HUT78059A - Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban - Google Patents

Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban Download PDF

Info

Publication number
HUT78059A
HUT78059A HU9901091A HU9901091A HUT78059A HU T78059 A HUT78059 A HU T78059A HU 9901091 A HU9901091 A HU 9901091A HU 9901091 A HU9901091 A HU 9901091A HU T78059 A HUT78059 A HU T78059A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
agent
medium
agst
stabilizing
stabilizing medium
Prior art date
Application number
HU9901091A
Other languages
English (en)
Inventor
John Martin Doyle
Cormac Gerard Kilty
Original Assignee
Biotrin Intellectual Properties Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotrin Intellectual Properties Limited filed Critical Biotrin Intellectual Properties Limited
Priority to HU9901091A priority Critical patent/HUT78059A/hu
Publication of HUT78059A publication Critical patent/HUT78059A/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány szerinti közeg különös előnye, hogy lehetővé teszi az aGST meghatározását vizeletben radioaktívan jelzett reagens alkalmazása nélkül.
*990109 1
KZtTÉTELI PuUttÁNY —
Képviselő:
Danubia Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft. Budapest
VIZELETBEN LÉVŐ α-GLUTATION S TRANSZFERÁZ ENZIMET STABILIZÁLÓ KÖZEG ALKALMAZÁSA ENZIM IMMUNMEGHATÁROZÁSBAN
BIOTRIN INTELLECTUAL PROPERTIES LIMITED,
Mount Merrion, County Dublin, Írország
Feltalálók:
DOYLE John Martin, Deansgrange, County Dublin KILTY Cormac Gerard, Sandycove, County Dublin
Írország
Aktaszám: 85461-7042-SZŐ-fa
A találmány tárgya: vizeletben lévő α-glutation S transzferáz (aGST) enzimet stabilizáló közeg; valamint e közeg (szer) alkalmazása aGST enzim immunmeghatározására.
A glutation transzferázok (GST enzimek) az emberi szövetekben nagyon különböző mennyiségekben találhatók. Ezek az enzimek három főcsoportba tartoznak, ezeket α, Π, és μ előjellel látják el. Ezen három főcsoportba tartozó enzimek sajátságai egészen különbözők.
Az aGST a vese proximális tubulusának környékén (a vesecsatorna bevezető részében) található, és egészséges egyénekben a vizeletbe szabadul fel, amint ezt enzim immunmeghatározással és „western biot” elemzéssel igazolták [J. A. H. Campbell és munkatársai: Cancer (Philadelphia) 67, 1608-1613 (1991)]. Bármely tényező, amely a proximális tubulust károsítja, előidézheti aGST felszabadulását a vizeletbe, s így a normális vizeleti szintek (koncentrációk) növekedését okozhatja. így tehát a vizeleti aGST szint növekedése a proximális tubulus károsodásának jele lehet [R. A. Sherman és munkatársai: Uremia Investigation 8, 111-115 (1985)]. Újabb kísérletek azt mutatták, hogy a ciszplatin által előidézett proximális tubulusi károsodás Wistar patkányokban a vizeleti aGST szintjének növekedésével és a szérum-kreatinin klirenszének csökkenésével jár együtt [M. Stojanov és munkatársai: Clin. Chem. 14. 1125 (1994)]; továbbá emberben az akut tubuláris nekrózis (elhalás), és veseátültetés kudarca mind az α-, mind a flGST szintek gyors növekedését idézi elő [A. G. M. Sundberg és munkatársai: Nephron 67. 308-316 (1994)].
Igen előnyös az a lehetőség, hogy a vizeletet testfolyadékok mintájaként alkalmazzák olyan enzim kimutatására és meghatározására, amely a vese károsodását, és különösen a vese egy adott tájékának a károsodását jelzi; különösen azért, mert ez szükségtelenné teszi a szervezet mintájának invazív (bemetszéses) gyűjtését. A kivánalom általában az aGST mérése olyan egyénekben, akik súlyos betegek, és ezért bármilyen szükségtelen beavatkozás minimálissá tétele nagyon ajánlatos.
Az aGST vizeletben végzett mérésére hagyományosan radioimmunmeghatározást alkalmaztak a radioaktívan jelzett anyag (röviden: radio-jelzett anyag) alkalmazásának velejáró hátrányaival.
