FI112364B - Asyloituja aminoalkaani-imidatsoleja ja -triatsoleja - Google Patents

Description

112364

ASYLOITUJA AMINOALKAANI-IMIDATSOLEJA JA -TRIATSOLEJA

Keksintö koskee asyloituja aminoalkyyli-imidatsolijohdannaisia ja -triatsolijohdannaisia.

5 Keksintö koskee erityisesti yhdisteitä, joilla

on kaava I

n—N

Fjl 10 CH-Cp-NH.CO^Q^3> 3 ' R, R2 15 jossa joko Ri tarkoittaa fenyyliä tai naftyyliä, jolloin nämä kaksi substituenttia on mahdollisesti mo-nosubstituoitu halogeenilla ja R2 tarkoittaa vetyä; tai Ri tarkoittaa vetyä ja R2 tarkoittaa pyridyyliä tai 20 2-(5-kloori)pyridyyliä; R3 tarkoittaa vetyä, halogeenia tai Ci-C4-alkoksia; ja X on CH tai N; ,, . ja jotka ovat vapaassa muodossa tai suolan muodossa, ja ) · \ ; joista käytetään tästä eteenpäin nimitystä "keksinnön ' ·' mukaiset yhdisteet".

: 25 Ri on edullisesti fenyyli. Kun se on muu kuin • > : fenyyli, se on edullisesti vety. R2 on edullisesti ve- | : : ty. R3 on edullisesti halogeeni. Se on edullisesti 4- asemassa. X on edullisesti CH.

*

Kun Ri on muu kuin vety, se on edullisesti 30 substituoimaton. Kun fenyyli on substituoitu, edulli- • · ··’ sesti sen 4-asema on substituoitu. Kun pyridyyli on Ύ substituoitu, edullisesti sen 5-asema on substituoitu.

·.!,· Halogeeni on fluori, kloori, bromi tai jodi, edullisesti kloori. Alkoksi sisältää edullisesti toi-;·’ 35 sistaan riippumatta 1-4, sopivasti 1 tai 2, erityi- \ . sesti 1 hiiliatomia.

2 112364

Pyridyyli on edullisesti 2- tai 4-pyridyyli.

Naftyyli on edullisesti 1-naftyyli.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden erääseen ryhmään kuuluu yhdisteet, joilla on kaava Is 5

Π-N

V

10 CH-CH-NH-CO-(^)-Is R,s R2s 15 jossa joko Ris tarkoittaa fenyyliä, fenyyliä, joka on monsubstituoitu halogeenilla, tai 1-naftyyliä, ja R2S tarkoittaa vetyä; tai Ris tarkoittaa vetyä ja R2s tarkoittaa pyridyyliä tai 2-(5-kloori)pyridyyliä; ja R3s tarkoittaa halogeenia tai 1-4 hiiliatomia sisältävää 20 alkoksia; ja jotka ovat vapaassa muodossa tai suolan muodossa.

Kaavan Is mukaisten yhdisteiden eräässä ala-: ryhmässä R3s on kloori. Eräässä toisessa alaryhmässä R3s V,· on 2 - 4 hiiliatomia sisältävä alkoksi. Edelleen erääs- : * : 25 sä alaryhmässä halogeenilla monosubstituoitu fenyyli on fenyyli, joka on monosubstituoitu kloorilla, joka on : edullisesti 4-asemassa. Edelleen eräässä alaryhmässä

RiS tarkoittaa fenyyliä tai, edullisesti, fenyyliä, • · · jonka 4-asema on monosubstituoitu kloorilla; R2s tar-,, , 30 koittaa vetyä; ja R3s tarkoittaa klooria, joka on 4- asemassa.

I · ’·.·* Keksinnön mukaisten yhdisteiden edelleen erää- : seen ryhmään kuuluu yhdisteet, joilla on kaava lp .’* 35 * · · * · • 1

> I

3 112364 Π-Ν 9 5 CH - CjH - ΝΗ - CO—ζ^>-Cl Ιρ R,p R2p jossa joko Rip tarkoittaa fenyyliä, jonka 4-asema on mahdollisesti monosubstituoitu kloorilla, ja R2P tar-10 koittaa vetyä; tai Rip tarkoittaa vetyä ja R2P tarkoittaa 2— (5— kloori)pyridyyliä, tai Rip tarkoittaa 1-naftyyliä, R2p tarkoittaa vetyä ja Xp on CH; 15 ja jotka ovat vapaassa muodossa tai farmakologisesti hyväksyttävän happoadditiosuolan muodossa.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa menetelmällä, jossa (a) vastaavat yhdisteet, joilla on kaava II, 20

Π-N

ITj

N

I Π : ·* CH-CH-NH,

0: I I

25 Rj R2 / / jossa substituentit ovat edellä määritellyn mukaisia, : asyloidaan vastaavan bifenyyli-4-karbonyyliryhmän vie- v * miseksi; tai 30 (b) sellaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on : ' : kaava Ia, ·: ' 35 CK - en, - ism - GO—Ia ··!; R·' 4 112364 jossa R3 ja X ovat edellä määritellyn mukaisia ja R/illä on muuten sama määrittely kuin edellä R^llä, mutta siihen ei kuulu vety; vastaavat yhdisteet, joilla on kaava III, 5

Ri' I l/T=V_/3r\R3 m 10 tai kaava lila, r; - CH - ch2 ~ jossa Ri' ja R3 ovat edellä määritellyn mukaisia, saatetaan reagoimaan vastaavan yhdisteen kanssa, jolla on kaava IV, 20

il—N

jO w

N

H

25 jossa X on edellä määritellyn mukainen; , ja saadut kaavan I mukaiset yhdisteet otetaan talteen vapaassa muodossa tai suolan muodossa.

: j : Keksinnön mukainen menetelmä voidaan toteuttaa ’ konventionaaliseen tapaan.

30 Menetelmävaihtoehto (a) voidaan esimerkiksi * toteuttaa saattamalla kaavan II mukainen yhdiste reagoi- maan asianmukaisen asyylihalogenidin kanssa liuottimes-sa, esim. orgaanisessa tai epäorgaanisessa emäksessä, t I » ;;; joka voi samanaikaisesti toimia happoa sitovana aineena, ;*’ 35 kuten pyridiinissä, ja mahdollisesti lisäämällä asyloin- tia kiihdyttävää ainetta, kuten 4-dimetyyliaminopyri-diiniä. Reaktio voidaan suorittaa myös antamalla kaavan 5 112364 II mukaisen yhdisteen reagoida asianmukaisen aktiivisen esterin tai edelleen aktivoidun asyylijohdannaisen kanssa, esim. seka-anhydridin tai imidatsolidin kanssa, jota saadaan käyttämällä reagenssina Ν,Ν-karbonyylidi-imidat-5 solia. Reaktio voidaan siten suorittaa esim. käyttämällä 2-pyridyylitioliesteriä, kuten 4'-klooribifenyyli-4-karboksyylihappo-2-pyridyylitioliesteriä, inertissä liuottimessa, kuten di(alempi alkyyli)karboksyyli-happoamidissa, esim. dimetyyliformamidissa, edullisesti 10 huoneenlämpötilassa.

Menetelmävaihtoehto (b) voidaan toteuttaa seostamalla kaavan III tai lila mukaista yhdistettä kaavan IV mukaisen yhdisteen kanssa ja kuumentamalla seos kohotettuun lämpötilaan, esim. n. 120 °C:seen.

15 Lähtöaineet ovat joko tunnettuja tai niitä voidaan valmistaa tunnettujen menetelmien mukaisesti tai analogisesti tunnettujen menetelmien kanssa tai analogisesti tässä hakemuksessa, esim. esimerkeissä, kuvatun kanssa.

20 Kaavan II mukaiset yhdisteet voidaan esimerkik si valmistaa seuraavan reaktiokaavion mukaisesti: » ' i · * * i i t ' < I · * t » * * · I · * · * » t » · • ·

* I

( · *

< I

’ * »

; I

» · 1 > » 6 112364

[j f R,’- CH - 0¾ - NH2 tai R,’ - CH - CH, - OH

X'f <L nh, Vlb

CH, - CH - Y XD

. I

5 R^ ▼ + atsidi R1'-CH-CH2-NH3+ tai R,’ - CH - CHj - 0S03’ oso, - v,,a nh3+ Vllb Π-N 3

xO

10 N

CH2 - CH - N3 v * R.'-ch-^ vm pelkistys ^ v 15

n-N + IV

X ') XV 1

I --N

ch2-ch-nh2 na II y

I X-N

20 I

CH - CH, - NH, lib I 2 2

Ri*

Yllä esitetyssä reaktiokaaviossa R2':lla on 25 muuten sama määrittely kuin edellä R2:lla/ mutta siihen , ei kuulu vety, Y tarkoittaa halogeenia, edullisesti klooria ja muut substituentit ovat edellä määritellyn '·* : mukaisia.

