時々振盪しつつ、37℃で1.5時間インキユベート
した。部分を再び遠心分離し、そして形成したペレツト
の各々を新たな媒質、RPMI1640および10％FBS35ml中に
懸濁した。それら貯蔵希釈液をついで、試験される化合
物の各々とで使用し、１ウエル当り0.25mlで24ウエルト
レイ上に分配した。

各ウエルに、下記の如き濃度で製造した医薬溶液0.25
mlを加えた。貯蔵医薬溶液の製造においては、水溶性化
合物は、10μＭの溶液を製造するように溶かした。もし
も必要ならば、化合物を溶かすために、エタノールジメ
チルスルホキサイド（DMOS）を使用した。貯蔵医薬溶液
は、下記表に示す如く10倍濃度方式で段階的に希釈し
た。医薬の２倍希釈は、ウイルス溶液0.25mlを既に含有
している各ウエルに各溶液0.25mlを添加して生じた。

ウイルスにより感染されていない細胞懸濁液の第７の
部分は、未感染細胞に対する医薬効果を決定するために
使用した。各ウエルが細胞懸濁液0.25mlを含有するウエ
ルの列の各ウエルに、段階的希釈された細胞懸濁液0.25
mlを加えた。

各水準におけるHIV−１の力価は、10日後に放射螢光
抗体法（RIA）を使用して決定し、そして各医薬の存在
における未感染細胞の生存性を決定した。

上記実験の結果を下記表I d（ｉ）、I g（ｉ）、I h
（ｉ）およびI l（ｉ）に示す。

ヒトＴおよびＢリンホサイト機能に対する化合物I
d、I gおよびI l同族体、ならびに代謝物の効果を研究
するために、実験I a（Ｉ）に略述した方法に従い１連
の実験を行つた。結果は、チヤートI d（ｉ）、I d（i
i）、I g（ｉ）、I g（ii）、I l（ｉ）、I l（ii）
（第18〜23図）に示す。

本発明を好ましい態様に関係して記載したけれども、
特定的に記載されていない付加、改変、置換および削除
が添付の特許請求の範囲に限定した精神および範囲から
逸脱することなしになしうるものであることは、この技
術分野におい熟練している者により認識しうるであろ
う。

