HUT78059A - Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban - Google Patents
Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban Download PDFInfo
- Publication number
- HUT78059A HUT78059A HU9901091A HU9901091A HUT78059A HU T78059 A HUT78059 A HU T78059A HU 9901091 A HU9901091 A HU 9901091A HU 9901091 A HU9901091 A HU 9901091A HU T78059 A HUT78059 A HU T78059A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- agent
- medium
- agst
- stabilizing
- stabilizing medium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány szerinti közeg különös előnye, hogy lehetővé teszi az aGST meghatározását vizeletben radioaktívan jelzett reagens alkalmazása nélkül.
*990109 1
KZtTÉTELI PuUttÁNY —
Képviselő:
Danubia Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft. Budapest
VIZELETBEN LÉVŐ α-GLUTATION S TRANSZFERÁZ ENZIMET STABILIZÁLÓ KÖZEG ALKALMAZÁSA ENZIM IMMUNMEGHATÁROZÁSBAN
BIOTRIN INTELLECTUAL PROPERTIES LIMITED,
Mount Merrion, County Dublin, Írország
Feltalálók:
DOYLE John Martin, Deansgrange, County Dublin KILTY Cormac Gerard, Sandycove, County Dublin
Írország
Aktaszám: 85461-7042-SZŐ-fa
A találmány tárgya: vizeletben lévő α-glutation S transzferáz (aGST) enzimet stabilizáló közeg; valamint e közeg (szer) alkalmazása aGST enzim immunmeghatározására.
A glutation transzferázok (GST enzimek) az emberi szövetekben nagyon különböző mennyiségekben találhatók. Ezek az enzimek három főcsoportba tartoznak, ezeket α, Π, és μ előjellel látják el. Ezen három főcsoportba tartozó enzimek sajátságai egészen különbözők.
Az aGST a vese proximális tubulusának környékén (a vesecsatorna bevezető részében) található, és egészséges egyénekben a vizeletbe szabadul fel, amint ezt enzim immunmeghatározással és „western biot” elemzéssel igazolták [J. A. H. Campbell és munkatársai: Cancer (Philadelphia) 67, 1608-1613 (1991)]. Bármely tényező, amely a proximális tubulust károsítja, előidézheti aGST felszabadulását a vizeletbe, s így a normális vizeleti szintek (koncentrációk) növekedését okozhatja. így tehát a vizeleti aGST szint növekedése a proximális tubulus károsodásának jele lehet [R. A. Sherman és munkatársai: Uremia Investigation 8, 111-115 (1985)]. Újabb kísérletek azt mutatták, hogy a ciszplatin által előidézett proximális tubulusi károsodás Wistar patkányokban a vizeleti aGST szintjének növekedésével és a szérum-kreatinin klirenszének csökkenésével jár együtt [M. Stojanov és munkatársai: Clin. Chem. 14. 1125 (1994)]; továbbá emberben az akut tubuláris nekrózis (elhalás), és veseátültetés kudarca mind az α-, mind a flGST szintek gyors növekedését idézi elő [A. G. M. Sundberg és munkatársai: Nephron 67. 308-316 (1994)].
Igen előnyös az a lehetőség, hogy a vizeletet testfolyadékok mintájaként alkalmazzák olyan enzim kimutatására és meghatározására, amely a vese károsodását, és különösen a vese egy adott tájékának a károsodását jelzi; különösen azért, mert ez szükségtelenné teszi a szervezet mintájának invazív (bemetszéses) gyűjtését. A kivánalom általában az aGST mérése olyan egyénekben, akik súlyos betegek, és ezért bármilyen szükségtelen beavatkozás minimálissá tétele nagyon ajánlatos.
Az aGST vizeletben végzett mérésére hagyományosan radioimmunmeghatározást alkalmaztak a radioaktívan jelzett anyag (röviden: radio-jelzett anyag) alkalmazásának velejáró hátrányaival.
Gyakran előfordul, hogy a vízeleti aGST szükséges mérése tekintélyes időn át, például napokig nem végezhető el a mintaavétel után. Ennek megfelelően gyakran szükséges a vizeletmintát igen alacsony hőmérsékleten, általában körülbelül -20 °C hőmérsékleten tárolni. Megfigyelték azonban, hogy a vizeleti aGST-nek ilyen alacsony hőmérsékleten végzett tárolása az immunreakcíókészségben veszteséget okoz, s így bármely immunmeghatározás érzékenysége csekéllyé válik. Az immunreakciókészségnek ez a vesztesége nagyon valószínűen a fagyasztás és a felolvasztás során bekövetkező denaturálódás következménye.