V * Kaavan III mukaiset lähtöaineet voidaan valmis- 30 taa esim. seuraavan reaktiokaavion mukaisesti: • · ·

'/ R'L\ -► ft,'—(7 -► R,'<HiH-MiOO -/ )—( A

·'.!/ N CH^ I N—J \JJ

*. · CH

IX Via M

• » ♦ o* ▼ m 7 112364 Tässä reaktiokaaviossa substituentit ovat edellä määritellyn mukaisia.

Kaavan lila mukaiset lähtöaineet voidaan valmistaa esim. asyloimalla asianmukaisesti vastaava kaavan 5 VIII mukainen yhdiste.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden muuta kuin vetyä tarkoittavan ryhmän Rx tai Rz hiiliatomi on kiraalinen ja siten yhdisteet voivat olla rasemaatteina, puhtaina enantiomeereina [ (R) ja (S)] tai näiden seoksina. Kek-10 sinto käsittää kaikki stereoisomeerit sekä raseemiset seokset. Isomeerit voidaan eristää tai erottaa käyttäen konventionaalisia menetelmiä, esim. kromatografisesti.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden puhtaiden enan-tiomeerien valmistus voidaan toteuttaa käyttämällä mene-15 telmävaihtoehdoissa (a) ja (b) lähtöaineina puhtaita enantiomeereja. Kaavan VIII tai lila mukaisten enantio-meerisesti puhtaiden atsiridiiniyhdisteiden renkaan avautuminen reaktiossa kaavan IV mukaisen yhdisteen kanssa etenee siten, että tapahtuu konfiguraation inver-20 sio, jolloin saadaan kaavan Hb tai Ia mukaista yhdistettä, jolla on vastakkainen konfiguraatio. Edelleen, reaktiovaiheessa, jossa kaavan XI mukaisista yhdisteistä V. saadaan kaavan III mukaisia yhdisteitä, ja seuraavassa vaiheessa, jossa saadaan kaavan Ia mukaisia yhdisteitä, l t i 1 25 tapahtuu myös konfiguraation inversio. Edellä kuvattui- , ’ hin reaktioihin käytetyissä muissa reaktiovaiheissa konfiguraatio pysyy muuttumattomana. Siten, kun käyte-: tään enantiomeerisesti puhtaita lähtöaineita, saadaan

I I I

V · konfiguraatioltaan vastakkaisia lopputuotteita käytettä- 30 essä yhtä sellaista reaktiovaihetta, joka johtaa konfi-guraation inversioon kiraliakeskuksessa, ja konfiguraa-tioltaan muuttumattomia lopputuotteita, kun ei käytetä *. lainkaan tai käytetään kahta sellaista reaktiovaihetta, * · t joka johtaa konfiguraation inversioon kiraliakeskukses- '··*' 35 sa.

» Näiden reaktioiden yksittäiset vaiheet voidaan suorittaa konventionaaliseen tapaan.

• » 8 112364

Keksinnön mukainen yhdiste voi olla vapaassa muodossa tai suolan, kuten happoadditiosuolan, muodossa. Vapaassa muodossa oleva keksinnön mukainen yhdiste voidaan konvertoida konventionaalisella tavalla sen suolan, 5 kuten happoadditiosuolan, esim. hydrokloridin tai nitraatin, muotoon ja päin vastoin.

Tästä eteenpäin käytetään seuraavia lyhenteitä: 25(OH)D3: 25-hydroksivitamiini D3 l,25(OH)2D3: 1,25-dihydroksivitamiini D3 (kalsitrioli) 10 24,25(OH)2D3: 24,25-dihydroksivitamiini D3 1,24,25(OH)3D3: 1,24,25-trihydroksivitamiini D3 l,23,25(OH)3D3: 1,23,25-trihydroksivitamiini D3 DMF: dimetyyliformamidi 15 DMSO: dimetyylisulfoksidi HPLC: suuren erotuskyvyn nestekromatografia THF: tetrahydrofuraani kp.: kiehumispiste 20 dpm: hajoamista per minuutti (disintegrations per minute) sp.: sulamispiste EGF: epidermaalinen kasvutekijä (epidermal growth fac- 25 tor) FCS: vasikansikiönseerumi (fetal calf serum) HBSS: Hankin tasapainotettu suolaliuos (Hank's balanced salt solution) KGM: keratinosyyttikasvatusväliaine (kerätinocyte growth 30 medium, Clonetics, San Diego, CA, USA)

Kaikki lämpötilat annetaan tässä hakemuksessa celsiusasteina. Seuraavat esimerkit tarkoitettu havainnollistamaan keksintöä rajoittamatta sitä millään tavoin.

Esimerkki 1: 1-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-1-yyli)-N-f 4-(4-kloorifenyyli)bentsoyyli1-1-aminoetaani 35 9 112364 [Menetelmävaihtoehto (a)]

Liuokseen, joka sisältää, 0,44 g l-amino-l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-1-yyli)etaania 1 ml:ssa dimetyyliformamidia, lisätään liuos, jossa on 5 0,645 g 4'-kloorifenyyli-4-karboksyylihapon 2-pyridyyli- tioliesteriä 2 ml:ssa kuivaa dimetyyliformamidia. Reak-tioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa ja argonin alla 18 tunnin ajan. Reaktioseos kaadetaan kylmään kyllästettyyn suolaliuokseen ja uutetaan etyyliasetaatilla.

10 Yhdistettyjä orgaanisia faaseja pestään suolavedellä, kuivataan Na2S04:llä, suodatetaan ja liuotin haihdutetaan (= menetelmän A mukainen käsittely). Raakatuotteen käsittely dietyylieetterillä tuottaa otsikon mukaista yhdistettä värittöminä kiteinä; sp.: 143 - 146°.

15 Käyttämällä lähtöaineena optisesti puhtaita aktiivisia enantiomeereja ja etenemällä edellä kuvatun mukaisesti, saadaan otsikon mukaisen yhdisteen optisesti aktiivisia enantiomeereja: ( + )-enantiomeeri: [a]D20 = +6,7° (c = 0,52, metanoli); 20 sp.: 175 - 186°, (-)-enantiomeeri: [a]D20 = -7,0° (c = 0,52, metanoli); sp.: 175 - 186°.

Analogisesti esimerkin 1 kanssa saadaan mene-telmävaihtoehdon (a) mukaisesti seuraavat kaavan I mu- 25 kaiset yhdisteet (X = CH, Rx = H) raseemisessa muodossa: :’· : ESIMERKKI__Rj__R3__sp.

• ; 1 2 2-pyridyyli 4-C1 165-166° i t 11 1 "" — " 1 - “ " 1 1 : 3__3-pyridyyli__4-Cl__215-218° _4__4-pyridyyli__4-Cl__185-191° _5__5-Cl-2-pyridyyli 4-OC2H5__170-184° !··\ 6 5-Cl-2-pyridyyli 4-OC4H9 152-155° • *;;; ’ Esimerkki 7: N-f 4-(4-kloorifenyyli)bentsoyyli)-2-(1H- '·*· imidatsol -1 -yyl i) -2 (S) - f enyyl i -1 -aminoetaani 30 [Menetelmävaihtoehto (a)] 10 112364

Liuokseen, joka sisältää 0,96 g raakaa (S)-2-fenyyli-2-(lH-imidatsol-l-yyli)-1-aminoetaania 5 ml:ssa Ν,Ν-dimetyyliformamidia, saatetaan sekoituksessa 1 g 4'-klooribifenyyli-4-karboksyylihapon 2-pyridyylitiolies-5 teriä. Kuuden tunnin jälkeen reaktioseos pysäytetään kaatamalla se kylmään veteen (0°, 50 ml). Sakkaa uutetaan etyyliasetaatilla, orgaanista faasia pestään suolavedellä, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja haihdutetaan. Kiteistä jäännöstä trituroidaan etanolilla, suodatetaan 10 käyttäen imua ja pestään kylmällä etanolilla, Kiteiden kuivaus tuottaa puhdasta otsikon mukaista yhdistettä; sp.: 176 - 177°; [a]D20 = +17,8° (c = 1,2, metanoli).

