JPH05503073A - ウイルス性疾患の治療に有用な6―アミノ―1,2―ベンゾピロン - Google Patents
ウイルス性疾患の治療に有用な6―アミノ―1,2―ベンゾピロンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本出願は、「抗ウィルス薬としてのアミノ−1,2−ベンゾピロンおよびその取
り扱い方法」および「ウィルス性疾患の治療に有用な6−アミノ−1,2−ベン
ゾピラン」という題名の米国特許出願に対応する応用に関する。
本発明は、米国国防総省のAir Force 0ffice of 5cie
ntific Re5earch Grants AFO3F−86−0064
およびAFO3R−89−0231によって援助された研究の一環としてなされ
た。米国政府は本発明にある種の権利を有し得る。
え肚立!見
及艶旦笈団
本発明は、一般に、抗ウィルス薬として6−アミノ−1,2−ベンゾピロンを用
いた、ウィルス性疾患の治療方法に関する。より詳細には、哺乳類宿主における
ウィルスの増殖を抑制および阻害することへの6−アミノ−1,2−ベンゾピロ
ン、その同族体および塩の使用に関する。これらの化合物は、ヒト免疫不全ウィ
ルス、単純ヘルペスウィルスおよびサイトメガロウィルスに対する特に有効な阻
害剤であり、従って、エイズ、ヘルペス性症状の発現、およびサイトメガロウィ
ルス感染症に対する治療に特に有用である。さらに、これらの化合物は、たとえ
あるとしても、非常に低い毒性しか有さない。
到達水準および関連した4示
ウィルス感染は、現代社会における最も深刻な問題の1つとなった。それらの高
度の伝染性および宿主生物内の迅速な再生サイクルは、非常に有毒なデオキシリ
ボヌクレオチド相同体以外は利用できる有効な治療が本質的にないことと合わせ
て、ウィルスをヒト個体群が日常レベルで遭遇するやつがいな健康上の障害とな
るものにしている。
ウィルスは、タンパク質の外層膜で覆われた中心コア核酸から本質的に成る、細
胞内寄生性の分子の粒子である。自己の再生について、ウィルスは宿主に完全に
依存している。
数百種の異なるウィルスがヒトに感染するものとして知られている。その広汎な
流行のために、ウィルス性疾患は重要な医療上および公共の健康上の問題を生じ
る。これらの中には、全てのウィルス性疾患のうちで最も一般的な、これ単独で
米国だけで毎年十億もの罹患の原因となるインフルエンザ、または、はしか、水
痘、狂犬病、ヘルペスウィルス性疾患、サイトメガロウィルスおよびエイズの原
因となるヒト免疫不全ウィルスのような高度な感染性を有するウィルス性疾患が
包含される。これらの全てのウィルスは、ヒト自身によって、主に呼吸性のおよ
び内臓の排出物を介して、または接触を介して速やかに広がる。さらに、ある種
のウィルスは、いずれの治療に対しても非常に耐性があり、そしである種のウィ
ルス、例えば、単純ヘルペスウィルスまたはサイトメガロウィルスは、体内に一
度入れば、抵抗性が弱まるまで休眠状態のままで永久に残存し得る。その池の、
例えば、ヒト免疫不全ウィルスは、はぼ常に致命的である。
ウィルス性疾患に対する簡単な治療はない。それらは抗生物質に感受性を示さず
、宿主におけるウィルスの複製を抑制する化学療法以外にウィルス性疾患の有効
な治療はない。測e Merck Manual、170 (1982)。これ
らの化学薬剤の例としては、単純ヘルペス角膜炎の治療に有用なイドクスウリジ
ン(IDU)、およびインフルエンザAウィルスに対して活性のあるメチサゾン
が挙げられる。他の周知のウィルス複製のインヒビターとしては、アシクロビル
、リバビリン、ビダラビン、ガンシクロビル、アデニンアラビノシド(ARA−
A)およびAZTが挙げられる。しかし、これら、および他のウィルス複製のイ
ンヒビターは、細胞毒性、肝毒性、神経毒性、腎毒性であることが知られており
、そして催奇形性効果を宵することが示された。
1/1rus Diseases、l−6(1978)、Crown Publ
ishers、ニューヨーク。
このように、ウィルス性の疾患に有効で、しかも無毒性の治療が利用可能となる
ことが非常に望まれている。
ヒト免疫不全ウィルス([IIV)感染は、現在世界中で最も緊急を要する健康
上の危機の一つを構成する。後天性免疫不全症候群(AIDS)として知られて
いる旧V感染症は、弱まった免疫抵抗性のために、はぼ常に致死的であり、それ
らは日和見感染、悪性腫瘍および神経障害を急速に随伴して早期の死を導く。
HIVという用語は、周知のヒトTリンパ球性ウィルス■型(HTLV−I I
+)、リンパ節疾患関連ウィルス(lymphadenopathy−asso
ciated virus)(LAY)およびレトロウィルス(ARV)という
名称で知られているレトロウィルスの一部を包含する。
レトロウィルスは、細胞質中のウィルス性RNAをDNAに変換し得る逆転写酵
素と呼ばれる酵素を含有する。それは染色体外の部位で複製され、または細胞核
中に移行して宿主細胞DNAの一部となる。これらの組み込まれたウィルスの遺
伝子は正常な細胞の遺伝子と共に複製され、そして初めに感染した細胞の全ての
後代はウィルスの遺伝子を含有する。数種のレトロウィルスのウィルスの遺伝子
の発現は、その細胞を癌に変換する腫瘍原性であり得るか、または正常の細胞の
機能を改変し得るかまたは細胞死を生じ得る他の病的効果を有し得る。
エイズ患者は、リンパ節腫脹、体重減少、間欠性発熱、倦怠感、傾眠、慢性下痢
、リンパ球減少、または貧血のような広範囲の急性または慢性の臨床上の問題を
、上記のあらゆる徴候に全般的な日和見感染症、例えばそのいくつかを挙げると
、ニューモンスティスカリニ肺炎、カンジダ症、ミツバクテリア感染症、サイト
メガロウィルスまたは単純ヘルペスウィルス感染症、または例えばカボーノ肉腫
および種々のリンパ腫のような二次的癌が組み合わされて成る完全なエイズ症候
群とともに経験する。これらの日和見の二次的感染症は、エイズ患者において9
0%より高い致死率をもたらす。
日和見感染症、新生物および池の合併症の治療以外は、エイズに対する有効な治
療はない。入手可能な細胞増殖抑制性の(AZT)および抗ウイルス性の(アシ
クロビル)薬剤は、はとんど極めて毒性が高く、従って、重篤な副作用をもたら
す。
それが致死的であるために、およびエイズ患者の治療がないために、有効な抗旧
V剤またはワクチンの開発に莫大な努力がなされている。目下研究されている全
ての薬剤またはワクチンの内で最も有望であるのは、ウィルスの増殖酵素、逆転
写酵素を何らかのかたちで抑制し得る、抗ウィルス薬であるように思われる。T
he Merck Manual、第1SL288(19g?)。
従って、HIVの増殖に影響を及ぼす、有効で、しかも無毒性の抗ウィルス薬を
提供することは、非常に重要であり、何千人ものエイズの犠牲者の生命を救う方
法となる。
単純ヘルペスウィルス1型および2型も同様に、広範囲に広がる感染症である。
それらは日和見感染の一つとしてエイズ患者において発症し得る。I(SV−2
は子宮癌の発生に関連付けられてきた。
単純ヘルペス(熱性庖疹およびカゼの華とも呼ばれる)は、最も罹患率の高いウ
ィルス性感染症の一つである。この感染をおこす病原因子は、比較的大きな単純
ヘルペスウィルスであるヘルペスウィルスホミニス(herpesvirus
hominis)(HVH)である。2種のHVH株がある。1型株(HSV−
1)は、通常、唇に発症するヘルペス角膜炎を、およびヘルペス角膜炎、すなわ
ち、角膜の炎症を引き起こす。2型は、通常、生殖器またはその付近に発症し、
主としてヘルペスのびらんまたは傷に直接接触することによって一般に伝達され
る。
口部(HSV−1)および生殖器(HSV−2>感染の推定の頻度およびその発
症は、1型の初感染の症例が米国だけで1年間当り約50万例であり、そして再
発症例が1年間当り9千8百万例である。生殖器感染のHSV−2の症例は、米
国において1年間当り初感染の陰部ヘルペスの症例は約500.000例てあり
、そして再発症例は3百万例〜9百万例である。Livin With Her
es、1−11゜(1983)、Doubleday and Compan
y、ニューヨーク。
単純ヘルペスウィルスは、非常に感染力が強く、接触によって迅速におよび容易
に伝達され得る。この極めて痛いウィルス感染に対する特別の治療法はない。コ
ルチコステロイドは、早期に与えられるなら、重篤な患者において痛みを和らげ
得る。アスピリンおよび池の抗炎症剤または抗ウィルス薬は、全身投与により痛
みを緩和する。しかし、これらの薬剤は、前記で論ぜられたのと同様の望ましく
ない副作用を有する。H3V感染症の治療は、主として、例えば、高度に細胞毒
性のIDUおよびトリフルリジン(TPT)、ARA−A、およびウィルスの複
製の半時異的酵素インヒビターであるアシクロビルまたはブロモビニルチオキシ
ウリジンのような抗ウィルス薬を全身投与することによる。
これらの薬剤の投与の第一の経路は全身投与であるので、このような治療には重
篤な副作用が伴うことが示された。さらに、これらの薬剤は、単純ヘルペスウィ
ルスの複製の選択的インヒビターではなく、正常細胞の複製にもまた影響を及ぼ
す。従って、知覚神経節において休眠している全てのヘルペスウィルスを捜し出
し、破壊するのに十分な多量で用いる場合、これらの化合物はまた、ウィルスが
増殖する宿主細胞中の正常なりNAに対してもを高度に破壊的であり得る。これ
はあまり望ましくない影響である。なぜなら、正常細胞の複製にも影響を及ぼす
からである。
従って、HSV感染症の有効な無毒性の治療を手に入れることが有利である。
サイトメガロウィルス(CMV)は、時折、HIVの危険な共感染(coinf
ection)である。ヒトCMVは、ヒトに潜伏し続ける傾向を有する高度に
感染性のある病原体の小群である。CMVは成人個体群において非常に一般的で
あり、成人の90%程度がCMV感染に曝され、感染している(experie
nced)o CMVは通常、血液、リンパ液、唾液、尿、ふん便、乳汁などの
ような体液中に存在する。先天性のCM’/感染症は、流産、死産、出生後の出
血死、貧血または重篤な肝臓障害またはCNS障害を引き起こす。成人において
は、cyvg染症は、無症候であり得るだけでな(、肝炎、異型リンパ球増加症
または失明をももたらし得る。エイズ患者に起こったCMS感染症は、CMVが
肺、胃腸または腎臓の合併症をもたらし得、特に危険である。
CM’/に対する特別の治療法はない。HSVとは対照的に、CMVは強力で非