Ennek megfelelően fennáll az igény olyan közegre (szerre), amely lehetővé teszi a vizeleti aGST tárolását vizeletben -20 °C körüli hőmérsékleteken az aGST immunreakcíókészségének lényeges vesztesége nélkül olyan immunmeghatározásban, amelyet az aGST kimutatására alkalmaznak, ha ez szükséges.
Találmányunkat az alábbiakban részletesen ismertetjük.
A találmány révén lehetővé válik közeg (szer) kialakítása aGST stabilizálására vizeletben, amely egy enzimtől eltérő fehérje, kelátozószer (komplexképző szer) és valamely puffer stabilizáló hatású mennyiségét tartalmazza olyan módon, hogy a közeg pH-értéke 7,0 és 7,5 közötti tartományban van, és a közeg az aGST immunológiai aktivitásának veszteségét hatékonyan gátolja.
A találmány szerinti stabilizáló közeg (szer) felhasználható vizeletminták tárolására -20 °C körüli hőmérsékleteken az immunreakciókészség (immunreaktivitás) vesztesége nélkül. Úgy találtuk azonban, hogy a találmány szerinti stabilizáló közeg (szer) akkor is növeli (javítja) az immunreaktivitást, ha friss vizelethez adjuk, és a mérés előtt két óráig terjedő időtartamon át 2-8 °C hőmérsékleten átmenetileg tároljuk.
Az enzimtől (aGST) eltérő protein előnyösen valamilyen albumin.
Az albumin valamilyen albumin és hidrolizált albumin keveréke lehet. Erre megfelelő, hidrolizált albumin a hidrolizált zselatin. Ilyen zselatinhidrolizátumok a kereskedelmi forgalomban például a Sigma Chemicals cégtől szerezhetők be (Code G-0262, enzimesen kialakított).
Különösen előnyös (nem-hidrolizált) albumin egy szérumalbumin, különösen a szarvasmarha-szérumalbumin (röviden: BSA).
Szérumalbumin és hidrolizált albumin előnyös keveréke egyenlő mennyiségű (tömeg/térfogatban mért) szarvasmarha-szérumalbumin és zselatinhidrolizátum keveréke.
Az enzimtől eltérő jellegű protein koncentrációja célszerűen 5-15 tömeg/térf.%, különösen 10 tömeg/térf.% körül van.
A kelátképző szer célszerűen az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) alkálifémsója.
A stabilizáló közeg sókoncentrációja célszerűen 4-5 tömeg/térf.% tartományban van. Különösen alkalmas sók az alkálífémsók, még előnyösebb a nátrium-klorid.
Valamilyen só, például nátrium-klorid hozzáadása elősegíti az albumin és/vagy albuminhidrolizátum vagy más felhasznált enzimtől eltérő proteinek, vagy a megkívánt stabilizáló sajátságokkal rendelkező proteinek oldódását.
Jóllehet nem óhajtjuk magunkat elméleti magyarázathoz kötni, véleményünk szerint a só szerepe a mérés „háttérzajának”, azaz a nemspecifikus kötésnek a csökkentése lehet.
A stabilizáló közeg célszerűen proteáz-gátló anyagot is tartalmaz. Előnyös proteáz-gátló valamilyen tripszin-inhibitor, például az aprotinin.
A puffer célszerűen ikerionos jellegű szer, amelyet N. E. Good és S. Izawa írtak le [Methods in Enzymol. 24., Part B, 53 (1972)]. Különösen alkalmas pufferoldat a 7,3 pHértékű HEPES.
A találmány szerinti stabilizáló közeg további adalékanyagokat, például különböző antimikrobiális hatású anyagokat vagy tartósítószereket tartalmazhat.
Alkalmas tartósítószer például a nátrium-azid, valamint a tiomerszál vagy tiomeroszál néven ismert, merkuro-tiolát-csoportot tartalmazó tartósítószerek.
A találmány szerinti stabilizáló közeget a tárolás előtt olyan vizeletmintával keverjük, amelynek aGST aktivitását -20 °C hőmérsékleten adott időn át végzett tárolása után kell meghatároznunk.
A találmány továbbá eljárást tesz lehetővé aGST kvantitatív meghatározására vizeletben. Ez az eljárás abban áll, hogy egy vizeletmintát - amelyet egy fentiekben meghatározott stabilizáló közeggel előkezeltünk - antiaGST IgG szolubilizálatlan alakjával érintkeztetünk, és meghatározzuk az anti-aGST IgG-hez kötött aGST mennyiségét úgy, hogy az enzimmel jelzett anti-aGST IgG-val a kötött aGST-t érintkeztetjük, majd az enzim jelzésének aktivitását megmérjük.