Suodos haihdutetaan ja puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä (dikloorimetaani/metanoli/heptaani 15 7/1/4), jolloin saadaan lisää otsikon mukaista yhdistet tä puhtaana materiaalina.

Otsikon mukaisen yhdisteen (R)-enantiomeeri valmistetaan analogisesti lähtien (R)-2-fenyyli-2-(1H-imidatsol-l-yyli)-l-aminoetaanista; sp.: 176 - 179°; 20 [a]D20 = -17,4° (c = 1,1, metanoli).

Esimerkki 8: N-f 4-(4-kloorifenvyli)bentsowli1~2-( 1H- imidatsol-l-yyli)-2(S)-fenyyli-l-aminoetaani * [menetelmävaihtoehto (b)] v : 25 0,398 g N-(4'-klooribifenyyli-4-karbonyyli)- :'· : 2(R)-fenyyliatsiridiinia ja 0,15 g imidatsolia seoste- taan keskenään ja kuummennetaan 110°:ssa 16 tunnin ajan. j Jäähdytyksen jälkeen kiinteä jäännös liuotetaan 1,5 ml i : t : DMF-liuokseen lämmittämällä. Liuos kaadetaan jääveteen.

< * t 30 Saostunut kiintoaine kerätään käyttäen imua, pestään .. . vedellä ja kuivataan. Materiaali puhdistetaan kromato- • * * grafisesti silikageelillä (tolueeni/etanoli = 8/1).

'·;·* Otsikon mukainen yhdiste saadaan valkoisina kiteinä; : sp.: 176 - 179°; [a]D20 = +19,6° (c = 1,0, metanoli); 35 ^-NMR (DMS0-d6) δ: 8,82 (t, J = 5,3 Hz, 1 H); 7,87 - 7,84 (m, 3H); 7,78 - 7,74 (m, 4H); 7,55 (d, J = 8,5 Hz, 11 112364 2H); 7,41 - 7,30 (m, 6H); 6,92 (s, 1H); 5,70 (dd, J = 6,0, 9,1 Hz, 1H); 4,16 - 3,94 (m, 2H).

Esimerkki 9: N-f4-(4-kloorlfenyyli)bentsoyyli 1 -2- (1H- 5 lmldatsol-1-yyli)-2(R)-fenyyll-l-aminoetaani [Menetelmävaihtoehto (b)] 380 mg 2-(4'-klooribifenyl-4-yyli)-5(S)-fenyyli-4,5-dihydro-oksatsolia ja 775 mg imidatsolia kuumennetaan 120 °:ssa 23 tunnin ajan. Etyyliasetaattia 10 ja vettä lisätään, orgaanista kerrosta pestään kolme kertaa vedellä, kuivataan magnesiumsulfaatilla ja konsentroidaan vakuumissa. Tolueenin lisäyksen jälkeen otsikon mukainen yhdiste saostuu värittöminä kiteinä, 20 sp.: 176 - 179° (uudelleenkiteytetty tolueenista): [a]D 15 = -17,4° (c = 1,1, metanoli). ^-NMR-spektri on identti nen esimerkin 8 mukaisen S(+)-enantiomeerin spektrin kanssa.

Anaolgisesti esimerkissä 8 esitetyn kanssa saadaan menetelmävaihtoehdon (b) mukaisesti seuraavat 20 kaavan I mukaiset yhdisteet raseemisessa muodossa: ESIMERKKI X__Rj__Rz__Rj__sp.

10*__CH 4-Cl~C6H4 H__4-Cl 229-234° 1 11 CH 1-naftyyli H 4-C1 227-230° ’ * Esimerkin 10 mukaisen yhdisteen 2 (S) — V; enantiomeeri saadaan analogisesti esimerkissä 9 kuvatun • 25 kanssa lähtien vastaavasta 4,5-dihydro-oksatsolista; sp.: 197 - 204°; [a]D20 = +1,1° (c = 0,49, kloroformi).

Esimerkki 12: N- f 4- (4-kloorifenyyli )bentsoyyli 1 -2- (1H- ·*·. imidatsol-l-yyli) -2-fenyyli-l-aminoetaani • 30 [Menetelmävaihtoehto (a)] 0,94 g 2-fenyyli-2-(lH-imidatsol-l-yyli)-1-aminoetaania asyloidaan 0,17 g: 11a 4 '-klooribifenyyli-4-karboksyylihapon 2-pyridyylitioliesteriä analogisesti 12 112364 esimerkissä 1 kuvatun kanssa. Kromatografointi silika-geelillä (dikloorimetaani/metanoli/NH3-vesiliuos/hep-taani = 7/1/0,1/5) tuottaa otsikon mukaista yhdistettä värittöminä kiteinä; sp.: 209 - 212°.

5 Lähtäaineet voidaan valmistaa seuraavasti: (A) 1-amino-l-(5-kloori-2-pyridwli)-2-(lH-imidatsol-1-yyli)etaani (a) 2-asetyyli-5-klooripyridiini 10 Suspensioon, joka sisältää 56 g 2-bromi-5- klooripyridiiniä 560 ml:ssa kuivaa dietyylieetteriä, lisätään 179 ml n-butyylilitiumliuosta (15-prosenttinen liuos heksaanissa), -78°:ssa ja argonin alla, sellaisella nopeudella, että lämpötila ei ylitä kertaakaan -72°.

15 Välittömästi tämän jälkeen lisätään liuos, joka sisältää 25,7 ml N,N-dimetyyliasetamidia kuivassa THFrssä. Seosta sekoitetaan yhden tunnin ajan samassa lämpötilassa ja sitten se hajoitetaan lisäämällä varovasti 100 ml 3 N suolahappoa, sitten 100 ml vettä, voimakkaassa jäähdyt-20 täen. Jälkikäsittely menetelmän A mukaisesti (ks. esimerkki 1) ja kromatografinen puhdistus silikageelillä (tolueeni/etyyliasetaatti = 20/1) tuottaa yhdistettä valkoisina neulasina; sp.: 58 - 65°.

’ ’ 25 (b) 2-bromiasetyyli-5-klooripyridiinin hydrobromidi V Liuokseen, joka sisältää 10 g 2-asetyyli-5- \i klooripyridiiniä 150 ml:ssa 48-prosenttista bromivetyha- pon vesiliuosta, lisätään sekoituksessa tipoittain, 80°:ssa, 4 ml bromia, joka on liuotettu 40 mitään bromi-30 vetyhappoa. Seosta sekoitetaan vielä 3 tuntia 80°:ssa.

. Tämän jälkeen liuos haihdutetaan vakuumissa. Jäännöstä I t trituroidaan asetonin kanssa, suodatetaan käyttäen imua, pestään asetonilla ja kuivataan vakuumissa, jolloin : : : saadaan yhdistettä keltaisina kiteinä, ja niitä käyte- 35 tään seuraavaan vaiheeseen ilman puhdistamista.

* · 13 112364 (c) 2 — Γ 2' — (lH-imidatsol-l-yyli)asetyyll1-5-klooripyri-dlinl 15 g 2-bromiasetyyli-5-klooripyridiinin hyd-robromidia liuotetaan 50 ml:aan kuivaa dikloorimetaania, 5 joukkoon lisätään 9,7 g imidatsolia ja seosta sekoitetaan 24 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Liuottimen haihdutus vakuumissa ja saadun jäännöksen kromatogra-fointi silikageelillä (dikloorimetaani/metanoli/heptaani = 7/1/4) tuottaa yhdistettä kermanvärisenä kiintoainee-10 na; sp.: 122 - 129°.

(d) _l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-l-yyli)- etan-l-oli

Liuokseen, joka sisältää 7,8 g 2-[2'-(lH-15 imidatsol-l-yyli)asetyyli]-5-klooripyridiiniä 40 ml:ssa metanolia, saatetaan 0°:ssa, pienissä erissä 2,0 g nat-riumboorihydridiä. Seosta sekoitetaan yhden tunnin ajan 0°:ssa. Jälkikäsittelyä varten seos hajotetaan lisäämällä varovasti 1 N suolahappoa 0°:ssa, ja sitten lisätään 20 IN natriumhydroksidia pH: n saamiseksi arvoon 9. Liuottimet haihdutetaan vakuumissa. Jäännös sekoitetaan veteen ja dikloorimetaaniin, vesipitoista faasia uutetaan kahdesti dikloorimetaanilla ja yhdistettyjä orgaanisia uutoksia pestään suolavedellä, kuivataan ja haihdute-25 taan. Yhdistettä saadaan kermanvärisenä kiintoaineena; sp.: >210° (hajoaa). Puhdistus on mahdollista kromato-grafisesti silikageelillä.