Gyakran előfordul, hogy a vízeleti aGST szükséges mérése tekintélyes időn át, például napokig nem végezhető el a mintaavétel után. Ennek megfelelően gyakran szükséges a vizeletmintát igen alacsony hőmérsékleten, általában körülbelül -20 °C hőmérsékleten tárolni. Megfigyelték azonban, hogy a vizeleti aGST-nek ilyen alacsony hőmérsékleten végzett tárolása az immunreakcíókészségben veszteséget okoz, s így bármely immunmeghatározás érzékenysége csekéllyé válik. Az immunreakciókészségnek ez a vesztesége nagyon valószínűen a fagyasztás és a felolvasztás során bekövetkező denaturálódás következménye.
Ennek megfelelően fennáll az igény olyan közegre (szerre), amely lehetővé teszi a vizeleti aGST tárolását vizeletben -20 °C körüli hőmérsékleteken az aGST immunreakcíókészségének lényeges vesztesége nélkül olyan immunmeghatározásban, amelyet az aGST kimutatására alkalmaznak, ha ez szükséges.
Találmányunkat az alábbiakban részletesen ismertetjük.
A találmány révén lehetővé válik közeg (szer) kialakítása aGST stabilizálására vizeletben, amely egy enzimtől eltérő fehérje, kelátozószer (komplexképző szer) és valamely puffer stabilizáló hatású mennyiségét tartalmazza olyan módon, hogy a közeg pH-értéke 7,0 és 7,5 közötti tartományban van, és a közeg az aGST immunológiai aktivitásának veszteségét hatékonyan gátolja.
A találmány szerinti stabilizáló közeg (szer) felhasználható vizeletminták tárolására -20 °C körüli hőmérsékleteken az immunreakciókészség (immunreaktivitás) vesztesége nélkül. Úgy találtuk azonban, hogy a találmány szerinti stabilizáló közeg (szer) akkor is növeli (javítja) az immunreaktivitást, ha friss vizelethez adjuk, és a mérés előtt két óráig terjedő időtartamon át 2-8 °C hőmérsékleten átmenetileg tároljuk.
Az enzimtől (aGST) eltérő protein előnyösen valamilyen albumin.
Az albumin valamilyen albumin és hidrolizált albumin keveréke lehet. Erre megfelelő, hidrolizált albumin a hidrolizált zselatin. Ilyen zselatinhidrolizátumok a kereskedelmi forgalomban például a Sigma Chemicals cégtől szerezhetők be (Code G-0262, enzimesen kialakított).
Különösen előnyös (nem-hidrolizált) albumin egy szérumalbumin, különösen a szarvasmarha-szérumalbumin (röviden: BSA).
Szérumalbumin és hidrolizált albumin előnyös keveréke egyenlő mennyiségű (tömeg/térfogatban mért) szarvasmarha-szérumalbumin és zselatinhidrolizátum keveréke.
Az enzimtől eltérő jellegű protein koncentrációja célszerűen 5-15 tömeg/térf.%, különösen 10 tömeg/térf.% körül van.
A kelátképző szer célszerűen az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) alkálifémsója.
A stabilizáló közeg sókoncentrációja célszerűen 4-5 tömeg/térf.% tartományban van. Különösen alkalmas sók az alkálífémsók, még előnyösebb a nátrium-klorid.
Valamilyen só, például nátrium-klorid hozzáadása elősegíti az albumin és/vagy albuminhidrolizátum vagy más felhasznált enzimtől eltérő proteinek, vagy a megkívánt stabilizáló sajátságokkal rendelkező proteinek oldódását.
Jóllehet nem óhajtjuk magunkat elméleti magyarázathoz kötni, véleményünk szerint a só szerepe a mérés „háttérzajának”, azaz a nemspecifikus kötésnek a csökkentése lehet.
A stabilizáló közeg célszerűen proteáz-gátló anyagot is tartalmaz. Előnyös proteáz-gátló valamilyen tripszin-inhibitor, például az aprotinin.
A puffer célszerűen ikerionos jellegű szer, amelyet N. E. Good és S. Izawa írtak le [Methods in Enzymol. 24., Part B, 53 (1972)]. Különösen alkalmas pufferoldat a 7,3 pHértékű HEPES.
A találmány szerinti stabilizáló közeg további adalékanyagokat, például különböző antimikrobiális hatású anyagokat vagy tartósítószereket tartalmazhat.
Alkalmas tartósítószer például a nátrium-azid, valamint a tiomerszál vagy tiomeroszál néven ismert, merkuro-tiolát-csoportot tartalmazó tartósítószerek.
A találmány szerinti stabilizáló közeget a tárolás előtt olyan vizeletmintával keverjük, amelynek aGST aktivitását -20 °C hőmérsékleten adott időn át végzett tárolása után kell meghatároznunk.
A találmány továbbá eljárást tesz lehetővé aGST kvantitatív meghatározására vizeletben. Ez az eljárás abban áll, hogy egy vizeletmintát - amelyet egy fentiekben meghatározott stabilizáló közeggel előkezeltünk - antiaGST IgG szolubilizálatlan alakjával érintkeztetünk, és meghatározzuk az anti-aGST IgG-hez kötött aGST mennyiségét úgy, hogy az enzimmel jelzett anti-aGST IgG-val a kötött aGST-t érintkeztetjük, majd az enzim jelzésének aktivitását megmérjük.
A találmány szerinti stabilizáló közeg lehetővé teszi a vizeleti aGST immunmeghatározásában olyan érzékenység elérését, amely szoros korrelációban van egy immunmeghatározás érzékenységével, amelyet a technika jelenlegi állása szerint friss vizeletmintákkal végzünk. Ellentét• ···· ·· · • · · · ··· · ben azzal a szituációval, amidőn vizeletmintákat -20 °C hőmérsékleten stabilizáló közeg nélkül tárolunk, az ilyen mintákat a találmány szerinti stabilizáló közeg jelenlétében tárolva az immunreaktivitásban lényegében nem lép fel veszteség. Ezt az alábbi példákkal igazoljuk.
Előnyös enzimjelző valamilyen peroxidáz, különösen a torma-peroxidáz (röviden: HRP).
Egy másik, előnyös peroxidáz-konjugátum egy biotinilezett avidin- (így sztreptavidin-)-peroxidáz komplex, amely egy antitest-biotin konjugátummal együtt felhasználható a szokásos módon az enzimmeghatározás érzékenységének növelésére. Egy ilyen, enzimes mérés során a szilárd fázisú antitesten szolubilizálatlanná tett (nemszolubilizált) antigén az antitest-biotin konjugátumhoz kapcsolódik - amely viszont a biotinilezett avidin/szreptavidin-peroxidáz komplexhez kötődik - és ezt követően a peroxidáz aktivitását mérjük.
Továbbá előnyös, ha az anti-aGST IgG-HRP konjugátum - amelyet az enzimes immunmeghatározásban alkalmazunk - stabilis, folyékony alakban, stabilizáló közegben van jelen, amely citokróm c és a stabilizáló mennyiségét, valamint szérumalbumin stabilizáló mennyiségét, továbbá felületaktív szert (nedvesítőszert), valamilyen poliolt és valamilyen puffért tartalmaz úgy, hogy a közeg pHé.rtéke 6,5 körüli, és a poliol végső koncentrációja 5-15 térf./térf.% tartományban van.
A citokróm c mennyisége előnyösen 0,02-2 tömeg/ /térf.%. Míg a citokróm c koncentrációja a stabilizálás lényeges befolyásolása nélkül 2 tömeg/térf.% fölé emelhető, a koncentrációnak körülbelül 0,02 tömeg/térf.% alá csökkentése a puffer stabilizáló hatásának csökkenésével jár.
E leírásunkban citokróm c jelentésén olyan citokrómot értünk, amelyben a hem egység oldalláncai és a protein között kovalens kötések vannak.
A stabilizáló protein előnyösen valamilyen szérumalbumin, amelynek mennyisége 0,5-2 tömeg/térf.%.
Különösen alkalmas szérumalbumin a szarvasmarhaszérumalbumin (BSA). A BSA mennyisége a stabilizáló hatás lényeges érintése nélkül 2 tömeg/térf.% fölé növelhető - mint a citokróm c komponens esetén - ha azonban koncentrációját körülbelül 0,5 tömeg/térf.% alá csökkentjük, akkor a puffer stabilizáló hatása csökken.
A szérumalbumin további stabilizáló hatású proteinnel, például BSA-ban dús borjúmagzatszérummal kiegészíthető.
A felületaktív szer (nedvesítőszer) előnyösen nemionos nedvesítőszer, amilyenek például a zsírsavak poli(oxi-etilén)-észterei, poli(oxi-etilén)-szorbitán-észterek, poli(oxi-etilén)-alkoholok, poli(oxi-etilén)-izoalkoholok, poli(oxi-eti lén)-éterek, poli(oxi-etilén)-észterek, poli(oxi-etilén)-p-t-oktil-fenolok vagy oktil-fenil-(etilén-oxid) kondenzált termékei, az etilén-oxid zsíralkoholokkal alkotott kondenzált termékei, poli(oxi-etilén)-nonil-fenolok, poli-alkilén-glikolok keveréke vagy a fenti anyagok keverékei.
Különösen előnyös, nemionos felületaktív szerek például: a polietilén-szorbitán-észterek (kereskedelmi márkanevük „Tween”), különösen a poli(oxi-etilén)-szorbitán• · · * ·· « • · · ·· • · < « « · * · * · · ·
-monolaurát (Tween 20), valamint a Tween 60 és Tween 80; poli(oxi-etilén)-éterek (kereskedelmi márkanevük Triton, így Triton X100, Triton X114, Triton X110E és Triton N101, valamint Brij; továbbá oktil-fenil-etilén-oxid kondenzált terméke (kerekedelmi márkaneve Nonidet P40); zsíralkoholok etilén-oxiddal alkotott kondenzált termékei (kereskedelmi márkanevük Lubrol, különösen Lubrol PX); valamint 1 tömegrész polietilénglikol és 4 tömegrész polipropilénglikol keveréke (kereskedelmi márkaneve Synperonic F108).
Különösen alkalmas felületaktív szer a Synperonic F108.
A poliol a protein-protein kölcsönhatást stabilizálja. Erre alkalmas poliolok például a glükóz, glicerin, mannit, szorbit és szacharóz, vagy ezek valamilyen keveréke. Különösen előnyös poliol a glicerin, körülbelül 10 térf.% végső koncentrációban.
Különösen előnyöen alkalmazható puffer a foszfáttal pufferolt konyhasóoldat.
Az anti-aGST IgG-HRP konjugátumot stabilizáló közeg az enzim-konjugátum jellegétől függően más adalékokat is tartalmazhat, ilyenek például a különböző antimikrobiális hatóanyagok, tartósítószerek, proteáz-gátlók, protein-protein kölcsönhatásokat stabilizáló anyagok, antioxidánsok és szinezőszerek, amelyek segítik az azonosítást.
Célszerűen alkalmazható antimikrobiális hatóanyag a gentamicin.
Alkalmas tartósítószerek például a tiomerszál vagy • · « · · ·
- 10 tiomeroszál néven ismert merkuro-tiolát-csoportot tartalmazó tartósítószerek.
Használható proteáz-gátló például valamely tripszin-inhibitor, így az aprotinin.
Alkalmas szinezőszer a karminvörös.
A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.
A találmány megvalósításának legjobb módja az alábbi:
1. példa
Vizeleti (vizeletben lévő) aGST-t stabilizáló közeget - 7,3 pH-értékkel - állítunk elő a következő komponensekből:
Komponensek:
HEPES
Na2EDTA
NaCl
BSA
Zselatinhidrolizátum
Aprotinin
Tiomerszál
Nátrium-azid
0,5 M mM
4,5 % (tömeg/térf.) % tömeg/térf.) % (tömeg/térf.) pg/ml
0,01 % (tömeg/térf.) 0,05 % (tömeg/térf.)
Valamennyi fenti komponenst az ionmentesített víz végső térfogatának 80 %-ához adjuk, és a pH-t nátrium-hidroxiddal 7,3-ra állítjuk. Ezután az oldatot ionmentesített vízzel végső térfogatáig töltjük. A BSA és a zselatinhidrolizátum hozzáadása során lényeges, hogy ezeket a komponenseket külön-külön adagoljuk, és gondoskodni kell arról, hogy az első
komponens teljesen feloldódjék, mielőtt a második komponenst hozzáadjuk.
Az így előállított stabilizáló közeget vizeletben lévő aGST stabilizálására úgy alkalmazzuk, hogy a közeg 1 részét adjuk 4 rész vizelethez (1/5 hígítás), a keveréket enyhén keverjük, és a mintát -20 °C hőmérsékleten fagyasztva tartjuk, vagy átmenetileg 2-8 °C hőmérsékleten tároljuk, ha a mérést legfeljebb két órán belül végezzük.
2. példa
Anti-aGST IgG-HRP konjugátumot stabilizáló, 6,5 pHértékű közeget állítunk elő az alábbi komponensekből.
Komponensek
NaCl 8,000 g
NaH2PO4.2H2O 0,260 g
Na2HPO4.2H2O 1,425 g
Citokróm c 0,250 g
Synperonic F108 10,000 g
BSA 10,000 g
Borhjúmagzatszérum 25,000 m
Tiomerszál 0,100 g
Gentamicin 0,100 g
Karmin színezék 0,930 g
Tömény sósav (a pH beállítására) változó
lonmentesített víz változó
- ionmentesített vízzel 1000 ml-re feltöltve
Egy üvegedénybe 700 ml ionmentesített vizet öntünk, hozzáadjuk a nátrium-kloridot, nátrium-dihidrogén-foszfát• «·· · ·· » · · ·
- 12 -dihidrátot, dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot és a tiomerszált, majd a komponensek oldódásáig keverjük. Ezután az oldathoz adjuk a Synperonic F108 terméket, és addig keverjük, amíg a nedvesítőszer fel nem oldódik. Ekkor az oldat pH-értékét ellenőrizzük és 5 moláris sósavoldattal 6,5 pH-ra állítjuk. Ezután az oldathoz adjuk a BSA-t, és oldódni hagyjuk. Az így kapott elegyhez adjuk a borjúmagzatszérumot, és ismét ennek oldódásáig keverjük. Ezután állandó keverés mellett hozzáadjuk a gentamicint, citokróm c-t és a karmin színezéket, és addig keverjük, amíg teljesen fel nem oldódnak, ekkor a pH értékét ismételten ellenőrizzük, és szükség esetén 6,5-re állítjuk. A végső térfogatot 1000 ml-re egészítjük ki, majd az így kapott pufferoldatot 0,2 pm szűrőnyílású szűrőn szűrjük, s így tárolásra kész állapotban kapjuk. A felhasználás során 9 rész pufferoldatot adunk 1 rész glicerinhez.
3. példa
A 2. példában előállított stabilizáló közegben vizsgáltuk egy anti-aGST IgG-HRP konjugátum stabilitását (amelyet jelenleg liofilizált formában egy enzim-immunmeghatározó készletben hoz forgalomba a Biotrin International Limited cég Nephkit kereskedelmi néven). A Nephkit használatával megvalósítható egy eljárás aGST kvantitatív meghatározására vizeletben, amely a vesében a proximális tubulus károsodását jelezheti.
Ha a fenti konjugátumot 24 órán át szobahőmérsékleten a 2. példában előállított stabilizáló közegben tároltuk, akkor ··· · *» ······ • · · · · · ··· · ·· ·· ··
- 13 egy tízszeres koncentrátum stabilitását 100 %-os-nak találtuk.
4. példa
Az 1. példa szerinti stabilizáló közeg alkalmazása vizeleti aGST stabilizálására -20 °C hőmérsékleten végzett tárolás során
Kilenc vizeletmintát (férfiaktól és nőktől) vettünk, és haladéktalanul mértük az aGST mennyiségét egy enzim-immunmeghatározó készlettel, amelyet a Biotrin International Limited cég Nephrit kereskedelmi néven hoz forgalomba). Eredményeinket az 1. táblázat 2. oszlopában szemléltetjük.
Ezután a mintákat kettéosztottuk, és az egyik részéhez 1. példában előállított stabilizáló közeget adtunk [-20 °C (SM)], a másikhoz ilyen közeget nem adtunk (-20 °C ).
A mintákat 3 napon át -20 °C hőmérsékleten tartottuk, mad a Nephkit készlet segítségével végeztük a mérést.
Úgy találtuk, hogy a -20 °C hőmérsékleten, stabilizáló közegben tárolt mintákkal kapott értékek igen közel álltak az eredeti, 4 °C hőmérsékleten (frissen) nyert adatokhoz. Ezzel ellentétben a stabilizáló közeg nélkül fagyasztott minták valamennyien a GST immunreaktivitás csökkenését mutatták. Amint fentebb utaltunk rá, nagyon valószínű, hogy az immunreaktivitásnak ez a vesztesége a fagyasztással és felolvasztással előidézett denaturálódás következménye.
• · ·
- 14 1. táblázat
Tárolási hőmérséklet
A minta száma 4 °C -20 °C [aGST] ng/ml -20 °C (SM)
1. 2,62 0,58 3,01
2. 2,63 0,81 2,93
3. 0,44 0,00 0,71
4. 8,54 3,64 8,43
5. 1,40 0,43 2,15
6. 3,30 0,95 4,43
7. 4,12 0,93 4,29
8. 1,80 0,43 2,13
9. 4,31 0,50 4,88
SM jelentése: stabilizáló közeg
5. példa
Előre beállított, vizeleti aGST tartalmú minták stabilizálása
Két vizeletmintát (A és B) öt különböző aGST-szintre (10, 25, 50, 100 és 500 ng/ml koncentrációra) állítottunk be, majd az 1. példában előállított stabilizáló közeg jelenlétében 2 napon át 4 °C , illetve -20 °C hőmérsékleten tároltuk. Az eredményeket a 2. és 3. táblázatokban foglaltuk össze.
- 15 A 2. és 3. táblázatokból látható, hogy a stabilizáló közeg jelenléte megvédi az aGST-t immunológiai aktivitásának veszteségétől, és ez megkönnyíti a kimutatást az alkalmazott enzim immunmeghatározásban.
2. táblázat
Tárolási hőmérséklet
Minta ng/ml 4 °C [aGST] ng/ml -20 °C (SM)
A : 500 191,1 507,8
A : 100 57,22 103,2
A : 50 29,48 47,11
A : 25 15,35 25,9
A : 10 7,71 11,82
3. táblázat
Tárolási hőmérséklet
Minta ng/ml 4 °C [aGST] ng/ml -20 °C (SM)
B : 500 49,30 467,8
B : 100 37,30 88,95
B : 50 17,52 45,23
B : 25 8,63 21,12
B : 10 3,40 8,26
·« ·
- 16 6. példa
Két mintát - jelük C 200 és D 200 - készítettünk, amelyek 200 ng/ml aGST-t tartalmaztak, és mindegyik mintához az 1. példa szerinti stabilizáló közeget adtuk.
Ezt követően mindkét mintát kettéosztottuk, és 4 °C -on, illetve -20 °C-on tároltuk.
Kétnapos tárolás után mindegyik mintát különböző hígításokban (1/40 - 1/320) a Nephkit mérőkészlet segítségével meghatároztuk (a módszerre vonatkozólag lásd a 4. példát).
Kapott eredményeinket a 4. és 5. táblázatok tartalmazzák.
Látható a 4. és 5. táblázatok adataiból, hogy a minta hígítása az aGST meghatározását nem befolyásolja, és a -20 °C hőmérsékleten végzett tárolás meglepő módon kedvezőbb a 4 °C -on végzett tárolásnál.
4. táblázat
Tárolási hőmérséklet
A minta jele 4 °C [aGST] ng/ml -20 °C (SM)
C 200 (1/40) 106 175
(1/80) 109 185
(1/160) 104 188
(1/320) 111 180
* · · a • ♦ · *** * ··
- 17 5. táblázat
Tárolási hőmérséklet
A minta ng/ml 4 °C [aGST] ng/ml -20 °C (SM)
C 200 (1/40) 141 183
(1/80) 141 183
(1/160) 134 180
(1/320) 128 187

Claims (18)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Vizeletben lévő α-glutation S transzferázt (aGST) stabilizáló közeg (szer), amely egy enzimtől eltérő protein, kelátképző (komplexképző) szer és puffer stabilizáló hatású mennyiségét tartalmazza úgy, hogy a közeg (szer) pH-értéke a 7,0-7,5 tartományban van, és a közeg (szer) az aGST immunológiai aktivitásában fellépő veszteséget hatékonyan gátolja.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol az enzimtől eltérő protein valamilyen albumin.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol az enzimtől eltérő protein valamilyen albumin és hidrolizált albumin keveréke.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a keverék egy szérumalbumin és egy hidrolizált albumin keveréke.
  5. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a keverék (tömeg/térfogat értékben számítva) egyenlő mennyiségű szarvasmarha-szérumalbumin és zselatinhidrolizátum keveréke.
  6. 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol az enzimtől eltérő protein koncentrációja 10 tömeg/térf. százalék nagyságrendű.
  7. 7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a kelátképző szer az etilén-diamin-tetraecetsav valamely alkálifémsója.
    * · Λ Λ *
    - 19
  8. 8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), amelynek sókoncentrációja 4-5 tömeg/ /térf. százalék tartományban van.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a só valamilyen alkálifémsó.
  10. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a só nátrium-klorid.
  11. 11. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), amely proteáz-gátlót tartalmaz.
  12. 12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a puffer ikerionos puffer.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a puffer HEPES.
  14. 14. Az előző igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeg (szer), ahol a puffer pH-értéke 7,3.
  15. 15. Eljárás α-GST kvantitatív meghatározására vizeletben, azzal jellemezve, hogy egy, az 1.-14. igénypontok bármelyike szerinti stabilizáló közeggel (szerrel) előkezelt vizeletmintát anti-aGST IgG szolubilizálatlan alakjával érintkeztetünk, és meghatározzuk az anti-aGST IgG-hez kötött aGST mennyiségét úgy, hogy a kötött aGST-t enzimmel jelzett anti-aGST IgG-vel érintkeztetjük, majd az enzim-jelző aktivitását megmérjük.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezv e, hogy enzim-jelzőként valamilyen peroxidázt alkalmazunk.
  17. 17. A 15. agy 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy peroxidázként torma-peroxidázt alkalma··
    - 20 zunk.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezv e, hogy az anti-aGST IgG-HRP-konjugátum folyékony, stabilis alakban olyan stabilizáló közegben (szerben) van jelen, amely citokróm c stabilizáló hatású mennyiségét, szérumalbumin stabilizáló mennyiségét, felületaktív szert (nedvesítőszert), valamilyen poliolt és valamilyen puffért tartalmaz úgy, hogy a közeg (szer) pH-értéke 6,5 nagyságrendű, és a poliol végső koncentrációja az 5-15 térf./térf. százalék tartományban van.
HU9901091A 1994-10-17 1994-10-17 Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban HUT78059A (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9901091A HUT78059A (hu) 1994-10-17 1994-10-17 Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IE1994/000050 WO1996012191A1 (en) 1994-10-17 1994-10-17 STABILISING MEDIUM FOR αGST IN URINE FOR USE IN AN ENZYME IMMUNOASSAY
HU9901091A HUT78059A (hu) 1994-10-17 1994-10-17 Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT78059A true HUT78059A (hu) 1999-07-28

Family

ID=11042488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9901091A HUT78059A (hu) 1994-10-17 1994-10-17 Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban

Country Status (14)

Country Link
US (1) US6071706A (hu)
EP (1) EP0787300B1 (hu)
JP (1) JPH10507269A (hu)
KR (1) KR970706497A (hu)
AU (1) AU690144B2 (hu)
CZ (1) CZ289955B6 (hu)
DE (1) DE69415560T2 (hu)
FI (1) FI971580A (hu)
HU (1) HUT78059A (hu)
NO (1) NO971641D0 (hu)
NZ (1) NZ274245A (hu)
PL (1) PL176625B1 (hu)
RU (1) RU2142136C1 (hu)
WO (1) WO1996012191A1 (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029745A1 (fr) * 1996-12-26 1998-07-09 Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Agent pour traiter les echantillons d'urine
US6977140B1 (en) 1998-09-29 2005-12-20 Organ Recovery Systems, Inc. Method for maintaining and/or restoring viability of organs
US6492103B1 (en) 2000-01-31 2002-12-10 Organ Recovery Systems, Inc. System for organ and tissue preservation and hypothermic blood substitution
GB0023057D0 (en) 2000-09-20 2000-11-01 Randox Lab Ltd Liquid reagent
CN100434515C (zh) * 2005-12-23 2008-11-19 上海复星长征医学科学有限公司 酶复合稳定剂
EP2196803B1 (en) 2007-09-27 2015-07-29 Niigata University Urine pretreatment agent for urinary protein determination, urine pretreatment method, and urinary protein determination method
US20150104811A1 (en) * 2011-08-11 2015-04-16 Sei Sasaki Method for pretreating biological sample containing protein

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4273756A (en) * 1978-07-28 1981-06-16 Abbott Laboratories Immunoassay for class specific antibodies
JPH025763A (ja) * 1989-04-10 1990-01-10 Kayaba Ind Co Ltd 可変型油圧モータ
US5278316A (en) * 1989-06-29 1994-01-11 Warner-Lambert Company N-substituted cycloalkyl and polycycloalkyl alpha-substituted Trp-Phe- and phenethylamine derivatives
JPH0425763A (ja) * 1990-05-21 1992-01-29 Maruko Seiyaku Kk グルタチオンＳ―トランスフェラーゼπの定量方法および診断のための試薬
US5264419A (en) * 1990-08-31 1993-11-23 Warner-Lambert Company N-substituted cycloalkyl and polycycloalkyl α-substituted TRP derivatives
US5217868A (en) * 1992-05-01 1993-06-08 Syncor Limited Measurement of an enzyme marker as an aid to diagnosis of liver transplant rejection
JP3029376B2 (ja) * 1994-07-15 2000-04-04 株式会社東芝 プライオリティエンコ−ダ
US5817497A (en) * 1996-11-26 1998-10-06 Incyte Pharmaceuticals Glutathione s-transferase
US5874248A (en) * 1997-08-21 1999-02-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Glutathione S-transferase homolog

Also Published As

Publication number Publication date
NO971641L (no) 1997-04-10
RU2142136C1 (ru) 1999-11-27
CZ117397A3 (en) 1997-09-17
DE69415560T2 (de) 1999-06-24
CZ289955B6 (cs) 2002-05-15
US6071706A (en) 2000-06-06
KR970706497A (ko) 1997-11-03
EP0787300A1 (en) 1997-08-06
AU7821994A (en) 1996-05-06
JPH10507269A (ja) 1998-07-14
FI971580A0 (fi) 1997-04-15
PL176625B1 (pl) 1999-07-30
PL319969A1 (en) 1997-09-01
AU690144B2 (en) 1998-04-23
NZ274245A (en) 1998-11-25
FI971580A (fi) 1997-04-15
DE69415560D1 (de) 1999-02-04
EP0787300B1 (en) 1998-12-23
NO971641D0 (no) 1997-04-10
WO1996012191A1 (en) 1996-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5185291B2 (ja) 血清あるいは血漿中のビタミンｄの直接決定
US4919889A (en) Sample collection and transport fluid composition
US20060008854A1 (en) Method of determining time of death
Klein et al. Quantification of oxidized metallothionein in biological material by a Cd saturation method
HUT78059A (hu) Vizeletben lévő alfa-glutation S transzferáz enzimet stabilizáló közeg alkalmazása enzim immunmeghatározásban
Pummer et al. False positive prostate specific antigen values in the sera of women with renal cell carcinoma
Sundberg et al. Quantitation of glutathione transferase-pi in the urine by radioimmunoassay
CN112979810B (zh) Tag-72抗体-hrp稀释液及其应用
WO2020066722A1 (ja) ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法
Geisert et al. Characterization and proteolytic activity of a cathepsin L-like polypeptide in endometrium and uterine flushings of cycling, pregnant and steroid-treated ovariectomized gilts
JPH11166932A (ja) ヒトヘモグロビンの安定化方法
Lagunoff et al. Inhibition of histamine release from rat mast cells by cytochalasin A and other sulfhydryl reagents
CA2202773A1 (en) Stabilising medium for .alpha.gst in urine for use in an enzyme immunoassay
JPH09510090A (ja) ヒト全血細胞溶解産物のプロテアーゼ活性の阻害
JPH11218533A (ja) ヘモグロビン試料の安定化
Bredkjoer et al. PreproVIP-derived peptides in the human female genital tract: expression and biological function
JP3337818B2 (ja) 非特異的吸着防止剤
JP2003194825A (ja) ヘムタンパク質の安定化方法およびこれに用いる保存溶液
US5385825A (en) Composition for processing bodyfluids, method of processing bodyfluids and products made from bodyfluids
CN1164279A (zh) 用于酶免疫测定检测尿中的αGST的稳定化介质
WATANABE et al. Immunohistochemical studies on thyroid peroxidase and thyroglobulin in 13 human thyroid tumors and 7 Graves' goiters
JP3028424B2 (ja) ペルオキシダーゼの安定化法
JPH09224942A (ja) ヒトヘモグロビンの安定化方法
JP2001249132A (ja) ヘムタンパク質の安定化方法
SHIKIMI et al. Human urinary trypsin inhibitor (urinastatin)-like substance in mouse kidney and its relationships to mouse kidney kallikrein

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee