HUT72063A

HUT72063A - Acylized amino-alkyl-imidazoles and -triazoles, pharmaceutical compositions containing them and process for producing them

Info

Publication number: HUT72063A
Application number: HU9501451A
Authority: HU
Inventors: Ingeborg Schuster; Helmut Egger
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1995-05-17
Publication date: 1996-03-28
Also published as: SK63595A3; GR3026505T3; NZ272129A; RU95107652A; CZ126595A3; DE69501915T2; NO951944D0; AU696880B2; IL113743A; FI952383A0; MY135559A; JPH0853422A; KR950032147A; NO304738B1; PE14896A1; CA2149459C; EP0683156A1; SI0683156T1; RU2152933C2; AU2008995A

Description

A találmány szerinti vegyületek szelektíven gátolják a

25-hidroxi-D₃-vitamin-hidroxiláz enzimeket, és felhasználhatók a D-vitaminra érzékeny szövetek differenciálódásával és ezen szövetek sejtéinek osztódásával összefüggő rendellenességek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények hatóanyagaiként.

60.637/BE ' S.B.G. & Κ.

Nemzetközi

Szabadalmi Iroda

H-lUtU Buuapest, Andrássy út 113.

Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323

KŐZZÉT^¹-’ pfetoANV

Acilezett amino-alkil-imidazolok és -triazolok

SANDOZ AG, BÁZEL, CH

Feltalálók:

dr. SCHUSTER Ingeborg, BECS, AT dr. EGGER Helmut, BECS, AT

A bejelentés napja: 1995. 05. 17.

Elsőbbsége:

1994. 05. 18. (9409882.9) GB • ·

- 2 A találmány tárgyát acilezett (amino-alkil)-imidazol- és -triazol-származékok képezik.

Részletesebben meghatározva, a találmányát tárgyát az (I) általános képletü vegyületek képezik szabad bázisként vagy só formájában, amelyek képletében

R]_ jelentése fenil-, naftil-, tienil- vagy piridil - csoport, és ez a négy helyettesítő csoport adott esetben monoszubsztituált lehet halogénatommal, alkoxi-, alkil-, dialkil-amino- vagy cianocsoporttal, és ebben az esetben

R₂ jelentése hidrogénatom; vagy

Rj_ jelentése hidrogénatom, és ebben az esetben

R₂ jelentése piridil- vagy 5-klór-2-piridil-csoport;

R₂ jelentése hidrogénatom, halogénatom, alkil-, ciano-, alkoxi-karbonil-, alkil-karbonil- vagy adott esetben helyettesített aminocsoport; és

X jelentése metincsoport (=CH-) vagy nitrogénatom, és ezeket a vegyúleteket ezt követően röviden a találmány szerinti vegyületek-nek nevezzük.

R-l_ jelentése előnyösen fenilcsoport; ha jelentése a fenilcsoporttól eltérő, az előnyösen hidrogénatom. R₂ jelentése előnyösen hidrogénatom. R₂ jelentése előnyösen halogénatom, és előnyösen a 4-es pozícióban helyezkedik el. Az X jelentése előnyösen metincsoport.

Ha jelentése hidrogénatomtól eltérő, előnyösen szubsztituálatlan. Ha R^_ jelentése fenilcsoport, előnyösen a 4-es pozícióban van szubsztituálva. Ha jelentése piridilcsoport, akkor előnyösen az 5-ös pozícióban szubsztituált.

• · · f ······*·

- 3 A halogénatom lehet fluor-, klór-, bróm- vagy jódatom, előnyösen klóratom. Az alkoxi- és/vagy alkilcsoportok és/vagy az alkil szubsztituensek a dialkil-amino-csoportban és/vagy az alkoxiesoport az alkoxi-karbonil- és/vagy az alkilcsoport az alkil-karbonil-csoportban előnyösen és egymástól függetlenül 1-4 szénatomosak, különösen 1 vagy 2 szénatomosak, előnyösen 1 szénatomosak lehetnek. Az adott esetben szubsztituált aminocsoport előnyösen szubsztituálatlan. Ha mégis szubsztituált, előnyösen diszubsztituált, előnyösen 1-4 szénatomos alkilcsoporttal .

A piridilcsoport előnyösen 2- vagy 4-piridil-csoport. A naftilcsoport előnyösen 1-naftil-csoport.

A találmány szerinti vegyületek egyik csoportját képezik az (Is) általános képletü vegyületek szabad bázis vagy só formájában, amely képletben ^Rls jelentése fenil-, halogénatommal monoszubsztituált fenilvagy 1-naftil-csoport, és ^R2s jelentése hidrogénatom; vagy ^Rls jelentése hidrogénatom, és

R_2g jelentése piridil- vagy 5-klőr-2-piridil-csoport; és

R_3s jelentése halogénatom vagy 1-4 szénatomos alkoxiesoport.

Az (Is) általános képletú vegyületek egyik alcsoportjában az R_3s jelentése klóratom. Egy másik alcsoportban a halogénatommal monoszubsztituált fenilcsoport jelentése klóratommal monoszubsztituált fenilcsoport, előnyösen a 4-es pozícióban. Egy további alcsoportban az R_ls jelentése fenil- vagy a 4-es pozícióban klóratommal monoszubsztituált fenilcsoport, R_2s je-

lentése hidrogénatom, és R_3g jelentése 4-es pozíciójú klóratom .

A találmány szerinti vegyületek egy másik csoportját képezik az (Ip) általános képletű vegyületek szabad bázis vagy só formájában, amely képletben

Rj_p jelentése adott esetben a 4-es pozícióban klóratommal monoszubsztituált fenilcsoport, és

R₂p jelentése hidrogénatom; vagy

Rj_p jelentése hidrogénatom, és

R₂p jelentése 5-klór-2-piridil-csoport; és

Xp jelentése CH-csoport vagy nitrogénatom; vagy

Rj_p jelentése 1-naftil-csoport,

R₂p jelentése hidrogénatom, és

Xp jelentése CH-csoport.

A találmány szerinti vegyületek előállíthatok az alábbi élj árasokkal:

a/ a megfelelő (II) általános képletű vegyületek acilezésével, amely képletben a szubsztituensek jelentése azonos a korábban megadottakkal, és az acilezés célja a megfelelő

4-karbonil-bifenil-csoport bevitele a molekulába; vagy b/ az (la) általános képletű vegyületek előállítása esetén, amely képletben R₃ és X jelentése azonos a korábban megadottakkal, és Rj_ jelentése — a hidrogénatom kivételével — azonos az Rj-re korábban megadottakkal, a megfelelő (III) vagy (Illa) általános képletű vegyületet, amely képletekben R-jj és R₃ jelentése azonos a korábban megadottakkal, a megfelelő (IV) általános képletű vegyület• · • · · · · · · · ·· · · «·· * ··

- 5 tel reagáltatjuk, amely képletben X jelentése azonos a korábban megadottakkal, és a kapott (I) általános képletű vegyületeket szabad bázis vagy só formájában elkülönítjük .

A találmány szerinti eljárást a szokásos módon lehet kivitelezni .

Az a/ reakcióváltozatot például oly módon lehet végrehajtani, hogy egy (II) általános képletű vegyületet a megfelelő savhalogeniddel egy oldószerben, például egy szerves vagy szervetlen bázisban — amely egyidejűleg savmegkötő ágensként is szerepel — például piridinben reagáltatunk, adott esetben az acilezést elősegítő reagens, például 4 -(dimetil-amino)-piridin hozzáadása mellett. Ez a reakció végrehajtható oly módon is, hogy egy (II) általános képletű vegyületet a megfelelő aktív észterrel, vagy más aktivált acil-származékkal, például vegyes anhidriddel vagy egy imidazoliddal reagáltatunk; ez utóbbi előállítható N,N-karbonil-diimidazol reagens segítségével. A reakció végrehajtható például a 2-piridil-tiol S-acil származékával, például az S-(2-piridil)-(4'-klór-bifenil-4-il)-karbotioáttal inért oldószerben, így egy karbonsav N,N-bisz-(rövid szénláncú alkil)-amidjában, például N,N-dimetil-formamidban, előnyösen szobahőmérsékleten.