常に毒性の強い抗ウィルス薬であるアシクロビルに対して、および他の周知の抗
ウィルス薬に対して耐性である。
従って、CMV感染症を有効に阻害する薬物を手に入れることが非常に有利であ
る。
大多数のウィルス感染症の現存の化学療法は、このように、非常に有毒な薬剤お
よび抗ウィルス薬に主として制限される。
それゆえに、本発明の第一の目的は、毒性の無い、高度に有効な抗ウィルス薬を
提供することである。6−アミノ−1,2−ベンゾピロン(6−ARP)は、こ
のような基本型の抗ウィルス薬の一部であると考えられる。
この薬剤(6−ABP)は、細胞培養物において、およびヒトの血液中において
、著しく毒性が低いが、しかし高度に有効なウィルス抑制の薬剤であることが今
回見いだされた。その抗ウイルス性スペクトルは、最も危険なウィルス性感染症
、例えば旧■、CMVおよびHSVによって引き起こされる上記の感染症の治療
に特に有用であると考えられる。しかし、それは他のウィルス性疾患の治療にお
いても等しく有効であり得る。
6−アミ/ベンゾピロンは既知であり、J、Pharm、Soc、Ja 、、4
98:615−628(1923)に記載されている。しかし、この物質の医療
用途についてはまれにしか報告されておらず、しかも、このテストは鎮静効果お
よび催眠効果について行われたものであった(j、T’hと1士エユ姐an、
73:351(1953)および同誌、74:271(1954))。降熱作用
が研究されたが、6−アミ7基は降熱効果を低減することが見いだされたYak
u aku Zasshi、78:491(1958)。数種の解熱、催眠、降
血圧および抗アドレナリン性の作用が報告されたく同誌、83:1124(19
63))。
関連の分子、1.2−ベンゾピロン(クマリン)は、新生物細胞中に存在するD
NA結合核タンパクである、アデノ/フジホスホリボーストランスフェラーゼ(
ADPRT)の抑制リガンドである7))。
6−ABPがADPRTに、触媒的に有効なりNA末端に結合する部位と同じ部
位において特異的に結合することが、さらなる研究によって示された。 従って
、6−ADPとDNAとは、ADPRTにおける同じ部位に対して競合する。こ
れらの結果は、FEBS Lett、、212ニア3(1987)に開示されて
いる。ここでは、ADPRTの合成リガンドを用いてADPRTの生物学的役割
が広く研究されており、DNAの増殖を、特に腫瘍化細胞において、抑制するこ
とが示された。ウィルスの複製に対するこれらのリガンドの強力な抗ウイルス効
果が今回研究され、それが本発明の課題である。
本発明の第一の目的は、単に限定された生物学上の有用性のみを有するものとし
て以前から知られている6−ABPが、特異的で、選択的で、強力な、そして無
毒性の抗ウィルス薬であるということの発見にある。H+vg染ヒトリンパ芽球
を包含する種々のウィルス感染した培養組織においてこれらの化合物を試験する
ことによって、6−ABPが旧■、HSVおよびCMV複製の抑制(こ特に有用
であることが示された。
■
本発明の一つの局面は、次式の化合物または薬学的に許容し得るそれらの塩の治
療上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類におけるウィルス感染
症を治療するための方法に関する:
ここで、R1、R2、R3、R4またはR5は、それぞれ独立して、水素、ヒド
ロキシ、アミノ、アルキル、アルコキ/、シクロアルキルか、またはアルキル、
アルコキン、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよいフェニル(ph
enol>から選択される。
本発明の他の局面は、次式の化合物または薬学的に許容し得るそれらの塩の治療
上有効な量を哺乳類に投与することを包含する、哺乳類中でのウィルスの再生を
阻害または抑制するための方法に関する:
ここで、R1% R2、R3、R4またはR5は、それぞれ独立して、水素、ヒ
ドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルか、またはアルキル
、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよいフェニル(p
henol)から選択される。
本発明のもう一つの局面は、次式を有する抗ウィルス薬または薬学的に許容し得
るそれらの塩に関する:ここで、R1、R2、R3、R4またはR5は、それぞ
れ独立して、水素、ヒドロキシ、アミ/、アルキル、アルコキシ、シクロアルキ
ルか、またはアルキル、アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されてい
てもよいフェニル(phenol>から選択されるが、但し、R1、R2、R3
、R4およびR5は同時に水素ではあり得ないか、または同時にR1が非置換の
フェニルではあり得ない。
本発明のさらにもう一方の局面は、次式の化合物または薬学的に許容し得るそれ
らの塩の治療上有効な量を哺乳類に投与することによる、HIVSHSVまたは
CMVによって引き起こされるウィルス性の疾患の治療方法に関する:ここで、
R】、R2、R3、R4またはR5は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、
アミン、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルか、またはアルキル、アルコキ
シ、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよいフェニル(phenol
)から選択される。
区五!Jソ1勤疲肌
図1は、前処理された細胞培養物中のHSV増殖に対する6−ABPの抑制効果
を示す。ここで、図IAは、HSV−1のF株のウィルス増殖の抑制%を、外に
加えた薬物濃度の関数として表し、そして図IBは、HSV−2のG株に対する
同様の抑制効果の%を表す。
図2は、I(SV−1のF株く図2A)の感染時、および感染4時間後に6−A
BPで処置した効果およびHSV−2のG株(図2B)の、ウィルス接触の0時
間後または4時間後にこの薬物をウィルスに加えたときの効果を比較している。
図3は、7 ’) 0ファージ(U937細胞)における、HIV17)HSV
−IE−110との同時トランスフェクンヨンによる旧V活性化に対する6−A
BPの効果を示す。
図4は、マクロファージ(0937細胞)における、1(IVと低力価のHSV
−IEとの同時トラノスフェクンヨンによるHIV活性化に対する6−ABPの
効果を例示している。
図5は、HIV(TR−CAT7 ノセイによッテ測定された、)IsI/また
はCMVによる旧Vの活性化に対する6−ABPの阻害効果を示す。
図6は、旧■伝幡の時間経過に対する、細胞外に添加された6−ABPの効果を
示す。
図7は、AA−2細胞における旧V増殖の抑制に対する、6−ARPの効果を示
す。
図8は、HIV複製に対する6−ABPの効果を、引き続いてp24形成の慣例
の分析を行って示したものである。
図9は、MT−2細胞におけるHIV再生およびシンシチウム形成に対する抑制
効果を示す。
図10は、エイズ患者由来のヒトリンパ芽球における旧V増殖に対する6−AB
Pの抑制効果を示す。
図11は、6−ABPによる旧■複製の選択的な抑制を示す。
図12は、抗ADPRT抗体によッTADPRTと共沈する、H3vタンパクR
R+およびIc5P 11/12のSDS’ゲルを示す。
本発Bの詳 な8B
友致
ここでは以下のように用いられる:
r 6−ABPJとは、クマリン炭素の3位、4位、5位、7位および8位にそ
れぞれ相当するRI% R2、R3、R4またはR5が、水素、ヒドロキシ、ア
ミン、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルあるいは、アルキル、アルコキシ
、ヒドロキシまたはハロゲンで置換されていてもよいフェニルで置換されている
かまたは置換されていない式(1)の6−アミノ−1,2−ベンゾピロンをいう
。
「薬学的に許容し得る酸付加塩」とは、°遊離塩基の生物学的効果および特性を
維持する、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素L 硫酸、硝酸、す/酸、メタンス
ルホン酸、エタンスルホン酸、p4ルエンスルホ/酸、す1ノチル酸などの塩を
1.)う。
rADPRTJとは、ADP−リボースの重合を触媒する真核生物の特異的なり
NA結合核タンノシクであり、ボ!J (ADP−!Jボース)ポリメラーゼ、
(EC2,4,99)としても知られるアデノシンジホスホリホーストランスフ
エラーゼを(Xう。
「アルキル」とは、飽和または不飽和の分枝鎖また(ま直鎖の炭化水素基をいう
。典型的なアルキルエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソフ゛チル、
第三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなど力量挙1デられる。
「アルコキシ」とは、−0−アルキル
アルコキシ基としては、メトキン、エトキン、プロポキシ、ブトキンおよびペン
トキンなどが挙げられる。
「シクロアルキル」とは、3〜8個の炭素原子を含有する飽和の単環式炭化水素
基、例えば、ンクロブロビル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル
、シクロヘプチルおよび/クロオクチルをいう。
「置換フェニル」とは、アルキル
ノまたは7%Oゲノてなる群から選択される置換基で一つまたは二つ置換された
全ての可能なフェニル基の異性体をし)う。
6−アミノベンゾピロンの− 1
本発明のアミノベンゾピロンは、次の一般式を有する化合物である:
ここで、R+, R2、R3、R4またはR5は、独立して、アルキル、アルコ
キシ、ヒドロキシまたはハロゲンで任意に置換され得る、水素、ヒドロキシ、ア
ミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキルまたはフェニルである。
この群の化合物の内、2種の化合物、すなわち、6−アミノ−1.2−ベンゾピ
ロンおよび6−アミノ−3−フェニル−1.2−ベンゾピロンだけは、以前、L
胆肛り鋭しハ1,4911:615(1923)および■狐1’工む巳摺り盈す
1拍,、 71 :1010(1968>にそれぞれ記載されていた。この化合
物の数種の医療または薬理学上の使用は、上で引用された技術中に述べられた。
抗腫瘍形成の活性については、1988年2月10日提出の米国特許出願第07
/154, 853号の「6−アミノ−1.2−ベンゾピロン抗腫瘍形成および
その方法」に開示されており、それはここで援用されている。しかし、本発明以
前には、抗ウィルス活性については開示されていなかった。
Aldrichから入手した、6−ニトロクマリンの酢酸中の鉄粉による自動還
元、次いで、濾過、酢酸のロータリー二バポレーション、エーテル中への抽出お
よびエタノールからの再結晶による、6−ARPの合成については、FEBS
Letters、212ニア3(1987)に記載されており、合成のよりよい
様式は、実施例1に記載されている。
R1、R2、R3、R4またはR5が、水素、ヒドロキシ、アミン、アルキル、
アルコキシ、ンクロアルキルまたはフェニルである6−ARPの調製の一般的な
反応を、反応スキーム1に示す。
多くの置換した化合物は、市販の適当に置換したらm;トロ化合物(A)を用い
て、同様のまたは類似の方法で調製され得る。
置換した前駆物質が入手可能でない他の化合物は、以下に記載のような池の反応
によって合成されなければならない。
6−ABPノフル牛ル、1導体は、典型的に、市販のアルキル化シた1、2−ベ
ンゾピロンから調4されるか、または入手可能な化学文献に記載のように調製さ
れる。典型的に、例えば、Ablrichから市販されている7−メチル−1,
2−ペンツピロン、および証皿l臣is、 599(1975)に従って調製し
た合成3−メチル−1,2−ベンゾピロン、および同誌、464(1977)に
よる4−メチル−1,1,2−ベンゾピロンは、氷酢酸中で硝酸を用いて硝酸化
しくIndian J。
Chem、 、7:49(1969))、E tl、chem、、20:453
(1977)に記載されているように主に6−二トロ誘導体が得られ、そしてそ
れを、J、Heteroc lie Chem、、23:87(1’J86)に
記載の方法を用いて水性メタノール中でPd(C)触媒と共に水素化ホウ素ナト
リウムを用いて6−アミン誘導体に還元する。他のアルキル化化合物も同様の方
法で調製される。
6−ABPの/クロアルキル誘導体は一例として、次のような方法、針部上1皿
、474(1977>の4−メチル−1−1,2−ベンゾピロンの合成における
メチル基をンクロヘキシル基に置き換えて、調製される。得られた4−ンクロへ
キンルー1.2−ベンゾピロンは、酸を用いて、好ましくは、氷酢酸中の硝酸を
用いて6位を硝酸化し、そして次に、水性メタノール中でPd(C)触媒と共に
水素化ホウ素ナトリウムを用い、対応する6−アミン化合物に還元する。他の7
クロアルキル類も同様の方法で調製される。
6−ABPのアリール誘導体は、Ko o Ka aku Zasshi、71
:110(1968)およびChem、Abstr、、70:30023(19
69)に記載の方法を用いて調製される。例としては、6−アミ/−3−フェニ
ル−1,2−ベンゾピロンの合成の、フェニル基をp−)リル基に置換し、6−
アミノ−3−p−トリル−1−2ベンゾピロンを得る。他のアリール誘導体も同
じまたは類似の方法で調製される。
6−ARPのヒドロキシ誘導体は、典型的に、4−ヒドロ半ノーおよび7−ヒド
ロキシ−1,2−ベンゾピロン(A ldr 1ch)のような市販の合成前駆
物質から、Indian J、Chem、、7:49(1969)に従って氷酢
酸中で硝酸を用い、これらの前駆物質を硝酸化することによって調製し、対応す
る6−ニトロ誘導体を得、それを次いで、水性メタノール中でPd(C)触媒と
共に水素化ホウ素ナトリウムによって、4−ヒドロキシ−および7−ヒトロキシ
ー6−アミノー1.2−ベンゾピロンに還元する。他のヒドロキシル化した6−
ABPも同様の方法で調製される。
アルコキシ誘導体は、典型的に、上記のヒドロキシ誘導体から容易に調製される
。典型的には、上述の4−ヒドロキシ−および7−ヒドロキシ−1,2−ベンゾ
ピロンの6−ニトロ誘導体をシ1thesis、 144(19117>に従っ
てジメチル硫酸で処理し、そのヒドロ牛ン基をメト牛シ基に変換し、そして次い
で、得られた化合物を水性メタノール中でPd(C)触媒と共に水素化ホウ素ナ
トリウムを用いて4−メトキシ−および7−メドキシー6−アミノー1,2−ベ
ンゾピロンに還元する。他のアルコキシ化合物も同じまたは類似の方法で調製さ
れる。
6−ABPのアミノ誘導体は、例えば、R1−R5にさらに(単数あるいは複数
の)アミノ置換基を有する前駆物質を用いることによって調製される。その前駆
物質は、例えば、Arch、 Pharm=、296:355(1963>に従
って調製される合成3−アミ/−6−ニトロ−1,2−ベンゾピロンであり、次
いて、それを水性メタノール中でPd(C)触媒と共に水素化ホウ素ナトリウム
を用いて3.6−ジアミツー1.2−ベンゾピロンに還元する。他のンアミノ誘
導体またはトリアミ/誘導体も同じ方法で調製される。
本発明の最も好ましい化合物は、6−アミノ−1,2−ベンゾピロン(6−AB
P)である。しかし、6位のアミン置換基を1.2−ベンゾピロン(クマリン)
の3位、4位、5位、7位および8位の親水性および疎水性の置換基R7、R2
、R3、R4およびR5と組み合わせると、6−ABFのこれらの誘導体に同様
のまたはより優れた生物学的活性が付与され、これらも、本発明の範囲内である
と意図されている。
L1工土五匿並
6−’ABP化合物はウィルスのDNA複製を非常に特異的にそして有効に抑制
する、強力でそして無毒性のプロドラッグであることが見い出された。実施例2
〜8で要約された結果は、高度な特異的なメカニズムの存在を示唆しており、そ
れによって6−ABPはウィルスのDNA複製を抑制する。6−ABPは、pH
7,2〜7゜4において、はとんどの哺乳類の細胞に、生理学的に限られた程度
まで浸透する「プロドラッグ」である。この細胞内で、6−ARPは、6位のア
ミ7基が速やかに酸化され、反応性の種類である6−ニトロン−1,2−ベンゾ
ピロン(6−NBP)となる。
細胞内で、この薬物6−ABPは、速やかに6−ニトロソ−1,2−ベンゾピロ
ンに酸化される。6〜NBPは、酵素ADPRTの亜鉛フィンガーに特異的にそ
して高いアフィニティーで結合し、そして亜鉛フィンガーのSH基を酸化するこ
とによって−5−3−基にし、それによって、ADPRTから亜鉛を除去または
排除する。亜鉛の排除は、ADPRTを代謝的に不活性化し、そしてそれを選択
的なりNA結合タンパク質に変換する。次に、このタンパク質はDNA構造に結
合し、DNA複製を阻害する。ADPRTは6−ABP部位を排他的に有するの
で、従ってウィルスの複製および腫瘍性の複製の非常に選択的なインヒビターと
なる。
6−ABP酸化生成物である6−NBPの高い反応性は、細胞のグルタチオンに
よる迅速な反応を引き起こし、その結果、それは還元されて6−ABPに戻され
る。このことにより、この薬物には非特異的な細胞毒性がないこと、およびそれ
固有のADPRT部位に特異的に結合することによる強い効力があることが説明
される。6−ABPが結合する部位は、ADPRTに対してのみ存在するので、
6−ARPによって活性化または抑制される他の酵素はなく、従って、6−AR
P薬物は完全に無毒性である。毒性の研究は、実施例8に記載されている。
6−ARPの明らかに低い毒性は、グルタチオンによる還元で細胞内に生じた6
−NPB誘導体がヒドロキシルアミンに、そして最終的には6−ABPに還元さ
れる急速な代謝によって、さらに説明され得る。この無駄な還元−酸化サイクル
は、肝細胞においては強いか、樟的細胞、例えば、リンパ細胞においては非常に
弱い。
6−ABPは、HIV、 ll5VおよびC’M V ノ特異的な、強力で、そ
して無毒性のインヒビターであることが見い出された。しかし、6−ABPは、
特異的なレトロウィルスのインヒビターではない。
なぜなら、それは、HSVおよび他の非レトロウィルス性のウィルスにおいても
また、有効であるからである。その抗ウイルス特異性は、特異的に結合する部位
および組み込みステップの抑制、およびある種のウィルスにおける亜鉛フィンガ
ー含有タンパク質に関する。従って、ADPRTの関与するDNAによるいかな
るウィルスの増殖も、6−ABPで抑制される。
6−ABP化合物の抗ウィルス活性は、独立してヒト免疫不全ウィルス、単純ヘ
ルペスウィルスおよびサイトメガロウィルスに感染した細胞培養物、および2種
のウィルスでトランスフェクトされた数種の細胞培養物において試験された。実
際の実験過程は実施例2〜8に記載されており、その結果は図1〜12に示され
ている。
HEp−2細胞培養物において増殖するHSVに対する6−ARP化合物の抑制
効果は、液体を重層する条件下でプラークアッセイを用いてウィルス力価測定に
より決定された。この薬物の種々の濃度での効果および薬物に曝す条件を調べる
以下の実験の結果は、図1〜5に要約されている。
図IAは、細胞に曝した薬物6−ABPの効果を示している。この細胞は、予め
この薬物に24時間曝され、細胞の内側の薬物の1度が外側の薬物のxiによっ
て平衡化されるのに十分な時間保った。図IAにおける曲線は、外側の薬物の濃
度の関数として増殖するHSV−1の抑制%を例示している。この曲線かられか
るように、2mM1J1度における6−ABPは、HSV−1のF株の増殖を5
0%を越えて抑制し得、一方、SmMIA度では、HSV−2のG株の約80%
を抑制する(図IB)。
曲線IAおよびIBかられかるように、24時間この薬物で前処理された1IE
p−2細胞において、増殖の50%抑制は、HSV−1のF株において2mMの
6−ABP濃度で達成された。これに対して、0.2mMの6−ABPで約45
%の抑制が達成され、そしてこの薬物1mMで約90%の抑制が達成され、そし
て1〜10mMの間の投与量でHSV−2のG株の増殖の90〜97%の抑制が
達成されるというように、5−ARPの処置に対するHSV−2のG株の感受性
はさらに強い。
上記の結果は、H3Vウィルスに対する6−ARP薬物の高い効能を示し、その
効能は、ウィルスの型(HSV−1またはHSV−2)によって変化する。
図2Aおよび2Bで示されている実験において、HSV−1(F)および)IS
V−2(G)で感染させた細胞培養物にこの薬物を加えた時と感染時に加えた時
との間で比較が行われた。ウィルス感染時(0時間)およびウィルス複製を導く
初期のウィルスの機能が既に発現している感染4時間後に、細胞培養物に1mM
、5mMおよびlomMItの薬物6−ARPを加えた。図2Aおよび2Bから
れかるように、0時間に薬物に曝す場合にいく分高い薬物の効果が得られるが、
薬物に曝すこれら2種の様式の間には本質的には違いはなかった。HSV−2(
G)に対するこの薬物の明らかに大きな効果は、図IAおよびIBに見られる結
果と一致する。
図3は、マクロファージ(0937細胞)中における旧VのHSV−IE 11
0との同時トランスフェクトによる旧Vの活性化に対する、薬物6−ABPの効
果を示す。このアプローチを使用する理由および/フンチア形成アッセイは実施
例3において記載されており、結果は表2に示されている。旧■増殖の活性化を
抑制する6−ARPの能力を決定するために、2重複の細胞培養物を使用した。
実験1および2において、U937細胞をH3V遺伝子IE−110またはCM
V遺伝子IEでトランスフェクトし、そして感染させたHIVの増殖は、IE−
110で同時トランスフェクトされたU937細胞では4日間て2,500 S
FU/mlまでおよび2,500 SFU/mlを越える量までに達し、そして
、CMV IEで同時トランスフェクションされたU937に対して4〜8日間
で約1200から1400 SFU/mlに達したことが示されている。実験3
において、1(SV−IE−110でトランスフェクトされ、モして旧Vに感染
させたU937細胞は3mMの6−ABPで処理された。この組み合せでは、こ
の薬物処理は、実験1におけるフントロールのプラスミドpBR322でトラン
スフェクトされた細胞においても見られる(擬似のトランスフェクション) 1
ml当り250〜300 SFUのバックグラウンドレベルにまで、HIV活性
化を減じ得た。活性化するHSVまたはC1+u/ DNAが存在しないとき、
薬物のみでは(実験5および6)旧■の増殖に効果はない。6種の実験の結果を
図3に示す。アクチベーターなしでは、HIVの増殖はほとんどないかまたは全
くないということは、明らかである。この薬物は旧VのIE−110(HSV)
に活性化された増殖を大いに抑えるということもまた、明らかである。CMV−
IHによる活性化もまた、この薬物によって抑制される。
HIVの増殖に対する薬物の直接の効果を示すかどうかを評価するために、比較
的低いウィルス価が検知されるように、ウィルス力価(SFUによる)の状態を
改善した以外は図3において示されている実験を繰り返した。図4において示さ
れているこれらの結果は、このアlセイ条件がアクチベーターの存在しない状態
での旧■のみの増殖に対する薬物の効果を検知することを可能にすること以外は
、図3に示された結果と本質的に同一である。HIVの増殖に対して重大な効果
が存在し、このことは、この薬物の作用のメカニズムには、活性化する(HSV
またはCMV)および標的(l(IV DNA)の両方が含まれるらしいことを
示す。
図3および4に示される全ての実験で、細胞は3mMの薬物に24時間曝された
。しかし、HSVの場合と同様に、この薬物の感染後の添加は、細胞が感染前に
処置された場合と同様に有効であった。この時、この薬物の処置から、この薬物
によってIE−110の発現およびHIV DNAが同時に抑制され得ることが
示唆される。
HIV−LTR−CATアッセイによって測定された、旧■複製に対するこの薬
物の阻害効果を図5に示す。図5に示されるように、IE−110オヨびCMV
−IE DNA(7)4度を03〜lμgの範囲で変化サセた。IE−110i
:よるHIV−LTR−CATノ最大活性化は、0.1μgのJI度で起こり、
そごでは、344倍の活性化が観察された。この活性化は、6−ABP 2mM
で処理することにより、0.4〜0.9倍の活性化に弱められた。同様に、CM
V IE(0,1μg)による活性化は、6−ABPがない状態で15(@であ
り、2mMの6−ABPの存在下で1倍に減少する。
細胞内の薬物濃度および薬物輸送のメカニズムの両方を決定することは重要であ
る。12種の異なる細胞系を薬物の種々の濃度を加えて種々の時間インキュベー
トし、そして細胞内の薬物濃度を、[53旧で標識した6−ABPを用いて分析
した。このテストを12種の異なる確立された細胞系において行ったとき、6−
ARPの輸送は、薬物の/J1度およびインキュベーシヨンの時間に依存するこ
と、そして、18〜24時間で、細胞外に適用される薬物濃度の10〜20%で
プラトーに達するということがわかった。従って、細胞膜を介する重要な輸送調
節がある。
1mMの細胞外投与を行うと、細胞内の薬物の濃度は、細胞系に依存して、65
〜200μMの間で変化したが、ADPRTに対する6−ABPのKiを常に越
えていた(195の47μM)。このことは、ADPRT部位の特異的な結合お
よび飽和が実際に起こることを示す。
ヒト免疫不全ウィルス(HIV)の発現は、5cience、 108:117
(1948):および同誌、230:850(1986)に記載されているよう
に、ホルボールエステルおよびレクチンによるインデューサーT細胞の活性化後
に増加する。この刺激は、HIVエンハンサ−の2回繰り返される1l−bp
kBのモチーフに結合する、転写を調節する因子であるNF−kBによって仲介
される(Nature、 326.711(1987)。NF−kBの結合を排
除するこの部位内の変異はまた、活性化したT細胞における旧■遺伝子の発現の
増加を消し去る。しかし、HIVは、その中で低レベルで複製を示すマクロファ
ージ中で生き残る。
エイズ疾患は、多量の旧■の複製を伴う。このような高度な複製は、数種の活性
化因子かこれらの細胞における旧■活性化に含まれることを示唆する。これらの
観察は5cience、 240:80、 (1988)および■胆包■、 1
67 :299. (1988)において発表された。
霊長類のウィルス(HSVおよびCMVを包含する)由来のDNAは、クロラム
フェニフールアセチルトランスフエラーセ(CAT) 遺伝子に連結された旧V
プロモーターを含むプラスミドと共に線維芽細胞中に同時トランスフェクトした
時、)IIV発現を誘発する。
roe、 Nat 1. Acad、 Sci、 、83 :9759 (19
86)。)ISVは、他の遺伝子の転写を活性化する数種の遺伝子産物をコード
する。−組のI(Svトランスアクチベーターは、感染後、ただちに合成されて
、極初期遺伝子(immediate−early gene)産物を生じるO
これらには、HI V−LTRca tを活性化するトランス−活性化遺伝子
(trans−activating genes)が包含され、その活性化は
明らかにNF−kB活性の誘導に関与している。CMVもまた旧■の発現を活性
化する。これはCMV IE遺伝子によって媒介される。しかし、NF−kBの
活性は必要としないようである。
実験は、確立されている細胞培養における、HIVに対する6−ABPの直接の
効果を決定するために行われた。この結果を図6および7、および表4に示す。
これらの結果は、MOLT II+細胞の上演をウィルスの供給源として培養中
のAA−2およびMT2細胞に対して用いた、MOLTI11細胞の高度に病毒
性な旧V株の、直接の広幅に対する6−ABPの効果を示す。
種々のDNAによる潜伏性の旧Vの活性化および6−ABPによるその予防が上
記で示されたが、一方、以下の実験はMo1t Ill細胞において旧Hから得
られた高度に悪性の17株の直接の広幅に対する6−ABPの効果を、AA−2
およびMT2細胞培養物に対して、ウィルスの供給源として細胞上清を用いて、
調べている。60を越える数のテストがウィルスの力価、曝す時間、および6−
ABPに曝すことを変化させて行われた。
この薬物(6−ABP)のその活性代謝物6−ニトロン−1,2−ベンゾピロン
(6−NBP)への変換の割合が、細胞への6−ABPの浸透割合に依存するの
か、および細胞内での酸化による6−ABPの6−NBPへの変換割合に依存す
るのかは知られていない。従って、細胞外の薬物の濃度は、6−NBPの細胞内
での発生に依存する生物学的作用に対して、間接的にのみ関与する。この考え方
は全ての細胞培養物系の実験法に対して有効である。
図6かられかるように、6−ABPの効果は外部に添加した薬剤の濃度1mMと
3lMとの間で顕著に増加し、このことは、全ての細胞タイプについて特徴的な
2種の生物学的パラメータ、すなわち、薬物の保持状態、および酸化の触媒反応
の影響を受ける。固定した初めのウィルス濃度を一定にして、細胞変性試験によ
って測定された場合、3mMの6−ABPは6日目でさえ、Hlvの広幅を完全
に排除し、一方、1mMの6−ABPは、コントロールに対してただわずかに旧
Vの繁殖を抑制し得るのみであることが明らかである。
図6は、培養中のAA−2細胞におけるウィルスの広幅の時間の過程に対する、
外部から、すなわち、細胞外から添加された2種の′Is度の6−ABPの効果
を示す。)IIVの伝播速度に対するlおよび3IIIMの6−ABPノ効果は
、一定の旧Vの希釈1:1600ニて細胞病変性によって分析される。
図7は、3日後および6日後の、AA−2細胞における旧■増殖の抑制に対する
3mMの6−ARPの効果を示す。培養物は種々の旧Vの希釈度でこの薬物の3
mMに曝した。AA−2細胞に3日間または6日間連続して作用させた6−AB
Pの濃度をウィルスの濃度(横座標において旧■の希釈度として与えられる)の
関数として示す。
ウィルスの濃度の関数として示された薬物の効果は、予期され得るように、3日
目には70%から100%の抑制までその大きさが変化し、または6日目には2
5%から100%まで変化した。
このことは、6−ABPまたは、むしろその代謝物である6−NDPが有効な抗
旧V薬であることを明確に示す。
図7について行ったのと同様の実験を用いた、AA−2細胞における旧V複製に
対する3mMの6−A RPの効果を、引続き自動化したELISAテストによ
るp 24形成の慣用の分析によって分析した。
この結果を図8に示す。グラフに示すように、図7と同様に感染させる旧■希釈
度をI:100からl:1600まで種々のHIVfi度に変化させた影響、ま
たはp24のインプットを追跡した。
3mMの6−ABPは、抗HIVmとして有効であった。4日目において、3m
Mの6−ABPは、l :+400の希釈度でp 24の発生を完全に抑制し、
そしてl・l 400のウィルスの希釈以上で旧Vの複製を顕著に抑制した。
図9に示されるように、同等の結果がMT−2細胞によって得られた。図9では
、シンジチアの形成の抑制は、定量的に測定した。図9から、3dの6−ABP
が旧Vの生成をほぼ完全に抑制することは明らかである。それは、シンジチアの
形成のほぼ完全な抑制を証拠に示された。非常に高い旧V力価では、1:100
の希釈度における無処理の/シンチアの形成は、処理された培養物においてより
も150倍高い。
図6.7.8.9および表4において示される結果は、はぼ30シリーズの実験
において再現され、そして6−ARPの一定した抗ウイルス効果が得られた。
確立されている細胞培養物における薬物の抗ウイルス試験は、高度に有意で再現
可能な結果を生じる一方で、培養、不滅化、代謝改変などによって何らかの形で
細胞が修飾を受けていることに関係する生来の問題を有する。従って、ヒトの疾
病との直接の相互関係には、起こるかもしれない細胞膜の浸透性およびcyt
p 450含有量の変化を考慮にいれなければならない。それらは6−ABPお
よびその誘導体の医療上の効果を評価する際の決定的なパラメータである。
このような相互関係は、ヒトエイズ患者から得られるリンパ芽球を用いて行われ
た。この結果を図1Oおよび図11に示す。
図10において、ヒトのリン/く芽球は、6−ABPに18時間曝した。調べた
薬物の濃度は、0.01mMからlomMの間であった。HIVの生成は2種の
時間間隔において、すなわち、薬物除去後、6日目および122日目、研究され
た。6日目および122日目両方において、HIVの生成は01μMの6−AB
Pを用いた処理で、劇的に減少し、非常に低濃度(01μM)の6−ARPがエ
イズリン/f芽球における旧■の増殖を実質的に抑制するのに十分であることを
示している。
図11は、リンパ芽球のDNA合成に作用することなく、旧■の復製が選択的に
抑制されることを示す。図11は、6−ABPは、それを18時間曝した後に、
遺伝子のDNA合成に影響を及ぼさないことを示す。
図11において、PHAで刺激された正常なリンパ芽球を、HIVに感染させ、
同時に0−10mMの6−ABPの種々の濃度に曝す。
短時間(18時間)@シた後、パネルA、 A’、およびA”では旧Vおよび6
−ABPの両者を除去し、パネルBおよびBoにおいて示される培養物には4日
目まで同濃度における6−ABPが再添加される。
4日目に、パネルAおよび已において3H−チミジン混合物(incorpor
ation)によって測定された増殖指標が決定された。/イネルAかられかる
ように、6−ABPでの18時間の処理は、細胞増殖によって測定されるDNA
合成に影響を及ぼさない。細胞培養物が、さらなる6−ARP処理に曝されたパ
ネルBにおいては、HIVは抑制され、そしてDNAの合成もまた一時的に抑制
される。パネルA°およびBでは、ウィルスの合成または抑制は、p 24アツ
セイによって測定される。AoおよびBoの培養物の両方に対して、ウィルスの
増殖はほぼ完全に抑制された。上記結果はノ(ネルA”において確認され、ここ
で、逆転写酵素のアッセイがウィルスの抑制を示すために用いられた。
白血球が効率のよい02発生/ステムを宵することは周知である。従って、6−
ABPから6−NBPへの変換は、適合した細胞培養物においてより、白血球細
胞において、より効率よくもたらされる。それゆえ、プロドラッグである6−A
BPの活性種への変換は、非常に効率がよく、従って、それはより高い化学療法
活性を有する。それゆえ、肝臓における6−ARPから6−NBPへの迅速な代
謝変換と、グルタチオン依存の無益な(不活化)サイクルによる6 −A BP
の再変換とを避けるような投与の様式が、静脈注入によって処置されるなら、6
−ARPは、エイズにかかつている患者において特に高い効果がある。
図10に示される結果は、旧■に感染した患者の全血中で本質的に再現され、従
って、臨床上の効果がある程度保証される。
6−ABPがHSVの増殖を抑制するという発見は、ADPRTがウィルスの複
製に関与していることを意味する。この疑問を明らかにするために、2種のさら
なるシリーズの実験が行われた。
この結果を図12および実施例6に示す。
図12に示される第一のシリーズにおいて、ADF’RTに対する抗体は、存在
するかもしれない、DNA複製に関与するADPRTとウィルスタンパクとの間
の関係を決定するために計画された免疫沈降実験において用いられた。これらの
実験でCよ、HEp−2細胞をHSV−2に感染させ、そして感染後0から12
時間において、35Sメチオニンで標識した。前に記載したJ、Virol、、
63:3389(1989)の方法を用いて、抽出物を調製し、そしてADPR
Tに対する抗体で免疫沈降を行った。リボヌクレオチド還元酵2は、ウィルスの
DNA合成に関与する酵素の一つであり、その発現はウィルス増殖のために必要
である。従って、抗ADPRT抗体に対するコントロールとして、HSV−2リ
ボヌクレオチド還元酵素(RRI)の大サブユニ、l−中の13個のアミノ酸残
基からなる合成ペプチド(LAI)に対する抗血清が用いられた。HSV−2に
感染後すぐ、LAI抗体は、HSV RRIのみを沈澱させることが示された。
感染後遅くに、H3Vリボヌクレオチド還元酵素(RR2)の小サブユニットが
合成される場合には、LAI抗体がRR2および、RRIと共に合成されたまだ
特徴的でない細胞タンパクの両方をも沈澱させる。これは図12の第4レーンに
おいて示されている。
LAI抗体は同様に標識化された非感染細胞由来のいかなるタンパクも沈澱しな
いことが示されている(図12、第3レーン)。ADPRTに対する抗体は非感
染細胞由来のADPRTを沈澱させる(図12、第ル−ン)。HSVに感染した
細胞では(図12、第2レーン)、それはADPRTだけでなく RRIおよび
IC3PII/12 (これは、DNAの巻戻しおよび?J!製に必要とされる
主要なHSV DNA結合夕/バクである)も沈澱させる。
これらのデータは、ADPRTがHSV?!lに必要とされるH3Vタンパクと
複合体を形成し、それによってウィルスの増殖に寄与することを示している。
効月−
6−アミノ−1,2−ベンゾピロン類は、有効で、特異的かつ非毒性の抗ウィル
ス剤であり、HIVSl(SVおよびCMVのようなウィルスの増殖を選択的に
阻害する。従って、これらの薬剤はこれらのウィルスによって引き起こされるウ
ィルス性疾病、つますAIDS、ヘルペス性の病変およびサイトメガロウィルス
の感染の処置、に有用である。6−ABPによる処置は他のウィルス性疾病に対
してもまた有効であると期待される。
実施において、本発明の化合物、つまり式Iの置換されたあるいは置換されてい
ない6−ABP、あるいはその任意の薬学的に許容され得る塩は、宿主細胞中で
のウィルスの発現を阻害するのに充分な量で投与され、そしてこのような目的の
ために最も適する薬学的形態で投与される。
本明細書に記載されている活性化合物および塩は、治療薬として許容され得る任
意の投与形態によって投与され得る。
これらの方法には、全身投与あるいは局所投与、例えば、経口的、非経口的、経
皮的、皮下的あるいは局所的な投与形態が含まれる。これらの薬剤の好ましい投
与方法は静脈内投与であるが、被験者がHSV病変および潰瘍のような局所的な
病変を有する場合には、局所的な投与が適切であり得る。場合によっては、組成
物を他の非経口的あるいは経口的形態で投与する必要があり得る。
意図される形態によって、組成物は、好ましくは投薬単位量で、例えば、注射剤
、錠剤、坐薬、丸剤、除放性カプセル、粉末、液体、懸濁剤等のような固体、半
固体あるいは液体の投薬形態であり得る。組成物は、式■の活性6−ARP化合
物あるいはその薬学的に許容され得る塩を含み、そしてそれに加え、任意の従来
の薬学的な賦形剤および他の医薬物質あるいは薬学的物質、キャリアー、アジユ
バント、希釈剤などを含み得る。
投与される活性化合物の量は、当然、処置される被験者、被験者の体重、病気の
程度、投与形式および処方する医師の判断に依存する。しかし、有効な投薬量は
0,01〜5000 mg/kgZ日の範囲内であり、好ましくは0.1〜10
00 mg/kg7日、より好ましくは1〜1oo mg/kg /日である。
その上限は、当然、患者に毒性作用が現れるときである。しかし、本発明の化合
物が実用的には無毒性であるため、投与量は必要なだけ多くし得る。
固体組成物では、式Iの活性6−ARP化合物に加え、賦形剤、例えば、製薬等
級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカ
リンンーダ、タルカム、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム等
力用い得る。上述で定義した活性6−ARP化合化合物言た、例えばプロピレン
グリコールのようなポリアルキレングリコールをキャリアーとして用いた坐薬と
しても処方し得る。
液体、特に注射剤組成物は、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリ
セロール、エタノール等のような薬学的な溶液に、活性6−ABP化合物工を例
えば、溶解したり、分散することなどによって調製し得、その結果、注射剤溶液
あるいは懸濁剤が作製される。
非経口注射剤の投与は、皮下、筋向あるいは静脈内の注射および注入に一般的に
用いられる。注射剤は、液体溶液あるいは懸濁液のいずれかの従来の形態、ある
いは、注射前に液体に溶解するのに適した固体形態として調製し得る。
最近考案された非経口投与のためのアプローチは、一定の投薬レベルの持続を確
実する除放性あるいは持続性の放出系の移植片を利用する。例えば、この明細書
に参考文献として援用されている米国特許第3,710,795号を参照のこと
。
肝臓内でニトロン誘導体は迅速に解毒されるため、通常、6−ARPは経口的に
は有効でないであろう。しかし、肝臓内でのこのような迅速な代謝を防ぐグルタ
チオン抑制薬剤を同時投与するのに相当する6−ARPの適切な化学的修飾法が
開発されると予期され、そして全ての他の可能な薬学的組成物と同様に、本発明
の範囲内にある。
所望するならば、投与される薬学的組成物はまた、少量の無毒性補助物質、例え
ば湿潤剤あるいは乳化剤、pH緩衝剤、および、例えば、酢酸ナトリウム、オレ
イン酸トリエタノールアミンなどのような他の物質を含有し得る。
このような投薬形態の実際の調製方法は、公知であるか、あるいは当業者に明白
であり、そしてRem1n ton’s Pharmaceutical 5c
iences、 Mack Publishing Company、 Eas
ton、Penn5ylvania、 17th Edition、 1985
に詳細に記載されている。投与される組成物あるいは調合剤は、いずれにしても
、患者に治療上有効な量が供給されることを確実するような量で、活性化合物あ
るいは複数の活性化合物を含有する。治療上有効な量とは、処置される被験者に
症状の発生を妨げるが、あるいは存在する症候を軽減するのに有効な量を意味す
る。
任意の薬学的な組成物は、活性6−ARP成分を0.1〜99%含有し、好まし
くは1〜70%含有し得る。
6−ABPの作用形管のかなり詳細な知識に基づき、6−ABPの医療的な有用
性に関する予測を明確に述べることが可能である。
6−ABP、好ましくはその薬学的に許容され得る任意の塩の形態、例えば塩酸
塩は、水性溶媒中ではがなり良く溶解する分子である。pH7,2〜7.9で1
0〜12 mM溶液を形成し得る。この溶液は、暗所下で保存するならば、室温
で、僅がな分解(0,102より少ない)はあるが、数カ月安定である。このよ
うな溶液は静脈注入の調合剤として用いる場合かなり安定である。静脈注入は、
いかなる病期の旧Vに対しても、おそらく最も有効な投与形態である。6−AB
Pは庇液脳関門を通過することが知られているため、AIDS神経障害の処置に
有効である。6−ABPはまた、A IDs関連の内部器官のカボジ肉腫の処置
にも有効である。
適切に処方すると、皮膚疾患に対しても有効である。
AIDS患者において、約1gの6−ARP/平均注入体重は典型的に有効な化
学療法を提供する。化学療法は、HIVが検出されるとき、あるいはまだ検出さ
れないときでも、間欠的に繰り返し得る。
その上、無毒性であるため、6−ARP治療は、単独で供給し得るか、あるいは
他の抗ウィルス剤または他の薬剤、例えばAZT2抗生物質、フルチフステロイ
ド、ビタミンおよびその他の薬剤、と組み合わせて供給し得る。作用形態がかな
り異なり、かつ6−ABPと池の薬剤との可能な相乗作用が予想可能であるため
、A ZT、他のこのような毒性の薬剤でも、6−ARPと共に使用することは
禁忌ではない。
6−ABP化合物は、HSV−1およびHSV−2の両者により引き起こされる
ヘルペス性の病変の処置に同様に有用である。この薬剤は、好ましくは、静脈注
入あるいは他の非経口的または全身的投与形態によって投与される。潰瘍の場合
、この薬剤はまた局所的にも投与し得る。CMVによる感染は、好ましくはAI
DSの処置のために提案したと同じ様式で処置される。
6−ABPの一つの主な利点は毒性がないことである。この薬剤が、ウィルス増
殖に関与する酵素ADPRTに対してのみ非常に特異的に作用するが他のいかな
る酵素には作用しないため、好ましくない副作用を全く有さない。
副作用および毒性が全(ないため、この薬剤は、存在しているHIV、 HSV
およびCMVあるいは他のウィルス感染の処置にだけでなく、このような感染の
予防にも都合よく用いられ得る。
また免疫抵抗性が低下した場合、二次ウィルス感染の発生を防ぐためにも、予防
的に投与され得る。
より親油性の分子を生成するR1−R6上の置換を有する置換6−ABP類は、
より容易に細胞壁を透過し、そして6−ARPよりもさらに高い効力を有し得、
従ってより低い濃度でより有効であり得る薬剤を与える。
以下の調製および実施例は本発明を例示するためのものである。これらは本発明
を狭めるもの、あるいは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない
。
6−ARPの様々な置換基(式に示されているように)は、細胞透過に関する脂
肪溶解速度を、従って臨床の投薬スケジュールをおそらく改変するが、上記の生
化学的な機構は置換によって分子レベルではおそらく変化しない。
友直見よ区且旦
ウィルス ・な
およびウィルス
Vero (アフリカミドリザルの腎臓)細胞およびMRC−5(ヒト肺繊維芽
細胞)細胞(M、A、 Bioproducts、Walkersville、
Maryland)を、25 mMのHerpesバッファーおよび10%ウ
シ胎児血清(FBS)を含むイーグル最小必須培地(MEM)中で増殖させた。
ヒトの類表皮癌No、 2 (HEp−2)細胞を、10% FBS含宵199
培地中で増殖させた。M、A、 Bioproductsから市販されているア
カゲザルの腎臓(、RMK)細胞をイーグルのMEM中で増殖させ、2%のFB
Sで維持した。U937ヒト単球性細胞を、10%FBSおよび1%ピルビン酸
ナトリウム含有のRPMI中で増殖した。元来NIBから得られた、T細胞白血
病細胞、MT2をio%FBS含有のRPM[164中で増殖させた。
単純ヘルペスウィルス(HSV) 1型および2型(それぞれ、FおよびG株)
をHEp−2細胞中で増殖させ、Proc、 Natl、 Acad。
」二i、、 83:2787 (1986)に記載されているように液体オーバ
ーレイ下でプラークアッセイして力価を測定した。
アデノウィルス、呼吸シンシチウムウイルス(R3v)、インフルエンザウィル
ス、エンテロウィルスおよびサイトメガロウィルス(CMV)は、臨床医療機関
で得られた患者からのオリジナル単離株である。CMVは、10%FBS含有の
MEM中のMRC−5細胞中で増殖させ、HSVは、2%FBS含有のMEM中
のHEp−2細胞中で、増殖させ、アデノウィルス、インフルエンザウィルスお
よびエンテロウィルスは、0.8%ウシ血清アルブミン(Fraction V
)および25 mM [1erpesバツフアー(インフルエンザ)あるいは2
%FBS (アデノウィルス、エンテロウィルス)含有のMEM中のRMK細胞
中で増殖させた。HIV−1は元来NIHから得られ、Mo1t3細胞中で増殖
させた。
CM’/およびRSVアデノウィルスおよびエンテロウィルスのウィルス力価は
、50%細胞変性効果(TCID50)をもたらす最大希釈として表現される。
[1SV−1および)ISV−2のウィルス力価は、l ml当たりのシンシチ
ウム形成単位(PFU)で表現される。■IV力価は、MT2細胞でアッセイし
たシンシチウム形成単位(SFU/ml)で表現される。インフルエンザウィル
スは赤血球凝集反応でアッセイし、その力価は50%赤血球凝集を引き起こす最
大希釈として表現される。このアッセイでは、感染したRMK細胞を入れたチュ
ーブを、1.5時間4°Cで、ハンクスの平衡塩類溶液中の0.5zギニアビッ
グ赤血球細胞懸濁液に曝して、洗浄し、付着細胞を計数する。
プラスミド
全てのキメラCAT構築物は、真核性のプロモーター配列のないCAT構造遺伝
子を含むpCATB’で調製された。プラスミドplGA15内のウィルス配列
の標的位置には、J、 Virol、 63:2773 (1989)1.:記
載されティるHSV−1+7) 1E175およびIEIIOタンハク質の遺伝
子を含む。
DNA )ランスフェクション
DNA トランスフェクションをDEAEデキストランで行った。要するに、U
937細胞(5X10’)を、60分37℃で、15 mlのスナップキ+ ツ
ブ6X35mmポリエチレン皿(Costar、 Cambridge、 Ma
ssachusetts)中で、5TBSバツフy −(137mM NaC1
,0,5Mgc+2.0.7 mM CaCl2、および5 mM KCI含有
の25mM)リスHCI。
pH7,5、および0.6 mM Na21(PO4)中のDEAEデキストラ
ン(1゜05 ug/+1)およびDNA混合物に、1ウエル当たり5XIO’
細胞を曝した。慣例的に、トランスフェクション混合物は、核酸濃度効果を均等
にするために1.Ougの標的スーパーコイルプラスミドおよびO,lugのD
NAを含ませた。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション後の4
0〜44時間に、CAT採集バッフy −(150mM NaC1,1mM E
DTA含有の40mM)リス、pt+7.4)で採集して、アッセイまで一20
℃で保存した。
でセライトを通して吸引濾過して触媒を除去し、そしてローハ、0.2 uci
の[+4c]−クロラムフェニコール基質を用い、インキュベーション時間は6
0分である。CAT活性および活性化倍率の定量的測定では、適切な切片を薄層
クロマトグラフィーから切り取り、シンチレーション液体を加え、そして放射活
性をシンチレーションカウンターで測定した。酵素濃度および時間に伴うクロラ
ムフェニコール−酢酸生成物量の測定によって定量的比較を行った。psv C
ATをポジティブコントロールとして、そして親(pCATB’ )をネガティ
ブコントロールとして用いた。
大ILL
6−アミノ−12−ベンゾピロン の−この実施例は6−アミノ−1,2−ベン
ゾピロン類の調製を例示する。
6−アミノ−12−ベンゾピロン の−16−ABPの調製に用いた方法は、J
、 Heteroc clic Chem、、 23:87 (1968)に報
告された方法の改変法である。
フード内で、125Illのフラスコ中の、30 mlの水に懸濁した0、50
gの活性化カーボン上の10%のパラジウム触媒に、35m1の水中の水素化ホ
ウ素カリウム水溶液(2,70g、、 0.050モル)をゆっくり加えた。次
に、組み合わせた混合物を、マグネチノクスターラーを備えた2リツトルのフラ
スコに移し、市販の6−二トロー1,2−ベンゾピロン(3,82g、、 0.
020モル)の10100Oのメタノール溶液を室諷にて徐々に添加した。添加
を終了した後、この混合物をさらに15分間攪拌し、ブフナー漏斗上ABPに、
HSV−1あるいはll5V−2(5〜10 PFU/細胞)による感染タリー
エバポレーターによりメタノールを除去した。残留物を冷水に懸濁し、ブフナー
漏斗上に注いで回収した。乾燥した後、この物質をエタノールで再結晶し、2.
18 g (68%収量)の黄色の生成物(m、p、 166〜169°C)を
得た。質量スペクトル: 161 (M+) 、133.104.78.52゜
そして/あるいは調製方法の項の記載に従って修飾を導入した。
塩酸6−アミノ−12−ベンゾピロンの一製6−アミノー1.2−ベンゾピロン
(1,61g、、0.010モル)の20m1の水の懸濁液を攪拌しながら、ア
ミンが溶解するCpH3〜4)まで2Mの塩酸水溶液を滴下した。次に、この溶
液を濾過し、ロータリーエバポレーターおよび真空ポンプにより水を除去した。
次に、乾燥残留物を熱無水メタノールに溶解し、活性化脱色剤で処理し、塩酸塩
の薄い黄色の結晶(m、p、 280〜285°C1分解)を得た(1.60g
、、81%収量)。質量スペクトル: 161 (M−HCI) +、133.
104.78.52.51゜他の塩類は、同方法あるいは類似の方法によって、
塩酸の代わりに他の適切な酸を代用して調製される。
K血丘主
HSVおよびCMVI:lする6−ABPノこの実施例は、)ISVあるいはC
MVのいずれかに感染させた培養細胞中でのFISVおよびCMVの複製に対す
る6−ARPの阻害活性を例示する。
Vero%MRC−5細胞のHEp−2を、0.1〜10mMの種々の濃度の6
−の前(24時間)、感染の間(0時間)および感染後(4時間)の種々の時点
で曝し、そして24時間後にウィルス力価を測定した。
その結果は既に図IA、 IB、 2Aおよび2Bの項で論じられている。感染
前、感染中および感染後に処理した場合、6−アミノ−1,2−ベンゾピロン(
6−ABP)はHSVの増殖を阻害した。同様の結果がCMVに関して得られた
。
感染ノ24時間前テノ6−ARPノ添加は、HSV−1あるいはI’1SV−2
の力価を投与量に依存して低下させた。この両方の場合では、HSV−2はHS
V−1よりかなり感受性であった。すなわち、1 mMの6−ARPの添加はI
(SV−1の増殖の50%阻害をもたらしたが、1 +iMの6−ARPで処理
した細胞でHSV−2の増殖の90%阻害が観察された。
10 mMより高い濃度の6−ABPに曝した培養物では、阻害は著しく増加し
なかったことにより、ウィルス増殖を著しく阻害するには10 mMの投与量で
充分であることが示された。
感染時(0時間)あるいは感染後の4時間での6−ABP処理は、本質的に同様
の阻害パターンをもたらした。つまり、HSV−2の増殖の85%および72%
阻害が、感染後の0および4時間に1 mMの6−ARPで処理した細胞でそれ
ぞれ観察された。10 +uMの6−ARPで同様に処理した細胞では、阻害は
著しく増加しなかった。24時間前処理した細胞で観察された結果と一致して、
感染後Oおよび4時間に1 mMの6−ABPで処理した細胞では、l’1sV
−1の増殖に対する阻害効果は幾分低く、それぞれ60〜65%阻害をもたらし
た。10 mMの6−ARPで処理した細胞では、阻害は約80%であった。
これらのデータは、1 mMはどの低い濃度の6−ABPで前処理あるいは処理
した細胞中でのHsv−iおよびHSV−2の増殖に対して、6−ABPが著し
い阻害効果を及ぼすことを示している。感染4時間後ではウィルスの復製を導く
早期ウィルス機能のほとんどが既に発現しているが、このような遅い時に細胞を
処理しても、阻害はまだ観察される。
HEp−2、VeroおよびMRC−5細胞におけるウィルスの増殖を比較する
研究から、本質的に同一の結果が得られたように、6−ABPの阻害効果は細胞
のタイプに影響されない。
CMV感染の培養細胞を用いて、上記に述べた研究と同じような研究を行った。
表1に示されているように、6−ABP処理はCMVの増殖をも効果的に阻害す
る。しかし、RSV、インフルエンザウィルス、アデノウィルスおよびエンテロ
ウィルスのような他のウィルスを6−ABP処理する研究において、このような
処理は、表1に示されているように、HSV、インフルエンザウィルス、アデノ
ウィルスおよびエンテロウィルスの増殖に対して効果を持たないようである。
この実験では、細胞をl mMの6−ABPに24時間曝してから、感染させた
。ウィルス力価を最大CPHのときに測定した。エンテロウィルスはECHO−
11であった。
(以下 余白)
表 1
ウィルスのt4 +1声−1−クー謁6−AB’Pだ1里の勧ウィルス +6−
ABP −6−ABP 士 阻害率CMV :LX1031xlO’ 90R5
V 1. x 1051 x 1050・イ′/フルニー/1− 1 x 10
’ 1 x 10’ 0アプーノ→イルス :L X 102 1 X 102
0H5V−22x 10516 x 106B7.5エソテロライIレス 1
.6 X 106 L6 X、1.06 0実JL[l一
定のDNAによる旧Vの活性化に夕・する6−ABPの阻 を果この実施例は特
定のDNAによる旧■の活性化に対する6−ABPの阻害効果を例示する。
一つの実験の/リーズでは、MT2細胞における旧Vの増殖の指標であるシンシ
チウム形成のアッセイを用いて、[flVの複製に対するHSV IEIIOお
よびCMV IH2の遺伝子発現の効果を調べた。旧■の増殖活性化に対する6
−ARPの阻害能力を2つの培養物テ調へた。U937細胞をHSV IEII
OあるいはCMV IH2)遺伝子でトランスフェクトし、あるいはpBR32
2プラスミドで疑似トランスフェクトし、モしてHIVで感染させた。その後の
種々の時期に、ウィルス(HIV)の増殖をアッセイした。)IIV力価はノン
/チウム形成単位/mlで表現される。
トランスフェクションは旧■感染の24時間前に行った。HIV感染後の3.5
.6、および8日目にサンプリングした。細胞間の6−ABP濃度を外部の薬剤
′a度と平衡化するため、6−ABP処理をトランスフェクションの24時間前
に行った。選んだ時期および投薬量は薬剤の透過性に関連している。SFUア、
セイは、5cience、 299:563 (1985)に記載されているH
aradaの方法であり、顕微鏡でシンシチウムを直接定量するために■二匡■
。
167:299 (1988)の記載に従って改変した。
結果は、表2に示され、6および8日目(グループ4)にHSVIEIIOでU
937細胞をトランスフェクションすることによって、HIVの複製が100倍
促進されることを示している。別の実験は、CMV IHに曝すことによっても
複製が7倍活性化されることを示す。l mMの6−ARPに曝すと、HSV
IEIIOによる活性化は事実上打ち消される。これはおそら<HSV IEI
IOの遺伝子発現に対する阻害効果によるものであろう。これらの知見はCAT
アッセイで得られた結果と実質的に同一である。
(以下 余白)
ゑ 2
6−ABPT” rLffLr:に+v ?L中7−のHLVnX 33=U9
]7 SFU/ml
l U937 @、%fi 27 ユ07 107 1332 U937+6−
ABP 13 10 10 1゜3 U937+pBR32232250250
250’Aイエ又)ラン又フェクシタソ
4 U937+ HSV 工EIIO16035015,00015,0005
U937+H5VrEllO+32 64 100 1006−ARP (l
mM)
HIV力価はシンシチウム形成単位/mlで表現される。
6−ARPは、活性化H3V遺伝子が存在しないときでも、HIVの増殖を著し
く減少させた。これは6−ABPがFIIVの増殖に対して高い阻害効果を有す
るという知見と一致する。
夫立五土
この実施例はマクロファージ中でのHSVおよびCMV媒介のH[V活性化に対
する6−ARPの効果を例示する。
マクロファージ中でのHSVおよび/あるいはCMV媒介の■I+/活性化に対
する6−ABPの効果を調べるために、U937細胞を、HSVおよびCMVの
公知のトランスアクティベーター遺伝子である■IV−LTRcatで同時トラ
ンスフェクションして、方法および材料の項に記述した方法を用いてCAT発現
をアッセイした。その結果を表3に要約した。
表 3
HIV−L Rの3′ト主イ乙l−”、する6−AB’Pmi釆Exp ksr
xbT;oNA %・)tにチも」トド pBR322(コントロール) 02
、 HSV−工E−110125
3、HSV−工E−1751
4、HSV−工E−410+ 6−ARP (5mM) 205、 pBR:3
22 +6−ABP 0表3に示したように、U937細胞の旧V−LTRca
tおよびHSV−IElloあるいはCMV IE2遺伝子による同時トランス
フェクションは、125倍の著しい旧V−CAT発現の活性化をもたらした(実
験2)。実験2と4との比較から見られるように、この活性化は0〜lO倍に著
しく減少した。実験3から見られるように、HS’/ IE17Sの導入は、こ
れらの細胞中でのHIV−CAT発現を促進しなかった。
大Jlt主
立 中の 立 の生 数に・ る6−ARPの I(+’/効果この実施例は樹
立した培養細胞中での旧Vの複製に対する6−ABPの直接阻害効果を例示する
。
AA−2細胞に対する6−ABPBPO4果を、細胞計数および、クローニング
効率およびトリパンブルー取り込みを含む細胞生死判別テストにより直接分析し
た。1ウエル当たり0.5X105の出発細胞数を有するAA−2培養細胞を3
mMの6−ABPで処理し、そしてそれを無処理(コントロール)培養細胞と
比較した。
6−ABPBPO4日後に細胞数を計数した。その結果を表4に示した。
表 4
出シ乙め釉蛸己言を含虻/!cm@Z*+を−し 斗日電
0.5 x 10’ (± 204) 1.5 x 105 (士 コ0N)6
−5 1 ・7 54
生死判別テストでは、6−ABPの毒性作用は全く見られなかりた。
6−ARPが細胞増殖に対して阻害効果を及ぼすこと、そしてその効果が一時的
であり、可逆的で、かつHIM複製の完全排除と同時に起こることが両方明かで
ある。しかし、AA−2細胞では、細胞分裂の減速は、他の薬剤の細胞増殖抑制
性の抗癌作用を予測する現象である任意の検出可能な細胞毒性とは同時に起こら
ない。細胞毒性を伴わないため、これは独特である。
K血匠立
1部 に ムするHSV
この実施例は複製(ori、)開始部位のADPRTに結合するH3vDNAを
例示する。
Is’/−1の230 bpのXbal−Hindlll ori、 DNAを
プラスミドpKC4から単離し、そしてE、 coHのDNAポリメラーゼのフ
レノウ断片によるfill−in反応によって[32P]dCTPで放射標識し
た。ムViro1..63:2773 (1989)に以前記載された方法に従
って、標識したDNAフラグメントを精製した。
J、 Biol、 Chem、、 263+1505 <1988)に記載の方
法に基づくニトロセルロースフィルター結合アッセイヲ用いて、ori、 DN
AへのADPRTの特異的な結合を調べた。ニトロセルロースフィルター(Sc
hleicher and 5chuell、 BA 85.0.47 unの
ポアサイズ、直径27 mm)を結合バッフy (250a+M)リス−C1,
pH8,0,100mM MgCl□、looomM NaCl5O,6mM
DTT、 0.1 mg/ml BSA、 0.1 mM PMSFおよびQ、
L mM TLCK)に60分間予め浸した。
5ulの[32P] art、 DNAを210 ulの冷した結合バッファー
に加え、1分間インキュベートした。次に、ADPRT (200ng)あるい
はHSV−1感染Vero細胞の抽出物(Vero(F)、2 ug)のいずれ
か2 ulを、このDNA溶液に加え、そして25℃で10分間インキコベート
した。サンプルを氷に移し、次いでニトロセルロースフィルターを通して濾過し
た。次に、25mM)リス−C1,pEI 8.0S10 mM MgCl2.
0.5 mM DTT、 100 mM NaC1,5%DMSO含有の冷した
洗浄バッファーでこのフィルターを4回洗浄した。フィルターを乾燥し、そして
フィルターに結合している放射性物質の量をシンチレーションスペクトロフォト
メトリーで測定した。
その結果は2つのサンプルの平均で表現され、表5に示されている。投入ori
、 DNAは8.000/サンプルであった。
(以下 余白)
ゑ 5
M 77’ IV 7<+n−11給に %CPM 1璽りワ斥右4ドセ
Ori、 DNA iQ 172
0ri、DNA 十 Vero (F) 1220 13.20ri DNA
十 ADPRT 6フB4 78.にの結果は、HSV−1のori、 DNA
フラグメントへのADPRTの結合が特異的であり、そしてHSV−1起点結合
タン、fり質を含む感染細胞の抽出物で以前観察された( Proc、 Nat
ニーAcad、 Set、−、85:2959 (198&))結果より、著し
く強(Aことを示して0る。
試験した条件下では、フィルターへのDNA単独の結合は最小であるが、利用で
きる1)HAの80%近くを結合させるのに充分な様式で、ADPRTはori
、 DNAと複合した。
宜ff1
AIDS患 から′8られたヒトリンパ 球 での旧V のこの実施例は、AI
DS患者から得られたヒドリン、f芽球中での旧V増殖↓二対する6−ARPの
阻害効果を例示する。
これらの実験に用いたHIM単離株は感染患者の血液力)ら単離された。単離後
、HIV感染をCEM細胞で樹立した。組織培養物に対する感染必要量< Tc
ID)の濃度を測定するためにその力価が測定されたHIVウィルスの株を生
産するのに、これらの感染細胞は用いられた。
6 ABPは、必要に応じてさらに希釈し得る量で食塩本に溶解−1そして細胞
を含む培地に、表示した濃度で添加された。
非感染の正常個体由来のヒト末梢血単核細胞を、組織培養中で、ファイトへマグ
ルチニンで2〜3日間刺激し、洗浄し、小分けし、そして20.0丁CIDある
いは507CIDのI(IVと共に一晩培養し、そして無処理か、あるいは0.
01.0.1.1.0あるいは10、Odの6−ARPで処理した。旧Vの非存
在下で、別のコントロールを10 mMの6−ARPと共にインキユベートした
。−晩のインキニベーシゴン後、残査を取った。追加の6−ARPは無しで、I
L−2を含んだ培地で細胞を培養し、6日および12日に、旧V−924コア抗
原の産生、あるいは粒子化した逆転写酵素に関する測定で、モニターした。これ
らの旧Vの指標のいずれかの量の減少は、6−ABPが正常なヒトリンパ芽球中
での旧Vの複製能力を阻害することを示している。
HIV p24抗原をELISAで、S pg+n/+olをカットオフとして
測定した。組織培養液からの遊離のウィルスを遠心沈降し、界面活性剤、マグネ
シウム、H3で標識したdTTPおよびポリrA、オリゴdTプライマーを含有
するバッファー中で旧Vを溶菌し、1時間インキュベートし、そして沈降可能な
放射活性を測定することにより、粒子化した逆転写酵素を測定し、HIV含有培
地の単位容積当たりのcpmとして表した。
培養の6日月に、IL−2、HIVおよびH3−チミジンと一緒の6−ARPに
6時間曝した細胞をインキユベートして、そして培養中の100.000細胞当
たりに取り込まれたCpIllの量を測定して、リンパ芽球の生存能力を測定し
た。
結果は図10に示され、これは薬剤に18時間だけ曝したヒトリンパ芽球の生存
を表す典型的な実験を現している。[1IV(1)24テスト)の激烈な減少は
、感染の6日後(下の曲線)あるいは12日後(上の曲線)に、0.1mMの6
−ARP濃度で既に起こっている。横軸は6−ABPJ度を表している。
ヒトリンパ芽球を18時間という比較的短い時間曝すことが、HIV複製を選択
的にブロックし、そしてリンパ芽球のDNA合成に対しては最小の影響しか与え
ないことを確かめるために、図11に示した増殖、p24および逆転写酵素の実
験も行った。
パネルA(−格上)では、リンパ芽球のDNA合成を6−ABP濃度に関連する
変化としてアッセイした。パネルA’ (その下の曲線)では、旧■複製の退化
を同時に測定し、そしてA″パネルでは逆転写酵素をアッセイした。これら全て
は容認されたI(I’/複製のアッセイである。
図11により、6−ABPに曝した18時間の間、6−ABPがHIV複製に対
して非常に選択性であり、細胞のDNA合成には事実上影響しないままであるこ
とが明かである。
リンパ芽球を4日間続けて種々の濃度の6−ARPに曝すこと(パネルBおよび
B’)は、チミジンの取り込みにより測定したリンパ芽球のDNA合成に対して
も阻害効果を有した。しかし、細胞の死滅が起こらず、従って、阻害は一時的、
かつ可逆的であるので、リンパ芽球の生死は薬剤に影響されない。すなわち、6
−ABPの増殖阻害作用は、任意の現在用いられるあるいは入手可能な細胞増殖
抑制物質と異なり、検出可能な細胞損傷あるいは細胞の死滅なしで達成し得る。
このことにより、当然、6−ARPによるAIDS患者の適切な静脈注入処置が
、リン、<芽球に対する強い毒性効果なしで行われ得ることになる。
夫立五主
6−ABPの に る 7
この実施例はマウスに6−ABPを腹腔内投与した後、毒性がないことを例示す
る。
マウスに6−ARPを投与する2つの毒性テストを下記の条件で5匹のマウスか
らなる1つのグループに腹腔内注射で1 g/kgの量の6−ARPを与えた。
マウスを24時間観察した。このグループのうち、4匹のマウスには中毒症状は
なかった。1匹のマウスは、注射の4時間後に、発作および後脚の虚弱を発生し
たが、18時間のうちに完全に回復した。
K版主:
50匹のホワイトマウスのグループに毎日6−ABPを250mg/kgで12
日間腹腔内注射した。目に見える毒性作用はなかった。
マウスの行動は全く正常であった。通常の体重増加に途絶はなかった。
F工GURE L
r工GURΣ 2
F工GURE 3
rL
1、 ローロ HIV + U9”37 + 工E−1102、X−X !(工
V + U937 + CMV 工E3、 ◆−◆ HIV + U937+工
E−110+6−ARP (3mM)4、 4−ム l(工V 〒 U937
+ PBR−322(4ipj−+)−ランスλ7)ン〕5.0−OH工v +
U937 + 6−ARP (3mM)6、 m−i+ H工y + U93
7 シント0−+しr工GURE 4
1、ムーム HIV + U937 +工E−1102、 ローロ HIV +
U937 + CMV工E3、・−・ HIV + 0937 + PBR−
3224、Δ−△ HIV + U937 コントロール5、II−閣 HIV
+ U937+工E−110+6−ABPP工GURE 5
F工GURE 6
+ クンドローlレ
ロ6−ABP (1mM)
06−ABP (3mM)
r工GURE 7
0= 650
F工G円ミ8
6象 H工Vの永釈彦
一一Δ−−:l+シト0−ルOa目
−→−−P!、処理4e目
−−0−−6−ARP (3mmol)6 B !!FIGt7RE 9
−−41−− @矧理 −6F3ヨ
ー−△−−6−ABP (3mmol) ’fe#)FIGURE 10
FIGURE 工1
Claims (10)
- 1.哺乳動物のウィルス感染の治療方法であって、このような治療を必要とする 哺乳動物に下式の化合物:(I)▲数式、化学式、表等があります▼ここで、R 1、R2、R3、R4またはR5は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ア ミノ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、フェニルまたはアルキル、アル コキシ、ヒドロキシあるいはハロゲンで置換されたフェニルから選択される;あ るいは、それらの薬学的に許容し得る塩;の有効量を投与することを包含する、 方法。
- 2.前記治療が静脈注射により効能を示す、請求項1に記載の方法。
- 3.前記化合物(I)が1日当たり1キログラム当たり0.1から1000mg の量で投与される、請求項2に記載の方法。
- 4.前記R1、R2、R3、R4およびR5が水素である、請求項3に記載の方 法。
- 5.前記投与量が1日当たり1キログラム当たり1から100mgである、請求 項5に記載の方法。
- 6.下式を有する抗ウィルス物質: (I)▲数式、化学式、表等があります▼ここで、R1、R2、R3、R4また はR5は、少なくとも1つのR置換基が必ず水素と異なり、そして、R2、R3 、R4およびR5が水素であるときには、R1はフェノールではないという条件 で、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ、シ クロアルキル、フェニルまたはアルキル、アルコキシ、ヒドロキシあるいはハロ ゲンで置換されたフェニルから選択される; あるいは、それらの薬学的に許容し得る塩;である抗ウィルス物質。
- 7.前記治療が静脈注射により効能を示す、請求項6に記載の物質。
- 8.前記化合物(I)が1日当たり1キログラム当たり0.1から1000mg の量で投与される、請求項7に記載の物質。
- 9.前記投与量が1日当たり1キログラム当たり1から100mgである、請求 項8に記載の物質。
- 10.ヒト免疫不全ウィルス、単純ヘルペスウィルスあるいはサイトメガロウィ ルスによって引き起こされる哺乳動物のウィルス性の疾病の治療方法であって、 このような治療を必要とする哺乳動物に下式の化合物: (I)▲数式、化学式、表等があります▼ここで、R1、R2、R3、R4また はR5は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキ シ、シクロアルキル、フェニルまたはアルキル、アルコキシ、ヒドロキシあるい はハロゲンで置換されたフェニルから選択される;あるいは、それらの薬学的に 許容し得る塩;の有効量を投与することを包含する、方法。
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