; (e) l-kloorl-l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-1- 30 yyli)etaani 1 g l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-1- » | ,···, yyli)etan-l-olia liuotetaan 2 ml: aan tolueenia, 6 ml tionyylikloridia lisätään ja reaktioseosta sekoitetaan 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Liuotin ja tionyy-

: : 35 likloridiylimäärä tislataan pois, jäännös liuotetaan 2 N

;·' NaOH-liuokseen, sitä uutetaan etyyliasetaatilla, kuiva- 14 112364 taan Na2S04:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan yhdistettä värittömänä öljynä.

( f) 1-atsido-l- (5-kloori-2-pyridwli) ~2- (lH-imidatsol-1-5 yyli)etaani 0,92 g 1-kloori-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(1H-imidatsol-l-yyli)etaania lisätään argonin alla liuokseen, joka sisältää 0,37 g litiumatsidia 2 mlrssa kuivaa dimetyyliformamidia ja reaktioseosta sekoitetaan 60°:ssa 10 18 tunnin ajan. Menetelmän A mukainen jälkikäsittely (ks. esimerkki 1) tuottaa otsikon mukaista ainetta kellertävänä öljynä.

(g) l-amino-l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-1-15 yylpetaani

Liuosta, joka sisältää 0,83 g l-atsido-l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidatsol-l-yyli)etaania 4 ml:ssa kuivaa pyridiiniä, sekoitetaan H2S-atmosfäärissä 3 tunnin ajan. Reaktioseos haihdutetaan, jäännös uudel-20 leenliuotetaan 5 ml:aan laimeaa etikkahappoa (etikka-happo/vesi, 1/4) ja uutetaan etyyliasetaatilla. Yhdistetyt orgaaniset faasit haihdutetaan, jolloin saadaan otsikon mukaista tuotetta kellertävänä öljynä.

Analogisesti edellä kohdassa (A) kuvatun kanssa 25 saadaan seuraavat kaavan II mukaiset lähtöaineet viskoo-• V seinä kellertävinä öljyinä, jotka käytetään ilman enem- pää puhdistamista (X = CH, Rx = H): :T:__Rg__sp_._ _B)__2-pyridyyli _öljy_ ;*·*; _C)__3-pyridyyli__öljy_ D) 4-pyridyyli öljy t I 1 30 (E) (S)-2-fenyyli-2-(lH-imidatsol-l-wlP-l-aminoetaani ·;*’ (a) (R) -2-amino-2-f enyyli-etanoli-Q-sulfaatin vetysul- faatti 15 112364

Liuos, joka sisältää 10,65 g (R)(-)-2-amino-2-fenyylietanolia 30 mlrssa vettä, neutraloidaan 48-prosenttisella rikkihapolla metyylipunapäätepisteeseen (4,2 ml), jonka jälkeen lisätään yhtä suuri tilavuus 5 rikkihappoa. Vesi sitten poistetaan pyöröhaihduttimessa, 70 - 90°:ssa, lopuksi 130°:n haudelämpötilassa ja 13,3 Pa:n (0,1 torr) paineessa vakiopainoon. Seos jähmettyy vähitellen ja se jauhetaan huhmareessa. Materiaalia voidaan käyttää ilman enempää puhdistamista seuraavaan 10 reaktioon.

(b) (R)(-)-2-fenyyliatsiridiini 16,2 g hienoksi jauhettua (R)-2-amino-2-fenyyli-etanoli-O-sulfaatin vetysulfaattia lisätään 15 erissä 2 N natriumhydroksidin sekoitettuun liuokseen 0°:ssa. Reaktioseos kuumennetaan sitten 100°:seen 3 tunnin ajaksi. Seoksen jälkikäsittelyä varten se jäähdyte-ään huoneenlämpötilaan ja sitä uutetaan neljä kertaa eetterillä. Orgaanista faasia pestään suolavedellä, se 20 kuivataan magnesiumsulfaatilla ja haihdutetaan. Jäännök sen tislaus alipaineessa tuottaa yhdistettä värittömänä öljynä; kp.: 46° (13,3 Pa (0,1 torr)); [a]D20 = -46,7° (etanoli, c = 1,09).

,*.* 25 (c) (S)-2-fenyyli-2- (lH-imidatsol-l-yyli)-1-aminoetaani 1 g (R) (-)-2-fenyyliatsiridiinia ja 1,14 g imidatsolia kuumennetaan 120°:ssa 24 tunnin ajan. Reak-: tioseoksen jäähdyttämisen jälkeen se voidaan käyttää asylointi vaiheeseen ilman enempää puhdistamista. Ana- » · · 30 lyyttinen näyte voidaan saada kromatografoimalla silika-geelillä; XH-NMR (CDCIJ δ: 7,66 (s, 1H); 7,41 - 7,31 (m, « » * 3H); 7,24 - 7,18 (m, 2H); 7,11 (t, J = 1 Hz, 1H), 7,03 ·:·: (t, J = 1Hz, 1H), 5,17 (m, 1H); 3,43 (m, 2H); 2,60 (s, : b, 2H).

O 35 (F)_N-(4 ,-klooribifenyyli-4-karbonyyli)-2(R)-fenyyli- \ *) atsiridiini 16 112364

Liuokseen, joka sisältää 0,232 g 4'-klooribifenyyli-4-karboksyylihappoa 3 ml:ssa kuivaa DMF:ää, lisätään sekoituksessa 0,18 g N,N'-karbonyylidi-imidatsolia huoneenlämpötilassa, argonatmosfäärissä.

5 Yhden tunnin kuluttua joukkoon lisätään tipoittain liuos, joka sisältää 0,12 g fenyyliatsiridiiniä 0,5 ml kuivassa DMF:ssä. Reaktioseosta sekoitetaan 21 tunnin ajan ja tämän jälkeen se jälkikäsitellään esimerkissä 1 kuvatun mukaisesti. Yhdistettä saadaan vaaleankeltaisena 10 öljynä ja se käytetään puhdistamattomana seuraavassa vaiheessa.

(G) 2 —(4'-klooribifenyl-4-yyli)-5(S)-fenyyli-4,5-dihyd- ro-oksatsoli 15 (a) 2-amino-l(R)-fenyylietanoli

Liuos, joka sisältää 15,8 g R(-)-fenyyli-oksiraania 150 ml:ssa etanolia, jäähdytetään -60°:seen ja lisätään 75 ml ammoniakkia. Reaktioseosta sekoitetaan 70 tunnin ajan huoneenlämpötilassa suljetussa ruostumat- 20 tomassa teräsreaktorissa. Liuottimet haihdutetaan ja joukkoon lisätään 300 ml vettä ja 60 ml tolueenia. Vesipitoisen kerroksen erotus ja liuottimen poisto vakuumis-sa tuottaa 14,14 g väritöntä kiintoainetta, joka sisäl- • .* tää 86 % 2-amino-l(R)-fenyylietanolia, 9 % 2-amino-2- 25 fenyylietanolia ja 5 % 2-(2-hydroksi-2-fenyylietyyli- l *_! amino)-1-fenyylietanolia (määritettynä Hi-NMRtllä). Seos käytetään seuraavassa vaiheessa ilman enempää puhdista- • mistä. Kromatografointi silikageelillä (dikloorimetaa-ni/metanoli/28-prosenttinen ammoniumhydroksidin vesiliu- 30 os = 100/10/1) tuottaa analyyttisen näytteen; sp.: 64,6°

... (sublimoituu); [a]D20 = -44,3° (c = 2, etanoli); ^-NMR

(DMSO-d6) δ: 7,37 - 7,22 (m, 5H); 4,44 (dd, J = 4,4, 7,7 Hz, 1H); 2,70/2,57 (ABX, J = 11,3, 4,4, 7,7 Hz, 2H) ; 2,60 (bs, 3H).

j 35 (b) 4'- klooribifenyyli-4-karbonyyli-f2(R)-hvdroksi-2- fenyylietyyli1amidi 17 112364

Liuosta, joka sisältää 1,2 g 4'-kloori- bifenyyli-4-karboksyylihappoa ja 715 μΐ trietyyliamiinia 20 ml:ssa kuivaa DMF:ää, jäähdytetään -20°:seen ja käsitellään 0,710 ml:11a isobutyylikloroformaattia. Reaktio-5 seosta sekoitetaan vielä 20 minuuttia ja joukkoon lisätään 955 mg raakaa (74 %) 2-amino-l(R)-fenyylietanolia 5 mlrssa DMF:ää. Seoksen annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitetaan 16 tunnin ajan. Liete kaadetaan 100 ml:aan jääkylmää vettä, sakka kerätään sintterisup-10 pilolle ja sitä pestään kolme kertaa vedellä ja kerran etanolilla. Kuivaus vakiopainoon tuottaa yhdistettä vaaleankeltaisina kiteinä; sp.: 229,3°; [a]D20 = +48,l°(c = 1,0, DMSO); ^-NMR (DMSO-d6) 6: 8,62 (t, J = 5,6 Hz, 1H); 7,95/7,78/7,55 (3d, J = 8,5 Hz, 8H) ; 7,41 - 7,22 15 (m, 5H), 5,55 (d, J = 4,4 Hz, 1H); 4,81 (ddd, J = 4,4, 4,7, 8,1 Hz, 1H); 3,56 - 3,46/3,40 - 3,29 (2m, 2H).