A b/ eljárásváltozat szerint úgy járhatunk el, hogy egy (III) vagy (Illa) általános képletű vegyületet összekeverünk egy (IV) általános képletű vegyülettel, és az elegyet magasabb hőmérsékletre, például mintegy 120 °C-ra felhevítjük.

A kiindulási anyagok vagy ismertek vagy ismert módszerek*· ·

- 6 kel vagy ismert módszerekkel analóg módon előállíthatók, ahogyan azt itteni kiviteli példákban ismertetjük.

A (II) általános képletű vegyületeket például az [A] reakcióvázlat szerint lehet előállítani. Ebben a reakcióvázlatban az R₂' jelentése — a hidrogénatom kivételével — megegyezik a korábban az R₂ jelentésésre megadottakkal, Y jelentése halogénatom, előnyösen klóratom, és a többi szubsztituens jelentése megegyezik a korábban megadottakkal.

A (III) általános képletű kiindulási anyagokat például a következőképpen lehet előállítani. Egy (IX) általános képletű oxirán-származékot ammóniával reagáltatva egy (Vla) általános képletű vegyülethez jutunk, amelyet egy megfelelő 4'-szubsztituált-bifenil-4-karbonsav-származékkal acilezünk, és az ekkor keletkező (XI) általános képletű vegyületből gyűrűzárással kapjuk meg a kívánt (III) általános képletű kiindulási vegyületet. Az itt említett általános képletekben a szubsztituensek jelentése megegyezik a korábban megadottakkal.

A (Illa) általános képletű kiindulási anyagokat például egy megfelelő (VIII) általános képletű vegyület megfelelő acilezésével állíthatjuk elő.

Az (I) általános képletű vegyületekben az R-j_ vagy az R₂szubsztituenst hordozó szénatomok királisak, feltéve, hogy ezen szubsztituensek jelentése hidrogénatomtól különböző, és ennek megfelelően ezek a vegyületek lehetnek racemátok, tiszta enantiomerek [(R) és (S)] vagy azok keverékei. A találmány valamennyi sztereoizomerre és a racem keverékekre egyaránt vonatkozik. Az izomereket rezolválással vagy a szokásos techni « ···

- 7 kákkal, például kromatográfiával lehet elkülöníteni.

Az (I) általános képletű vegyületek tiszta enantiomerjei előnyösen úgy állíthatók elő, hogy az a/ és a b/ eljárásváltozatoknál a kiindulási vegyületek tiszta enantiomerjeit alkalmazzuk. A (VIII) vagy a (Illa) általános képletű vegyületeknek egy (IV) általános képletű vegyülettel végrehajtott reakciója során a tiszta enantiomer aziridinek konfigurációja ellentétesre változik, tehát az ellentétes konfigurációjú (Ilb) vagy (la) általános képletű vegyületek keletkeznek. Hasonlóképpen a (XI) általános képletű vegyületek átalakítása a (III) általános képletű vegyületekké, majd ezt követően az (la) általános képletű vegyületekhez vezető reakció során is ellentétesre változik a konfiguráció. A korábban ismertetett összes többi reakciólépésben azonban változatlan marad a konfiguráció. Ezért amennyiben tiszta enantiomerekből indulunk ki, a végtermékben az eredetivel ellentétes konfiguráció jelenik meg, ha olyan reakciólépést alkalmazunk, amely a királis centrum konfigurációját inverzióval megváltoztatja, ugyanakkor változatlan marad a végtermékben a konfiguráció, ha vagy az alkalmazott reakciólépés nem érinti a királis centrumot, vagy pedig két olyan reakciólépést végzünk egymás után, amelyek mindegyike inverziót okoz a királis centrumon.

Az egyes itt alkalmazott reakciólépéseket a szokásos módon lehet végrehajtani.

Egy találmány szerinti vegyület létezhet szabad bázisként vagy sókétn, például savaddíciós só formájában. Egy találmány szerinti, szabad bázisként létező vegyület átalakítható sóvá, • · · · · · • ··«· · · · • · · · · · · • · ·· ··· « ··

- 8 így savaddiciós sóvá, például hidrogénkloriddá vagy nitráttá a szokásos módon, és mindez fordítva is elvégezhető.

A leírás következő részében az alábbi rövidítéseket hasz-

náljuk:
26(OH)D3	25-hidroxi-D₃-vitamin
1,25 (OH)₂D3	1,25-dihidroxi-D₃-vitamin (kalcitriol)
24,25 (OH)₂D3	24,25-dihidroxi-D₃-vitamin
1,24,25(OH)₃D3	1,24,25-trihidroxi-D₃-vitamin
1,23,25(OH)₃D3	1,23,25-trihidroxi-D₃-vitamin
DMSO	dimetil-szulfoxid
EGF	epidermális növekedési faktor
FOS	borjú magzat szérum
HBSS	Hank-féle kiegyensúlyozott (fiziológiás)
	sóoldat
KGM	keratinocita táptalaj
	(Clonetics, San Diego, CA, USA)

Az itt következő példák a találmány bemutatására szolgálnak anélkül, hogy azt bármilyen tekintetben korlátoznák.

1. példa:

N-í(4'-Klór-bifenil-4-il)-karbonil]-1-(5-klőr-2-piridil)-2- (lH-imidazol-l-il) -1-amino-etán (a/eljárásváltozat)

0,44 g 1-amino-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán 1 ml N,N-dimetil-formamiddal készített oldatához hozzáadjuk 0,645 g S-(2-piridil)-(4'-klór-bifenil-4-il)-karbotioát 2 ml N,N-dimetil-formamiddal készített oldatát. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten, argongáz alatt 18 órán keresztül ke• · « ···· · ·· • · · · · · · ·· ·· ··· « «·

- 9 verjük. Ezután a reakcióelegyet hideg, telített nátrium-klorid-oldatba öntjük, és etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, nátrium-szulfát felett megszárítjuk, és az oldószert lepároljuk (A/ feldolgozási eljárásváltozat). A nyersterméket dietil-éterrel kezelve a címben megnevezett vegyületet kapjuk színtelen kristályok formájában.

Olvadáspont: 143 - 146 °C.

A kiindulási anyag optikailag tiszta enantiomerjét alkalmazva és a fentiek szerint eljárva a címben megnevezett vegyület optikailag tiszta enantiomerjeit kapjuk meg:

(+)-enantiomer: fajlagos forgatóképesség: = + 6,7° (c = 0,52,- metanol) olvadáspont: 175 - 186 °C;

(-)-enantiomer: fajlagos forgatóképesség: (β° = - 7,0° (c = 0,52; metanol) olvadáspont: 175 - 186 °C.