【図面の簡単な説明】

第１図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当り
のカウントのグラフであり；第２図は、検定におけるIPAの濃度に対する増殖能力の
増加または減少パーセントのグラフであり；第３図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当り
のカウントのグラフであり；第４図は、検定におけるIPAの濃度に対するＴおよびＢ
リンホサイト増殖の増加または減少のパーセントのグラ
フであり；第５図は、検定におけるIPAの濃度に対するMLC反応性の
増加または減少のパーセントのグラフであり；第６図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当り
のカウントのグラフであり；第７図は、検定におけるIPAの濃度に対する１分間当り
のカウントのグラフであり；第８図は、検定におけるIPAの濃度に対するＴおよびＢ
リンホサイトの機能の増加または減少のパーセントのグ
ラフであり；第９図および第10図は、検定におけるAZTの濃度に対す
るＴリンホサイト増殖のグラフであり；第11図および第12図は、検定におけるddCの濃度に対す
るＴリンホサイト機能のグラフであり；第13図は、H9細胞のインビトロHIV感染に対するIPAの効
果のグラフであり；第14図は、HIV産生に対するIPAの効果のグラフであり
（PHA刺激正常PBLで共培養した患者のリンパ球）；第15図は、検定におけるIPAの濃度に対するウイルス複
製の阻害のグラフであり（HIV−１とCAEVの複製、毒性
なし）；第16図および第17図は、検定におけるIPAの濃度に対す
る細胞毒性およびウイルス阻害のグラフであり（図16は
HIV−１感染81−66−45細胞；図17はHIV−１感染H9細
胞）；第18図は、検定におけるN⁶−アダマンチルアデノシンの
濃度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフ
であり；第19図は、検定におけるN⁶−ベンジルアデノシンの濃度
に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフであ
り；第20図は、検定におけるN⁶−フルフリルアデノシンの濃
度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフで
あり；第21図は、検定におけるN⁶−フルフリルアデノシンの濃
度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフで
あり；第22図は、検定におけるN⁶−ベンジルアデノシンの濃度
に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフであ
り；そして、第23図は、検定におけるN⁶−アダマンチルアデノシンの
濃度に対するヒトＴおよびＢリンホサイト機能のグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｈ 19/213 Ｃ０７Ｈ 19/213 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 19/167 C07H 19/20 A61K 31/7076 A01P 31/12 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次式：［式中、 R₁は、ＨまたはCH₃Sであり、そして R₄は、であり、そして R₅は、CH₃またはClであり、 R₆は、CH₃、CH₂OHまたはClであり、そして R₇は、ＨまたはBrである、あるいは R₁は、Ｈであり、そして R₄は、であり、そして X₁およびX₂は、個々にＨ、メチル、エチル、ヒドロキシ
ル、ハロゲンおよびカルボキシルから選択され、あるい
は R₄は、であり、あるいは R₄は、であり、あるいは R₄は、であり、そして R₈は、であるか、またはR₈は、（CH₂）₇CH₃である、そして R₂は、OHであり、そして R₃は、OH、モノホスフェート、ジホスフェートまたはト
リホスフェートであるか、あるいは R₂およびR₃は結合して、３′,5′−環状モノホスフェー
ト誘導体を形成している］で表わされる化合物を含有す
る、ウイルス感染に対してヒト患者を治療するための医
薬組成物。
【請求項２】上記患者が、ウイルスに感染している、請
求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】上記患者が、レトロウイルスに感染してい
る、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】上記患者が、HIVに感染している、請求項
３に記載の医薬組成物。
【請求項５】上記患者が、エプステイン−バール（Epst
ein−Barr）ウイルス（EBV）に感染している、請求項２
に記載の医薬組成物。
【請求項６】当該化合物が、N⁶−（Δ^２−イソペンテニ
ル）アデノシン（IPA）である、請求項１に記載の医薬
組成物。
【請求項７】当該化合物が、ゼラチンカプセル、錠剤、
糖衣錠剤、シロップ、懸濁液（但し、当該化合物が、N⁶
−（Δ^２−イソペンテニル）アデノシンおよびベンジル
アデノシンである場合を除く）、局所用クリーム、座
剤、医薬として許容される注射溶液、シリコーンディス
ク、ポリマービーズとして提供される、またはシロッ
プ、懸濁液、局所用クリーム、坐剤もしくは医薬として
許容される注射溶液を調製するためのキット中に含有さ
れている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】上記患者に対して有効量のアデノシンデア
ミナーゼインヒビターをさらに含有する、請求項１に記
載の医薬組成物。
【請求項９】上記患者に対して有効量の免疫系ブースタ
ーをさらに含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】エイズウイルスに感染している患者を治
療する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１１】ヘルペスウイルスに感染している患者を
治療する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１２】サイトメガロウイルスに感染している患
者を治療する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１３】次式：［式中、 R₁は、ＨまたはCH₃Sであり、 R₄は、であり、そして R₅は、OHまたはモノホスフェート基であり、 R₆は、CH₃、CH₂OHまたはClであり、そして R₇は、ＨまたはBrであり、そして R₂は、OHまたはCH₃であり、そして R₃は、OH、CH₃、モノホスフェート、ジホスフェートま
たはトリホスフェートであるか、あるいは R₂およびR₃は結合して、３′,5′−環状モノホスフェー
ト誘導体を形成している］で表わされる化合物からなる群から選択される化合物を
含有する、ウイルス感染に対してヒト患者を治療するた
めの医薬組成物。
【請求項１４】単位用量が、0.01mg〜1000mgである、請
求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】静脈投与用の一日薬用量が、0.01mg〜80
mg/体重Kgである、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１６】請求項１に列挙されている化合物からな
る群から選択される化合物を含有し、当該医薬組成物を
投与しながら、投与された患者から採取した血液試料中
のウイルス抗原の量を測定することによって、ウイルス
感染の程度を監視するための医薬組成物。
【請求項１７】次式：［式中、 R₁は、ＨまたはCH₃Sであり、そして R₄は、であり、そして R₅は、CH₃またはClであり、 R₆は、CH₃、CH₂OHまたはClであり、そして R₇は、ＨまたはBrである、あるいは R₁は、Ｈであり、そして R₄は、であり、そして X₁およびX₂は、個々にＨ、メチル、エチル、ヒドロキシ
ル、ハロゲンおよびカルボキシルから選択され、あるい
は R₄は、であり、あるいは R₄は、であり、あるいは R₄は、であり、そして R₈は、であるか、またはR₈は、（CH₂）₇CH₃である、そして R₂は、OHであり、そして R₃は、OH、モノホスフェート、ジホスフェートまたはト
リホスフェートであるか、あるいは R₂およびR₃は結合して、３′,5′−環状モノホスフェー
ト誘導体を形成している］で表わされる化合物（但し、
N⁶−（Δ^２−イソペンテニル）アデノシン（IPA）を除
く）を含有する、ウイルス感染に対してヒトを除く動物
を治療するための医薬組成物。
【請求項１８】ウイルスに感染している動物を治療す
る、請求項17に記載の医薬組成物。
【請求項１９】上記動物が、ヤギ関節炎脳炎ウイルスに
感染しているヤギである、請求項18に記載の医薬組成
物。