(c) 2 — (4'-klooribifenyl-4-yyli)-5(S)-fenyyli-4,5-dihyd- ro-oksatsoli 20 Liuos, joka sisältää 1,24 g 4'-klooribifenyyli- 4-karbonyy1i-[2(R)-hydroksi-2-fenyylietyyli]amidia 20 ml:ssa pyridiiniä, jäähdytetään jäähauteessa ja käsitellään liuoksella, jossa on 921 mg metaanisulfonihapon anhydridiä dikloorimetaanissa. Reaktioseosta sekoitetaan • 25 vielä 16 tunnin ajan 5°:ssa, joukkoon lisätään etyyli- • ·* asetaattia ja natriumvetykarbonaatin kyllästettyä vesi- ; liuosta, orgaaninen faasi erotetaan, kuivataan ja kon- • ; ; sentroidaan vakuumissa. Vakuumi-flash-kromatografointi lit » silikageelillä (tolueeni/etyyliasetaatti = 3/1) tuottaa 30 yhdistettä vaaleankeltaisina kiteinä; sp.: 121,5° ... (uudelleenkiteytetty etanolista); [oc]D20 = +133,5° (c = 1,3, metanoli); ^-NMR (CDC13) δ: 8,09/7,63/7,56/7,43 t t (4d, J = 8,5 Hz, 8H); 7,44 - 7,36 (m, 5H); 5,68 (dd, J = : 7,9, 10,1 Hz, 1H); 4,51/4,02 (ABX, J = 14,9, 10,1, 7,9 35 Hz, 2H).

i t » > 18 112364 (H) (+)- ja (-)-1-amino-l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(1H- imidatsol-l-yyli)etaani (a) 1-f(IS)-kamfanoyyli1amino-1-(5-kloori-2-pyridyyli)- 2-(lH-imidatsol-l-yyli)etaani 5 Liuokseen, joka sisältää 0,38 g 1-amino-l-(5- kloori-2-pyridyyli)-2-(lH-imidtasol-l-yyli)etaania (ra-seeminen yhdiste, ks. (A) edellä) 4 ml:ssa kuivaa dikloorimetaania, lisätään 0,26 g (0,36 ml) trietyylia-miinia. Seosta sekoitetaan ja se jäähdytetään -79°:seen.

10 Sitten lisätään 0,44 g (IS)(-)-kamfaanihappokloridia siten, että lämpötila ei ylitä -74°. Sekoitusta jatketaan vielä 90 minuuttia ilman enempää jäähdyttämistä. Seoksen jälkikäsittelemiseksi se kaadetaan jää-veteen, sitä uuteaan kolme kertaa dikloorimetaanilla ja pestään 15 suolavedellä. Natriumsulfaatilla kuivaamisen jälkeen liuotin haihdutetaan. Saadaan kahden diastereomeerisen amidin seosta, jolle suoritetaan kromatografinen erotus silikageelillä (dikloorimetaani/metanoli/heptaani = 10/1/5). Kaksi yhdistettä saadaan valkoisina kiteinä: 20 - diastereomeeri B: sp.: 195 - 199° - diastereomeeri A: sp.: 151 - 160°.

‘ : (b) ( + )- ja (-)-l-amino-l-(5-kloori-2-pyridyyli)-2-(lH- imidatsol-l-yyli)etaani 25 0,16 g kamfanoyylidiastereomeeria B ja 0,8 ml 35-prosenttista perkloorihappoa kuumennetaan lasiauto-,‘ ,* klaavissa 12 tunnin ajan, 120°:ssa. Laimentamisen 2 ; ml:11a vettä jälkeen seosta uutetaan etyyliasetaatilla ’·’ * (joka poistetaan). Vesipitoinen faasi tehdään alkalisek- 30 si 2 N natriumhydroksidillä ja sitä uutetaan kolme ker- * taa etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros kuivataan magi’ : nesiumsulfaatilla ja haihdutetaan kuiviin. Kromatogra- , fointi silikageelillä (dikloorimetaani/metanoli/heptaani !!! = 10/1/5 —> 7/1/4) tuottaa ( + )-enantiomeerista otsikon ; 35 mukaista yhdistettä (B-isomeeri) vaalean keltaisena • ’>· öljynä: 19 112364 VNMR (CDC13) δί 8,57 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 7,61 (dd, J, 2,5, J2 = 8,3 Hz, 1H); 7,38 (s, 1H); 7,13 (d, J = 8,3, 1H); 7,02 (s, 1H); 6,83 (s, 1H); 4,32 - 4,14 (m, 3H); 1,73 (s, b, 2H).

5 Analogisesti edellä kuvatun kanssa saadaan (-)- enantiomeerista otsikon mukaista yhdistettä (A-isomeeri) hydrolysoimalla kamfanoyylidiastereoisomeeri A.

(I) 2-fenyyli-2-(lH-imidatsol-l-yyli)-l-aminoetaani 10 Yhdistettä saadaan 2-fenyyliatsiridiinista analogisesti edellä kohdassa (E) (c) kuvatun kanssa.

Kromatografointi silikageelillä (dikloorimetaani/meta-noli/NH3-vesiliuos = 10/1/0,1) tuottaa otsikon mukaista yhdistettä värittömänä viskoosina öljynä.

15 Kaavan I mukaiset yhdisteet vapaassa muodossa tai farmakologisesti hyväksyttävän suolan muodossa, tästä eteenpäin lyhyesti "keksinnön mukaiset aineet", ovat farmakologisesti aktiivisia ja niitä ehdotetaan näin ollen käytettäväksi farmaseuttisina aineina. Eri-20 tyisesti, ne ovat voimakkaita, selektiivisiä estäjiä sellaisille 25-hydroksivitamiinin D3 -hydroksylaaseille, joiden vaikutuskohteena on kalsitriolin C20-27-sivu-• ketju, kuten 25(OH)D3-24-hydroksylaasi, ja jotka siten kataboloivat hormonaalisesti aktiivisia vitamiini D3 -25 metaboliitteja (esim. kalsitriolia), samalla kun keksin-\ nön mukaiset aineet häiritsevät huomattavasti vähemmän ,* itse kalsitriolisynteesiä, joka tapahtuu 25(OH)D3-l- : hydroksylaasin välityksellä.

‘ Selektiivinen esto voidaan määrittää esim.

30 seuraavilla koemenetelmillä: : : 1-hydroksylaasin aktiivisuus [·_ Tämä voidaan määrittää suoraan ihmisen kerati-

Iti li! nosyyttien konfluenteista (yhteen kasvaneista) viljel- 35 mistä, kun taas C20-27-sivuketjuun vaikutuksensa kohdis- '*· tavien hydroksylaasien aktiivisuuden määritystä täytyy :edeltää konfluenttien viljelmien 16 tunnin esikäsittely 20 112364 1,25(OH)2D3:11a (10 nM), jolloin nämä aktiivisuudet ohjautuvat esiin (to upregulate) (molemmat menetelmät ovat kuvanneet Bikle, D.D et ai., J. Clin. Invest. 78 557 [1986]).