Az 1. példában leírtakkal analóg módon a következő (I) általános képletű vegyületeket állítottuk elő az a/ eljárásváltozat szerint, racém formában (X jelentése CH-csoport, jelentése hidrogénatom):

A példa száma R₂ R₃ olvadáspont °C

2	2-piridil-	4-C1	165-166
3	3-piridil-	4-C1	215-218
4	4-piridil-	4-C1	185-191
5	5-klór-2-piridil-	4-OC₂H₅	170-184
6	5-klór-2-piridil-	4-OC₂H₅	152-155

· ·

7. példa:

N-Γ(4'-Klőr-bifenil-4-il)-karbonil] -2(lH-imidazol-l-il)-2-(S)-fenil-l-amino-etán (a/ eljárásváltozat)

0,96 g nyers (S)-2-fenil-2-(lH-imidazol-1-il)-1-amino-1-etán 5 ml N,N-dimetil-formamiddal készített oldatát reagáltatjuk keverés közben 1 g S-(2-piridil)-(4'-klór-bifenil-4-il)-karbotioáttal. A reakciót 6 óra eltelte után megszakítjuk oly módon, hogy a reakcióelegyet 50 ml 0 °C-os hideg vízbe öntjük. A képződő csapadékot etil-acetáttal kiextraháljuk, a szerves fázist telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfát felett megszárítjuk és bepároljuk. A kristályos maradékot eldörzsöljük etanollal, a szilárd részt kiszűrjük, és a szűrőn hideg etanollal mossuk. Szárítás után kristályok formájában nyerjük a címben megnevezett vegyületet.

(c = 1,2; metanol).

A szűrletet bepárolva, és a maradékot szilikagélen kromatografálva [eluens: metilén-diklorid(metanol)heptán = 7:1:4] a címben megnevezett vegyület további mennyiségéhez jutunk tiszta formában.

A címben megnevezett vegyület (R-enantiomerjét analóg módon állíthatjuk elő a (R)-2-fenil-2-(lH-imidazol-l-il)-1-amino-etánból kiindulva.

Olvadáspont: 176 - 179 °C.

Fajlagos forgatóképesség: ja|= - 17,4° (c = 1,1; metanol).

8. példa :

Ν-[(4' -Klór-bifenil-4-il)-karbonil]-2-(ΙΗ-imidazol-l-il)-2(S)-fenil-l-amino-etán (b/ eljárásváltozat)

0,398 g N-[ (4'-klór-bifenil-4-il)-karbonil]-2-(R)-fenil-aziridint összekeverünk 0,15 g imidazollal, és a keveréket

110 °C-on hevítjük 16 órán keresztül. Lehűlés után a szilárd maradékot melegítés közben feloldjuk 1,5 ml N,N-dimetil-forma midban. Az oldatot azután jeges vízre öntjük. A szilárd csapadékot szívatással szűrjük, vízzel mossuk és megszárítjuk. Az anyagot szilikagélen kromatografálva tisztítjuk (eluens:

toluol/etanol = 8:1).

A címben megnevezett vegyületet fehér kristályokként kapjuk

Olvadáspont:

¹H-NMR-spektrum (DMSO) ppm: 8,82 (t, J = 5,3 Hz,

7,87 - 7,84 (m, 3H);

7,78 - 7,74 (m, 4H); 7,55 (d, J = 8,5 Hz,

2H); 7,41 - 7,30 (m,

Hz, 1H); 4,16 - 3,94 (m, 2H).

9. példa:

N-[(4'-Klór-bifenil-4-il)-karbonil]-2-(ΙΗ-imidazol-l-il)-2(R)-fenil-l-amino-etán (b/ eljárásváltozat)

380 mg 2-(4'-klór-bifenil-4-il)-5(S)-fenil-4,5-dihidro-oxazol és 775 mg imidazol keverékét 120 °C-on hevítjük 23 órán keresztül. A reakció termékéhez etil-acetátot és vizet adunk, majd a szerves fázist háromszor mossuk vízzel, megszá• · ·»♦ « ♦ · • · ♦ · · · · • · ·· ··· * »«

- 12 rítjuk magnézium-szulfát felett, és csökkentett nyomáson bekoncentráljuk. Toluol hozzáadása után a címben megnevezett terméket színtelen kristályokként nyerjük.

Olvadáspont: 176 - 179 °C.

Fajlagos forgatóképesség: ja= -17,4° (c = 1,1; metanol).

Az ^H-NMR-spektrum azonos volt az S (+)-enantiomerre a 8. példában megadottal.

A 8. példában leírtakkal analóg módon a következő (I) általános képletű vegyületeket állítottuk elő a b/ eljárásváltozat szerint racém formában:

Példa X R]_ R2 R3 Olvadáspont

10* CH 4-klór-fenil- H 4-C1 229 - 234 °C

CH 1-naftil- H 4-C1 227 - 230 °C * A 10. példában megadott vegyület 2(S)-enantiomerjét a

9. példában leírtakkal analóg módon állítottuk elő a megfelelő

4,5-dihidro-oxazolból; olvadáspontja: 197 - 204 °C; fajlagos forgatóképessége: 1,1° (c = 0,49; kloroform).

12. példa:

N-Γ(4'-Klőr-bifenil-4-il)-karbonill -2-(1H-imidazol-1-il)-2-fenil-l-amino-etán (a/ eljárásváltozat)

0,94 g l-amino-2-fenil-2-(lH-imidazol-l-il)-eánt acilezünk 0,17 g S-(2-piridil)-(4'-klór-bifenil-4-il)-karbotioáttal az 1. példában leírtakkal analóg módon. A nyerstermék szilikagélen végzett kromatográfiás tisztítása [eluens: metilén-diklorid (metanol ) ] vizes ammónia oldat/heptán 7:1:0,1:5) után színtelen kristályok formájában kapjuk a címben megnevezett vegyületet.

Olvadáspontja: 209 - 212 °C.

A kiindulási vegyületeket a következő módon lehet előállítani :

A/ 1-Amino-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán a/ 2-Acetil-5-klőr-piridin g 2-bróm-5-klór-piridin 560 ml száraz dietil-éterrel készített szuszpenziójához 179 ml butil-lítium-oldatot (hexánban oldott, 15 %-os) adunk -78 °C-on, argongáz atmoszférában olyan ütemben, hogy a hőmérséklet ne haladja meg a -72 °C-ot. Ezt követően azonnal hozzáadjuk 25,7 ml N,N-dimetil-acetamid száraz tetrahidrofuránnal készített oldatát. Az elegyet egy órán keresztül keverjük ugyanazon a hőmérsékleten, majd bontás céljából óvatosan 100 ml 3M sósavoldatot, ezt követően pedig 100 ml vizet adunk hozzá. Az 1. példában ismertetett A/ feldolgozási eljárásváltozat szerint feldolgozva a reakcióelegyet, és a terméket szilikagélen kromatografálva (eluens: tolul/etil-aetát 20:1) fehér tűk formájában kapjuk meg a várt vegyületet; olvadáspontja: 58 - 65 °C.

b/ 2-Bróm-acetil-5-klór-piridin-hidrobromid g 2-acetil-5-klór-piridin 150 ml 48 %-os vizes hidrogén-bromid-oldattal készített oldatához 4 ml bróm 40 ml hidro• · » · · · • « «·· · ·« * · · · · 4 « ·· «· ··« * «·

- 14 gén-bromid-oldattal készített oldatát adagoljuk cseppenként, keverés közben, 80 °C-on. Az elegyet további 3 órán keresztül keverjük 80 °C-on, majd az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot acetonnal eldörzsöljük, szívatással szűrjük, a szűrőn acetonnal mossuk, és csökkentett nyomáson megszárítjuk. A várt vegyület sárga kristályok alakjában keletkezik, melyet további tiszítás nélkül viszünk a következő reakciólépésbe.

c/ 2-[2'-(lH-Imidazol-l-il)-acetill-5—klór-piridin g 2-(bróm-acetil)-5-klór-piridin-hidrobromidot feloldunk 50 ml vízmentes metilén-dikloridban, hozzáadunk 9,7 g imidazolt, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 24 órán keresztül. Az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, és a maradékot szilikagélen kromatografáljuk [eluens: metilén-diklorid(metanol)heptán 7:1:4). A címben megnevezett vegyület krémszínű anyag; olvadáspontja: 122 - 129 °C.