A találmány szerinti stabilizáló közeg lehetővé teszi a vizeleti aGST immunmeghatározásában olyan érzékenység elérését, amely szoros korrelációban van egy immunmeghatározás érzékenységével, amelyet a technika jelenlegi állása szerint friss vizeletmintákkal végzünk. Ellentét• ···· ·· · • · · · ··· · ben azzal a szituációval, amidőn vizeletmintákat -20 °C hőmérsékleten stabilizáló közeg nélkül tárolunk, az ilyen mintákat a találmány szerinti stabilizáló közeg jelenlétében tárolva az immunreaktivitásban lényegében nem lép fel veszteség. Ezt az alábbi példákkal igazoljuk.
Előnyös enzimjelző valamilyen peroxidáz, különösen a torma-peroxidáz (röviden: HRP).
Egy másik, előnyös peroxidáz-konjugátum egy biotinilezett avidin- (így sztreptavidin-)-peroxidáz komplex, amely egy antitest-biotin konjugátummal együtt felhasználható a szokásos módon az enzimmeghatározás érzékenységének növelésére. Egy ilyen, enzimes mérés során a szilárd fázisú antitesten szolubilizálatlanná tett (nemszolubilizált) antigén az antitest-biotin konjugátumhoz kapcsolódik - amely viszont a biotinilezett avidin/szreptavidin-peroxidáz komplexhez kötődik - és ezt követően a peroxidáz aktivitását mérjük.
Továbbá előnyös, ha az anti-aGST IgG-HRP konjugátum - amelyet az enzimes immunmeghatározásban alkalmazunk - stabilis, folyékony alakban, stabilizáló közegben van jelen, amely citokróm c és a stabilizáló mennyiségét, valamint szérumalbumin stabilizáló mennyiségét, továbbá felületaktív szert (nedvesítőszert), valamilyen poliolt és valamilyen puffért tartalmaz úgy, hogy a közeg pHé.rtéke 6,5 körüli, és a poliol végső koncentrációja 5-15 térf./térf.% tartományban van.
A citokróm c mennyisége előnyösen 0,02-2 tömeg/ /térf.%. Míg a citokróm c koncentrációja a stabilizálás lényeges befolyásolása nélkül 2 tömeg/térf.% fölé emelhető, a koncentrációnak körülbelül 0,02 tömeg/térf.% alá csökkentése a puffer stabilizáló hatásának csökkenésével jár.
E leírásunkban citokróm c jelentésén olyan citokrómot értünk, amelyben a hem egység oldalláncai és a protein között kovalens kötések vannak.
A stabilizáló protein előnyösen valamilyen szérumalbumin, amelynek mennyisége 0,5-2 tömeg/térf.%.
Különösen alkalmas szérumalbumin a szarvasmarhaszérumalbumin (BSA). A BSA mennyisége a stabilizáló hatás lényeges érintése nélkül 2 tömeg/térf.% fölé növelhető - mint a citokróm c komponens esetén - ha azonban koncentrációját körülbelül 0,5 tömeg/térf.% alá csökkentjük, akkor a puffer stabilizáló hatása csökken.
A szérumalbumin további stabilizáló hatású proteinnel, például BSA-ban dús borjúmagzatszérummal kiegészíthető.
A felületaktív szer (nedvesítőszer) előnyösen nemionos nedvesítőszer, amilyenek például a zsírsavak poli(oxi-etilén)-észterei, poli(oxi-etilén)-szorbitán-észterek, poli(oxi-etilén)-alkoholok, poli(oxi-etilén)-izoalkoholok, poli(oxi-eti lén)-éterek, poli(oxi-etilén)-észterek, poli(oxi-etilén)-p-t-oktil-fenolok vagy oktil-fenil-(etilén-oxid) kondenzált termékei, az etilén-oxid zsíralkoholokkal alkotott kondenzált termékei, poli(oxi-etilén)-nonil-fenolok, poli-alkilén-glikolok keveréke vagy a fenti anyagok keverékei.