5

Keratinosyyttivil jelmät .·

Normaalit ihmisen keratinosyytit eristetään aikuisen tuoreesta ihosta, joka on saatu poistettaessa maitorauhasta, ja käytetään välittömästi steriileissä 10 olosuhteissa. Eristys ja kasvatus seerumista vapaissa olosuhteissa ja ilman syöttäjäkerrosta noudattaa modifioitua menetelmää, jota ovat käyttäneet Bikle et ai., julkaisussa Biochemistry 25 (1986) 1545 - 1548. Nämä olosuhteet valitaan, jotta voidaan välttää seerumiin 15 ja/tai syöttäjäkerrokseen mahdollisesti jääneiden vitamiini D -metaboliittien määrittelemättömät vaikutukset.

Sen jälkeen, kun orvaskesi on erotettu steriilillä der-matomilla ihosta, sitä inkuboidaan 0,25-prosenttisessa trypsiiniliuoksessa 45 minuutin ajan, 37°:ssa. Tämän 20 jälkeen solut raaputetaan irti ja saatetaan 50 ml:aan HBSS-liuosta, joka sisältää 10 % FCS:ää, trypsiinipilk-komisen lopettamiseksi ja sentrifugoidaan 2 000 rpm:ssä, 2 minuuttia. Saadusta solupelletistä, joka on suspensoi-*; · tu tiettyyn seerumista vapaaseen KGM-väliaineeseen, 25 jonka kalisumpitoisuus on pieni (0,06 mM) ja joka sisäl- ’· . tää 0,1 ng/ml EGF:ää, 5 pg/ml insuliinia, 0,5 pg/ml .* hydrokortisonia, naudan aivolisäkeuutosta sekä antibi- ;· ootteja (gentamysiiniä, amfoterisiiniä), saadaan primaa- * riviljelmä. Inkubaattorissa 37°:ssa ja karbogeenikaasu- 30 käsittelyn (95 % 02/ 5 % C02) alaisena 24 tunnin pitämi- i ’,· sen jälkeen kiinnittymättömät solut poistetaan, astiaa · __·’ pestään ja siihen saatetaan tuoretta KGM-liuosta. Kava- , tusväliaine vaihdetaan joka toinen päivä ja solut siir-

• ► I

retään, kun ne saavuttavat 80 - 90 %:n konfluenssin ’I’ 35 (tavallisesti 6-10 päivää maljauksesta). Siirtämistä '·* varten vanha KGM-liuos poistetaan ja kiinnittyneet kera- tinosyytit siirretään paikaltaan käsittelemällä nopeasti 21 112364 (5 minuuttia) 0,125 %:lla trypsiinillä, sitten asettamalla HBSS + FCS -liuokseen, sentrifugoimalla ja lopuksi uudelleensuspensoimalla KGM-liuokseen siten, että 1 levystä primaariviljelmää saadaan 3 levyllistä ensimmäi-5 sen siirron soluja. Solujen lopullisen lukumäärän lisäämiseksi kerätinosyyttejä kasvatetaan vielä edellä kuvatun mukaisesti, ja yleensä ne käytetään niiden ollessa toisessa siirtovaiheessa.

10 (a) Vitamiini D3 -hydroksylaasien selektiivinen esto KGM-liuoksessa, alhaisessa kalsiumpitoisuudessa (0,06 mM) ihmisen keratinosyyttien konfluentit viljelmät kykenevät tuottamaan 1-hydroksylaasin avulla suuressa määrin kalsitriolia ja, kuitenkin, sivuketjun hapettumi-15 sen kautta tapahtuvan metaboliasarjän (sequential metabolism) aktiviisuudet puuttuvat lähes kokonaan. Siten 1-hydroksylaasien esto konfluenteissa viljelmissä voidaan määrittää suoraan, ja metaboliasarjän esto, sen jälkeen kun kukin hydroksylaasi, esim. 24-hydroksylaasi, on 20 ohjautunut esiin, määritetään yön yli (17 tuntia) 10 nM kalsitriolilla esikäsittelyn jälkeen, kuten ovat kuvanneet Bikle et ai. (1986) (viitattu edellä).

: 1-hydroksylaasin ja sellaisten metaboliasarjän . eräiden vaiheiden [esim. l,24,25(OH)3D3 + 25 l,24okso,25(OH)zD3 muodostuminen] aktiivisuudet, joissa . vielä säilyy kalsitriolin kaltaisia aktiivisuuksia, 3- epi-kalsitriolimetaboliittien muodostuminen, vesifaasiin ’ sisälyvien polaaristen metaboliittien muodostuminen sekä *·* ' sellaisten metaboliittien muodostuminen, jotka osoitta- 30 vat sivuketjun katkeamisen, sekä niiden esto koeyhdis- • \: teillä määritetään seuraamalla 3H-25(OH)D3:n (Amersham; : spesifinen aktiivisuus on n. 0,61 mCi/nmol) hapettumista ’·, seuraavasti:

Konf luentte ja ihmisen keratinosyytte jä, jotka 35 ovat 1 ml KGM-liuoksessa 6-kuopan levyissä, inkuboidaan : *· kaksoiskokeena 37°:ssa 3H-25(OH)D3:n kanssa 1 tunnin ajan : (1-hydroksylaasi), 4 tunnin ajan (metaboliasarja) ja eri 22 112 3 6 4 aikavälein 1-24 tunnin välillä, ilman esi-inkubointia 10 nM kalsitriolin kanssa ja tämän kanssa esi-inkuboinnin jälkeen, sekä yhdessä ja ilman estäviä ko-eyhdisteitä, joita lisätään 0 - 10 μΜ pitoisuuksia.

5 Tämän jälkeen reaktio pysäytetään 1 ml:11a metanolia kuoppaa kohti, solut raaputetaan irti, siirretään koeputkeen yhdessä supernatantin ja kahden pesuliuoksen (1 ml metanolia ja 0,8 ml vettä) kanssa. Modifioimaton 3H-25(OH)D3 ja suurin osa tuotteista uutetaan kokonaisuu-10 dessaan yhdistetyistä liuoksista ja solupelletistä uuttamalla peräkkäisesti 2,1 ml:lla ja 1 ml:lla CHCl3:a huoneenlämpötilassa. Määritetään 3H-aktiivisuus CHC13-faasissa, vedessä ja 3H-kokonaissaanto. Pidemmän aikavälin (> 4 tuntia) inkuboinnit lisäävät voimakkaasti 3H-15 aktiivisuutta vesifaasissa, mikä johtuu erittäin polaa risista metaboliiteista ja haihtuvien tuotteiden 3H-aktiivisuuden merkittävästä hävikistä, joka on lähes yksinomaan seurausta sellaisesta sivuketjun katkeamisesta, jossa 3H-leima C26/27-kohdassa lohkeaa pois. Yhdis-20 tetyt CHCl3-uutokset haihdutetaan sitten argonin alla, 35°:ssa, jäännökset liuotetaan 0,4 ml:aan etanolia ja liuoksille suoritetaan HPLC-analyysi Zorbax-Sil-pylväällä (Dupont; 4,6 x 250 mm) käyttäen heksaani:2-. propanolin ei-lineaarista gradienttia 97:3:sta 85:15:een 25 virtausnopeudella 2 ml/min ajon kestäessä kokonaisuudes saan 70 minuuttia. Piikeistä määritettiin substraatti ja yksittäiset metaboliitit sovittamalla yhteen samanaikai-‘ * sesti kromatografoitujen leimaamattornien standardien kanssa. Määritetään tietyn tuotteen määrä, joka on muo-30 dostunut erityisen estäjän pitoisuudessa 0 - 10 μΜ läsnä ollessa, ja lasketaan eston voimakkuus (IC50) Dixon Plot ,·' -kuvaajasta (1/nopeus estäjän pitoisuutta vastaan).

Selektiivisyyttä voidaan arvioida vertaamalla IC50-·., arvoja, jotka on saatu tietyllä estäjällä erityisten 35 peräkkäisprosessien tapauksessa (sequential processes) ·· ja 1-hydroksylaasin tapauksessa.

i I

23 112364 (b) -H-tymidiinin sisäänotto ihmisen keratinosyytteihin vitamiinin D -metaboliittien antiproliferatiiviset vaikutukset niiden kataboliaa selektiivisesti estävien aineiden läsnä ollessa 5 3H-tymidiinin sisäänottoa mitataan 96-kuopan levyillä seuraavasti: 200 μΙίΞεβ KGM-liuosta alhaisessa kalsiumpitoisuudessa olevat keratinosyytit maljataan alkutiheyteen 104 solua kuoppaa kohti (toinen siirto) ja pidetään 24 tunnin ajan 37°:ssa inkubaattorissa, samalla 10 kun johdetaan karbogenkaasua (95 % 02/5 % C02). Tämän jälkeen koeyhdisteet, jotka ovat pitoisuudessa 0-10 μΜ, lisätään 1 μΐίβββ etanolia 25(OH)D3:n tai la,25(OH)zD3:n (molempia 0-7 nM) läsnä tai poissa ollessa. Jokaisesta pitoisuudesta tehdään kolme näytettä.

15 Vain liuotinta tai vitamiini D -metaboliittia sisältävät blank-näytteet sijoitetaan jokaisen kuoppakolmikon jälkeen. Lisätään 5-10 blankkia levyä kohti liuottimen puuttuessa. Vielä 24 tunnin jälkeen lisätään 50 μΐ 3H-tymidiiniä (1 pCi) KGM-liuoksessa, inkubointia jatketaan 20 vielä 17 tuntia ja lopuksi pysäytetään keräämällä solut ja suorittamalla lyysi.

Kerääminen suoritetaan Filtermate 196 - Harves-·': ter -laitteella (Packard-Canberra). Ensimmäisessä vai- heessa supernatantit imetään 96-kuopan suodatinlevyjen ; 25 läpi ja suoritetaan 3 x vesipesu. Näiden suodatinlevyjen mittaukset, kuten alla on esitetty, osoittavat selvästi, että yhtään 3H-aktiivisuutta sisältävää solua ei ollut * ♦ * päässyt irti. Sitten inkuboiduilla levyillä kiinnitty- * · · ’·’ neenä olevat solut irrotetaan käsittelemällä 100 μ1:11β 30 0,125 % trypsiiniä sisältävää PBS-liuosta, 37°:ssa, 5 : minuutin ajan, kerätään uudelle suodatinlevylle ja pes- • · ί tään 3 x vedellä. 50 μΐ tuikeseosta (MicroScint O, , Packard) lisätään ja 3H-aktiivisuus lasketaan Microplate

Scintillation Counter -laitteella (Topcount, Packard 35 Canberra).

’ · Tulokset käytetään keskiarvoina ± SEM

(keskiarvon keskivirhe) (n = 3). IC50-arvot vitamiini D - 24 112364 metaboliittien aikaansaamalle proliferaation estymiselle pitoisuuksiltaan vaihtelevien sivuketjumetabolian estäjien läsnä ollessa ja päin vastoin määritetään muodostamalla kuvaaja käänteisestä proliferaationopeudesta yhtä 5 estäjäpitoisuutta vastaan, samalla kun muiden estäjien pitoisuus pidetään vakiona (Dixon Plot). Estomekanismis-ta riippumattomasti IC50-arvot voidaan saada tältä kuvaajalta x-akselin leikkaupisteestä.

Keksinnön mukaiset aineet osoittavat estävää 10 aktiivisuutta edellä mainituissa kokeissa (a) ja (b) pitoisuuksina n. 0,01 - 10 μΜ.

Keksinnön mukaisia aineita ehdotetaan siten käytettäväksi sellaisten 25-hydroksivitamiini D3 hydroksylaasien selektiivisinä estäjinä, joiden vaikutus 15 kohdistuu vitamiinin D3 C20-27-sivuketjuun, hoidettaessa vitamiiniin D vasteellisten kudosten proliferaatio- ja erilaistumishäiriöitä, erityisesti sellaisia tiloja, joiden hoidossa halutaan estää selektiivisesti kalsit-riolihormonin kataboliaa häiritsemättä sen synteesiä 20 esiasteestaan 25(OH)D3, kuten kohottaa ja pitkittää endogeenisen hormonin tasoja ja siten saada aikaan edullisia vaikutuksia proliferaation ja erilaistumisen, immuuni toiminnon sekä kalsiumhomeostaasin suhteen, esim.

; ; . ihon tapauksessa hyperproliferatiivisissa ja inflammato- ;v. 25 risissa sairauksissa, kuten psoriasiksessa ja ekseemi- sissä sairauksissa, tukikudosta degeneroivissa muutok-sissa, jotka voivat olla patologisia tai normaaliin ·;;· vanhenemiseen liittyviä, hiustenlähdön estossa sekä *·' hiustenkasvun regeneroinnissa, ja muun kuin ihon tapauk- 30 sessa kasvaimien supressiossa, sietokyvyn lisäämisessä tl » i allosiirrännäisiä kohtaan, nivelreumassa ja luun uudel- » » * :t> : leenmuotoutumisen yhteydessä.

, ,·. Näihin käyttötarkoituksiin sopiva annos luon- !!! nollisesti vaihtelee riippuen esim. käytetystä keksinnön ;* 35 mukaisesta aineesta, isännästä, antotavasta ja käyttö- ’· tarkoituksesta. Kuitenkin, edellä esitettyihin indikaa- tioihin ehdotetaan päiväannokseksi n. 70 - 1 400 mg 25 112364 keksinnön mukaista ainetta annettuna asianmukaisesti, esim. jaettuina annoksina, jotka on tarkoitettu annettaviksi aina 2 tai 4 kertaa saakka päivässä enteraalis-ta/systeemistä hoitoa varten, ja pitoisuudessa alle 0,5 5 %, esim. 0,1, - 2 %, voiteessa/liuottimessa, joka on tarkoitettu topikaaliseen hoitoon.

Keksinnön mukaisia aineita voidaan antaa seostettuna konventionaalisiin farmaseuttisesti hyväksyttäviin laimennusaineisiin ja kantajiin sekä, mahdollises-10 ti, muihin apuaineisiin.

Niitä voidaan antaa mitä tahansa konventionaalista tietä, erityisesti enteraalisesti, esim. oraalisesti, kuten tablettien tai kapseleiden muodossa, tai topikaalisesti, esim. lotioneiden, geelien, kremoreiden, 15 suihkeiden ja liuosten muodossa, kuten silmä- tai nenä-liuoksina tai aerosoleina, jotka on tarkoitettu ihon ja limakalvojen, kuten silmän, hengitysteiden, emättimen, suun ja nenän ontelon, paikalliseen hoitoon.

Niitä voidaan antaa yksin tai yhdessä pienten 20 kalsitrioliannosten kanssa, tai klassisten aineiden kanssa, kuten syklosporiinin A (SandimmuneR), lisäämään immunosuppressivisia tai anti-inflammatorisia vaikutuk-| '[: siä; huomattavasti tavallista pienemmillä yksittäisten ; lääkeaineiden annoksilla saadaan vähennettyä ei- 25 toivottuja sivuvaikutuksia. Keksinnön mukaisilla aineil- : la voidaan korvata glukokortikoideilla (esim. deksameta- sonilla, betametasonilla, prednisolonilla) ja muilla * * · ‘II.' immunosuppressoivilla aineilla toteutettua hoitoa ja i ( i ‘ niillä voidaan täydentää kalsitoniini- ja partyroidea- 30 hormonihoitoa.

• Edellä mainittuhin indikaatioihin erityisen edullisia aineita ovat enantiomeeriset yhdisteet N-[4-.,·. (4-kloorifenyyli)bentsoyyli]-2-(lH-imidatsol-l-yyli)- ,···, 2 (S)-fenyyli-l-aminoetaani (esimerkki 8) ja sen (R) — 35 enantiomeeri (esimerkki 9). Ne ovat sellaisten 25- : * hydroksivitamiini D3 -hydroksylaasien selektiivisiä estäjiä, joiden vaikutus kohdistuu vitamiinin D3 C20-27- 26 112364 sivuketjuun, ilman, että ne häiritsevät tämän synteesiä esiasteestaan 25(OH)D3. Esimerkiksi edellä esitetyissä kokeissa (a) ja (b) niiden sivuketjumetabolian eston IC50-arvoksi on määritetty 10 - 50 nM.

5 Keksintö tuo edelleen esiin farmaseuttisia koostumuksia, jotka on tarkoitettu esim. topikaalista antoa varten ja jotka sisältävät keksinnön mukaista ainetta sekä vähintään yhtä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimennusainetta. Tällaisia koostumuk-10 sAadvoidaan valmistaa konventionaaliseen tapaan seostamalla keksinnön mukaista ainetta ja vähintään yhtä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimennusainetta. Yksikköannosmuodot sisältävät, esimerkiksi, n. 20 -700 mg aktiivista ainetta.

15 Käyttö kohdistuu erityisen edullisesti psoria siksen hoitoon.

Keksinnön mukaisilla aineilla on korostuneempi ja selektiivisempi 25(OH)D3-hydroksylaasia estävä aktiivisuus, kuin rakenteellisesti vastaavien yhdisteiden 20 perusteella voisi odottaa.

» * * · I I |

• I

» J

I » t »

Claims (8)

112364

1. Yhdiste, jolla on kaava I, Π-N 3

5 N R1 r2 10 jossa joko Ri tarkoittaa fenyyliä tai naftyyliä, jolloin nämä kaksi substituenttia on mahdollisesti mo-nosubstituoitu halogeenilla ja R2 tarkoittaa vetyä; tai Ri tarkoittaa vetyä, ja R2 tarkoittaa pyridyyliä tai 2- (5-kloori)pyridyyliä;

15 R3 tarkoittaa vetyä, halogeenia tai Ci-C4-alkoksia; ja X on CH tai N; ja joka yhdiste on vapaassa muodossa tai suolan muodossa .

2. Förening enligt patentkrav 1, k ä n n e -20 tecknad därav, att föreningen har formel Ip, Π-N : £y

25 CH - CH - NH - CO—<^J>—Ip :/: R,P R2p vari antingen Rip avser fenyl, vars 4-position möjligen är monosubstituerad med klor, och R2p avser väte; .. . 30 eller RiP avser väte och R2p avser 2- (5-klor) pyridyl; I t I / eller RiP avser 1-naftyl, R2p avser väte och Xp är CH; I » '··.* och föreningen är i fri form eller i form av ett farma- ; kologiskt acceptabelt syreadditionssalt.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, 20 tunnettu siitä, että yhdisteellä on kaava lp, r-N ; !s fH-fi-Ni-co-O-O-0 RiP r2P jossa joko Rip tarkoittaa fenyyliä, jonka 4-asema on mahdollisesti monosubstituoitu kloorilla, ja R2p tar-|(< 3 0 koittaa vetyä; ' tai Rip tarkoittaa vetyä ja R2p tarkoittaa 2- (5- kloori) pyridyyliä ; : : tai RiP tarkoittaa 1-naftyyliä, R2p tarkoittaa vetyä ja , Xp on CH; 35 ja yhdiste on vapaassa muodossa tai farmakologisesti ’ hyväksyttävän happoadditiosuolan muodossa. > I 112364

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että yhdisteellä on kaava Is r-N 1 3 5 CH - <pi - NH - CO-,s RjS R2s 10 jossa joko RiS tarkoittaa fenyyliä, fenyyliä, joka on monsubstituoitu halogeenilla tai 1-naftyyliä, ja R2s tarkoittaa vetyä; tai RiS tarkoittaa vetyä ja R2s tarkoittaa pyridyyliä tai 2-(5-kloori)pyridyyliä; ja R3s tarkoittaa halogeenia tai 1-4 hiiliatomia sisältävää 15 alkoksia; ja yhdiste on vapaassa muodossa tai suolan muodossa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että se on N- [4- (4-klooritenyy-li)bentsoyyli]-2-(lH-imidatsol-l-yyli)-2-fenyyli-l- 20 aminoetaani, joka on vapaassa muodossa tai suolan muodossa .

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, ; tunnettu siitä, että yhdiste on 2(S)-enantio- ; meerin muodossa, joka 2(S)-enantiomeeri on vapaassa 25 muodossa tai suolan muodossa. >t ; 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, / tunnettu siitä, että yhdiste on 2 (R)-enantio- meerin muodossa, joka 2 (R)-enantiomeeri on vapaassa i t I muodossa tai suolan muodossa.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, i i > tunnettu siitä, että yhdisteessä X on CH, ja joko Ri tarkoittaa vetyä ja R2 ja R3 tarkoittavat vas-, taavasti - 2-(5-kloori)pyridyyliä ja 4-klooria, ja yhdiste on ‘I’ 35 raseemisessa tai ( + ) - tai (-)-enantiomeerisessa muodos- ** sa, tai - 2-pyridyyliä ja 4-klooria, tai 112364 - 3-pyridyyliä ja 4-klooria, tai - 4-pyridyyliä ja 4-klooria, tai - 2-(5-kloori)pyridyyliä ja 4-etoksia, tai - 2-(5-kloori)pyridyyliä ja 4-n-butoksia; 5 tai R2 tarkoittaa vetyä, R3 tarkoittaa 4-klooria ja Ri tarkoittaa 4-klooritenyyliä, ja yhdiste on raseemisessa tai (+)(S)-enantiomeerisessa muodossa, tai 10 - 1-naftyyliä; ja yhdiste on vapaassa muodossa tai suolan muodossa.

8. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä 15 (a) vastaava yhdiste, jolla on kaava II, n-N xO N I n

20 CH-CH-NH, R, R2 j" . jossa substituentit ovat patenttivaatimuksessa 1 määri- , , tellyn mukaisia, asyloidaan vastaavan bifenyyli-4- . _ 25 karbonyyliryhmän viemiseksi; tai ' , (b) sellaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava ! : Ia' : = R]! jossa R3 ja X ovat patenttivaatimuksessa 1 määritellyn 35 mukaisia ja Ri':llä on muuten sama määrittely kuin edellä R^llä, mutta siihen ei kuulu vety; j vastaava yhdiste, jolla on kaava III, t · 112364 *Y 5 tai kaava Ilia, R.'-CH-CH, 10 ma jossa Ra' on tässä patenttivaatimuksessa määritellyn mukainen ja R3 on patenttivaatimuksessa 1 määritellyn 15 mukaisia; saatetaan reagoimaan vastaavan yhdisteen kanssa, jolla on kaava IV, n-N xO

20 N jossa X on patenttivaatimuksessa 1 määritellyn mukai-: nen ; ja saatu kaavan I mukainen yhdiste otetaan talteen , 25 vapaassa muodossa tai suolan muodossa. . : 9. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu . ’ siitä, että koostumus sisältää jonkin patenttivaatimuk- sista 1-7 mukaista yhdistettä, joka on vapaassa muo-’ dossa tai farmakologisesti hyväksyttävän suolan muodos- 30 sa, sekä vähintään yhtä farmaseuttisesti hyväksyttävää : ,* kantajaa tai laimennusainetta. ·,,,· 10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukai- t , , sen, vapaassa muodossa tai farmakologisesti hyväksyttä- _···_ vän suolan muodossa olevan yhdisteen käyttö lääkkeen 35 valmistuksessa, joka lääke on tarkoitettu terapeutti- : '·· seen käyttöön hoitamaan, estämällä selektiivisesti 25- /·; hydroksivitamiini D3 -hydroksylaaseja, joiden vaikutus 112364 kohdistuu vitamiinin D3 C20-27-sivuketjuun, vitamiiniin D vasteellisten kudosten proliferaatio- ja erilaistu-mishäiriöitä, ja erityisesti tiloja, joiden hoidossa halutaan estää selektiivisesti kalsitriolihormonin 5 kataboliaa häiritsemättä sen synteesiä esiasteestaan 25(OH)D3, kuten kohottaa ja pitkittää endogeenisen hormonin tasoja ja siten saada aikaan edullisia vaikutuksia proliferaation ja erilaistumisen, immuunitoimin-non sekä kalsiumhomeostaasin suhteen, esim. ihon tapa-10 uksessa hyperproliferatiivisissa ja inflammatorisissa sairauksissa, kuten psoriasiksessa ja ekseemisissä sairauksissa, tukikudosta degeneroivissa muutoksissa, jotka voivat olla patologisia tai normaaliin vanhenemiseen liittyviä, hiustenlähdön estossa sekä hiustenkas-15 vun regeneroinnissa, ja muun kuin ihon tapauksessa kasvaimien supressiossa, sietokyvyn lisäämisessä allo-siirrännäisiä kohtaan, nivelreumassa ja luun uudelleenmuotoutumisen yhteydessä. • · 112364 l.Förening, med formel I, π-N 5 xj 'n f-T-NH-CO-^H3iR3 ‘ R, R, 10 vari antingen R2 avser fenyl eller naftyl, varvid dessa tva substituenter möjligen är monosubstituerade med en halogen och R2 avser väte; eller Ri avser väte, och R2 avser pyridyl eller 2-(5-15 klor)pyridyl; R3 avser väte, halogen eller C1-C4-alkoxy; och X är CH eller N; och vilken förening är i fri form eller i form av salt.

3. Förening enligt patentkrav 1, k ä n n e -35 tecknad därav, att föreningen har formel Is ‘ « * ‘ * I 112364 r-N