d/ 1-(5-Klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán-l-ol

7,8 g 2-[2'-(ΙΗ-imidazol-l-il)-acetil] -5-klór-piridin 40 ml metanollal készített oldatához 0 °C-on, részletekben hozzáadunk 2,0 g nátrium-tetrahidro-borátot. Az elegyet egy órán keresztül keverjük 0 °C-on. A feldolgozás során az elegyet 1M sósavoldat óvatos adagolásával megbontjuk, közben az elegy hőmérsékletét 0 °C-on tartjuk, ezután pedig 1M nátrium-hidroxid-oldattal annak pH értékét 9-re állítjuk be. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot elkeverjük vízzel és metilén-dikloriddal, az elválasztott vizes fázist metilén-dikloriddal kétszer extraháljuk, az egyesített szerves • · « * « · • · ··· · ·· • · · · 4 · · ·« 44 ·4« 9 4« extraktokat telített nátirum-klorid-oldattal mossuk, megszárítjuk és bepároljuk. A vegyület krémszínű, szilárd anyag; olvadáspontja: > 210 °C (bomlás közben). Szilikagélen kromatografálva lehet tisztítani.

e/ 1-Klór-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán g 1-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán-l-ol-t feloldunk 2 ml toluolban, hozzá adunk 6 ml szulfinil-kloridot, és a reakcióelegyet 30 percen keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Az oldószert és a szulfinil-klorid feleslegét ledesztilláljuk, a maradékot felvesszük 2M nátrium-hidroxid-oldatban, az oldatot etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot nátrium-szulfát felett megszárítjuk és bepároljuk. A kívánt vegyület színtelen olajként marad vissza.

f/ 1-Azido-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán

0,92 g 1-klór-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etánt hozzáadunk 0,37 g lítium-azid 2 ml vízmentes N,N-dimetil-formamiddal készített oldatához argongáz alatt, és a reakcióelegyet 60 °C-on keverjük 18 órán keresztül. Az 1. példában megadott A/ feldolgozási eljárásváltozat szerint feldolgozzuk a reakcióelegyet, ekkor a kívánt vegyületet sárgás olaj formájában kapjuk meg.

g/ l-Amino-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-1-il)-etán

0,83 g 1-azido-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán 4 ml vízmentes pridinnel készített oldatát hidrogén16

-szulfid atmoszférában keverjük 3 órán keresztül. A reakcióelegyet bepároljuk, a maradékot feloldjuk 5 ml hígított ecetsavban (ecetsav/víz 1:4), és az oldatot etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat bepárolva a várt vegyület sárgás olajként marad vissza.

Az A/ pontban leírtakkal analóg módon állítottuk elő a következő (II) általános képletű kiindulási anyagokat, melyek mindegyike sárgás, viszkózus olaj, és valamennyit további tisztítás nélkül használtuk fel a következő reakciólépésben (a

képletben X atom minden	j elentése esetben):	=CH- csoport, és R¹ jelentése hidrogén
^R2	Olvadáspont
B		2-piridil-	olaj
C		3-piridil-	olaj
D		4-piridil-	olaj

E/ (S)-2-Fenil-2-(lH-imidazol-l-il)-1-amino-etán a/ (R)- 2-Amino-2 -fenil-etanol-0-szulfát-hidrogén-szulfát

10,65 g (R)(-)—2-amino-2-fenil-etanol 30 ml vízzel készített oldatát 48 %-os kénsavoldattal a metilvörös átcsapási pontjáig semlegesítjük (4,2 ml), majd ugyanolyan térfogatú kénsavat adunk az oldathoz. A vizet forgó bepárlóban 70-90 °C-on eltávolítjuk, majd 130 °C füdőhőmérséklet mellett 13,33 Pa (0,1 Torr) nyomás mellett állandó tömegű állapotig szárít- • · · · · t • · ·· t> · » · · ·« ··« · ··

- 17 juk. Az elegy fokozatosan megszilárdul; végül mozsárban összetörjük. Az anyagot további tisztítás nélkül vihetjük be a következő reakciőlépésbe.

b/ (R)(-)-2-Fenil-aziridin

16,2 g finoman elporított (R)-2-amino-2-fenil-etanol-0-szulfát-hidrogén-szulfátot adagolunk 0 °C-on 2M nátrium-hidroxid oldathoz keverés közben. Ezután a reakcióelegyet 3 órán keresztül 100 °C-on hevítjük. A feldolgozáshoz az elegyet lehűtjük szobahőmérsékletre, és dietil-éterrel négyszer extraháljuk. A szerves fázist telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, megszárítjuk magnézium-szulfáton és bepároljuk. A maradékot csökkentett nyomáson desztillálva a várt vegyületet színtelen olaj formájában nyerjük.

Forráspont: 46 °C (13,33 Pa = 0,1 Torr).

Fajlagos forgatóképesség: Jajp® = -46,7° (c = 1,09; etanol).

c/ (S)-2-Fenil-2-(lH-imidazol-l-il)-1-amino-etán

Az lg (R) (-)-2-fenil-aziridint és 1,14 g imidazolt 120 °C-on hevítünk 24 órán kereszült. Lehűlés után a reakcióelegyet további tisztítás nélkül továbbvihetjük az acilezési reakcióba. analitikai mintát szilikagélen végzett kromatografálással állítottunk elő.

⁴H-NMR-spektrum (CDC1₃) ppm: 7,66 (s, 1H), 7,41 - 7,31 (m, 3H) , 7,24 - 7,18 (m, 2H) , 7,11 (t, J = 1 Hz, 1H) , 7,03 (t, J = 1 Hz, 1H), 5,17 (m, 1H), 3,43 (m, 2H), 2,60 (s, b, 2H).

F/ Ν- Γ (4'-Klór-bifenil-4-il)-karbonil] -2-(R)-fenil-aziridin

0,232 g 4'-klór-4-karboxi-bifenil 3 ml vízmentes N,N-dimetil-formamiddal készített oldatához 0,18 g N,N'-karbonil-diimidazolt adunk keverés közben, szobahőmérsékleten, argongáz alatt. Egy óra eltelte után cseppenként beadjuk 0,12 g fenil-aziridin 0,5 ml vízmentes N,N-dimetil-formamiddal készített oldatát. A reakcióelegyet ezután 21 órán keresztül keverjük, majd az 1. példában leírtak szerint feldolgozzuk. A vegyületet halványsárga olaj formájában nyerjük, és további tisztítás nélkül visszük be a következő reakciólépésbe.

G/ 2-(4'-Klór-bifenil-4-il)-5(S)-fenil-4,5-dihidro-oxazol a/ 2-Amino-l(R)-fenil-etanol

15,8 g R(-)-fenil-oxiránt 150 ml etanolban lehűtünk -60 °C-ra, és hozzáadunk 75 ml ammóniát. A reakcióelegyet 70 órán keresztül keverjük szobahőmérsékleten, saválló acélból készült lezárt reaktorban. Az oldószert lepároljuk, a maradékhoz 300 ml vizet és 60 ml toluolt adunk. A vizes réteget elválasztjuk, és az oldószer eltávolítása után 14,14 g színtelen, szilárd anyag marad vissza, amely 86 % 2-amino-l(R)-fenil-etanolt, 9 % 2-amino-2-fenil-etanolt és 5 % 2-(2-hidroxi-2-fenil-etil-amino)-1-

-fenil-etanolt tartalmaz. (Az összetételt ¹H-NMR-spektroszkópiával állapítottuk meg). Az elegyet további tisztítás nélkül használjuk fel a következő reakciólépésben. Szilikagélen végzett kromatográfiával [eluens: metilén-diklorid(metanol)28 %os vizes ammónium-hidroxid-oldat - 100:10:1] analitikai mintát • · · · · * « ···· · · · • · · · · · · • · ·· *·· · · ·

- 19 nyertünk, olvadáspontja: 64,6 °C (szublimál); fajlagos forgatóképessége: }αί|ρθ = -44,3° (c = 2; etanol) .

^XH-NMR-spektrum (DMSO-dg) ppm: 7,37 - 7,22 (m, 5H), 4,44 (dd, J = 4,4, 7,7 Hz, 1H), 2,70/2,57 (ABX, J = 11,3, 4,4, 7,7

Hz, 2H), 2,60 (bs,3H).

b/ N-[2(R)-Hidroxi-2-fenil-etill -4'-klór-bifenil-4-karboxamid

1,2 g 4'-klór-4-karboxi-bifenil és 715 μΐ trietil-amin 20 ml száraz Ν,Ν-dimetil-formamiddal készített oldatát -20 °C-ra lehűtjük, és hozzáadunk 0,710 ml izobutil(klór-formiát)-ot. A reakcióelegyet további 20 percig keverjük és hozzáadjuk 955 mg nyers (74 %) 2-amino-l(R)-fenil-etanol 5 ml Ν,Ν-dimetil-formamiddal képezett oldatát. Az elegyet engedjük felmelegedni szobahőmérsékletre és 16 órán kereszült keverjük. A keletkezett csapadékos elegyet 100 ml jéghideg vízbe öntjük, a csapsdékot zsugorított üvegszűrön leszűrjük, és a szűrön háromszor vízzel és egyszer etanollal mossuk. Addig szárítjuk, amíg a tömege többé már nem változik. A termék halványsárga, kristályos anyag, olvadáspontja: 229,3 °C, fajlagos forgatóképessége:

Oi g° = -48,1° (c = 1,0; DMSO) .

^xH-NMR-spektrum (DMSO-dg) ppm: 8,62 (t, J = 5,6 Hz,

7,95/7,78/7,55 (3d, J = 8,5 Hz, 8H), 7,41 - 722 (m, 5H),

5,55 (d,

4,4 Hz, 1H), 4,81 (ddd, J = 4,4, 4,7,

8,1 Hz,

1H) , c/ 2 -(4'-Klór-bifenil-4-il)-5(S)-fenil-4,

5-dihidro-oxazol

1,24 g N-[2(R)-hidroxi-2-fenil-etil]-4'-klór-bifenil-4-

-karboxamid 20 ml piridinnel készített oldatát jeges fürdőben lehűtjük, és metilén-dikloridban oldott 921 mg metánszulfonsavanhidridet adunk hozzá. A reakcióelegyet további 16 órán keresztül keverjük 5 °C-on, majd etil-acetátot és telített, vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá. A szerves réteget elválasztjuk, megszárítjuk, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Szilikagélen végzett vákuum flash kromatográfiával történt tisztítás után (eluens: toluol/etil-acetát 3:1) a vegyületet halványsárga kristályok formájában kapjuk meg. Olvadáspontja: 121,5 °C (etanolból végzett átkristályosítás után); fajlagos forgatóképesség: | aj= +133,5° (c = 1,3; metanol).

¹H-NMR-spektrum (CDCI3) ppm: 8,09/7,63/7,56/7,43 (4d, J =

8,5 Hz, 8H), 7,44 - 7,36 (m, 5H), 5,68 (dd, J = 7,9, 10,1 Hz, 1H), 4,51/4,02 (ABX, J = 14,9, 10,1, 7,9 Hz, 2H).

H/ ( + )- és (-)-1-Amino-1-(5-klór-2-piridil)-2-(1H-imidazol-l-il)-etán a/ 1-Γ(IS)-Kamfanoill -amino-1-(5-klór-2-piridil)-2-(1H-imidazol-l-il)-etán

0,38 g 1-amino-l-(5-klór-2-piridil)-2-(lH-imidazol-l-il)-etán (racém vegyület, lásd korábban az A/ pontot) 4 ml vízmentes metilén-dikloriddal képezett oldatához 0,26 g (0,36 ml) trietil-amint adunk. Az elegyet keverés közben lehűtjük -79 °C-ra. Ezután hozzáadunk 0,44 g (IS)(-)-kamfanoil-kloridot olyan ütemben, hogy az elegy hőmérséklete ne lépje túl a -74 °C-ot. A keverést további hűtés nélkül még 90 percen át folytatjuk. A feldolgozásnál az elegyet jeges vízhez öntjük, metilén-dikloriddal háromszor extraháljuk, és az extraktumot teli• · « ♦ · · · · · · • · · · · · · ·· · ο · · · · · ·

- 21 tett nátrium-klorid-oldattal mossuk. Nátrium-szulfát felett megszárítjuk, és az oldószert lepároljuk. A két diasztereomer amid keverékét szilikagélen végzett kromatográfiával választjuk szét [eluens: metilén-diklorid(metanol)heptán 10:1:5]. Mindkét vegyület fehér, kristályos anyag,· a B diasztereomer olvadáspontja: 195 - 199 °C, az A diasztereomer olvadáspontja: 151 - 160 °C.

b/ (+)- és (-)-1-Amino-1-(5-klór-2-piridil)-2-(1H-imidazol-l-il)-etán

0,16 g kamfanoil-B-diasztereomert 0,8 ml 35 %-os perklórsavval hevítünk üveg autoklávban 120 °C-on 12 órán keresztül. Az elegyet hígítjuk 2 ml vízzel, extraháljuk etil-acetáttal (az extraktumot eldobjuk), és a vizes fázist 2M nátrium-hidroxid-oldattal meglúgosítjuk. Az így kapott oldatot háromszor extraháljuk etil-acetáttal, a szerves fázist magnézium-szulfáton megszárítjuk, és bepároljuk oldószermentesre. A maradékot szilikagélen kromatografáljuk [eluens: metilén-diklorid(metanol) heptán = 10:1:5 —> 7:1:4), ekkor a címben megnevezett vegyület (+)-enantiomerjét (B izomer) kapjuk meg halványsárga olaj ként.

¹H-NMR-spektrum (CDC1₃) ppm: 8,57 (d, J = 2,5 Hz, 1H),

7,61 (dd, J-l = 2,5, J₂ = 8,3 Hz, 1H) , 7,38 (s, 1H) , 7,13 (d, J=

8,3 Hz, 1H), 7,02 (s, 1H), 6,83 (s, 1H), 4,32 - 4,14 (m, 3H),

1,73 (s, b, 2H).

A címben megnevezett vegyület (-)-enantiomerjét (A izomer) analóg módon nyerhetjük a kamfanoil-A-diasztereomer hidrolízisével .

• ·

1/ l-Amino-2-fenil-2-(ΙΗ-imidazol-l-il)-etán

A vegyületet az E/c/ pontban leírtakkal analóg módon lehet előállítani 2-fenil-aziridinből. Szilikagélen végzett kromatográfia után [eluens: metilén-diklorid(metanol)vizes ammónia-oldat = 10:1:0,1] a címben megnevezett vegyületet színtelen, viszkózus olaj formájában nyerjük.

Az (I) általános képletú vegyületek szabad bázisként vagy gyógyszerészetileg elfogadható só formájában — amelyeket ezután röviden úgy említünk, hogy a találmány szerinti hatóanyagok — farmakológiai hatékonyságot mutatnak, ezért gyógyszerként történő alkalmazásuk javasolható. Ezek a hatóanyagok különösen erősen és szelektíven gátolják a 25-hidroxi-D₃-vitamin-hidroxilázokat, amelyek megtámadják a kalcitriol ^20-27 oldalláncát, ilyen enzim például a 25-hidroxi-D₃-vitamin-24-hidroxiláz, ezáltal képesek lebontani hormonálisán aktív D₃-vitamin-metabolitokat (például a kalcitriolt), miközben lényegesen gyengébben interféráinak magával a kalcitriol-szintézissel, amely viszont előfordul a 25-hidroxi-D₃-vitamin-1-hidroxiláz esetében.

A szelektív gátlást például a következő vizsgálati módszerekkel lehet meghatározni:

Az 1-hidroxiláz-aktivitás meghatározása:

A meghatározás közvetlenül történhet humán keratinocita összefüggő sejtkultúrán. Olyan esetben azonban, ha a C₂0-27 oldallánc lebontására képes hidroxilázokat is meg kívánjuk határozni, az összefüggő sejtkultúrát a mérés előtt 16 órával • · · · · · • « *·« * ·· • · · * · · ·· ·· ··· · ♦ · kezelni kell 1,25-dihidroxi-D₃-vitaminnal (lOnM), hogy ezeket az aktivitásokat indukáljuk. Mindkét módszert ismerteti az alábbi közlemény: D.D.Bikle et al. : J. Clin. Invest. 78 , 557 (1986) .

Keratinocita kultúrák:

A normál humán keratinocitákat mastectomia után nyert friss felnőtt bőrből izoláltuk, és steril körülmények között azonnal felhasználtuk. Az izolálás és a tenyésztés szérummentes körülmények között, tápréteg nélkül történt a Bikle és munkatársai által közölt leírás [Bikle et al.: Biochemistry, 25, 1545 1548 (1986)] módosított változata szerint. Ezeket a feltételeket abból a célból választottuk, hogy a szérum és/vagy a tápréteg által visszatartott D-vitamin metabolitok okozta bizonytalanságokat elkerüljük. Miután a felhámot az irhától steril dermatomával elválasztottuk, a felhámot (epidermis) 0,25 %-os tripszin-oldattal inkubáltuk 37 °C-on 45 percen keresztül. Ezután a sejteket lekapartuk, és 50 ml, 10 %-os FCS-t tartalmazó HBSS-hez adtuk azokat, hogy a tripszin okozta emésztést leállítsuk, végül az elegyet 2 percig centrifugáltuk 2000 fordulat/perc sebességgel. A keletkezett sejtüledéket KGM-ben felszuszpendáltuk, amely egy meghatározott szérummentes, alacsony kalcium-koncentrációjú (0,06 mM) tápoldat, amely 0,1 ng/ml EGF-et, 5 gg/ml inzulint, 0,5 Mg/ml hidrokortizont, marha agyalapi mirigy kivonatot és antibiotikumokat (gentamicin, amfotericin) tartalmaz; ez képezte a primer kultúrát. Inkubátorban 37 °C-on, karbogén-gáz (95 % 0₂/ 5 % CO2) atmoszférában 24 órán keresztül történt növesztés után a le nem tapadt ·♦ sejteket eltávolítottuk, a palackot átmostuk, és feltöltöttük friss KGM tápoldattal. A tápoldatot minden második napon lecseréltük, és a sejteket passzáltuk, amíg a lemez felületét 80-90 %-ban egybefüggő sejtréteg borította be (6-10 nap eltelte után). A kimerült KGM tápfolyadékot eltávolítottuk, és a letapadt keratinocitákat rövid ideig (5 percig) kezeltük 0,125 %-os tripszin-oldattal, majd a sejteket HBSS és FCS keverékéhez adtuk, centrifugáltuk, és esetenként újra felszuszpendáltuk KGM-ben oly módon, hogy 1 lemeznyi primer kultúrából 3 lemeznyi első passzázsú sejtet kapjunk. A végső sejtszám növelése céljából a keratinocitákat tovább növesztettük a fentebb leírtak szerint, és általában a második passzázs sejtjeit használtuk a mérésekhez.

a/ A Do-vitamin-hidroxilázok szelektív gátlása

Az alacsony kalcium koncentáricójú (0,06 mM) KGM tápoldatban lévő humán keratinocita összefüggő sejtkultúra nagy mennyiségben képes kalcitriol termelésére az 1-hidroxiláz-aktivitás segítségével, ugyanakkor az oldallánc oxidációja révén lejátszódó szekvenciális metabolizmus itt csaknem teljesen hiányzik. Ezért az 1-hidroxiláz gátlását az összefüggő sejtkultúrákban közvetlenül meg lehet határozni, míg a szekvenciális metabolizmust a megfelelő hidroxilázok — például a 24-hidroxiláz — indukálásával lehet meghatározni, azaz egy éjjelen (17 órán) keresztül végrehajtott, 10 nM kalcitriollal végzett előkezeléssel, amint azt Bikle és munkatársai leírták 1986-ban (lásd fentebb).

Az 1-hidroxilázok aktivitását és a szekvenciális metabo• · · · · · • ···· · · · • · · · · · · • · ·· ··« · · ·

- 25 lizmus sajátos lépéseit [például az 1,24,25(CH)g-Dg - és a 24-oxo-1,25(OH)₂-Dg-vitamin képződését, amely vegyületek még megőrizték kalcitriol-szerű hatékonyságukat], a 3-epi-kalcitriol-metabolitok képződését, a vizes fázisban visszamaradó poláris metabolitok képződését, mely utóbbiak az oldallánc lebontására utalnak, továbbá a vizsgált vegyületeknek a fenti folyamatokra kifejtett gátló hatását a ³H-25(OH)-Dg oxidációjának (Amersham, fajlagos aktivitás mintegy 2,257 x 10⁷ Bq/ /nmól = 0,61 mCi/nmól) követésével határozhatjuk meg a következők szerint:

Humán keratinociták egybefüggő sejtkultúráját 1 ml KGM-oldatban, 6 mintahelyes lemezen, két párhuzamosban inkubáltuk 37 °C-on ³H-25(CH)-Dg-mai együtt 1 órán keresztül (1-hidroxiláz), 4 órán keresztül (szekvenciális metabolizmus), továbbá 1 és 24 óra közötti intervallumban 10 nM kalcitriollal való előinkubálás után vagy anélkül, valamint a vizsgálandó, gátló vegyületek 0-10 μΜ koncentrációtartományba eső mennyiségének hozzáadása után vagy anélkül. Ezután mindegyik mintahelyhez 1 ml metanolt adva a reakciókat leállítottuk, a sejteket lekapartuk, és a felülúszóval együtt átvittük kémcsőbe, ahol kétszer átmostuk azokat (1 ml metanollal és 0,8 ml vízzel). Az egyesített oldatokból a változatlan ³H-25(OH)-Dg-at kiextraháltuk a legtöbb .átalakulási termékkel együtt, ezt követően pedig a sejtüledéket 2,1 ml és 1 ml kloroformmal extraháltuk szobahőmérsékleten. A kloroformos és a vizes fázisban megmérve a ³H-aktivitást, meghatároztuk a teljes ³H-hozamot. A megnyújtott időtartamú (> 4 óra) inkubálásoknál az erősen poláris me• · tabolitok keletkezése miatt a ³H-aktivitás a vizes fázisban jelentősen megnőtt, ugyanakkor az illékony termékek keletkezése következtében szignifikáns ³H-aktivitás-veszteség is jelentkezett; ez csaknem kizárólag az oldallánc hasadásának következménye, melynek során a ³H-jelzett ^26/27 oldallánc-szakasz lehasadt. Az egyesített kloroformos extraktumot argongáz alatt, 35 °C-on bepároltuk, a maradékot feloldottuk 0,4 ml etanolban, és az oldat alikvot részét magasnyomású folyadékkromatográfiával vizsgáltuk Zorbax-Sil oszlopot (Dupont,

4,6 x 250 mm) használva, a hexán/izopropil-alkohol eluens 97:3-tól 85:15 arányig terjedő nemlineáris, grádiens elúciójával. Az eluens áramlási sebessége 2 ml/perc volt, a teljes analízis ideje pedig 70 perc. A szubsztrát és az egyes metabolitok csúcsait ismert, jelöletlen sztenderd anyagok együtt-kromatografálásával azonosítottuk. A specifikus inhibitorok 0-10 μΜ koncentrációtartományba eső mennyiségének jelenlétében meghatároztuk a jellegzetes termékek képződésének mértékét, és a gátlás erősségét (IC^q) a Dixon diagramból (a képződési sebesség reciproka az inhibitor koncentrációjának függvényében ábrázolva) számítottuk ki. A szelektivitás becslése céljából összehasonlítottuk egy specifikus inhibitornak a szekvenciális folyamattal és az 1-hidroxilázzal jellegzetes kapcsolatos

IC^q értékeit.

b/

A ³H-~ielzett timidin beépülése a humán keratinocitákba; a D-vitamin-metabolitok antiproliferatív ha tása az azok lebomlását szelektíven gátló anyagok η elenlétében

A ³H-jelzett timidin beépülését 96 mintahelyes lemezen • · • ··«· · «« ♦ · · · · · ♦ ·· ·· ··· · ··

- 27 határoztuk meg a következőképpen: a keratinocitákat 200 μΐ, alacsony kalcium-koncentrációjú KGM-ben vittük fel a lemezre úgy, ogy inden mintahelyre 10⁴ számú sejt kerüljön (második passzázs), és a lemezeket argongáz atmoszférában, 37 °C-on inkubáltuk 24 órán keresztül. Ezután hozzáadtuk a vizsgálandó vegyületeket 1 μΐ etanolban oldva a oldva a 0-10 μΜ koncentrációtartományba eső mennyiségben, 25(OH)D₃ la,25(OH)₂D₃ (a koncentrációtartomány mindkét anyag esetében 0-7 nM volt) jelenlétében és távollétében, és mindegyik koncentrációt három párhuzamosban alkalmaztunk. A vak mintahelyeket, amelyek vagy csak oldószert vagy csak D₃-vitamin-metabolitot tartalmaztak, a fenti mintahely-hármasok után helyztük el a lemezen. Lemezenként 5-10 oldószer nélkül vak mintahelyet alkalmaztunk. További 24 óra eltelte után 50 μΐ KGM-mel készített ³H-jelzett timidin oldatot (aktivitás: 3,7 x 10⁴ Bq = 1 μθί) adtunk a mintahelyekhez, majd még 17 órán keresztül folytattuk az inkubálást, végezetül a sejteket összegyűjtöttük, és lízisnek vetettük alá azokat.

A sejtek összegyűjtését Filtermate-196 típusú sejtgyűjtővel (Packard-Canberra) hajtottuk végre. Először egy 96 mintahelyes szűrőlappal felitattuk a felülúszót, és vízzel háromszor mostuk. Ezen szűrőlap mérése, amint azt alább ismertetni fogjuk, világosan mutatta, hogy egyetlen ³H-aktivitást mutató sejt sem tapadt hozzá. Ezután a lemezre letapadt sejteket 100 μΐ PBS-ben oldott, 0,125 %-os tripszin oldattal kezeltük 37 °C-on 5 percig, és a fellazult sejteket átvittük egy új szűrőlemezre, és háromszor mostuk vízzel. Hozzáadtunk 50 μΐ szcin• · · · · · • ···· · · · • · · · · · « ·» ·· ··« · ··

- 28 tillációs koktélt (MicroScint 0, Packard), és a ³H-aktivitást Microplate típusú szcintillációs számlálóval (Topcount, Packard Canberra) mértük.

Az adatok kiértékelése során meghatároztuk az átlagokat és a ± szórásértékeket (n = 3). A D-vitamin-metabolitok által kiváltott proliferáció gátlására vonatkozó IC₅₀ értékeket az oldallánc-lebontást gátló anyagok (inhibitorok) változó koncentrációinak jelenlétében és vice versa úgy határoztuk meg, hogy a proliferációs sebesség reciprokát az inhibitorok egyike koncentrációjának függvényében ábrázoltuk úgy, hogy a többi inhibitor koncentrációját állandó értéken tartottuk (Dixon diagram) . Az IC^q értékeket — a gátlás mechanizmusától függetlenül — a görbének az X-tengellyel alkotott metszéspontjából lehet leolvasni.

A találmány szerinti hatóanyagok a fentebb ismertetett a/ és b/ vizsgáló rendszerekben gátló hatást mutatnak a 0,01 μΜtól a 10 μΜ-ig terjedő koncentráció tartományban.

A találmány szerinti hatóanyagok ennélfogva felhasználhatók a D^-vitamin C₂q_27 oldalláncát megtámadó 25-hidroxi-D₃— —vitamin-hidroxilázok szelektív gátlására, a D-vitamin-érzékeny szövetekben fellépő proliferációs és differenciálódási rendellenességek kezelésére, különösen pedig az olyan állapotok kezelésére, amelyeknél kívánatos a kalcitriol hormon lebomlásának szelektív gátlása anélkül, hogy ezzel megzavarnánk annak szintézisét előanyagából, a 25(OH)D₃-bői, minthogy így megnő és elnyújtott lesz a belső hormonszint, és ez kedvező hatást fejt ki a proliferáció és a diffferenciálódás tekinte• · · · · · * · ··« « ·* • · · · · · · ·· ·· ··· · ··

- 29 tében az immunfunkciókra, a kalcium-homeosztázisra, továbbá a bőr vonatkozásában az olyan hiperproliferatív és gyulladásos megbetegedésekre, mint a pszoriázis és az ekcémás betegségek, azután úgy a normál, mint a kóros öregedéssel összefüggő degeneratív kötőszöveti elváltozásokra, a hajhullás megelőzésére, a hajnövekedés szabályozására, ezenkívül elősegíti a tumor-szupressziót, jelentős toleranciát fejt ki az allotranszplantátumokkal szemben, jó hatású reumatoid artritiszben és a csont-új raképződésben.

A felsorolt indikációk szempontjából megfelelő adagolás természetesen függ például a felhasznált, találmány szerinti hatóanyagtól, a kezelendő szervezettől, az alkalmazás módjától és a szóbajöhető indikációtól. Általában véve, állatkísérletekben kielégítő eredményeket kaptunk, ha az állatok testtömegének 1 kg-jára számított napi dózis 1 és 20 mg közé esett. Nagyobb emlősök, például az ember esetében egy találmány szerinti hatóanyag a szokásos alkalmazások esetén, ez 70 mg és 1400 mg közötti érték, például több dózisra elosztva, napi két- vagy négyszeri enterális/szisztémás kezelést véve alapul, és a koncentráció-tartomány 0,5 %-nál kisebb, például 0,1 %, és ez a helyi kezelésre szolgáló krémek/oldatok esetében felmehet egészen 2 %-íg is.

A találmány szerinti hatóanyagok összekeverhetők a szokásos, gyógyszerészetileg elfogadható hígító- és vivőanyagokkal, adott esetben egyéb kötőanyagokkal is.

Ezeket a hatóanyagokat bármilyen szokásos módon alkalmazhatjuk, különösen enterálisan, például orálisan, például tab30 • · · · · ♦ • · ··♦ · ·♦ • « · * · · · • · »« ··· · · · letták vagy kapszulák formájában, vagy helyileg, például lemosószerek, gélek, krémek, permetek és oldatok, úgy mint a szem és az orrüreg kezelésére szolgáló oldatok, vagy aeroszolok a bőr és a nyálkahártyák — például a szem, a légzőrendszer, a hüvely, az orr és a szájüreg — kezelésére.

Ezeket a hatóanyagokat alkalmazhatjuk egyedül vagy kombinációban, úgy mint a kalcitriollal vagy olyan sztenderdekkel együtt, mint a ciklosporin A (Sandimmun^) az immunszupresszív és a gyulladásgátló hatás fokozása céljából. Az egyes hatóanyagoknak a szokásosnál jóval kisebb dózisa csökkenti a nemkívánatos mellékhatásokat. A találmány szerinti hatóanyagok helyettesíthetik a terápiában a glükokortikoidokat (például a dexametazont, a betametazont vagy a prednizolont) és egyéb immunszupresszív hatóanyagokat, és a ezelést kalcitoninnal vagy paratiroidális hormonnal lehet kiegészíteni.

A fenti indikációk szempontjából előnyös vegyületek az N-[(4'-klór-bifenil-4-il)-karbonil]-2-(lH-imidazol-l-il)-2 (S)-fenil-l-amino-etán (8. példa) és annak (R)-enantiomerje (9. példa). Mindkét vegyület szelektív inhibitora a D₃-vitamin ^20-27 oldalláncát lebontó 25-hidroxi-D₃-vitamin-hidroxilázoknak anélkül, hogy zavarnák annak a 25(OH)D₃-ból, mint előanyagból történő szintézisét. így például megállapítottuk, hogy a fentebb ismertett két tesztben (a/ és b/) ezen vegyületek IC50 értéke az oldallánc-metabolizmust tekintve 10 nm és 50 nM, továbbá az (S)- és az (R)-enantiomer az alábbi IC^q értékeket mutatta az a/tesztben: a 3-epi-1,25(OH)₂-D3-vitamin szint stabilizáci• · óját illetően 40 nM és 12nM, az 1,25(OH)₂D₃, az

1,24,25(OH)₃D₃ és a 24-oxo-1,25(OH)₂D₃ együttes szintjének stabilizációját tekintve 45 nM és 19 nM, míg az 1-hidroxiláz gátlását illetően az

ICtjQ értékek 530 nM illetve 620 nM;

a b/tesztben: az a koncentráció, amely az la,15(OH)₂-Dg antiproliferatív hatásának megkettőzéséhez kell esetében ezek az értékek 11 nM és 12 nM.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy például a pszoriázis kezelése folyamán ezeket az anyagokat lehetséges helyileg

0,1 %-tól mintegy 0,5 %-ig terjedő koncentrációban alkalmazni nagy emlősök, például az ember esetében, az általában ajánlott adagolási/alkalmazási módokhoz hasonlóan.

A találmány tárgyát képezik még a helyi használatra al kalmas gyógyszerészeti készítmények, amelyek egy találmány szerinti hatóanyagot legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható vivő- vagy higítóanyaggal együtt tartalmaznak. Az ilyen készítményeket a szokásos módon, azaz egy találmány szerinti hatóanyagot legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható vivő vagy higítóanyaggal összekeverve lehet előállítani. Az egység nyi adagolási formák például 20 mg-tól 700 mg-ig terjedő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak.

Előnyös ezek felhasználása a pszoriázis kezelésére.

A találmány szerinti hatóanyagok kifejezettebb és szelek tívebb 25(OH)Dg-hidroxiláz gátló hatást mutatnak, mint az várható lenne a szerkezetileg hasonló vegyületektől.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy (I) általános képletű vegyület — amely képletben jelentése fenil-, naftil-, tienil- vagy piridilcsoport, és ez a négy helyettesítő csoport adott esetben monoszubsztituált lehet halogénatommal, alkoxi-, alkil-, dialkil-amino- vagy cianocsoporttal, és ebben az esetben

R2 jelentése hidrogénatom; vagy

R₄ jelentése hidrogénatom, és ebben az esetben

R₂ jelentése piridil- vagy 5-klőr-2-piridil-csoport;

R₃ jelentése hidrogénatom, halogénatom, alkil-, ciano-, alkoxi -karbonil - , alkil-karbonil- vagy adott esetben helyettesített aminocsoport, és

X jelentése metincsoport (=CH-) vagy nitrogénatom — szabad bázis vagy só formájában.
2. Egy 1. igénypont szerinti (Ip) általános képletű vegyület — amely képletben

R-|_p jelentése fenilcsoport, amely adott esetben monoszubsztituált lehet a gyűrű 4-es pozíciójában halogénatommal, és ebben az esetben ^R2p jelentése hidrogénatom, vagy

R₄p jelentése hidrogénatom, és ebben az esetben

R2p jelentése 5-klór-2-piridil-csoport és

X„ jelentése CH-csoport vagy nitrogénatom, vagy ir

R^p jelentése 1-naftil-csoport, és ebben az esetben • · · ·· ·· jelentése hidrogénatom és jelentése metincsoport szabad bázisként vagy gyógyszerészetileg elfogadható só formáj ában.
3. Az N-[4-(4-klór-fenil)benzoil]-2-(lH-imidazol-l-il)-2-fenil-l-amino-etán racém vagy 2(S)- vagy 2(R)-enantiomer formában, szabad bázisként vagy só formájában.
4. Egy 1. igénypont szerinti vegyület — amelynek képletében

X jelentése metincsoport, és

R]_ jelentése hidrogénatom, és

R₂, illetve R₂ jelentése 5-klór-2-piridil-csoport, illetve

4-es helyzetű klőratom, racém vagy (+)- vagy (-)-enantiomer formában, vagy

2- piridil-csoport, illetve 4-es helyzetű klóratom, vagy

3- piridil-csoport, illetve 4-es helyzetű klóratom, vagy

4- piridil-csoport, illetve 4-es helyzetű klóratom, vagy
5- klór-2-piridil-csoport, illetve 4-etoxi-csoport, vagy

5-klór-2-piridil-csoport, illetve 4-butoxi-csoport; vagy R₂ jelentése hidrogénatom,

R₂ jelentése 4-es helyzetű klóratom, és

R-j_ jelentése 4-klór-fenil-csoport, racém vagy ( + ) (S)-enantiomer formában, vagy 1-naftil-csoport — szabad bázisként vagy só formájában.

5. Eljárás egy 1. igénypont szerinti vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a/ egy megfelelő (II) általános képletú vegyületet, • ·

- 34 «· amely képletben a szubsztituensek jelentése azonos az 1. igénypontban megadottakkal, acilezünk azzal a céllal, hogy a megfelelő 4-karbonil-bifenil-csoportot bevigyük a molekulába; vagy b/ egy (la) általános képletü vegyület — amely képletben és X jelentése azonos az 1. igénypontban megadottakkal, és R]_' jelentése a hidrogénatom kivételével megegyezik az R-^-re az 1. igénypontban megadottakkal — előállítása esetén egy megfelelő (III) vagy (Illa) általános képletü vegyületet — amelyek képletében R·^' jelentése azonos a jelen igénypontban, R3 jelentése pedig azonos az 1. igénypontban megadottakkal — a megfelelő (IV) általános képletü vegyülettel — amely képletben X jelentése azonos az 1. igénypontban megadottakkal — reagáltatjuk, és a kapott (I) általános képletü vegyületet szabad bázisként vagy só formájában elkülönítjük.
6. Gyógyszerkészítmény, amely egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet szabad bázis vagy gyógyszerészetilég elfogadható só formájában, legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható vivő- vagy higítóanyaggal együtt tartalmaz.