Különösen előnyös, nemionos felületaktív szerek például: a polietilén-szorbitán-észterek (kereskedelmi márkanevük „Tween”), különösen a poli(oxi-etilén)-szorbitán• · · * ·· « • · · ·· • · < « « · * · * · · ·
-monolaurát (Tween 20), valamint a Tween 60 és Tween 80; poli(oxi-etilén)-éterek (kereskedelmi márkanevük Triton, így Triton X100, Triton X114, Triton X110E és Triton N101, valamint Brij; továbbá oktil-fenil-etilén-oxid kondenzált terméke (kerekedelmi márkaneve Nonidet P40); zsíralkoholok etilén-oxiddal alkotott kondenzált termékei (kereskedelmi márkanevük Lubrol, különösen Lubrol PX); valamint 1 tömegrész polietilénglikol és 4 tömegrész polipropilénglikol keveréke (kereskedelmi márkaneve Synperonic F108).
Különösen alkalmas felületaktív szer a Synperonic F108.
A poliol a protein-protein kölcsönhatást stabilizálja. Erre alkalmas poliolok például a glükóz, glicerin, mannit, szorbit és szacharóz, vagy ezek valamilyen keveréke. Különösen előnyös poliol a glicerin, körülbelül 10 térf.% végső koncentrációban.
Különösen előnyöen alkalmazható puffer a foszfáttal pufferolt konyhasóoldat.
Az anti-aGST IgG-HRP konjugátumot stabilizáló közeg az enzim-konjugátum jellegétől függően más adalékokat is tartalmazhat, ilyenek például a különböző antimikrobiális hatóanyagok, tartósítószerek, proteáz-gátlók, protein-protein kölcsönhatásokat stabilizáló anyagok, antioxidánsok és szinezőszerek, amelyek segítik az azonosítást.
Célszerűen alkalmazható antimikrobiális hatóanyag a gentamicin.
Alkalmas tartósítószerek például a tiomerszál vagy • · « · · ·
- 10 tiomeroszál néven ismert merkuro-tiolát-csoportot tartalmazó tartósítószerek.
Használható proteáz-gátló például valamely tripszin-inhibitor, így az aprotinin.
Alkalmas szinezőszer a karminvörös.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.
A találmány megvalósításának legjobb módja az alábbi:
1. példa
Vizeleti (vizeletben lévő) aGST-t stabilizáló közeget - 7,3 pH-értékkel - állítunk elő a következő komponensekből:
Komponensek:
HEPES
Na2EDTA
NaCl
BSA
Zselatinhidrolizátum
Aprotinin
Tiomerszál
Nátrium-azid
0,5 M mM
4,5 % (tömeg/térf.) % tömeg/térf.) % (tömeg/térf.) pg/ml
0,01 % (tömeg/térf.) 0,05 % (tömeg/térf.)
Valamennyi fenti komponenst az ionmentesített víz végső térfogatának 80 %-ához adjuk, és a pH-t nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állítjuk. Ezután az oldatot ionmentesített vízzel végső térfogatáig töltjük. A BSA és a zselatinhidrolizátum hozzáadása során lényeges, hogy ezeket a komponenseket külön-külön adagoljuk, és gondoskodni kell arról, hogy az első
komponens teljesen feloldódjék, mielőtt a második komponenst hozzáadjuk.
Az így előállított stabilizáló közeget vizeletben lévő aGST stabilizálására úgy alkalmazzuk, hogy a közeg 1 részét adjuk 4 rész vizelethez (1/5 hígítás), a keveréket enyhén keverjük, és a mintát -20 °C hőmérsékleten fagyasztva tartjuk, vagy átmenetileg 2-8 °C hőmérsékleten tároljuk, ha a mérést legfeljebb két órán belül végezzük.
2. példa
Anti-aGST IgG-HRP konjugátumot stabilizáló, 6,5 pHértékű közeget állítunk elő az alábbi komponensekből.
Komponensek | ||
NaCl | 8,000 | g |
NaH2PO4.2H2O | 0,260 | g |
Na2HPO4.2H2O | 1,425 | g |
Citokróm c | 0,250 | g |
Synperonic F108 | 10,000 | g |
BSA | 10,000 | g |
Borhjúmagzatszérum | 25,000 | m |
Tiomerszál | 0,100 | g |
Gentamicin | 0,100 | g |
Karmin színezék | 0,930 | g |
Tömény sósav (a pH beállítására) változó | ||
lonmentesített víz | változó |
- ionmentesített vízzel 1000 ml-re feltöltve
Egy üvegedénybe 700 ml ionmentesített vizet öntünk, hozzáadjuk a nátrium-kloridot, nátrium-dihidrogén-foszfát• «·· · ·· » · · ·
- 12 -dihidrátot, dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot és a tiomerszált, majd a komponensek oldódásáig keverjük. Ezután az oldathoz adjuk a Synperonic F108 terméket, és addig keverjük, amíg a nedvesítőszer fel nem oldódik. Ekkor az oldat pH-értékét ellenőrizzük és 5 moláris sósavoldattal 6,5 pH-ra állítjuk. Ezután az oldathoz adjuk a BSA-t, és oldódni hagyjuk. Az így kapott elegyhez adjuk a borjúmagzatszérumot, és ismét ennek oldódásáig keverjük. Ezután állandó keverés mellett hozzáadjuk a gentamicint, citokróm c-t és a karmin színezéket, és addig keverjük, amíg teljesen fel nem oldódnak, ekkor a pH értékét ismételten ellenőrizzük, és szükség esetén 6,5-re állítjuk. A végső térfogatot 1000 ml-re egészítjük ki, majd az így kapott pufferoldatot 0,2 pm szűrőnyílású szűrőn szűrjük, s így tárolásra kész állapotban kapjuk. A felhasználás során 9 rész pufferoldatot adunk 1 rész glicerinhez.
3. példa
A 2. példában előállított stabilizáló közegben vizsgáltuk egy anti-aGST IgG-HRP konjugátum stabilitását (amelyet jelenleg liofilizált formában egy enzim-immunmeghatározó készletben hoz forgalomba a Biotrin International Limited cég Nephkit kereskedelmi néven). A Nephkit használatával megvalósítható egy eljárás aGST kvantitatív meghatározására vizeletben, amely a vesében a proximális tubulus károsodását jelezheti.
Ha a fenti konjugátumot 24 órán át szobahőmérsékleten a 2. példában előállított stabilizáló közegben tároltuk, akkor ··· · *» ······ • · · · · · ··· · ·· ·· ··
- 13 egy tízszeres koncentrátum stabilitását 100 %-os-nak találtuk.
4. példa
Az 1. példa szerinti stabilizáló közeg alkalmazása vizeleti aGST stabilizálására -20 °C hőmérsékleten végzett tárolás során
Kilenc vizeletmintát (férfiaktól és nőktől) vettünk, és haladéktalanul mértük az aGST mennyiségét egy enzim-immunmeghatározó készlettel, amelyet a Biotrin International Limited cég Nephrit kereskedelmi néven hoz forgalomba). Eredményeinket az 1. táblázat 2. oszlopában szemléltetjük.
Ezután a mintákat kettéosztottuk, és az egyik részéhez 1. példában előállított stabilizáló közeget adtunk [-20 °C (SM)], a másikhoz ilyen közeget nem adtunk (-20 °C ).
A mintákat 3 napon át -20 °C hőmérsékleten tartottuk, mad a Nephkit készlet segítségével végeztük a mérést.
Úgy találtuk, hogy a -20 °C hőmérsékleten, stabilizáló közegben tárolt mintákkal kapott értékek igen közel álltak az eredeti, 4 °C hőmérsékleten (frissen) nyert adatokhoz. Ezzel ellentétben a stabilizáló közeg nélkül fagyasztott minták valamennyien a GST immunreaktivitás csökkenését mutatták. Amint fentebb utaltunk rá, nagyon valószínű, hogy az immunreaktivitásnak ez a vesztesége a fagyasztással és felolvasztással előidézett denaturálódás következménye.
• · ·
- 14 1. táblázat
Tárolási hőmérséklet | |||
A minta száma | 4 °C | -20 °C [aGST] ng/ml | -20 °C (SM) |
1. | 2,62 | 0,58 | 3,01 |
2. | 2,63 | 0,81 | 2,93 |
3. | 0,44 | 0,00 | 0,71 |
4. | 8,54 | 3,64 | 8,43 |
5. | 1,40 | 0,43 | 2,15 |
6. | 3,30 | 0,95 | 4,43 |
7. | 4,12 | 0,93 | 4,29 |
8. | 1,80 | 0,43 | 2,13 |
9. | 4,31 | 0,50 | 4,88 |
SM jelentése: stabilizáló közeg
5. példa
Előre beállított, vizeleti aGST tartalmú minták stabilizálása
Két vizeletmintát (A és B) öt különböző aGST-szintre (10, 25, 50, 100 és 500 ng/ml koncentrációra) állítottunk be, majd az 1. példában előállított stabilizáló közeg jelenlétében 2 napon át 4 °C , illetve -20 °C hőmérsékleten tároltuk. Az eredményeket a 2. és 3. táblázatokban foglaltuk össze.
- 15 A 2. és 3. táblázatokból látható, hogy a stabilizáló közeg jelenléte megvédi az aGST-t immunológiai aktivitásának veszteségétől, és ez megkönnyíti a kimutatást az alkalmazott enzim immunmeghatározásban.
2. táblázat
Tárolási hőmérséklet | ||
Minta ng/ml | 4 °C [aGST] ng/ml | -20 °C (SM) |
A : 500 | 191,1 | 507,8 |
A : 100 | 57,22 | 103,2 |
A : 50 | 29,48 | 47,11 |
A : 25 | 15,35 | 25,9 |
A : 10 | 7,71 | 11,82 |
3. táblázat
Tárolási hőmérséklet | ||
Minta ng/ml | 4 °C [aGST] ng/ml | -20 °C (SM) |
B : 500 | 49,30 | 467,8 |
B : 100 | 37,30 | 88,95 |
B : 50 | 17,52 | 45,23 |
B : 25 | 8,63 | 21,12 |
B : 10 | 3,40 | 8,26 |
·« ·
- 16 6. példa
Két mintát - jelük C 200 és D 200 - készítettünk, amelyek 200 ng/ml aGST-t tartalmaztak, és mindegyik mintához az 1. példa szerinti stabilizáló közeget adtuk.
Ezt követően mindkét mintát kettéosztottuk, és 4 °C -on, illetve -20 °C-on tároltuk.
Kétnapos tárolás után mindegyik mintát különböző hígításokban (1/40 - 1/320) a Nephkit mérőkészlet segítségével meghatároztuk (a módszerre vonatkozólag lásd a 4. példát).
Kapott eredményeinket a 4. és 5. táblázatok tartalmazzák.
Látható a 4. és 5. táblázatok adataiból, hogy a minta hígítása az aGST meghatározását nem befolyásolja, és a -20 °C hőmérsékleten végzett tárolás meglepő módon kedvezőbb a 4 °C -on végzett tárolásnál.
4. táblázat
Tárolási hőmérséklet | ||
A minta jele | 4 °C [aGST] ng/ml | -20 °C (SM) |
C 200 (1/40) | 106 | 175 |
(1/80) | 109 | 185 |
(1/160) | 104 | 188 |
(1/320) | 111 | 180 |
* · · a • ♦ · *** * ··
- 17 5. táblázat
Tárolási hőmérséklet | ||
A minta ng/ml | 4 °C [aGST] ng/ml | -20 °C (SM) |
C 200 (1/40) | 141 | 183 |
(1/80) | 141 | 183 |
(1/160) | 134 | 180 |
(1/320) | 128 | 187 |
Claims (18)
- Szabadalmi igénypontok1. Vizeletben lévő α-glutation S transzferázt (aGST) stabilizáló közeg (szer), amely egy enzimtől eltérő protein, kelátképző (komplexképző) szer és puffer stabilizáló hatású mennyiségét tartalmazza úgy, hogy a közeg (szer) pH-értéke a 7,0-7,5 tartományban van, és a közeg (szer) az aGST immunológiai aktivitásában fellépő veszteséget hatékonyan gátolja.
- 2. Az 1. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol az enzimtől eltérő protein valamilyen albumin.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol az enzimtől eltérő protein valamilyen albumin és hidrolizált albumin keveréke.
- 4. A 3. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a keverék egy szérumalbumin és egy hidrolizált albumin keveréke.
- 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a keverék (tömeg/térfogat értékben számítva) egyenlő mennyiségű szarvasmarha-szérumalbumin és zselatinhidrolizátum keveréke.
- 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol az enzimtől eltérő protein koncentrációja 10 tömeg/térf. százalék nagyságrendű.
- 7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a kelátképző szer az etilén-diamin-tetraecetsav valamely alkálifémsója.* · Λ Λ *- 19
- 8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), amelynek sókoncentrációja 4-5 tömeg/ /térf. százalék tartományban van.
- 9. A 8. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a só valamilyen alkálifémsó.
- 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a só nátrium-klorid.
- 11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), amely proteáz-gátlót tartalmaz.
- 12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a puffer ikerionos puffer.
- 13. A 12. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a puffer HEPES.
- 14. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a puffer pH-értéke 7,3.
- 15. Eljárás α-GST kvantitatív meghatározására vizeletben, azzal jellemezve, hogy egy, az 1.-14. igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeggel (szerrel) előkezelt vizeletmintát anti-aGST IgG szolubilizálatlan alakjával érintkeztetünk, és meghatározzuk az anti-aGST IgG-hez kötött aGST mennyiségét úgy, hogy a kötött aGST-t enzimmel jelzett anti-aGST IgG-vel érintkeztetjük, majd az enzim-jelző aktivitását megmérjük.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezv e, hogy enzim-jelzőként valamilyen peroxidázt alkalmazunk.
