JPH10507269A - 酵素免疫分析に使用するための尿中のαＧＳＴの安定化用保存液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 尿中αＧＳＴのための安定化用保存液が、安定化する量の、牛血清アルブミンおよびゼラチン加水分解物の等量（ｗ／ｖ）混合物のような非−酵素蛋白質、キレート剤ならびに緩衝剤を含有し、その結果、保存液のｐＨが７．０〜７．５であり、αＧＳＴの免疫学的活性の損失を防止するのに有効である。この安定化用保存液は、このような安定化用保存液なしで貯蔵する尿試料で観察される種類のαＧＳＴ免疫反応性のどんな損失もなく、およそ−２０℃という温度で尿試料を貯蔵するのに使用できる。この安定化用保存液は、分析前最高２時間までの間２〜８℃で一時的に貯蔵する新たな尿に加えるときαＧＳＴの免疫反応性の改良もする。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素免疫分析に使用するための尿中のαＧＳＴの安定化用保存液 技術分野 本発明は、尿中のアルファグルタチオンＳトランスフェラーゼ（αＧＳＴ）の ための安定化用保存液（ｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）およびαＧＳ Ｔの酵素免疫分析におけるその保存液の使用に関する。背景技術 グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、ヒトの組織中で高度に変動す る量で見いだされる酵素である。これらの酵素は、α、πおよびμと呼ばれる三 種の主要な分類を形成する。これらの三種の酵素はその特性において全く異なる 。 αＧＳＴは腎臓の近位尿細管領域に見いだされ、正常個体の尿中に放出され、 これは酵素免疫分析およびウエスタンブロット分析により確認される［Ｃａｍｐ ｂｅｌｌ，Ｊ．Ａ．Ｈ等（１９９１年）Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉ ａ），６７，第１６０８頁〜第１６１３頁］。近位尿細管の損傷に陥ったいずれ の場合も尿中へのαＧＳＴの放出を引き起こし、正常尿値の増加をもたらす。し たがって、尿中αＧＳＴ値の上昇は近位尿細管の損傷の指標となり得る［Ｓｈｅ ｒｍａｎ，Ｒ．Ａ．等（１９８５年）Ｕｒｅｍｉａ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏ ｎ，８，第１１５頁〜第１１５頁］。最近の研究では、ウイスター系ラットのシ スプラチン誘導近位尿細管損傷が尿中αＧＳＴ活性のレベルを上昇させ且つ血清 クレアチニンクリアランスを減少させることと関連があり［Ｓｔｏｊａｎｏｖ， Ｍ．等（１９９４年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１４，第１１２５頁］、そしてヒ トの急性尿細管壊死および腎臓移植組織梗塞がαおよびπＧＳＴ双方のレベルの 急速な上昇をもたらすこと［Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｇ．Ｍ．等（１９９４年） Ｎｅｐｈｒｏｎ，６７，第３０８頁〜第３１６頁］が示されている。 腎臓の損傷、特に、腎臓の特定の領域の損傷を示す酵素の検出および決定のた めに体液の試料として尿が使用できることは利点である。このことの主な理由は 体の試料の侵入的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）採取が必要としないからである。一般に 、重篤な病気の患者のαＧＳＴを評価することが望まれ、そして不必要な損傷を できるだけ少なくすることが極めて望ましい。 従来、尿中のαＧＳＴを評価するためにラジオイムノアッセイが使用されてお り、放射性標識物質を使用することの付随的な欠点を伴っていた。 しばしば、試料を採取した後、例えば、数日のような妥当な時間で尿中αＧＳ Ｔの必要な評価を行うことが不可能である。したがって、しばしば、典型的には およそ−２０℃というような非常に低い温度で尿試料を貯蔵することが必要であ る。しかし、貯蔵時このような低い温度ではαＧＳＴが免疫反応性を損失し、し たがって、どのような免疫分析でも感度を低下させることが判明した。この免疫 反応性の損失は、ほとんど冷凍−解凍変性によるものと思われる。 したがって、必要なときに、αＧＳＴを検出するのに使用する免疫分析におい てαＧＳＴの免疫反応性の実質的な損失なしで、およそ−２０℃というような温 度で尿中のαＧＳＴを貯蔵することができる保存液に対する必要性がある。発明の開示 したがって、本発明は尿中のαＧＳＴのための安定化用保存液を提供するもの であり、当該保存液は安定化する量の非酵素蛋白質、キレート剤および緩衝剤を 含み、その結果、保存液が７．０〜７．５の範囲内のｐＨを有し、当該保存液は αＧＳＴの免疫学的活性の損失を防止するのに有効である。 本発明の安定化用保存液は、免疫反応性の損失が全くなくおよそ−２０℃とい うような温度で尿試料を貯蔵するのに使用できる。しかし、追加的に、本発明の 安定化用保存液は、分析前に最高２時間の間一時的に２〜８℃で貯蔵された新た な尿に加えるとき、免疫反応性を改良することが判明した。 好ましくは、非酵素（αＧＳＴ）蛋白質はアルブミンである。 このアルブミンはアルブミンと加水分解したアルブミンとの混合物であること ができる。適当な加水分解アルブミンは加水分解ゼラチンである。このようなゼ ラチン加水分解物は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（コードＧ−０ ２６２酵素処理により形成）から商業的に入手できる。 特に好適なアルブミン（加水分解されていないもの）は、血清アルブミン、特 に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である。 血清アルブミンと加水分解アルブミンとの好適な混合物は牛血清アルブミンと ゼラチン加水分解物との等量（ｗ／ｖ）混合物である。 非酵素蛋白質の濃度は５〜１５％ｗ／ｖの範囲内が適当であり、より具体的に はおよそ１０％ｗ／ｖである。 キレート剤はＥＤＴＡのアルカリ金属塩が適当である。 安定化用保存液は４〜５％ｗ／ｖの範囲内の塩濃度が適当である。特に、適当 な塩はアルカリ金属塩であり、ことに塩化ナトリウムである。 塩化ナトリウムのような塩の含有はアルブミンおよび／またはアルブミン加水 分解物あるいは使用するその他の非酵素蛋白質の溶解の助けとなり、それは必要 な安定化特性を有する。 本発明のいかなる理論的説明によっても束縛されることを望むものではないが 、塩が、分析の「バックグウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）」すなわち、非特異 的結合を減少させることにより機能できると思われる。 安定化用保存液は、プロテアーゼインヒビターを含有することも適当である。 好適なプロテアーゼインヒビターはアプロチニンのようなトリプシンインヒビタ ーである。 緩衝剤は、Ｎ．Ｅ．ＧｏｏｄおよびＳ．Ｉｚａｗａ（（１９７２年）Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４，パートＢ，第５３頁）により記載され ている種類の双性イオン性緩衝剤が適当である。特に適当な緩衝剤はｐＨ７．３ のＨＥＰＥＳである。 本発明の安定化用保存液はその他の添加剤、例えば、種々の抗微生物剤や防腐 剤も含むことができる。 適当な防腐剤にはナトリウムアジドおよびチオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓ ａｌ）もしくはチオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）としても知られてい るマーキュロチオレート（ｍｅｒｃｕｒｏｔｈｉｏｌａｔｅ）を含有する防腐剤 等がある。 本発明の安定化用保存液は貯蔵前に尿試料と混合し、一定時間で−２０℃で貯 蔵すした後、αＧＳＴの分析がされる。 本発明は、さらに尿中のαＧＳＴの定量法を提供し、当該方法は尿試料を不溶 化された形態の抗−αＧＳＴＩｇＧと接触させ（ここで、尿試料は上記で規定し た安定化用保存液で前処理してある）、抗−αＧＳＴＩｇＧに結合したαＧＳＴ の量を、この結合したαＧＳＴと酵素−標識化抗−αＧＳＴＩｇＧとを接触させ そして酵素標識の活性を測定することにより決定する。 当業界により採取したばかりの尿試料として呼ばれるものについて免疫分析が 行われる時に得られるものと密接に相関する尿中αＧＳＴの免疫分析の感度に、 本発明の安定化用保存液により達成できる。以下の実施例に示されているように 、本発明の安定化用保存液なしで−２０℃で尿試料が貯蔵された時の状態と対照 的に、本発明の安定化用保存液の存在下で同様の試料を貯蔵した後でも免疫反応 性に実質的な損失がない。 好適な酵素標識はペルオキシダーゼであり、特に、西洋ワサビペルオキシダー ゼである。 別の好適なペルオキシダーゼ複合体は、ビオチン処理したアビジン（ストレプ トアビジンを含む）−ペルオキシダーゼ複合体であり、この複合体は従来技術と 同様に抗体−ビオチン複合体と共に使用して酵素分析を増幅できる。このような 酵素分析では、固相抗体上に不溶化された抗原が抗体−ビオチン複合体に結合し 、次いでこの複合体がビオチン処理したアビジン／ストレプトアビジン−ペルオ キシダーゼ複合体に結合し、このときのペルオキシダーゼ活性を測定する。 さらに、好適には、酵素免疫分析に使用される抗−αＧＳＴＩｇＧ−ＨＲＰ− 複合体は安定化用保存液中で安定な液状であり、当該安定化用保存液は安定化す る量のチトクロームｃならびに安定化する量の血清アルブミン、界面活性剤、ポ リオールおよび緩衝剤を含み、およそ６．５のｐＨであり且つポリオールの最終 濃度は５〜１５％ｖ／ｖである。 チトクロームｃは０．０２〜２％ｗ／ｖの量で存在するのが好ましい。チトク ロームｃの濃度を、安定化に実質的に影響を与えないで２％ｗ／ｖを超えて増加 できるが、約０．０２％ｗ／ｖ未満の濃度に減少させると緩衝剤の安定化効果を 減少させる。 本明細書中でチトクロームｃという用語はヘム部の側鎖と蛋白質との間の共有 結合が存在するチトクロームを意味する。 安定化用蛋白質は血清アルブミンが好ましく、０．５〜２％ｗ／ｖの量で存在 する。 特に適当な血清アルブミンは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である。チトクロー ムｃ成分の場合と同様、ＢＳＡの量を安定化に実質的に影響を与えないで２％ｗ ／ｖを超えて増加できるが、この濃度を約０．５％ｗ／ｖ未満に減少させると緩 衝剤の安定化効果を減少させる。 血清アルブミンをさらに別の安定化用蛋白質、例えば、ＢＳＡに富む牛胎児血 清（ｆｏｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）により補足できる。 界面活性剤は、好ましくは、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキ シエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエ チレンイソアルコール、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエス テル、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフエノールもしくはオクチルフエ ニル−エチレンオキシド濃縮物、脂肪族アルコールとのエチレンオキシド濃縮物 、ポリオキシエチレンノニルフエノールおよびポリオキシアルケングリコール類 の混合物もしくはそれらの混合物から選択される非イオン性界面活性剤である。 特に好適な非イオン性界面活性剤には、商標Ｔｗｅｅｎという名で販売されて いるポリエチレンソルビタンエステル、特にモノラウリン酸ポリエチレンソルビ タン、すなわちＴｗｅｅｎ２０であるが、Ｔｗｅｅｎ６０およびＴｗｅｅｎ８０ でもよい；ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ１１４、ＴｒｉｔｏｎＸ１１ ０ＥおよびＴｒｉｔｏｎＮ１０１のような商標Ｔｒｉｔｏｎ並びにＢｒｉｊとい う名で販売されているポリオキシエチレンエーテル；商標ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０ という名で販売されているオクチルフエニル−エチレンオキシド濃縮物；商標Ｌ ｕｂｒｏｌ、特にＬｕｂｒｏｌＰＸという名で販売されている脂肪族アルコール のエチレンオキシド濃縮物；並びに商標Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０８という 名で販売されている１重量部のポリオキシエチレングリコールおよび４重量部の ポリプロピレングリコールの混合物等がある（Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｂｒ ｉｊ、Ｎｏｎｉｄｅｔ、ＬｕｂｒｏｌおよびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃはすべて商標 である）。 特に適当な界面活性剤はＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０８である。 ポリオールは蛋白質−蛋白質相互作用を安定化させる。適当なポリオールには 、グルコース、グリセリン、マンニトール、ソルビトールおよびスクロースまた はそれらの混合物がある。特に好適なポリオールは、最終濃度がおよそ１０％ｖ ／ｖのグリセリンである。 特に適当な緩衝剤は燐酸塩で緩衝化した食塩水である。 抗−αＧＳＴＩｇＧ−ＨＲＰ−複合体のための安定化用保存液は、酵素複合体 の種類に依存してその他の添加剤、例えば、種々の殺菌剤、防腐剤およびプロテ アーゼインヒビター、蛋白質−蛋白質相互作用を安定化する薬剤、抗酸化剤およ び確認を助ける着色剤等を含有できる。 適当な殺菌剤はゲンタマイシンである。 適当な防腐剤にはマーキュロチオレートを含有しチオメルサールもしくはチオ メロサールとしても知られている防腐剤がある。 適当なプロテアーゼインヒビターは、例えば、アプロチニンのようなトリプシ ンインヒビターである。 適当な着色剤はカーミン染料である。 本発明を下記の実施例によりさらに例証する。発明を実施するための最適な態様 実施例 １ 尿中αＧＳＴのためのｐＨ７．３の安定化用保存液を次の試薬から調製した。 上記の成分のすべてを最終容量の８０％の脱イオン水中に加え、ＮａＯＨでｐ Ｈを７．３に調節した。次いで、この溶液を脱イオン水で最終容量にした。ＢＳ Ａとゼラチン加水分解物の添加の場合には、これらを別々に加え、最初の成分が 完全に溶解してから確実に第二の成分を加えるように注意を払うことが重要であ る。 こうして調製した安定化用保存液を、この保存液１部を尿４部に加え（１／５ 希釈）、穏やかに混合し、−２０℃で試料を冷凍するかまたは分析前最高２時間 まで一時的に２〜８℃に貯蔵することにより尿中αＧＳＴを安定化するのに使用 される。 実施例 ２ 抗−αＧＳＴＩｇＧ−ＨＲＰ複合体のためのｐＨ６．５の安定化用保存液を次 の試薬から調製した。試薬 量 ＮａＣｌ ８．０００ｇ ＮａＨ₂ＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏ ０．２６０ｇ Ｎａ₂Ｈ₂ＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏ １．４２５ｇ チトクロームｃ ０．０２５ｇ Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０８ １０．０００ｇ ＢＳＡ １０．０００ｇ 牛胎児血清 ２５．０００ｍｌ チオメルサール ０．１００ｇ ゲンタマイシン ０．１００ｇ カーミン染料 ０．９３０ｇ 濃塩酸（ｐＨ調整用） 適量 脱イオン水 適量 脱イオン水で１０００ｍｌにする。 ガラス容器に７００ｍｌの脱イオン水を入れた。これにＮａＣｌ、ＮａＨ₂Ｐ Ｏ₄．２Ｈ₂Ｏ、Ｎａ₂Ｈ₂ＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏおよびチオメルサールを加え試薬が溶解 するまで撹拌した。次いで、この溶液にＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ Ｆ１０８を加え 、この界面活性剤が溶解するまで撹拌した。次いで、溶液のｐＨを調べ、５ＭＨ ＣｌでｐＨ６．５に調節した。次いで、得られた溶液にＢＳＡを加え、溶解させ た。次いで、これに牛胎児血清を加え、溶解するまでさらに撹拌した。次いで、 ゲンタマイシン、チトクロームｃおよびカルミン染料を加え、溶解するまでさら に撹拌した。ｐＨを再度調べ、必要に応じてｐＨ６．５に調節した。最終容量を １０００ｍｌに調節し、緩衝剤を０．２μｍのフイルターにより濾過し、貯蔵す る。使用の際、９部の緩衝剤を１部のグリセリンに加えた。 実施例 ３ 現在、商標Ｎｅｐｈｋｉｔの下でＢｉｏｔｒｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｌｉｍｉｔｅｄにより市場化されている酵素免疫分析用キットにおいて凍結 乾燥形態で提供されている抗−αＧＳＴＩｇＧ−ＨＲＰ複合体安定性を実施例２ で調製した安定化用保存液中で検討した。Ｎｅｐｈｋｉｔ分析は尿中のαＧＳＴ の定量決定法を提供し、腎臓の近位細尿管の損傷の指標であり得る。 実施例２で調製した安定化用保存液中で室温で２４時間前記複合体を貯蔵する とき１０倍濃度について１００％安定性が得られた。 実施例 ４ −２０℃における貯蔵の間に尿中αＧＳＴを安定化するための 実施例１の安定性用保存液の利用 ９個の尿試料（男性および女性）を得、直ちに商標Ｎｅｐｈｋｉｔの下でＢｉ ｏｔｒｉｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｍｏｕｎｔ Ｍｅ ｒｒｉｏｎ，Ｃｏｕｎｔｒｙ Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）により市場化さ れている酵素免疫分析用キットを使用してαＧＳＴについて分析した。結果を表 １の第２欄に示す。 次いで、試料を分割し、実施例１で調製した安定化用保存液を一方のロット （−２０℃（ＳＭ））に加え、他方（−２０℃）には加えなかった。 試料を三日間−２０℃に保持し、その後、試料をＮｅｐｈｋｉｔ分析を使用し て分析した。 安定化用保存液中に−２０℃で貯蔵した試料について得られた値は最初の４℃ （新鮮な）データと密接に相関したことが見いだされた。しかし、安定化用保存 液なしで冷凍した例はすべてαＧＳＴ免疫反応性の減少を示した。上で示したよ うな免疫反応性のこの損失は、凍結−解凍により引き起こされた変性によるもの と思われる。 実施例 ５ 尿中αＧＳＴ添加試料の安定性 二種の尿試料（ＡおよびＢ）を五種のレベルのαＧＳＴ（１０、２５、５０、 １００および５００ｎｇ／ｍｌ）に各々添加し、次いで、実施例１の安定化用保 存液の存在下で二日間４℃と−２０℃で貯蔵した。結果を表２および３に示す。 表２および３から、安定化用保存液の存在が免疫学的活性の損失に対してαＧ ＳＴを保護し、使用される酵素免疫分析における検出を促進することが観察され る。 実施例 ６ ２００ｎｇ／ｍｌのαＧＳＴを含有する二種類の試料（Ｃ２００およびＤ２０ ０と表示する）を調製し、実施例１の安定化用保存液を各試料に加えた。 次いで、この二試料を各々分割し、各場合の得られた分割試料を４℃および− ２０℃で貯蔵した。 二日間貯蔵後、各試料を実施例４で示したＮｅｐｈｋｉｔ分析法を使用して分 析希釈剤中で異なる希釈度（１／４０〜１／３２０）で分析した。 結果を表４および５に示す。 表４および５に示されたデータから、試料の希釈がαＧＳＴ決定に影響を与え ないこと並びに−２０℃における貯蔵が驚いたことに４℃で貯蔵したよりも優れ ていることが明らかとなる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．尿中のαＧＳＴのための安定化用保存液であって、安定化する量 の非酵素蛋白質、キレート剤および緩衝剤を含み、その結果、この保存液が７． ０〜７．５のｐＨを有し、αＧＳＴの免疫学的活性の損失を防止するのに有効で ある、前記安定化用保存液。 ２．非酵素蛋白質がアルブミンである、請求の範囲第１項に記載の安 定化用保存液。 ３．非酵素蛋白質がアルブミンと加水分解したアルブミンとの混合物 である、請求の範囲第１項または第２項に記載の安定化用保存液。 ４．前記混合物が血清アルブミンと加水分解アルブミンとの混合物で ある、請求の範囲第３項に記載の安定化用保存液。 ５．混合物が牛血清アルブミンとゼラチン加水分解物との等量（ｗ／ ｖ）混合物である請求の範囲第３項または第４項に記載の安定化用保存液。 ６．非酵素蛋白質の濃度がおよそ１０％ｗ／ｖである、請求の範囲第 １項〜第５項のいずれかに記載の安定化用保存液。 ７．キレート剤がＥＤＴＡのアルカリ金属塩である、請求の範囲第１ 項〜第６項のいずれかに記載の安定化用保存液。 ８．４〜５％ｗ／ｖの塩濃度がを有する、請求の範囲第１項〜第７項 のいずれかに記載の安定化用保存液。 ９．塩がアルカリ金属塩である、請求の範囲第８項に記載の安定化用 保存液。 １０．塩が塩化ナトリウムである、請求の範囲第８項または第９項に 記載の安定化用保存液。 １１．プロテアーゼインヒビターを含有する、請求の範囲第１項〜第 １０項のいずれかに記載の安定化用保存液。 １２．緩衝剤が双性イオン性緩衝剤である、請求の範囲第１項〜第１ １項のいずれかに記載の安定化用保存液。 １３．緩衝剤がＨＥＰＥＳである、請求の範囲第１２項に記載の安定 化用保存液。 １４．緩衝剤が７．３のｐＨである、請求の範囲第１項〜第１３項の いずれかに記載の安定化用保存液。 １５．尿中のαＧＳＴの定量的決定方法であって、尿試料と不溶化形 態の抗−αＧＳＴＩｇＧとを接触させ、ここで、尿試料は請求の範囲第１項〜第 １４項のいずれかに記載の安定化用保存液で前処理されており、抗−αＧＳＴＩ ｇＧに結合したαＧＳＴの量を結合αＧＳＴと酵素−標識抗−αＧＳＴＩｇＧと を接触させ、酵素標識の活性を測定することにより決定することを含む前記方法 。 １６．酵素標識がペルオキシダーゼである、請求の範囲第１５項に記 載の方法。 １７．ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求 の範囲第１５項または第１６項に記載の方法。 １８．抗−αＧＳＴＩｇＧ−ＨＲＰ−複合体が、安定化する量のチト クロームｃならびに安定化する量の血清アルブミン、界面活性剤、ポリオールお よび緩衝剤を含む安定化用保存液中で安定な液状であり、その結果、この保存液 がおよそ６．５のｐＨを有し、ポリオールの最終濃度が５〜１５％ｗ／ｖである 、請求の範囲第１７項に記載の方法。