- 17. A 15. agy 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy peroxidázként torma-peroxidázt alkalma··- 20 zunk.
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezv e, hogy az anti-aGST IgG-HRP-konjugátum folyékony, stabilis alakban olyan stabilizáló közegben (szerben) van jelen, amely citokróm c stabilizáló hatású mennyiségét, szérumalbumin stabilizáló mennyiségét, felületaktív szert (nedvesítőszert), valamilyen poliolt és valamilyen puffért tartalmaz úgy, hogy a közeg (szer) pH-értéke 6,5 nagyságrendű, és a poliol végső koncentrációja az 5-15 térf./térf. százalék tartományban van.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9901091A HUT78059A (hu) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/IE1994/000050 WO1996012191A1 (en) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | STABILISING MEDIUM FOR αGST IN URINE FOR USE IN AN ENZYME IMMUNOASSAY |
HU9901091A HUT78059A (hu) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT78059A true HUT78059A (hu) | 1999-07-28 |
Family
ID=11042488
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9901091A HUT78059A (hu) | 1994-10-17 | 1994-10-17 | Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6071706A (hu) |
EP (1) | EP0787300B1 (hu) |
JP (1) | JPH10507269A (hu) |
KR (1) | KR970706497A (hu) |
AU (1) | AU690144B2 (hu) |
CZ (1) | CZ289955B6 (hu) |
DE (1) | DE69415560T2 (hu) |
FI (1) | FI971580A (hu) |
HU (1) | HUT78059A (hu) |
NO (1) | NO971641D0 (hu) |
NZ (1) | NZ274245A (hu) |
PL (1) | PL176625B1 (hu) |
RU (1) | RU2142136C1 (hu) |
WO (1) | WO1996012191A1 (hu) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998029745A1 (fr) * | 1996-12-26 | 1998-07-09 | Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Agent pour traiter les echantillons d'urine |
US6977140B1 (en) | 1998-09-29 | 2005-12-20 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method for maintaining and/or restoring viability of organs |
US6492103B1 (en) | 2000-01-31 | 2002-12-10 | Organ Recovery Systems, Inc. | System for organ and tissue preservation and hypothermic blood substitution |
GB0023057D0 (en) | 2000-09-20 | 2000-11-01 | Randox Lab Ltd | Liquid reagent |
CN100434515C (zh) * | 2005-12-23 | 2008-11-19 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 酶复合稳定剂 |
EP2196803B1 (en) | 2007-09-27 | 2015-07-29 | Niigata University | Urine pretreatment agent for urinary protein determination, urine pretreatment method, and urinary protein determination method |
US20150104811A1 (en) * | 2011-08-11 | 2015-04-16 | Sei Sasaki | Method for pretreating biological sample containing protein |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4273756A (en) * | 1978-07-28 | 1981-06-16 | Abbott Laboratories | Immunoassay for class specific antibodies |
JPH025763A (ja) * | 1989-04-10 | 1990-01-10 | Kayaba Ind Co Ltd | 可変型油圧モータ |
US5278316A (en) * | 1989-06-29 | 1994-01-11 | Warner-Lambert Company | N-substituted cycloalkyl and polycycloalkyl alpha-substituted Trp-Phe- and phenethylamine derivatives |
JPH0425763A (ja) * | 1990-05-21 | 1992-01-29 | Maruko Seiyaku Kk | グルタチオンS―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬 |
US5264419A (en) * | 1990-08-31 | 1993-11-23 | Warner-Lambert Company | N-substituted cycloalkyl and polycycloalkyl α-substituted TRP derivatives |
US5217868A (en) * | 1992-05-01 | 1993-06-08 | Syncor Limited | Measurement of an enzyme marker as an aid to diagnosis of liver transplant rejection |
JP3029376B2 (ja) * | 1994-07-15 | 2000-04-04 | 株式会社東芝 | プライオリティエンコ−ダ |
US5817497A (en) * | 1996-11-26 | 1998-10-06 | Incyte Pharmaceuticals | Glutathione s-transferase |
US5874248A (en) * | 1997-08-21 | 1999-02-23 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Glutathione S-transferase homolog |
-
1994
- 1994-10-17 EP EP94929002A patent/EP0787300B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-17 RU RU97107455A patent/RU2142136C1/ru active
- 1994-10-17 US US08/817,696 patent/US6071706A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-17 KR KR1019970701871A patent/KR970706497A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-10-17 DE DE69415560T patent/DE69415560T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-17 AU AU78219/94A patent/AU690144B2/en not_active Ceased
- 1994-10-17 JP JP8513079A patent/JPH10507269A/ja active Pending
- 1994-10-17 CZ CZ19971173A patent/CZ289955B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-10-17 HU HU9901091A patent/HUT78059A/hu unknown
- 1994-10-17 WO PCT/IE1994/000050 patent/WO1996012191A1/en active IP Right Grant
-
1997
- 1997-04-10 NO NO971641A patent/NO971641D0/no not_active Application Discontinuation
- 1997-04-15 FI FI971580A patent/FI971580A/fi unknown
- 1997-04-17 NZ NZ274245A patent/NZ274245A/en unknown
- 1997-04-17 PL PL94319969A patent/PL176625B1/pl unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO971641L (no) | 1997-04-10 |
RU2142136C1 (ru) | 1999-11-27 |
CZ117397A3 (en) | 1997-09-17 |
DE69415560T2 (de) | 1999-06-24 |
CZ289955B6 (cs) | 2002-05-15 |
US6071706A (en) | 2000-06-06 |
KR970706497A (ko) | 1997-11-03 |
EP0787300A1 (en) | 1997-08-06 |
AU7821994A (en) | 1996-05-06 |
JPH10507269A (ja) | 1998-07-14 |
FI971580A0 (fi) | 1997-04-15 |
PL176625B1 (pl) | 1999-07-30 |
PL319969A1 (en) | 1997-09-01 |
AU690144B2 (en) | 1998-04-23 |
NZ274245A (en) | 1998-11-25 |
FI971580A (fi) | 1997-04-15 |
DE69415560D1 (de) | 1999-02-04 |
EP0787300B1 (en) | 1998-12-23 |
NO971641D0 (no) | 1997-04-10 |
WO1996012191A1 (en) | 1996-04-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5185291B2 (ja) | 血清あるいは血漿中のビタミンdの直接決定 | |
US4919889A (en) | Sample collection and transport fluid composition | |
US20060008854A1 (en) | Method of determining time of death | |
Klein et al. | Quantification of oxidized metallothionein in biological material by a Cd saturation method | |
HUT78059A (hu) | Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban | |
Pummer et al. | False positive prostate specific antigen values in the sera of women with renal cell carcinoma | |
Sundberg et al. | Quantitation of glutathione transferase-pi in the urine by radioimmunoassay | |
CN112979810B (zh) | Tag-72抗体-hrp稀释液及其应用 | |
WO2020066722A1 (ja) | ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法 | |
Geisert et al. | Characterization and proteolytic activity of a cathepsin L-like polypeptide in endometrium and uterine flushings of cycling, pregnant and steroid-treated ovariectomized gilts | |
JPH11166932A (ja) | ヒトヘモグロビンの安定化方法 | |
Lagunoff et al. | Inhibition of histamine release from rat mast cells by cytochalasin A and other sulfhydryl reagents | |
CA2202773A1 (en) | Stabilising medium for .alpha.gst in urine for use in an enzyme immunoassay | |
JPH09510090A (ja) | ヒト全血細胞溶解産物のプロテアーゼ活性の阻害 | |
JPH11218533A (ja) | ヘモグロビン試料の安定化 | |
Bredkjoer et al. | PreproVIP-derived peptides in the human female genital tract: expression and biological function | |
JP3337818B2 (ja) | 非特異的吸着防止剤 | |
JP2003194825A (ja) | ヘムタンパク質の安定化方法およびこれに用いる保存溶液 | |
US5385825A (en) | Composition for processing bodyfluids, method of processing bodyfluids and products made from bodyfluids | |
CN1164279A (zh) | 用于酶免疫测定检测尿中的αGST的稳定化介质 | |
WATANABE et al. | Immunohistochemical studies on thyroid peroxidase and thyroglobulin in 13 human thyroid tumors and 7 Graves' goiters | |
JP3028424B2 (ja) | ペルオキシダーゼの安定化法 | |
JPH09224942A (ja) | ヒトヘモグロビンの安定化方法 | |
JP2001249132A (ja) | ヘムタンパク質の安定化方法 | |
SHIKIMI et al. | Human urinary trypsin inhibitor (urinastatin)-like substance in mouse kidney and its relationships to mouse kidney kallikrein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |